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Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Hormônios reguladores do metabolismo
energético e repercussões na atividade funcional dos
fagócitos mononucleares do colostro de puérperas com
excesso de peso pré-gestacional
Tassiane Cristina Morais
São Paulo – SP
2019
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Saúde Pública para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Saúde, Ciclos de vida e
Sociedade
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos de Abreu
Hormônios reguladores do metabolismo
energético e repercussões na atividade funcional dos
fagócitos mononucleares do colostro de puérperas com
excesso de peso pré-gestacional
Tassiane Cristina Morais
Versão Revisada
São Paulo – SP
2019
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Saúde Pública da Faculdade de Saúde da
Universidade de São Paulo para obtenção do título
de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Saúde, Ciclos de vida e
Sociedade
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos de Abreu
Dedico este trabalho para todos os meus ancestrais, em especial para a minha bisavó paterna Lúcia que teve sua vida abreviada após um parto e não gozou da possibilidade de embalar, ninar e amamentar seu bebê. Ela não deteve do direito de fazer parte da memória de sua filha, provavelmente, pelo simples fato de ser mulher. Assim, dedico este trabalho a todas as mães de Maria.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela estrada percorrida e por ser uma fonte infinita de força e
esperança que nos impulsiona a seguir em frente.
Agradeço a minha mãe, Suely Estela da Silva Morais, e a meu pai, Pedro Morais (In
memoriam), que me deram a vida e todas as ferramentas necessárias para amadurecer e ter a
coragem de sair para trilhar meu próprio caminho. Com vocês eu descobri o que é amar e
receber o amor real, de modo incondicional. Eu os amo e tenho imensa gratidão!
Agradeço a toda minha família, em especial a minha tia Solimar da Silva quem abriu
as portas de sua casa e me recebeu com todo o seu amor e carinho, fato fundamental para me
sentir em casa nesta cidade tão querida. Meus agradecimentos a minha avó Elydia Campi
Silva, ao meu irmão Rodrigo Roberto Morais, minha cunhada Milene Bordin, a minha irmã
Tame Renata Morais e meus sobrinhos Carlos Caique Morais do Nascimento, Larissa Mayra
Morais do Nascimento e Vitor Hugo Morais do Nascimento, vocês são a minha base e o meu
porto seguro! Espero que com o passar dos anos nossos laços se fortaleçam cada vez mais e
nossas relações sejam sempre baseada na cumplicidade e amor.
Agradeço ao meu amigo, namorado e grande parceiro, Ricardo Morais Freitas, que veio
como um lindo presente de primavera que adentrou estações e coloriu meus dias junto ao
final dos experimentos desta pesquisa. Gratidão por compartilhar comigo segredos e virtudes,
pelo seu lindo coração e sua capacidade de amar, eu o amo.
Meus agradecimentos para Leila Santos e Vanessa Ribeiro que foram minhas “amigas
irmãs” nesta fase de doutorado. Agradeço pela companhia, amizade, apoio, ombro amigo,
incentivo, pelos sonhos compartilhados e memórias vividas, meus sinceros agradecimentos.
Agradeço também a Maria Elizangela Ramos Junqueira por toda amizade, fé, otimismo,
conselhos, amparo, constante incentivo, por sua capacidade de ver além e abrir meus olhos
para novas perspectivas. Agradeço ao meu amigo Rafael Souza Pessoa, pela sua sensibilidade,
pelas gotas de lavanda para ansiedade, por todos os seus conselhos, pela ajuda nos
experimentos e por simplesmente ser você. Gratidão meu amigo!
Agradecimentos ao Cleiton Fiório por todas as risadas durante os almoços, por saber
acolher seus amigos sem julgamentos, mostrando a praticidade para se resolver um problema.
Agradeço também a Agatha Gameiro, a Denize Rupolo Dall Agnol e a todos os outros amigos
que não foram aqui citados, mas que fizeram parte da minha história. Os anos de doutorado
foram acompanhados de muitas vivências que extrapolaram o espaço acadêmico, foi uma fase
rica, agregada a muita busca e amadurecimento pessoal.
Um agradecimento a Dr.ª Mahmi Fujimori que foi uma das pioneiras nesta linha de
pesquisa e abriu as portas para que hoje possamos estar avançando neste campo de
conhecimento.
Um agradecimento em especial a meu orientador Prof. Dr. Luiz Carlos de Abreu, por
ter aceitado conduzir este projeto de doutorado. Meus agradecimentos por toda confiança e
autônomia dada a mim para o desenvolvimento deste trabalho. Admiro-o pela sua audácia de
sempre extrapolar sua zona de conforto, buscando novas parcerias e projetos de âmbitos
nacionais ou internacionais e por sua visão em agrupar talentos e formar grupos. Meus
agradecimentos pelos seus conselhos, por ter contribuído com minha maturidade como
cientista e principalmente pelo constante incentivo de ir além.
Agradeço também a Profª Dr.ª Adenilda Cristina Honório-França que em muito
colaborou para o desenvolvimento deste trabalho. Sua experiência e conhecimento foram
fundamentais para o enriquecimento desta pesquisa. Agradeço por toda sua dedicação,
ousadia, humildade, ética, amor ao tema e a seus alunos. Gratidão pelo acolhimento dado,
pelas orientações transmitidas e por toda confiança e liberdade que a mim foi conferida.
Aprendi muito com suas orientações que também foram essenciais para meu amadurecimento
no campo das ciências. Meus agradecimentos pelo constante apoio e incentivo nesta
caminhada, tenho imensa admiração pelo seu trabalho e pela sua pessoa. Gratidão!
Agradeço ao Prof. Dr. Eduardo Luzia França, a quem tenho imensa gratidão e grande
admiração por sua simplicidade, sua forma de fazer ciência, pela grandiosidade de seus
pensamentos e por respeitar a individualidade de cada aluno. Suas contribuições foram
fundamentais, não só para a constituição desse trabalho, mas como para meu reconhecimento
da minha própria vocação. Um Professor que sempre ensinou que cada um tem seu tempo,
que devemos sonhar grande, mirar no alvo para além do que queremos!
Agradeço aos membros da Banca, em especial ao Prof. Dr. Claudio Leone, pelo aceite
em fazer parte desta Banca de defesa de doutorado e que gentilmente contribuiu para a
melhoria deste trabalho desde o processo de qualificação desta pesquisa. Meus
agradecimentos por compartilhar o conhecimento com os alunos de forma simples,
interessante e gentil. Agradeço por ser um Professor acessível e que mesmo após a
aposentadoria continua com seus trabalhos, contribuindo com o desenvolvimento da ciência
nesta instituição de ensino.
Um agradecimento especial também a Prof.ª Dr.ª Isabel C. E. Sorpreso por suas
contribuições visando a melhoria desta tese e pelo incentivo em aprofundar a temática tratada
em futuras pesquisas. Meus agradecimentos principalmente por fazer parte desta Banca e
trazer a força do seu feminino para a discussão de um tema fundamental para a saúde de
muitas crianças e mulheres. Meus singelos agradecimentos.
Agradeço também as minhas parceiras de pesquisa Ocilma B. de Quental e Blanca
Blanca E.G. Daboin pelas colaborações prestadas e por terem despertado em mim, novamente,
um olhar mais humano perante a saúde materno-infantil.
Agradeço aos colegas do Laboratório de Delineamentos e Escrita Científica, do Centro
Universitário Saúde ABC, e aos colegas, professores e funcionários da Faculdade de Saúde
Pública da Universidade de São Paulo, locais em que eu aprendi muitos ensinamentos ao longo
dos anos. Meus agradecimentos também aos colegas dos Laboratórios de
Cronoimunomodução e de Imunologia da Relação Materno-Infantil, da Universidade Federal
do Mato-Grosso-UFMT, em especial ao Aron, Bruno, Carol, Elton, José Nivaldo (pelo café e
otimismo diário), Renata Araújo, Rubian, Taisline, Patrícia e as professoras: Danny Laura
Gomes Fagundes, Lucélia Campelo de Albuquerque Moraes e Patrícia Fernandes Massmann.
Gratidão pela ajuda e sugestões prestadas.
Agradeço especialmente a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo por
ter fomentado este trabalho com Auxílio a Pesquisa (Processo auxílio 2015/19922-0) e a bolsa
de doutorado (Processo Fapesp n° 2015/01051-3), recursos essenciais para execução desta
pesquisa.
Meus agradecimentos a todas as doadoras de colostro por compartilharem parte deste
momento do puerpério e da amamentação, por acreditarem na ciência e colaborarem na
tentativa de construírem um mundo melhor.
Meus agradecimentos finais a todos que contribuíram com este trabalho e que por
ventura não foram aqui citados. Uma tese de doutorado não se faz sozinha, este trabalho
também é resultado da confiança e da força de cada um de vocês. Meus sinceros
agradecimentos!
“La loba, a velha, Aquela Que Sabe, está dentro de
nós. Ela viceja na mais profunda alma-psique das
mulheres, a antiga e vital Mulher Selvagem. Ela
descreve sua casa como um lugar no tempo no qual
o espírito das mulheres e o espírito dos lobos se
encontram – o lugar onde a mente e os instintos se
misturam, onde a vida profunda da mulher embasa
sua vida rotineira. É o ponto em que o Eu e o Tu se
beijam, o lugar onde as mulheres correm com os
lobos”
-Clarissa Pinkola Estés-
MORAIS, TC. Hormônios reguladores do metabolismo energético e repercussões na atividade
funcional dos fagócitos mononucleares do colostro de puérperas com excesso de peso pré-
gestacional [tese]. São Paulo: Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo; 2019.
RESUMO
A promoção a amamentação representa uma importante estratégia de saúde pública no manejo
do sobrepeso e obesidade mundial. É possível que os hormônios reguladores do metabolismo
energético, como a adiponectina, leptina e melatonina do colostro humano, possa beneficiar o
sistema imunológico do lactente e minimizar os impactos ocasionados pelo excesso de peso
materno pré-gestacional. Esses hormônios também possuem ação imunomoduladora, assim,
mudanças nas suas concentrações podem comprometer a atividade funcional das células
mononucleares (MN) do colostro humano e contribuir para o aumento de infecções neonatais.
Por isto, o objetivo desta pesquisa foi analisar a atividade funcional dos fagócitos MN do
colostro de mulheres com excesso de peso pré-gestacional, na ausência e presença de
adiponectina, leptina e melatonina. As amostras de colostro foram coletadas de 109 doadoras
saudáveis e foram divididas em dois grupos: grupo controle e grupo com excesso de peso. O
colostro foi centrifugado para obtenção do botão celular e sobrenadante. O sobrenadante foi
utilizado para dosagem de melatonina, quantificada por ELISA. As células MN foram utilizadas
no ensaio de fagocitose, por citometria de fluxo, e a produção de espécies reativas de oxigênio
(EROS), cálcio intracelular e apoptose foram realizadas por fluorimetria. Foram consideradas
diferenças significativas quando p<0,05. O colostro de mulheres com excesso de peso pré-
gestacional apresentou uma maior concentração de melatonina (p<0,05). Os fagócitos MN do
grupo excesso de peso teve um menor índice de fagocitose (p<0,05), no entanto, os estímulos
foram capazes de restaurar a atividade fagocítica para este grupo (p<0,05). A
adiponectina+leptina foi o estímulo que desenvolveu uma resposta mais efetiva, com
restauração dos níveis de EROS, manutenção do cálcio intracelular e elevação do índice de
apoptose para o grupo com excesso de peso (p<0,05). Os dados em conjunto reforçam a
hipótese de que amamentação é benéfica para a saúde da criança, e a manutenção dos níveis
endógenos maternos de adiponectina, leptina e melatonina são essenciais para intensificar a
proteção do colostro. Assim, políticas públicas que apoiam o controle de peso pré-gestacional
devem ser encorajadas.
Palavras-chave: adiponectina, colostro, fagócitos, leptina, melatonina, obesidade.
MORAIS, TC [Hormones regulating energy metabolism and repercussions on the functional
activity of phagocytes from colostrum of pre-gestational overweight women] [Thesis]. São
Paulo: Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo; 2019. Portuguese.
ABSTRACT
Breastfeeding promotion represents an important public health iniciative in worldwide
overweight and obesity management strategies. It is possible that the hormones regulating
energy metabolism, such as adiponectin, leptin and melatonin of human colostrum can benefit
the infant's immune system and minimize the impacts caused by pre-gestational maternal
overweight. As these hormones also have immunomodulatory action, changes in their
concentrations can affect the functional activity of mononuclear cells of human colostrum and
contribute to the increase of neonatal infections. Therefore, the aim of this study is to analyze
the functional activity of colostrum mononuclear phagocytes in women with pregestational
overweight, with absence or presence of adiponectin, leptin and melatonin. Colostrum samples
collected from 109 healthy donors were divided into two groups: the control group and the high
body mass index (BMI) group. Colostrum samples were centrifuged to obtain the cell button
and supernatant. The supernatant was used for melatonin dosing performed by ELISA,
mononuclear cells used to phagocytosis assay, by flow cytometry and production of reactive
species of oxygen, intracellular calcium and apoptosis assays were performed by fluorimetry
using plate reader. Statistically significant differences were considered when p<0.05.
Colostrum of pre-gestational high BMI group had higher concentration of melatonin (p<0.05).
Mononuclear phagocytes of high BMI group had a lower index of phagocytosis (p<0.05).
However, the stimuli restored the phagocytic activity for high BMI group (p<0.05).
Adiponectin+leptin was the stimulus that developed a more effective response, with restoration
of reactive oxygen species levels, maintenance of intracellular calcium and elevation of
apoptosis index (p<0.05) in the high BMI group. These data reinforce that breastfeeding is
beneficial to child's health and maintaining maternal endogenous levels of adiponectin, leptin
and melatonin may increase colostrum protection. Thus, public policies that support pre-
gestational weight control should be encouraged.
Keywords: adiponectin; colostrum; leptin; melatonin; phagocytes; obesity.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS........................................................................................................................ 29
2.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................. 29
2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO.................................................................................... 29
3 MÉTODO............................................................................................................................. 30
3.1 DESENHO DO ESTUDO.................................................................................... 30
3.2 SUJEITOS E TAMANHO AMOSTRAL............................................................. 31
3.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO, EXCLUSÃO E DESCONTINUIDADE............. 32
3.4 DEFINIÇÃO DAS VARIÁVEIS......................................................................... 33
3.5 MÉTODOS DE COLETA E AVALIAÇÃO........................................................ 33
3.5.1 Estado Nutricional Pré-Gestacional......................................................... 33
3.5.2 Idade Gestacional..................................................................................... 34
3.5.3 Procedimento para Obtenção de Células Mononucleares do Colostro..... 35
3.5.4 Dosagem da Melatonina........................................................................... 36
3.5.5 Estímulos Utilizados................................................................................ 36
3.5.6 Ensaio de Fagocitose................................................................................ 36
3.5.7 Análises de Espécies Reativas de Oxigênio.............................................. 37
3.5.8 Dosagem de Cálcio Intracelular................................................................ 37
3.5.9 Ensaio de Apoptose.................................................................................. 38
3.6 ASPECTOS ÉTICOS........................................................................................... 38
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................... 39
4. RESULTADOS................................................................................................................... 40
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA.................................... 40
4.2 DOSAGEM DA MELATONINA NO SOBRENADANTE DO COLOSTRO.....41
4.3 ANÁLISES DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO COLOSTRO.............. 41
5 DISCUSSÃO........................................................................................................................ 47
6 CONCLUSÃO...................................................................................................................... 56
7 REFERÊNCIAS................................................................................................................... 57
ANEXOS................................................................................................................................. 72
ANEXO 1 – QUESTIONÁRIO.................................................................................. 73
ANEXO 2 – TERMO DE CONSCENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO............. 77
ANEXO 3 – PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA............ 79
ANEXO 4 –VALORES BRUTOS DAS MÉDIAS E DESVIO PADRÃO DOS
RESULTADOS DE FAGOCITOSE, ESPÉCIES REATIVAS DE
OXIGÊNIO, NÍVEIS DE CÁLCIO INTRACELULAR E
APOPTOSE.......................................................................................... 83
CURRÍCULO LATTES......................................................................................................... 84
ARTIGO PUBLICADO......................................................................................................... 86
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 – Caracterização da população estudada 40
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos dados apresentados nos gráficos da
sessão Resultados, referentes a atividade funcional dos fagócitos do
colostro humano, segundo o estado nutricional pré-gestacional.
83
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 – Hipótese do estudo 27
Figura 2 – Esquematização das etapas desenvolvidas pela pesquisa 30
Figura 3 – Separação de fases e de população celular do colostro humano 35
Figura 4 –
Níveis de melatonina em pg/mL no sobrenadante do colostro
humano segundo o IMC pré-gestacional
41
Figura 5 – Índice de fagocitose das células mononucleares do colostro humano
de acordo com o IMC materno pré-gestacional
42
Figura 6 – Liberação de espécie reativas de oxigênio pelos fagócitos do
colostro segundo o excesso de peso materno
44
Figura 7 – Níveis de cálcio intracelular liberados no processo de fagocitose
das células mononucleares do colostro em função o estado
nutricional materno pré-gestacional.
45
Figura 8 – Índice de apoptose dos fagócitos MN do colostro humano em
função o estado nutricional materno pré-gestacional
46
LISTAS DE ABREVIATURAS
AdipoRs – Receptores de adiponectina
AMP cíclico – Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA – Análise de Variância
Bcl-2 – B-cell lymphoma protein 2
BSA – Albumina do soro bovino
DHR 123 – Dihidrorhodamina 123
DP – Desvio padrão
ELISA – Ensaio de imunoabsorção enzimática
EROS – Espécies reativas de oxigênio
FcαR – Receptor do fragmento Fc da imunoglobulina alfa
FITC – Isotiocianato de Fluoresceina
FLUO-3 AM – Fluo-3/acetoxymethyl ester
HBSS – Hank’s Balanced Salt Solution
IkB – Quinase do inibidor kappa B
IMC – Índice de massa corporal
JAK/STAT– Janus Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição
Kg – Quilograma
m2 – Metros ao quadrado
LepRs – Receptores de leptina
M1 – Macrófagos de fenótipo M1 da via clássica
M2 – Macrófagos de fenótipo M2
MN – Mononucleares
MT1 – Receptor de melatonina do tipo 1
MT2 – Receptor de melatonina do tipo 2
MT3 – Receptor de melatonina do tipo 3
Myd88 – Fator de diferenciação mielóide 88
NF-kB – Fator nuclear kappa beta
pg/mL – Picogramas por mililitros
RZR/RORα – Receptores órfãos do ácido retinóico
TLR – Receptores Toll-like
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
17
1 INTRODUÇÃO
O sobrepeso (IMC 25,0 a 29,9 Kg/m2) e a obesidade (IMC≥ 30,0 Kg/m2) é um complexo
problema de saúde pública de proporções epidêmicas dado que, a maior parte da população
mundial reside em países em que o excesso de peso mata mais pessoas que o baixo peso (WHO,
2018).
De acordo com a Federação Mundial de Obesidade, a obesidade é considerada uma
doença crônica complexa, recorrente e progressiva. Por isso, ressalta-se a necessidade de ações
com enfoque na prevenção e controle desta epidemia mundial (BRAY et al., 2017). No entanto,
é altamente desafiador o desenvolvimento de estratégias eficazes para o controle do excesso de
peso corporal, devido a sua complexa etiologia que envolve diversos fatores, tais como: fatores
genéticos, ambientais, fisiológicos, culturais, políticos, socioeconômicos e até mesmo as forças
de mercado (MITCHELL e SHAW, 2015; RALSTON et al., 2018).
Destaca-se que os custos diretos e indiretos do manejo da obesidade representam 21%
do total dos gastos médicos, principalmente devido a associação de comorbidades (CAWLEYA
e MEYERHOEFERD, 2012; SEVERIN et al., 2019), gerando assim, custos consideráveis para
o indivíduo e para a comunidade (HAFEKOST et al., 2013).
O excesso de peso eleva o risco para o desenvolvimento de comorbidades, tais como:
asma, desordens musculoesqueléticas e do sono, diabetes mellitus do tipo 2, disfunções
hepáticas e renais, doenças cardiovasculares, infertilidade e até mesmo câncer (câncer de mama,
de endométrio, de vesícula biliar, de ovário, próstata, rim, fígado e colón) (MANNA e JAIN,
2015; ROGERO e CALDER, 2018; WHO, 2018). Por isso, por volta de 2,8 milhões de pessoas
morrem a cada ano, decorrente das consequências do sobrepeso e da obesidade. Essas mortes
18
poderiam ser evitadas por intermédio de medidas preventivas ao excesso de peso corporal
(WHO, 2018).
Ressalta-se que, na maioria dos países, o sexo feminino é o público mais acometido pelo
sobrepeso e a obesidade (NG et al., 2014).
No Brasil, o Estudo Longitudinal de Saúde do Adulto (ELSA-Brasil), um estudo de
coorte com 15.105 servidores públicos de 35 a 74 anos de idade, descreveu que os homens
brasileiros foram os mais acometidos pelo sobrepeso do que as mulheres. No entanto, a
obesidade foi mais frequente no sexo feminino (PINTO et al., 2018). Esse fato, em especial,
tem potencial de ocasionar impactos na saúde das gerações futuras (MITCHELL e SHAW,
2015), pois as mulheres obesas estão cada vez mais expostas a um risco elevado de
complicações metabólicas e desfechos gestacionais adversos, tanto para mulher quanto para a
criança (STEWART et al., 2007; RAMSAY et al., 2012; CATALANO E SHANKAR, 2017).
O excesso de peso gestacional, além de estar correlacionado a diabetes gestacional e
pré-eclâmpsia, pode acarretar transtornos tais como: elevação na pressão arterial, macrossomia
fetal, aumento de parto por via cesárea, aumento da morbidade perinatal e elevação nas taxas
de natimortalidade e mortalidade infantil (DONG et al., 2013; MISSION et al., 2015;
MITCHELL e SHAW, 2015; CNATTINGIUS e VILLAMOR, 2016).
O estado nutricional materno desempenha um papel importante na saúde da criança,
inclusive na predisposição para distúrbios metabólicos. Geralmente, as mulheres com excesso
de peso apresentam maior probabilidade de terem filhos que desenvolvam a obesidade
(WHITAKER, 2004; DONG et al., 2013). Pois o acúmulo dos metabólitos de lipídios,
resultante da obesidade materna, é capaz de ativar na criança uma série de cascatas de
sinalização envolvidas com o estresse metabólico, o que ocasiona complicações que surgirão
mais tarde na vida adulta (DONG et al., 2013).
19
Destaca-se que o período da gestação e do puerpério representa um oportunidade para
intervenção, identificação da obesidade e redução de suas possíveis consequências adversas,
dado que, a própria gestação pode atuar como desencadeante da obesidade, ou como agravante.
Por isso, a prática ideal seria iniciar as atividades profiláticas ao excesso de peso desde o período
anterior a concepção, com incentivo a perda de peso antes da gravidez e ao controle do ganho
de peso gestacional (MATTAR et al., 2009; LEE et al., 2015; MISSION et al., 2015;
CNATTINGIUS e VILLAMOR, 2016). Além do mais, o período que precede a amamentação,
também é o momento de ser encarado como uma fase de oportunidade para implementação de
mudanças no estilo de vida e na dieta. Essas, beneficiam a curto e a longo prazo as mulheres
com sobrepeso e obesidade, assim como seus filhos (MITCHELL e SHAW, 2015).
Enfatiza-se que a promoção ao incentivo a um estilo de vida saudável e ao controle do
peso corporal, deveria ocorrer desde dos estágios iniciais da vida (BRAY et al., 2017). Pois a
nutrição nesses estágios iniciais é fundamental para o desenvolvimento da programação
nutricional e metabólica do indivíduo. Nesse sentido, o leite humano é o alimento mais
recomendado para o recém-nascido (DIETERICH et al., 2013; BADILLO-SUÁREZ et al.,
2017).
O leite materno proporciona inúmeros benefícios, inclusive proteção ao
desenvolvimento de alterações metabólicas, como obesidade e diabetes (BINNS et al., 2016;
BADILLO-SUÁREZ et al., 2017). Dessa maneira, a amamentação representa um importante
caminho com capacidade real de ocasionar impactos na redução do excesso de peso, com
alcance no binômio mãe-filho (MAYER-DAVIS et al., 2006; DIETERICH et al., 2013;
SHARMA et al., 2014; BINNS et al., 2016; BADILLO-SUÁREZ et al., 2017; HORTA et al.,
2018). Entretanto, a obesidade está associada à interrupção precoce da amamentação. As
mulheres com elevado índice de massa corporal, possuem maiores taxas de cessação da
amamentação exclusiva (KRONBORG et al., 2013; MARSHALL et al., 2018).
20
Ademais, estudos relatam que as alterações metabólicas, consequentes do excesso de
peso materno, acarretam em mudanças nos constituintes do colostro e leite humano,
modificando assim a oferta, via amamentação, de diferentes concentrações de hormônios
reguladores do apetite e do metabolismo energético, tais como: a adiponectina e leptina.
Impactando em eventuais repercussões no desenvolvimento infantil (BRONSKY et al., 2011;
ANDREAS et al., 2014; FUJIMORI et al., 2017; GRIDNEVA et al., 2018; KRATZSCH et al.,
2018).
A adiponectina e leptina desempenham papel na programação nutricional das crianças.
Essas adipocinas, juntamente com outros hormônios do leite materno, auxiliam na regulação
do balanço energético e modulam vias neuroendócrinas envolvidas na regulação do peso
corporal. No entanto, os mecanismos não são totalmente esclarecidos. Sabe-se que um tempo
maior de amamentação diminui o risco para o desenvolvimento da obesidade (DONERAY et
al., 2009; SAVINO et al., 2009; NEWBURG et al., 2010; BRONSKY et al., 2011; MITROVA
et al., 2014).
Realça-se que a obesidade é caracterizada por um aumento no percentual do tecido
adiposo, que é considerado um grande órgão com propriedades plásticas e endócrinas (CINTI,
2018). Esse tecido, tem sido historicamente classificado em tecido adiposo branco anabólico e
tecido adiposo marrom catabólico (LEE, MOTTILLO e GRANNEMAN, 2014). Há um grande
esforço dedicado ao desenvolvimento de terapias baseadas no próprio tecido adiposo, com
enfoque na plasticidade das células desse tecido, visando a conversão do tecido adiposo branco
que é acumulador de gordura, em tecido adiposo marrom que dissipa energia (MONTANARI,
POŠĆIĆ e COLITTI, 2017).
O tecido adiposo marrom requer uma vasculatura para fornecer oxigênio, gasto de
energia para ser queimado e um meio de ativação termogênica (LEE, MOTTILLO e
21
GRANNEMAN, 2014). Enquanto que as principais atividades metabólicas do tecido adiposo
branco, inclui a lipogênese, lipólise e secreção de adipocinas (PROENÇA et al., 2014).
Adipocinas é a denominação geral utilizada para as citocinas ou hormônios que são
secretados pelos adipócitos, sendo que as mais abundantes são: a adiponectina e a leptina
(MARSEGLIA et al., 2015; PARK, 2018).
A adiponectina e leptina desenvolvem papel primordial no processo de regulação da
saciedade, elas inibem a alimentação, por diferentes mecanismos, atuando em seus respectivos
receptores (AdipoRs e LepRs) localizados em neurônios no hipotálamo (SUN et al., 2016). Essa
é uma região do cérebro que promove a regulação do processo de homeostase energética,
envolvendo a ação de diversos hormônios e a atividade de neurônios das regiões límbicas e do
córtex cerebral, que atuam no controle do apetite e peso corporal (AHIMA e ANTWI, 2008;
AUSTIN e MARKS, 2009; COCCURELLO e MACCARRONE et al., 2018). Além do mais,
a adiponectina e leptina possuem outras ações fisiológicas, como as descritas a seguir.
A adiponectina possui propriedades anti-inflamatórias, antidiabéticas, antiaterogênicas
e angiogênicas. A insuficiência dessa adipocina ocasiona a resistência da insulina e o
desenvolvimento de inflamação metabólica (MOUZON e CATALO, 2013). Ademais, ela tem
sido implicada na adaptação fisiológica da gravidez normal, como também nas complicações
obstétricas (NIEN et al., 2007). Em grávidas, seus níveis elevados estimulam a absorção de
glicose no músculo esquelético materno, reduzindo a disponibilidade de nutrientes para o feto.
Por isso, os baixos níveis circulantes de adiponectina, observados em gestantes obesas, estão
associados ao aumento do crescimento fetal (AYE et al., 2013).
A leptina também está envolvida em inúmeros processos fisiológicos, incluindo o
processo de homeostasia, regulação de funções neuroendócrinas, angiogênese, formação óssea,
reprodução, homeostase da glicose, metabolismo de ácidos graxos (MANZAR e HUSSAIN,
2011; NEWMAN e GONZALEZ-PEREZ, 2014) e hipertensão relacionada com a obesidade.
22
Além do mais, a exposição para uma hiperleptinemia no início da vida pode predispor a criança
a ter uma hipertensão de início precoce, uma hiperfagia e até mesmo disfunções cardíacas
(TAYLOR et al., 2014). Essa adipocina também está envolvida em processos inflamatórios e
respostas imunológicas (MANZAR e HUSSAIN, 2011; MIEHLE et al., 2012; NEWMAN e
GONZALEZ-PEREZ, 2014).
A proporção entre os níveis destas adipocinas (leptina/adiponectina) é um indicador para
o desenvolvimento de obesidade e síndrome metabólica, dado que é verificado em indivíduos
com sobrepeso e obesidade uma redução nas concentrações endógenas de adiponectina e
aumento nos níveis de leptina (KONSOULOVA et al., 2016; van ZYL et al., 2017). Assim, é
de extrema importância a manutenção do equilíbrio entre os níveis de adiponectina e leptina,
bem como o estudo de componentes bioativos com potencial de restaurar os níveis alterados
dessas adipocinas. Nessa esfera, destaca-se o hormônio melatonina.
A melatonina é uma indolamina produzida principalmente pela glândula pineal,
secretada seguindo variações circadianas e que desempenha um papel fundamental na regulação
temporal dos ritmos biológicos (REITER, 1992; CIPOLLA-NETO et al., 2014; KATO et al.,
2015; PEVET et al., 2017). Ela controla os níveis endógenos de adiponectina e leptina e possui
um importante papel na patogênese da obesidade e síndrome metabólica, atuando tanto como
um agente protetor, como na reversão das desordens ocasionadas pela obesidade
(CORBALÁN-TUTAU et al., 2014; KATO et al., 2015; SZEWCZYK-GOLEC, WOSNIAK e
REITER, 2015; CARDINALI e HARDELAND, 2017).
Evidências científicas destacam que os níveis séricos da melatonina podem estar
reduzidos em indivíduos obesos e a compensação dos déficits dessa indolamina está associada
a efeitos positivos na dislipidemia e na obesidade. Por isso, a melatonina representa um
potencial alvo de abordagem para o controle do excesso de peso e das doenças metabólicas
associadas (AGIL et al., 2011; TAN et al., 2011; SATO et al., 2013; SZEWCZYK-GOLEC,
23
WOSNIAK e REITER, 2015; CHOJNACKI et al., 2016; GROSSHANS et al., 2016; LIU et
al., 2017; FERNÁNDEZ VÁZQUEZ, REITER e AGIL, 2018).
As ações anti-obesogênica da melatonina e os seus efeitos na redução do peso corporal
abrange muitos mecanismos e ações (CIPOLLA-NETO et al., 2014). Sabe-se que a melatonina
faz a regulação da massa corporal e do balanço energético, seguindo variações circadianas, com
elevação em sua concentração no período noturno (ZHANG et al., 1994; CAGNACCI et al.,
2002; ALONSO-VALE et al., 2005). Os receptores MT2, os quais são sítios de ligação da
melatonina estão presentes nas células do tecido adiposo (BRYNDON et al., 2001).
Proporcionando assim, a capacidade da mesma de controlar os ritmos circadianos dos tecidos
adiposos periféricos, resultando em mudanças no peso corporal (LIU et al., 2017). Além do
mais, essa indolamina pode recrutar o tecido adiposo marrom, de modo termogênico, assim
como, possui potencial de inibir a adipogênese (ALONSO-VALE et al., 2009; FERNÁNDEZ
VÁZQUEZ, REITER e AGIL, 2018).
É essencial destacarmos que a melatonina está presente no colostro e leite materno, com
flutuações rítmicas temporais com pico de concentração no período noturno (PONTES et al.,
2006; PONTES et al., 2007; HONORIO-FRANÇA et al., 2013; KATZER et al., 2016). Por
isso, a melatonina via amamentação desempenha um papel importante na sincronização do
neonato com o ritmo biológico materno e eleva a capacidade de leucócitos do colostro de
proteger frente a infecções (ILLNEROVÁ e BURESOVÁ, 1993; FRANÇA et al., 2010;
MORCELI et al., 2013).
Enfatiza-se que ainda há lacunas no conhecimento científico que tange o impacto do
excesso de peso materno nos níveis da melatonina no colostro e leite humano. Mas, sabe-se que
esse hormônio diminui o risco de ocorrência de obesidade precoce (FIGUEROA e AGIL,
2011). Dessa forma, o incentivo a amamentação a livre demanda pode contribuir para a redução
no nível de obesidade das futuras gerações. Assim, a promoção ao aleitamento materno, pode
24
representar um novo caminho de intervenção, visando a criação de contemporâneas abordagens
que utilizem esse consagrado alimento, de modo a intensificar os benefícios para a saúde da
mãe e da criança. Inclusive, no combate a infecções infantis (FRANÇA et al., 2011a, 2011b;
MORCELI et al., 2013; FAGUNDES et al.; 2018) e frente a epidemia da obesidade (MAYER-
DAVIS et al., 2006; DIETERICH et al., 2013; HORTA et al., 2018).
Dentro do contexto abordado, é imprescindível dar ênfase ao fato de que a melatonina,
assim como a adiponectina e leptina, possuem capacidade de modular as respostas
imunológicas, destacando assim a interação entre as vias do metabolismo e do sistema
imunológico (OHASHI, 2010; CERMAKIAN, WESTFALL e KIESSLING, 2014; LUO e LIU,
2016; FRANCISCO et al. 2018).
A adiponectina, leptina e melatonina, além de ativarem leucócitos, desencadeiam o
início de uma importante função da resposta imunológica, que é a progressão do processo
inflamatório, que tem como função primária a destruição dos micro-organismos invasores.
Mecanismo esse, que pode sofrer alterações decorrentes da obesidade e síndrome metabólica
(SANCHEZ-POZO et al., 2003; SHIRSHEV e ORLOVA, 2005; MORCELI et al., 2013;
CERMAKIAN, WESTFALL e KIESSLING, 2014; OHASHI, 2010; LUO e LIU, 2016;
FRANCISCO et al. 2018; ROGERO e CALDER, 2018).
Na presença de micro-organismos invasores, os leucócitos do colostro são fundamentais
para a proteção do lactente. Essas células estão presentes no colostro e leite humano em
quantidades variáveis, dependendo do estágio de lactação, entre elas, destacam-se os
macrófagos e os linfócitos (FIELD, 2005; CHIRICO e GASPARONI, 2006; ISLAM et al.,
2006).
Os macrófagos e linfócitos são células mononucleares, que dão respostas seletivas ao
sistema imunológico e representam, nos humanos, as principais células desse sistema
(POURAHMAD e SALIMI, 2015).
25
Os macrófagos estão presentes em todos os tecidos dos vertebrados e desempenham
papéis-chave no reconhecimento e eliminação bacteriana, bem como na polarização da resposta
imunológica inata e adaptativa. Dado que, essas células fagocitam bactérias e secretam
mediadores pró-inflamatórios e antimicrobianos (HIRAYAMA et al., 2017).
No colostro, a presença de microrganismos estimula os macrófagos, via receptores FcαR
(FRANÇA et al., 2011b), que englobam a partícula invasora e durante o processo de fagocitose,
há o desenvolvimento da atividade microbicida, estresse oxidativo e consequente aumento da
liberação de espécies reativas de oxigênio (EROS) (FRANÇA-BOTELHO et al., 2006;
FRANÇA et al., 2011a; MORCELI et al., 2013; FAGUNDES et al. 2018).
As EROS são moléculas que podem ou não conter elétrons não pareados, tais como:
ânion superóxido (•O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (•OH)
(DJORDJEVIC, 2004; McMURRAY et al., 2016). A liberação de EROS é um dos últimos
eventos no decorrer da resposta imunológica inata e tem função essencial para o processo de
morte do microrganismo invasor (DJORDJEVIC, 2004). A ativação da atividade microbicida,
via EROS, é um provável mecanismo de proteção adicional para os lactentes, frente a eventuais
infecções no decorrer dessa fase da vida, que pode persistir até o sistema imunológico do bebê
estiver desenvolvido (FRANÇA et al., 2011a; MORCELI et al., 2013; FAGUNDES et al.;
2018).
Em relação aos linfócitos, esses são células do sistema imunológico, de aparência
uniforme e com funções variadas, tais como: produção de anticorpos, morte direta mediada por
células infectadas por vírus e células tumorais e regulação da resposta imunológica. Os
linfócitos incluem as células: linfócitos B, linfócitos T e células “natural killer” (LAROSA e
ORANGE, 2008).
No colostro a maioria dos linfócitos são as células T, mas os linfócitos B e as células
natural killer também são encontrados. Essas células, no colostro, apresentam uma ampla
26
função, atuam através de uma fina rede de interação e influenciam a resposta imunológica inata
e a adaptativa, principalmente pela produção de citocinas e secreção de imunoglobulinas
(FIELD, 2005; CIARDELLI et al., 2008; FRANÇA et al., 2010; TREND et al., 2015; ISLAM
et al., 2006). Assim, o leite humano além de promover no lactente a imunidade passiva, ele
também modula diretamente o desenvolvimento do sistema imunológico da criança
(GAROFALO e GODMAN, 1999).
Apesar de haver estudos na literatura científica que descrevem os constituintes do
colostro humano, o impacto proveniente de alterações metabólicas do excesso de peso materno
ainda é um caminho pouco explorado, principalmente no que tange a atividade funcional das
células deste primordial alimento.
Mas, sabe-se que o sobrepeso e a obesidade materna acarreta em mudanças nos
constituintes bioquímicos e imunológicos do colostro, alterando as concentrações de glicose,
conteúdo de calorias, gorduras e de Imunoglobulina A secretória (FUJIMORI et al., 2015).
Além de modificar as concentrações de hormônios imunomoduladores como a adiponectina e
leptina (ANDREAS et al., 2016; FUJIMORI et al. 2017; FIELDS et al., 2017).
Nessa conjuntura, hipotetizou-se que as alterações hormonais do colostro decorrentes
do excesso de peso materno pré-gestacional, refletem na atividade funcional das células
mononucleares do colostro, comprometendo a proteção do lactente.
27
Figura 1 – Hipótese do estudo
Dentro do exposto, observa-se o enredamento envolvido na temática. Assim, enfatiza-
se que a obesidade não é simplesmente sobre peso corporal ou imagem corporal. Trata-se de
um assunto altamente complexo e de múltiplos determinantes. Por isso, são necessários o
desenvolvimento de novas narrativas que possam colaborar para uma construção de uma
resposta mais abrangente a obesidade (RASTON et al., 2018).
Excesso de peso pré-
gestacional
Alterações de hormônios reguladores do
metabolismo e imunomoduladores
Mudanças na atividade funcional das
células mononucleares do colostro
COLOSTRO
HUMANO
Adiponectina
Leptina
Melatonina
Fagócitos mononucleares do
colostro
Estímulo exógeno
Restauração da atividade
celular
28
O colostro e leite humano representam esse novo caminho. Pois as avaliações das
repercussões dos hormônios reguladores do metabolismo energético, sob atividade das células
mononucleares do colostro, são peças essenciais para o embasamento de eventuais estratégicas
que protejam a saúde materno-infantil. Por isso, o objetivo desse estudo foi avaliar a ação da
adiponectina, leptina e melatonina sob as células mononucleares do colostro humano, em
função do excesso de peso da mulher, no período pré-concepção.
Espera-se que os resultados desse estudo possam colaborar com futuras pesquisas no
campo de ciências de implementação, principalmente com pesquisas que utilizem o próprio
colostro ou leite humano, via amamentação em horários estratégicos, como ferramenta para a
redução da incidência e prevalência da obesidade. Sendo assim, um econômico e sustentável
caminho para ações benéfica frente ao impacto do sobrepeso e obesidade.
29
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL:
Avaliar a ação da adiponectina, leptina e melatonina na atividade funcional dos
fagócitos mononucleares do colostro, segundo o índice de massa corporal (IMC) pré-
gestacional.
2.2 OBJETIVO ESPECÍFICO:
✓ Descrever os níveis de melatonina no colostro humano segundo o IMC materno pré-
gestacional;
✓ Analisar nos fagócitos mononucleares do colostro de mulheres com sobrepeso e
obesidade, a fagocitose e o burst oxidativo com estímulo da adiponectina, da leptina e da
melatonina;
✓ Analisar os mecanismos intracelulares de modulação dos fagócitos mononucleares do
colostro na presença da adiponectina, leptina e melatonina, através da liberação do cálcio
intracelular e indução de apoptose.
30
Pseudo-coorte com análises laboratoriais
Puérperas - HU/USP, São Paulo, Brasil
TCLE
Coleta de dados materno-infantil
Caracterização da população
EutróficoIMC:18,5 a 24,99 kg/m2
Excesso de PesoIMC: ≥25,00 kg/m2
Coleta de Colostro
Análises laboratóriais
Separação de fases do colostro
Sobrenadante do colostro
Dosagem hormonal (melatonia)
Células mononucleares
Macrófagos
- Fagocitose
-EROS
- Ca+2 intracelular
- Apoptose
3 MÉTODO
3.1 DESENHO DO ESTUDO
Figura 2 – Esquematização das etapas desenvolvidas pela pesquisa.
31
Foi realizado um estudo do tipo pseudo-coorte, seguido de análises laboratoriais
considerando-se o estado nutricional materno pré-gestacional (eutrófico e excesso de peso).
As mulheres participantes tiveram parto no Hospital Universitário (HU) da
Universidade de São Paulo, São Paulo – SP, no período de 2016 a 2017. As mulheres foram
informadas sobre os objetivos da pesquisa e consultadas sobre a disponibilidade em responder
a um questionário (anexo 1) e em doar uma amostra de colostro. A coleta foi realizada por
ordenha manual, nos intervalos entre duas mamadas, no período diurno, correspondente as
primeiras 48 a 72 horas após o parto.
Para as análises das amostras, o projeto contou com estrutura e equipamentos
disponíveis no Laboratório de Imunologia da Relação Materno-Infantil e o de
Cronoimunomodução, da Universidade Federal do Mato-Grosso-UFMT, localizados no
Campus Universitário do Araguaia.
3.2 SUJEITOS E TAMANHO AMOSTRAL
As amostras de colostro foram obtidas de nutrizes que realizaram seus partos no
Hospital Universitário (HU) da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, no período de 2016
e 2017. Os colostros coletados foram classificados de acordo com o IMC materno pré-
gestacional e divididos em dois grupos: grupo eutrófico (IMC entre 18,5 a 24,9 kg/m2) e grupo
excesso de peso (IMC ≥ 25,0 kg/m2).
O tamanho amostral proposto nesse estudo foi baseado em amostra de conveniência. O
estudo foi constituído por 109 puérperas, distribuídas em: 48 mulheres no grupo eutrófico e 61
no grupo excesso de peso. O Poder do teste foi calculado de acordo com os critérios citados por
32
Armitage e Berry (1987). O poder do Teste utilizado neste estudo foi de 80%, considerando o
nível de significância de 5%, o número amostral usado em cada experimento e as diferenças
encontradas entre os grupos.
3.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO, EXCLUSÃO E DESCONTINUIDADE
Foram elegíveis como possíveis doadoras as nutrizes caracterizadas nos grupos
experimentais: puerpéras com peso pré-gestacional normal (grupo eutrófico) e com sobrepeso
ou obesidade pré-gestacional (grupo excesso de peso), sendo estabelecidos os seguintes
critérios de inclusão: idade de 18 a 35 anos; peso pré-gestacional conhecido ou medido até o
final da 13ª semana gestacional; idade gestacional no parto entre 37 a 416/7 semanas; reações
sorológicas negativas para hepatite, HIV e sífilis; ter realizado assistência pré-natal; não ter
restrição alimentar; assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Critérios de exclusão: diabetes gestacional, doença hipertensiva da gravidez, gravidez gemelar,
malformações fetais e parto antes da 36ª semana de gestação.
Critérios de descontinuidade: desistência da mãe após aceite, escassez de colostro, mastite ou
rachaduras no seio.
33
3.4 DEFINIÇÃO DAS VARIÁVEIS:
As seguintes variáveis foram investigadas: presença (sim) ou ausência (não) de
tabagismo, diabetes mellitus (prévia ou gestacional), anemia, consumo de álcool, hipertensão
arterial; idade gestacional, em semanas completas; IMC pré-gestacional (peso normal e excesso
de peso) e IMC na última consulta de pré-natal; ganho de peso total durante a gestação,
categorizado em insuficiente, adequado e excessivo.
Foram variáveis independentes do estudo: Grupos experimentais: eutrófico (controle) e
excesso de peso classificado de acordo com o IMC pré-gestacional. As variáveis dependentes
do estudo foram: determinação da atividade funcional dos fagócitos mononucleares do colostro.
3.5 MÉTODOS DE COLETA E AVALIAÇÃO
3.5.1 Estado Nutricional Pré-Gestacional
Para determinar o estado nutricional pré-gestacional, foi utilizado o índice de massa
corporal pré-gestacional. A definição do IMC pré-gestacional foi obtida por meio da fórmula:
índice de massa corpórea = peso pré-gestacional (kg)/altura (m2). Foi utilizado o peso pré-
gestacional referido pela gestante durante a primeira consulta de pré-natal, ou, na ausência dessa
informação, foi utilizado o peso obtido em alguma consulta realizada até a 13ª semana de
gestação. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o peso aferido nesse período tem sido
34
utilizado como proxy do peso pré-gestacional, possibilitando uma estimação do estado
nutricional pré-gestacional.
A classificação do IMC foi definida de acordo com o “Institute of Medicine dos Estados
Unidos” (IOM, 2009), utilizando como referência as seguintes categorias: baixo peso
(IMC<18,5 kg/m2); eutrófica (IMC entre 18,5 a 24,9 kg/m2); sobrepeso (IMC entre 25,00 a
29,99 kg/m2) e obesidade (IMC≥30 kg/m2). Para os experimentos foram utilizadas a
classificação de eutrófica (IMC entre 18,5 a 24,9 kg/m2) e excesso de peso (IMC≥25,0 kg/m2).
O peso no momento da coleta e a altura foram mensurados em duplicata de acordo com
protocolo padronizado (FRISANCHO, 1990). A altura adotada foi a referida na primeira
consulta de pré-natal, confirmada pela que altura aferida com estadiômetro da marca Seca® com
precisão de 1mm e capacidade de 205 cm.
3.5.2 Idade Gestacional
A idade gestacional foi calculada utilizando, primeiramente, o resultado da ultra-
sonografia com data inferior a 20 semanas. Para gestantes que tiverem ultrassonografia maior
que 20 semanas, a idade gestacional foi calculada fazendo-se a média entre a idade informada
pela ultra-sonografia e aquela calculada pela data da última menstruação. Para as gestantes que
não possuírem ultra-sonografia, a idade gestacional foi calculada somente a partir da data da
última menstruação.
35
3.5.3 Procedimento para Obtenção de Células Mononucleares do Colostro
Foram coletados aproximadamente 5mL de colostros, no período diurno, até 72 horas
após o parto. As amostras foram centrifugadas por 10 min (160 g, 4°C) para separação de fases:
pellet celular, sobrenadante e gordura. A população celular foi separada por gradiente de
concentração, Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden). As células mononucleares foram
ressuspendidas em meio 199 (Gibco, Grand Island, USA), ajustadas para concentração de
1x106 células por mL e o sobrenadante foi armazenado para posterior dosagem hormonal
(FRANÇA et al., 2011a; MORCELI et al., 2013; FAGUNDES et al., 2018).
Figura 3 – Separação de fases e de população celular do colostro humano.
(A) (B)
(A)Colostro humano após a centrifugação para separação de fases. (B) Botão celular diluído em tampão, após a
centrifugação com Ficool-Paque para obtenção das células mononucleares.
Gordura
Sobrenadante
Botão celular
Células
Mononucleares
Células
Polimorfonucleares
Ficoll-Paque
36
3.5.4 Dosagem da Melatonina
A melatonina foi quantificada no sobrenadante do colostro humano, por meio do kit
de ELISA da Immuno-Biological Laboratories (IBL, Hamburg). A melatonina do sobrenadante
foi extraída por cromatografia de afinidade e concentrada por “speed-vacuum”, seguindo as
orientações do fabricante. Os resultados foram descritos em pg/mL de acordo com descrito por
Pontes e colaboradores (2006) e Honório-França e colaboradores (2013).
3.5.5 Estímulos Utilizados
Para as análises as células mononucleares foram tratadas na presença e na ausência dos
hormônios: adiponectina humana (Sigma, ST Loius, USA), leptina humana (Thermo Fisher,
Carlsbad, USA) e melatonina (Sigma, ST Loius, USA) na concentração de 100ng/mL.
Constituindo os seguintes grupos de tratamento: células tratadas com meio 199 (controle
negativo), adiponectina, leptina, melatonina, adiponectina+leptina e leptina+metatonina.
3.5.6 Ensaio de Fagocitose
As células mononucleares foram incubadas (por 2 h, a 37°C e sob agitação contínua)
com Zymosan pHrodo Green® (Thermo Fisher, Carlsbad, USA), na presença e ausência dos
estímulos, de acordo com as instruções do fabricante. O pHrodo Green® emitem fluorescência
37
verde em pH ácido durante o processo de fagocitose. Após o período de incubação, foram
analisados 10 mil eventos por citometria de fluxo, utilizando FACSCalibur® (BD Biosciences,
San Jose, USA).
3.5.7 Análises de Espécies Reativas de Oxigênio
A dihidrorhodamina 123 (DHR 123) é um composto que emite fluorescência no interior
celular após ser oxidado pelas espécies reativas de oxigênio. A intensidade de fluorescência
emitida é proporcional a produção das espécies reativas de oxigênio. Sendo esse método mais
sensível para detecção de OH. e H2O2. Por isto, os fagócitos foram incubados com DHR123
(5µ/mL) (Sigma, ST Loius, USA), na presença e ausência dos estímulos e de 0,5mg/mL
Zymosan A (Sigma, ST Loius, USA), seguindo protocolo padronizado para o tipo de
experimento (LIEBERMAN et al. 1996; RICHARDSON et al. 1998; RADOGNA et al.,
2009a). A intensidade de fluorescência foi medida em no leitor de placa Fluoroskan Ascent
FL®, com os filtros de 485 nm excitação e 538nm de emissão. Os resultados foram expressos
em intensidade de fluorescência de DHR 123.
3.5.8 Dosagem de cálcio intracelular
As células foram incubadas na ausência ou presença de Zymosan A (Sigma, ST Loius,
USA) e dos estímulos. Sendo adicionado 5µL de solução de Fluo-3 AM (Sigma, ST Loius,
USA) e incubado por 2 horas a 37°C (BURCHIEL et al., 2000; FAGUNDES et al. 2018). As
38
células foram lavadas e ressuspendias em HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution) contendo
BSA. A intensidade de fluorescência foi medida pelo leitor de placa Fluoroskan Ascent FL®,
com os filtros de 485 nm excitação e 538nm de emissão. Os resultados foram expressos em
intensidade de fluorescência do Fluo 3 AM.
3.5.9 Ensaio de Apoptose
As células mononucleares (na concentração de 1x106 células/mL) foram previamente
incubados por 2 horas, na presença ou ausência de 0.5mg/mL Zymosan A from Saccharomyces
cerevisiae (Sigma, ST Loius, USA) e dos estímulos. A apoptose, foi analisada utilizando FITC
Annexin V (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium). A intensidade de fluorescência foi
medida pelo leitor de placa Fluoroskan Ascent FL®, usando os filtros de 485 nm excitação e
538nm de emissão. Os resultados foram expressos em intensidade de fluorescência do FITC-
Annexin V.
3.6 ASPECTOS ÉTICOS
As considerações éticas foram baseadas no uso do material biológico para fins
científicos, com sigilo da identidade da nutriz, livre de coação ou conflito de interesses da
instituição ou de pessoas envolvidas na pesquisa. As coletas respeitaram os protocolos técnicos
do serviço envolvido. As nutrizes foram previamente informadas e o material somente foi
coletado, ou utilizado, sob o consentimento em formulário específico (Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido - TCLE) (Anexo 2), conforme resolução 466/2012 do Conselho Nacional
39
de Saúde. Esse trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Saúde
Pública, juntamente com o do Hospital Universitário da USP (CAAE 46643515.0.3001.0076)
(Anexo 3).
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi executada respeitando os pressupostos determinados pelos
resultados, características e comportamento das variáveis de estudo, dependendo da
distribuição normal ou não normal dos dados. Os resultados foram apresentados como média
(±desvio padrão) ou mediana. Foram utilizados o teste de normalidade Shapiro-Wilk ou
D’Agostino e para a comparação entre os grupos foi utilizado o Teste de Mann-Whitney ou a
análise de Variância (ANOVA) seguido pelo teste de Tukey. Foram consideradas diferenças
significativas quando p<0,05.
40
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA
Houve diferença estatística (p<0,05) entre o IMC pré-gestacional e o IMC ao final da
gestação entre os grupos eutróficos e excesso de peso, essas e outras caraterísticas materno-
infantil foram descritas na Tabela 01.
Tabela 01– Caracterização da população estudada.
# Diferença estatística (p<0,05) entre o grupo eutrófico e excesso de peso (ANOVA, seguido pelo teste de Tukey).
Variáveis Eutrófico
n=48 (100,00%)
Excesso de Peso
n=61(100,00%)
Idade (anos) (Média±DP) 24,77±5,2 26,72±5,16
Número de Gestação (Média±DP) 2,08±1,08 2,36±1,17
Número de Paridade (Média±DP) 1,85±0,95 2,06±1,08
Número de Abortos (Média±DP) 0,23±0,56 0,33± 0,57
Peso Materno Pré-Gestacional (Média±DP) 54,86±6,72 77,39±10,51
Altura materna em metros (Média±DP) 1,58±0,06 1,61±0,06
Peso Gestacional Final (kg) (Média±DP) 66,88±7,76 86,95±9,68
IMC Pré-Gestacional em kg/m2 (Média±DP) 21,78±1,88 29,64±3,46#
IMC ao Final da Gestação kg/m2 (Média±DP) 26,68±2,57 33,57±3,45#
Ganho de peso gestacional 12,09±4,39 9,99±4.98#
Tipo de Parto
Normal 32 (66,67%) 30 (49,18%)
Cesárea 15 (31,25%) 27 (44,26%)
Fórceps 1 (2,08%) 4 (6,56%)
Idade Gestacional em semanas (Média±DP) 38,81±1,26 39,08±1,23
Sexo do bebê
Feminino 25 (52,08%) 28 (44,00%)
Masculino 23 (47,92%) 33 (56,00%)
Peso ao Nascer em gramas (Média±DP) 3141,25±337,38 3336,64±427,62
Estatura em centímetros (Média±DP) 48,33±1,48 48,91±2,01
Classificação do Recém-Nascido
Pequeno para Idade Gestacional 3 (6,25%) 7 (11,47%)
Adequado para Idade Gestacional 43 (89,58%) 52 (85,25%)
Grande para Idade Gestacional 2 (4,17%) 2 (3,28%)
Apgar
1 minuto (Mediana/ máximo-minimo) 8 (7-10) 8 (7-10)
5 minutos (Mediana/ máximo-minimo) 10 (8-10) 10 (8-10)
10 minutos (Mediana/ máximo-minimo) 10 (9-10) 10 (9-10)
Perímetro Cefálico em cm (Média±DP) 34,11±1,29 33,94±3,64
Perímetro Torácico em cm (Média±DP) 32,80±1,39 33,03±3,60 Perímetro Abdominal em cm (Média±DP) 31,88±2,22 32,10±3,47
41
Sobrenadante do colostro
4.2 DOSAGEM DA MELATONINA NO SOBRENADANTE DO COLOSTRO
Foram descritos os níveis de melatonina do sobrenadante do colostro de mulheres
eutróficas e com excesso de peso pré-gestacional (Figura 4). As concentrações médias de
melatonina foram maiores (27,14±2,26 pg/mL) no grupo excesso de peso, quando comparado
ao controle (15,60 ±2,66 pg/mL) (p<0,05). Os níveis de adiponectina e de leptina do colostro
não foram dosados, dado que seus valores são claramente descritos na literatura científica em
função do IMC materno.
Figura 4 – Níveis de melatonina em pg/mL no sobrenadante do colostro humano segundo o
IMC pré-gestacional.
Os dados foram avaliados pelo Teste de Mann-Whitney, os resultados foram expressos em média ± DP (n=10 por
grupo), indicado como a seguir: *Diferença estatística (p<0,05) em relação ao grupo controle.
4.3 ANÁLISES DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO COLOSTRO
O percentual de fagocitose das células mononucleares do colostro segundo o estado
nutricional materno no período pré-gestacional é descrito na Figura 5.
0
5
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Eutrófico Excesso de Peso
Mel
ato
nin
a (
pg
/mL
) *
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MEIO 199 MLT LEP MLT+LEP
Eutrófico
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0
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MEIO 199 ADIPO LEP ADIPO+LEP
Eutrófico
Excesso de Peso
Células +Zymosan
Figura 5 – Índice de fagocitose das células mononucleares do colostro humano de acordo com
o IMC materno pré-gestacional.
(A)
(B)
(C)
(A) Percentual de fagocitose das células MN na presença ou ausência de adiponectina e/ou leptina ou (B) tratadas
na presença ou ausência de melatonina e/ou leptina. (C) Imagem de microscopia de fluorescência da fagocitose de
partícula de Zymosan pHrodo® Green pelas células MN (aumento: 100x). Os resultados foram avaliados por
ANOVA e teste de Tukey, os dados foram expressos em média ± DP (n=10 por tratamento), indicado como a
seguir: *Diferença estatística (p<0,05) em relação ao mesmo grupo tratado com meio 199 (controle). #Diferença
estatística (p<0.05) intragrupo considerando o mesmo tratamento.
Índ
ice
de
fag
oci
tose
(%
)
Células +Zymosan
#
* * *
Índ
ice
de
fag
oci
tose
(%
)
* * * *
#
43
Os fagócitos MN do colostro de mulheres com excesso de peso pré-gestacional
apresentaram redução no índice de fagocitose (p<0,05) (Figura 5). No entanto, os hormônios
adiponectina e leptina restauraram o percentual de fagocitose apenas para o grupo com elevado
IMC materno (p<0,05) (Figura 5A), enquanto que a melatonina elevou o índice de fagocitose
tanto para o grupo eutrófico, quanto para o grupo excesso de peso (p<0,05) (Figura 5B). A
associação dos hormônios adiponectina+leptina (Figura 5A) e melatonina+leptina (Figura 5B)
restabeleceu o índice de fagocitose das células MN do grupo com excesso de peso, para valores
similares ao do grupo eutrófico (p<0,05).
Durante o processo de fagocitose as células liberaram espécies reativas de oxigênio,
conforme descrito na Figura 6. Nas células não tratadas, os níveis de espécies reativas de
oxigênio foram menores para o grupo excesso de peso em relação ao grupo eutrófico (p<0,05).
Apenas a leptina aumentou as concentrações de radicais livres para o grupo excesso de peso
(p<0,05) (Figura 6A). No entanto, a ação em conjunto das adipocinas adiponectina+leptina
elevou os níveis de radicais livres para o grupo excesso de peso, restaurando os níveis de EROS
a valores semelhantes ao do grupo eutrófico (p<0,05) (Figura 6A). Enquanto que, a leptina não
elevou os níveis de EROS na presença de melatonina (p<0,05) (Figura 6B).
44
0
10
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MEIO 199 ADIPO LEP ADIPO+LEP
Eutrófico
Excesso de peso
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MEIO 199 MLT LEP MLT+LEP
Eutrófico
Excesso de peso
Figura 6 – Liberação de espécie reativas de oxigênio pelos fagócitos do colostro segundo o
excesso de peso materno.
(A)
(B)
Liberação de espécies reativas de oxigênio pelos fagócitos MN na presença ou ausência de partículas de Zymosan
e dos hormônios: (A) adiponectina e/ou leptina ou (B) melatonina e/ou leptina. Os resultados foram avaliados por
ANOVA e teste de Tukey, os dados foram expressos em média ± DP (n=10 por tratamento), indicado como a
seguir: *Diferença estatística (p<0,05) em relação ao mesmo grupo, tratado com meio 199 (controle). # Diferença
estatística (p<0,05) intragrupo considerando o mesmo tratamento.
Células +Zymosan
Células +Zymosan
# #* *
#
#*
#
Inte
nsi
da
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de
Flu
ore
scên
cia
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R1
23
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cia
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R1
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MEIO 199 MLT LEP MLT+LEP
Eutrófico
Excesso de Peso
0
2
4
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MEIO 199 ADIPO LEP ADIPO+LEP
Eutrófico
Excesso de peso
O excesso de peso materno anterior a gestação não influenciou a liberação de cálcio
intracelular pelos fagócitos MN do colostro humano (p>0,05), como ilustrado na Figura 7. Mas,
a adiponectina elevou (p<0,05) e a leptina reduziu os níveis de cálcio intracelular apenas para
o grupo excesso de peso (Figura 7A). A melatonina, não alterou as concentrações de cálcio
intracelular em nenhum dos grupos estudados (p>0,05) (Figura 7B).
Figura 7 – Níveis de cálcio intracelular liberados no processo de fagocitose das células
mononucleares do colostro em função o estado nutricional materno pré-gestacional.
(A)
(B)
Cálcio intracelular liberados pelos fagócitos MN do colostro humano na presença ou ausência de partículas de
Zymosan e dos hormônios: (A) adiponectina e/ou leptina ou (B) melatonina e/ou leptina. Os resultados foram
avaliados por ANOVA e teste de Tukey, os dados foram expressos em média ± DP (n=10 por tratamento), indicado
como a seguir: *Diferença estatística (p<0,05) em relação ao mesmo grupo tratado com meio 199 (controle). #Diferença estatística (p<0,5) intragrupo considerando o mesmo tratamento.
Células+Zymosan
Inte
nsi
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de
de
Flu
ore
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Células+Zymosan
#*
#*
#*
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-3 A
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MEIO 199 MLT LEP MLT+LEP
Eutrófico
Excesso de Peso
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MEIO 199 ADIPO LEP ADIPO+LEP
Eutrófico
Excesso de Peso
O elevado IMC materno pré-gestacional não alterou o índice de apoptose dos fagócitos
mononucleares do colostro humano (Figura 8). No entanto, o efeito sinérgico da
adiponectina+leptina aumentou os níveis de apoptose para o grupo com excesso de peso pré-
gestacional (p<0,05) (Figura 8A). Enquanto que, a melatonina reduziu o índice de apoptose
para o grupo excesso de peso em relação ao controle (p<0,05). A associação da
melatonina+leptina, não alterou os níveis de cálcio intracelular (p>0,05) (Figura 8B).
Figura 8 – Índice de apoptose dos fagócitos MN do colostro humano em função o estado
nutricional materno pré-gestacional.
(A)
(B)
Índice de apoptose dos fagócitos MN do colostro na presença ou ausência de partículas de Zymosan e dos
hormônios: (A) adiponectina e/ou leptina ou (B) melatonina e/ou leptina. Os resultados foram avaliados por
ANOVA e teste de Tukey, os dados foram expressos em média ± DP (n=10 por tratamento), indicado como a
seguir: *Diferença estatística (p<0,05) em relação ao mesmo grupo tratado com meio 199 (controle). #Diferença
estatística (p<0,05) intragrupo considerando o mesmo tratamento.
Células+Zymosan
Células+Zymosan
Inte
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C-A
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47
5 DISCUSSÃO
A partir dos resultados desta pesquisa, observou-se que os fagócitos do colostro tiveram
menor índice de fagocitose em função do excesso de peso pré-gestacional. Esse fato ilustra que
o impacto da obesidade materna para a criança não se finaliza com o nascimento. É possível
que o nível de adiposidade materna altere as concentrações dos constituintes do leite humano e
assim, modifique inclusive a programação do apetite dos lactentes (KUGANANTHAN et al.,
2017), dado que a amamentação também representa um link metabólico entre as mães e seus
bebês (SAVINO et al., 2012).
As adipocinas do leite humano influenciam no lactente o desenvolvimento dos
constituintes corpóreos durante o primeiro ano de vida, que é um período crítico da
programação nutricional infantil (GRIDNEVA et al., 2018). Dessa forma, a desregulação nos
níveis das adipocinas nos estágios iniciais da vida pode elevar o risco de desenvolvimento de
obesidade e distúrbios metabólicos nas fases posteriores dos ciclos de vida (KRATZSCH et al.,
2018). Por isso, torna-se cada vez mais essencial a avaliação de como o IMC materno e os
hormônios associados às doenças metabólicas estão relacionadas aos componentes bioativos do
leite humano (YOUNG et al., 2017).
A origem das adipocinas do leite materno é difícil de ser uniformemente definida, visto
que as suas concentrações são dependentes de inúmeros fatores, elas podem ser influenciadas
pelos níveis séricos ou ser oriundas dos tecidos periféricos e até mesmo do próprio tecido
mamário (KRATZSCH et al., 2018). Outro fator importante que também influencia nas
concentrações das adipocinas do leite humano é o estado nutricional materno, esse altera
mudanças nos níveis de adipocinas, tais como: adiponectina e leptina (FUJIMORI et al., 2017;
KRATZSCH et al., 2018).
48
As concentrações da adiponectina e da leptina no colostro e leite humano, em função do
estado nutricional materno são divulgadas na literatura científica (SAVINO et al., 2012;
ANDREAS et al., 2016; FUJIMORI et al., 2017; CHAN et al., 2018; GRIDNEVA et al., 2018;
KRATZSCH et al., 2018). Aparentemente, o excesso de peso materno pode estar associado ao
aumento das concentrações da adiponectina (MARTIN et al., 2006; FUJIMORI et al., 2017) e
da leptina no colostro e leite humano (ANDREAS et al. 2016; DE LUCA et al. 2016; FIELDS
et al., 2017; FUJIMORI et al., 2017, CHAN et al., 2018).
Essas alterações possivelmente, descrevem um mecanismo materno-infantil de controle
do excesso de peso corpóreo, pois no primeiro ano de vida, a medida que os níveis de
adiponectina do leite se elevam, o peso do lactente e a circunferência abdominal diminuem
significativamente. Ilustrando assim, o efeito regulador da amamentação, via adiponectina, sob
a adiposidade infantil no primeiro ano de vida (MOHAMAD et al., 2018). Semelhante também
acontece com a leptina.
Os níveis de leptina tendem a aumentar em função da elevação da adiposidade, de modo
a controlar a homeostase energética, limitando o desenvolvimento da obesidade (AHIMA et al.
1996). As elevadas concentrações de leptina no leite materno também estão associadas a
redução da relação peso/comprimento no primeiro ano de vida da criança (CHAN et al., 2018).
Embora os estudos acima citados abordem os mecanismos materno-infantil que
influenciam o controle do peso corpóreo, via adipocinas da amamentação, ainda há lacunas no
conhecimento que engloba a temática tratada; principalmente, no que faz referência a variação
de marcadores do ritmo circadiano, como a melatonina do colostro ou leite humano segundo o
estado nutricional materno.
Temos que destacar que nos mamíferos, há uma sinalização entre este importante
marcador do ritmo circadiano - a melatonina - e o metabolismo de lipídios, sendo assim, um
hormônio eficaz na prevenção e tratamento da obesidade (AGIL et al., 2011; LIU et al., 2018).
49
Esse fato, torna ainda mais instigante a constatação descrita nos resultados desta atual pesquisa,
no que se refere ao aumento dos níveis de melatonina no colostro do grupo excesso de peso
(27,14 pg/mL), em relação ao grupo eutrófico (15,60 pg/mL), ambos coletados no período
diurno.
Pesquisas descrevem níveis variados da melatonina no colostro coletado no período
diurno: 4,16 pg/mL (PONTES et al., 2006), 4,2 pg/mL (PONTES et al., 2007),
aproximadamente 15 pg/mL (HONORIO-FRANÇA et al., 2013) e 1,5 pg/mL (KATZER et al.,
2016). As divergências nos valores descritos na literatura, possivelmente deve-se as
características próprias de cada população estudada, pois a melatonina é um marcador do ritmo
circadiano e seus níveis variam de acordo com as características sazonais (KARAMITRI e
JOCKERS, 2019).
Apesar de haver lacunas no conhecimento a respeito das concentrações da melatonina
no colostro segundo o excesso de peso materno, sabe-se que no sangue, os níveis de melatonina
estão reduzidos em indivíduos obesos (SATO et al. 2013; CHOJNACKI et al. 2016).
Desta forma, é possível inferirmos que a elevação nos níveis de melatonina no colostro
de mulheres com excesso de peso, também representa um dos possíveis mecanismos protetores
do aleitamento materno ao desenvolvimento do sobrepeso e obesidade no lactente. Ela é
responsável, em partes, pela regulação do fluxo de energia através da ativação do tecido adiposo
marrom. Assim, as reduções nos níveis de melatonina podem levar a uma cronodisrupção e
desencadear a obesidade (CIPOLLA-NETO et al., 2014).
Por isto, a promoção da amamentação a livre demanda, o que inclui o incentivo a
amamentação noturna- período no qual há uma maior concentração de melatonina no colostro
e leite humano- (HONORIO-FRANÇA et al., 2013; KATZER et al., 2016), poderia ser
considerada também uma ferramenta nas campanhas públicas que visam a redução do
sobrepeso e obesidade populacional.
50
É fundamental lembrarmos que os hormônios adiponectina, leptina e melatonina
modulam as respostas imunológicas em leucócitos mononucleares (LOFFREDA et al. 1998;
HONORIO-FRANÇA et al., 2013; MORSHEDI et al., 2013; PIRES-LAPA et al., 2013;
DAYAKAR et al. 2016). Desse modo, essa população celular foi utilizada para verificar o
possível impacto do excesso de peso materno sob a atividade funcional dessas células.
Os fagócitos mononucleares do colostro foram incubados com partículas de Zymosan.,
que por ser um derivado fúngico, possui β-glucanas em sua composição que se liga nos
fagócitos via receptores Dectin-1, receptores Toll-like (TLR) e Myd88 (fator de diferenciação
mielóide 88), além de ativar o fator de transcrição NF-kB, dando início ao processo de
fagocitose e ativação de estresse oxidativo (BROWN et al., 2003; UNDERHILL, 2003;
ELCOMBE et al., 2013; JIANG et al., 2013; CAMILI et al., 2018).
Neste estudo, o Zymosan induziu a resposta inflamatória, na qual foi verificada um
menor índice de fagocitose e de liberação de EROS no grupo com sobrepeso e obesidade pré-
gestacional. Os hormônios adiponectina, leptina e melatonina restauraram o índice de
fagocitose a valores semelhantes ao do grupo eutrófico. Contudo, a associação da
adiponectina+leptina teve destaque, dado que foi o único tratamento capaz de restaurar no grupo
excesso de peso, o percentual de fagocitose com respectivo aumento de EROS a valores
semelhantes ao controle.
Na literatura científica não há informações sobre o índice de fagocitose de macrófagos
do colostro humano, em função do excesso de peso materno. Porém, pesquisas que associam
a atividade fagocítica e o excesso de peso corporal ilustram resultados controversos, alguns
estudos descrevem uma redução no índice de fagocitose e no número de macrófagos com
habilidade fagocítica em função do excesso de peso (LOFFREDA et al. 1998; HUNSCHE,
HERNANDEZ e DE LA FUENTE, 2016), enquanto que outros sugerem aumento no índice de
fagocitose (NIEMAN et al. 1999; MEANEY et al. 2016).
51
Em relação a liberação de radicais livres, resultados controversos são descritos na
literatura científica. Algumas pesquisas relatam que a obesidade está associada a elevação do
burst oxidativo em macrófagos e neutrófilos (NIEMAN, 1999; NEGRO et al. 2017), enquanto
que outras descrevem que a elevação do IMC não reflete em aumento de marcadores do estresse
oxidativo (PAHWA, ADAMS-HUET e JIALAL, 2017), semelhante ao encontrado neste
estudo. Possivelmente, as diferenças nos resultados dos estudos citados estão no tipo de
amostras e nos diferentes agentes indutores de fagocitose utilizados.
Quanto ao tratamento dos fagócitos com os hormônios utilizados, sabe-que a
adiponectina, apesar de ser conhecida por sua ação anti-inflamatória, decorrente da sua
capacidade de estimular a expressão de marcadores de macrófagos de fenótipo M2. Ela também
é capaz de ocasionar em macrófagos estímulos pró-inflamatórios (CHENG et al., 2012; LEE et
al., 2018), por ativação de macrófagos da via clássica (M1 - pró-inflamatória) (CHENG et al.,
2012; SANZ-GARCIA et al., 2014). Essa adipocina induz a ativação da enzima IkB Kinase,
enzima responsável pela degradação da proteína inibitória kB e assim, consequente ativação do
NF-kB, que no núcleo irá promover a liberação de citocinas pró-inflamatórias e o
desencadeamento da resposta inflamatória (LEE et al., 2018).
Em relação a leptina, estudo demonstra que sua deficiência em animais ocasiona
prejuízos na fagocitose, o que demonstra a importância dessa adipocina para o processo de
fagocitose (MOORE et al., 2003). Seu mecanismo de ação envolve a ativação das vias de
sinalização JAK/STAT, que induz a fagocitose, burst oxidativo e aumento da secreção de
citocinas pró-inflamatórias (SHIRSHEV e ORLOVA, 2005). Estudos na literatura descrevem
a ação da leptina na elevação da geração de EROS, contribuindo assim para a atividade
microbicida de monócitos (PADRA et al. 2012; DAYAKAR et al. 2016; TEIXEIRA et al.,
2017), semelhante ao verificado neste estudo. No entanto, ela também possui potencial de
reduzir a formação de EROS, provavelmente, devido a ocorrência de uma dessensibilização em
52
monócitos provenientes de indivíduos que se encontram num estado hiperinflamatório
(SANCHEZ-POZO et al., 2003),
A respeito do hormônio melatonina, na literatura científica ainda não é totalmente
esclarecida a ação da melatonina nos fagócitos segundo o índice de massa corporal. Nesse
estudo, a melatonina elevou o índice de fagocitose independente do IMC materno pré-
gestacional, sem restituir a liberação de EROS para o grupo excesso de peso.
A melatonina eleva os índices de fagocitose, inclusive ela aumenta a fagocitose induzida
por partículas de Zymosan (PIRES-LAPA et al., 2013), além de elevar a capacidade do colostro
na proteção a enterophatogenic Escherichia coli (EPEC), demonstrando assim, que a
melatonina no colostro apresenta uma função essencial para proteção do recém-nascido nos
primeiros dias de vida (HONORIO-FRANÇA et al., 2013; MORCELI et al., 2013).
Nos mamíferos, a melatonina atua principalmente via receptores acoplados à proteína
G, denominados de MT1 e MT2. Ambos desencadeiam cascatas de eventos intracelulares, que
envolve a inibição da produção do AMP cíclico ou liberação de cálcio. Outros sítios de ligação
da melatonina estão relacionados a proteínas intracelulares como a calmodulina, enzima
quinona redutase 2 (MT3), receptores nucleares RZR/RORα relacionados a família do ácido
retinóico (Von GALL, STEHLE e WEAVER, 2002; DUBOCOVICH e MARKOWSKA, 2005;
TAN et al., 2007; HARDELAND et al., 2011; MARKUS, CECON e PIRES-LAPA, 2013;
EMET et al., 2016).
Nas células mononucleares do colostro humano, durante a fagocitose do Zymosan, a
melatonina age diretamente via receptor MT2 e contribui para aumentar a eficiência dos
fagócitos por elevar a expressão de dectina-1, fundamental na resposta imunológica inata a
fungos, mecanismo importante na fagocitose do Zymosan (PIRES-LAPA et al. 2013).
Neste estudo, apesar da melatonina ter aumentado a fagocitose, ela não aumentou a
liberação de EROS pelas células mononucleares do colostro.
53
De acordo com a literatura, a melatonina tem ação antioxidante, pela interação
diretamente com uma variedade de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, protegendo as
células contra danos moleculares (REITER et al., 2007). Por outro lado, ela é capaz de estimular
a produção de espécies reativas de oxigênio sem ocasionar distúrbios na mitocôndria e de forma
independente da estimulação de receptores MT1/MT2. Nos leucócitos, a melatonina pode
induzir a liberação da fosfolipase A2, independente de cálcio (Ipla2), que reage com sítio de
ligação da calmudolina e assim leva a produção de radicais livres (RADOGNA et al., 2009a;
RADOGNA et al., 2009b).
No caso dos fagócitos mononucleares do colostro, a melatonina induz a liberação de
ânion superóxido no decorrer da fagocitose de bactérias. No entanto, na presença de alterações
metabólicas, como diabetes, a melatonina não eleva a liberação do ânion superóxido
(HONORIO-FRANÇA et al., 2013; MORCELI et al. 2013). Similar ao encontrado nesta
pesquisa, indicando assim uma atividade antioxidante da melatonina em casos de alterações
metabólicas, como o excesso de peso.
No decorrer da resposta inflamatória, além da liberação de EROS que são importantes
para atividade microbicida (DJORDJEVIC, 2004), os níveis de liberação de cálcio intracelular
também são necessários no processo de ingestão de antígenos e no controle das etapas
subsequentes envolvidas na maturação de fagossomos (NUNES e DEMAUREX 2010). O
ajuste fino da homeostasia do cálcio intracelular por meio de proteínas anti- e pró-apoptóticas
molda o sinal de cálcio e controla o processo de apoptose celular (PINTON et al., 2008).
Constatamos neste estudo que o excesso de peso materno pré-gestacional não
influenciou nas alterações do cálcio intracelular e de apoptose das células mononucleares do
colostro na presença de Zymosan.
Sabe-se que o excesso de peso está associado a elevação de apoptose em monócitos.
Possivelmente, os aumentos nos níveis de ácidos graxos saturados, são capazes de ativar vias
54
inflamatórias nessas células, principalmente, por elevar a atividade das caspases, causando
liberação de citocinas inflamatórias e inflamassomas (PILLON et al., 2016). Diferente do
verificado neste estudo, que ilustra a capacidade do colostro de manter o número de células
viáveis, independente do IMC materno pré-gestacional.
No colostro mais de 90% dos fagócitos mononucleares são formados por células viáveis
(MORES et al. 2015), enquanto que o índice de apoptose nesta população celular é de 6,75%
(HONORIO-FRANÇA et al., 2016). Fato que demonstra a disponibilidade de número
significativo de células viáveis, para o desenvolvimento de uma possível resposta inflamatória.
Neste atual estudo, a melatonina reduziu os níveis de apoptose das células
mononucleares do colostro, enquanto que a interação da adiponectina+leptina aumentaram a
apoptose para o grupo com elevado IMC pré-gestacional.
A melatonina modula a apoptose em leucócitos via estimulação dos receptores
MT1/MT2, promovendo a relocalização da proteína anti-apoptótica Bcl-2 à mitocondria
(RAGDONA et al., 2015) e pode atenuar a resposta inflamatória com reflexo na redução na
concentração de apoptose em macrófagos (CHEN et al., 2018).
No entanto, nessa pesquisa apenas a associação da adiponectina+leptina foi o tratamento
que refletiu em maior índice de apoptose. Considerando que a adiponectina elevou os níveis de
cálcio intracelular e quando associada a leptina (adiponectina+leptina) o nível de EROS elevou-
se, podemos sugerir que as adipocinas em conjunto induziram nos fagócitos mononucleares
uma resposta mais efetiva, com mecanismo de associação dependente de EROS e do controle
de cálcio intracelular, culminando dessa maneira no aumento dos níveis de apoptose.
Provavelmente, essa associação potencializou a atividade microbicida desses fagócitos e assim,
o consequente aumento verificado nos níveis de apoptose para o grupo elevado IMC. Esses
resultados condizem com a literatura, a qual descreve que as adipocinas em conjunto
intensificam a resposta celular, provavelmente pela ativação da via clássica do NF-kB, que
55
regula os genes responsáveis pela produção da maior parte de EROS nas células (MORGAN e
LIU, 2011).
Dessa forma, é importante salientar a necessidade da manutenção do equilíbrio dos
hormônios reguladores do metabolismo no organismo materno, para uma adequada atividade
funcional das células mononucleares do colostro humano. No entanto, temos que destacar que
mesmo havendo diferenças nas respostas das células mononucleares em função do excesso de
peso pré-gestacional, essas células proporcionam proteção imunológica ao lactente. Além do
mais, é possível que as diferenças encontradas na atividade funcional das células
mononucleares, seja um mecanismo de defesa materno-infantil para garantir ao lactente uma
eficiente resposta imunológica. Visto que, essas células in natura, também estarão estão
emergidas em um meio alterado de hormônios e estímulos variáveis segundo a presença de
alterações metabólicas decorrentes do excesso de peso materno.
Assim, a amamentação deve ser incentivada. O aleitamento materno continua sendo
uma importante estratégia de saúde pública para o combate da epidemia da obesidade, com
potencial real de proporcionar efeitos protetores ao excesso de peso para o binômio mãe e filho
(OZENOGLU et al., 2017; BELL et al., 2018; ORTEGA-GARCÍA et al., 2018) e no combate
de infecções infantis (HONÓRIO-FRANÇA et al., 2013).
Dessa maneira, estudos que avaliem as ações e os níveis dos hormônios reguladores do
metabolismo, do colostro e leite humano, podem trazer importantes contribuições para o
desenvolvimento de novas estratégias frente a epidemia da obesidade e até mesmo no combate
de infecções infantis. Seja por meio do incentivo ao controle de peso materno, ou medidas que
utilizem o próprio colostro e leite materno como estratégia de intervenção.
56
6. CONCLUSÃO
O excesso de peso materno pré-gestacional elevou as concentrações da melatonina do
colostro e influenciou na atividade funcional dos fagócitos mononucleares do colostro humano.
Os estímulos de adiponectina, leptina e melatonina restaurou o índice de fagocitose para
o grupo excesso de peso, a valores similares ao grupo eutrófico. A associação da
adiponectina+leptina nos fagócitos mononucleares foi o tratamento mais eficaz para restituir o
índice de fagocitose no grupo excesso de peso, com restauração dos níveis de espécies reativas
de oxigênio e manutenção das concentrações de cálcio intracelular. Contribuindo assim, para
uma atividade microbicida mais efetiva, que foi refletida no aumento do índice de apoptose.
A melatonina e leptina, restauraram o índice de fagocitose, sem elevação no índice de
apoptose, indicando uma ação antioxidantes desse hormônio, que pode prevenir danos
celulares, nas células do colostro de mulheres com excesso de peso.
Os dados em conjunto reforçam a hipótese de que a amamentação representa um
caminho para beneficiar a saúde da criança. Assim, a promoção do controle de peso corporal,
junto ao incentivo da amamentação a livre demanda, representam um econômico e sustentável
caminho para o desenvolvimento de ações benéficas frente a redução do impacto do sobrepeso
e da obesidade populacional.
57
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72
ANEXOS
73
ANEXO 1 – QUESTIONÁRIO
FICHA PARA COLETA DE DADOS INDIVIDUAIS
Projeto: “Aleitamento materno: influência do sobrepeso e obesidade materna sobre componentes
imunológicos do colostro humano”.
Pesquisador Responsável: Prof. Dr. Luiz Carlos de Abreu
Pesquisadora executante: Tassiane Cristina Morais
DADOS DA PACIENTE
Nome:………………………………………………………….................................................................
Paciente no…..... Data:……/……/……
Registro.........................
Data de nascimento:……/……/…… RG:..........................................................
Qual o seu endereço (rua, nº , cidade, CEP):________________________________________
___________________________________________________________________________
Telefone para contato _____________________________
Qual é sua nacionalidade?______________________________
Cor: Branca ( ) Parda ( ) Negra ( ) Amarela ( )
Estado civil
( )casada ( )divorciada ( )solteira
( )amasiada ( )viúva
Escolaridade: Qual a sua escolaridade:
____________________________________________________
Hábito de fumar: Nunca fumou ( ) Parou de fumar ( ) há quanto tempo?.............
Por quanto tempo fumou?....................................
No de cigarros/dia…………………...
Tipo: ( )cachimbo ( ) charuto ( ) palha ( ) papel com filtro ( ) outros
Convive com fumante? Sim ( ) Não ( )
Local: ( )casa ( )trabalho ( )outros
N°. de pessoas?......................Quantas horas/dias?..............................................
74
Consume bebida alcoólica? Sim ( ) Não ( )
Quanto? Até 7 doses/sem. ( ) Mais de 7 doses/sem ( )
Usa algum tipo de drogas? Sim ( ) Não ( )
Tipo: ( )maconha ( )cocaína ( )craque ( )outros
Vias de administração: ( )inalatória ( )endovenosa ( )
outras Já usou? Sim ( ) Não ( )
Quanto tempo?.....................................................................
Parou há quanto tempo?.....................................................
Contato com substâncias tóxicas? Sim ( ) Não ( )
Quais?.........................................................................................................................................................
Por quanto tempo (meses)?..............................................................................
Período sem contato com a (s) substância (s) (meses):...................................................
Possui algum tipo de doença? Sim ( ) Não ( )
Qual(is)?......................................................................................................................................................
Diabetes mellitus Sim ( ) Não ( )
Já teve infarto? Sim ( ) Não ( ) Há quanto tempo?……………..
É hipertensa? Sim ( ) Não ( ) É obeso? Sim ( ) Não ( )
Peso (anterior a gestação) (Kg)………… Altura (cm)…………..
IMC:………………….
Peso (Kg) no momento do parto: …………
Toma medicamento? Sim ( ) Não ( ) Qual(is)? Em que
dosagem?…….........................................................……………………………………………………..
..………………………………..……………………………...........................................……………….
…................................................................................................................................................…………
Profissão:……....................................…………… Há exigência de esforço físico? Sim ( ) Não ( )
Pratica exercício físico? Sim ( ) Não ( )
Com que freqüência?………...........................................…
HISTÓRICO FAMILIAR
Possui algum parente com:
Diabetes Mellitus ( ) Obesidade ( ) Hipertensão ( )
Doença cardiovascular ( ) Hipercolesterolemia ( ) Outros ( )
Quem?……………………………………………
Não tem ( ) Não sabe ( )
75
HISTÓRIA GESTACIONAL
Gestação:....................Pariadade:.........................Abortos:..............................Cesáreas:............................
DUM:................................................... DPP: ...................................................
IG (Ultrassom) ................................................... IG (DUM) ...................................................
Pré-natal: Sim ( ) Não ( ) N° de consultas?.................................
Intercorrências durante a gravidez: ( )náuseas ( )vômitos ( ) dor abdominal ( )dor para
urinar ( )corrimentos ( ) sangramento ( )outros
Doenças durante a gestação: Sim ( ) Não ( ) Tipo?...............................................
Tratamento: Sim ( ) Não ( ) Qual?........................................................................
Fatores de risco para HIV? Sim ( ) Não ( )
DADOS DO CARTÃO DE PRÉ-NATAL:
DATA
Idade Gestacional
Pressão Arterial (mmHg)
Peso (kg)
VDRL
Hepatite
Tox. IgM/IgG
Glicemia
HIV
Outros exames:
Queixas:
76
DADOS DO RECÉM-NASCIDO (RN)
Data de Nascimento:
Tipo de parto: ( )normal ( )cesária ( )fórceps ( )outros
Sinais de sofrimento fetal? Sim ( ) Não ( )
Qual?.................................................................................................................................
Mecônio: Sim ( ) Não ( )
Tipo: ( )fluido ( ) moderado ( ) espesso
Apgar: 1’ ................................5’.....................................
New Ballard (NB):............................Sexo:.....Peso:.......................Estatura:............
PC:............................PT:................................PA:.........................................
Classificação do RN: ( ) PIG ( ) AIG ( ) GIG
Necessidade de reanimação: ( ) máscara ( )ventilação sob pressão ( ) intubação
( ) drogas Quais drogas?..................................................................................
Anomalias ou malformações: Sim ( ) Não ( )
Quais?............................................................................................................
77
ANEXO 2 – TERMO DE CONSCENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE SAÚDE PÚBLICA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
I – TÍTULO DA PESQUISA: ATIVIDADE FUNCIONAL DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DO COLOSTRO DE MÃES COM SOBREPESO E OBESIDADE E O PAPEL DOS AGENTES
IMUNOMODULADORES: ADIPONECTINA, LEPTINA E MELATONINA.
1. Justificativa e objetivos: Prezada senhora, como já lhe foi informado, o excesso de peso materno
pode ocasionar alterações no organismo diminuindo os mecanismos naturais de defesa. É possível que
isto influencie na qualidade do leite materno que protege a criança contra infecções. Por este motivo,
para o desenvolvimento deste projeto, será necessário a coleta de leite materno (colostro) para
avaliarmos se o excesso de peso influencia na atividade das células do leite humano, que são um dos
mecanismos de proteção do bebê. A coleta do colostro será realizada por ordenha manual, sendo um
processo indolor, apresentando incômodo ou não. Caso a senhora não queira participar da pesquisa, você
tem todo o direito de se recusar. Caso comece na pesquisa e depois deseje desistir, também estará
garantida a assistência prestada por esta unidade de saúde para você e sua criança.
2. Procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos procedimentos
que são experimentais: Será coletado uma amostra de colostro para realização de experimentos
laboratoriais para determinar algumas das atividades anti-infecciosas do leite humano.
3. Desconfortos e riscos esperados: O desconforto ocasionado à senhora será pequeno. A coleta do
colostro não causa dor, pode apresentar incômodo ou não. O risco apresentado é mínimo e não há
nenhum risco ao recém-nascido. Em caso a senhora relatar qualquer incômodo, a coleta do colostro será
interrompida imediatamente.
4. Benefícios que poderão ser obtidos: Não há benefício direto para a senhora, pois trata-se de estudo
com análise laboratorial e somente no final do estudo poderemos concluir a presença de algum benefício.
No entanto, acredita-se que o benefício a ser obtido será um melhor conhecimento sobre a influência do
excesso de peso na qualidade do leite materno. Este conhecimento, favorece o desenvolvimento de
condutas futuras que poderão beneficiar os pacientes evitando maiores riscos aos recém-nascidos.
II – OBSERVAÇÃO:
✓ Atendendo a resolução CNS 466/12, este Termo de Consentimento Livre e Esclarecido é
elaborado em duas vias, devidamente assinadas pelo pesquisador, uma via deste termo será
entregue ao participante da pesquisa e a outra ficará sob a guarda pesquisador.
✓ A senhora terá acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e
benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para diminuir eventuais dúvidas.
✓ A senhora terá direito de retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de participar
do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência.
✓ Disponibilidade de assistência, por eventuais danos à saúde, decorrentes da pesquisa.
78
✓ Se for detectado, algum problema de saúde previamente ao início da pesquisa, a senhora será
encaminhada ao Sistema Único de Saúde (SUS) para o tratamento.
✓ Se houver intercorrência de saúde decorrente da pesquisa, a senhora será atendida no Hospital
Universitário da USP, São Paulo-SP, segundo o critério de assistência do mesmo. Se houver
necessidade de atendimento de maior complexidade, a encaminharemos ao SUS.
✓ A senhora terá total confidencialidade, sigilo e privacidade dos dados deste estudo.
✓ A duração prevista da pesquisa é de 4 anos, mas o material será coletado apenas uma vez.
III – INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS
PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE
INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS:
NOME DOS PESQUISADORES ENVOLVIDOS:
Pesquisadora executante: Tassiane Cristina Morais – [email protected]
Pesquisador responsável: Prof. Dr. Luiz Carlos de Abreu – [email protected]
Faculdade de Saúde Pública – Universidade de São Paulo: Endereço: Av. Dr. Arnaldo, 715 –
CEP:01.246-904 – São Paulo/SP. Telefone: 3061-7703.
Em caso de dúvida a senhora também pode entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, situado à Av. Dr. Arnaldo, 715,
Cerqueira César - CEP 01246-904, São Paulo, SP - Telefone: (11) 3061-7779 / e-mail:
[email protected] e/ou Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário da USP, situado à
Av. Prof. Lineu Prestes, 2565 – Cidade Universitária - CEP: 05508-000 – São Paulo, SP - Telefone:
(11) 3091-9457 / e-mail: [email protected] .
IV – INFORMAÇÕES DO PACIENTE
Nome do paciente: ...................................................................................................................
Documento de identidade N°: .................................................................................................
Data de nascimento: ......../......../....................
Endereço: ...................................................................................Número:..............Ap............. Bairro:
..................................................................Cidade:.......................................................
CEP:........................................................Telefone: DDD( )...................................................
V – ENCERRAMENTO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
“Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi
explicado, consinto em participar do presente projeto de pesquisa.”
SÃO PAULO – São Paulo, ............ de ..................................201.......
_________________________________ _________________________________
Assinatura do paciente Assinatura do pesquisador
79
ANEXO 3 – PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA
80
81
82
83
ANEXO 4 – VALORES BRUTOS DAS MÉDIAS E DESVIO PADRÃO DOS RESULTADOS DE
FAGOCITOSE, ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO, NÍVEIS DE CÁLCIO INTRACELULAR
E APOPTOSE.
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos dados apresentados nos gráficos da sessão Resultados,
referentes a atividade funcional dos fagócitos do colostro humano, segundo o estado nutricional
pré-gestacional.
Os resultatos foram avaliados por ANOVA, seguido de Teste de Tukey, os dados foram expressos em média
(±DP), (n=10 por tratamento e experimento), indicando: * Diferença estatística (p<0,05) em relação ao mesmo
grupo tratado com meio 199 (controle negativo); # Diferença estatística (p<0,05) intragrupo (eutrófico x excesso
de peso) considerando o mesmo tratamento.
Variáveis Eutrófico
(Média±DP)
Excesso de Peso
(Média±DP) Índice de Fagocitose (% de células)
Células+Zy+meio 199 38,51 (±5,11) 33,02 (±4,27)#
Células+Zy+Adiponectina 39,9 (±3,73) 40,96 (±6,09)*
Células+Zy+Leptina 36,81 (±3,84) 39,06 (±3,82)*
Células+Zy+Melatonina 42,72 (±2,96)* 40,62 (±2,28)*
Células+Zy+Adiponectina+Leptina 40,61 (±3,74) 41,12 (±1,94)*
Células+Zy+Melatonina+Leptina 39,73 (±4,64) 39,74 (±4,04)*
Liberação de EROS (intensidade de fluorescência -
DHR123)
Células+Zy+meio 199 20,07 (±6,58) 15,32 (±1,87)#
Células+Zy+Adiponectina 13,70 (±3,43) 14,42 (±1,60)
Células+Zy+Leptina 10,70 (±1,14) 16,16 (±1,55)#*
Células+Zy+Melatonina 18,88 (±4,96) 14,19 (±3,92)#
Células+Zy+Adiponectina+Leptina 16,10 (±4,17) 17,56 (±2,41)*
Células+Zy+Melatonina+Leptina 16,40 (±1,82) 14,22 (±2,09)
Níveis de Cálcio Intracelular (intensidade de
fluorescência - FLUO-3 AM)
Células+Zy+meio 199 2,54 (±0,56) 2,48 (±0,59)
Células+Zy+Adiponectina 2,89 (±0,85) 3,64 (±1,08)#*
Células+Zy+Leptina 2,51 (± 0,47) 1,9 (±0,58)#*
Células+Zy+Melatonina 2,95 (±0,64) 3,38 (±1,39)
Células+Zy+Adiponectina+Leptina 2,53 (±0,72) 2,29 (±0,65)
Células+Zy+Melatonina+Leptina 2,36 (±0,79) 2,43 (±0,67)
Índice de Apoptose (média da intensidade de
fluorescência de FITC- Annexin-V)
Células+Zy+meio 199 0,82 (±0,11) 0,86 (±0,13)
Células+Zy+Adiponectina 0,82 (±0,20) 0,87 (±0,29)
Células+Zy+Leptina 0,80 (±0,32) 0,79 (±0,11)
Células+Zy+Melatonina 0,84 (±0,09) 0,73 (±0,06)
Células+Zy+Adiponectina+Leptina 0,85 (±0,11) 1,07 (±0,26)#*
Células+Zy+Melatonina+Leptina 0,82 (±0,11) 0,78 (±0,08)#*
84
CURRÍCULO LATTES
85
86
ARTIGO PUBLICADO
Journal: Cells (ISSN 2073-4409) – Fator de Impacto: 5,656 (2019).