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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAIBA
FACULDADE DE EDUCAÇAO E ARTES
BACHARELADO EM QUÍMICA
ANDRÉ LUIZ DA MOTTA SIQUEIRA
COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS ANALÍTICAS INSTRUMENTAIS:
ESPECTROFOTOMETRIA VERSUS HPLC EM ANÁLISE DE
NITROGÊNIO AMONIACAL EM EFLUENTES INDUSTRIAIS.
Jacareí, SP
2013
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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA FACULDADE DE EDUCAÇÃO E ARTES
COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS ANALÍTICAS INSTRUMENTAIS:
ESPECTROFOTOMETRIA VERSUS HPLC EM ANÁLISE DE
NITROGÊNIO AMONIACAL EM EFLUENTES INDUSTRIAIS
ANDRÉ LUIZ DA MOTTA SIQUEIRA
Relatório Final apresentado como parte das exigências da disciplina Trabalho de Conclusão de Curso à Banca Examinadora da Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do Paraíba.
ORIENTADOR: Prof. Dr. DENILSON NOGUEIRA MORAES
Jacareí, SP
2013
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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA FACULDADE DE EDUCAÇÃO E ARTES
Curso: Bacharel Químico Da Faculdade de Educação e Artes
Trabalho de Conclusão de Curso 2013
Titulo: Comparação de técnicas analíticas instrumentais: Espectrofotometria versus HPLC em analise de Nitrogênio Amoniacal em efluentes industriais.
Alunos: André Luiz da Motta Siqueira
Orientador: Prof. Dr. Denílson Nogueira de Moraes. Banca Examinadora: Prof.ª MSc Gisele Gomes Valle
Prof.ª Monica Duarte V. Del Core Torres Barbosa
Prof.ª Dra. Viviane Soccio M. Henrique
Jacareí, SP
2013
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela força nos momentos em que me senti fraco.
A minha família e namorada por acreditarem no meu potencial,
mesmo quando eu não acreditei. A vocês dedico o meu
crescimento pessoal e profissional.
Aos amigos, do trabalho e da vida acadêmica, pelo apoio
fornecido, sem os quais essa tarefa seria mais árdua.
Ao final, ao laboratório químico da Monsanto, por permitir as análises em
suas dependências.
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RESUMO
A qualidade das águas dos nossos rios é fixada pela presença de
substâncias e compostos químicos em determinados intervalos, sendo
regulada pelo CONAMA através da resolução N°430, que entre outros
itens trata do padrão de aceitação de lançamento de efluentes ao corpo
receptor “Rio Paraíba do Sul” classe II. A comparação entre técnicas
analíticas se faz importante, pois determina qual o grau de confiabilidade
analítica do método. Este trabalho foi realizado na Empresa Monsanto no
município de São Jose dos Campos - SP no período de agosto a outubro
de 2013 e teve por finalidade estudar duas técnicas instrumentais,
Espectrofotometria HACH versus HPLC e obter através da comparação
aquela de maior precisão e exatidão e que atendam aos limites
considerados aceitáveis pelo CONAMA e a CETESB. Para isto, foram
avaliados a calibração, tempo de resposta dos equipamentos e as leituras
pontuais das amostras de efluentes brutos e tratados. O método por
HPLC apresentou-se mais confiável para análise de Nitrogênio amoniacal
em água, é um método mais seletivo e apresenta menores interferentes,
com menor tempo de análise e menor custo.
Palavras-Chave: Comparação de técnicas. Nitrogênio Amoniacal. HPLC.
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ABSTRACT
The quality of our rivers is determined by the presence of chemicals
and compounds at certain intervals, being regulated by the CONAMA
Resolution No. 430, which among other things deals with the acceptance
standard for effluent discharge to the receiving body "Rio Paraíba Sul"
class II. The comparison between analytical techniques becomes
important because it determines the degree of reliability of the analytical
method. This work was carried out at Monsanto Company in the city of
Sao Jose dos Campos - SP in the period August to October 2013 and
aimed to study two instrumental techniques, HACH spectrophotometry
versus HPLC and get by comparing that of accuracy and precision and
meet the limits considered acceptable by CONAMA and Catesby. For this,
we evaluated the calibration, response time and equipment readings
occasional samples of raw and treated wastewater. The HPLC method
presented is more reliable for analysis of ammonia nitrogen in water, a
method is more selective and has lower interfering with lower analysis time
and lower cost.
Keywords: comparison of techniques. Ammoniacal Nitrogen. HPLC.
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LISTAS DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo do nitrogênio na natureza. Fonte: METCALF & EDDY
(1991).
Figura 2: Natureza ondulatória de um feixe de radiação com uma única
frequência, onde uma onda plano-polarizada é mostrada propagando-se
ao longo do eixo x.
Figura 3: Natureza ondulatória de um feixe de radiação com uma única
frequência, onde somente as oscilações do campo elétrico são
mostradas.
Figura 4: Atenuação de um feixe de radiação por uma solução
absorvente.
Figura 5: Dispersão da luz por um prisma (a) e (b) uma rede de
transmissão.
Figura 6: Área de amostragem do espectrofotômetro HACH DR 2800.
Figura 7: Esquema de uma fotomultiplicadora com nove dinodos.
Figura 8: Diagrama de um cromatografo liquido
Figura 9: HPLC Waters – Instrumentação usada para analise de N-NH3.
Figura 10: Curva padrão de Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH.
Figura 11: Curva padrão de Nitrogênio Amoniacal pelo método HPLC.
Figura 12: Cromatograma do Padrão de Nitrogênio Amoniacal
Figura 13: Comparação entre o resultados das leituras das amostras de
Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa A.
Figura 14: Comparação entre o resultados das leituras das amostras de
Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – TQ. Aeração.
Figura 15: Comparação entre o resultados das leituras das amostras de
Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa C.
Figura 16: Comparação entre o resultados das leituras das amostras de
Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa B.
Figura 17: Diferença de resultados entre as técnicas HACH x HPLC.
Figura 18: Desvio Padrão apresentado nas duas metodologias
8
Figura 19: Gráfico tipo caixa mostra aonde se encontra a minha
população de amostras em função da concentração em ppm
Figura 20: Valores individuais de cada metodologia e seus resíduos
Figura 21: Valores dos Teste T e Analises de Variância Anova
Figura 22: Reação pós-coluna OPA/MERC antes de ir para o detector
Figura 23: Reação que acontece no tubo reagente para formar um
complexo colorimétrico.
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LISTAS DE TABELAS
Tabela 1: Região do espectro eletromagnético e seus respectivos
comprimentos de onda.
Tabela 2: Valores de calibração obtidos na leitura de padrões pelo
método espectrofotométrico HACH.
Tabela 3: Valores de calibração obtidos na leitura de padrões pelo
método HPLC Waters.
Tabela 4: Equipamentos e seu coeficiente de linearidade.
Tabela 5: Concentração de Nitrogênio amoniacal medida nas amostras
pelo método de HPLC.
Tabela 6: Concentração de Nitrogênio amoniacal medida nas amostras
pelo método de HACH.
Tabela 7: Diferença de resultados em ppm entre os métodos HACH x
HPLC
Tabela 8: Comparação de tempo de analises entre a técnica HACH
versus HPLC.
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ABREVIAÇÕES
ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas
ABS - Absorbância
ANSI – American National Standards Institute
APHA – American Public Health Association
ASTM – American Society for Testing and Materials
CDS – Software de Coleta de Dados Cromatográfico
CLAE – Cromatografia Liquida de Alta Precisão
CONAMA – Conselho Nacional de Meio Ambiente
DBO – Demanda Biológica de Oxigênio
DP – Desvio Padrão
DQO – Demanda Química de Oxigênio
EPA – Envirommental Protection Agency
ER – Erro Relativo
HPLC – High-performance liquid chromatography
MERC – 2-Mercaptoetanol
NIST- National Institute of Standards and Technology
OPA - Ortoftalaldeído
PCR – Reagente Pós-Coluna
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SUMARIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 16
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 16
2.2 Objetivo Especifico .................................................................................. 16
3. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 17
3.1 Nitrogênio Amoniacal ............................................................................... 17
3.1.1 Formas em que os compostos de nitrogênio se apresentam nas
aguas ......................................................................................................... 19
3.1.2 Importância nos estudos de controle de qualidade das aguas .......... 19
3.2 Espectrofotometria ................................................................................... 22
3.2.1 Sistema Espectrofotométrico HACH DR 2800 .................................. 28
3.3 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC) .................................... 34
3.3.1 Cromatografia por troca iônica .......................................................... 37
4. METODOLOGIA ........................................................................................... 39
5. RESULTADOS ............................................................................................. 43
6. DISCUSSÃO ................................................................................................. 56
7. CONCLUSÃO ............................................................................................... 61
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................ 62
12
1. INTRODUÇÃO
A amônia é um composto facilmente biodegradável principalmente
pela flora do meio aquático que a absorve e utiliza como nutriente, sendo
este muito importante para a produção de compostos azotados,
nomeadamente proteínas. A sua origem nos meios hídricos é proveniente
da degradação de resíduos de origem animal ou vegetal. Em
concentrações elevadas, como por exemplo, na água de consumo, pode
causar danos graves nos humanos e animais, já que a amônia interfere
no transporte de oxigênio pela hemoglobina, entre outros efeitos nefastos.
Não é apenas para a saúde humana que o íon amônia é prejudicial, pois
este a nível ecológico tem também bastantes implicações, influenciando a
quantidade de oxigênio dissolvido na água o que faz com que haja
inúmeras alterações metabólicas nos seres vivos aquáticos (METCALF &
EDDY, 1991).
Para que esse excesso de nitrogênio amoniacal não cresça em
nossos rios e prejudique a vida aquática existente e indiretamente não
afete os seres humanos o CONAMA (Conselho Nacional de Meio
Ambiente), órgão federal responsável por estabelecer leis, normas e
diretrizes para controle e preservação do meio ambiente e recursos
naturais publicou no dia 13 de Maio de 2011 a RESOLUÇÃO N°430, a fim
de definir os padrões de lançamentos de efluentes.
Segundo tal Resolução, o efluente a ser lançado num rio, como por
exemplo, o “Rio Paraíba do Sul”, que pela resolução é classificado como
classe 2, deve ter no máximo 20,0 mg/L N de nitrogênio amoniacal no
efluente a ser lançado.
Diante dessa informação, empresas como a Monsanto do Brasil,
local onde será executado este trabalho, precisam ter um bom tratamento
13
de efluentes para reduzir o teor de nitrogênio amoniacal no mínimo até a
especificação antes de lançá-lo no Rio Paraíba do Sul.
Para isso, a empresa conta com um laboratório de controle
ambiental com uma técnica analítica precisa, fácil e viável para que este
controle seja bem executado. Para que este laboratório realize as
análises de nitrogênio amoniacal com ótimos padrões de qualidade, faz-
se necessário o estudo de um método que seja de fácil implementação e
que responda de forma confiável em uma faixa de trabalho. É de extrema
importância demonstrar que um método de ensaio químico, nas
condições em que é praticado, tem as características necessárias para a
obtenção de resultados com a qualidade exigida.
Segundo NIT DICLA 008 do INMETRO (2003) a comparação entre
métodos consiste em confrontar os resultados obtidos utilizando um
método interno com os resultados conseguidos através de um método de
referência. O objetivo é estudar o grau de proximidade dos resultados
obtidos pelos dois métodos de ensaio, ou seja, de avaliar a exatidão do
método interno relativamente ao de referência ou normalizado.
Método normalizado, de acordo com o referido documento é:
Aquele desenvolvido por um organismo de normalização ou outras
organizações, cujos métodos são aceitos pelo setor técnico em questão.
Por exemplo, ABNT, ASTM, ANSI, APHA Standard Methods for
Examination of Water and Wastewater.
Já um método não normalizado, segundo NIT DICLA 008, é
aquele:
Desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras partes, ou
adaptado a partir de métodos normalizados e validados. Por exemplo,
métodos publicados em revistas técnicas, métodos de fabricantes de
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equipamentos, métodos utilizando “kits” de ensaio e instrumentos
portáteis.
Existem várias técnicas para se comparar os resultados obtidos por
dois métodos de ensaio, entre as quais Testes de Hipótese, Teste de
Regressão Linear e Projeto de Experimento.
O parâmetro de linearidade objetiva verifica até que ponto a faixa
de concentração do analito coincide com a faixa de resposta do método,
ou seja, até que ponto é possível medir linearmente o analito dentro de
uma escala.
Para se comparar dois métodos analíticos a linearidade, a exatidão
e a precisão são de suma importância. A linearidade é obtida através de
expressões matemáticas, como a equação da reta que relaciona duas
variáveis. A expressão que caracteriza a equação da reta é y = ax + b,
onde y é a resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc), x é
a concentração do analito, o a representa a inclinação da curva, e b é a
interseção com o eixo y. Para a construção da curva de linearidade são
necessárias no mínimo 5 concentrações do analito (INMETRO, 2003).
A exatidão do método é a concordância entre o resultado de um
ensaio e o valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro.
Uma das maneiras de verificar esse parâmetro é a utilização de materiais
de referência. Para a comparação da exatidão de um método pode ser
utilizado o erro relativo, expresso em porcentagem através da fórmula: ER
= ((Xlab – Xv)/Xv) x 100, onde Xlab é a média aritmética dos valores
obtidos e Xv é o valor aceito como verdadeiro.
Já para a avaliação da precisão, recorre-se ao teste F, baseado no
cálculo da razão entre as variâncias dos dois métodos (CIENFUEGOS,
2005).
15
A precisão é definida como um termo geral que avalia a dispersão
de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma
amostra, em condições definidas. É geralmente expressa como desvio
padrão ou desvio padrão relativo (BACAN, 1979).
As análises são efetuadas em replicata, utilizando os dois métodos,
em separado, sobre as mesmas amostras, numa faixa restrita de
concentrações ou em toda faixa de concentrações em que se pretende
validar o método. O método é mais sensível quando pequenas variações
de concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, maior
inclinação (SKOOG, 2009).
Devido à importância do controle desse parâmetro para o
lançamento de efluentes, este trabalho tem por finalidade estudar e
identificar entre os dois métodos analíticos instrumentais, um utilizando
espectrofotômetro e outro, HPLC (Cromatografia Liquida de Alta
Precisão), aquele de melhor aplicabilidade e confiabilidade analítica
dentro da rotina de análise do laboratório.
Essa comparação contribuirá na identificação e seleção, dentre as
duas técnicas que serão estudadas, aquela que melhor responda de
forma precisa e exata dentro de limites aceitáveis.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo principal deste trabalho foi determinar através da
comparação entre duas técnicas instrumentais, espectrofotometria e
HPLC, aquela que demonstre maior aplicabilidade dentro da rotina de
análises de Nitrogênio Amoniacal em efluentes industriais.
2.2. Objetivo Específico:
Comparar as curvas de calibração ou coeficiente de linearidade
das duas técnicas e a resposta das amostras de efluentes;
Comparar os tempos, precisões, interferências e custos das
análises.
17
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Nitrogênio Amoniacal
São diversas as fontes de nitrogênio nas águas naturais. Os
esgotos sanitários constituem em geral a principal fonte, lançando nas
águas nitrogênio orgânico devido à presença de proteínas e nitrogênio
amoniacal, devido à hidrólise sofrida pela ureia na água. Os esgotos
sanitários apresentam, normalmente, de 20 a 85 mg-N.L-1, das quais de 8
a 35 mg-N.L-1 são de nitrogênio orgânico e de 12 a 50 mg-N.L-1
encontram-se na forma amoniacal (METCALF & EDDY, 1991). Alguns
efluentes industriais também concorrem para as descargas de nitrogênio
orgânico e amoniacal nas águas, como algumas indústrias químicas,
petroquímicas, siderúrgicas, farmacêuticas, de conservas alimentícias,
matadouros, frigoríficos e curtumes. A atmosfera é outra fonte importante
devido a diversos mecanismos: (a) o de fixação biológica desempenhada
por bactérias e algas, que incorporam o nitrogênio atmosférico em seus
tecidos, contribuindo para a presença de nitrogênio orgânico nas águas;
(b) o de fixação química, reação que depende da presença de luz, e que
concorre para as presenças de amônia e nitratos nas águas; (c) o das
lavagens da atmosfera poluída pelas águas pluviais, que concorrem para
as presenças de partículas contendo nitrogênio orgânico, bem como para
a dissolução de amônia e nitratos. Nas áreas agrícolas, o escoamento
das águas pluviais pelos solos fertilizados também contribui para a
presença de diversas formas de nitrogênio. Também nas áreas urbanas,
as drenagens de águas pluviais associadas às deficiências do sistema de
limpeza pública, constituem fonte difusa de difícil caracterização
(METCALF & EDDY, 1991).
O ciclo do nitrogênio na natureza é ilustrado na Figura 1.
18
Figura 1. Ciclo do nitrogênio na natureza. Fonte: METCALF & EDDY (1991).
O nitrogênio orgânico que toma parte no tecido de uma planta pode
ser incorporado em tecidos animais pelo processo nutricional destes. A
morte, seguida de decomposição, de animais e vegetais e,
principalmente, as transformações sofridas pelos compostos orgânicos
presentes nos esgotos, levam à formação de nitrogênio amoniacal nas
águas, nas formas de amônia gasosa (NH3) ou do íon amônio (NH4+). Nas
águas, o processo de oxidação biológica sofrida pela amônia, que é
convertida a nitrito (NO2-) por um grupo de bactérias nitrificadoras
chamadas Nitrossomonas e, posteriormente, a nitrato (NO3-) por outro
grupo conhecido por Nitrobacter, chama-se nitrificação. A nitrificação é
um processo que ocorre apenas em meio aeróbio, pois não existem
bactérias anaeróbias nitrificadoras. Corresponde, como visto, à demanda
bioquímica de oxigênio de segundo estágio, devendo ocorrer nas
estações de tratamento de esgotos. O processo inverso, ou seja, a
redução biológica, é possível, mas o caminho preferencial é a redução de
nitrato a nitrito e posteriormente a nitrogênio gasoso (N2).
Este processo se denomina desnitrificação e ocorre em meio
anóxico, isto é, na ausência de oxigênio livre, em lodos de fundo de rios e
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lagos e de unidades de separação de sólidos (decantadores) de estações
de tratamento de esgotos. Reatores anaeróbios são projetados com esta
função específica, pois a nitrificação (aeróbia) e a desnitrificação
(anóxica) levam ao controle efetivo dos problemas que os compostos
nitrogenados podem trazer às águas naturais.
Ocorrem ainda, no ciclo do nitrogênio na natureza, as fixações
químicas e biológicas e o seu uso como nutriente, sendo que as plantas
são capazes de metabolizar nitratos e os animais nutrem-se de nitrogênio
na forma orgânica, principalmente.
3.1.1 Formas em que os compostos de nitrogênio se
apresentam nas águas
Como visto, o nitrogênio pode ser encontrado nas águas nas
formas de nitrogênio orgânico, amoniacal, nitrito e nitrato. As duas
primeiras chamam-se formas reduzidas e as duas últimas, formas
oxidadas. Pode-se associar a idade da poluição com a relação entre as
formas de nitrogênio, ou seja, se for coletada uma amostra de água de
um rio poluído e as análises demonstrarem predominância das formas
reduzidas significa que o foco de poluição se encontra próximo; se
prevalecer nitrito e nitrato, ao contrário, significa que as descargas de
esgotos se encontram distantes. Nas zonas de autodepuração natural em
rios, distinguem-se as presenças de nitrogênio orgânico na zona de
degradação, a primeira zona de poluição que se forma após o lançamento
do esgoto, amoniacal na zona de decomposição ativa, na qual se localiza
o ponto de concentração mínima de oxigênio dissolvido nas águas, nitrito
na zona de recuperação e nitrato na zona de águas limpas.
20
3.1.2 Importância nos estudos de controle de qualidade das
águas
Os compostos de nitrogênio são nutrientes para processos
biológicos. São tidos como macronutrientes, pois, depois do carbono, o
nitrogênio é o elemento exigido em maior quantidade pelas células vivas.
Quando descarregados nas águas naturais juntamente com o fósforo e
outros nutrientes presentes nos despejos, provocam o enriquecimento do
meio tornando-o mais fértil e possibilita o crescimento em maior extensão
dos seres vivos que os utilizam, especialmente as algas, o que é
chamado de eutrofização. Quando as descargas de nutrientes são muito
fortes, dá-se o florescimento muito intenso de gêneros que predominam
em cada situação em particular. Este crescimento excessivo de
populações de algas pode trazer prejuízos aos usos que se possam fazer
dessas águas, prejudicando seriamente o abastecimento público ou
causando poluição por morte e decomposição. O controle da eutrofização,
através da redução do aporte de nitrogênio, é comprometido pela
multiplicidade de fontes, algumas muito difíceis de serem controladas
como a fixação do nitrogênio atmosférico, por parte de alguns gêneros de
algas. Por isso, deve-se investir preferencialmente no controle das fontes
de fósforo.
Deve ser lembrado também que os processos de tratamento de
esgotos empregados atualmente no Brasil não são otimizados para a
remoção de nutrientes e os efluentes finais tratados liberam grandes
quantidades destes, que também podem dar margem à ocorrência do
processo de eutrofização.
Nos reatores biológicos das estações de tratamento de esgotos, o
carbono, o nitrogênio e o fósforo têm que estar em proporções adequadas
para possibilitar o crescimento celular sem limitações nutricionais. Com
base na composição das células dos microrganismos que formam parte
dos tratamentos, costuma-se exigir uma relação DBO:N:P mínima de
21
100:5:1 em processos aeróbios e uma relação DQO:N:P de pelo menos
350:7:1 em reatores anaeróbios, sendo que alguns autores propõem
500:5:1. Deve ser notado que estas exigências nutricionais podem variar
de um sistema para outro, principalmente em função do tipo de substrato.
Os esgotos sanitários são bastante diversificados em compostos
orgânicos, já alguns efluentes industriais possuem composição bem mais
restrita, com efeito sobre o ecossistema a ser formado nos reatores
biológicos para o tratamento e sobre a relação C/N/P. No tratamento de
esgotos sanitários, estes nutrientes se encontram em excesso, não
havendo necessidade de adicioná-los artificialmente, ao contrário, o
problema está em removê-los. Em alguns efluentes industriais, como é o
caso dos efluentes de fábricas de celulose, que são compostos
basicamente de carboidratos, não possuindo praticamente nitrogênio e
fósforo, estes devem ser adicionados de forma a perfazer as relações
recomendadas, utilizando-se para isto uréia granulada, rica em nitrogênio,
e fosfato de amônia, que possui nitrogênio e fósforo, dentre outros
produtos comerciais.
Pela legislação federal em vigor, a resolução N 430 do CONAMA,
o nitrogênio amoniacal é padrão de classificação das águas naturais e
padrão de emissão de esgotos. Atender a um padrão de emissão igual a
20 mg-N.L-1 para amônia total pode ser difícil para sistemas de tratamento
por lagoas de estabilização fotossintéticas ou por processo anaeróbio,
mesmo que complementados por processos físico-químicos a base de
coagulação e floculação com separação de sólidos por sedimentação ou
por flotação com ar dissolvido.
O nitrato é tóxico, causando uma doença denominada
metaemoglobinemia infantil, que é letal para crianças (o nitrato é reduzido
a nitrito na corrente sanguínea, competindo com o oxigênio livre, tornando
o sangue azul). Por isso, o nitrato é padrão de potabilidade, sendo 10 mg
N-NO3.L-1 o valor máximo permitido pela Portaria 518/2000 do Ministério
da Saúde. Pode ser entendido como um contaminante que pode se
22
apresentar nas águas naturais sem ter sido introduzido diretamente,
decorrendo do processo de decomposição biológica da matéria orgânica
nitrogenada.
A amônia é um tóxico bastante restritivo à vida dos peixes, sendo
que muitas espécies não suportam concentrações acima de 5 mg.L-1.
Além disso, como visto anteriormente, a amônia provoca consumo de
oxigênio dissolvido das águas naturais ao ser oxidada biologicamente, a
chamada DBO de segundo estágio. Por estes motivos, a concentração de
nitrogênio amoniacal é importante parâmetro de classificação das águas
naturais e normalmente é utilizada na composição de índices de
qualidade das águas. Como a amônia gasosa (molecular, NH3) é mais
tóxica que o íon amônio (NH4+) e prevalece em faixa mais elevada de pH,
a Resolução 430 do CONAMA estabelece limites de amônia na água em
função do valor do pH. Por exemplo, para águas classe 1, o limite de
amônia total é de 3,7 mg-N.L-1 para pH ≤ 7,5; 2,0 mg-N.L-1 para 7,5 < pH
≤ 8,0; 1,0 mg-N.L-1 para 8,0 < pH ≤ 8,5 e 0,5 para pH > 8,5.
3.2 Espectrofotometria
A espectrofotometria engloba um conjunto de técnicas analíticas,
denominadas de espectroscopia que se baseia na interação da luz e
outras formas de radiação eletromagnéticas utilizadas para identificação
de moléculas ou espécies atômicas.
Os métodos espectrofotométricos de análise são baseados na
medida da quantidade de radiação produzida ou absorvida pelas
moléculas ou pelas espécies atômicas de interesse, sendo esta técnica
amplamente utilizada em laboratórios químicos e clínicos de todo mundo
(SKOOG, 2002).
23
A absorção de radiação ultravioleta ou visível também conhecida
como espectroscopia molecular, baseia-se na excitação de elétrons de
ligação, ao passar um feixe de luz branca através de uma cubeta de vidro
ou quartzo com um líquido. Fenômenos de interação ocorrem com as
moléculas presentes no sistema e a radiação emergente será menos
intensa que a incidente. Segundo (Ewing 1972) esta diminuição na
intensidade pode ser igual em todo o intervalo do comprimento de onda
ou pode apresentar diferentes amplitudes para diferentes cores.
A espectroscopia de absorção molecular é, portanto valiosa para
identificar grupos funcionais em uma molécula. Mais importantes, no
entanto, são as aplicações da espectroscopia de absorção ultravioleta e
visível na determinação quantitativa de compostos contendo grupos
absorventes (SKOOG, 2006).
Denomina-se radiação eletromagnética as ondas que se propagam
nas regiões do Ultra-Violeta/Visível e algumas vezes no infravermelho
(IV), mas para Skoog (2006) esse termo deveria ser utilizado somente
para o comprimento de onda do visível. A radiação eletromagnética é uma
onda com comprimento, frequência, velocidade e amplitude.
Fenômenos como a reflexão, refração, interferência e difração, são
tratados no campo da radiação eletromagnética como constituídos de um
campo elétrico e um campo magnético, oscilantes e perpendiculares entre
si, como mostrado na Figura 2, onde o campo elétrico oscila de forma
senoidal no eixo y em uma determinada frequência.
O campo elétrico na onda eletromagnética está representado como
um vetor, cujo comprimento é proporcional ao campo.
O campo elétrico para uma dada frequência oscila de forma
senoidal no espaço e no tempo, conforme a Figura 2. O campo elétrico é
24
representado como um vetor cujo comprimento é proporcional à
intensidade do campo.
Figura 2: Natureza ondulatória de um feixe de radiação com uma única frequência, onde
uma onda plano-polarizada é mostrada propagando-se ao longo do eixo x.
Fonte: Fundamentos da Química Analítica (2006).
O eixo x no gráfico representa o tempo quando a radiação passa
por um ponto fixo no espaço ou à distância para um tempo fixo. A direção
na qual o campo oscila é perpendicular àquela na qual a radiação se
propaga.
Figura 3: Natureza ondulatória de um feixe de radiação com uma única frequência, onde
somente as oscilações do campo elétrico são mostradas.
25
Fonte: Fundamentos da Química Analítica (2006).
Na Figura 3, a amplitude da onda é o comprimento do vetor de
campo elétrico no ponto máximo da onda, enquanto o comprimento da
onda é a distância entre dois máximos sucessivos.
Segundo Skoog (2006) uma característica da onda observada seria
a amplitude da onda senoidal e o comprimento de onda através de uma
representação espacial, onde segundo o mesmo autor o período (p) da
radiação representa o tempo em segundos necessários para a passagem
de dois máximos sucessivos ou dois mínimos por um ponto fixo no
espaço, sendo a frequência (v) o número de oscilações do vetor campo
elétrico por unidade de tempo em que o valor é igual a 1/p. O
comprimento de onda (λ) é a distância linear entre dois máximos ou
mínimos sucessivos de uma onda, como mostrado na Figura 3.
O espectro eletromagnético cobre uma faixa enorme de energia
(frequência) e, portanto, de comprimento de onda conforme Tabela 1. As
frequências úteis variam de 1019 Hz (raios γ) a 103 Hz (onda de rádio).
Tabela 1: Região do espectro eletromagnético e seus respectivos
comprimentos de onda.
Fonte: Fundamentos de Química Analítica (2006)
Análises empregando as interações da radiação com a matéria são
muito utilizadas pelos espectroscopistas para obter informações sobre
uma amostra através de estímulos como energia na forma de calor,
energia elétrica, luz, partículas ou por uma reação química. O analito que
26
se encontra em seu estado de energia mais baixo ou estado fundamental,
faz com que algumas das espécies da amostra sofram uma transição
para um estado de maior energia ou estado excitado, onde segundo
Skoog (2006), obtêm-se informações sobre o analito medindo-se a
radiação eletromagnética emitida quando esta retorna ao estado
fundamental ou a quantidade de radiação eletromagnética absorvida
decorrente da excitação.
O processo de absorção é conhecido como a lei de absorção ou lei
de Beer-Lambert, que afirma quantitativamente que a grandeza da
atenuação depende da concentração das moléculas absorventes e da
extensão do caminho sobre o qual ocorre a absorção. À medida que a luz
atravessa um meio contendo um analito, um decréscimo de intensidade
ocorre na proporção que o analito é excitado. Para uma solução do
analito de determinada concentração, quanto mais longo for o
comprimento do caminho do meio através do qual a luz passa (caminho
óptico), mais centros absorventes existirão, e maior será a atenuação.
Também, para um dado caminho óptico, quanto maior for a concentração
de absorventes, mais forte será a atenuação (SKOOG, 2006).
A absorbância A de uma solução está relacionada com a
transmitância de forma logarítmica, como mostrada na equação A = -logT
= log(P0/P). Quando a absorbância de uma solução aumenta, a
transmitância diminui de acordo com a Figura 4.
27
Figura 4: Atenuação de um feixe de radiação por uma solução absorvente.
Fonte: Fundamentos da Química Analítica (2006).
A seta larga representando o feixe incidente significa maior
potência radiante que aquela transmitida pela solução. O caminho óptico
da solução absorvente é igual a b, e sua concentração, igual a c.
Os termos P0 e P segundo Skoog (2006) referem-se à potência de
um feixe que tenha passado por uma célula contendo o branco (solvente)
e o analito, respectivamente.
De acordo com a lei de Beer, existe uma relação de linearidade
entre a concentração da substância absorvente e a intensidade de luz
emitida. Conforme a equação A = log (P0/P) = abc, onde a é a constante
de proporcionalidade denominada absortividade c e ao caminho óptico b
do meio absorvente. Uma vez que a absorbância é uma grandeza
adimensional (sem unidade), a absortividade tem unidades que cancelam
as unidades de b e c.
Quando expressamos a concentração em mols por litro e b em
centímetros, a constante de proporcionalidade é chamada absortividade
28
molar, à qual é dado o símbolo especial, ε, em que ε possui as unidades
de L. mol-1. cm-1.
São poucos os desvios observados na lei de Beer. Porém,
observam-se algumas alterações entre a absorbância e a concentração
quando o caminho óptico b é mantido constante (SKOOG, 2006).
Alguns desvios, denominados desvios reais, são fundamentais e
representam limites reais a lei de Beer. Outros são resultantes do método
que empregamos para efetuar as medidas de absorbância (desvios
instrumentais) ou resultados de alterações químicas que ocorrem com a
variação (desvios químicos). Concentrações que excedem 0,01 mol.L-1
causam desvios de linearidade, pois quanto maior a concentração, mais
próximos estão os íons causando interações eletrostáticas, levando ao
afastamento da lei de Beer. Os desvios químicos aparecem quando a
espécie absorvente sofre associação, dissociação ou reação com
solventes para gerar produtos que absorvem de forma diferente do analito
(SKOOG, 2006).
Segundo (INMETRO, 2003) a relação da resposta do instrumento
para a concentração não tem que ser perfeitamente linear para um
método ser efetivo, porém nesse caso, a curva de calibração deve ser
preparada diariamente, sendo que alguns procedimentos analíticos não
demonstram linearidade mesmo após quaisquer alterações.
Outra fonte de desvio são as radiações policromáticas já que a lei
de Beer se aplica as monocromáticas.
29
3.2.1 Sistema Espectrofotométrico HACH DR 2800
O espectrofotômetro HACH DR 2800 é formado basicamente de
quatro partes fundamentais: fonte, monocromador, célula de fluxo
portacubeta e detector.
A fonte utilizada emite uma radiação contínua também conhecida
como fonte “branca” em uma ampla faixa de comprimento de onda. O
princípio da radiação das lâmpadas baseia-se na incandescência, visto
que qualquer substância a uma dada temperatura acima de zero absoluto
emite radiação.
Os espectros contínuos podem ser obtidos através das descargas
em diversos gases, por exemplo, em xenônio a várias atmosferas, em
vapor de mercúrio, hidrogênio e deutério (EWING, 1972).
As fontes de radiação mais usadas são as lâmpadas de deutério,
tubos de descarga de hidrogênio e tungstênio. O HACH DR 2800 utilizado
neste trabalho, opera na faixa do visível, de 400nm a 900nm utilizando
lâmpada de tungstênio. Depois de emitir este feixe de radiação, uma
banda de comprimento de onda é selecionada, através de um filtro ou
monocromador.
O monocromador, segundo Cienfuegos (2000), tem como função
separar os diversos comprimentos de onda, permitindo isolar uma banda
de comprimento de onda bem estreita. O monocromador é formado por
um elemento de dispersão que pode ser um prisma ou uma rede de
difração, e duas fendas estreitas que servem como entrada e saída da
radiação. A fenda de entrada define um feixe estreito da radiação que
incide no elemento dispersante que tem como objetivo dispersar a
radiação com um leque, conforme a Figura 5. Uma fenda de saída deixa
passar uma banda bem estreita do comprimento de onda. Quanto mais
estreita for a fenda de saída e quanto mais distante estiver localizada do
30
prisma ou da rede de difração, melhor será a resolução do comprimento
de onda.
O prisma ou rede, juntamente com lentes, espelhos e fendas,
selecionam a banda de comprimento de onda desejado.
Figura 5: Dispersão da luz por um prisma (a) e (b) uma rede de transmissão.
Fonte: Métodos Instrumentais de Análise Química (1972).
Os prismas são elementos dispersantes convenientes entre o
ultravioleta próximo e as regiões do infravermelho médio, mas para Ewing
(1972) eles não são aplicáveis em outras regiões, sendo hoje em dia
muito utilizada a dispersão por rede.
Uma rede de difração é um componente óptico que opera por
reflexão ou transmissão de radiação e possui uma série de ranhuras
impressas em sua superfície, bem próximas umas das outras. Quando a
radiação é refletida ou transmitida pela rede, cada linha se comporta
como uma fonte independente de radiação. Diferentes comprimentos de
onda da radiação são refletidos ou transmitidos pela rede em ângulos
diferentes. A mudança de direção dos raios de radiação, provocada pela
rede, é denominado difração. Conforme as quantidades de linhas na rede
31
e o desvio sofrido pela radiação têm-se o comprimento de onda e a
rotação da rede permite selecionar outros comprimentos de onda
(HARRIS, 2008).
O comprimento de onda selecionado no monocromador para a
análise de Nitrogênio Amoniacal (655nm) incide sobre o líquido no
compartimento de amostragem, onde as interações da radiação com o
elemento irão ocorrer.
Na célula de fluxo portacubeta do equipamento utilizado neste
trabalho conforme Figura 6, são colocadas as cubetas de vidro de
material apropriado contendo a solução branco e o analito,
respectivamente.
Figura 6: Célula de fluxo portacubeta do espectrofotômetro HACH DR 2800.
Fonte: HACH, 2009.
O compartimento 1 da Figura 6 é utilizado para cubetas cilíndricas
de caminho óptico de 1cm. Já no compartimento 2 podem ser utilizadas
cubetas retangulares de caminho ópticos de 10cm.
Após a passagem da radiação monocromática pela área de
amostragem o feixe transmitido é captado pelo detector.
32
O detector é a parte do equipamento que recebe a energia radiante
transmitida através da solução e a transforma em energia elétrica. O mais
empregado é a célula fotomultiplicadora.
Quando a radiação passa para a unidade de detecção, o feixe é
focalizado em tubos fotomultiplicadores separados, os quais geram uma
diferença de potencial proporcional à energia incidente. Quando a energia
é absorvida no feixe da amostra, a diferença de potencial desequilibrada
que resulta é compensada pela diferença de potencial equivalente obtida
de uma porção de uma resistência variável (CIENFUEGOS, 2000).
O espectro obtido é registrado como comprimento de onda versus
transmitância. Como a absorbância (A) é proporcional a log 1/T, o uso de
uma resistência que varia de modo logarítmico com o comprimento
permite a obtenção de espectros lineares com relação à absorbância.
Geralmente uma fotocélula e/ou uma fotomultiplicadora avaliam a
intensidade do feixe emergente. O princípio do funcionamento baseia-se
no deslocamento de elétrons causado pela radiação que incide na
fotocélula ou fotomultiplicadora.
Os deslocamentos ocorrem porque esses dispositivos são
constituídos por substâncias semicondutoras. Esse movimento de
elementos produz uma corrente elétrica que pode operar um amperímetro
ou galvanômetro. Um tipo de fotocélula usada em fotometria são as
fotovoltaicas. Elas produzem corrente suficiente para operar um
microamperímetro sem requerer ampliação eletrônica (CIENFUEGOS,
2000).
Pode-se ter também fotoválvula a vácuo ou fotomultiplicadora
como receptor.
33
Uma fotoválvula a vácuo consiste em dois eletrodos encaixados em
um envoltório transparente. O cátodo é uma lâmina de metal recoberta
com um ânodo é um fio que funciona como coletor de elétrons.
De acordo com a Figura 7, as fotomultiplicadoras são um tipo de
válvula a vácuo onde se consegue uma ampliação do sinal de vários
milhões de vezes. É um dispositivo de grande sensibilidade, onde os
elétrons, emitidos pela superfície fotossensível, atingem uma segunda
superfície, denominado dinodo, que é positiva em relação ao emissor
fotossensível. Os elétrons são acelerados e atingem o dinodo com
energia cinética superior à sua energia cinética original. Esses novos
elétrons energizados retiram mais de um elétron da superfície do dinodo.
Esses novos elétrons são acelerados na direção de um segundo dinodo,
que é mais positivo que o primeiro. Esse processo é repetido diversas
vezes até que mais 106 elétrons sejam finalmente coletados para cada
fóton que atingiu a superfície. Desta maneira, intensidades de radiação
extremamente baixas são produzidas em sinais elétricos mensuráveis.
Figura 7: Esquema de uma fotomultiplicadora com nove dinodos.
Fonte: Análise Química Quantitativa (2008).
34
A amplificação do sinal ocorre em cada dinodo, que está
aproximadamente 90 volts mais positivo do que o dinodo anterior
(SKOOG, 2006).
3.3 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC)
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela
está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma
mistura, que ocorre devido a deferentes interações entre duas fases
imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionaria. A grande variedade de
combinações entre fases móveis e estacionárias torna-a uma técnica
extremamente versátil e de grande aplicação (Degani,2001).
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e
sua utilização é atribuída a um botânico russo, ao descrever suas
experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. Neste
estudo, a passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma
coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionaria), a
qual se adicionou o extrato, levou a separação dos componentes em
faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual esta técnica é
conhecida como cromatografia (“chrom” – cor e “graphie” – escrever),
podendo levar a errônea ideia de que este processo seja dependente da
cor (Braga,1998).
A Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE/HPLC) surgiu
como aplicação de cromatografia liquida as teorias e instrumentações
desenvolvidas originalmente para a cromatografia gasosa.
Baseando-se na teoria de cromatografia gasosa, de que a
eficiência de uma separação aumenta com a diminuição do tamanho da
35
partícula da fase estacionaria, surgiu, na década de 60, a Cromatografia
Liquida de Alta Eficiência.
A principal diferença entre a cromatografia liquida clássica e a
cromatografia liquida de alta eficiência é a utilização da fases
estacionarias com micropartículas (10, 5 ou 3 µm) esféricas, de
preferências. Estas fases, por serem muito menos permeáveis, tornaram
necessária a utilização de bombas para eluição da fase móvel
(HARRIS,2008).
A cromatografia liquida é a mais usada de todas as técnicas
analíticas de separação. As razões para essa popularidade do método
são sua detectabilidade, e sua pronta adaptabilidade às determinações
quantitativas com exatidão, a sua adequação para a separação de
compostos não voláteis ou termicamente instáveis e, acima de tudo, a sua
ampla aplicação a substancias de grande interesse para a indústria, para
muitos campos da ciência e para o publico. Exemplos desses materiais
incluem aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarbonetos,
carboidratos, drogas, terpenóides, agrotóxicos, antibióticos, esteróides,
espécies organometálicas e uma variedade de substancias inorgânicas
(SKOOG, 2009).
A instrumentação necessária para HPLC é extremamente
sofisticada, muito diferente dos aparelhos utilizados pela cromatografia
liquida clássica. A figura 8 os componentes fundamentais de um
equipamento para HPLC.
Figura 8: Diagrama de um cromatografo liquido
Fonte: SKOOG, 2009 6º edição
36
Atualmente, existem equipamentos totalmente computadorizados.
São divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente ou
por computador. Os softwares disponíveis são capazes de detectar
problemas de funcionamento e também a necessidade de troca de
alguma peça.
O desenvolvimento de colunas com fase estacionaria preparadas
com partículas de menor diâmetro, as quais ofereciam maior resistência a
passagem de fase móvel, tornou necessária a utilização de sistemas de
bombeamento mais eficientes. As primeiras bombas utilizadas,
conhecidas como bombas de baixa pressão, produziam fluxos pulsantes,
sendo inadequadas para tal fim.
Segue abaixo a figura 9 que mostra a instrumentação utilizada para
detectar e quantificar o Nitrogênio Amoniacal em efluentes industriais.
Figura 9: HPLC Waters – Instrumentação usada para analise de N-NH3.
Fonte: Laboratório Central – Monsanto.
37
A utilização de detectores de fluorescência tornou-se mais ampla a
partir do desenvolvimento de técnicas de derivatização utilizadas na
análise de compostos não fluorescentes ou pouco fluorescentes (VOGEL,
2008).
Segundo Busto (apud PRESTES, 2007), os agentes derivatizantes
mais utilizados na determinação por fluorescência de aminas bioativas
são: cloreto de dansyl, ortoftalaldeído (OPA) e fluorescamine. A principal
vantagem que o reagente OPA apresenta em relação aos outros
reagentes derivatizantes é que este reage com aminas rapidamente e
possibilita a detecção de baixos níveis de aminas biogênicas.
3.3.1 – Cromatografia por troca iônica
Na cromatografia por troca iônica, a fase estacionaria é um tipo de
fase ligada com grupos iônicos, como os grupos sulfônicos, -SO3-, ou
carboxílico, COO-, no fim de uma cadeia alifática curta, no caso dos
trocadores de cátions, ou o grupo amina quaternária , -NR3+, no fim da
cadeia, normalmente propil, no caso do trocador de ânions. Os grupos
iônicos tem contra-ions (com carga oposta) que podem ser deslocados
pelos íons dissolvidos na fase móvel de cargas que lhe são similares. Por
exemplo, para uma fase trocadora de cátions, tem-se o equilíbrio entre o
contra-íon Na+ e o cátion da amostra, M+ (Braga, 2006):
M+ + R-SO3- Na+ Na+ + R-SO3
- M+
Exemplos de compostos separados por cromatografia de troca
iônica são ácidos carboxílicos, bases orgânicas, peptídeos, aminoácidos e
ácidos nucleicos, que podem se ionizar em soluções com pH
devidamente tamponado, bem como ânions inorgânicos e cátions
metálicos ou complexos (Collins, 2006).
38
No caso deste trabalho que é a amônia, utilizou-se os grupos
carregados de R quimicamente ligados e que estão presentes em todo
tipo de material de troca iônica. Para amônia utilizamos –NH2R+ ou NH3
+
trocadores fracos de ânions (Collins,2006).
A matriz pode ser constituída de resinas poliméricas porosas ou
partículas microporosas de sílica, ambas com grupos iônicos apropriados,
quimicamente ligados. O uso como matriz de partículas microporosas de
sílica resulta em fase estacionarias de alta eficiência, boa estabilidade,
tanto à pressão como a solventes, e alta capacidade de troca. Contudo,
seu emprego restringe-se ao intervalo de 2 < pH < 8 (Guimarães,2006).
A fase móvel é uma solução salina tamponada escolhida de forma
a ser compatível com o trocador iônico selecionado.
A seletividade e retenção nesta técnica é fortemente influenciada
pelo tamanho e carga dos analitos, tipo de trocador iônico, temperatura da
coluna e diversas características da fase móvel, tais como pH, força
iônica, vazão, modificador orgânico, tipo de contra-ion, concentração do
contra-ion e tipo de solução-tampão. A ordem de eluição dos analitos é
muito difícil de ser prevista, visto que muitos fatores estão envolvidos,
além de problemas de adsorção que podem ocorrer. Portanto, a
otimização de uma separação por cromatografia de troca iônica é feita
empiricamente (Collins,2006).
39
4. METODOLOGIA
Esse trabalho foi realizado no Laboratório Central da MONSANTO
DO BRASIL S.A., situado na cidade de São Jose dos Campos – SP no
período de Agosto a Outubro de 2013. Na execução dos ensaios serão
utilizadas duas técnicas analíticas instrumentais, sendo uma via
espectrofotometria Método 10031 da HACH (Método Salicilato) onde o
composto de amoníaco combinado com cloro livre encontrado na maioria
dos casos forma a monocloramina, sendo assim, a mesma reage com o
salicilato para formar o 5-aminossalicilato que é oxidado na presença de
um catalisador de nitroprussiato de sódio e desenvolve uma coloração
azul. A cor azul é mascarada pela cor amarela do reagente em excesso
presente gerando na verdade uma cor verde que será absorvida pelo
HACH no comprimento de onda de 655 nm (HACH 2013).
Reação que acontece no tubo reagente para formar um complexo colorimétrico.
Fonte: Método HACH
E outra pelo método de HPLC onde o nitrogênio amoniacal
separado cromatograficamente por meio de uma coluna de troca iônica,
usando como fase móvel uma solução de KH2PO4 0,010 mol.L-1 e
identificadas através de uma reação após eluição com Ortoftalaldeido
OPA (PCR- reagente pós-coluna) em presença de MERC (2-
mercaptoetanol), podendo ser quantificados através de um detector de
fluorescência com comprimento de onda de excitação 340 nm e de
emissão 420 nm (EPA Método 547).
40
OPA Complexo Fluorescente
Reação pós-coluna OPA/MERC antes de ir para o detector
Fonte: EPA Method 547
Inicialmente serão preparados cinco padrões de Nitrogênio
Amoniacal nas concentrações de 0,1ppm, 0,5ppm, 1,0ppm, 2,5ppm e
5,0ppm, a partir da diluição do padrão de Nitrogênio Amoniacal de
100ppm da marca HACH para calibração do HPLC e posteriormente
serão preparados 10 padrões de concentrações 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0,
10,0, 20,0, 30,0, 40,0 e 50,0 ppm do mesmo padrão referência para
calibração do espectrofotômetro, rastreada ao NIST, o que garante a
confiabilidade dos resultados. Com esses padrões iremos construir a
curva de calibração. Os procedimentos de calibração seguiram os
manuais de funcionamento dos respectivos equipamentos.
Para verificação da curva de calibração de ambas as técnicas
instrumentais utilizou-se um padrão de referência de 10,0 ppm da HACH
para garantir a checagem do equipamento e garantir a eficiência da
lineralidade da curva de calibração. Na comparação das técnicas utilizou-
se amostras de Efluente Bruto (Lagoa A, Lagoa B e Lagoa C) e Efluente
Tratado (Saída do Tanque de Aeração) do tratamento de efluentes da
Monsanto num período de 30 dias onde teremos 30 dados analíticos para
realizar o estudo estatístico de variância para provar a precisão e
acuracidade dos métodos.
Para o método espectrofotométrico, utilizou-se o espectrofotômetro
HACH DR 2800 no comprimento de onda de 655 nm (MÉTODO 10031,
HACH). Calibrou-se o equipamento de acordo com o manual do
Fabricante, onde foram adicionados 0.1mL de padrão ou amostra no tubo
reagente da HACH já pronto para analise que contem: (AmVer Diluent
41
Reagent Test ‘N), um envelope do regente HACH Ammonia Salicylate e
outro envelope do reagente HACH Ammonia Cyanurate. Fechou-se o
tubo, homogeinizou-se bem e deixou em repouso por 20 minutos.
Efetuou-se a leitura após zerar o equipamento fazendo a reação anterior
mas adicionando água DI como branco, coletou-se os valores de
absorbância e construir a curva de calibração e após realizar as analises
das amostras.
Para o método de HPLC utilizou-se o cromatógrafo liquido com os
módulos da marca WATERS nas seguintes condições:
Temperatura da coluna: Ambiente
Índice de Fluxo da fase móvel : 0,70 mL.min-1
Índice de Fluxo da fase reagente: 0,20 mL.min-1
Temperatura do coil pós-coluna: Ambiente
Sistema de Detecção : Fluorescência
o Excitação da lâmpada = 340 nm
o Emissão da lâmpada = 420 nm
o Sensibilidade detector = 1000 FUFS
o A lâmpada é ligada automaticamente quando se injeta a
amostra
o Filtro digital = 2.0 segundos
o Voltage = 600 V
o Tempo de corrida = 16 minutos
o Volume de injeção = 2 a 100 microlitros
Após o condicionamento do equipamento nas condições acima
descritas foram injetados os padrões, amostras e coletou-se os dados
através do software CDS.
Para a garantia e qualidade dos resultados obtidos será utilizo-se
neste trabalho micropipeta volumétrica 0,1 mL a 10 mL da Eppendorf
calibrada para pipetagem dos padrões e amostras; béquer de 50 mL; tubo
42
de vidro (cubeta) de 5mL; espectrofotômetro HACH DR 2800; Bomba
HPLC - Waters modelo 515 ou equivalente; Bomba de reação pós-coluna
- Waters modelo RMA ou equivalente; Detector HPLC - Waters 2475
Fluorescência ou equivalente; Sistema de injeção - Autosampler Waters
717 ou equivalente; Coluna cx (troca catiônica) - Zorbax 300 SCX 4,6mm
x 25cm, MacMod Part N°. 880952,704; Misturador Tee - 1/16 x 1/16´´ OD
Union Tee ou equivalente; Misturador tubulação (coil) - tubo de Teflon
PTFE medida 20 ft . 1/16´´ OD ou equivalente; Aparelho de filtragem
Millipore - filtro de 0,45 micra; Balança analítica - precisão a cerca de ±
0,1 mg; Vidraria normal de laboratório e suprimentos; Software de coleta
de dados cromatográficos (CDS). Água ultrapura MilliQ; padrão de
nitrogênio amoniacal de 100ppm marca HACH; Água deionizada ou
desmineralizada; Dihidrogenofosfato de Potássio P.A. (KH2PO4) ou de
maior pureza; Metanol P.A. (CH3COH) ou de maior pureza; Ácido
Fosfórico 85% P.A. (H3PO4) ou de maior pureza; Ácido Bórico P.A.
(H3BO3) ou de maior pureza; Hidróxido de Potássio P.A. (KOH) ou de
maior pureza; Ortoftalaldeído P.A. (OPA - C6H4-1,2-[CHO]2) ou de maior
pureza;2-Mercaptoetanol P.A. (HSCH2CH2OH) ou de maior pureza.
Após registro das informações, os dados obtidos foram tratados
estatisticamente no programa de tratamento de dados estatísticos
MINITAB. Para avaliação da precisão e exatidão foram utilizados o
coeficiente de linearidade, a dispersão dos pontos na curva de calibração,
desvio relativo, desvio padrão, o Teste de Fisher (F) e o erro relativo.
43
5. RESULTADOS
De acordo com as metodologias acima descritas, os resultados
obtidos experimentalmente na calibração e análise de Nitrogênio
Amoniacal foram registrados em tabelas, equações e gráficos.
Neste trabalho utilizou-se o teste de regressão linear para
avaliação dos resultados obtidos, bem como o desvio relativo e o desvio-
padrão das leituras, e a média dos tempos de calibração entre diferentes
analistas.
Os valores de absorbância e área obtidos da calibração dos
equipamentos espectrofotômetro HACH DR 2800 e HPLC Waters estão
expostos nas Tabelas 2 e 3.
Tabela 2: Valores de calibração obtidos na leitura de padrões pelo
método espectrofotométrico HACH.
Padrão de N-NH3 [ mg.L-1] Hach [ ABS]
0,000
0,000
0,106
0,003
0,532
0,011
1,006
0,033
2,503
0,078
4,976
0,147
10,000
0,359
19,749
0,769
29,968
1,183
39,420
1,511
46,938 1,870
Para se verificar a dispersão dos pontos foram utilizados os dados
da Tabela 2 para a construção do Gráfico, conforme Figuras 10.
44
Abaixo do gráfico verifica-se a equação da reta e o coeficiente de
linearidade (r2) obtida após tratamento dos dados no Excel.
Figura 10: Curva padrão de Nitrogênio Amoniacal pelo método HACH.
A equação da reta e o Coeficiente de Linearidade para o método
espectrofotométrico é y = 0,0396x - 0,0168 e o r2 = 0,9991.
Tabela 3: Valores de calibração obtidos na leitura de padrões pelo
método HPLC Waters.
Padrão de N-NH3 [mg.L-1] HPLC – Área
[µV.min]
0,000
0,000
0,100
395,000
0,500
2098,700
2,500
10397,000
5,000 19745,400
Para se verificar a dispersão dos pontos foram utilizados os dados
da Tabela 3 para a construção do Gráfico, conforme Figuras 11.
Abaixo do gráfico verifica-se a equação da reta e o coeficiente de
linearidade (r2) obtida após tratamento dos dados no Excel.
45
Figura 11: Curva padrão de Nitrogênio Amoniacal pelo método HPLC.
A equação da reta e o Coeficiente de Linearidade para o método
HPLC é y = 3944,95628x – 160,38648 e o r2 = 0,9995.
Figura 12: Cromatograma do Padrão de Nitrogênio Amoniacal
46
Para comparação dos métodos por espectrofotométrico HACH e
HPLC, os coeficientes de linearidade foram obtidos a partir da equação da
reta conforme a Tabela 4, onde os dados da Tabela 2 e 3 foram tratados
no Excel.
Tabela 4: Equipamentos e seu coeficiente de linearidade.
Equipamento Coeficiente de Linearidade r2
Espectrofotometro Dr 2800 HACH
0,9991
HPLC Waters 0,9995
Aceita-se para qualquer técnica segundo APHA (2005) um
coeficiente de linearidade ≥0,995.
Posteriormente à calibração dos equipamentos e análise dos
valores dos coeficientes de linearidade, as amostras foram lidas 3 vezes
cada uma e os valores da media podem ser observados nas Tabelas 5 e
6. Foram avaliados também, os desvios-padrão e os desvios relativos.
47
Tabela 5: Concentração de Nitrogênio amoniacal em ppm medida
nas amostras pelo método de HPLC.
Nº Analises Data Lagoa A Lagoa B Lagoa C TQ. Aeração
1 09/09/2013 1,74 0,78 126,41 0,19
2 10/09/2013 0,36 0,56 128,89 0,10
3 11/09/2013 1,20 2,30 115,00 0,20
4 12/09/2013 1,47 3,83 131,37 0,10
5 13/09/2013 1,76 4,87 86,59 0,10
6 16/09/2013 16,36 1,27 127,20 0,10
7 17/09/2013 1,03 0,10 93,00 0,10
8 18/09/2013 1,27 2,01 56,23 0,20
9 19/09/2013 2,06 2,77 132,00 0,10
10 20/09/2013 2,18 2,49 121,12 0,10
11 23/09/2013 0,90 0,83 133,00 0,20
12 24/09/2013 2,17 1,80 102,60 0,10
13 25/09/2013 3,03 2,70 107,07 0,10
14 26/09/2013 2,32 1,97 104,27 0,10
15 27/09/2013 1,89 0,76 59,94 0,20
16 30/09/2013 0,91 0,74 119,58 0,10
17 03/10/2013 1,41 18,91 128,88 0,10
18 04/10/2013 2,22 2,41 126,55 0,10
19 07/10/2013 2,11 1,31 125,08 0,20
20 08/10/2013 0,22 0,60 89,98 0,10
21 09/10/2013 2,59 2,56 32,81 0,10
22 10/10/2013 2,30 3,54 77,12 0,73
23 11/10/2013 2,59 2,88 65,10 0,23
24 14/10/2013 10,75 8,04 69,93 0,60
25 15/10/2013 0,77 0,28 55,43 0,10
Para se atingir o objetivo proposto foram realizadas também,
leituras das mesmas amostras pelo método espectrofotométrico, visando
a comparação das duas técnicas.
48
Tabela 6: Concentração de Nitrogênio amoniacal em ppm medida
nas amostras pelo método de HACH.
Para efeito de comparação, os resultados obtidos nas diferentes
técnicas e Lagoas foram plotados e estão representados no gráfico da
Figura 13, 14, 15 e 16.
Nº Analises Data Lagoa A Lagoa B Lagoa C TQ. Aeração
1 09/09/2013 1,93 0,82 125,96 0,22
2 10/09/2013 0,30 0,67 129,33 0,10
3 11/09/2013 1,23 2,06 115,00 0,20
4 12/09/2013 1,36 3,55 131,00 0,13
5 13/09/2013 1,51 4,60 87,00 0,10
6 16/09/2013 15,99 1,25 127,00 0,10
7 17/09/2013 1,00 0,15 92,81 0,10
8 18/09/2013 1,12 2,32 56,00 0,14
9 19/09/2013 2,22 2,91 131,5 0,12
10 20/09/2013 2,01 2,77 121,00 0,19
11 23/09/2013 1,00 0,73 134,00 0,17
12 24/09/2013 2,09 1,63 103,00 0,11 13 25/09/2013 3,01 2,70 107,00 0,15 14 26/09/2013 2,26 1,79 104,00 0,10 15 27/09/2013 1,80 0,72 60,25 0,23
16 30/09/2013 0,90 0,71 120,1 0,10 17 03/10/2013 1,33 18,69 129,00 0,10 18 04/10/2013 2,25 2,40 126,09 0,10 19 07/10/2013 2,08 1,45 125,2 0,18 20 08/10/2013 0,20 0,55 90,26 0,19 21 09/10/2013 2,60 2,70 33,20 0,10 22 10/10/2013 2,30 3,26 77,00 0,82 23 11/10/2013 2,65 2,90 65,00 0,25 24 14/10/2013 11,09 8,00 70,20 0,55
25 15/10/2013 0,80 0,30 55,00 0,13
49
Figura 13: Comparação entre o resultados das leituras das amostras de Nitrogênio
Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa A.
Figura 14: Comparação entre os resultados das leituras das amostras de Nitrogênio
Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – TQ. Aeração.
50
Figura 15: Comparação entre os resultados das leituras das amostras de Nitrogênio
Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa C.
Figura 16: Comparação entre os resultados das leituras das amostras de Nitrogênio
Amoniacal pelo método HACH versus HPLC – Lagoa B.
Na tabela 7 são apresentadas as diferenças entre as técnicas,
assim como foi ilustrado nas figuras 13, 14, 15 e 16, porém, com o desvio
padrão, o desvio relativo e o erro relativo, não da técnica utilizada em
cada método, mas sim, confrontando os resultados apresentados por
cada um deles.
51
Tabela 7: Diferença de resultados em ppm entre os métodos HACH
x HPLC
Nº Analises Data Lagoa A Lagoa B Lagoa C TQ. Aeração
1 09/09/2013 0,19 0,04 0,45 0,03
2 10/09/2013 0,06 0,11 0,44 0,0
3 11/09/2013 0,03 0,24 0,0 0,0
4 12/09/2013 0,11 0,28 0,37 0,03
5 13/09/2013 0,25 0,27 0,41 0,0
6 16/09/2013 0,37 0,02 0,2 0,0
7 17/09/2013 0,03 0,05 0,19 0,0
8 18/09/2013 0,15 0,31 0,23 0,06
9 19/09/2013 0,16 0,14 0,5 0,02
10 20/09/2013 0,17 0,28 0,12 0,09
11 23/09/2013 0,10 0,10 1,00 0,03
12 24/09/2013 0,08 0,17 0,40 0,01
13 25/09/2013 0,02 0,10 0,07 0,05
14 26/09/2013 0,06 0,18 0,27 0,0
15 27/09/2013 0,09 0,04 0,31 0,03
16 30/09/2013 0,01 0,03 0,52 0,0
17 03/10/2013 0,08 0,22 0,12 0,0
18 04/10/2013 0,03 0,01 0,46 0,0
19 07/10/2013 0,03 0,14 0,12 0,02
20 08/10/2013 0,02 0,05 0,28 0,09
21 09/10/2013 0,01 0,14 0,39 0,0
22 10/10/2013 0,01 0,28 0,12 0,09
23 11/10/2013 0,06 0,02 0,10 0,02
24 14/10/2013 0,34 0,04 0,27 0,05
25 15/10/2013 0,03 0,02 0,43 0,03
Media
0,0992 0,1272 0,3108 0,026
Desvio Padrão
1,009549078 1,247528954 1,52603673 0,8804711
Desvio Relativo
0,098261691 0,101961561 0,203664823 0,029529646
Erro relativo
3,813624481 4,566996984 0,308835804 5,88888889
Para se verificar a dispersão dos pontos foram utilizados os dados
da Tabela 3 para a construção do Gráfico, conforme Figuras 11.
52
Figura 17 : Diferença de resultados entre as técnicas HACH x HPLC
Outro fator importante para podermos avaliar o objetivo do trabalho
foi comparar o tempo de análise para cada técnica. Pois este fator hoje
em dia é primordial para que o processo possa tomar rápidas decisões de
acerto do sistema de tratamento de efluentes em casos de falhas.
Tabela 8: Comparação de tempo de analises entre a técnica HACH
versus HPLC.
Equipamento Tempo de analise ( min)/amostra
Espectrofometro Dr 2800 HACH
30
HPLC Waters 13
A análise de variância Anova e o teste T foram utilizados neste
trabalho para determinar se os dois métodos diferem em precisão
analítica conforme NIT DICLA 008. Ambos foram calculados utilizando
53
recursos do software estatístico MINITAB, em função da quantidade de
leituras e estabelecendo 95% de confiança. Segue abaixo os gráficos e os
resultados plotados no Minitab.
Figura 18: Desvio Padrão apresentado nas duas metodologias
Fonte: Minitab 31/10/2013 Monsanto.
54
Figura 19: Gráfico tipo caixa mostra aonde se encontra a minha população de amostras
em função da concentração em ppm
Fonte: Minitab 31/10/2013 Monsanto.
Figura 20: Valores individuais de cada metodologia e seus resíduos
Fonte: Minitab 31/10/2013 Monsanto.
55
Figura 21: Valores dos Teste T e Analises de Variância Anova
Fonte: Minitab 31/10/2013 Monsanto.
Os valores apresentados acima, na figura 20, mostram que os
resultados das análises entre as diferentes técnicas são confiáveis e
estão com os valores críticos dentro dos intervalos estabelecidos pelo CI
95%. O teste T para estudo de paridades de técnicas demonstra que os
resultados medidos apresentam valores próximos, não há diferença entre
os métodos, pode-se usar qualquer técnica para fazer as análises de
nitrogênio amoniacal.
Test and CI for Two Variances: HPLC (ppm); HACH (ppm) Method
Null hypothesis Sigma(HPLC (ppm)) / Sigma(HACH (ppm)) = 1
Alternative hypothesis Sigma(HPLC (ppm)) / Sigma(HACH (ppm)) not = 1
Significance level Alpha = 0,05
Statistics
Variable N StDev Variance
HPLC (ppm) 97 44,839 2010,564
HACH (ppm) 97 44,886 2014,797
Ratio of standard deviations = 0,999
Ratio of variances = 0,998
95% Confidence Intervals
Distribution CI for StDev CI for Variance
of Data Ratio Ratio
Normal (0,817; 1,222) (0,667; 1,492) Continuous (0,595; 1,678) (0,354; 2,814) Tests
Method Test DF1 DF2 Statistic P-Value
F Test (normal) 96 96 1,00 0,992
Levene's Test (any continuous) 1 192 0,00 0,997
Paired T-Test and CI: HPLC (ppm); HACH (ppm) Paired T for HPLC (ppm) - HACH (ppm) N Mean StDev SE Mean
HPLC (ppm) 97 25,97 44,84 4,55
HACH (ppm) 97 25,99 44,89 4,56
Difference 97 -0,0225 0,2360 0,0240
95% CI for mean difference: (-0,0700; 0,0251) T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = -0,94 P-Value = 0,351
56
6. DISCUSSÃO
Enquanto a espectroscopia molecular baseia-se na interação de
uma radiação eletromagnética com a matéria, onde seus princípios
embasam-se na lei de Beer-Lambert, o método por HPLC se fundamenta
na técnica de separação de substâncias complexas onde a mesma é
eluída por uma fase móvel liquida, passando por uma coluna
cromatográfica que contém uma fase estacionária que irá segurar as
substâncias indesejáveis e separar oque se deseja analisar. No caso
deste trabalho a separação se dá por troca iônica.
Buscando comparar o grau de proximidade dos resultados obtidos
pelos dois métodos de ensaio e de avaliar a exatidão e precisão dos
métodos, espectrofotométrico e por HPLC, as análises foram comparadas
através da regressão da reta conforme NIT DICLA 008 e análise pontual
das amostras.
Os resultados foram obtidos através da calibração com padrões de
Nitrogênio amoniacal nas concentrações de 0,0, 0,1, 0,5 2,5 e 5,0 ppm
para o HPLC e 0,0, 0,1060, 0,5318, 1,0063, 2,5029, 4,9760, 10,0,
19,7485, 29,9675, 39,4202 e 46,9382 ppm para o HACH ambas
preparadas no laboratório com padrão de 10 e 100 ppm da marca HACH.
E também as análises das amostras Lagoa-A, Lagoa-B, Lagoa-C e TQ de
Aeração .
Para isso, a Tabela 2 e 3 mostra os valores nominais das
concentrações dos padrões, e os dados obtidos experimentalmente de
absorbância e área-µV.min dos equipamentos espectrofotômetro e HPLC,
respectivamente. Os dados de absorbância obtidos na calibração do
espectrofotômetro HACH DR 2800 e visualizados na Tabela 2, mostram
que quanto maior a concentração de Nitrogênio Amoniacal maior o valor
de absorbância lido, fato este comprovado no trabalho, pois a reação de
amônia com salicilato produz um complexo colorimétrico do azoto
57
amoniacal que é diretamente proporcional à cor produzida. E os dados de
área obtidos na calibração do HPLC Waters e visualizados na tabela 3,
também são diretamente proporcional ao aumento de concentração maior
o valor de área.
Os resultados encontrados foram tratados no programa Excel,
onde a equação da reta foi obtida conforme Figuras 10 e 11 e o
coeficiente de linearidade na Tabela 4.
Os resultados de coeficiente de linearidade da reta (r²) obtidos
experimentalmente conforme Tabela 4, 0,9991 método
espectrofotométrico e 0,9995 para o método HPLC, foram comparados
em termos de linearidade, pois segundo o Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater da American Public Health
Association (APHA, 2005), valores maiores ou iguais 0,9950 são
considerados ideais. Como se pode observar, os coeficientes de
linearidade para ambos os métodos atenderam a especificação do
SMWW e portanto os dados mencionados neste trabalho são válidos.
Após a calibração dos equipamentos utilizados neste experimento,
foram realizadas 25 análises de nitrogênio amoniacal em amostras dos
pontos de amostragens Lagoa A, Lagoa B e Lagoa C que representam o
Efluente Bruto e TQ de Aeração que representa o efluente tratado da
Empresa, utilizando os equipamentos espectrofotômetro modelo HACH
DR 2800 e o HPLC modelo Waters.
As amostras foram lidas totalizando 100 medições por técnica,
dados estes registrados nas Tabelas 5 e 6.
Com os dados registrados foram calculados a diferença entre as
técnicas, a média, o desvio-padrão, o desvio-relativo e o erro relativo das
amostras, conforme a tabela 7.
58
As amostras analisadas pelo método de Salicilato HACH foram
submetidas à análise pela técnica espectrofotométrica (colorimétrica),
sendo os dados registrados na Tabela 6. Pode-se perceber que para a
técnica de espectrofotometria, o erro relativo é maior por ser menos
seletiva e por isso apresentam mais interferentes, já as amostras
analisadas por HPLC conforme a tabela 5 apresentam um erro relativo
menor por ser mais seletiva, mais estável e por apresentar menos
interferências. Conforme a tabela 7 podemos concluir que as técnicas são
equivalentes ao desvio padrão, relativo e erro relativo ao que se
correspondem entre as diferenças de resultados apresentados na tabela 5
e 6, sendo assim, podemos avaliar a eficiência e precisão da técnica de
HPLC comparado com a técnica Salicilato HACH por ser mais seletiva e
não ter interferentes que influenciam diretamente na forma qualitativa do
método.
Com relação à tabela da figura 21, pode-se concluir através da
análise do valor do teste de Fisher que os valores de F determinados
ficaram abaixo do tabelado (F=1), portanto, tanto a técnica de
espectrofotometria quanto a de Cromatografia liquida por troca iônica
estão com seus parâmetros de precisão e variância aceitos. Isso indica
que os métodos estão validos para uso de acordo com índice de
confiabilidade de 95%. E de acordo com o teste de paridade T podemos
interpretar que a variabilidade entre eles praticamente não existe, o que
nos leva a definir que não existem diferenças significantes entre os
resultados apresentados pelas diferentes técnicas utilizadas.
Conforme os dados mostrados na tabela 8 acima, o método HPLC
apresentou uma grande redução no tempo de trabalho, no tempo de
acompanhamento (analista x hora) e no tempo de finalização das análises
das amostras, em comparação com o método Salicilato HACH
Em relação à comparação realizada não consideramos o tempo de
montagem, preparação de reagentes, soluções analíticas e outros ajustes
59
extras necessários para o perfeito funcionamento dos dois sistemas
(HPLC x HACH). A discrepância de tempo gasto nas duas técnicas
mostra que a técnica HPLC é mais rápida e eficiente para a análise de
amônia.
Consideramos ainda outros ganhos, como: maior segurança no
processo de análise da amônia, por não utilizar vidrarias, menor
interferentes, utilizar menores volumes de reagentes e soluções
corrosivas e tóxicas, e consequente uma grande redução na geração de
resíduos ao meio ambiente.
Outro benefício do HPLC baseia-se no fato de a amônia ser
separada cromatograficamente por meio de uma coluna de troca iônica,
usando como fase móvel uma solução de KH2PO4 0,062 mol.L-1 e
identificada através de uma reação após eluição com reagente
derivatizante OPA em presença de mercapto etanol, sendo quantificadas
através de um detector de fluorescência com comprimento de onda de
excitação 340 nm e de emissão 420 nm (EPA, Método 547). Com isso o
HPLC torna-se um método qualitativo e quantitativo, enquanto a técnica
Salicilato HACH é um método somente quantitativo que mede o nitrogênio
orgânico total.
Segue abaixo as reações envolvidas na técnica HPLC e
Espectrofotômetro, conforme a figura 22 e 23 respectivamente.
OPA Complexo Fluorescente
Figura 22: Reação pós-coluna OPA/MERC antes de ir para o detector
Fonte: EPA Method 547
60
Figura 23: Reação que acontece no tubo reagente para formar um complexo
colorimétrico.
Fonte: Método HACH
Uma vantagem do HPLC sobre o método HACH são os
interferentes, na cromatografia os interferentes são basicamente
sistêmicos o que pressupõem que o mesmo esteja com todas as
manutenções e qualificações em dias. Agora já o espectrofotômetro além
da parte sistêmica também tem as varias interferências durante a analise
por devido ter concentrações de algumas substâncias tais como: Ca, Fe,
Mg, NO3, NO2, PO4, SO4, SO2 e outras substâncias que possam ter
precipitação com adição de silicato. Essas substâncias vão interferir na
formação do complexo colorimétrico, influenciando o resultado final e
aumentando o erro relativo do método.
Outro dado importante na aplicabilidade do método é o custo por
análise, tirando o custo de adquirir os equipamentos que nesse caso a
empresa já possui os dois, tem o preço dos reagentes do kit da HACH
que gira aproximadamente R$ 22,00/análises oque nos dá um custo anual
de R$32120,00, já no HPLC temos um gasto de aproximadamente R$
15,00/análise totalizando um custo anual de R$21900,00, dando uma
redução de custo de 38,2% ao ano.
61
7. CONCLUSÃO
Diante de todo levantamento de dados e revisão bibliográfica, a
técnica por HPLC demonstrou, através dos resultados obtidos
experimentalmente, possuir maior consistência analítica, sendo uma
técnica de maior precisão e exatidão na faixa de estudo de 0,1 a 5,0 ppm.
Todos os dados processados no Minitab, assim como os testes T
realizados demonstram que os resultados das análises realizadas pelo
método Salicilato, são considerados estatisticamente iguais aos
resultados das análises pelo método por HPLC.
Portanto, como ambos os resultados estatisticamente são iguais os
dados nos mostra que aplicabilidade do método por HPLC nos traz uma
vantagem muito grande em relação ao HACH, pela rapidez das análises,
pela confiabilidade do método, pela redução de custo e por ser menos
susceptível a interferentes.
62
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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63
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