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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN
ESTUDO DA RETENÇÃO DE VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS E HIDROSSOLÚVEIS
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO SUPERCRÍTICO DE ULTRA
ALTA EFICIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE ACORDO COM OS
CONCEITOS DE ANALYTICAL QUALITY BY DESIGN
CAMPINAS
2018
FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN
ESTUDO DA RETENÇÃO DE VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS E HIDROSSOLÚVEIS
EMPREGANDO CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO SUPERCRÍTICO DE ULTRA
ALTA EFICIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE ACORDO COM OS
CONCEITOS DE ANALYTICAL QUALITY BY DESIGN
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como parte
dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em
Química, na área de Química Analítica
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Cristina Breitkreitz
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELO ALUNO FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN, E ORIENTADO PELA PROFA.
DRA. MÁRCIA CRISTINA BREITKREITZ.
CAMPINAS
2018
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Márcia Cristina Breitkreitz (Orientadora)
Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya (FCF-UNICAMP)
Profa. Dra. Alessandra Sussulini (IQ – UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno
FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN, aprovado
pela Comissão Julgadora em 07 de fevereiro de 2018.
AGRADECIMENTOS
A Fernanda, minha querida esposa, qυе dе forma especial е carinhosa
mе dеυ força е coragem, mе apoiando nоs momentos dе maiores dificuldades.
Obrigado pelo carinho, paciência е pоr sua capacidade dе me trazer pаz nа correria
dе cada semestre. Também aos meus filhos, Gabriela e Thiago, quе embora nãо
tivessem conhecimento disto, iluminaram dе maneira especial оs meus
pensamentos mе levando а buscar mais conhecimentos. Agradeço também a meus
queridos pais e irmão pelo incentivo е pelo apoio sempre constantes e, finalmente, a
todos os professores que de alguma forma contribuíram com minha formação, em
especial às professoras Márcia e Isabel, que me incentivaram desde o começo desta
jornada, sempre mostrando que era possível a realização deste sonho, mesmo com
todas os desafios e dificuldades encontradas pelo caminho.
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”
Cora Coralina
RESUMO
Este trabalho teve por objetivo descrever a retenção e separação das principais
vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis na técnica de Ultra High Performance
Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC) em função dos principais fatores
experimentais envolvidos e utilizar os conceitos de Analytical Quality by Design para
o desenvolvimento de métodos analíticos. Inicialmente, por meio de um estudo de
triagem, as fases estacionarias Acquity HSS C18 SB e Acquity Torus 2-PIC foram
identificadas como sendo as mais promissoras, juntamente com o metanol como
modificador orgânico da fase móvel, em conjunto com os aditivos formato de amônio
(10 mmol L-1), água (5%) e hidróxido de amônio (10 mmol L-1), que se mostraram
fundamentais para melhoria dos parâmetros cromatográficos para as vitaminas
hidrossolúveis. Em seguida, um Planejamento do tipo Composto Central foi
realizado para estudar as variáveis que influenciam a densidade do fluído:
porcentagem de modificador orgânico ao final do gradiente, contra-pressão e
temperatura. As respostas avaliadas foram: fator de retenção (k), número de pratos
(N), assimetria (As), área dos picos e resolução (Rs). O estudo multivariado mostrou
que os três fatores influenciaram de forma diferente cada resposta analítica e
permitiu, por meio de funções de desejabilidade, a construção do Design Space, que
é a região onde se garante robustez e adequabilidade dos parâmetros do método
cromatográfico. Todas as vitaminas apresentaram respostas analíticas (áreas)
diretamente proporcionais à concentração, com r > 0.99. Na análise de um produto
farmacêutico em forma de cápsula gelatinosa mole não foram detectados
interferentes da matriz e do diluente.
Palavras-chave: Vitaminas, Cromatografia com fluído supercrítico de ultra alta
eficiência (UHPSFC), Analytical Quality by Design (A-QbD).
ABSTRACT
The objective of this work was to describe the retention and separation of the major
fat soluble and water soluble vitamins in the Ultra High Performance Supercritical
Fluid Chromatography (UHPSFC) technique as a function of the main experimental
factors involved and to use the concepts of Analytical Quality by Design for the
development of analytical methods. Initially, through a screening study, the stationary
phases Acquity HSS C18 SB and Acquity Torus 2-PIC were identified as the most
promising along with methanol as the organic modifier of the mobile phase and
ammonium formate (10 mmol L-1), water (5%) and ammonium hydroxide (10 mmol L-
1) as additives, which were mandatory for the improvement of chromatographic
parameters for water soluble vitamins. Then, a Central Composite Design was
performed to study the variables that influence the fluid density: percentage of
organic modifier at the end of the gradient, counter-pressure and temperature. The
evaluated responses were: retention factor (k), number of plates (N), asymmetry
(As), area of the peaks and resolution (Rs). The multivariate study showed that the
three factors influenced in a different way each analytical response and allowed, by
means of desirability functions, the construction of the Design Space, which is the
region where robustness and adequacy of the parameters of the chromatographic
method are guaranteed. All vitamins presented analytical responses (areas) directly
proportional to the concentration, with r > 0.99. In the analysis of a pharmaceutical
soft capsule, no interferences of the matrix and the diluent were detected.
Palavras-chave: Vitamins, Ultra high performance supercritical fluid chromatography
(UHPSFC), Analytical Quality by Design (A-QbD).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA: Ácido Ascórbico.
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
ATP: do inglês, Analytical Target Profile.
BPR: do inglês, Back Pressure Regulator.
CO2: Dióxido de Carbono.
CPP: do inglês, Critical Process Parameters.
CQA: do inglês, Critical Quality Attributes.
CZE: do inglês, Capillary Zone Electrophoresis.
DAD: do inglês, Diode Array Detector.
Dc: Densidade crítica.
DCG: do inglês, Dense Gas Chromatography.
DoE: do inglês, Design of Experiments.
DS: do inglês, Design Space.
ELDS: do inglês, Evaporative Light Scattering Detector.
ESI: do inglês, Electrospray Ionization.
FDA: do inglês, Food and Drug Administration.
FE: Fase Estacionária.
FM: Fase Móvel.
FMEA: do inglês, Failure Mode Effect Analysis.
GC: do inglês, Gas Chromatography.
HILIC: do inglês, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography.
HPLC: do inglês, High Performance Liquid Chromatography.
HRGC: do inglês, High Resolution Gas Chromatography.
ICH: do inglês, International Conference on Harmonization.
KS: do inglês, Knowledge Space.
LC: do inglês, Liquid Chromatography.
LC-MS: do inglês, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry.
LD: Limite de Detecção.
LQ: Limite de Quantificação.
LSER: do inglês, Linear Solvatation Energy Relationship.
MODR: do inglês, Method Operable Design Region.
MS: do inglês, Mass Spectrometry.
NFLC: do inglês, Normal Phase Liquid Chromatography.
PAT: do inglês, Process Analytical Technology.
Pc: Pressão crítica.
PTFE: Politetrafluoretileno.
QbD: do inglês, Quality by Design.
QbT: do ingles, Quality by Testing.
RDC: Resolução da Diretoria Colegiada.
RPLC: do inglês, Reverse Phase Liquid Chromatography.
RSM: do inglês, Response Surface Methodology.
SFC: do inglês, Supercritical Fluid Chromatography.
SFC-MS: do inglês, Supercritical Fluid Chromatography – Mass Spectrometry.
Tc: Temperatura crítica.
UHPLC: do inglês, Ultra High Performance Liquid Chromatography.
UHPSFC: do inglês, Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography.
UPC2: do inglês, Ultra Performance Convergence Chromatography.
USP: do inglês, United States Pharmacopeia.
UV: Ultravioleta.
UV-Vis: Ultravioleta-Visível.
VHS: Vitaminas Hidrossolúveis.
VLS: Vitaminas Lipossolúveis.
SUMÁRIO
1. Introdução ................................................................................................... 13
1.1 Analytical Quality by Design .............................................................................. 13
1.2 Cromatografia com Fluido Supercrítico .............................................................. 17
1.2.1 Histórico ...................................................................................................... 17
1.2.2 A Condição Supercrítica ............................................................................. 21
1.2.3 Composição de Fase Móvel ........................................................................ 26
1.2.4 Fases Estacionárias.................................................................................... 31
1.2.5 Desempenho Cinético ................................................................................. 35
1.2.6 Áreas de Aplicação da Técnica ................................................................... 40
1.3 Vitaminas ......................................................................................................................... 43
1.3.1 Palmitato de Retinol (Vitamina A) ............................................................... 46
1.3.2 Colecalciferol (Vitamina D).......................................................................... 49
1.3.3 Acetato de -Tocoferol (Vitamina E) ........................................................... 51
1.3.4 Tiamina (Vitamina B1) ................................................................................ 53
1.3.5 Riboflavina (Vitamina B2) ........................................................................... 55
1.3.6 Nicotinamida (Vitamina B3) ......................................................................... 56
1.3.7 Piridoxina (Vitamina B6) ............................................................................. 58
1.3.8 Ácido Fólico (Vitamina B9) .......................................................................... 59
1.3.9 Cianocobalamina (Vitamina B12) ................................................................ 61
1.3.10 Ácido Ascórbico ........................................................................................ 63
2. Objetivo ....................................................................................................... 69
3. Experimental ............................................................................................... 69
3.1 Reagentes ......................................................................................................... 69
3.2 Equipamentos ................................................................................................... 70
3.3 Colunas Cromatográficas .................................................................................. 70
3.4 Amostras ........................................................................................................... 71
3.5 Procedimentos .................................................................................................. 72
3.5.1 Avaliação da Solubilidade das Vitaminas .................................................... 72
3.5.2 Avaliação do Volume de Injeção ................................................................. 72
3.5.3 Seleção de Fase Móvel (Modificador Orgânico) e Seleção de Fase Estacionária
............................................................................................................................ 73
3.5.4 Seleção de Fase Móvel - Aditivos ............................................................... 75
3.5.5 Planejamento Experimental ........................................................................ 76
3.5.6 Linearidade ................................................................................................. 77
3.5.7 Injeções da Amostra ................................................................................... 78
4. Resultados e Discussão ............................................................................ 80
4.1 Solubilidade ....................................................................................................... 80
4.2 Volume de Injeção ............................................................................................. 87
4.3 Estudo de Seleção de Fase Estacionária e Fase Móvel .................................... 89
4.3.1 Estudo da Seleção de Fase Estacionária .................................................... 90
4.3.2 Estudo da Seleção de Fase Móvel .............................................................. 97
4.4 Planejamento Experimental ............................................................................. 113
4.4.1 Resultados Empregando a Coluna Acquity HSS C18 SB ......................... 114
4.4.2 Resultados Empregando a Coluna Acquity Torus 2-PIC ........................... 123
4.5 Linearidade, Limites de Detecção e Quantificação .......................................... 133
4.6 Injeções da Amostra ........................................................................................ 135
5. Conclusão ................................................................................................. 138
6. Perspectivas Futuras................................................................................140
7. Referências Bibliográficas ...................................................................... 141
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Analytical Quality by Design
O desenvolvimento de ferramentas analíticas cada vez mais eficientes
apresenta-se como um aspecto fundamental na indústria farmacêutica, pois a
análise de fármacos em matérias-primas e produtos acabados é necessária em
praticamente todo o processo de desenvolvimento e produção de medicamentos.
Desta maneira, há uma constante busca por métodos analíticos mais rápidos,
econômicos e ecologicamente sustentáveis em relação aos tradicionais para a
prática de trabalho nas indústrias farmacêuticas de todo o mundo.
Por este motivo, há mais de uma década, a agência regulatória
americana, a FDA (Food and Drug Administration) iniciou um trabalho de introdução
de novas tecnologias e metodologias analíticas para o desenvolvimento de produtos
farmacêuticos, com o propósito de favorecer a construção de um ambiente científico
e ao mesmo tempo flexível para a obtenção de produtos confiáveis, com alto nível
de qualidade, sem a necessidade de vigilância regulatória extensiva. Sob esta
perspectiva, esta agência lançou em 2004 o guia denominado Process Analytical
Technology (PAT), no intuito de encorajar as empresas farmacêuticas a melhoram o
entendimento a cerca de seus processos de fabricação, através do uso de
ferramentas inovadoras de design, análise e controle de operações farmacêuticas
[1]. Em continuidade à iniciativa de PAT, em 2005 o International Conference on
Harmonization (ICH), um grupo formado por autoridades de agências regulatórias
dos Estados Unidos, Europa e Japão, lançou a iniciativa de Quality by Design (QbD),
a qual é definida como "uma abordagem sistemática para o desenvolvimento que
começa com objetivos previamente definidos e enfatiza o entendimento e controle
do produto do processo, com base na ciência e no gerenciamento de riscos” [2]. A
estratégia de QbD tem por objetivo aumentar o conhecimento nos processos
industriais por meio de uma abordagem racional e multivariada baseada em
ferramentas científicas e de análise de risco para atingir a qualidade desejada e
minimizar erros. Um aspecto central no conceito de QbD é que a qualidade do
produto deve ser construída ao longo do seu desenvolvimento, em contraposição à
14
estratégia adotada anteriormente, denominado Quality by Testing (QbT), onde os
fatores eram estudados por meio de testes univariados e a qualidade era
simplesmente testada ao final do processo de fabricação [3].
A estratégia de QbD estabelece o estudo das variáveis experimentais de
forma multivariada e, por este motivo, as ferramentas de Planejamento e Otimização
Experimental (Design of Experiments - DoE) são fundamentais nesta estratégia.
Este procedimento apresenta diversas vantagens em relação ao método univariado,
dentre as quais pode-se citar a detecção de interações entre as variáveis em estudo,
obtenção de uma superfície de resposta que descreve como as propriedades do
sistema variam em função das variáveis experimentais e a otimização efetiva do
sistema, considerando seus diferentes atributos de qualidade. Inicialmente a
estratégia de QbD foi introduzida para o desenvolvimento de produtos e processos
de fabricação na área farmacêutica, sendo aplicado principalmente em problemas da
formulação [4,5], síntese de ingrediente ativo farmacêutico e biofármacos [6,7]. Mais
recentemente, surgiu a vertente analítica do QbD, denominada Analytical Quality by
Design, na qual o enfoque é a aplicação de conceitos de QbD ao desenvolvimento
de métodos analíticos [3,8–10].
Para implementação dos princípios de QbD na área analítica, deve-se,
primeiramente definir todos os requisitos que o método deve atender em termos de
qualidade, ou seja, definir o Analytical Target Profile (ATP) [3]. Deve-se então
selecionar quais atributos são críticos para o desempenho adequado do método
(Critical Quality Attributes - CQA) tais como retenção adequada na coluna, resolução
apropriada entre todos os picos no cromatograma, simetria adequada para
integração, linearidade, precisão, exatidão, etc., e deve-se estabelecer um valor alvo
ou um limite de aceitação para cada um deles. Em seguida, definem-se quais são as
variáveis experimentais críticas que impactam estes atributos de qualidade, e que,
portanto devem ser monitoradas e controladas para garantir a qualidade desejada,
os quais são denominados Critical Process Parameters (CPP) [2]. Como o número
de parâmetros experimentais que podem potencialmente afetar os CQA pode ser
muito grande, esse número deve ser reduzido, através de uma análise de risco,
priorizando os parâmetros mais críticos. Esta etapa pode ser realizada empregando
algumas das ferramentas formais de análise de risco existentes, tais como o FMEA
15
(Failure Mode Effect Analysis) [11] e o Diagrama de Ishikawa [3] ou por meio de
tabelas de análise de risco, nas quais são atribuídos os níveis de risco a cada CPP
(baixo/médio/alto).
No método FMEA, as variáveis são classificadas de acordo com a
probabilidade com que podem afetar os CQA, a severidade do efeito sobre os
resultados analíticos e a dificuldade em sua detecção, resultando em um número
para cada parâmetro. Aqueles que atingiram numeração acima de um valor de corte
são considerados críticos, e devem ser escolhidos para a próxima etapa, e aqueles
que resultaram em numeração abaixo da linha de corte podem ser seguramente
eliminados dos estudos futuros [9]. Já a ferramenta de Diagrama de Ishikawa
segrega os parâmetros em diferentes categorias, por exemplo aquelas associadas
com instrumentação, materiais, métodos, medições, ambiente do laboratório e
fatores humanos. Em seguida, são classificados entre os que devem ser
controlados, os que representam apenas ruído e os que devem ser avaliados
experimentalmente a fim de se obter critérios de aceitação. Dessa forma, apenas as
condições críticas são conduzidas para futuros estudos, enquanto as demais são
fixadas por experimentos preliminares ou por conhecimento prévio do analista [3].
Em um artigo de revisão sobre aplicações de ferramentas de Quality by
Design, Orlandini et al. [3] explicam que, após aplicação da ferramenta de análise de
risco, é interessante a realização de estudos de varredura para avaliar o efeito dos
CPP de maior criticidade sobre os CQA, a fim de reduzir o número de CPP de fato
avaliados com mais detalhe em um planejamento experimental. Assim, define-se o
Knowledge Space (KS), conhecido como a região experimental a ser investigada
mais detalhadamente pelo estudo de DoE, que deve ser cuidadosamente conhecida,
a fim de minimizar os risco de não se obterem resultados interessantes no estudo de
DoE, pelo simples fato de ter escolhido parâmetros e níveis inapropriados para o
estudo [10]. Como exemplo, planejamento do tipo Plackett-Burman pode ser
empregado para avaliar o efeito do pH da fase móvel, vazão, temperatura, volume
de injeção, e concentração de solvente orgânico na fase móvel sobre resolução e
fator de assimetria dos picos cromatográficos [12]. Estudos de varredura também
são utilizados com frequência sobre variáveis discretas, como tipo de coluna
cromatográfica, tipo de tampão da fase móvel e solvente orgânico (prótico/aprótico),
16
reservando o planejamento experimental para as variáveis contínuas, como
temperatura e níveis de gradiente [12].
Finalmente, após realizada a análise de risco e os estudos de varredura
para determinação do KS, apenas os CPP que apresentarem alto risco são
estudados por meio de ferramentas de DoE para construir superfícies de resposta e
identificar o Design Space (DS), que é a região multidimensional cuja combinação
multivariada dos CPP estudados garante a qualidade desejada do método [9], sendo
limitado por regiões nas quais a performance do método não é aceitável. Dessa
forma, um método analítico não é mais validado em apenas uma condição fixa, mas
sim apresentado dentro de faixas aceitáveis para cada parâmetro [13]. Como
consequência, tem-se que variações no método dentro do DS podem não serem
consideradas como alterações analíticas, e não precisariam de futura aprovação
regulatória para serem implementadas [2,13]. Para aplicações envolvendo
metodologia analítica, o Design Space também pode ser denominado Method
Operable Design Region (MODR) [14].
Conforme descrito anteriormente, uma grande vantagem do uso de
ferramentas de DoE durante o desenvolvimento do método é a possibilidade da
determinação dos níveis de robustez do método analítico através da incorporação
deste parâmetro no momento da determinação do DS e das especificações de
trabalho e não somente após o desenvolvimento do método, como é realizado
tradicionalmente. O próprio DS pode ser entendido como uma região teórica de
robustez analítica, pois alterações dentro desta região não devem afetar
significantemente a qualidade da separação [10,15].
A otimização do método deve então ser realizada através de análise
estatística multivariada, sendo a metodologia de superfície de resposta (Response
Surface Methodology - RSM) a mais empregada atualmente [16–18], e que consiste,
através da aplicação de diversas técnicas matemáticas e estatísticas baseadas no
ajuste da equação polinomial dos dados experimentais obtidos, na previsão do efeito
de cada variável sobre as respostas estudadas, a fim de se otimizar
simultaneamente os níveis das variáveis de forma a obter a condição de máximo
desempenho do método.
17
Dentre as ferramentas de RSM, as funções de Derringer e Suich, ou
funções de desejabilidade, são aplicadas quando um grande número de respostas
deve ser avaliado simultaneamente, sendo necessária a determinação de uma
condição que represente o melhor compromisso possível para todas elas. Nesta
metodologia, inicialmente determina-se uma função de desejabilidade para cada
resposta individualmente, introduzindo as especificações que cada resposta deve
alcançar. Em seguida, com todas as funções de desejabilidade individuais definidas,
é traçada uma função de desejabilidade global, definida como uma média
geométrica de cada função individual [16–18] reduzindo o problema à otimização de
uma única resposta.
Outro fator determinante para adoção do DoE como ferramenta para o
desenvolvimento de um método analítico é a questão da redução na quantidade de
experimentos a serem realizados, gerando redução no tempo e custo do
desenvolvimento. Técnicas analíticas mais complexas, com grande quantidade de
parâmetros a serem ajustados, interdependentes entre si, tal como as técnicas
cromatográficas em geral, e em especial a cromatografia com fluido supercrítico, são
fortes candidatas para aplicação de conceitos de DoE e RSM, garantindo um
processo de desenvolvimento de método mais eficiente e robusto.
1.2 Cromatografia com Fluido Supercrítico
1.2.1 Histórico
Em 1906, os primeiros artigos envolvendo a cromatografia como ciência
foram publicados pelo botânico russo Michael Tswett, demonstrando a separação de
compostos orgânicos oriundos de extratos de plantas [19]. Desde então, um forte
desenvolvimento da técnica pôde ser observado, com o surgimento da cromatografia
gasosa (Gas Chromatography - GC) e, posteriormente, da cromatografia líquida
(Liquid Chromatography - LC).
Em 1962, Klesper et al. [20] apresentaram o primeiro trabalho utilizando
fluido supercrítico como fase móvel, pouco antes do surgimento da cromatografia
líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography – HPLC),
18
marcando, dessa forma, o nascimento da cromatografia com fluido supercrítico
(Supercritical Fluid Chromatography – SFC). Entretanto, o uso desta técnica não foi
amplamente difundido, como ocorreu com a HPLC, sendo resgatada somente a
partir da década de 1990 como uma ferramenta útil para aplicação em metodologias
de separação de compostos orgânicos [21].
Dentre as razões para a baixa difusão da técnica até então está o rápido
estabelecimento da cromatografia gasosa de alta resolução (High-Resolution Gas
Chromatography – HRGC) e da HPLC, na década de 80, que acabaram inibindo o
crescimento da SFC. Enquanto a cromatografia gasosa já se apresentava como uma
técnica bem estabelecida, com muita instrumentação disponível no mercado, de
diversos fornecedores, buscava-se o desenvolvimento de métodos analíticos
capazes de analisar compostos instáveis termicamente, não voláteis e polares, em
cujo campo a GC não conseguia atuar. A cromatografia líquida surgiu com
alternativa à GC para estes tipos de compostos e, embora inicialmente não
apresentasse eficiência satisfatória, fortes investimentos foram realizados no intuito
de desenvolver a técnica, nascendo assim a HPLC, que ofuscou o desenvolvimento
da SFC e sua aplicação como técnica analítica para a grande maioria de aplicações
[21].
A elevada capacidade de solvatação dos fluidos supercríticos foi
descoberta por Hannay e Hogarth, em 1879, a partir de um estudo sobre a
solubilidade de cloretos metálicos em etanol no estado supercrítico [21]. Somente
em 1962, Klesper et al. demonstraram o uso de fluido supercrítico como fase móvel
(FM) para separar uma mistura de porfirinas [20]. Sie e Rijnders, em 1967 [22],
realizaram o primeiro estudo publicado para se avaliar o efeito da pressão sobre o
coeficiente de partição e a permeabilidade e eficiência de colunas em sistemas
cromatográficos, usando fluido supercrítico como FM.
No final da década de 1960, alguns pesquisadores desenvolveram
instrumentações mais sofisticadas em relação aos equipamentos usados nos anos
anteriores. Em 1966, Karayannis et al. [23] reportaram o desenvolvimento de um
sistema equipado com regulador de pressão mecânico, capaz de controlar a pressão
independentemente da vazão da fase móvel. Em 1969, Gidding et al. [24]
19
descreveram a cromatografia gasosa densa (Dense Gas Chromatography – DGC),
citando em seu artigo a famosa frase “um dos aspectos mais interessantes da
cromatografia gasosa de alta pressão seria sua conversão com a cromatografia
líquida clássica”. Os autores estudaram diversos gases, como He, N2, CO2 e NH3, e
avaliaram a retenção de vários grupos de compostos orgânicos, como purinas,
nucleosídeos e nucleotídeos, esteróides, açúcares, aminoácidos e proteínas, entre
outros.
Na década de 70, verificou-se o desenvolvimento de instrumentos
capazes de realizar um gradiente de pressão. Jentoft e Gouw [25] separaram
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e estireno através de um sistema de
gradiente de pressão. Os autores verificaram que, quanto maior a pressão, maior o
poder de solvatação da fase móvel, possibilitando a separação adequada dos
compostos em estudo. Em 1977, Klesper e Hartamn [26] desenvolveram um sistema
de SFC preparativa, obtendo o fracionamento de oligômeros de estireno, sendo que
em 1978, Randall e Wahrhafting [27] descreveram o primeiro acoplamento de DGC
com a espectrometria de massas (Mass Spectrometry - MS).
Com a introdução de colunas capilares em 1981 por Novotny et al. [28],
verificou-se um aumento na comercialização de equipamentos de SFC, que eram
semelhantes aos cromatógrafos a gás (colunas capilares, fornos e detectores de
ionização em chama). A principal vantagem do uso de colunas capilares era a
possibilidade de se desenvolver um gradiente de pressão, porém nesse sistema não
era possível variar a pressão sem modificar a vazão da fase móvel, o que poderia
ocasionar instabilidades, baixa robustez e deformações nos picos cromatográficos.
Como esses sistemas não eram muito robustos e se limitavam ao uso de CO2 puro
como fase móvel, sua aplicação era limitada à análise de compostos lipofílicos, e,
dessa forma, entre as décadas de 1980 e 1990 houve diminuição drástica no uso da
técnica [29], que só sobreviveu a esse declínio devido ao seu bom desempenho na
separação de enantiômeros, com alta resolução e rapidez, quando comparada à
HPLC [30].
Entretanto, em 1982, Gere et al. [31], contribuíram imensamente para o
ressurgimento da técnica de SFC, pois, ao modificarem um equipamento de HPLC
20
em laboratório, adicionando um regulador de contra-pressão e usando colunas
recheadas, tornaram possível o controle individual de pressão e da vazão de fase
móvel, de modo a obter um gradiente de pressão, sem alteração da vazão da fase
móvel. Além disso, a introdução de um sistema binário permitiu o emprego de
modificadores orgânicos e aditivos na fase móvel, proporcionando a análise de
compostos com ampla faixa de polaridade. Trabalho como este e os de Cui e Olesik
[32], que estudaram os efeitos da mistura de CO2, metanol e água como FM e de
Lee e Olesik [33] que avaliaram, em 1995, o uso de n-hexano e CO2, auxiliaram a
impulsionar a técnica e a proporcionar o desenvolvimento de novos equipamentos.
Entretanto, a repetibilidade e robustez destes equipamentos ainda eram inferiores às
obtidas em LC, o que, de forma geral, barrou a implementação destes equipamentos
em laboratórios analíticos [29].
Entretanto, nos últimos anos, observou-se o ressurgimento da
cromatografia com fluido supercrítico, através do lançamento no mercado de uma
nova geração de instrumentos e insumos analíticos que sanaram diversas limitações
da técnica, observadas em seu início [21]. Em 2012, um novo equipamento foi
lançado pela empresa Waters Corporation, introduzindo no mercado várias fases
estacionárias (FE) com partículas de tamanho sub-2 µm, e que associadas aos
modificadores orgânicos e aditivos adicionados à FM permitem a separação de uma
vasta gama de compostos, de forma rápida e eficiente, resultando em uma mudança
drástica no cenário de possíveis aplicações da técnica. Além disso, este
equipamento garante repetibilidade das análises por meio do resfriamento da
cabeça das bombas de CO2, o que aumenta a eficácia de compressão da FM,
removendo o calor produzido, e do controle efetivo da pressão de retorno do
sistema, com um novo regulador de contra pressão (BPR) que mantém a pressão
constante mesmo usando gradiente [29,34]. A problemática crise gerada pela
escassez de acetonitrila no mercado, em 2008, também favoreceu o retorno da SFC
como técnica cromatográfica viável, pois obrigou cientistas a buscarem alternativas
à LC, encontrando na SFC uma ótima alternativa para uma série de aplicações até
então conduzidas exclusivamente por LC [35].
Esta nova tecnologia associa o potencial das técnicas de SFC e UHPLC
(Ultra High Performance Liquid Chromatography), dando origem à técnica
21
denominada de Cromatografia com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (Ultra
High Performance Supercritical Fluid Chromatography - UHPSFC), que representa o
estado da arte em termos de técnica de separação, abrindo uma nova dimensão de
instrumentação analítica que emprega os conceitos do fluído supercrítico sob altas
pressões [36].
Avanços relacionados ao sistema de detecção em SFC também
contribuiram para impulsionar o ressurgimento da técnica. São empregados
detectores semelhantes aos de GC e de LC, como por absorção no UV-Vis, por
arranjo de diodos (DAD), por espalhamento de luz evaporativo (ELSD) e por
espectrometria de massas, que possibilitam obtenção de mais informações sobre as
amostras [37]. Técnicas de ionização de espectrometria de massas mais recentes,
como de ionização química em pressão atmosférica (APCI) e ionização por
eletrospray (ESI) apresentam-se como as mais populares em SFC-MS, permitindo a
introdução direta da amostra no espectômetro de massas. Bernal et al. consideram
não haver limitações no acoplamento de SFC aos espectrômetros de massas
disponíveis no mercado [37], representando uma alternativa de seletividade e
complementariedade em relação à LC-MS [38].
O crescimento da aplicação da técnica pode ser comprovado pelo
crescente número de publicações a cada ano. Saito et al. [21] afirmaram em seu
artigo que na década de 1960, o número de artigos científicos publicados
envolvendo a técnica foi muito pequeno, aumentando na década de 1970, porém
não ultrapassando a marca de 30 artigos. Entretanto, na década de 1980, este
número aumentou exponencialmente, para cerca de 400 artigos, e nos anos de
1990, chegou a cerca de 600 artigos publicados. Na década de 2000, observou-se,
novamente, um aumento expressivo nas publicações, ultrapassando a marca dos
800 artigos publicados empregando SFC como técnica de separação.
1.2.2 A Condição Supercrítica
A condição supercrítica de um fluido é alcançada com valores de
temperatura e pressão acima dos valores críticos. Embora raro, esta condição existe
na natureza, como na atmosfera do planeta Vênus, composta por 96,5 % de CO2, e
22
temperatura em torno de 462 °C e pressão de 1350 psi. A água, em oceanos
profundos, próximos aos vulcões submarinos, também está em condição supercrítica
[39].
Na condição supercrítica, a densidade do gás e do líquido tornam-se
iguais, e a interface entre ambos desaparece, formando um único fluido, o fluido
supercrítico. A Tabela 1 apresenta a temperatura crítica – Tc (°C), pressão crítica -
Pc (psi) e a densidade crítica – Dc (g/mL) de diversos compostos orgânicos, vários
deles já empregados como fase móvel de instrumentos analíticos para as técnicas
de SFC e UHPSFC.
Tabela 1. Parâmetros físico-químicos de alguns compostos utilizados como fase móvel em
Cromatografia com Fluído Supercrítico [40].
FLUÍDO FORMULA
MOLECULAR TEMPERATURA CRÍTICA -Tc (°C)
PRESSÃO CRÍTICA - Pc
(psi)
DENSIDADE CRÍTICA Dc
(g/mL)
Dióxido de Carbono CO2 31,3 1071,3 0,47
Óxido Nitroso N2O 36,5 1053,7 0,45
n-Pentano C5H12 196,6 489,4 0,23
Hexafluoreto de Enxofre
SF6 45,5 545,2 0,74
Xenônio Xe 16,6 858,2 1,10
Metanol CH3OH 240,5 1159,5 0,27
2-Propanol C3H7OH 235,3 690,7 0,27
Assim como a região de fluído supercrítico é aquela na qual a pressão e
temperatura excedem os pontos críticos de pressão e temperatura, existe a região
subcrítica, na qual a temperatura e pressão encontram-se abaixo dos pontos críticos
de pressão e temperatura, respectivamente. Quando são empregados modificadores
orgânicos e aditivos na fase móvel, os pontos críticos de temperatura e pressão se
elevam drasticamente, chegando à cerca de 135 °C e 2436 psi para a mistura
CO2/Metanol 70:30 (v/v) como fase móvel. Uma consequência prática deste fato é
que a maioria das publicações em SFC e UHPSFC não apresenta, na verdade, a
fase móvel em condição supercrítica, mas sim em condições subcríticas. Quando se
trabalha com temperatura entre 40 a 60° C, qualquer que seja o gradiente
23
empregado, mesmo que inicialmente se esteja em condição supercrítica, um fluído
subcrítico será obtido rapidamente, assim que a proporção de modificador orgânico
aumentar ao longo do gradiente de fase móvel [30]. Na Figura 1 é ilustrado um
diagrama de pressão/temperatura do CO2 puro, indicando a região onde o fluido
supercrítico é obtido. Logo fora dessa região, obtém-se o fluído subcrítico.
Figura 1. Diagrama pressão/temperatura e os equilíbrios entre os estados sólido, líquido e gasoso. Definição de região supercrítica para o CO2. Tc: temperatura crítica; Pc: pressão crítica. Adaptado da referência [40].
Teoricamente, o grande problema em se operar abaixo da condição
supercrítica seria a separação de fases, sendo que neste caso a fase móvel
passaria a ser constituída de uma fase gasosa, contendo CO2 e outra líquida,
contendo principalmente o modificador orgânico utilizado [41]. Tal fenômeno
ocasionaria sérios problemas cromatográficos, como alteração da solubilidade dos
analitos, intensas alterações de retenção e formato de picos, além de elevação de
ruído na linha de base devido à passagem da mistura gás-líquido no detector [41].
Entretanto, Lesellier e West descreveram, em seu artigo de revisão [30], que esta
separação de fases nunca foi observada na região subcrítica, em temperatura
inferior à temperatura crítica, mas com a pressão mantida acima daquela considera
crítica, conforme confirmado em diversas publicações [42–45]. Se a temperatura
tivesse que estar acima do ponto crítico, o emprego de modificadores orgânicos
seria inviável, pois seria incompatível com o uso da maioria das colunas recheadas
24
disponíveis, e representaria uma dificuldade na análise de compostos termolábeis.
Assim, a transição entre os estados supercrítico e subcrítico ocorre sem ocasionar
grande impacto no desempenho do sistema [46].
Compostos como hidrocarbonetos leves, amônia, óxido nítrico e
clorofluorcarbonos foram utilizados como fase móvel em condição supercrítica em
alguns trabalhos [29], porém tiveram seu uso praticamente extinto devido aos sérios
problemas de segurança resultantes de sua aplicação, aos danos aos
equipamentos, à instabilidade quando utilizados para análise de compostos
termolábeis e ao elevado dano ambiental [47]. O dióxido de carbono apresenta
condições brandas para atingir a condição supercrítica (pressão de 1071,3 psi e
temperatura 31,3 ºC), conforme mostrado na Tabela 1, além de não ser tóxico
(exceto em altas concentrações) e inflamável e ser de fácil descarte [19], já sendo
inclusive relatado o desenvolvimento de sistemas capazes de reciclar o CO2 do
processo, tornando a técnica ainda mais amigável ecologicamente [36,48–50]. Além
disso, por ser normalmente utilizado em temperaturas pouco acima da temperatura
ambiente e não ser reativo, evita-se a degradação térmica e química dos analitos e a
formação de compostos de degradação. Dessa forma, este composto consagrou-se
como o mais empregado como fase móvel em SFC [29,30,39].
As propriedades físico-químicas de um fluido supercrítico, sob o ponto de
vista cromatográfico, se assemelham às características dos gases, como baixa
viscosidade e alta difusibilidade, resultando em uma elevada velocidade da fase
móvel e pressão reduzida, garantindo uma separação eficiente [51]. Além disso,
apresenta densidade e elevado poder de solvatação, semelhante a um líquido,
proporcionando adequada solubilidade e rápido transporte dos analitos.
Consequentemente, as análises empregando a técnica de SFC são mais rápidas,
devido à baixa viscosidade do fluido supercrítico, o que possibilita o uso de vazões
mais altas em relação à HPLC e a eficiência é comparável à GC, devido à alta
difusibilidade dos analitos no fluido supercrítico [19]. Desta maneira, por unificar a
Cromatografia Líquida com a Gasosa, a empresa Waters patenteou o seu
equipamento como “Cromatografia de Convergência de Ultra Performance” (Ultra
Performance Convergence Chromatography - UPC2), confirmando a previsão de
Gidding, em 1969.
25
Muitos trabalhos foram descritos na literatura buscando esclarecer o
comportamento de retenção dos compostos em SFC, através da correlação do fator
de retenção com as condições de pressão e temperatura, ou com as propriedades
específicas da fase móvel, como densidade, fugacidade e solubilidade no soluto.
Entretanto, fatores como viscosidade, difusibilidade e solubilidade da fase móvel
estão diretamente ligados à densidade do fluído, que é um fator determinante sobre
a força da fase móvel, e, consequentemente, sobre a retenção e seletividade. De
forma geral, quanto maior a densidade da fase móvel, maior a solubilidade dos
analitos nesta fase e menor é a sua retenção [39]. Basicamente, a densidade do
fluído depende de três parâmetros ajustáveis do método analítico em SFC:
composição da fase móvel, contra-pressão do sistema e temperatura da coluna
[52,53].
O efeito da contra-pressão do sistema sobre a retenção é direto. Quando
a pressão é aumentada, mantendo-se fixa a temperatura, a densidade e o poder de
solvatação do fluido é aumentado, reduzindo a retenção dos analitos [54]. A
amplitude desta alteração varia de acordo com a composição da fase móvel, sendo
muito mais significativa quando somente CO2 puro é utilizado na fase móvel, se
comparado à uma fase móvel composta de CO2 contendo um modificador orgânico.
Isso porque a compressibilidade do fluido quando somente CO2 está presente é
maior que quando um modificador orgânico é adicionado à fase móvel, reduzindo
dessa forma o efeito de variações na contra-pressão sobre a retenção dos analitos
[55].
Em relação ao efeito da temperatura sobre a retenção, verifica-se que o
aumento na temperatura, sob pressão constante, leva ao aumento na pressão de
vapor do soluto e redução na densidade do fluído supercrítico, além de alterar a
afinidade do analito com a fase estacionária [54]. Trata-se, portanto de uma
complexa mistura de mecanismos, que resulta em uma redução na retenção dos
analitos. Esse efeito sobre a retenção é ampliado quando se trabalha com
temperatura próxima à temperatura crítica, porém é minimizado quando a
temperatura de trabalho encontra-se acima da temperatura crítica, podendo ser
registrado inclusive aumento na retenção nestes casos, devido ao aumento na
pressão de vapor [56].
26
Entretanto, quando se trabalha na condição subcrítica, o que é bastante
comum em SFC e UHPSFC, seja por se utilizar uma temperatura branda, menor que
a supercrítica, ou por se adicionar grande quantidade de modificador orgânico à fase
móvel, verifica-se forte redução do efeito de compressibilidade da fase móvel,
mantendo a densidade do fluído mais elevada. Dessa forma, o efeito de alterações
na temperatura e na contra-pressão do sistema sobre a retenção é minimizado,
quando se trabalha na condição subcrítica, proporcionando um método mais robusto
quando se trabalha nesta região [30,46], o que justifica o emprego quase que
unânime desta condição nas publicações recentes.
Em resumo, conforme descrito por Asberg et al. [57], os parâmetros:
composição da fase móvel (presença de modificador orgânico), contra-pressão do
sistema e temperatura da coluna afetam a retenção dos analitos e a seletividade,
sendo que o primeiro parâmetro atua de forma mais significativa que os demais.
Dessa forma, levando em consideração também a influência primordial da fase
estacionária na retenção e seletividade, fica claro que os primeiros parâmetros a
serem estudados em um desenvolvimento de método em SFC e UHPSFC são a
escolha da fase móvel e da fase estacionária, seguidos dos parâmetros pressão e
temperatura, como um ajuste fino da metodologia em desenvolvimento [39,58].
1.2.3 Composição da Fase Móvel
O CO2, por apresentar momento dipolar zero, apresenta força
cromatográfica semelhante ao hexano, ou seja, apresenta propriedades altamente
lipofílicas, o que dificulta a eluição de compostos de alta massa molar e mais
polares, capazes de realizar ligações de hidrogênio ou outras interações com a fase
estacionária polar [39]. Para contornar este problema e melhorar a seletividade da
fase móvel, foi desenvolvido um sistema de bomba binária que permitiu a adição de
solventes polares na fase móvel, chamados de modificadores orgânicos, os quais
são adicionados em pequenas quantidades (tipicamente de 1 a 30 %) com o intuito
de aumentar o poder de solvatação da fase móvel e alterar sua seletividade,
garantindo a solubilidade dos analitos e evitando sua precipitação quando a amostra
é introduzida na coluna. Os modificadores orgânicos podem apresentar uma grande
27
faixa de polaridade, desde os apolares, utilizados em Cromatografia Líquida de Fase
Normal (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC), até aqueles com caráter
mais polar, utilizados em Cromatografia Líquida de Fase Reversa (Reverse Phase
Liquid Chromatography - RPLC). Desta maneira, é possível varrer toda a série
eluotrópica pela variação de polaridade da fase móvel e conduzir separações de
analitos que seriam realizadas por Cromatografia Líquida, tanto no modo de Fase
Normal quanto de Fase Reversa. Além disso, os modificadores orgânicos
proporcionam a ativação de sítios ativos na superfície da fase estacionária e alteram
a densidade da fase móvel, o que pode favorecer a análise cromatográfica [30].
Os diferentes tipos de interações entre os analitos e a fase estacionária,
como ligações de hidrogênio, e dipolo-dipolo, favorecem o aumento de seletividade.
Dependendo do tipo de modificador orgânico empregado, diversas características,
como constante dielétrica, capacidade de formação de ligações de hidrogênio,
capacidade de transferência de massas e viscosidade do solvente podem ser
alteradas. O uso de álcoois como modificadores orgânicos, por exemplo, por
possuírem a característica de formadores de ligação de hidrogênio, atuam
minimizando o efeito prejudicial de distorção dos picos cromatográficos gerados
pelos grupamentos silanóis livres da fase estacionária, pois estes se apresentam
como receptores de ligação de hidrogênio, que deixam de interagir com os analitos,
e passam a interagir com o modificador orgânico [29].
O metanol constitui um modificador orgânico de elevada força
cromatográfica, devido à sua alta polaridade, e é considerado o solvente mais
utilizado em eluição de compostos polares em SFC e UHPSFC. Ele é
completamente miscível em CO2, em uma ampla faixa de temperatura e pressão.
Um gradiente típico, com início de 2 a 5% de metanol, até 30 a 40%, constitui uma
boa opção para a realização de um screening inicial, seguindo Naváková et al. [29].
Outros álcoois, como etanol e 2-propanol, também podem ser empregados, porém
são observados picos cromatográficos mais largos e maiores tempos de corrida que
quando comparados com metanol [55]. Além disso, o metanol é menos viscoso e
mais polar, favorecendo a solubilização de compostos mais polares na fase móvel, e
mais compatível com espectrometria de massas [55]. O emprego de acetonitrila
também foi relatado por Brunelli et al. [55], proporcionando diferenças na ordem de
28
eluição e formato dos picos. No caso deste solvente, nota-se um aumento na
retenção dos compostos e baixa simetria dos picos, o que pode ser explicado pela
falta de grupamentos doadores para ligações de hidrogênio na molécula e assim
apresentar uma baixa cobertura dos grupamentos silanóis livres. Por esta razão, a
acetonitrila é dificilmente utilizada de forma pura, mas sim em conjunto com outros
modificadores orgânicos tais como os álcoois metanol, etanol, 2-propanol, solventes
próticos capazes de interagir via realização de ligações de hidrogênio, como
doadores e receptores de elétrons. [45,55].
Quando a adição de um modificador orgânico à fase móvel de dióxido de
carbono não for suficiente para garantir a eluição dos analitos com formato de pico
adequado, introduz-se um terceiro componente à fase, usualmente chamado de
“aditivo”, porém em menores concentrações que a do modificador orgânico,
normalmente entre 0,05 a 1 % (v/v), com intuito de contornar problemas
relacionados à seletividade, eluição e formato dos picos [30]. Tais compostos,
geralmente bastante polares, podem até ser imiscíveis em CO2, mas devem ser
solubilizados no modificador orgânico e miscíveis na mistura formada por CO2,
modificador orgânico e aditivo [39]. Os aditivos podem afetar a retenção, separação
e formato de picos através de diversos mecanismos, sendo estes muitas vezes não
totalmente elucidados [30]. Geralmente, os aditivos atuam sobre os sítios ativos da
fase estacionária alterando sua polaridade, sobre a polaridade da fase móvel,
aumentando seu poder de solvatação, e podem alterar o nível de ionização dos
analitos, levando à formação de pares iônicos entre ambos [30,39].
Os aditivos mais comuns incluem ácidos e bases, a fim de melhorar o
formato dos picos e a seletividade de compostos ácidos ou básicos,
respectivamente. Assim, a eluição de ácidos orgânicos pode ser melhorada com
adição de ácidos fortes, como trifluoracético [59], ou de ácidos fracos, tais como
ácido fórmico ou acético, que são compatíveis com a espectrometria de massas [60],
ou ainda ácido cítrico e etanossulfônico [42,61], enquanto que a eluição de
compostos básicos pode ser aperfeiçoada com a adição de aminas alifáticas, como
isopropilamina, dietilamina, etildimetilamina ou trietilamina [42,62]. Até mesmo o uso
de hidróxido de amônio já foi relatado, fornecendo formato de picos simétricos para
diversos compostos básicos e racematos, sendo considerado um bom aditivo, por
29
ser volátil, compatível com espectrometria de massas, facilmente removível da
coluna, quando comparado às aminas alifáticas e não degradar a sílica [29,44,63].
Perrenoud et al. [63] esclareceram em seu estudo que a maior parte das publicações
em SFC e UHPSFC refere-se à análise de compostos neutros, ácidos ou levemente
básico, embora compostos básicos sejam bastante comuns na área farmacêutica,
englobando moléculas de valores de pKa entre 7 a 10. Eles afirmaram que
compostos básicos apresentam restrições para serem plenamente analisados por
estas técnicas, nas quais possuem desempenho cromatográfico pobre, com picos
bastante distorcidos, incluindo caudas frontais e distais, picos divididos e com
‘ombros’, sendo sugerido fortemente o emprego de aditivos básicos para contornar
tais inconvenientes.
Em alguns casos, aditivos ácidos e básicos são adicionados em conjunto
na fase móvel, a fim de obter os benefícios acima descritos [63]. Podem ser usados
sais, tais como acetato de lítio, acetato de tetrametilamônio ou cloreto de amônio.
Tampões voláteis, como formato, acetato e carbonato de amônio, são utilizados com
sucesso como aditivos em análise de compostos básicos [63,64] e ácidos, pois
apresentam capacidade de aprimorarem o formato dos picos dos dois tipos de
compostos simultaneamente [55], sendo empregados, geralmente, na concentração
entre 1 a 20 mmol/L, junto ao modificador orgânico [65,66] com a vantagem de
serem compatíveis com a técnica de espectrometria de massas e, normalmente, são
utilizados em screening inicial, como aditivos da fase móvel, quando há compostos
ionizáveis na amostra [30].
Apesar das vantagens descritas, deve-se avaliar criteriosamente o
emprego de aditivos à fase móvel. Alguns aditivos apresentam absorbância no UV,
resultando em aumento no ruído da linha de base durante o desenvolvimento da
programação de gradiente. Além disso, podem interagir fortemente com a fase
estacionária, aumentando o tempo necessário para atingir o equilíbrio e, portanto,
para a estabilização do sistema, além de sua remoção da coluna ser difícil, exigindo
procedimentos de lavagem e regeneração mais complexos e demorados. Poe et al.
[67] relataram em sua publicação que, com adição de aditivo à fase móvel,
fenômenos mais complexos, como alterações na temperatura, na densidade da fase
e na pressão do sistema podem ocorrer, sugerindo então a escolha criteriosa das
30
condições experimentais, de forma a minimizar a perda de eficiência que pode
ocorrer devido à estas alterações nas condições do sistema.
A água também pode ser utilizada como aditivo, porém poucos estudos
foram publicados empregando este solvente na fase móvel. Ela deve ser sempre
utilizada em conjunto com algum solvente orgânico, que a torna então miscível em
CO2. Ela é mais polar que o metanol e possui dois grupamentos que realizam
ligações de hidrogênio, o que aumenta o poder de solvatação da fase móvel, sendo
compatível com a técnica de espectrometria de massas. A quantidade utilizada varia
entre 0,1 a 5% (v/v) [68]. Recentemente, Taylor et al. [65] relataram o uso de água
como aditivo melhorando a capacidade de eluição e formato de pico de compostos
polares. Além disso, a água demonstrou apresentar pequeno efeito sobre a
seletividade da fase móvel, o que certamente representa uma vantagem em
separações de misturas complexas de compostos [69].
Vale ressaltar que, em SFC e UHPSFC, é difícil avaliar exatamente qual a
força de um ácido ou base empregado como aditivo na fase móvel, visto que as
constantes de dissociação são diferentes daquelas conhecidas em meio aquoso.
Além disso, está premissa é válida também para os analitos, ácidos e básicos, que
devem apresentar constantes de dissociação diferentes em fluído supercrítico
daquelas observadas em meio aquoso. Dessa forma, ao se utilizar um aditivo
supostamente mais forte que o analito, pode-se apenas esperar que a escala de
dissociação, determinada em fase aquosa, também se reproduza em fluído
supercrítico [30].
Na cromatografia com fluído supercrítico, o pH da fase móvel não pode
ser determinado, não sendo, portanto, um parâmetro estudado, tal qual ocorre em
LC, durante o desenvolvimento de método por esta técnica. Entretanto, conforme
descrito anteriormente, compostos são adicionados à fase móvel contendo CO2, de
forma a alterar a polaridade da fase móvel, buscando aprimoramento de parâmetros
como seletividade, retenção e desempenho cromatográfico. Tal fato demonstra a
importância do entendimento das alterações na polaridade da fase móvel após
adição de compostos ao CO2, a fim de prever, com maior exatidão, o
comportamento de cada tipo de analito em estudo [70].
31
Um estudo recente de West et al. [70] avaliou o efeito das principais
modificações da fase móvel realizadas em SFC sobre o pH da fase, através da
leitura do pH com sondas solvatocrômicas. Os autores verificaram que os álcoois,
bastante utilizados como modificadores orgânicos, reagem com o CO2 formando
ácido alquilcarbônico, o que confere um caráter ácido à fase móvel, de pH de cerca
de 5,0, indo de acordo com os estudos de Zheng et al., que concluíram que a fase
móvel utilizando metanol como modificador aparentava um pH de cerca de 5,5 [71] .
Além disso, o aumento da quantidade de metanol na fase móvel, como ocorre em
um sistema de eluição por gradiente, resulta em maior formação de ácido, e,
portanto, o pH da fase tende a reduzir ainda mais. A adição de aditivos como sais e
bases, quando utilizados nas concentrações padrão (até 20 mmol/L), não resultam
em aumento no pH, provavelmente devido às pequenas concentrações empregadas,
mas parecem estabilizar o pH durante as corridas em eluição por gradiente. Os
autores também verificam que o emprego de aditivos ácidos e água resultou em
uma redução drástica do pH aparente da fase móvel, para abaixo de 1,7 [70].
1.2.4 Fases Estacionárias
A vasta faixa de polaridade dos solventes que podem ser adicionados ao
CO2 permite uma alteração significativa da polaridade da fase móvel, a qual, por sua
vez, possibilita a utilização de diferentes fases estacionárias, desde aquelas muito
polares, baseadas em sílica e utilizadas em NPLC, até aquelas com grupos mais
apolares, tais como o grupo octadecil ligado a sílica, muito utilizada em RPLC. Além
disto, é possível utilizar fases com grupos químicos diferenciados ligados à sílica,
tais como fenil, amina, diol, entre muitas outras. Desta maneira, é possível variar a
seletividade da fase estacionária de forma muito abrangente, tornando as
possibilidades de desenvolvimento analítico quase ilimitadas quanto a este quesito.
Atualmente, existem colunas cromatográficas recheadas com fases estacionárias de
ampla seletividade, com partículas de tamanho inferior a 2 µm, o que diminui o
alargamento dos picos cromatográficos e permite análises mais rápidas. Outra
característica importante da técnica de SFC está relacionada às baixas temperaturas
32
utilizadas no sistema, que impedem a degradação dos compostos termicamente
instáveis [30].
Em seus artigos de revisão, West et al. [30] e Lesellier [72] afirmaram que,
dentre as diversas estratégias de desenvolvimento de método em SFC e em
UHPSFC, a principal é a escolha da fase estacionária para garantir uma boa
separação, em contraste com o observado em LC, na qual a composição da fase
móvel representa a primeira grande etapa de otimização a ser realizada. Os autores
explicam que é bastante recomendável que se disponha de alguns tipos de fase
estacionária com diferentes seletividades, de forma a garantir a maior
ortogonalidade possível, sendo então realizado um screening inicial com todas elas,
de forma a selecionar aquelas mais promissoras. Somente em seguida, com as
fases estacionárias previamente escolhidas, se prossegue com as demais etapas do
desenvolvimento analítico.
Para auxiliar neste importante processo de seleção de fases
estacionárias, existe um sistema de classificação baseado no uso da relação da
energia linear de solvatação – Linear Solvatation Energy Relationship (LSER),
desenvolvido por West e Lesellier [73] e detalhado em diversos trabalhos
subsequentes dos autores na área [74–77]. Os autores estudaram uma centena de
compostos e 28 diferentes fases estacionárias, e relacionaram a capacidade de
realização de cinco tipos de interações de cada fase com o analito, calculadas em
termos de coeficientes, sendo eles: e - transferência de carga, s - dipolo-dipolo, a -
doação de ligações de hidrogênio, b - receptor de ligações de hidrogênio e v -
dispersão. O objetivo do trabalho foi entender a influência da fase estacionária
quando a fase móvel é extremamente diferente de uma fase aquosa, visto que a
retenção em SFC e UHPSFC é mais fortemente influenciada pelas interações entre
os solutos e a fase estacionária que o observado em HPLC, onde a influência da
água é dominante.
Em seus trabalhos, West e Lesellier dividiram as fases estacionárias em
três grandes grupos: não polares, polares e aromáticas [74–76]. Esta classificação
auxilia na escolha da fase estacionária mais adequada para realização da separação
de novos produtos, sendo que após extenso estudo, os autores demostraram que,
33
para compostos farmacêuticos, os quais frequentemente apresentam grupamentos
polares, as colunas classificadas como polares devem ser preferencialmente
escolhidas, a fim de se obter suficiente retenção dos analitos. A Figura 2 ilustra uma
representação da classificação proposta, por Nováková et al. [29] em seu artigo de
revisão sobre o assunto, onde cada tipo de coluna cromatográfica está alocado
conforme sua capacidade de realizar algum dos tipos de interações descritas
anteriormente.
Figura 2. Classificação das Fases Estacionárias de acordo com Nováková et al. [29].
Pode-se verificar neste diagrama que colunas polares, como por exemplo
aquelas baseadas em sílica (BEH) e sílica modificada (BEH 2-EP), e colunas
apolares, que não apresentam nenhum grupamento polar (por exemplo, HSS C18)
são alocadas em regiões opostas, com as fases apolares na esquerda e as polares
à direita. Entre elas, fases com comportamento híbrido podem ser encontradas,
como por exemplo, as fases aromáticas fluorfenil no topo. Segundo Galea et al. [78],
colunas localizadas em regiões próximas no diagrama apresentam seletividade
similares, embora alguma variação neste parâmetro ainda possa ser observada.
Entretanto, quando dois componentes não são devidamente separados em uma
dada coluna, deve-se buscar uma coluna localizada em outra parte do diagrama,
34
indicando que ela apresenta diferente capacidade de separação, e, portanto, poderá
proporcionar a adequada separação dos analitos.
Um estudo recente realizado por Khater e West [79] monstrou que cinco
fases estacionárias com partículas menores que 2 µm (HSS C18 SB, XSelect CSH
Fluorofenil, BEH, BEH 2-EP e BEH RP18 Shield) podem ser utilizadas para a
realização de uma triagem inicial durante o desenvolvimento de métodos por
UHPSFC, pois estão alocadas em posições diferentes do diagrama ilustrado na
Figura 2. Da mesma maneira, West e Lesellier [80] também descreveram como
escolher os tipos de fase estacionárias para realização de um estudo ortogonal,
empregando diferentes tipos de colunas cromatográficas. Segundo os autores,
quando uma fase estacionária apolar é utilizada, como C18 (capeada), compostos
aromáticos e hidrofóbicos são mais retidos, enquanto compostos polares são menos
retidos, comportamento este similar ao observado em RPLC, sendo que a adição de
modificador orgânico polar na fase móvel (por exemplo, metanol, etanol, acetonitrila)
reduz a retenção da maioria dos compostos [72]. Para fases estacionárias polares,
como cianopropil ou aminopropil, analitos mais polares são mais retidos, enquanto
espécies hidrofóbicas e de alta massa molar eluem primeiro, tal como observado em
NPLC, sendo que diferentes tipos de colunas polares resultam em diferente
seletividades [72]. Entretanto, quando se utilizam fases estacionárias com diferentes
características de polaridade, tais como C18 junto a outro grupamento polar, ou
ligantes aromáticos (fenilpropil, pentafluorofenilpropil), a retenção não se caracteriza
mais como similar à fase reversa ou fase normal, mas a um tipo de retenção única
para SFC e UHPSFC. Dessa forma, uma coluna C18 capeada pode apresentar
resultados de retenção bastante diferentes de uma coluna C18 não capeada, devido
à presença dos grupamentos silanóis livres em sua estrutura, sendo possível que
esta diferença de seletividade observada possa ser útil, dependendo das
características dos analitos em estudo [80,81].
Muitas colunas utilizadas nesta classificação realizada por West e
Lesellier são de HPLC, pois ainda existem relativamente poucos tipos de fase
estacionárias produzidas especificamente para SFC e UHSFC [30]. Entretanto,
muitos grupos de pesquisadores vem desenvolvendo tipos de fases estacionárias
específicas para estas técnicas [82,83], com particular interesse nas fases
35
estacionárias baseadas em ligantes de líquidos iônicos, que podem ser úteis para
separação de misturas de compostos ácidos e básicos, característica muito
frequente em produtos de interesse farmacêutico [84]. Além disso, as fases
estacionárias mais modernas de boa qualidade são altamente reprodutíveis lote a
lote, garantindo o desenvolvimento de métodos robustos, além de sofrerem
degradação da fase muito lentamente, sob as condições padrão de análise [85].
1.2.5 Desempenho Cinético
A dimensão da coluna cromatográfica também constitui um importante
parâmetro a ser avaliado no desenvolvimento do método analítico. Desfontaine et al.
[51] descreveram que a dimensão da coluna cromatográfica deve ser determinada
de acordo com o volume morto do sistema, sendo bem estabelecido que o volume
morto do sistema deve representar no máximo 10% da variação total (soma da
variação relativa ao sistema e à coluna analítica), a fim de garantir que a maior
porção da eficiência gerada pela coluna seja aproveitável. Para os sistemas de SFC
mais modernos (UHPSFC), a variância é de 85 μL2, muito maior que a observada
em sistemas de UHPLC, com cerca de 10 μL2 de variação. Dessa forma, as colunas
com tamanho de partículas reduzidas, menores que 2 µm, largamente utilizadas em
UHPLC, não seriam compatíveis com sistemas de UHPSFC, mesmo os mais
modernos. Isso porque a variação deste tipo de coluna é de cerca de 100 μL2 para
coluna 50 mm x 2,1 mm x 1,7 µm, representando 45 % da variação total
sistema/coluna, muito maior que o valor aceitável. Colunas com diâmetro de 4,6 mm
seriam as mais adequadas, porém, a vazão necessária para estas colunas seria
maior que o suportado pelos equipamentos, além do consumo de solvente ser
extremamente elevado. Os autores concluiram que a melhor relação entre eficiência
e consumo de solvente seria obtida com colunas com de 100 mm x 3,0 mm, sendo
nestas condições a técnica de UHPSFC bastante competitiva com o UPHLC, do
ponto de vista cinético.
Originalmente, partículas menores que 2 μm foram desenvolvidas para
LC, a fim de atender a demanda industrial que visava aumento da eficiência na
separação e redução de tempo de análise [86]. A introdução de colunas com
36
partículas menores que 2 μm é relativamente recente [87], sendo realizada antes
mesmo do surgimento da nova geração de cromatógrafos de fluido supercrítico no
mercado, o que limitou o ganho de eficiência observada com estas colunas, devido
ao alto volume do sistema, associado à limitada capacidade de pressão das bombas
dos equipamentos da época.
Entretanto, com o desenvolvimento da nova geração de cromatógrafos, a
vantagem cinética da utilização de partículas pequenas, menores que 2 μm, pôde
ser claramente observada. Uma forma de avaliar a eficiência do sistema
cromatográfico, e em particular, da coluna cromatográfica, é através de uma curva
que relaciona a altura equivalente a um prato (H) e a velocidade linear da fase móvel
(μ) que é a curva de van Deemter (Equação 1).
(Equação 1)
A Equação 1 mostra os três diferentes fatores que afetam o valor de H, e,
portanto, a eficiência da separação. O termo A está relacionado às diferentes
trajetórias (caminhos múltiplos) do analito no leito cromatográfico e também à
difusão de Eddy, quando as moléculas do analito se prendem em poros presentes
na fase estacionária, de onde só saem por meio de difusão, sendo que tal termo não
possui qualquer relação com a velocidade linear da fase móvel empregada. Uma vez
na coluna em contato com a fase móvel, o analito tende a difundir em todas as
direções, incluindo o sentido longitudinal. Esta difusão está descrita pelo termo B da
equação e é responsável por um alargamento da banda. A importância deste termo
está relacionada ao tempo de permanência do analito na coluna e à velocidade
linear da fase móvel, sendo que quanto maior a velocidade, menor a difusão
observada, aumentado da eficiência. O coeficiente C representa a cinética de
transferência de massa do analito entre as fases móvel e estacionária, que deve
ocorrer a fim de garantir a separação dos diferentes compostos da amostra, sendo
diretamente proporcional à velocidade linear da fase móvel [88]. A Figura 3A mostra
graficamente o comportamento de cada um destes coeficientes descritos acima
37
sobre o valor de H em função de μ, além de mostrar uma curva combinada com os
efeitos de todos os fatores simultaneamente. A Figura 3B apresenta as curvas de
van Deemter obtidas com colunas de tamanho de partícula de 3,5 μm (em SFC e
HPLC) e de 1,7 μm (em UHPSFC e UHPLC), utilizando amostra de butilparabeno,
com fase móvel de H2O:ACN e MeOH:CO2, respectivamente, a fim de comparar o
efeito da redução do tamanho da partículas e das propriedades de cada sistema
sobre a eficiência na separação [89].
Figura 3. Curva de van Deemter: (A) Relação de cada termo em função de µ (adaptado da referência
[90]); (B): Curvas de van Deemter para as técnicas de HPLC, UHPLC, SFC e UHPSFC (adaptado da referência [89]).
38
Como pode ser observado, a técnica de HPLC possui a menor eficiência,
pois apresenta valores reduzidos de velocidade linear ótima (μopt), cerca de 1,1
mm/s, e um valor de H mínimo (Hmin) de 8,4 μm, enquanto que em SFC, os valores
encontrados foram de μopt de 4,5 mm/s e Hmin de 7,9 μm. Isso pode ser explicado
pelo fato do coeficiente B ser aumentado em SFC, pois este termo é proporcional ao
coeficiente de difusão, que é maior nesta técnica, proporcionando uma maior μopt
que em HPLC. Além disso, o efeito do coeficiente C (cinética de transferência de
massas) é menor em SFC que em HPLC, devido à alta difusibilidade dos analitos na
fase móvel supercrítica que ocorre em SFC, o que favorece a transferência de
massa e a redução do H [89]. Quando se compara a técnica de UHPLC à HPLC
verifica-se que há redução significativa do Hmin para 3,8 μm e aumento da μopt para
2,3 mm/s. Estas observações são explicadas pela redução no tamanho das
partículas, que reduz a resistência à transferência de massas, reduzindo o efeito do
coeficiente C sobre os valores de H, aumentando a eficiência na separação.
No caso do UHPSFC, a curva mostra que esta técnica apresenta as
vantagens da SFC e da UHPLC, uma vez que o valor de μopt é aproximadamente
10,0 mm/s, um aumento considerável, e a Hmin de 4,7 μm, apenas um pouco maior
que em UHPLC. Mais uma vez, a redução drástica no efeito do coeficiente C sobre
os valores de H justifica o ganho na eficiência observado com a redução no tamanho
da partícula para 1,7 μm. Devido à alta difusibilidade dos analitos na fase móvel
supercrítica, o coeficiente C (cinética de transferência de massas) é menos
importante em UHPLC, podendo então ser facilmente observado que a influência do
aumento da velocidade linear (vazão da fase móvel) sobre a eficiência é muito mais
impactante em UHPLC que em UHPSFC. A elevação da velocidade linear
rapidamente aumenta o valor de H em UHPLC, pois aumenta drasticamente a
contribuição do coeficiente relacionado à cinética de transferência de massas sobre
o valor de H, caracterizando uma rápida perda de eficiência em valores mais
elevados de μ. Como em UHPSFC este coeficiente C é menos importante, o
aumento da velocidade linear por si só não contribui muito para elevação de H.
Assim, a velocidade linear ótima é de apenas 2,3 mm/s em UHPLC contra 10,0
mm/s em UHPSFC [39,89].
39
Apesar do aumento na velocidade linear ótima e na cinética de
transferência de massas observado quando se trabalha com partículas de tamanho
reduzido (sub 2 μm), que é ainda mais pronunciado quando se trabalha em
condições supercríticas, devido à redução da viscosidade da fase móvel e aumento
no coeficiente de difusão, existe um fator que impõe uma grande limitação na
instrumentação disponível atualmente para UHPSFC, que é o limite máximo de
pressão suportado pelos equipamentos disponíveis no mercado, hoje de 400 bar.
Este valor não é suficiente para suportar o aumento na pressão gerado quando são
utilizadas colunas de partículas sub 2 μm e fase móvel de CO2 na presença de
modificadores orgânicos, que são as mais usuais em UHPSFC na atualidade,
juntamente com a contra-pressão adicional necessária para garantir a manutenção
do CO2 na condição supercrítica. Em seu estudo, Perrenoud et al. [89]
demonstraram que, quando se utiliza somente CO2 puro, é possível se trabalhar com
vazão de 3,25 mL/min, sem que seja ultrapassado o limite máximo do equipamento,
em uma coluna de 100 mm x 3 mm x 1,7 μm. Entretanto, com a adição de metanol
como modificador orgânico, o limite de pressão máximo é rapidamente obtido, sendo
que apenas 11 % de metanol pode ser adicionado quando se mantém a vazão de
trabalho em 3,25 mL/min, na coluna selecionada. A utilização de colunas recheadas
com partículas superficialmente porosas, também chamas de partículas “core-shell”,
permite alcançar eficiência cromatográfica igual ou maior que as partículas
convencionais totalmente porosas, gerando, no entanto, uma menor pressão no
sistema cromatográfico [91], e assim sendo, podem ser uma alternativa interessante
para contornar a limitação de pressão observada nos instrumentos de UHPSFC
atuais.
Diversas aplicações de colunas recheadas com partículas menores que 2
μm foram relatadas em UHPSFC. Um estudo publicado por Perranoud et al. [92]
monstrou o desenvolvimento de um método capaz de separar diversos analitos
básicos, de interesse farmacêutico, utilizando colunas recheadas com partículas
menores que 2 μm em UHPSFC, mantendo a compatibilidade de associação à
espectrometria de massas. Neste estudo, os autores compararam três diferentes
técnicas cromatográficas (RPLC, HILIC e UHPSFC), na separação de compostos
altamente hidrofílicos, que incluem um grande grupo de compostos biologicamente
40
ativos, e concluíram que UHPSFC apresenta grande potencial para análise deste
tipo de compostos, demonstrando seletividade e retenção cromatográfica satisfatória
com fases estacionárias polares, através de um mecanismo de separação
semelhante à fase normal [92]. Nóvaková et al. [93] publicaram o desenvolvimento e
validação de um método ultra rápido para quantificação de nove compostos
derivados do estrogênio em preparações farmacêuticas comerciais, utilizando uma
coluna sub 2 μm de tamanho de partículas. Li et al. [94] reportaram a aplicação da
técnica de UHPSFC acoplada a um detector por espalhamento de luz evaporativo,
para separação e quantificação de vários triterpenos presentes em uma complexa
matriz vegetal de Rosa sericea, com emprego de coluna de tamanho de partícula
reduzido, através do desenvolvimento de um método com níveis de precisão,
recuperação e sensibilidade aceitáveis.
1.2.6 Áreas de Aplicações da Técnica de UHPSFC
Devido às características descritas anteriormente, a aplicação da técnica
de UHPSFC vem crescendo intensamente em diversas áreas, como alimentos,
produtos naturais, ciência forense, combustíveis fósseis, agrotóxicos e ambiental,
polímeros, e farmacêutica, tanto em análises quirais como aquirais, assim como em
cromatografia preparativa [29,37,51,95–98]
Bernal et al. [37] discorreram sobre a aplicação da UHPSFC em análises
de alimentos, demonstrando que embora a maioria das aplicações tenha sido focada
na análise de compostos lipídicos, devido à alta solubilidade destes em CO2, muitos
trabalhos recentes têm comprovado a aplicabilidade da técnica também para análise
de compostos polares de origem alimentícia, tais como aminoácidos e carboidratos,
utilizando fases móveis com modificadores orgânicos.
Desfontaine et al. [51] publicaram um artigo de revisão no qual levantaram
as principais aplicações de UHPSFC na área farmacêutica. Segundo os autores,
apesar das diversas vantagens apresentadas pela técnica, principalmente em
relação à capacidade de análise de compostos lipofílicos e hidrofílicos, a quantidade
de publicações empregando SFC na indústria é bastante limitada, se comparado à
HPLC, porém não representativo de seu uso na área, pois a maior parte das
companhias que estão rotineiramente trabalhando com a técnica não publica seu
41
trabalho. Apesar do aumento no número de publicações, principalmente à partir de
2012, os autores afirmam que a maior parte dos artigos é considerada estudos
fundamentais, e quando abordam aspectos quantitativos, a maioria deles aplica-se à
cromatografia quiral. A explicação para isso seria a menor sensibilidade da detecção
UV e reprodutibilidade que a técnica demonstra, se comparado à HPLC. Essa menor
detectabilidade é explicada pelo alto nível de ruído observada na linha de base,
ocasionado pelas flutuações na pressão e consequentes alterações na densidade do
fluído e seu índice de refração.
Entretanto, avanços recentes na instrumentação da técnica permitem que
a mesma seja utilizada para aplicações quantitativas e análise de impurezas,
apresentando detectabilidade suficiente para esta finalidade, capazes de monitorar
impurezas a partir de 0,05 % da área no fármaco, conforme estudo recente de Galea
et al. [99]. Em 2014, Dispas et al. [100] publicaram o primeiro artigo descrevendo
uma validação integral em UHPSFC, para antibióticos, e compararam o potencial de
dois métodos, um em UHPSFC e outro em UHPLC. Os autores concluíram que,
embora o método em UHPLC apresentasse resultados levemente melhores em
relação à precisão e sensibilidade, o potencial quantitativo da UHPSFC foi
seguramente demonstrado, sendo ambas as metodologias similares em termos de
desempenho cromatográfico.
A análise do perfil de impurezas de um fármaco empregando SFC foi
primeiramente demonstrado em 2011, por Wang et al. [96], através do
desenvolvimento e validação de um método ortogonal para análise das impurezas,
em furoato de mometasona. Os autores demonstraram que a metodologia em
UHPSFC foi capaz de monitorar níveis de impurezas de até 0,05 % da área do
fármaco ativo, sendo todas as impurezas devidamente separadas e com tempo de
análise muito menor em UHPSFC que em UHPLC. Lesellier et al. [97] também
demostraram aplicação da técnica no desenvolvimento de método para análise de
cosméticos, normalmente mais complexo, devido à composição dos produtos e
interferência da matriz lipofílica. Apesar disso, os autores relataram uma redução no
prazo de desenvolvimento de métodos de 5 a 12 vezes em comparação com HPLC,
dependendo da complexidade da amostra estudada, quando empregada a técnica
de UHPSFC.
42
No campo da cromatografia quiral, desde a determinação em 1992, por
parte do FDA, que dois enantiômeros devem ser investigados individualmente em
relação a sua toxicidade, bioatividade e propriedades farmacocinéticas, que o
interesse por técnicas de separação enantioméricas cresceu muito. Dentre as
diversas técnicas descritas para esta análise, tais como a cromatografia líquida (LC)
e gasosa (GC), eletroforese capilar (CZE) e SFC [101], destaca-se a LC, que
apresenta a maior eficiência na separação de enantiômeros. Entretanto, esta
técnica, principalmente quando utilizada no modo de fase normal (NPLC), apresenta
uma série de complicações, como o uso de solventes altamente tóxicos e
inflamáveis, baixa reprodutibilidade em eluições por gradiente, retenção
inconsistente, alto tempo de estabilização do sistema e tempo de análise [102].
A primeira separação enantiomérica em SFC foi registrada em 1985,
usando uma fase estacionária quiral [101]. Atualmente, SFC vem sendo considerada
uma alternativa bastante viável à NPLC, e, progressivamente, vem se tornando a
primeira escolha em separações enantioméricas em muitas empresas
farmacêuticas, devido ao melhoramento contínuo da instrumentação analítica
empregada nesta técnica e melhor entendimento das suas vantagens em relação às
metodologias convencionais [51], tais como maior eficiência na separação de
enantiômeros, menor tempo de análise, menor uso de solventes orgânicos e
menores custos com descarte de fase móvel [90]. Em seu artigo de revisão sobre o
uso de SFC como uma ferramenta em análise de separações enantioméricas,
Kalíkova et al. [98] relataram mais de uma centena de aplicações de SFC na área, e
concluíram que, por proporcionar análises mais rápidas e eficientes que outras
técnicas normalmente empregadas, pode ser considerada a técnica do futuro em
termos de separação analítica. Diversos estudos publicados por Klerck et al.
[90,103–105] demostraram o grande potencial da técnica de UHPSFC quando
aplicada ao desenvolvimento de métodos de separação enantiomérica de fármacos.
A SFC vem sendo extensamente aplicada na forma de cromatografia
preparativa, visando a purificação de compostos, desde poucos gramas até vários
quilos ao dia. De forma geral, a SFC apresenta uma série de vantagens em relação
à LC preparativa, tais como baixa viscosidade da fase móvel supercrítica,
possibilitando o uso de alta vazão e, consequentemente, maior produtividade do
43
sistema de purificação. Além disso, apresenta menor consumo de solvente orgânico,
visto que o principal constituinte da fase móvel é CO2, que pode ser facilmente
removido da coluna por despressurização do sistema. Dessa forma, o trabalho, o
tempo e os custos de descarte são fortemente reduzidos quando a SFC é
empregada, justificando seu rápido crescimento na área preparativa, visto que
agrega fatores fundamentais para escolha da técnica de separação a ser utilizada
em qualquer indústria [106].
O uso da SFC em uma plataforma de purificação de moléculas foi
primeiramente descrito por MacClain et al. [107], que relataram redução no tempo de
secagem do processo de oito horas quando empregado LC, para apenas uma hora
em SFC. Além disso, através de mecanismos de separação alternativos
proporcionados pela SFC, compostos antes impossíveis de serem separados foram
isolados. Searle et al. [108] reportaram sucesso na obtenção de compostos livres de
sal, quando aplicada a SFC, o que não ocorria em LC, devido à presença de ácido
trifluoracético, frequentemente empregado nesta técnica. Inúmeros exemplos de
separação enantiomérica preparativa utilizando SFC também já foram descritos em
literatura, sendo adotados praticamente por todas as grandes empresas
farmacêuticas do mundo (por exemplo, Merck, Eli Lilly, Amgen, Sanofi-Aventis,
Roche, Takeda, Bristol-Meyers Squibb, Pfizer, Novartis, Johnson and Johnson, entre
outras), devido as vantagens observadas sobre as técnicas convencionais,
supracitadas [106].
Mais recentemente, em 2015, Lesellier e West [30] também relacionaram
diversas aplicações da técnica em várias áreas. De acordo com os autores, a maior
parte das análises de moléculas pequenas realizadas por HPLC poderia também ser
feita por SFC, demonstrando assim um grande campo de crescimento da técnica e
concluiram que a crescente publicação de artigos na área está fortalecendo o
entendimento da mesma. Neste artigo de revisão, os autores afirmaram que, no
estágio atual de entendimento da técnica, não existem ferramentas para se prever a
retenção e seletividade dependendo de todos os parâmetros operacionais. Dessa
forma, estratégias de otimização univariadas ainda são preferidas e adotas na
maioria dos desenvolvimentos analíticos em SFC. Entretanto, a estratégia de
desenvolvimento multivariado pode ser adotada, sendo recomendado o trabalho
44
com no mínimo três níveis para cada parâmetro selecionado. Normalmente os
desenvolvimentos multivariados se iniciam trabalhando com variações na proporção
de modificador orgânico, seguido de alterações na composição do modificador e
somente na sequência, se estudam os efeitos da temperatura e da pressão sobre a
retenção, seletividade e desempenho cromatográfico.
1.3 Vitaminas
Entre os nutrientes necessários para as diversas funções fisiológicas
essenciais à vida, encontram-se as vitaminas. Ao contrário de outras classes de
nutrientes, as vitaminas não apresentam funções estruturais, nem seu catabolismo
fornece energia significativa. Em vez disso, cada uma apresenta função altamente
específica e são necessárias apenas em pequenas quantidades na dieta, sendo que
as formas comuns da maioria das vitaminas presentes nos alimentos exigem alguma
ativação metabólica para suas formas funcionais.
De acordo com sua solubilidade, estes compostos podem ser
classificados em dois grandes grupos: vitaminas lipossolúveis (VLS) ou vitaminas
hidrossolúveis (VHS). As vitaminas lipossolúveis são as vitaminas A, D, e E, todas
sintetizadas a partir de condensação de múltiplos compostos isoprenóides. As
vitaminas hidrossolúveis mais comuns são representadas pelas vitaminas do
complexo B (B1, B2, B3, B6, B9, B12), além de alguns ácidos orgânicos, como ácido
ascórbico (vitamina C) [109,110].
Sabe-se que várias vitaminas apresentam função de cofatores de
enzimas (vitaminas A, K e C, tiamina, niacina, riboflavina, vitamina B6, biotina, ácido
pantotênico, ácido fólico e vitamina B12), outras atuam como antioxidantes
(vitaminas E e C) e várias apresentam função de cofatores em reações de oxidação-
redução metabólicas (vitaminas E, K e C, niacina, riboflavina, ácido pantotênico).
Duas vitaminas (vitaminas A e D) funcionam como hormônios, sendo que a vitamina
A também atua como um cofator fotorreceptor no processo de visão [109].
Diversas técnicas analíticas já foram descritas para análise das vitaminas,
como Espectroscopia UV-Vis [111], Fluorimetria [112], Eletroforese Capilar [113],
ensaios microbiológicos [114], Cromatografia Eletrocinética [115], Cromatografia
45
Gasosa [116] e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência [117–120], sendo esta
última a mais utilizada.
A grande diferença de solubilidade em água das vitaminas lipo e
hidrossolúveis pode ser expressa através do valor de logP (coeficiente de partição
octanolágua), que reflete a grande diferença de polaridade entre os compostos.
Além disso, estas vitaminas também apresentam diferenças de comportamento
ácido-base, o que pode ser verificado pela ampla faixa de valores de pKa. Dessa
forma, a análise por HPLC de vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis em um único
procedimento analítico é extremamente difícil, visto que os parâmetros previamente
citados impactam diretamente nas análises por esta técnica. Além disto, deve-se
considerar a dificuldade em relação à solubilização das vitaminas em um solvente
com polaridade próxima à fase móvel, bem como a estabilidade das moléculas no
diluente. O próprio capítulo geral da Farmacopeia Americana (USP), que aborda as
metodologias adotadas como referência para praticamente todas as indústrias
farmacêuticas a nível mundial, descreve uma série de métodos complexos, muitas
vezes destinados à análise de uma única vitamina, por meio de várias técnicas como
HPLC, GC, microbiologia e potenciometria [121].
Um único artigo publicado descrevendo a análise simultânea destes
grupos de vitaminas por HPLC foi encontrado [117], no qual foram separadas um
total de 12 vitaminas em 45 minutos de análise. Entretanto, o método mostrou-se
bastante complexo, com diversas rampas de gradiente, em um sistema de mistura
de três fases móveis diferentes, sendo necessário, inicialmente, trabalhar somente
com solução tampão, para eluir as vitaminas hidrossolúveis, e terminar o gradiente
com 100% de solvente orgânico, a fim de eluir as vitaminas lipossolúveis, o que
aumenta drasticamente a possibilidade de danificar o equipamento, devido ao risco
de precipitação do sal, além de demandar um longo tempo lavagem do sistema e de
estabilização da linha de base a cada injeção.
A técnica de UHPSFC pode ser promissora no desenvolvimento de uma
única metodologia analítica para separação e doseamento de vitaminas
lipossolúveis e hidrossolúveis em uma mesma amostra, devido à ampla seletividade
alcançada quando se utiliza o CO2 como fluido supercrítico, associado ao emprego
46
de modificadores orgânicos na fase móvel. Isso porque compostos de uma ampla
faixa de polaridade podem ser separados por esta técnica, incluindo aqueles que
apresentam grandes diferenças de polaridade e caráter ácido-base de seus
constituintes, como é o caso das vitaminas.
Alguns trabalhos publicados relataram a utilização da técnica de UHPSFC
para análise de vitaminas lipossolúveis provenientes de matrizes complexas como
suplementos alimentares, bebidas e alimentos [37,122]. Lesellier et al. também
demonstraram o emprego de UHPSFC em análise de carotenoides e vitaminas
lipossolúveis, afirmando que esta técnica apresenta diversas vantagens em relação
às técnicas convencionais (LC e GC), tais como redução no tempo de análise e
possibilidade de análise através de um único procedimento [123,124]. Recentemente
um artigo empregando UHPSFC acoplado à espectrômetro de massas foi publicado
[125]. Entretanto, neste trabalho, os compostos não foram resolvidos de acordo com
o seu tempo de retenção, uma vez que não há essa necessidade para análise por
espectrometria de massas. Cabe ressaltar que nenhum trabalho foi encontrado na
literatura associando ferramentas de QbD à técnica de UHPSFC para o
desenvolvimento simultâneo de vitaminas hidro e lipossolúveis.
1.3.1 Palmitato de Retinol (Vitamina A)
Em 1913, Osborne e Mendel da Universidade de Yale e Davis e
McCollum da Universidade de Wisconsin descobriram simultaneamente a vitamina
A, sendo a primeira vitamina lipossolúvel descoberta [109].
O termo “vitamina A” refere-se a um grupo de compostos químicos que inclui
retinol, retinaldeído, ácido retinóico e seus esteres, com estrutura química de 20
carbonos composta por um grupo metil no anel cicloexenil (anel β-ionona) e uma
cadeia lateral isoprenóide que apresenta o carbono 15 substituído, o que caracteriza
quimicamente as diferentes substâncias com atividade de vitamina A [126], e que,
devido a sua natureza lipídica, é incluída no grupo das vitaminas lipossolúveis. A
estrutura molecular do palmitato de retinol está apresentada na Figura 4 [109,127].
47
Figura 4. Estrutura molecular do palmitato de retinol.
A atividade da vitamina A em tecidos animais é encontrada
predominantemente sob a forma de retinol ou de seus ésteres, de retinal e, em
menor quantidade, como ácido retinóico. As formas sintéticas, como o acetato e o
palmitato de retinil são utilizados principalmente como suplementos alimentares e na
indústria em geral. Os retinóides aparecem como cristais amarelos ou, às vezes, na
forma de óleo, como é observado para os ésteres de retinila de cadeia longa. O
palmitato de retinol é um líquido oleoso e amarelo. A faixa de polaridade e a
solubilidade dos vários retinóides varia de solúvel a insolúvel em solventes polares
como a água e vice-versa em solventes apolares como hexano. Para os retinóides
ionizáveis, como o ácido retinóico, a solubilidade depende do pH do solvente, sendo
que este apresenta pKa 6-8 e é altamente solúvel em água. Retinóides apolares
como os ésteres de retinila são pouco solúveis em solventes polares como metanol
e acetonitrila. O palmitato de retinol é praticamente insolúvel em água, solúvel ou
parcialmente solúvel em etanol anidro, miscível com solventes orgânicos,
apresentando absorção UV máxima entre 325-328 nm [109].
A vitamina A não pode ser sintetizada pelos seres humanos, os quais
necessitam obtê-la através da dieta. Os retinóides são encontrados apenas em
alimentos de origem animal e seus derivados, tais como fígado, manteiga, queijo,
leite integral, gema de ovo e peixes gordos. Já os alimentos de origem vegetal
fornecem a vitamina A na forma de pró-vitaminas, especialmente alguns
carotenóides que apresentam ao menos um anel beta não substituído, tais como α-
caroteno, β-caroteno e as criptoxantinas, que podem ser convertidos em retinóides
por mamíferos [128]. A vitamina A é facilmente absorvida no tubo digestivo, embora
diminua na sua absorção em condições de consumo reduzido de gorduras e
proteínas ou deterioração das funções hepática ou pancreática. As enzimas
pancreáticas hidrolisam os ésteres de vitamina A para retinol, que é reabsorvido e
48
reesterificado. Uma parte do retinol é armazenada no fígado, e é libertada unida à
globulina alfa-1 específica (proteína de união ao retinol) no sangue. A porção que
não é armazenada no fígado glucoroniza-se e oxida-se para retinol e ácido retinóico,
sendo eliminada pela urina e pelas fezes. A vitamina A não atravessa facilmente a
placenta, mas está presente no leite materno [110].
Esta vitamina é essencial para o bom funcionamento da retina, sendo que
sua forma oxidada (retinol) combina-se com a opsina (pigmento vermelho da retina)
originando a rodopsina (púrpura visual), que é necessária para a adaptação à visão
noturna. Além disso, intervém no crescimento ósseo, na função testicular e ovariana,
no desenvolvimento do embrião, regulando ainda o crescimento e a diferenciação
dos tecidos epiteliais, podendo também atuar como cofator em reações bioquímicas
[109,129].
Os retinóides são termolábeis, fotossensíveis e facilmente atacados por
oxidantes. Estas características estão ligadas principalmente à sua cadeia poliênica,
que contém várias ligações duplas carbono-carbono em conjugação. A degradação
oxidativa da vitamina A e dos carotenoides em alimentos pode ocorrer por
peroxidação direta ou por ação indireta de radicais livres, produzidos durante a
oxidação de ácidos graxos. Os fatores que promovem a oxidação dos ácidos graxos
insaturados aumentam a degradação da vitamina A, quer por oxidação direta quer
por efeitos indiretos dos radicais livres. Perda de atividade de vitamina A em
retinóides e carotenoides dos alimentos ocorrem principalmente por reações que
envolvem a cadeia isoprenóide lateral insaturada, tanto por autoxidação como por
isomerização geométrica. Análises por HPLC revelam que muitos alimentos contêm
uma mistura de isômeros nas formas cis e trans de retinóides e carotenoides, sendo
que o enlatamento convencional de frutas e vegetais é suficiente para a indução de
isomerização e consequente perda de atividade de vitamina A. Além das
isomerizações térmicas, a conversão das formas trans de retinóides e carotenoides
em diversos isômeros cis pode ser induzida por exposição à luz, ácidos, solventes
clorados (p. ex. clorofórmio) e iodo diluído [110].
49
1.3.2 Colecalciferol (Vitamina D)
A Vitamina D, classificada como lipossolúvel, pode ser sintetizada pelas
plantas e pelos animais, sendo o colecalciferol (vitamina D3) e o ergocalciferol
(vitamina D2) suas fontes mais utilizadas. O ergocalciferol é originário de esteróides
das plantas, chamado de ergosterol, que pela incidência de raios solares é
convertido em vitamina D2. Já o colecalciferol é produzido exclusivamente pelos
animais, por meio da conversão do 7- deidrocolesterol, derivado do colesterol ou
esqualeno, pela incidência de luz solar [109,130]. A estrutura molecular do
colecalciferol está apresentada na Figura 5 [109].
Figura 5. Estrutura molecular do colecalciferol.
A vitamina D3 exerce inúmeras funções no metabolismo animal e dentre
elas as de principais interesses é são a regulação metabólica do cálcio e fósforo e a
absorção intestinal desses minerais [109,127], além de contribuerem para
prevenção, tratamento e aumento da imunidade contra algumas doenças,
principalmente as autoimunes [131]. As principais fontes alimentares são peixes
gordos, óleo de peixe e gema de ovo [109,127,131]
As vitaminas D2 e D3 não são biologicamente ativas, mas são
convertidas in-vivo na forma ativa da vitamina D por duas reações sequenciais de
hidroxilação. A primeira hidroxilação ocorre no fígado é catalisada por uma
hidroxilase específica, produzindo o 25-hidroxicolecalciferol (25-OHD3), que é a
forma predominante da vitamina D no plasma, sendo esta uma importante forma de
armazenamento da mesma. O 25-OHD3 é posteriormente hidroxilado na porção
50
primária por uma enzima específica, 25-hidroxicolecalciferol 1-hidroxilase,
encontrada primariamente no rim. O resultado é a formação do composto
denominado 1,25-diidroxicolecalciferol (1,25(OH)2D3) [109,127]. A função geral do
metabólito 1,25(OH)2D3 com ação combinada ao paratormônio – PTH é manter os
níveis plasmáticos de cálcio e fósforo, funcionando basicamente como hormônio
esteróide. O metabólito fisiologicamente ativo realiza estas funções por meio da
captação crescente de cálcio e fósforo pelo intestino e por minimizar a perda de
cálcio e fósforo pelos rins, estimulando a reabsorção óssea quando necessário
[109,132].
A maioria dos humanos depende de uma adequada exposição ao sol para
satisfazer suas necessidades diárias de vitamina D, sendo a síntese desta vitamina
diminuída no inverno e durante a noite [133]. Apesar da maior exposição solar em
países tropicais, concentrações séricas insuficientes de vitamina D3 são também
reportadas [134]. Saraiva et al. [134] encontraram concentrações inadequadas em
42% dos idosos na cidade de São Paulo e em 24% de mulheres com osteoporose.
Em adolescentes saudáveis e adultos jovens, a prevalência foi de 60% e 50%,
respectivamente. A deficiência de vitamina D manifesta-se como raquitismo em
crianças devido à mineralização prejudicada dos ossos durante esta fase. O
raquitismo é resultado não apenas da privação da vitamina D como também das
deficiências de cálcio e fósforo, sendo caracterizado por anormalidades estruturais
de ossos que suportam o peso, e está associado a dor óssea e sensibilidade
muscular. Nos adultos manifesta-se como osteomalácia, devido às reduções
generalizadas na densidade óssea e a presença de pseudo fraturas, especialmente
da coluna vertebral, fêmur e úmero. Os pacientes apresentam fraqueza muscular,
sensibilidade óssea e maior risco de fraturas, particularmente do punho e da pelve.
Nestes casos, existe a indicação de obtenção da vitamina D através de fontes
alternativas, com consumo de suplementos e alimentos fortificados
[109,127,130,132].
A vitamina D é suscetível à degradação pela luz. Nos alimentos, essa
degradação pode ocorrer em embalagens de leite de vidro, durante o
armazenamento, sendo relatadas perdas de 50% do colecalciferol adicionado ao
leite desnatado durante 12 dias de exposição contínua à luz fluorescente, a 4° C.
51
Não se sabe se essa degradação envolve degradação fotoquímica direta,
mecanismos que envolvem fotossensibilizadores que geram uma espécie reativa de
oxigênio ou efeitos indiretos da luz que levam à oxidação lipídica. Assim como
outros componentes solúveis na gordura insaturada dos alimentos, a vitamina D é
um composto sensível à degradação oxidativa. De modo geral, no entanto, a
estabilidade da vitamina D em alimentos, em especial em condições anaeróbias, não
é uma preocupação importante [110].
1.3.3 Acetato de Tocoferol (Vitamina E)
O acetato de tocoferol, uma das formas da vitamina E, é um óleo viscoso
de coloração amarela e praticamente inodora, solúvel em hidrocarbonetos, álcoois,
gorduras e óleos, mas insolúvel em água. Com relação à sua estabilidade, em
contraste com a forma álcool da vitamina, a forma acetato é resistente ao
aquecimento e à presença de oxigênio, não é resistente a álcalis, pois reage por
saponificação, nem à presença de agentes oxidantes fortes [110] . A estrutura
molecular do acetato de tocoferol é apresentada na Figura 6 [127].
Figura 6. Estrutura molecular do acetato de tocoferol.
A vitamina E é essencial para os processos metabólicos da respiração e
metabolismo de ácidos nucléicos em todas as células, muito atuante naquelas do
sistema nervoso. A vitamina E desempenha um importante papel como agente
antioxidante contra radicais livres na proteção de lipídios e da vitamina A, sendo
classificada como o agente antioxidante lipossolúvel de ocorrência natural mais ativo
[109,127,135]. Nessa função também estão a vitamina C, o betacaroteno e
substâncias enzimáticas, como as glutationas peroxidases [109]. A vitamina E
desativa produtos formados em cadeias de reações radicalares, que podem danificar
a membrana celular, acelerar processos de envelhecimento, e danificar o DNA, com
52
consequentes possibilidades mutagênicas e efeitos carcinogênicos, assim como
também influencia a síntese de prostaciclina e o metabolismo de eicosanoides e por
sua vez indiretamente previne tromboses e reações de inflamação [109,127]. O
termo vitamina E engloba todos os derivados de tocol e tocotrienol que exibem
qualitativamente a atividade biológica do α-tocoferol [109].
Alimentos animais e vegetais contêm diferentes quantidades de
tocoferóis, mas são sintetizadas apenas por plantas. Altos conteúdos dessa vitamina
são encontrados em óleos vegetais (por exemplo, de soja, de milho e de semente de
girassol), e especialmente no óleo de germe de trigo. Nesses óleos, o conteúdo de
vitamina E está correlacionado com a proporção de ácidos graxos insaturados, o
que providencia uma proteção natural contra agentes oxidantes. Também está
presente, mas em menores quantidades, em sementes e grãos em geral, vegetais
verdes e legumes [109,127].
Com a diminuição da vitamina E no organismo, o número de radicais
livres aumenta, e isso leva à oxidação dos lipídios, que por sua vez conduzem à
sintomas de deficiência de metabolismo muscular, funções da membrana e do
sistema nervoso. Os sintomas clínicos incluem um aumento na taxa de hemólise de
eritrócitos, formação de corpos de Heinz, fraqueza muscular, deposição de
pigmentos lipídicos, disfunções neuromusculares com tremulação do andar e
paralisia dos nervos faciais [109]. Recentemente foi demonstrado que uma proteína
derivada da vitamina E (α-tocoferol transfer proteína - TTP) é essencial nos
primeiros estágios de desenvolvimento do sistema nervoso central de vertebrados
[135]. Condições envolvendo a má absorção de lipídio podem também conduzir à
deficiência de vitamina E. Tais condições incluem aquelas resultantes da perda das
funções exócrinas pancreáticas (por exemplo, pancreatite, tumor pancreático, atrofia
pancreática nutricional, ocasionadas pela deficiência de selênio), outras envolvendo
a deficiência luminal da bile, ou devido ao defeito de lipoproteínas. Outra causa de
deficiência da vitamina E advém do fato que ela não atravessa prontamente a
placenta, por isso recém-nascidos estão particularmente sujeitos ao risco de sua
deficiência, especialmente se prematuros [109,127].
Devido às suas propriedades, o acetato de tocoferol pode ser usado em
preparações farmacêuticas em base lipofílica, como cremes e óleos. Para
53
preparações em base aquosa, como xaropes, gotas, solubilizáveis e injetáveis, é
necessário o uso de agentes solubilizantes [110]. Outra aplicação comum é como
antioxidante em alimentos industrializados ou preparações farmacêuticas para
manter a estabilidade dos produtos susceptíveis à oxidação [109].
1.3.4 Tiamina (Vitamina B1)
A tiamina é uma molécula carregada positivamente, por este motivo
encontra-se no mercado nas formas de sais de nitrato ou cloreto. Ambas as formas
são pós brancos e com leve odor característico. O hidrocloreto de tiamina é muito
solúvel em água (aproximadamente 100 g em 100 mL de água a 25 °C), solúvel em
glicerol, pouco solúvel em etanol e praticamente insolúvel em éter, acetona, tolueno
e clorofórmio. O nitrato de tiamina é solúvel em água fervente e menos solúvel em
água fria (3 g em 100 mL a 25 °C) [110,127]. A estrutura molecular da tiamina é
mostrada na Figura 7.
Figura 7. Estrutura molecular da tiamina.
A resistência ao aquecimento e à presença de oxigênio é melhor em
soluções ácidas (valores de pH menor que 4,5) do que em soluções neutras ou
alcalinas, nas quais se decompõe muito rapidamente, particularmente sob influência
da luz. Agentes oxidantes e redutores em solução também aceleram a
decomposição da tiamina em solução [109,110]. Em preparações farmacêuticas
líquidas é preferível a forma de nitrato de tiamina devido a sua melhor solubilidade
em água, ao passo que a forma nitrato é preferível em formas sólidas, devido ao
baixo conteúdo de água que o material sólido pode absorver, conferindo maior
estabilidade [109,110]. Na sua forma biológica ativa, tiamina difosfato (TDP), a
tiamina desempenha um papel importante como coenzima em reações chaves para
54
converter lipídios e carboidratos em energia. A tiamina também apresenta certas
funções no sistema nervoso central, na geração de impulsos e na regeneração de
nervos periféricos [109,127,136].
A tiamina pode ser encontrada em alimentos de origem vegetal e animal,
embora em diferentes formas e em pequenas quantidades. Nos tecidos animais está
presente principalmente como TDP, que deve ser previamente clivada antes que
possa ser absorvida pelos organismos. As plantas contêm a forma livre, não
fosfatada, da vitamina, diretamente disponível. Cereais e seus derivados são as
principais fontes dessa vitamina para o homem. Como a riboflavina, a tiamina está
mais concentrada nos germes e na camada aleurona (ou tegumento, é uma fina
camada que reveste a amêndoa ou endosperma), de tal forma que no arroz polido e
na farinha branca está presente em poucas quantidades. Boas fontes dessas
vitaminas são a farinha integral e produtos derivados, batatas, leguminosas, carne
de porco, leite e derivados [109,127].
A falta da vitamina B1 pode se manifestar em dois conjuntos diferentes de
sintomas, relacionados às suas duas principais funções bioquímicas, sendo eles
desordem cardiovascular (dispneia, aperto no peito, dor precardial, taquicardia,
edema, alterações no eletrocardiograma e quedas repentinas na pressão
sanguínea) e desordem neurológica (desordens nervosas com parestesia,
hiperestesia ou anestesia, sensação de ardência nos pés, fraquezas musculares,
dores, cólicas, paralisias, desordem na coordenação de origem cerebral, alterações
psicológicas como irritabilidade, lassitude, depressão, e ansiedade) [109,127]. A
manifestação clínica da carência de tiamina, conhecida como beribéri, se caracteriza
por uma maciça disfunção neurológica, desgastes dos músculos esqueléticos,
fraqueza nos músculos do coração e edema, ambos juntos ou separadamente,
dependendo do avanço da doença e da deficiência de outros nutrientes. O beribéri
ainda é bastante frequente em países subdesenvolvidos, sendo a maior causa de
mortalidade infantil em populações asiáticas, mas muito raro em países
desenvolvidos [137]. A doença pode ainda ter outras causas como o alcoolismo
crônico, dietas de redução de peso e dietas com altas proporções de carboidratos,
insuficiências gástricas ou abuso de antiácidos, o uso de contraceptivos orais e
doenças como diabete mellitus, Alzheimer e AIDS [109]. Antagonistas da tiamina
55
presentes em tanino (chá), café, noz de betel, bem como tiaminases presentes em
fermentados de peixe, podem bloquear a absorção de tiamina, bem como sua
biodisponibilidade [109,137].
1.3.5 Riboflavina (Vitamina B2)
A riboflavina é um sólido cristalino de cor amarelo-alaranjada, com um
odor suave. Apresenta solubilidade em água bastante limitada (70-80 mg/L), e é
praticamente insolúvel em etanol, acetona e éter. Em solução alcalina é solúvel. A
solução aquosa neutra de riboflavina apresenta coloração intensa de amarela a
verde fluorescente [109,110,127]. Na Figura 8 se apresenta a estrutura molecular da
riboflavina [127].
Figura 8. Estrutura molecular da riboflavina.
A riboflavina é bastante estável na forma sólida, se devidamente
armazenada, e também em solução ácida na ausência de luz, mesmo se aquecida.
Contudo, a riboflavina é sensível em meios alcalinos, na presença de sais de metais
pesados e exposta à luz. Sua aplicação, geralmente, está limitada a comprimidos e
fortificantes em pó ou granulados [110]. Como flavinamononucleotídeo (FMN), ou
como flavina adenina dinucleotídeo (FAD), a riboflavina (também chamada de
lactoflavina) é a coenzima para uma ampla variedade de enzimas respiratórias,
conhecidas como flavoproteínas. Algumas flavoproteínas desempenham um papel
na transferência de átomos de hidrogênio na geração oxidativa de energia dentro
das células, conhecidas como cadeia respiratória. Sendo assim, a riboflavina, bem
como outras vitaminas do complexo B, agem como coenzimas no metabolismo de
proteínas, lipídeos e carboidratos e na geração de energia via ATP [109,127]. A
riboflavina também está envolvida no metabolismo de outras vitaminas do complexo
56
B e na produção de hormônio no córtex adrenal [109]. Delgadillo [138] demonstrou
que a riboflavina atua na formação da dentição em vertebrados. No trabalho
desenvolvido por sua equipe ficou constatado que a ausência total de riboflavina na
dieta materna de ratas provocou defeitos nos tecidos dentoalveolar durante o
desenvolvimento dos embriões. Anand et al. [139] reportaram um caso em que o
quadro clínico da síndrome de Brown-Vialetto-Van Laere (BVVLS), uma condição
genética causada por uma mutação no gene C20ORF54, apresentou melhoras
significativas após a administração de altas doses de riboflavina (150 mg duas vezes
ao dia) a uma menina de 22 meses que apresentava essa síndrome. Os autores
sugeriram, então, que em todos os casos que essa síndrome for diagnosticada
deveria ser considerado o tratamento com altas doses de riboflavina. Segundo eles,
parte dos sintomas da BVVLS são devidos ao transporte deficiente de riboflavina no
intestino.
A riboflavina ocorre na forma livre ou como FMN, em todos os organismos
vegetais e animais. Fontes ricas desta vitamina incluem fermentados, leites e
derivados do leite, ovos, carne (particularmente as vísceras), peixe, repolho, feijão e
ervilha. Em grãos é encontrada principalmente no germe e na camada aleurona, de
tal forma que a farinha branca, contém apenas um terço de riboflavina do total do
grão. A maioria das frutas e dos vegetais contém pouca quantidade de riboflavina
[109,127].
1.3.6 Nicotinamida (Vitamina B3)
Nicotinamida, niacinamida e 3-piridincarboxamida são sinônimos. Esta
substância no estado puro é um pó branco, com odor característico fraco, solúvel em
água (cerca de 70g/100 mL a 20 °C) e etanol, solúvel em glicerol e levemente
solúvel em éter [109,110]. A estrutura molecular da nicotinamida é apresentada na
Figura 9 [127].
Figura 9. Estrutura molecular da nicotinamida.
57
A nicotinamida é muito estável em alimentos, em presença do oxigênio
atmosférico, aquecimento e luz, tanto no estado sólido quanto em solução aquosa, e
por isso é usada em formas farmacêuticas líquidas e sólidas [110]. A nicotinamida,
o ácido nicotínico e diversas moléculas derivadas dessas duas, fazem parte das
chamadas niacinas que, em geral, são substâncias essenciais na formação das
coenzimas nicotinamida adenosina dinucleotídeo (NAD) e nicotinamida adenosina
dinucleotíde fosfato (NADP), nas quais a nicotinamida age como um doador de
elétrons em muitas reações biológicas redox. Estão envolvidos na geração de
energia a partir de carboidratos, proteínas e lipídios e em reações não redox
envolvendo o reparo do DNA [109,127]. Gazanion et al. [140] investigaram a
atividade de nicotinamida isoladamente e em associação com outras drogas já
empregadas no tratamento de várias formas de Leishmaniose. Quando usado em
concentrações inferiores a 20 mmol/L no meio de cultura, a nicotinamida apresentou
atividade anti-leishmaniose, enquanto que seu uso em concentrações superiores
induziu a morte do parasita. O efeito da combinação da vitamina com as drogas
antimônio pentavalente (SbV), tartarato de potássio e antimônio tri-hidrato (SbIII),
pentamida e anfotericina também foi estudado e os resultados mostraram que a SbV
e a SbIII apresentaram um sinergismo moderado, isto é, aumentaram
significantemente a atividade dessas drogas contra parasitas intracelular. A
pentamida apresentou um efeito antagonista com relação à presença de
nicotinamida e a anfotericina mostrou apenas um efeito de atividade aditivo [140].
Todos os vegetais e animais podem ser fontes da nicotinamida, que
ocorre como NAD e NADP devido a sua função geral. Fontes ricas das niacinas são
os fermentos, vísceras (rins, fígado e coração), assim como o músculo e a farinha
integral [109,141,127] A niacina não é uma vitamina clássica, uma vez que o corpo
pode sintetizar parte da demanda diária a partir do aminoácido essencial triptofano.
Apenas se a dieta de nicotinamida e triptofano forem insuficientes é que irão
aparecer os sintomas. A deficiência de nicotinamida é a causa principal da doença
pelagra, que têm entre seus sintomas a demência de todos os tipos, atraso no
desenvolvimento infantil, envelhecimento precoce, manifestações intestinais e na
pele devido a infecções crônicas. A pelagra também aumenta o risco de
58
desenvolvimento de câncer, o que está ligado à função da nicotinamida no reparo do
DNA [109,127].
1.3.7 Piridoxina (Vitamina B6)
A vitamina B6 é o nome que abrange piridoxina, piridoxal e piridoxamina,
bem como as formas fosfatadas. A piridoxina está disponível no mercado na forma
hidroclorada, sendo um pó cristalino sem cheiro, solúvel em água (20 g por 100 mL
a 25°C), pouco solúvel em etanol e praticamente insolúvel em éter, clorofórmio e
acetona [110,127]. A estrutura molecular da piridoxina está mostrada na Figura 10
[127].
Figura 10. Estrutura molecular da piridoxina.
A piridoxina é muito estável no estado puro cristalino, em misturas secas
(por exemplo, comprimidos) e em soluções. Esta substância é resistente ao
aquecimento na presença de bases e ácidos, mas degrada pela ação da luz em
soluções neutras e alcalinas. Não é aconselhável que haja combinação de ferro na
formulação, pois a piridoxina tende a se complexar com esse metal. A piridoxina
pode ser usada em praticamente todas as formas de dosagem com propósitos
terapêuticos e preventivos [110]. Na forma de coenzimas, piridoxal-5-fosfato (PLP) e
piridoxamina-fostato (PMP), a vitamina B6 desempenha um papel chave no
metabolismo dos aminoácidos [109,142]. Esta vitamina é necessária no sistema
nervoso central como coenzima para a síntese de aminas biogênicas. Também
desempenha um papel importante no metabolismo dos carboidratos, especialmente
no desprendimento de glicose do glicogênio, e influencia na conversão de
aminoácido triptofano a niacina, na biossíntese de porfirina, em certas funções no
sistema nervoso e na síntese de hemoglobina. Há pelo menos 100 reações
dependentes de piridoxal fosfato no ser humano [109,127,143].
59
A ocorrência da piridoxina nos reinos vegetal e animal é muito ampla,
sendo encontrada em altas concentrações, principalmente nas vísceras e laticínios.
Alimentos vegetais, tais como, batata, legumes, bananas, couve e alface também
são boas fontes de piridoxina. Nos vegetais a vitamina B6 pode estar presente na
forma de piridoxina glicosídica, que possui uma biodisponibilidade reduzida por
causa da necessidade de ser previamente hidrolisada por uma glicosidase intestinal
para ser absorvida. Gorduras, óleos e açúcar não contêm vitamina B6
[109,141,127,143,144].
A deficiência isolada de vitamina B6 é muito rara em humanos, em vista
que se há escassez dessa, a deficiência de outras vitaminas do complexo B estão
associadas e os sintomas de deficiência dessas outras vitaminas já estão presentes
no indivíduo. Os sintomas típicos incluem a pelagra; dermatite seborreica nas
regiões do nariz, boca e olhos; inflamações na boca e nos lábios; insônia; desordens
nervosas; irritabilidade; cólicas de origem cerebral em bebês; anemia hipocrômica;
aumento da eliminação renal de ácido oxálico acompanhada da formação de pedras
no trato urinário eferente. As deficiências de piridoxina, geralmente, estão
associadas a uma dieta pobre por um longo período de tempo, à hemodiálise, ao
uso de algumas drogas continuamente, ao alcoolismo crônico e a várias desordens
metabólicas e intestinais [110,127,145]. Outra circunstância que a deficiência pode
ocorrer é durante a gravidez e a lactação. Nesses períodos o organismo requer
maiores quantidades de piridoxina e o consumo deve ter um aumento proporcional.
Por isso a quantificação de vitamina B6 (e os compostos relacionados a ela) em leite
humano tem sido extensamente estudada, especialmente porque o leite é a única
fonte de nutrientes para crianças de até 4-6 meses de idade [144].
1.3.8 Ácido Fólico (Vitamina B9)
Folato é o termo genérico utilizado para designar tanto a forma natural
quanto a sintética da vitamina B9. O ácido fólico (ácido piteroilmonoglutâmico) é uma
substância cristalina laranja-amarelada que é solúvel em água, mas insolúvel em
etanol ou solventes orgânicos menos polares. É instável à luz, em condições ácidas
ou alcalinas, e na presença de agentes redutores e, exceto na forma seca, ao
aquecer. A estrutura molecular do ácido fólico está mostrada na Figura 11 [127].
60
Figura 11. Estrutura molecular do ácido fólico.
Os folatos incluem um grande número de espécies quimicamente
relacionadas, cada uma diferindo em relação aos vários substituintes possíveis em
três locais na estrutura básica do ácido piteroilmonoglutâmico. Considerando todas
as variações estruturais possíveis, mais de 170 folatos diferentes são teoricamente
possíveis. Nem todos estes ocorrem na natureza, porém se estima que até 100
formas diferentes são encontradas em animais [109].
Em relação ao metabolismo, o ácido fólico é reduzido in vivo
enzimaticamente, primeiro a ácido 7,8-diidrofólico (FH2) e depois a FH4. Ambos
estes compostos são instáveis em ambientes aeróbios e devem ser protegidos pela
presença de um antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico, 2 mercaptoetanol)
[109,127]. Dois derivados de ácido fólico, cada um tendo um grupo amino no lugar
do hidroxilo em C-4, são antagonistas de folato de uso biomédico: aminopterina
(ácido 4-aminofolico) e metotrexato (ácido 4-amino-N10-metilfolico). A aminopterina
é usada como um rodenticida e o metotrexato como um agente antineoplásico [109].
Essa vitamina é encontrada naturalmente em frutas e verduras,
particularmente as hortaliças como espinafre, couve e brócolis, entre outras fontes
de leguminosas, e em vísceras, principalmente o fígado. Dentre suas funções
biológicas, atua em diversas reações de transferência de unidades de carbono como
coenzima, incluindo metabolismo de aminoácidos, síntese de purinas e pirimidinas.
A falta desta vitamina implica em anemia megaloblástica, aumento da concentração
plasmática de homocisteína e defeitos na formação do tubo neural em fetos
[109,127].
61
1.3.9 Cianocobalamina (Vitamina B12)
Vitamina B12 (Cobalamina) é um termo coletivo que abrange um
conjunto de compostos que possuem um átomo de cobalto no centro de um sistema
de anel do tipo porfirina, mas que possuem diferente substituintes. Seis formas de
cobalamina (cianocobalamina, hidroxocobalamina, cobalamina R, cobalamina S,
metilcobalamina e adenosilcobalamina) demonstraram atividade de vitamina B12 no
organismo humano [109].
A cianocobalamina cristaliza facilmente em agulhas vermelho escuras
insípidas e inodoras, é muito solúvel em água, em álcool, insolúvel em éter, acetona
e clorofórmio, e funde numa faixa de 210 a 220 °C com decomposição. Os cristais
são bastante higroscópicos e podem absorver até cerca de 12 % de água da
atmosfera. A cianocobalamina se decompõe em soluções básicas, ou fortemente
ácidas, ou na presença de agentes redutores, e, quando exposta à radiação UV, em
soluções neutras e ligeiramente ácidas, mas é relativamente estável na presença de
oxigênio atmosférico ou submetida a aquecimento. Em solução aquosa é mais
estável numa faixa de pH de 4,5 a 5,0 [110]. A estrutura molecular genérica das
cobalaminas está mostrada na Figura 12. A cianocobalamina, especificamente, tem
na posição do radical R um grupo ciano (– CN) [127].
Figura 12. Estrutura molecular genérica da cobalamina.
62
As vitaminas provenientes da dieta são convertidas em suas formas
ativas – as coenzimas adenosilcobalamina e metilcobalamina. A primeira é
responsável pelo rearranjo intramolecular de grupos alquil e na degradação de
ácidos adiposos bifurcados e de número ímpar, bem como de certos aminoácidos.
Já a metilcobalamina desempenha um papel importante na transferência de grupos
metil na síntese dos aminoácidos metionina a partir da homocisteína, que algumas
vezes depende da presença de folatos, na mitocôndria das células. Assim, a
vitamina B12 também desempenha um papel importante na conversão, transporte e
estocagem das formas do ácido fólico em suas formas ativas, que são requeridas na
homogênese [109,141,127]. Também, está indiretamente envolvida na síntese de
ácidos nucleicos, e proteínas via biossíntese de bases púricas e pirimídicas, e de
metionina, com um importante papel no crescimento e nos processos de
desenvolvimento [109,146].
A cobalamina ocorre apenas em alimentos de origem animal. As maiores
quantidades são encontradas no fígado. Outras fontes de vitamina B12 incluem
substâncias musculares, peixe, gema de ovo, leite e queijo [127,146]. Alimentos de
origem vegetal podem apenas conter traços dessa vitamina se forem submetidas à
fermentação bacteriana, como no caso de bebidas fermentadas. Assim, uma dieta
estritamente vegetariana está quase totalmente livre dessa vitamina [146].
A baixa ingestão de cobalamina na dieta é extremamente rara. Os
sintomas de deficiência, geralmente, ocorrem em desordens orgânicas que levam ao
impedimento da absorção dessa vitamina pelo organismo. Dentre essas desordens
se destacam a baixa acidez estomacal (isto é, ausência de ácido clorídrico), atrofia
da mucosa gástrica ou cirurgia que levem à diminuição do fator intrínseco (IF),
formação de anticorpos contra o IF ou contra o complexo IF-B12, presença de certas
bactérias ou parasitas no trato gastrointestinal, desordens no fígado que reduzem o
estoque de vitaminas B12 e desordens metabólicas intracelular com formação
inadequada das formas da vitamina com atividade [109,146].
Os sintomas de deficiência de cianocobalamina consistem nos seguintes:
anemia megaloblástica – formação defeituosa das células na medula óssea conduz
a essa anemia, com supercrescimento característicos dos corpúsculos vermelhos do
sangue; desordens neurológicas – um sério resultado da deficiência de vitamina B12
63
é a degeneração de certas áreas do cordão espinhal, que é frequentemente
irreversível e pode causar danos permanentes no sistema nervoso, caracterizado
pelo desprendimento da mielina, necrose de células do cordão espinhal e do córtex
14 cerebral. Tais desordens são acompanhadas de formigamento das mãos e pés,
perda do tato, dos movimentos de reflexo, da memória e do poder visual, confusões,
mudanças de caráter, alucinações e psicoses. O déficit de cianocobalamina pode
simular uma enfermidade de Creutzfeldt-Jakob, com combinação variável de
demência, ataxia e sinais piramidais e extrapiramidais [109,147,148].
1.3.10 Ácido Ascórbico (Vitamina C)
O ácido ascórbico (AA) é um sólido cristalino branco, que escurece
facilmente em contato com a luz. Faz parte do grupo das vitaminas hidrossolúveis e,
como tal, apresenta uma elevada solubilidade em água. Os seus sais, ascorbato de
sódio e ascorbato de cálcio, são ainda mais solúveis. Todos os derivados desta
vitamina são, então, insolúveis em gorduras e óleos [110,149]. O AA é pouco solúvel
em ácido acético, acetona e álcoois de cadeia curta como o metanol e o etanol, e
insolúvel em éter, clorofórmio, benzeno e éter de petróleo. Trata-se de um composto
estável em sua forma seca, porém se oxida com facilidade em solução aquosa. A
excepcional facilidade com que essa vitamina é oxidada faz com que ela funcione
como um bom agente oxidante: um composto que pode proteger outras espécies
químicas de possíveis oxidações, sendo este processo aumentado na presença de
calor [109,110,127,150]. A estrutura molecular do ácido ascórbico está apresentada
na Figura 13 [127].
Figura 13. Estrutura molecular do ácido ascórbico.
Apesar de não possuir grupos carboxílicos, a vitamina C apresenta
características de um ácido orgânico. A deslocalização dos elétrons π entre os
carbonos do sistema conjugado enediol aumenta a estabilidade da molécula e faz
64
com que o hidrogênio do grupo hidroxila torne-se bastante ácido (pKa 1= 4,17)
contribuindo para a natureza ácida da vitamina C [109]. A sua elevada solubilidade
em água e outros solventes polares, caráter ácido, forte agente redutor e reatividade
são características atribuídas à sua estrutura química (presença do grupo hidroxi-
enólico). As ligações duplas no anel lactona estão relacionadas com as suas
propriedades de absorção. A absorção UV do ácido ascórbico é dependente das
espécies iônicas presentes, ou seja, do pH do meio. Em ambientes ácidos (níveis de
pH baixos), o AA encontra-se na forma protonada e a sua absorção máxima ocorre
em torno de 245 nm. Acima do pH 5, o AA encontra-se predominantemente como
espécie monoaniônica (ânion ascorbato) e possui absorção máxima por volta de 265
nm. Em soluções em pH acima de 12 o AA encontra-se totalmente dissociado [110].
O nome ácido ascórbico designa a atividade antiescorbútica da vitamina
C, e deriva da antiga forma inglesa da palavra escorbuto (scorby). Os seres
humanos fazem parte do grupo de seres vivos que não são capazes de sintetizar
vitamina C que devido à ausência da enzima L-gulonalactona oxidase não
conseguem transformar a glicose do sangue em ácido ascórbico. Desta forma, a
ingestão desta vitamina é vital para a saúde e até mesmo para a sobrevivência do
ser humano, pois o ácido ascórbico participa de inúmeras atividades fisiológicas. A
quantidade de vitamina C recomendada pela OMS (Organização Mundial de Saúde),
é de 45 mg /dia, a qual é facilmente atingida com o consumo de frutas e vegetais
frescos [151]. As principais fontes naturais de vitamina C são encontradas em frutas,
como o caju, goiaba, manga, laranja e acerola, vegetais folhosos, como brócolis e
couve e os legumes, como os pimentões e o nabo [109,127,152,153]. A deficiência
de vitamina C pode ser definida como uma concentração no plasma inferior a 23
mmol/L, e afeta cerca de 5 a 10 % dos adultos no mundo ocidental, com maior
incidência em certos subgrupos, como fumantes, pessoas de baixa renda, mulheres
grávidas e seus recém-nascidos [109,127,154]. Por esse motivo, há diversos
suplementos nutricionais produzidos empregando a vitamina C em sua composição
[151].
O ácido deidroascórbico é a forma oxidada do ácido ascórbico (AA) e
possui 80% da atividade biológica de seu precursor não oxidado. A atividade
antioxidante da vitamina C envolve a doação de um elétron e a formação do radical
65
livre ascorbato. O ácido deidroascórbico representa menos de 10% da vitamina C
total dos vegetais, tendendo a aumentar com o período de estocagem. Por isso
existem muitos trabalhos cujo escopo é dosar os teores de ácido ascórbico e
também deidroascórbico [151]. O ácido ascórbico é afetado pelo processamento de
frutas e vegetais, por isso sua retenção é usada frequentemente como indicativo da
qualidade nutricional e até mesmo de conservação dos alimentos. Durante o
processamento ou armazenamento, podem ocorrer perdas da vitamina C através de
uma série de rotas diferenciadas [110,151]. A determinação do ácido ascórbico em
alimentos é bastante complexa em função dos baixos níveis em que estes
compostos podem ser encontrados, além da presença de substâncias interferentes
da matriz estudada que podem, inclusive, contribuir para a sua degradação
[151,155].
Na Tabela 2 são mostradas as principais características físico-químicas
das vitaminas descritas. Pode-se verificar a grande diferença estrutural e,
consequentemente, entre as principais características físico-químicas dos
compostos vitamínicos listados, como massa molar, solubilidade, pKa, entre outras.
Tais diferenças podem contribuir para tornar o processo de desenvolvimento da
metodologia de análise bastante complexo.
66
Tabela 2. Vitaminas avaliadas e suas principais características físico-químicas [156–159] .
VITAMINA NOME
GENÉRICO NOME QUÍMICO DESCRIÇÃO
FÓRMULA MOLECULAR
MASSA MOLAR (g/mol)
pKa LogP ESTABILIDADE SOLUBILIDADE ESTRUTURA
A Palmitato de
Retinol
(2E,4E,6E,8E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-
trimetilciclohex-1-en-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraen-
1-il hexadecanoato
Líquido viscoso ou
semi-sólido, amarelado a alaranjado
C36H60O2 524,86 7,04 13,6
Sensível a oxidação; absorve umidade em exposição ao ar; fácil
metamorfismo na exposição à luz; em
solução, armazenar no escuro a temperatura de -
20°C em solventes livres de peróxidos
Levemente solúvel em etanol; solúvel em metanol, clorofórmio, éter etílico e óleos; insolúvel em água
D3 Colecalciferol
(1S,3E)-3-2-[(1R,3aS,4E,7aR)-7a-
metil-1-[(2R)-6-metilheptan-2-il]-
octahidro-1H-inden-4-ilidene]etilideno-4-
metildeneciclohexan-1-ol
Cristais finos e incolores
C27H44O 384,64 1,32; 18,38
7,5
Sensível á oxidação e à umidade do ar; armazenar sob vácuo, protegido da luz
a 4°C
Solúvel em etanol,
éter etílico, clorofórmio, acetona
e óleos vegetais; insolúvel em água
E Acetato de -
tocoferol
(2R)-2,5,7,8-Tetrametil-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimetiltridecil]-3,4-
diidro-2H-cromen-6-il acetato
Líquido viscoso,
levemente amarelado
C31H52O3 472,74 10,8 7,59
Estável ao calor na ausência de oxigênio,
ácidos fortes e luz visível; estável em solução
alcalina; instável sob luz UV; leve oxidação na
exposição ao ar
Solúvel em etanol, éter etílico,
clorofórmio, acetona e óleos vegetais; insolúvel em água
B1 Tiamina
3-[(4-Amino-2-metil-5-pirimidinil)metil]-5-(2-
hidroxietil)-4-metil-1,3-tiazol-3-ium
Pó branco cristalino
C12H17N4OS 265,35 15,5 -2,11
Estável sob condições normais de armazenagem
e soluções ácidas; degradada em soluções
neutras e alcalinas; instável na presença de luz e
aquecimento
Solúvel em água; levemente solúvel em etanol; insolúvel em
éter e benzeno
67
B2 Riboflavina
1-Deoxi-1-(4-hidroxi-7,8-dimetil-2-
oxobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)-D-ribitol
Cristal alaranjado a
amarelo C17H20N4O6 376,37 6,97 -1,46
Estável em soluções ácidas e na presença de agentes oxidantes; muito sensível
ao pH alcalino e luz
Solúvel em soluções aquosas básicas;
levemente solúvel em água e etanol; insolúvel em
clorofórmio e éter
B3 Nicotinamida Piridinacarboxamida Pó branco cristalino
C6H6N2O 122,13 13,39 -0,45 Estável em soluções ácidas e básicas; estável ao calor
Solúvel em água, etanol e glicerol
B6 Cloridrato de
Piridoxina 4,5-Bis(hidroximetil)-2-
metil-3-piridinol
Pó branco a quase branco,
cristalino C8H11NO3 169,18 9,4 -0,57
Estável em soluções ácidas; instável em soluções alcalinas e
fotossensível
Solúvel em água, etanol e soluções alcalinas; insolúvel
em éter
B12 Cianocobalami
na
Cobalto(3+);[(2R,3S,4R,5S)-5-(5,6-
dimetilbenzimidazol-1-il)-4-hidroxi-2-
(hidroximetil)oxolan-3-il] [(2R)-1-[3-
[(1R,2R,3R,5Z,7S,10Z,12S,13S,15Z,17S,18S,
19R)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoetil)-
7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropil)-
3,5,8,8,13,15,18,19-octametil-2,7,12,17-
tetrahidro-1H-corrin-24-id-3-
il]propanoilamino]propan-2-il] fosfato;cianeto
Cristal vermelho escuro,
amorfo ou cristalino
C63H88CoN14
O14P 1355,29 1,84 0,67
Estável em exposição ao ar; instável em soluções
alcalinas e de ácidos fortes, com máxima estabilidade observada na faixa de pH
de 4,5-5,0
Solúvel em água e etanol; insolúvel em
éter, acetona e clorofórmio
68
C Ácido
Ascórbico
(2R)-2-[(1S)-1,2-dihidroxietil]-3,4-
dihdroxi-2H-furan-5-ona
Pó cristalino branco a
amarelado, com sabor
ácido
C6H8O6 176,09 4,36 -1,58
Estável ao ar quando seco; amostras impuras oxidam facilmente após exposição
ao ar e luz; soluções aquosas são rapidamente
oxidadas pelo ar, aceleradas por pH alcalino,
ferro e cobre
Solúvel em água; levemente solúvel em etanol; insolúvel em
éter
B9 Ácido Fólico
2-[[4-[(2-amino-5-formil-4-oxo-1,6,7,8-
tetrahidropteridin-6-il)metilamino]benzoil]a
mino] ácido pentanodióico
Pó cristalino, alaranjado amarelo
C20H23N7O7 441,37 3,37 -1,2 Estável quando exposto ao ar; instável quando exposto
à luz
Solúvel em soluções alcalinas; levemente solúvel em metanol; insolúvel em água e
etanol
69
2. OBJETIVOS
Os principais objetivos deste trabalho são:
1. Compreender a retenção das principais vitaminas lipossolúveis e
hidrossolúveis na técnica de Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta
Eficiência;
2. Aplicar as ferramentas de Quality by Design para o desenvolvimento de
um método analítico único para separação e quantificação de vitaminas lipossolúveis
e hidrossolúveis em complexos vitamínicos farmacêuticos empregando
Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência.
3. EXPERIMENTAL
3.1 Reagentes
Palmitato de retinol, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Colecalciferol, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Acetato de alfa-tocoferol, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Nitrato de tiamina, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Riboflavina, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Nicotinamida, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Cloridrato de piridoxina, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Ácido fólico, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Cianocobalamina, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Ácido ascórbico, DSM Nutritional Products Colombia S.A;
Metanol grau HPLC, Tedia;
Acetonitrila grau HPLC, Panreac;
2-propanol grau HPLC, Panreac;
Dimetilsulfóxido grau HPLC, Panreac, lote: 476706;
Trietilamina grau HPLC, JT Baker, lote: G11J10;
Ácido fosfórico grau HPLC, Synth, lote: 106575;
Formato de amônio, Fluka, lote: #BCB4959V;
70
70
Acetato de amônio, JT Baker, lote: E51C11;
Hidróxido de amônio, Sigma, lote: S57344-278;
Hidróxido de sódio, Ecibra, lote: 252975;
Água deionizada;
Dióxido de carbono (99,9% de pureza), Air Products.
3.2 Equipamentos
Balança analítica (Sartorius), com capacidade de pesagem de 0,01 mg à 220
g;
Banho de ultrassom (Logen Scientific);
Bomba a vácuo Vacunbrand, modelo 1C;
Sistema de deionização de água, Milli-Q Plus;
Vórtex (Phoenix Luferco AP56);
Cromatógrafo de Convergência de Ultra Performance (UPC2), da empresa
Waters Corporations, equipado com injetor de amostra automático, sistema binário
de bombeamento da fase móvel e detector por arranjo de diodos (DAD). Para
obtenção e tratamento dos dados foi empregado o software Empower Pro.
3.3 Colunas Cromatográficas
Coluna comercial ACQUITY UPC2 BEH 1,7 µm 2,1 mm X 100 mm, fabricada
pela empresa Waters, PN: 18606560, lote: 0106130281;
Coluna comercial ACQUITY UPC2 HSS C18 SB, 1,8 µm, 2,1 mm X 50 mm,
PN: 186006617, lote: 0106360251, precedida da coluna de guarda Van Guard® C18,
fabricada pela empresa Waters, de 1,8 µm, 2,1 mm X 5 mm (PN: 186006616, lotes:
106361591 e 104343431);
Coluna comercial ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolilamina) 1,7 µm, 2,1
mm X 50 mm, PN: 186007596, lote: 0101343021, precedida da coluna de guarda
71
71
Van Guard® C18, fabricada pela empresa Waters, de 1,7 µm, 2,1 mm X 5 mm
(PN:186007604, lote: 0101342481);
Coluna comercial ACQUITY UPC2 CSH Fluoro Fenil, 1,7 µm, 2,1 mm X 50
mm, PN: 186006567, lote: 0102331411, precedida da coluna de guarda Van Guard®
CSH Fluoro Fenil, fabricada pela empresa Waters, de 1,7 µm, 2,1 mm X 5 mm
(PN:186006566, lote: 0102130381).
3.4 Amostra
O produto farmacêutico utilizado como amostra e avaliado ao final do
desenvolvimento do método constitui-se de uma cápsula gelatinosa mole, contendo
em sua composição vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis, além de minerais e
excipientes. A composição padrão da formulação é mostrada na Tabela 3.
Tabela 3. Composição do produto farmacêutico a ser analisado [160]
COMPONENTE QUANTIDADE POR
CÁPSULA
Retinol (palmitato) – Vitamina A 2664 UI (2,664 mg)
Colecalciferol - Vitamina D 400 UI (0,01 mg)
Acetato de alfa-tocoferol - Vitamina E 10,0 mg
Ácido ascórbico - Vitamina C 70,0 mg
Tiamina (mononitrato) - Vitamina B1 3,0 mg
Riboflavina - Vitamina B2 3,40 mg
Nicotinamida - Vitamina B3 17,0 mg
Piridoxina (cloridrato) - Vitamina B6 4,0 mg
Ácido fólico - Vitamina B9 0,60 mg
Cianocobalamina - Vitamina B12 2,20 µg
72
72
3.5 Procedimentos
3.5.1 Avaliação da Solubilidade das Vitaminas
Inicialmente, foi realizado um levantamento sobre a solubilidade das
vitaminas para a determinação dos solventes potenciais a serem utilizados como
diluentes no preparo da amostra em UHPSFC e avaliou-se, experimentalmente, a
solubilização das vitaminas em água, metanol, 2-propanol, acetonitrila e
dimetilsulfóxido, devido as suas conhecidas capacidades de solubilização de
matrizes complexas. Foram preparadas soluções das vitaminas em estudo, em
balões volumétricos, nas concentrações de 1,0 mg/mL por ser comumente
empregada em métodos de doseamento e 0,2 mg/mL, por se tratar de uma
concentração mais próxima da presente no produto farmacêutico avaliado, em cada
um dos diluentes testados. Cada solução foi agitada manualmente, levada ao
ultrassom por 15 minutos, agitados em agitador por 2 minutos e mantidas em
repouso por cerca de 60 minutos. Verificou-se a solubilização das vitaminas, em
cada condição, através de observação macroscópica, sendo considerados solúveis
aquelas que resultaram em uma solução límpida, sem observação de solutos
precipitados, após o tempo de repouso.
3.5.2 Avaliação do Volume de Injeção
Para avaliação do volume de injeção, preparou-se uma solução da
vitamina B3 (nicotinamida), na concentração de 1,0 mg/mL, nos diluentes 2-propanol,
dimetilsulfóxido, 100% metanol, metanol:água 80:20 (v/v) e metanol:água 50:50 (v/v),
e injetou-se no sistema cromatográfico 1 ou 3 μL, no modo isocrático, com 5% de
metanol:CO2 como fase móvel, vazão 1,0 mL/min, na coluna cromatográfica Acquity
UPC2 HSS C18 SB, com temperatura do forno de 40°C e detecção em 265 nm,
comprimento de onda este no qual todas as vitaminas apresentaram absortividade.
73
73
Após a corrida, integrou-se o pico e avaliou-se o seu formato e o fator de assimetria,
em cada condição testada.
3.5.3 Seleção de Fase Móvel (Modificador Orgânico) e Seleção de
Fase Estacionária
Para o estudo de triagem da fase estacionária e do tipo de modificador
orgânico a ser empregado na fase móvel, avaliaram-se as colunas mencionadas no
item 3.3 e os solventes orgânicos: metanol, acetonitrila e 2-propanol.
Para a realização destes ensaios, as soluções padrão de trabalho foram
preparadas de forma a obter as concentrações descritas na Tabela 4, baseadas no
teor de cada vitamina esperado por cápsula da amostra, considerando a utilização de
duas cápsulas em um balão volumétrico de 25 mL, exceto para as vitaminas D, B9 e
B12, que por estarem em concentrações muito reduzidas na amostra, a solução
padrão de trabalho foi preparada na concentração de 0,10 mg/mL. Utilizou-se uma
solução de metanol:água 95:5 (v/v) como diluente, com volume de injeção de 1 μL,
temperatura do forno de 40°C e análise em comprimento de onda de 265 nm.
Tabela 4. Concentração dos analitos na solução padrão de trabalho
COMPONENTE CONCENTRAÇÃO NA
SOLUÇÃO TRABALHO (mg/mL)
Retinol (palmitato) - Vitamina A 0,21
Colecalciferol - Vitamina D 0,10
Acetato de alfa-tocoferol - Vitamina E 0,10
Ácido ascórbico - Vitamina C 5,60
Tiamina (mononitrato) - Vitamina B1 0,24
Riboflavina - Vitamina B2 0,27
Nicotinamida - Vitamina B3 1,36
Piridoxina (cloridrato) - Vitamina B6 0,32
74
74
Ácido fólico - Vitamina B9 0,10
Cianocobalamina - Vitamina B12 0,10
As VLS (A, D e E) e as VHS (B1, B2, B3, B6, B9, B12 e C), foram
analisadas separadamente, a fim de facilitar a identificação dos picos e a análise dos
resultados. Para as VLS, foram construídas curvas de retenção variando a
porcentagem de modificador orgânico de 0 a 25 % (v/v), em modo isocrático, de
forma a obter o maior número de picos, com formato adequado, com vazão de 1,0
mL/min, temperatura do forno de 40°C. Já para as VHS, devido à grande diferença
na retenção destas vitaminas nas fases estacionárias avaliadas, a retenção deste
grupo de compostos foi verificada empregando eluição por gradiente, conforme
gráfico mostrado na Figura 14, de forma a selecionar o modificador orgânico e a fase
estacionária que resultassem no maior número de picos, com formato adequado.
Nestes estudos, o sistema de gradiente empregado atingiu até 40% de modificador
orgânico na fase móvel, a fim de garantir que nenhum composto ficasse retido na
coluna. A vazão empregada foi de 1,0 mL/min, temperatura do forno de 40°C.
Figura 14. Programa do gradiente utilizado no estudo de seleção do modificador orgânico e da fase
estacionária para eluição das vitaminas hidrossolúveis.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 10 15 20 25 26 30
% M
od
ific
ado
r O
rgân
ico
Tempo (min)
75
75
3.5.4 Seleção de Fase Móvel - Aditivos
Nesta etapa do desenvolvimento, avaliou-se o efeito de alguns aditivos
comumente empregados em UHPSFC sobre o formato dos picos e o tipo de eluição
cromatográfica, nas melhores condições de fase estacionária e modificador orgânico
obtidas nos testes anteriores. Dessa forma, avaliou-se o efeito da adição na fase
móvel de acetato de amônio (10 mmol/L), formato de amônio (10 mmol/L), hidróxido
de amônio (5, 10, 20, 38,5 mmol/L e 0,2%, v/v), trietilamina (0,2%, v/v), ácido
fosfórico (0,2%, v/v), hidróxido de sódio (10 mmol/L) e água (5%, v/v) sobre o formato
dos picos das vitaminas e sua eluição.
Para a realização deste teste, as soluções padrão foram preparadas de
acordo com a Tabela 4, obtendo as concentrações descritas, em mg/mL, utilizando
uma solução de metanol:água 95:5 (v/v) como diluente, com volume de injeção de 1
μL, temperatura do forno de 40°C. Neste momento, as vitaminas foram preparadas
em uma única solução, e eluidas usando o programa de gradiente mostrado na
Figura 15. Nesta etapa do desenvolvimento, o sistema de gradiente foi otimizado,
visto que já se conhecia previamente o comportamento de eluição das vitaminas em
estudo. A vazão foi aumentada para 1,5 mL/min e a proporção máxima de
modificador orgânico utilizado foi de 25%.
Figura 15. Programa do gradiente de fase móvel empregado durante o estudo de seleção de aditivos
para a fase móvel (VHS + VLS).
0
5
10
15
20
25
30
0 1 5 25 26 30 % M
od
ific
ado
r O
rgân
ico
Tempo (min)
76
76
3.5.5 Planejamento Experimental
Para realização dos estudos de planejamento experimental, as soluções
foram preparadas nas concentrações indicadas na Tabela 4, utilizando uma solução
de metanol:água 95:5 (v/v) como diluente, com volume de injeção de 1 μL e vazão de
1,5 mL/min. Neste momento, as vitaminas foram preparadas em uma única solução e
analisadas empregando eluição pelo gradiente descrito na Figura 15, utilizando as
melhores condições de fase móvel (modificadores orgânicos e aditivos) e fase
estacionária selecionadas nos estudos anteriores (Knowledge Space).
Desta forma, um Planejamento Experimental do tipo Composto Central foi
conduzido, conforme Tabela 5, com as colunas Acquity UPC2 HSS C18 SB e Torus
2-PIC, em fase móvel constituída de formato de amônio 10 mmol/L em metanol:água
95:5 (v/v) com adição de 10 mmol/L de hidróxido de amônio, a fim de se avaliar a
influência das variáveis que afetam a densidade do fluído em SFC sobre a eluição
cromatográfica dos analitos em estudo, a fim de se obter o Design Space.
Assim, as variáveis estudadas, ou Critical Process Parameters
selecionados foram: porcentagem de modificador ao final do gradiente, avaliado de
20 a 30 %, contra-pressão, avaliada de 1500 a 2500 psi e temperatura do forno,
avaliada de 30 a 50 °C. As respostas, ou Critical Quality Attributes (CQA) do método
observadas foram o fator de retenção, fator de assimetria dos picos, resolução,
número de pratos e a área dos analitos. O software utilizado para tratamento dos
resultados experimentais foi o Design Expert, versão 9.
77
77
Tabela 5. Condições dos experimentos realizados de acordo com o Planejamento Composto Central.
ORDEM PADRÃO
ORDEM DE EXECUÇÃO
EXPERIMENTAL
MODIFICADOR ORGÂNICO (%)
PRESSÃO (PSI)
TEMPERATURA (°C)
4 1 30 2500 30
8 2 30 2500 50
1 3 20 1500 30
13 4 25 2000 30
17 5 25 2000 40
9 6 20 2000 40
15 7 25 2000 40
14 8 25 2000 50
10 9 30 2000 40
20 10 25 2000 40
3 11 20 2500 30
7 12 20 2500 50
6 13 30 1500 50
12 14 25 2500 40
16 15 25 2000 40
18 16 25 2000 40
2 17 30 1500 30
11 18 25 1500 40
19 19 25 2000 40
5 20 20 1500 50
3.5.6 Linearidade
A fim de desafiar o método analítico desenvolvido, testes prévios de
linearidade e seletividade foram conduzidos, com o intuito de verificar se o método
está apto para ser validado conforme RDC 166/2017 da ANVISA.
Para tal, preparou-se uma solução padrão estoque das vitaminas e em
seguida, alíquotas foram transferidas para balões volumétricos, resultando em
soluções com as concentrações descritas na Tabela 6. Para a vitamina B2
78
78
(riboflavina), pelo fato desta apresentar limitada solubilidade, preparou-se cada
solução da curva de linearidade de forma direta, de forma a obter as concentrações
descritas na mesma tabela.
Estas soluções foram injetadas nas colunas Acquity UPC2 Torus 2-PIC
(VHS) e Acquity HSS C18 SB (VLS), conforme método desenvolvido, a fim de avaliar
a linearidade de cada analito. Através da correlação “área x concentração”, avaliou-
se os parâmetros coeficiente de correlação (critério de aceitação: mínimo 0,990),
coeficiente de determinação (r), resíduos padronizados (critérios de aceitação:
distribuição aleatória dentro do intervalo de -3 a 3) e intercessão com o eixo Y
(coeficiente linear) [161].
79
Tabela 6. Concentrações de cada composto no ensaio de Linearidade e porcentagem correspondente da Solução Padrão.
Vitamina A Vitamina E Vitamina D Vitamina B1 Vitamina B2 Vitamina B3 Vitamina B6 Vitamina C
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
Conc. (mg/mL)
% Solução
Trabalho
0,04 18,77 0,15 18,75 0,02 20,00 0,01 4,17 0,02 8,15 0,01 0,74 0,01 3,13 3,00 53,57
0,06 28,15 0,23 28,13 0,03 30,00 0,02 8,33 0,04 15,11 0,02 1,47 0,02 6,25 3,50 62,50
0,08 37,54 0,30 37,50 0,04 40,00 0,04 16,67 0,06 21,63 0,04 2,94 0,04 12,50 4,00 71,43
0,10 46,92 0,38 46,88 0,05 50,00 0,06 25,00 0,08 28,89 0,06 4,41 0,06 18,75 4,50 80,36
0,12 56,31 0,45 56,25 0,06 60,00 0,08 33,33 0,12 44,07 0,08 5,88 0,08 25,00 5,00 89,29
0,14 65,69 0,53 65,63 0,07 70,00 0,10 41,67 0,16 58,89 0,10 7,35 0,10 31,25 5,50 98,21
0,16 75,08 0,60 75,00 0,08 80,00 0,15 62,50 0,20 73,33 0,15 11,03 0,15 46,88 6,00 107,14
0,18 84,46 0,68 84,38 0,09 90,00 0,20 83,33 0,24 87,41 0,20 14,71 0,20 62,50 6,50 116,07
0,20 93,84 0,75 93,75 0,10 100,00 0,25 104,17 0,26 97,41 0,25 18,38 0,25 78,13 7,00 125,00
0,22 103,23 0,83 103,13 0,11 110,00 0,30 125,00 0,27 100,00 0,30 22,06 0,30 93,75 7,50 133,93
0,24 112,61 0,90 112,50 0,12 120,00 0,35 145,83 0,28 104,81 0,35 25,74 0,35 109,38 8,00 142,86
0,26 122,00 0,98 121,88 0,13 130,00 0,40 166,67 0,30 110,74 0,40 29,41 0,40 125,00 8,50 151,79
0,28 131,38 1,05 131,25 0,14 140,00 0,45 187,50 0,35 130,00 0,45 33,09 0,45 140,63
0,30 140,77 1,13 140,63 0,15 150,00 0,50 208,33 0,37 135,19 0,50 36,76 0,50 156,25
0,32 150,15 1,20 150,00 0,16 160,00 0,75 312,50 0,75 55,15 0,75 234,38
0,34 159,53 1,00 416,67 1,00 73,53 1,00 312,50
1,25 520,83 1,25 91,91 1,25 390,63
1,50 625,00 1,50 110,29 1,50 468,75
1,75 729,17 1,75 128,68 1,75 546,88
2,00 833,33 2,00 147,06 2,00 625,00
80
3.5.7 Injeções da Amostra
Após definição dos principais parâmetros do método analítico, avaliou-se o
perfil do cromatograma obtido após injeção de uma solução preparada com o
produto farmacêutico em teste.
Para a realização deste ensaio, transferiu-se o conteúdo de duas cápsulas
para um balão volumétrico de 25 mL e utilizou-se uma solução de metanol:água 95:5
(v/v) como diluente. Após solubilização sob agitação e banho de ultrassom, as
amostras foram filtradas em membrana de PTFE de 0,22m e injetadas (1 μL) no
sistema, conforme condições analíticas determinadas anteriormente.
A seguir, compararam-se os cromatogramas obtidos com a solução
amostra, solução padrão e injeção de diluente, a fim de detectar possíveis
interferências da matriz no tempo de retenção dos analitos.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Solubilidade
Da mesma maneira que em cromatografia líquida, na técnica de UHPSFC
é importante que o analito seja solubilizado em um solvente com polaridade
semelhante à fase móvel, ou mais fraco que esta, pois a utilização de solventes com
maior força cromatográfica que a fase móvel como diluente dificulta a interação dos
analitos com a fase estacionária, na entrada da coluna, até que a amostra se dilua
na fase móvel, ocasionando em problemas de alteração na retenção e distorção do
pico cromatográfico [162,163]. Além disso, diluentes de viscosidade muito diferente
da fase móvel também são fontes de distorções, visto que aqueles mais viscosos
dificultam a solubilização dos analitos na fase móvel, levando à distorção dos picos
dos compostos menos retidos, enquanto os diluentes menos viscosos proporcionam
uma introdução instável da amostra na coluna, também acarretando em alargamento
dos picos [164].
A transferência destes conhecimentos para SFC não é simples, conforme
explicitado por Ambrahamsson e Sandahl [165], pois a avaliação do grau de
81
solubilização da amostra na fase móvel não é direta, visto que a força
cromatográfica da fase móvel depende de muitos fatores, como densidade,
temperatura, pressão e o emprego de modificadores orgânicos, sendo estes
interdependentes entre si, o que dificulta a realização de estimativas e compreensão
do fenômeno de solubilização da amostra na fase móvel. Segundo os autores,
poucos trabalhos publicados tratam destes aspectos relacionados à solubilização da
amostra.
Assim, do ponto de vista prático, devido ao fato da fase móvel em
UHPSFC ser constituída basicamente de CO2, a qual é apolar, e, portanto,
apresenta uma baixa força cromatográfica, deve-se selecionar um diluente com
caráter também apolar e, caso isto não seja possível, deve-se aumentar a polaridade
do diluente e avaliar o formato do pico cromatográfico.
Fairchild e Hill [166] avaliaram o formato do pico do composto
butilparabeno dissolvido em oito diferentes solventes orgânicos (metanol, etanol,
isopropanol, tetraidrofurano, 30:70 (v/v) isopropanol:heptano, 50:50 (v/v)
tetraidrofurano:heptano, 30:70 (v/v) tetraidrofurano:heptano e dimetilsulfóxido), em
uma coluna de 150 x 2,1 mm x 5 μm. Os autores constataram que, diluentes com
força cromatográfica mais próxima do CO2 apresentavam formatos de pico mais
regulares, como n-hexano e n-heptano. À medida que a força cromatográfica do
solvente aumentava, o pico tornava-se mais largo, como observado com 2-propanol
e metanol, mesmo quando pequenos volumes de injeção eram utilizados. A Figura
16 mostra os cromatogramas obtidos pelos autores utilizando 30:70 (v/v)
isopropanol:heptano (A), 2-propanol (B) e metanol (C) como diluentes da amostra,
após injeção de vários volumes de injeção – 0,5 µL (preto), 1,0 µL (vermelho), 1,5 µL
(azul), 2,0 µL (verde), 2,5 µL (azul claro), 3,0 µL (rosa) e 4,0 µL (marrom).
82
Figura 16: Cromatogramas do butilparabeno utilizando: (A) 30:70 (v/v) isopropanol:heptano, (B) 2-
Propanol e (C) metanol como diluente da amostra. As cores representam vários volumes de injeção:
0,5 µL (preto), 1,0 µL vermelho), 1,5 µL (azul), 2,0 µL (verde), 2,5 µL (azul claro), 3,0 µL (rosa) e 4,0
µL (marrom). Adaptado de Fairchild e Hill (2013) [166].
Outro artigo que mostra o efeito de diferentes diluentes foi publicado por
Abrahamsson e Sandahl [165], porém de forma mais exaustiva que Fairchild e Hill.
Desta vez, diversos analitos, de diferentes polaridades, foram analisados em três
colunas cromatográficas diferentes (sílica, C18 e 2-EP), usando 17 diluentes puros,
sem misturas de solventes, com intuito de verificar quais características dos
solventes, como ponto de ebulição, tensão superficial, diferentes tipos de interações
83
moleculares, densidade, constante dielétrica, entre outros, apresentavam maior
influência sobre o formato dos picos cromatográficos dos diferentes analitos em
estudo. Assim como descrito por Fairchild e Hill, o dimetilsulfóxido apresentou picos
bastante largos, e mostrou-se o pior diluente para as amostras, em relação ao
formato dos picos. O estudo mostrou também que existe uma interação entre o
diluente, fase estacionária utilizada e composição de fase móvel, sendo que cada
configuração pode beneficiar ou afetar negativamente o formato do pico
cromatográfico de um analito, e, portanto, a eficiência da separação. Segundo os
autores, as maiores fontes de distorção dos picos estão relacionadas à densidade,
pressão de vapor e interações do diluente com a coluna e com os analitos.
Pode-se concluir, portanto, que uma relação ideal entre a solubilidade da
amostra, formato do pico, estabilidade da amostra e retenção do composto deve ser
obtida, a fim de se determinar o melhor solvente para ser empregado como diluente,
a fim de proporcionar resultados satisfatórios durante o desenvolvimento de uma
metodologia analítica pela técnica de UHPSFC.
Observando os valores de logP das vitaminas mostrados na Tabela 2, fica
claro que as vitaminas A, D e E apresentam menor solubilidade em água e maior
solubilidade em octanol que as demais, e por isso são classificadas como vitaminas
lipossolúveis. As demais vitaminas apresentam valores de logP bem menores,
indicando serem mais hidrossolúveis que as anteriores. Além disso, pode-se inferir
que cada grupo de vitaminas deve realizar diferentes tipos de interações entre a fase
estacionária, fase móvel e diluente, tornando o processo de escolha do diluente
bastante complexo. Como a diferença de solubilidade entre as vitaminas estudadas
é bastante significativa, houve a necessidade de se testar diversos diluentes para
solubilizá-las, visto que esta é uma condição primária para escolha de um diluente
adequado. West [167] cita que um composto pode ser considerado apto para ser
analisado por SFC quando este for capaz de se dissolver pelo menos na
concentração de 1 mg do analito por mL de metanol, destacando assim a
importância do estudo de solubilidade dos analitos durante o desenvolvimento da
metodologia analítica por UHPSFC. Foram realizados então testes de solubilidade
84
das vitaminas em diversos solventes comumente utilizados em UHPSFC, de
diferentes características físico-químicas, a fim de se determinar o diluente mais
adequado para solubilizar as diferentes vitaminas em estudo. Os resultados obtidos
inicialmente são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7. Resultados dos testes de solubilidade empregando diferentes solventes.
VIT.
DILUENTE
ÁGUA METANOL ACETONITRILA 2-PROPANOL DIMETILSULFÓXIDO
1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL
A Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
D Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
E Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B1 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel
B2 Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel
B3 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B6 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B9 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel
B12 Solúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel
C Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel
Verifica-se que todas as vitaminas lipossolúveis de fato são imiscíveis em
água pura, em ambas as concentrações estudadas. Além disso, as vitaminas B2
(riboflavina) e B9 (ácido fólico) também se mostraram insolúveis em água, a 1,0
mg/mL, sendo que a vitamina B2 é solúvel na concentração de 0,2 mg/mL neste
solvente. O metanol, assim como os demais solventes orgânicos avaliados
(acetonitrila, 2-propanol e dimetilsulfóxido) foram capazes de solubilizar as vitaminas
lipossolúveis. Entretanto, para as vitaminas hidrossolúveis, os resultados não foram
satisfatórios, com exceção do dimetilsulfóxido, que solubilizou todas as vitaminas. A
acetonitrila e o 2-propanol não foram capazes de solubilizar a maioria das vitaminas
hidrossolúveis, em qualquer concentração. Assim, pode-se concluir que o metanol
foi o solvente orgânico puro, juntamente com o dimetilsulfóxido, que apresentou os
melhores resultados, solubilizando o maior número de vitaminas. Entretanto, o
metanol não solubilizou a vitamina B12 (cianocobalamina) em nenhuma
concentração estudada. O dimetilsulfóxido poderia ser um bom diluente, em relação
85
a sua capacidade de solubilização das vitaminas analisadas. De fato, este solvente
orgânico é bastante utilizado para solubilizar amostras complexas, principalmente
em Cromatografia Gasosa. Entretanto, por tratar de uma molécula extremamente
polar, causa uma severa distorção nos picos cromatográficos, conforme observado
por Fairchild e Hill [166] e Abrahamsson e Sandahl [165]. Assim, o metanol mostrou-
se o melhor solvente para solubilizar as vitaminas lipossolúveis e a maioria das
hidrossolúveis. Dessa forma, com o intuito de solubilizar as vitaminas hidrossolúveis
B9 e B12, foram preparadas soluções de metanol e água, em diferentes proporções
(de 50 a 5% de água em metanol). Os resultados são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8. Resultados do teste de solubilidade empregando metanol:água em diferentes proporções
(v/v).
VIT.
DILUENTE
METANOL:ÁGUA 50:50
METANOL:ÁGUA 80:20
METANOL:ÁGUA 90:10
METANOL:ÁGUA 95:5
1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL
A Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
D3 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
E Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B1 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B2 Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
B3 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B6 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B9 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
B12 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel
C Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
Como pode ser observado na Tabela 8, a adição de uma pequena
quantidade de água em metanol prejudica a solubilização das vitaminas
lipossolúveis, principalmente a vitamina A, mais apolar dentre as vitaminas
estudadas. Entre 5 a 10 % de água (v/v), entretanto, é possível solubilizá-las, na
concentração de 0,2 mg/mL, que é mais próxima da concentração de trabalho a ser
empregada no método analítico a ser desenvolvido. Em relação às vitaminas
hidrossolúveis, foi possível solubilizá-las com a adição de 20% de água em metanol,
86
na concentração de 0,2 mg/mL, com exceção da cianocobalamina (vitamina B12),
que se manteve insolúvel em todas as proporções de água avaliadas em ambas as
concentrações.
A vitamina B12 mostrou-se, portanto, a vitamina de maior dificuldade
de solubilização neste estudo. Embora presente em concentrações muito baixas nas
formulações farmacêuticas, não foi possível solubilizá-la em metanol, nem em
solução hidroalcoólica de metanol, mesmo que em alta concentração de água. De
fato, se trata de uma molécula de elevada massa molar, e baixa solubilidade em
solventes orgânicos. Entretanto, como pode ser observado na Tabela 7, esta
vitamina foi solúvel apenas em água pura. Dessa forma, realizaram-se experimentos
de solubilidade onde foram adicionados primeiramente um determinado volume de
água, seguido por agitação em ultrassom, e então adicionado o metanol. O objetivo
foi avaliar se a água adicionada inicialmente era capaz de solubilizar as vitaminas
hidrossolúveis, incluindo a vitamina B12, e se a posterior adição de metanol não
levaria a precipitação destas vitaminas já solubilizadas ao mesmo tempo em que o
metanol fosse capaz de solubilizar as vitaminas lipossolúveis. Os resultados estão
mostrados na Tabela 9.
Tabela 9. Resultados do teste de solubilidade empregando metanol:água em diferentes proporções
(v/v), com adição de água seguida de agitação em ultrassom e posterior adição de metanol.
DILUENTE
VIT. 50 ÁGUA + 50 METANOL 20 ÁGUA + 80 METANOL 10 ÁGUA + 90 METANOL 5 ÁGUA + 95 METANOL
1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL 1,0 mg/mL 0,2 mg/mL
A Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
D3 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
E Insolúvel Insolúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B1 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B2 Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
B3 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B6 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
B9 Insolúvel Insolúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel Insolúvel Solúvel
B12 Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
C Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel Solúvel
87
Pode-se verificar que a adição de água, seguida da adição de metanol,
desfavorece bastante a solubilização das vitaminas lipossolúveis, sendo que a
vitamina A (retinol) foi a mais afetada, devido ao fato desta ser a mais apolar das
vitaminas avaliadas. Ao reduzir a quantidade de água adicionada para 10% e 5%,
encontra-se uma condição onde todas as vitaminas são solubilizadas, na
concentração de 0,2 mg/mL. Primeiramente as vitaminas hidrossolúveis são
solubilizadas, na pequena quantidade de água adicionada, e depois as lipossolúveis,
na grande quantidade de metanol adicionada posteriormente. A fim de garantir que
as vitaminas lipossolúveis de fato estejam solubilizadas, foi escolhido a condição de
5% de água e 95% de metanol, pois em 10% de água foi necessário um tempo
extremamente longo de agitação e ultrassom parra dissolver a vitamina A. Além
disso, quanto maior a proporção de água utilizada no diluente, mais polar este fica,
prejudicando assim o formato dos picos cromatográficos, conforme resultados que
serão mostrados a seguir.
4.2 Volume de Injeção
Paralelamente à definição do diluente, verificou-se o efeito de diferentes
volumes de injeção sobre o perfil dos picos cromatográficos. Fairchild e Hill
afirmaram em seu estudo [166] que o volume de injeção também constitui um fator
bastante crítico para a técnica de UHPSFC e deve ser cuidadosamente estudado.
Volumes de injeção elevados levam a distorções dos picos cromatográficos,
enquanto volumes de injeção reduzidos podem levar à perda da detectabilidade
analítica. Os autores também mostraram que o volume de injeção ótimo apresenta
forte dependência com o tipo de diluente utilizado. Normalmente, o volume de
injeção ideal para esta técnica é de cerca de 0,5% do valor do volume da coluna,
menor, portanto, que o empregado em cromatografia líquida, onde geralmente se
trabalha na faixa de cerca de 1,0% do volume da coluna cromatográfica, conforme
sugerido por Nováková et al. [29].
Na Tabela 10 são mostrados os resultados da variação do volume de
injeção e do tipo de diluente utilizado sobre o formato do pico cromatográfico e fator
88
de assimetria do pico para uma das vitaminas estudadas (vitamina B3), na
concentração de 1,0 mg/mL. Consideram-se aceitáveis valores de fator de
assimetria de pico entre 0,8 a 1,5 [168].
Tabela 10. Formato do pico cromatográfico e fator de assimetria para a vitamina B3 em função de
vários tipos de diluentes e diferentes volumes de injeção.
Pode-se verificar que os diluentes tetraidrofurano e dimetilsulfóxido, por
serem solventes bastante polares, apresentaram os piores resultados de fator de
assimetria, em ambos os volumes de injeção avaliados, possivelmente por
89
proporcionarem fortes interações com os silanóis livres presentes na coluna, assim
como já relatado na literatura [165,166]. O 2-propanol, por apresentar polaridade
mais próxima da fase móvel dentre os solventes avaliados, forneceu melhores
valores de fator de assimetria nos dois volumes de injeção estudados, no entanto,
sua capacidade de solubilização dos analitos presentes na amostra é muito
pequena, e o formato do pico na injeção de 3 µL ficou alargado.
O metanol, apesar de ser mais polar que o 2-propranol, apresentou valor
de fator de assimetria adequado quando se utilizou o volume de 1 µL, mesmo
quando se adicionou até 20% de água na solução. Entretanto, ao se utilizar solução
com 50% de água como diluente, ou aumentar o volume de injeção para 3 µL (para
qualquer proporção de água), houve distorção do formato do pico, indicando assim
que, ao utilizar o metanol como diluente de escolha para a metodologia analítica a
ser desenvolvida, o volume de injeção não deverá ser superior a 1 µL. Nota-se que,
na proporção 50:50 (v/v) metanol:água, o fator de assimetria do pico ficou em 0,98, e
embora seja considerado um valor aceitável, o formato do pico ficou comprometido,
com uma cauda frontal bastante significativa, característica de injeções onde o
diluente apresenta força cromatográfica significativamente maior que a fase móvel,
como neste caso. Tais resultados estão de acordo com os observados por
Abrahamsson e Sandahl [165], que concluíram que as propriedades físico químicas
do solvente utilizado como diluente influencia no formato dos picos cromatográficos,
assim como o volume de injeção utilizado.
4.3 Estudo da Seleção de Fase Estacionária e Fase Móvel
Após definição do diluente e volume de injeção mais adequados, foi
necessário definir o tipo de fase estacionária e a composição da fase móvel mais
apropriadas para separação das vitaminas. Como a técnica de UHPSFC é nova,
pouquíssimas informações sobre fases estacionárias e composição de fase móvel
indicadas para análises de vitaminas estão publicadas. Além disto, não é possível
prever as condições cromatográficas a serem utilizadas nesta técnica com base em
métodos por HPLC, uma vez que os mecanismos de retenção envolvidos são
90
completamente diferentes. Dessa forma, foi preciso, inicialmente, realizar
experimentos visando compreender o comportamento de cada vitamina frente
algumas composições de fase móvel e de tipos de fase estacionárias mais comuns
para a técnica de UHPSFC.
Para a realização da triagem inicial proposta, avaliou-se o desempenho
cromatográfico das diferentes vitaminas estudadas em quatro diferentes tipos de
fase estacionárias, disponíveis no laboratório, sendo elas BEH (sílica), Acquity HSS
C18 SB, Torus 2-PIC e CHS Fluoro-Fenil, cujas estruturas estão mostradas na
Figura 17, e três solventes orgânicos diferentes, sendo eles metanol, 2-propanol e
acetonitrila.
Figura 17. Estrutura das fases estacionárias utilizadas neste trabalho: A) BEH (somente sílica
híbrida), B) HSS C18 SB, C) CHS Fluoro-Fenil e D) Torus 2-PIC.
4.3.1 Estudo de Seleção de Fase Estacionária
Para as VLS, foi possível observar que as vitaminas A e E apresentam
baixa retenção em todas as fases estacionárias, com exceção da HSS C18 SB, onde
a retenção observada foi muito maior. Além disso, a vitamina D apresentou maior
retenção em todas as fases estudadas, quando comparada às demais VLS. Os
91
cromatogramas mostrados na Figura 18 representam os resultados obtidos para
separação das VLS quando utilizado 10% de metanol como modificador orgânico,
para os quatro tipos de fase estacionária avaliados.
Figura 18. Cromatogramas obtidos para separação das VLS, utilizando metanol como modificador
orgânico, nas diferentes fases estacionárias estudadas: A) HSS C18 SB, B) Torus 2-PIC, C) BEH e D)
CHS Fluoro-Fenil. Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A e 3. Vitamina D. Eluição isocrática com
10% de metanol na fase móvel, vazão de 1,0 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume
de injeção e detecção em 265 nm.
A coluna BEH é constituída basicamente de cadeias de sílica híbrida de
segunda geração, interligadas por ponte de eteno, sendo, portanto, considerada
uma coluna bastante polar, porém com a quantidade reduzida de grupos silanóis.
Pode-se verificar uma baixa retenção das VLS nesta coluna, com qualquer solvente
orgânico empregado como fase móvel, em qualquer concentração. Entretanto, é
possível observar que, mesmo que os analitos sejam extremamente apolares, e a
coluna extremamente polar, o aumento de solvente orgânico, mais polar que a fase
92
móvel (CO2), favorece a eluição mais rápida das vitaminas apolares, indicando que
outros parâmetros, além da afinidade analito-fase móvel-fase estacionária,
influenciam no processo de eluição nesta técnica cromatográfica. Nesta coluna, as
vitaminas A e E sempre coeluiram em um mesmo tempo de retenção, em qualquer
proporção de solvente orgânico, sendo que a vitamina D apresenta uma retenção
maior que as demais. Assim, pode-se verificar que a coluna BEH não se mostrou
adequada para a separação destes compostos apolares.
A coluna Acquity Torus 2-PIC, composta também de vários grupamentos
polares (2-picolilamina), apresentou retenção ainda menor para as VLS, em relação
à coluna BEH, sendo que as vitaminas A e E sempre coeluiram em um tempo de
retenção próximo ao tempo de retardamento (volume morto) da coluna. O mesmo
comportamento pode ser observado quando utilizada a coluna Acquity CSH Fluoro-
fenil, que também pode ser considerada uma coluna polar. Assim como na coluna
BEH, a vitamina D apresentou uma retenção maior que as demais vitaminas nestas
duas colunas, porém menor que nas colunas Acquity Torus 2-PIC e CSH Fluoro-
Fenil. O fato destas colunas apresentarem grupamentos muito polares, como átomos
de flúor, oxigênio e nitrogênio, deve contribuir para repelir os grupamentos apolares
dos analitos avaliados, contribuindo assim para a mínima retenção destes nestas
colunas, não sendo, portanto, adequadas para este tipo de separação.
Como esperado, a coluna Acquity HSS C18 SB apresentou maior
retenção de todas as VLS analisadas, inclusive com separação de todas as VLS,
para qualquer solvente orgânico utilizado como fase móvel, mesmo em altas
concentrações de solvente orgânico, indicando ser esta coluna a mais apropriada
para a separação deste grupo de compostos. Por ser constituída de grupamentos
apolares de carbono (C18) ligados à sílica e pelo fato dos analitos serem
extremamente apolares, estes ficaram mais retidos na fase estacionária, devido à
intensa interação hidrofóbica com a mesma, aumentando o tempo de retenção e
proporcionando a adequada separação dos compostos. A Figura 19 mostra o perfil
de retenção da Vitamina A em função do aumento da proporção de metanol
empregado como modificador orgânico. Para todas as VLS e todos os modificadores
93
orgânicos testados, os resultados foram similares aos demonstrados a seguir.
Observa-se claramente que a inflexão da curva “fator de retenção vs. porcentagem
de modificador orgânico”, para a coluna Acquity HSS C18 SB é mais pronunciada
que nas demais colunas, sendo a faixa de 0,8 a 10% de modificador orgânico a mais
indicada para ser utilizada em uma metodologia analítica de separação destes
compostos com esta coluna.
Figura 19. Fator de retenção da Vitamina A em função da variação na proporção de modificador
orgânico metanol, nas diferentes fases estacionárias estudadas.
Verificou-se que em todas as colunas a Vitamina D apresentou uma
retenção sempre maior que as demais VLS. Isso pode ser explicado pelo fato desta
vitamina ter a menor massa molar e possuir um grupo hidroxila mais livre que as
demais vitaminas. Assim, as moléculas de colecalciferol podem interagir mais
intensamente com a fase estacionária, levando ao maior tempo de retenção,
principalmente na coluna Acquity HSS C18 SB.
Em relação às VHS, pode-se verificar que os resultados mais satisfatórios
e promissores foram observados nas colunas Acquity Torus 2-PIC e Acquity HSS
C18 SB. Para as colunas Acquity CSH Fluoro-Fenil e BEH, os picos apresentam os
piores formatos e obtiveram desempenho cromatográfico insatisfatório para todos os
solventes orgânicos avaliados. Os cromatogramas mostrados na Figura 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Fato
r d
e R
eten
ção
Metanol (%)
Coluna HSS C18
Coluna BEH
Coluna Torus 2-PIC
94
representam os resultados obtidos para separação das VHS quando se utilizou
metanol como modificador orgânico, para os quatro tipos de fase estacionária
avaliados.
Figura 20. Cromatogramas obtidos para separação das VHS, utilizando metanol como modificador
orgânico, nas diferentes fases estacionárias estudadas: A) HSS C18 SB, B) Torus 2-PIC, C) BEH
e D) CHS Fluoro-Fenil. Compostos: 1. Vitamina C, 2. Vitamina B3, 3. Vitamina B6 e 4. Vitamina
B2. Programação de gradiente conforme Figura 14, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da forno de
40°C, 1µL de volume de injeção e detecção em 265 nm.
A coluna Acquity Torus 2-PIC, composta por grupamentos bastante
polares em sua estrutura (2-picolilamina), apresentou resultados satisfatórios para a
análise das VHS, quando se empregou metanol como modificador orgânico da fase
móvel, possibilitando a eluição de quatro das sete VHS em estudo. Além disso,
conforme será discutido na sessão “estudo de seleção de fase móvel” mais adiante,
a adição dos aditivos formato de amônio e água melhoraram os resultados obtidos,
sendo possível obterem valores adequados de fator de assimetria, resolução e
95
detectabilidade quando se empregou esta coluna. Entretanto, nesta coluna não foi
possível obter uma condição aceitável para análise das VLS, pois as vitaminas A e E
não foram eluidas em nenhuma das fases móveis avaliadas. Além disso, o pico da
vitamina D apresentou formato insatisfatório. Dessa forma, esta coluna não pode, a
princípio, ser usada para análise simultânea de VLS e VHS, mas certamente pode
ser aplicada ao desenvolvimento de métodos visando o doseamento apenas das
VHS, como por exemplo, em medicamentos que contenham as vitaminas do
complexo B.
A coluna Acquity HSS C18 SB também apresentou resultados
promissores para análise das VHS, separando razoavelmente quatro das sete VHS
em estudo, sendo que o emprego de aditivos, conforme discutido na sequência,
melhorou de forma significativa o desempenho observado. Além disso, pelo fato de
ter sido a fase estacionária mais adequada para análise das VLS, pode ser
considerada a coluna mais adequada para uma separação simultânea deste grupo
de compostos, com características físico-químicas muito diferentes entre si. Uma
explicação razoável para esse fato é que, tendo a coluna com grupos apolares (C18)
ligados à sílica e as VLS também sendo apolares conseguem interagir por
interações hidrofóbicas com a fase estacionária, sendo então devidamente
separadas. Além disso, a coluna C18 é capaz de reter compostos hidrofílicos, como
as VHS, devido às interações hidrofílicas com os grupos silanóis livres da FE. Dessa
forma, uma mesma coluna apresenta-se capaz de separar uma série tão extensa de
compostos orgânicos, de ampla faixa de polaridade.
As colunas Acquity CSH Fluoro-Fenil e BEH foram capazes de eluir
apenas três das sete VHS analisadas e com formatos de pico insatisfatórios. Por se
tratarem das colunas de fase estacionária com maior polaridade dentre as colunas
estudadas, possivelmente não apresentaram seletividade suficiente para separação
adequada nem mesmo dentro do grupo exclusivo das VHS. Conforme mostrado
mais adiante, para todos os modificadores orgânicos e aditivos utilizados na fase
móvel, estes dois tipos de fase estacionárias não proporcionaram resultados
96
interessantes de desempenho cromatográfico e formato dos picos para as vitaminas
em estudo.
Dentre as vitaminas analisadas, verifica-se que a vitamina B1 (tiamina)
não foi detectada em nenhuma fase estacionária e condição de fase móvel descritas
acima. Uma explicação para tal observação é de que, pelo fato deste analito ser
bastante polar, inclusive com indicação de estar protonado em solução, devido ao
elevado valor de pKa do grupo amina presente em sua estrutura química, interage
de forma intensa com os grupos polares da fase estacionária, sendo necessário uma
elevada força cromatográfica da fase móvel para garantir sua eluição da coluna, o
que não foi observado utilizando-se os modificadores orgânicos puros em estudo.
Entretanto, durante a discussão dos resultados do “estudo de seleção de fase
móvel”, poderá ser observado que o emprego de aditivos polares à fase móvel, tais
como sais, hidróxidos e água, resulta em aumento da polaridade da fase móvel,
sendo possível então a eluição da vitamina B1, contornando este problema em
relação a eluição deste composto.
Já em relação às vitaminas B9 (ácido fólico) e B12 (cianocobalamina),
verificou-se que estas não foram detectadas em nenhuma fase estacionária e
nenhuma das condições de fase móvel avaliadas. Estas vitaminas apresentam
características que dificultam sua análise por UHPSFC, como elevada massa molar
(1355,29 para cianocobalamina e 441,37 para ácido fólico) e reduzidos valores de
logP (0,67 para cianocobalamina e -1,2 para o ácido fólico). Tratam-se de compostos
extremamente polares, e que, apesar de solubilizados no diluente empregado,
metanol:água 95:5 (v/v), podem precipitar em contato com a fase móvel, que nesta
técnica, é bastante apolar, devido à presença majoritária do CO2. Além disso, é
conhecido que, apesar de se encontrar na literatura métodos analíticos para
doseamento destas vitaminas por cromatografia, os mesmos envolvem condições
extremas e de difícil reprodutibilidade, sendo que a maioria dos métodos de
quantificação destas vitaminas baseia-se em análises microbiológicas.
Conforme afirmado por West e Leseiller [30] e Lesellier [72] em seus
artigos de revisão, dentre as diversas estratégias para obtenção de um bom
97
desempenho cromatográfico em SFC, a principal delas é a escolha da melhor fase
estacionária para garantir uma boa separação, frente à grande diferença de
resolução e formato dos picos obtidos em cada fase estacionária avaliada. Dessa
forma, pode-se afirmar que o conhecimento dos conceitos do sistema de
classificação de fase estacionárias, baseado no uso da relação da energia linear de
solvatação – Linear Solvatation Energy Relationship (LSER), desenvolvido por West
e Lesellier [73], norteou a análise dos quatro tipos de fases estacionárias
empregadas neste estudo, que se localizam em diferentes regiões deste sistema, o
que garantiu a ortogonalidade necessária para realização da triagem de fase
estacionária para as vitaminas em estudo, de forma similar ao proposto por Khater et
al. [79], assegurando que os resultados obtidos fossem representativos e confiáveis,
possibilitando assim o prosseguimento das demais etapas do desenvolvimento
analítico de forma eficiente.
4.3.2 Estudo de Seleção de Fase Móvel
Em relação à fase móvel, verifica-se que existe pouca variação na
retenção das VLS quando se alteraram os modificadores orgânicos da fase móvel,
principalmente para as colunas mais polares BEH, Acquity Torus 2-PIC e Acquity
CSH Fluoro-Fenil. Para estas colunas, devido ao fato dos analitos serem mais
apolares e as fases estacionárias mais polares, a retenção é mais influenciada pela
força do CO2 em si e não pela presença de modificador orgânico na fase móvel, que
não altera, de forma consistente, as interações estabelecidas.
Observa-se, para as colunas BEH e Acquity CSH Fluoro-Fenil, que o 2-
propanol proporcionou um leve aumento nos tempos de retenção das VLS. De fato,
conforme descrito por Nováková et al. [29], a alteração dos modificadores orgânicos
utilizados leva à modificações em diversas características do sistema, que
proporcionam mudanças na seletividade, tempos de retenção e formato dos picos.
Para as colunas Acquity HSS C18 SB e Torus 2-PIC, observou-se que somente
quando se utilizou a acetonitrila obteve-se um maior tempo de retenção para os
analitos, sendo que os demais solventes apresentaram praticamente a mesma
98
resposta. Além disso, observou-se que o formato dos picos, quando se utilizou a
acetonitrila, piorou, pois estes se tornaram mais largos e com maior fator de
assimetria. Estes resultados estão de acordo com os descritos por Brunelli et al. [55]
que relataram em seu estudo um maior tempo de retenção e piora no formato dos
picos quando a acetonitrila foi empregada como modificador orgânico de forma pura,
provavelmente devido ao seu caráter aprótico, que não proporciona cobertura dos
grupos silanóis presentes na fase estacionária, e, portanto, os deixa mais livres para
interagirem com os analitos, ocasionando a distorção verificada nos picos.
Comparando os resultados obtidos com metanol na presença do aditivo
formato de amônio, na concentração de 10 mmol/L, e metanol puro, verifica-se que
não houve influência sobre a retenção das VLS e o formato dos picos.
Provavelmente, isso ocorreu devido ao fato das VLS serem altamente apolares,
caracterizadas por não apresentarem grupos fortemente ácidos ou básicos em suas
estruturas, não sofrendo influência do sal formato de amônio, visto que a interação
hidrofóbica analito-fase estacionária é a principal responsável pela retenção das
VLS. Dessa forma, o metanol pode ser considerado o modificador orgânico que
apresentou os melhores resultados para as VLS, sendo então dispensável o uso de
aditivos na FM quando estes compostos são analisados. Na Figura 21 são
mostrados os cromatogramas obtidos para cada modificador orgânico estudado, na
coluna Acquity HSS C18 SB, para separação das VLS, como ilustração. Para as
demais colunas cromatográficas testadas, os resultados obtidos foram
insatisfatórios, conforme discutido anteriormente.
99
Figura 21. Cromatogramas obtidos para separação das VLS, utilizando a coluna Acquity C18 SB
como fase estacionária, e os diferentes modificadores orgânicos estudados: A) Metanol, B) 2-
Propanol, C) Acetonitrila e D) 10 mmol/L de Formato de Amônio em metanol. Compostos: 1. Vitamina
E, 2. Vitamina A e 3. Vitamina D. Eluição isocrática com 10% de metanol na fase móvel, vazão de 1,0
mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de injeção e detecção em 265 nm.
Em relação às VHS, foi possível verificar que o tipo de modificador
orgânico utilizado se mostrou como o maior responsável pelas diferenças na eluição
e separação deste grupo de compostos. De uma forma geral, a acetonitrila mostrou-
se como o pior modificador orgânico, pois eluiu o menor número de analitos, em
todas as colunas cromatográficas avaliadas. Observou-se que o formato dos picos
piorou para maior parte das colunas testadas e os mesmos tornaram-se mais largos
e assimétricos quando a acetonitrila foi utilizada, devido ao seu caráter aprótico,
conforme já discutido anteriormente para as VLS. O 2-propanol, apesar de ser o
mais apolar dentre os solventes avaliados, também não forneceu resultados
satisfatórios quanto a eluição e formato dos picos. A Figura 22 ilustra os resultados
100
de separação das VHS obtidos para cada modificador orgânico estudado, na coluna
Acquity HSS C18 SB.
Figura 22. Cromatogramas obtidos para separação das VHS, utilizando a coluna Acquity HSS C18
SB como fase estacionária, e os diferentes modificadores orgânicos estudados: A) Metanol, B) 2-
Propanol e C) Acetonitrila. Compostos: 1. Vitamina C, 2. Vitamina B3, 3. Vitamina B6 e 4. Vitamina
B2. Programação de gradiente conforme Figura 14, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da forno de
40°C, 1µL de volume de injeção e detecção em 265 nm.
Verifica-se que o metanol, quando comparado aos demais modificadores
orgânicos puros (acetonitrila e 2-propanol), apresentou os melhores resultados em
termos de eluição e formato dos picos, além de possibilitar a eluição de um maior
número de analitos (quatro das sete VHS em estudo). Entretanto, os picos
continuaram assimétricos, sendo possível verificar alguns pares de vitaminas quase
coeluindo. Conclui-se que de fato, o emprego do modificador orgânico sem aditivos
não possibilitou a eluição de todas as VHS com formato de pico satisfatório. Esta
observação sugere que o emprego de aditivos, a serem adicionados à fase móvel,
101
juntamente com o modificador orgânico, é importante para alcançar este objetivo,
conforme relatado por diversos autores [34,44,63].
Dessa forma, iniciou-se a avaliação do efeito do emprego de aditivos à
fase móvel, com as mesmas fases estacionárias descritas anteriormente, sobre a
separação das VLS e das VHS simultaneamente e sobre o formato dos picos.
Inicialmente, avaliou-se o efeito da adição do sal formato de amônio ao metanol,
na concentração de 10 mmol/L, sobre a eluição e formato dos picos das VHS
conforme relatado em outros estudos [30,63,64,66,169]. Nesta triagem, o metanol foi
escolhido como modificador orgânico, pois apresentou melhores resultados entre os
solventes avaliados, tanto para as VLS como para as VHS. Na Figura 23 é possível
comparar os cromatogramas obtidos quando se utilizou metanol puro e quando ao
mesmo foi adicionado o sal formato de amônio, para as colunas Acquity HSS C18
SB e Torus 2-PIC, que apresentaram resultados mais promissores.
Figura 23: Cromatogramas obtidos para separação das VHS. A) Acquity HSS C18 SB, metanol,
B) Acquity HSS C18 SB, 10 mmol/L de formato de amônio em metanol, C) Acquity Torus 2-PIC,
metanol, D) Acquity Torus 2-PIC, 10 mmol/L de formato de amônio em metanol. Compostos: 1.
Vitamina C, 2. Vitamina B3, 3. Vitamina B6 e 4. Vitamina B2, 5. Vitamina B1. Programação de
gradiente conforme Figura 14, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da forno de 40°C, 1µL de volume
de injeção e detecção em 265 nm.
102
Verificou-se que o principal efeito da adição deste sal à fase móvel foi a
eluição da vitamina B1 em todas as fases estacionárias estudadas. Esta vitamina,
conforme relatado, apresenta forte afinidade pela fase estacionária e fica retida
quando apenas o metanol puro é utilizado como fase móvel. A adição do sal
favoreceu a eluição da vitamina B1, provavelmente, devido à interação dos grupos
amônio com os silanóis livres da fase estacionária, tornando estes menos
disponíveis para interação com a vitamina B1, uma molécula positivamente
carregada, reduzindo assim seu tempo de retenção. Além disso, a possível formação
de pares iônicos entre moléculas deste analito positivamente carregadas e ânions
formato também poderia favorecer a eluição deste composto, aumentando sua
afinidade pela fase móvel. Além disso, verificou-se uma maior resposta para a
vitamina B6, que sem a presença do sal, apresentou picos bastante reduzidos, em
ambas as colunas, possivelmente devido aos mesmos mecanismos descritos para a
vitamina B1, pois também se trata de um composto básico. Verificou-se também
grande alteração na seletividade dos picos, devido às mudanças na ordem de
eluição dos compostos em estudo. Entretanto, pouco efeito sobre o fator de
assimetria dos picos foi observado.
Avaliou-se também, apenas na coluna Acquity HSS C18 SB, o efeito do
uso do sal acetato de amônio, na concentração de 10 mmol/L, pois também se trata
de um aditivo comumente empregado em UHPSFC [66]. Na Figura 24 é possível
comparar os cromatogramas obtidos quando se utilizou o sal formato de amônio e
quando foi adicionado o sal acetato de amônio à fase móvel, somente para a coluna
Acquity HSS C18 SB.
103
Figura 24. Cromatogramas obtidos para separação das VHS. A) Acquity HSS C18 SB, 10 mmol/L de
formato de amônio em metanol, B) Acquity HSS C18 SB, 10 mmol/L de acetato de amônio em
metanol. Compostos: 1. Vitamina B3, 2. Vitamina B6, 3. Vitamina C, 4. Vitamina B2 e 5. Vitamina B1.
Programação de gradiente conforme Figura 14, vazão de 1,0 mL/min, temperatura da forno de 40°C,
1µL de volume de injeção e detecção em 265 nm.
O formato dos picos e a eluição das vitaminas foram semelhantes aos
obtidos com o formato de amônio. Como a maioria das referências da literatura que
citavam a utilização de sais de amônio como aditivos da fase móvel empregavam o
formato de amônio, este foi, então, empregado nos demais experimentos realizados.
Entretanto, os resultados obtidos ainda não estavam satisfatórios, visto
que os formatos dos picos não estavam simétricos, assim como havia problemas de
coeluição de vitaminas, como a vitamina B2 e C, que passaram a coeluir na coluna
Acquity HSS C18 SB com a utilização do sal. Dessa forma, optou-se pela adição de
água ao metanol, como aditivo da fase móvel a ser adicionado junto ao modificador
orgânico, conforme estudado por outros autores [65,68,69]. Em seu estudo, Taylor
[65] concluiu que o emprego de água como aditivo na fase móvel contribui para
aumentar o poder de solvatação da fase e, consequentemente, garante maior
solubilização de analitos mais polares. Além disso, devido a sua capacidade de
atuar simultaneamente como doadora e receptora de ligações de hidrogênio, a água
é uma molécula com grande capacidade de proporcionar fortes interações fase
móvel-analito-fase estacionária, o que pode ser bastante benéfico no caso de
separações de compostos hidrofílicos. Na Figura 25 é possível comparar os
cromatogramas obtidos utilizando metanol puro e quando foi adicionada água à fase
móvel, para as colunas Acquity HSS C18 SB e Acquity Torus 2-PIC.
104
Figura 25. Cromatogramas obtidos para separação das VLS e VHS. A) Acquity HSS C18 SB,
metanol, B) Acquity HSS C18 SB, 5% água em metanol (v/v), C) Acquity Torus 2-PIC, metanol, D)
Acquity Torus 2-PIC,5% água em metanol (v/v). Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina
D, 4. Vitamina C, 5. Vitamina B3, 6. Vitamina B6 e 7. Vitamina B2, 8. Vitamina B1. Programação de
gradiente conforme Figura 15, vazão de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de
injeção e detecção em 265 nm.
Pelo fato da água ser um composto bastante polar, esperava-se que,
de alguma forma, contribuísse para reduzir a retenção dos compostos,
principalmente da vitamina B1 para a coluna Acquity HSS C18 SB, e da vitamina C,
na coluna Acquity Torus 2-PIC, além de contribuir para melhorar o formato dos
picos, conforme os mecanismos anteriormente descritos. Os resultados
demonstraram, no entanto, apenas uma leve redução no tempo de retenção da
vitamina C, na coluna Acquity Torus 2-PIC, não sendo possível ainda obter a eluição
da vitamina B1 na coluna Acquity HSS C18 SB, o que era bastante desejável. Assim
como sugerido por Alexander et al. [69] verificou-se pouco efeito sobre a seletividade
105
dos picos avaliados. Para as VLS, a adição de água ao metanol não alterou de
forma significativa a eluição dos compostos.
Verificou-se que apenas para as colunas Acquity HSS C18 SB e Torus 2-
PIC a adição de água favoreceu a eluição das VHS e melhorou o formato dos picos,
sendo, portanto, as fases mais promissoras. Apenas na coluna Acquity Torus 2-PIC
foi possível eluir a Vitamina B1 com a adição de água ao metanol, pois na coluna
Acquity HSS C18 SB esta vitamina continuou retida pela fase estacionária, como
observado quando somente metanol foi utilizado como modificador orgânico da fase
móvel. Para as colunas Acquity CSH Fluoro-Fenil e BEH, os resultados continuaram
bastante insatisfatórios, pois não houve melhoras que justificassem o emprego de
5% (v/v) de água como aditivo na fase móvel, quando adicionada somente ao
metanol puro. De fato, as colunas Acquity CSH Fluoro-Fenil e BEH não
apresentaram resultados satisfatórios de eluição quando empregado metanol puro,
sendo que a adição de água não foi capaz de alterar a eluição dos picos de forma a
tornar a separação das VHS em estudo satisfatória.
Em seu estudo, Fairchild et al. [170] demonstraram que a presença de
uma pequena quantidade de água junto ao modificador orgânico na fase móvel evita
a formação de um silil éter, resultante da reação do metanol da fase móvel com os
grupos silanóis livres da fase estacionária e que, segundo o autor, é um dos
principais responsáveis pela intensa variação no tempo de retenção e seletividade
dos compostos na aplicação da técnica de SFC, pois a medida que o éter é formado,
a hidrofilicidade da fase estacionária é reduzida, alterando assim a retenção dos
analitos. O autor apresenta resultados que mostram que a adição de 5% de água em
uma fase móvel de modificador orgânico constituído de metanol e 20 mmol/L de
amônia resultou em uma variação mínima no tempo de retenção dos compostos em
análise. Dessa forma, conclui-se que a adição de água trouxe benefícios tanto em
relação à eluição dos compostos em estudo, como também impede a não formação
de silil éter e consequente variação no tempo de retenção dos analitos.
Em seguida, avaliou-se a adição de água, na proporção de 5% (v/v) no
metanol, juntamente com o sal formato de amônio 10 mmol/L, na fase móvel.
106
Além disso, após relatado problemas de pressão elevada no equipamento após
utilização em trabalhos anteriores, suspeitou-se que a adição do sal diretamente ao
metanol pudesse ocasionar precipitação, prejudicando o funcionamento adequado
do sistema, embora o sal escolhido fosse solúvel em metanol e a concentração
utilizada ser baixa. Assim, a adição de água visava garantir a solubilização do sal
adicionado e prevenir possível precipitação do mesmo no interior do equipamento e
insumos. Na Figura 26 observa-se os cromatogramas obtidos quando se utilizou o
sal formato de amônio 10 mmol/L em metanol contendo 5% de água para as colunas
Acquity HSS C18 SB e Torus 2-PIC.
Figura 26. Cromatogramas obtidos para separação das VLS e VHS. A) Acquity HSS C18 SB, 10
mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v), B) Acquity Torus 2-PIC, 10 mmol/L de
formato de amônio + 5% água em metanol (v/v). Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina
D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B6, 6. Vitamina B2 e 7. Vitamina C, 8. Vitamina B1. Programação de
gradiente conforme Figura 15, vazão de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de
injeção e detecção em 265 nm.
Os cromatogramas indicam que para as colunas Acquity Torus 2-PIC e
HSS C18 SB, os resultados foram bastante satisfatórios, sendo possível observar
que a adição de água à fase móvel já contendo o sal proporcionou a obtenção de
picos com melhor simetria e resolução, mais próximo dos valores considerados
aceitáveis para o desenvolvimento de metodologias analíticas. Possivelmente, os
mecanismos de interações discutidos para a adição de sal são maximizados nesta
condição aquosa, uma vez que a presença simultânea do sal e da água parece
indicar um efeito de interação bastante positivo sobre os parâmetros analíticos
avaliados para as VHS. Para as VLS, a adição de água juntamente ao sal como
107
aditivos não alterou de forma significativa a eluição dos compostos, da mesma forma
que observado com a adição de água ao metanol puro. Além disso, para as colunas
Acquity CSH Fluoro-Fenil e BEH, não foram observadas alterações na eluição e
formato dos picos quando se adicionaram, simultaneamente, água e o sal formato de
amônio com aditivos à fase móvel, que continuaram apresentando resultados
insatisfatórios de separação e formato dos picos cromatográficos.
Alguns autores relataram o emprego de aditivos básicos, como hidróxido
de amônio, trietilamina, entre outros [34,44,46,63] na fase móvel, e observaram
grande melhora nos perfis dos picos cromatográficos. Dessa forma, utilizando as
colunas Acquity HSS C18 SB e Torus 2-PIC, avaliou-se o efeito da adição, na FM,
de hidróxido de amônio 0,2 % (v/v) e trietilamina 0,2 % (v/v). Na Figura 27
observa-se os cromatogramas obtidos quando se utilizou o sal formato de amônio 10
mmol/L em metanol contendo 5% de água na fase móvel (v/v), com adição de mais
0,2% de hidróxido de amônio ou 0,2% de trietilamina como aditivos da fase móvel,
para as colunas Acquity HSS C18 SB e Torus 2-PIC.
108
Figura 27. Cromatogramas obtidos para separação das VLS e VHS. A) Acquity HSS C18 SB, 10
mmol/L de formato de amônio+ 5% água em metanol (v/v) + 0,2% hidróxido de amônio (v/v), B)
Acquity HSS C18 SB, 10 mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 0,2%
trietilamina (v/v), C) Acquity Torus 2-PIC, 10 mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol
(v/v) + 0,2% hidróxido de amônio (v/v), D) Acquity Torus 2-PIC, 10 mmol/L de formato de amônio+ 5%
água em metanol (v/v) + 0,2% trietilamina (v/v). Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina
D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B6, 6. Vitamina B2 e 7. Vitamina C, 8. Vitamina B1. Programação de
gradiente conforme Figura 15, vazão de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de
injeção e detecção em 265 nm.
Para a coluna Acquity HSS C18 SB, verificou-se uma melhora bastante
significativa no formato do pico da piridoxina (vitamina B6) quando se utilizou
hidróxido de amônio como aditivo. A piridoxina, por conter anel de amina
heterocíclica, provavelmente interage mais fortemente com os grupos silanóis,
resultando em picos assimétricos. Com o emprego de hidróxido de amônio, verificou-
se que o formato do pico da piridoxina melhorou bastante, provavelmente devido ao
fato dos íons amônio da FM interagirem, preferencialmente, em relação aos grupos
amina da piridoxina, com os silanóis livre da FE, favorecendo a eluição da piridoxina
109
que apresenta menor retenção e picos com menor cauda. O mesmo mecanismo não
ocorreu quando a trietilamina foi utilizada e, dessa forma, a adição desta amina
terciária não favoreceu a eluição dos picos, tampouco melhorou o seu formato.
Outro composto bastante beneficiado com a utilização do hidróxido de
amônio foi a vitamina C (ácido ascórbico), em ambas as colunas cromatográficas
Apesar de Berger et al. [42,46] terem sugerido que o emprego de aditivos ácidos na
fase móvel leva a uma maior interação dos analitos ácidos com a fase estacionária e
consequente melhora no fator de assimetria, por estes estarem em sua maior parte
na forma molecular, os resultados obtidos mostraram que o emprego do hidróxido de
amônio favoreceu a eluição do ácido ascórbico, embora fosse esperado o contrário.
O emprego de trietilamina não apresentou efeito sobre o formato do pico desta
vitamina, assim como observado para a piridoxina. Além disso, testes realizados
utilizando 0,2% de ácido fórmico na fase móvel não apresentaram resultados
satisfatórios, nem mesmo para o próprio ácido ascórbico, descartando assim o
emprego de aditivos ácidos no desenvolvimento da metodologia analítica. Na Figura
28 são mostrados os cromatogramas ilustrativos do efeito da fase móvel contendo
0,2% de ácido fórmico (v/v) sobre a eluição e formato dos picos, para as colunas
Acquity HSS C18 SB e Acquity Torus 2-PIC.
Figura 28. Cromatogramas obtidos para separação das VLS e VHS. A) Acquity HSS C18 SB, 10
mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 0,2% ácido fórmico (v/v), B) Acquity
Torus 2-PIC, 10 mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 0,2% ácido fórmico
(v/v). Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B6, 6.
Vitamina C e 7. Vitamina B2, 8. Vitamina B1. Programação de gradiente conforme Figura 15, vazão
de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de injeção e detecção em 265 nm.
110
Em relação ao fator de assimetria do pico da vitamina C, este mostrou-se
ainda elevado, embora com o emprego dos aditivos propostos tenha sido possível
obter valores aceitáveis. Suspeitou-se que, pelo fato da concentração deste analito
no produto farmacêutico ser elevada, a solução padrão utilizada poderia estar
saturando a coluna, devido à alta concentração empregada (mais de 5 mg/mL).
Entretanto, foram realizados testes empregando baixas concentrações deste analito
em solução e o formato dos picos se mantiveram semelhantes, indicando não se
tratar de um simples efeito de concentração elevada, mas sim de fato relacionado à
eluição do analito e suas interações com o sistema fase móvel-fase estacionária.
Além da piridoxina e ácido ascórbico, a vitamina B1 (tiamina) também se
mostrou bastante afetada pela adição do hidróxido de amônio à fase móvel como
aditivo, porém somente quando empregada a coluna Acquity HSS C18 SB. Sem o
emprego da base, a tiamina eluiu com alto tempo de retenção nesta coluna, com
pico deformado e baixa detectabilidade. Com o emprego do aditivo, verificou-se que
o tempo de retenção da vitamina B1 foi reduzido e o formato do pico e a
detectabilidade melhoraram. Possivelmente, o mesmo efeito observado com a
piridoxina ocorreu com a tiamina, que possui uma amina terciária em sua estrutura.
Ao adicionar hidróxido de amônio, os íons amônio alteram a ligação hidrofílica
desenvolvida entre a tiamina e os grupos silanóis, favorecendo a sua eluição e o
formato de pico. O efeito benéfico sobre o formato do pico cromatográfico da
vitamina C também não foi observado quando se utilizou trietilamina como aditivo
básico na fase móvel.
Em relação ao uso do hidróxido de amônio como aditivo na fase móvel,
inicialmente, testou-se a concentração de 0,2% da base, por representar um valor
coerente com a maior parte das metodologias analíticas desenvolvidas empregando
aditivos, além de estar devidamente autorizado seu emprego nestas concentrações,
conforme consta na publicação “Care and Use Manual - Acquity UPC2 BEH, CSH
and HSS Columns”, da empresa Waters [171]. Entretanto, o uso desta base nesta
concentração não se mostrou viável, apesar dos resultados serem interessantes
analiticamente, pois ocorreram problemas de pressão durante as corridas analíticas.
111
De forma geral, ao iniciar a passagem da fase móvel contendo 0,2% de hidróxido de
amônio (cerca de 60 mmol/L) no sistema, verificou-se desestabilização do sistema e
aumento de pressão, sendo impossível prosseguir com as análises. O mesmo
problema foi verificado com 20 e 38,5 mmol/L de hidróxido de amônio ao modificador
orgânico em estudo. A concentração de 10 mmol/L mostrou ser adequada, pois não
provocou aumento de pressão e desestabilização do sistema. Assim, optou-se por
adicionar 10 mmol/L de hidróxido de amônio ao modificador orgânico, visto que
nesta condição, apesar de não ocorrer a eluição da tiamina de forma tão satisfatória
para a coluna Acquity HSS C18 SB, os picos da piridoxina e ácido ascórbico
apresentaram formato satisfatório, nesta coluna, com o emprego deste aditivo
básico, além de melhorar o formato do pico do ácido ascórbico quando a coluna
Acquity Torus 2-PIC é utilizada. A Figura 29 ilustra esta condição.
Figura 29. Cromatogramas obtidos para separação das VLS e VHS. A) Acquity HSS C18 SB, 10
mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 10 mmol/L hidróxido de amônio (v/v), B)
Acquity Torus 2-PIC, 10 mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 10 mmol/L
hidróxido de amônio (v/v), Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina D, 4. Vitamina B3, 5.
Vitamina B6, 6. Vitamina B2 e 7. Vitamina C, 8. Vitamina B1. Programação de gradiente conforme
Figura 15, vazão de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume de injeção e detecção
em 265 nm.
Diversos mecanismos para explicar problemas de pressão foram
discutidos. Cogitou-se o fato de o hidróxido de amônio tornar-se volátil durante a
passagem pelo forno, quando aquecido a 40°C, levando à desestabilização do
sistema. Outro questionamento levantado, refere-se ao efeito da base que pode
112
elevar o pH do modificador orgânico utilizado na fase móvel, favorecendo a
degradação da fase estacionária e resultando em desestabilização do sistema ou
entupimento da coluna/coluna de guarda. Entretanto, a justificativa mais provável é
que, devido à complexidade da fase móvel, constituída pelo modificador orgânico
metanol, hidróxido de amônio, formato de amônio e água, ao se misturarem com o
CO2, pode ocorrer separação de fases, uma vez que os componentes podem não
ser completamente miscíveis, desestabilizando, portanto, o sistema cromatográfico.
Frente a este problema, avaliou-se o uso de hidróxido de sódio como
aditivo, em substituição ao hidróxido de amônio. Apesar do hidróxido de sódio
também elevar o pH do modificador orgânico, ele é bem menos volátil que o
hidróxido de amônio. Entretanto, verificou-se que o emprego de hidróxido de sódio
0,2% também resultou em problemas de pressão. Mesmo em uma fase anidra,
também se constatou desestabilização do sistema e aumento da pressão. Avaliou-se
também uma concentração reduzida de hidróxido de sódio, 10 mmol/L, que não
apresentou aumento de pressão, entretanto forneceu resultados insatisfatórios,
como a não eluição das vitaminas B1 e B6, além de formato de pico extremamente
prejudicado para a vitamina C, reforçando a necessidade da presença dos íons
amônio na fase móvel, principalmente no caso das vitaminas citadas. A Figura 30
mostra um cromatograma ilustrativo.
113
Figura 30. Cromatograma obtido para separação das VLS e VHS. Acquity HSS C18 SB, 10 mmol/L
de formato de amônio+ 5% água em metanol (v/v) + 10 mmol/L de hidróxido de sódio. Compostos: 1.
Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B2, 6. Vitamina C. Programação
de gradiente conforme Figura 15, vazão de 1,5 mL/min, temperatura do forno de 40°C, 1µL de volume
de injeção e detecção em 265 nm.
Desta forma, conclui-se eu a melhor condição de fase móvel foi obtida
quando se utilizou 10 mmol/L do sal formato de amônio em metanol contendo 5% de
água na fase móvel (v/v), com adição de mais 10 mmol/mL de hidróxido de amônio
como aditivos da fase móvel, conforme cromatogramas ilustrados na Figura 29.
4.4 Planejamento Experimental
A realização dos estudos iniciais de triagem, visando a seleção das
melhores condições de fase móvel e de fase estacionária, composição do diluente e
volume de injeção mais apropriados, garantiram o conhecimento do Knowledge
Space (KS), que representa a região experimental a ser investigada, mais
detalhadamente pelo estudo de DoE, através de planejamento experimental. Esta
região experimental deve ser cuidadosamente conhecida, a fim de minimizar os risco
de não se obter resultados interessantes no estudo de DoE, pelo simples fato de ter
escolhido parâmetros e níveis inapropriados [10]. Dessa forma, pode-se inferir que
todo o desenvolvimento realizado até este ponto se refere a um trabalho de “sintonia
grossa”, enquanto que a etapa de planejamento experimental descrita a seguir
114
refere-se a uma etapa de “sintonia fina” dos parâmetros analíticos do método em
desenvolvimento, que resultaram na determinação do Design Space, região de
desejabilidade analítica onde se garante robustez e adequabilidade dos parâmetros
do método desenvolvido.
4.4.1 Resultados empregando a coluna Acquity HSS C18 SB
O planejamento Composto Central foi realizado para avaliar a influência
da densidade do fluído supercrítico, a qual é fortemente influenciada pelas variáveis
experimentais porcentagem de modificador orgânico, pressão e temperatura, sobre
as principais respostas analíticas do método: fator de retenção, número de pratos,
fator de assimetria dos picos, resolução e área dos analitos, utilizando a coluna
Acquity HSS C18 SB.
Durante os experimentos, foi possível verificar que não houve alteração na
ordem de eluição dos compostos, assim como a resolução manteve-se satisfatória
em todas as condições, além de repetibilidade aceitável dos resultados, assegurada
através dos resultados das réplicas no ponto central.
Em relação à retenção, para as VLS, nenhum fator experimental avaliado
resultou em alterações significativas na retenção, possivelmente, pelo fato destes
analitos eluirem rapidamente. Para a Vitamina D, a mais retida das VLS, observou-
se efeito da pressão e da interação entre porcentagem de modificador orgânico e
pressão, onde o aumento na porcentagem de modificador orgânico resultou em
redução na retenção deste composto, mas somente quando a pressão do sistema
foi menor, conforme demonstrado na Figura 31. Esta interação entre pressão e
porcentagem de modificador orgânico é facilmente explicada, pois em pressões
menores a influência do modificador orgânico é maior, devido à menor densidade do
fluído.
115
Figura 31. Superfície de resposta para o fator de retenção da vitamina D, variando % modificador orgânico e a pressão.
Para as VHS, os três fatores experimentais foram significativos para a
retenção das mesmas, sendo que o aumento da porcentagem de modificador
orgânico e aumento da pressão contribuíram para redução na retenção destas
vitaminas, e a temperatura, de uma maneira geral, contribuiu para o aumento da
retenção. Como exemplo, as superfícies de resposta para a retenção da vitamina B3
são mostradas na Figura 32 para temperatura de 30 °C (A) e 50 °C (B).
Figura 32. Superfície de resposta para o fator de retenção da vitamina B3, variando % modificador orgânico e a
pressão na temperatura de 30 °C (A) e 50 °C (B).
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Retenção Vit. D
Design points above predicted valueDesign points below predicted value17.2
13.05
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 50
1500
1700
1900
2100
2300
2500
20
22
24
26
28
30
13
14
15
16
17
18
Fa
tor d
e R
ete
nç
ão
Vit
. D
A: % MeOHB: Pressão
116
A redução na retenção dos compostos com o aumento da quantidade de
modificador orgânico pode ser explicada pelo aumento na polaridade da fase móvel,
que resulta no aumento na densidade, intensificando a afinidade dos compostos
pela fase móvel e reduzindo a retenção na fase estacionária. A redução na retenção
dos compostos com o aumento da pressão empregada é justificada pelo aumento do
poder de solvatação da fase móvel, resultando em aumento na solubilização dos
analitos e, consequente, redução no tempo de retenção.
É interessante ressaltar o efeito de interação entre os parâmetros
porcentagem de modificador orgânico e pressão, sobre a retenção das VLS, e, em
menor extensão, sobre a retenção das VHS. O aumento da pressão causou uma
redução mais significativa na retenção quando o modificador esteve em
concentração menor na fase móvel, o que é esperado, pois a mesma tem a
densidade mais próxima de um gás. Como o efeito de um fator depende do nível do
outro, existe uma interação entre os fatores, o que ficou evidente no estudo
multivariado.
Em relação à temperatura, verificou-se que, de maneira geral, conforme é
possível observar comparando-se as Figuras 32 A e B, o aumento deste parâmetro
levou ao aumento na retenção das VHS, pois contribuiu para reduzir a densidade do
fluido supercrítico. Como a força de eluição depende da densidade do fluído
supercrítico, maior força de eluição é obtida em temperaturas menores, quando a
densidade do fluído é maior. Desta maneira, temperaturas elevadas tendem a
aumentar a retenção em SFC. No entanto, isto não pode ser generalizado, pois
assim como observado em outros trabalhos do grupo, alguns analitos apresentaram
comportamento oposto, ou seja, a retenção diminuiu com o aumento da temperatura.
Neste estudo isto foi observado para a vitamina B1, conforme pode ser observado
na Figura 33. Deve-se ressaltar ainda que, quanto maior a porcentagem de
modificador orgânico na fase móvel, menor deve ser a influência da temperatura
sobre a retenção, devido à proximidade de uma condição subcrítica, o que pode ser
verificado na Figura 33 pelo fato das duas arestas da superfície não serem paralelas.
117
Figura 33. Superfície de resposta para o fator de retenção da vitamina B1, variando % de modificador orgânico e temperatura.
Pelo fato das VHS apresentarem altos valores de fator de retenção (a
partir de 19 para a vitamina B3, primeira VHS a eluir da coluna, nas condições
padrão do método – ponto central), a condição analítica mais interessante seria
aquela que levasse à uma redução na retenção das VHS. Assim, em termos de
retenção, as melhores condições seriam maior porcentagem de modificador orgânico
(30%), maior pressão do sistema (2500 psi) e menor temperatura (30 °C).
Em relação à eficiência da coluna, observa-se que, de forma geral, a
regressão é pouco significativa para as VLS, indicando que esta resposta não muda
de forma significativa para esta classe de compostos, conforme observado em
relação a retenção. Isto já era esperado, uma vez que são analitos pouco retidos.
Para as VHS, o aumento na porcentagem de modificador orgânico resultou em maior
número de pratos sendo este o parâmetro que mais influência este atributo de
qualidade. Este aumento se dá devido à redução significativa no tempo de retenção
com o aumento da porcentagem de modificador, gerando picos mais estreitos. A
pressão também mostrou afetar a eficiência cromatográfica, porém em menor
extensão, conforme ilustrado na Figura 34.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Retenção Vit. B1
Design points above predicted valueDesign points below predicted value143.55
93.22
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
30
35
40
45
50
20
22
24
26
28
30
80
100
120
140
160
180
200
Fa
tor d
e R
ete
nç
ão
Vit
. B
1
A: % MeOHC: Temperatura
118
Figura 34. Superfície de resposta para o número de pratos da vitamina B6, variando % de modificador orgânico e pressão.
De uma maneira geral, a temperatura aumentou o número de pratos,
principalmente para as vitaminas B2 e B3, devido ao aumento da retenção.
Entretanto, em valores absolutos, este aumento não foi significativo, pois o número
de pratos aumenta de cerca de 50.000 para cerca de 60.000 para a vitamina B3, não
justificando a escolha da temperatura mais elevada como condição analítica, visto
que para outros critérios, esta condição foi prejudicial.
Assim, em termos de eficiência cromatográfica, a melhor condição
analítica foi obtida quando se trabalhou em maior porcentagem de modificador
orgânico (30%), menor pressão (1500 psi) e temperatura maior (50°C).
Em relação ao fator de assimetria dos picos, este mostrou resultados
diversos entre os diferentes analitos em estudo. O aumento na porcentagem de
modificador orgânico mostrou reduzir significantemente a assimetria dos picos
somente da vitamina B3, sendo nenhum efeito detectado para os demais
compostos. A elevação da pressão indicou aumentar o fator de assimetria somente
das vitaminas E e D, sendo indiferente para as demais. A temperatura do forno
revelou-se como o parâmetro mais importante sobre o fator de assimetria do pico da
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualNúmero de Pratos Vit. B6
Design points above predicted valueDesign points below predicted value54590.1
28600.6
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 40
1500
1700
1900
2100
2300
2500
20
22
24
26
28
30
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
Nú
me
ro
de
Pra
tos
Vit
. B
6
A: % MeOH
B: Pressão
119
maioria dos compostos, afetando significativamente os picos das vitaminas E, D, B3,
B6 e C, sendo indiferente para as demais vitaminas. Neste caso, o aumento da
temperatura proporcionou menor simetria dos picos das vitaminas B6 e C, conforme
ilustrado na Figura 35, e uma leve redução no fator de assimetria dos picos das
vitaminas E, D e B3, conforme Figura 36.
Figura 35. Mapa de contorno do fator de assimetria da vitamina C, variando temperatura e % de modificador orgânico, 2000 psi.
Figura 36. Superfície de resposta do fator de assimetria da vitamina D, variando temperatura e pressão, usando porcentagem de modificador orgânico de 25% ao final do gradiente.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Assimetria Vit. C
Design Points4.98
1.69
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
20 22 24 26 28 30
30
35
40
45
50Fator de Assimetria Vit. C
A: % MeOH
C:
Te
mp
era
tura
2
2.5
2.5
3
3.5
4
6
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Assimetria Vit. D
Design points above predicted valueDesign points below predicted value1.15
0.99
X1 = C: TemperaturaX2 = B: Pressão
Actual FactorA: % MeOH = 25
1500
1700
1900
2100
2300
2500
30
35
40
45
50
0.95
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
Fa
tor d
e A
ss
ime
tria
Vit
. D
C: Temperatura
B: Pressão
120
Os resultados obtidos permitem concluir que a redução da simetria
quando se aumentou a temperatura da coluna, para as vitaminas B6 e C, é bastante
crítica. Para a vitamina C, os valores passaram de cerca de 2 a 2,5 quando a
temperatura foi menor, para mais de 4,0 quando a temperatura foi elevada. É
possível que a elevação na temperatura resulte em maior interação destes
compostos com os grupos silanóis livres da coluna, aumentando a formação da
cauda observada em temperaturas mais elevadas para esta vitamina, sendo
pertinente sugerir que uma menor participação dos aditivos utilizados, como formato
de amônio e hidróxido de amônio como bloqueadores dos silanóis livres possa ser
um dos mecanismos que contribuem para o resultado observado. Além disso,
embora para as vitaminas E, D e B3, o aumento na temperatura resultou em melhora
no valor do fator de assimetria do pico, este ganho não é muito importante do ponto
de vista prático, pois tais compostos apresentam valores aceitáveis de assimetria
dentro de todo o domínio experimental.
Assim, em termos de fator de assimetria dos picos dos analitos, pode-se
concluir que a melhor condição analítica seria obtida trabalhando com uma menor
temperatura (30°C), porcentagem de modificador orgânico elevada (30%) e menor
pressão (1500 psi), sendo estes dois últimos parâmetros de menor relevância.
Para os critérios resolução entre os picos críticos Vitaminas A/E e
Vitaminas B2/C, nenhum modelo apresentou significância estatística, indicando que
nenhuma alteração nos parâmetros afetou significativamente estes critérios.
Entretanto, foi possível observar uma tendência de piora nas resoluções quando se
aumentou a porcentagem de modificar orgânico, porém de forma pouco relevante
em termos absolutos, visto que os valores ainda se mantiveram elevados, maiores
que 3,0 em todas as condições testadas.
Finalmente, em relação à resposta analítica para cada vitamina em
estudo, medida através da área obtida em cada condição testada, foi possível
verificar que os parâmetros que mais influenciaram esta resposta foram a
porcentagem de modificador orgânico e a temperatura, mas somente para as
vitaminas B1, B3 e C. Para as demais vitaminas, nenhum parâmetro afetou a área
121
observada, indicando robustez. No caso das vitaminas citadas, observou-se que o
aumento na temperatura levou a uma redução da área, principalmente para a
vitamina C, conforme pode ser verificado na Figura 37. Além disso, a elevação da
porcentagem de modificador orgânico favoreceu a resposta, sendo que a interação
entre estes parâmetros é muito importante, pois a maior área foi observada quando
a temperatura é menor (30°C) e a porcentagem de modificador orgânico é maior
(30%), sendo a pressão pouco relevante neste caso. Estes resultados estão de
acordo com os obtidos no planejamento experimental conduzido com a coluna
Acquity Torus 2-PIC, os quais serão mostrados a seguir, comprovando a influência
destes parâmetros sobre eluição desta vitamina e demonstrando a importância deste
tipo estudo no entendimento do efeito de cada alteração sobre os resultados.
Figura 37. Superfície de resposta da área do pico da vitamina C, variando temperatura e % de modificador orgânico.
Com a análise dos resultados obtidos para cada critério de qualidade do
método analítico, foi possível observar que a melhor condição analítica, de forma
geral, seria encontrada trabalhando-se com maior porcentagem de modificador
orgânico (30% de metanol no gradiente de fase móvel), menor temperatura do forno
(30°C), e contra-pressão do sistema entre 1500 a 2500 psi, resultados idênticos aos
obtidos no planejamento experimental realizado com a coluna Acquity Torus 2-PIC.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualArea Vit. C
Design points above predicted valueDesign points below predicted value7.5615E+006
4.33802E+006
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
30
35
40
45
5020
22
24
26
28
30
4E+006
5E+006
6E+006
7E+006
8E+006
Are
a V
it.
C
A: % MeOH C: Temperatura
122
A Figura 38 mostra a superfície de desejabilidade, onde todos os
parâmetros avaliados são considerados simultaneamente, de forma a obter a melhor
condição analítica possível. Verifica-se nesta Figura que, de fato, a melhor condição
é obtida com maior proporção de modificador orgânico (30%), dentro de toda a faixa
de pressão (1500 a 2500 psi), sem que haja perda na eficiência do método analítico
em relação aos parâmetros de qualidade avaliados, sendo possível escolher a
pressão de trabalho de 1500 psi, que acarretará em menor pressão total do sistema
cromatográfico. Quanto ao fator porcentagem de modificador orgânico, entretanto,
este deve ser mantido em nível elevado (30% ao final do gradiente), não sendo
possível reduzir este valor sem que haja perda considerável da desejabilidade, pois
este fator foi, de fato, o que mostrou maior influência sobre os parâmetros de
qualidade avaliados.
Figura 38. Superfície de resposta da desejabilidade do método, variando % de modificador orgânico e pressão, na temperatura de 30°C.
Em relação à temperatura, verificou-se perda no fator de desejabilidade
do método analítico quando se trabalhou em 50°C, indicando uma potencial perda
nos resultados analíticos do método proposto nestas condições, conforme pode ser
observado na Figura 39. Dessa forma, a temperatura escolhida foi de 30°C.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualDesirability
1.000
0.000
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 40
1500
1750
2000
2250
2500
20
22.5
25
27.5
30
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
De
se
jab
ilid
ad
e
A: % MeOHB: Pressão
123
Figura 39. Superfície de resposta da desejabilidade do método, variando % de modificador orgânico e pressão, na temperatura de 50°C.
Dessa forma, os estudos de desejabilidade comprovaram os resultados
observados para cada parâmetro isoladamente, assegurando que uma ótima
condição do método foi alcançada, indicando que estes parâmetros, nos níveis
escolhidos, asseguram as condições de melhor compromisso dos atributos de
qualidade observados neste estudo de planejamento fatorial (retenção, fator de
assimetria dos picos, resolução, eficiência e resposta dos analitos) para o método
desenvolvido.
4.4.2 Resultados empregando a coluna Acquity Torus 2-PIC
O planejamento Composto Central foi realizado, também para a coluna
Torus 2-PIC, para avaliar a influência da densidade do fluído supercrítico, a qual é
fortemente influenciada pelas variáveis experimentais, porcentagem de modificador
orgânico, pressão e temperatura, sobre as principais respostas analíticas do método,
como fator de retenção, número de pratos, assimetria dos picos, resolução e área
dos analitos, neste tipo de fase estacionária.
Em relação à retenção dos analitos, verificou-se que a porcentagem de
modificador orgânico constitui o principal fator de influência sobre as vitaminas
analisadas, afetando todas elas e sempre com efeito negativo (seu aumento
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualDesirability
1.000
0.000
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 50
1500
1750
2000
2250
2500
20
22.5
25
27.5
30
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
De
se
jab
ilid
ad
e
A: % MeOHB: Pressão
124
diminuiu a retenção). Com exceção das vitaminas B2 e C, a pressão também
apresentou efeito sobre a retenção, o qual é mais pronunciado quando a
porcentagem de modificador na fase móvel é menor. A pressão se mostrou um
efeito negativo para todos os analitos, de maneira similar aos resultados da Acquity
HSS C18 SB. A Figura 40 mostra a superfície de resposta para a retenção da
vitamina B3 em função dos fatores porcentagem de modificador orgânico e pressão,
onde foi possível verificar uma grande interação entre estes fatores.
Figura 40. Superfície de resposta para o fator de retenção da vitamina B3, variando a % de modificador orgânico e pressão.
A temperatura mostrou um efeito positivo para a maioria das vitaminas,
semelhante ao encontrado na coluna Acquity HSS C18 SB. A Figura 41 ilustra a
superfície de resposta para a vitamina B1 em função da porcentagem de
modificador orgânico e temperatura. Foi possível verificar que o efeito da
temperatura é ligeiramente mais pronunciado quando a porcentagem de modificador
é menor, conforme esperado.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Retenção Vit. B3
Design points above predicted valueDesign points below predicted value34.26
28
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 40
1500
1700
1900
2100
2300
2500
20
22
24
26
28
30
28
28.7143
29.4286
30.1429
30.8571
31.5714
32.2857
33
Fa
tor d
e R
ete
nç
ão
Vit
. B
3
A: % MeOHB: Pressão
125
Figura 41. Superfície de resposta para o fator de retenção da vitamina B1, variando a % de modificador orgânico e temperatura.
Verificou-se que não houve alteração na ordem de eluição dos compostos
e a resolução manteve-se satisfatória em todas as condições testadas, assim como
a repetibilidade dos resultados, avaliada através da observação das replicatas do
ponto central, cujos experimentos foram executados de forma aleatória com os
demais experimentos do planejamento.
Os dados deste planejamento permitiram observar que a vitamina C foi a
mais afetada pelas mudanças na densidade do fluído, sendo que em algumas
condições estudadas ela apresentou um pico largo e em outras ela não chegou a ser
detectada. Por este motivo, não foi possível aferir o efeito das variáveis
experimentais sobre a retenção e o fator de assimetria deste composto, optando-se
por avaliar apenas a área do pico deste analito. Para esta resposta, verificou-se um
modelo quadrático bastante significativo, mostrando que sua resposta é influenciada
pelos fatores porcentagem modificador orgânico, temperatura e a interação entre
ambos. A pressão não foi significativa neste modelo. A superfície de resposta esta
mostrada na Figura 42. Verifica-se que para condições de maior temperatura e
menor porcentagem de modificador orgânico na fase móvel, a vitamina C não foi
detectada no tempo de corrida. Assim, é possível concluir que a melhor condição
para análise desta vitamina seria de 30% de modificador orgânico na fase móvel, na
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualFator de Retenção Vit. B1
Design points above predicted valueDesign points below predicted value71.53
51.81
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
30
35
40
45
50
20
22
24
26
28
30
50
55
60
65
70
75
Fa
tor d
e R
ete
nç
ão
Vit
. B
1
A: % MeOH
C: Temperatura
126
temperatura do forno de 30°C, preferencialmente sob pressão de 1500 psi
(proporcionando menor pressão do sistema).
Figura 42. Superfície de resposta para a área da vitamina C, variando % de modificador orgânico e temperatura.
Para as vitaminas B2 e B3, o aumento na porcentagem de modificador
orgânico também proporcionou maior resposta, sendo o parâmetro pressão
significativo apenas para a vitamina B3, indicando que o aumento na pressão
ocasionou em aumento na área do pico desta vitamina, sendo, entretanto, este
aumento pouco relevante em termos de valores absolutos. A variação observada de
área, embora estatisticamente significativa, está próxima à variabilidade encontrada
quando se compara com às replicatas no ponto central, conforme ilustrado na Figura
43. Para as demais vitaminas, nenhum parâmetro demonstrou influência sobre a
área do pico cromatográfico. Assim, pode-se concluir que em relação à área, para
estas vitaminas, as melhores condições analíticas foram obtidas com porcentagem
de modificador orgânico elevada (30%), sendo os parâmetros temperatura e pressão
indiferentes, e dessa forma, optou-se em trabalhar, preferencialmente, com menor
temperatura (30°C) e menor pressão (1500 psi).
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualÁrea Vit. C
Design points above predicted valueDesign points below predicted value1.43776E+006
0
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
30
35
40
45
5020
22
24
26
28
30
-500000
0
500000
1E+006
1.5E+006
Áre
a V
it.
C
A: % MeOHC: Temperatura
127
Figura 43. Superfície de resposta para a área da vitamina B3, variando % de modificador orgânico e pressão, indicando a variabilidade experimental.
Em relação ao fator de assimetria dos picos, verificou-se que apenas os
fatores porcentagem de modificador orgânico e temperatura afetaram
significativamente a resposta. A pressão mostrou pouquíssima ou nenhuma
influência sobre o referido parâmetro analítico, influenciando apenas, como fator de
interação com a porcentagem de modificador orgânico e fator de assimetria da
vitamina B1. Para estas vitaminas, verificou-se que o aumento na proporção de
modificador orgânico e a redução da temperatura favoreceram a simetria dos picos,
indicando que o aumento na densidade do fluído observado, nestas condições,
contribui para tal observação, conforme ilustrado na Figura 44. Nesta figura, é
possível observar o efeito de aumento do fator de assimetria do pico da vitamina B1
quando se trabalhou em baixa (Figura 44A) e alta (Figura 44B) temperatura. Para a
vitamina B3 a regressão não foi significativa, indicando que nenhuma variável
experimental afetou a simetria do pico.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualÁrea Vit. B3
Design points above predicted valueDesign points below predicted value785816
747590
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 40
1500 1700
1900 2100
2300 2500
20
22
24
26
28
30
740000
750000
760000
770000
780000
790000
Áre
a V
it.
B3
A: % MeOHB: Pressão
128
Figura 44. Superfície de resposta para o fator de assimetria da vitamina B1, variando a % de
modificador orgânico e pressão. A) temperatura de 30°C, B) temperatura de 50°C.
Dessa forma, pode-se concluir que em relação ao fator de assimetria dos
picos das vitaminas, a melhor condição analítica foi obtida com porcentagem de
modificador orgânico elevada (30%) e temperatura reduzida (30°C), sendo o
parâmetro pressão indiferente e, dessa forma, optou-se em trabalhar
preferencialmente com a menor pressão (1500 psi). Resultados semelhantes foram
obtidos com o planejamento experimental realizado na coluna Acquity HSS C18 SB.
Em relação à eficiência da coluna, observou-se que o aumento na
porcentagem de modificador orgânico aumentou, significativamente, o número de
pratos, indicando ser este o parâmetro mais importante, neste caso. A temperatura
também apresentou efeito positivo, pois o aumento deste parâmetro resultou em
aumento no número de pratos, porém de forma significativa apenas para as
vitaminas B2 e B6. De uma maneira geral, a pressão não apresentou efeito
significativo no número de pratos. Foi possível registrar um interessante efeito de
interação entre porcentagem de modificador orgânico e a temperatura, onde o
aumento na temperatura proporcionou um maior aumento no número de pratos, mas
somente quando a proporção do modificador foi elevada. Neste caso, em valores
absolutos, o número de pratos passou de 160.000 para cerca de 200.000, para a
vitamina B2, não representando, entretanto, uma diferença que justifique a adoção
da temperatura elevada, de 50°C, para o método analítico em desenvolvimento,
129
visto que este parâmetro, neste nível, mostrou-se prejudicial à outras respostas
avaliadas. Os resultados obtidos foram similares ao encontrado no planejamento
realizado com a coluna Acquity HSS C18 SB. Para a vitamina B1, nenhum
parâmetro experimental afetou o número de pratos. A Figura 45 ilustra os resultados
discutidos.
Figura 45. Superfície de resposta para o número de pratos da vitamina B2, variando % de modificador orgânico e temperatura.
Dessa forma, foi possível concluir que o aumento na densidade do fluido,
causado pelo aumento na proporção de metanol na fase móvel, resulta em uma
maior eficiência cromatográfica, possivelmente por proporcionar a eluição de picos
mais estreitos. Em relação à temperatura, espera-se que seu aumento proporcione
maior retenção dos analitos e, consequentemente, maior número de pratos. Assim,
em termos de eficiência da coluna, a melhor condição analítica foi obtida quando se
trabalhou em maior porcentagem de modificador orgânico (30%) e de temperatura
(50°C), sendo a porcentagem de modificador orgânico o parâmetro mais relevante.
Em relação à resolução entre o par crítico vitamina B1/B2, verificou-se que
um modelo linear significativo foi observado, onde as variáveis porcentagem de
modificador orgânico e temperatura foram, mais uma vez, importantes sobre
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualPratos B2
Design points above predicted valueDesign points below predicted value212110
71719.5
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2000
30
35
40
45
50
20
22
24
26
28
30
50000
100000
150000
200000
250000
Nú
me
ro
de
Pra
tos
Vit
. B
2
A: % MeOHC: Temperatura
130
resposta observada, e a variável pressão bem menos relevante. A Figura 46 ilustra
uma superfície de resposta com estas observações. É possível afirmar que a melhor
resposta foi obtida na condição de menor porcentagem de modificador orgânico
(20%) e menor temperatura (30°C), com resposta de resolução de cerca de 9,8 para
este par de vitaminas. Entretanto, quando se utiliza uma maior proporção de
modificador orgânico (30%), verificou-se que a resposta também foi excelente, com
resolução de cerca de 8,8.
Figura 46. Superfície de resposta para a resolução entre vitaminas B1 e B2, variando a % de modificador orgânico e temperatura.
Em relação às VLS, verificou-se que em nenhuma condição experimental
a eluição dos picos foi satisfatória nesta coluna. De fato, em experimentos prévios
realizados de forma univariada já havia sido constatado que esta coluna não é
adequada para separação deste grupo de compostos. Entretanto, optou-se em
inserir a análise destas vitaminas também no estudo de planejamento multivariado,
com o intuito de se avaliar a detecção de alguma condição experimental não
avaliada através dos experimentos univariados, e que pudesse contribuir
positivamente para separação destas vitaminas, o que não foi obtido.
Desta maneira, através da análise dos resultados obtidos para cada
atributo de qualidade do método, foi possível concluir que a melhor condição
131
analítica pode ser obtida com o emprego da porcentagem de modificador orgânico
em 30%, temperatura do forno em 30°C e pressão em 1500 psi, com a coluna
Acquity Torus 2-PIC, para análise exclusiva das VHS.
Estes resultados estão mostrados nas Figuras 47 e 48, que revelam o
nível de desejabilidade analítica obtida quando todos os parâmetros avaliados são
considerados simultaneamente, de forma a obter a melhor condição analítica
possível. Na Figura 47, a desejabilidade está mostrada em função da variação da
porcentagem de modificador orgânico e pressão, enquanto na Figura 48, em função
da composição da fase móvel em termos de porcentagem de modificador orgânico e
temperatura. A análise destes gráficos demonstra que de fato a porcentagem de
modificador orgânico representa o fator que mais influencia na desejabilidade, e que
deve ser mantido no nível máximo (30%) para garantir melhores resultados
analíticos. Quanto à pressão, verificou-se que este fator apresenta pouca influência
nos resultados, podendo ser mantida em seu menor nível (1500 psi), sem afetar os
resultados, proporcionando uma menor pressão total do sistema cromatográfico.
Finalmente, a análise da temperatura mostra que este fator deve ser mantido em
nível reduzido (30°C), pois seguramente representa a condição de melhor
compromisso em relação aos atributos de qualidade observados neste estudo de
planejamento fatorial (retenção, fator de assimetria dos picos, resolução, eficiência e
reposta dos analitos) para o método desenvolvido.
132
Figura 47. Superfície de resposta da desejabilidade em função da % de modificador orgânico e pressão, na temperatura de 30°C.
Figura 48. Superfície de resposta da desejabilidade, em função da % de modificador orgânico e temperatura, na pressão de 2000 psi.
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualDesirability
1
0
X1 = A: % MeOHX2 = B: Pressão
Actual FactorC: Temperatura = 32
1500
1750
2000
2250
2500
20
22.5
25
27.5
30
-0.2
-2.77556E-017
0.2
0.4
0.6
0.8
1
De
se
jab
ilid
ad
e
A: % MeOHB: Pressão
Design-Expert® SoftwareFactor Coding: ActualDesirability
1
0
X1 = A: % MeOHX2 = C: Temperatura
Actual FactorB: Pressão = 2081.08
30
35
40
45
5020
22.5
25
27.5
30
-0.2
-2.77556E-017
0.2
0.4
0.6
0.8
1
De
se
jab
ilid
ad
e
A: % MeOH
C: Temperatura
133
4.5 Linearidade, Limites de Detecção e Quantificação
A realização do ensaio de linearidade, conforme preconizado na RDC n°
166, de 24 de julho de 2017, com as condições analíticas determinadas após a
conclusão do estudo de DoE, indicou que tanto as VLS como as VHS apresentaram
respostas analíticas diretamente proporcionais às concentrações dos analitos,
indicando serem lineares nas faixas estudadas. As VLS foram avaliadas na coluna
Acquity HSS C18 SB, e as VHS na coluna Acquity Torus 2-PIC.
De uma forma geral, os resultados do coeficiente de correlação
mostraram-se satisfatórios (maiores que 0,990) para todas as vitaminas, em uma
ampla faixa de concentrações. O mesmo ocorreu com os resíduos, que ficaram
dispersos de forma aleatória, com o mesmo número de valores positivos e
negativos. Foram calculados os resíduos padronizados (resíduos divididos pelo
desvio padrão da regressão) e todos estiveram dentro dos limites aceitáveis com
99% de confiança (de - 3 a + 3). Foi calculado o intervalo de confiança para os
coeficientes linear e angular, sendo que o último sempre se mostrou significativo e
diferente de zero. Para algumas vitaminas o intervalo de confiança do coeficiente
linear não passou pelo zero, no entanto, seu valor não impactou de forma
significativa na quantificação.
Na Figura 49A está mostrada a curva analítica e na Figura 49B o gráfico
de resíduos padronizados para a vitamina A como exemplo. A faixa estudada para
esta vitamina foi de 0,04 a 0,34 mg mL-1. O intervalo de confiança para o intercepto
passou pelo zero, não representando impacto na quantificação. Os Limites de
Detecção (LD) e de Quantificação (LQ) calculados para esta vitamina, através das
equações descritas a seguir, foram de 9,7 x 10-3 mg mL-1 e 3,3 x10-2 mg mL-1,
respectivamente.
(Equação 2)
(Equação 3)
134
Figura 49: Curva Analítica (A) e Resíduos Padronizados (B) para a vitamina A.
135
Para as demais vitaminas, os resultados foram compilados conforme
mostrado na Tabela 11.
Tabela 11. Resultado do estudo de linearidade para as vitaminas analisadas.
4.6 Injeções da Amostra
Após definição dos principais parâmetros do método analítico, avaliou-se o
desempenho cromatográfico obtido após injeção de uma solução preparada com o
produto farmacêutico em teste, a fim de visualizar o cromatograma e identificar
possíveis interferências da matriz, como excipientes, sobre a eluição das vitaminas.
Nas Figuras 50 a 53 são mostrados os cromatogramas obtidos com a solução da
amostra, solução padrão de trabalho e diluente, e a sobreposição entres estes
cromatogramas, para ambas as colunas cromatográficas estudadas.
136
Figura 50. Cromatogramas obtidos na coluna Acquity HSS C18 SB. A: Diluente, B: Solução Padrão de Trabalho, C: Solução Amostra.
Figura 51. Sobreposição dos cromatogramas obtidos na coluna Acquity HSS C18 SB - Diluente
(preto), Solução Padrão de Trabalho (azul), Solução Amostra (verde). Fase móvel: 10 mmol/L de
formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 10 mmol/L hidróxido de amônio (v/v). Demais
condições cromatográficas conforme descrito na Figura 25. Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A,
3. Vitamina D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B6, 6. Vitamina B2 e 7. Vitamina C, 8. Vitamina B1.
137
Figura 52. Cromatogramas obtidos na coluna Acquity Torus 2-PIC. A: Diluente, B: Solução Padrão de Trabalho, C: Solução Amostra.
Figura 53. Sobreposição dos cromatogramas obtidos na coluna Acquity Torus 2-PIC - Diluente (preto), Solução Padrão de Trabalho (azul), Solução Amostra (verde). Fase móvel: 10 mmol/L de formato de amônio + 5% água em metanol (v/v) + 10 mmol/L hidróxido de amônio (v/v). Demais condições cromatográficas conforme descrito na Figura 25. Compostos: 1. Vitamina E, 2. Vitamina A, 3. Vitamina D, 4. Vitamina B3, 5. Vitamina B6, 6. Vitamina B1 e 7. Vitamina B2, 8. Vitamina C.
A comparação dos cromatogramas da solução da amostra, solução padrão
de trabalho e diluente, para ambas as colunas cromatográficas estudadas, mostra
138
que praticamente não há interferência de componentes da matriz do produto
farmacêutico sobre a eluição das vitaminas em estudo. Entretanto, uma análise mais
profunda, em termos de pureza de pico e realização de uma degradação forçada é
necessária para assegurar que o método proposto apresenta a seletividade
necessária, conforme RDC n° 166/2017, da ANVISA.
5. CONCLUSÕES
A diferença marcante de solubilidade das vitaminas estudadas destaca a
importância da realização de um estudo sobre a solubilidade das mesmas nos
principais solventes utilizados em UHPSFC. Este estudo mostrou que o metanol foi o
solvente orgânico capaz de solubilizar a maior parte das vitaminas, embora a adição
de uma pequena quantidade de água (5%, v/v) na solução diluente foi necessária
para garantir a solubilização da vitamina B12 (cianocobalamina), que se mostrou
insolúvel em metanol puro. Paralelamente, a avaliação do efeito do volume de
injeção sobre o formato dos picos mostrou que, quanto maior a polaridade do
diluente utilizado, pior é o formato do pico, mesmo para volumes de injeção baixos.
Além disso, o efeito do aumento do volume de injeção também é prejudicial à
simetria do pico, mesmo para diluentes mais apolares. Dessa forma, a solução
diluente metanol:água 95:5 (v/v) forneceu picos com formato adequado, desde que o
volume de injeção fique restrito a 1 µL.
Em relação à fase estacionária, concluiu-se que a coluna Acquity HSS
C18 SB foi a fase estacionária mais adequada para separação simultânea dos dois
grupos de vitaminas. Em relação ao tipo de modificador orgânico, o metanol mostrou
apresentar os resultados mais satisfatórios de eluição e formato dos picos, sendo
fundamental o emprego de aditivos, como o sal formato de amônio (10 mmol/L),
água (5%) e hidróxido de amônio (10 mmol/L) para melhoria dos parâmetros
cromatográficos destes analitos nesta coluna cromatográfica. A realização o estudo
multivariado mostrou que os fatores porcentagem de modificador orgânico, pressão
e temperatura do forno influenciaram as respostas analíticas estudadas, sendo que
a condição cromatográfica de escolha para análise simultânea das VLS e VHS foi de
139
proporção de modificador orgânico de 30% ao final do gradiente, temperatura do
forno de 30°C e contra-pressão de 1500 a 2500 psi.
No caso de análise exclusiva de VLS, concluiu-se que a coluna Acquity
HSS C18 SB foi a fase estacionária mais adequada a ser utilizada, devendo o
metanol ser empregado como modificador orgânico da fase móvel, pois forneceu
tempo de retenção menor e picos mais simétricos que os demais solventes
avaliados (acetonitrila e 2-propanol), sem a necessidade do emprego dos aditivos
formato de amônio, água e hidróxido de amônio, pois estes não contribuíram para
melhorar o formato dos picos desta classe de vitaminas.
No caso das VHS, a coluna Acquity Torus 2-PIC mostrou-se a mais
adequada, apresentando retenção e resolução satisfatórias, e o metanol mostrou-se
como o modificador orgânico mais indicado para análise deste grupo de vitaminas.
A fase móvel mais adequada para análise das VHS deve apresentar também os
aditivos formato de amônio (10 mmol/L), água (5%) e hidróxido de amônio (10
mmol/L) para melhoria dos parâmetros cromatográficos destes analitos nesta coluna
cromatográfica. A realização do estudo multivariado mostrou que os fatores
porcentagem modificador orgânico e temperatura do forno apresentaram maior
influência sobre a eluição das VHS, sendo a melhor condição analítica para análise
exclusiva das VHS obtida utilizando a coluna Acquity Torus 2-PIC com o emprego do
fator porcentagem de modificador orgânico em 30%, temperatura do forno em 30°C
e contra-pressão entre 1500 a 2500 psi.
Em relação à linearidade na metodologia analítica desenvolvida, foi
possível observar que tanto as VLS como as VHS apresentam respostas analíticas
diretamente proporcionais à concentração dos analitos. Com a análise de um
produto farmacêutico em forma de cápsula, foi possível verificar que não foram
detectados interferentes da matriz e do diluente nos tempos de retenção das
vitaminas em estudo.
Conclui-se que o desenvolvimento de um método analítico único, capaz
de identificar e quantificar VLS e VHS é possível, através do emprego da técnica de
UHPSFC, o que representa uma interessante vantagem em relação às principais
140
metodologias adotadas atualmente na separação destes grupos de compostos, as
quais empregam, frequentemente, mais de uma técnica analítica. No entanto, foi
verificado que a análise de compostos de alto massa molar, extremamente polares e
de difícil solubilização em meio não aquoso, tais como as vitaminas B9 e B12,
configuram-se como limitações desta técnica. Além disto, a grande quantidade de
parâmetros analíticos que influenciam a separação, com mecanismos ainda não
totalmente elucidados, representam um desafio analítico.
Como conclusão final, pode-se dizer que a principal contribuição deste
trabalho constituiu no desenvolvimento de um método analítico inovador para
análise simultânea das VLS e VHS, que são analitos com características muito
distintas, e na avaliação dos principais fatores que afetaram a retenção, separação e
formato dos picos dos compostos empregando a técnica de UHPSFC, dentre eles a
composição da fase estacionária e da fase móvel e a densidade do fluído.
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Como trabalhos futuros, sugere-se a validação completa dos métodos
desenvolvidos, de acordo com a legislação vigente, a aplicação em outros produtos
comerciais, além da divulgação dos resultados por meio de artigos científicos, de tal
maneira que os métodos possam ser de utilidade para indústrias de diferentes áreas
(farmacêutica, alimentícia, cosmética, etc) que tenham a necessidade de quantificar
vitaminas em seus produtos.
141
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Food and Drug Administration, Guidance for Industry PAT: A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacuring, and Quality Assurance, FDA Off. Doc. (2004) 16. doi:http://www.fda.gov/CDER/guidance/6419fnl.pdf.
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