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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
RITA DE CÁSSIA DE OLIVEIRA COLLAÇO
ATIVIDADE DO VENENO DE Tityus bahiensis EM PREPARAÇÕES
NEUROMUSCULARES E AUTÔNOMAS
CAMPINAS
2019
RITA DE CÁSSIA DE OLIVEIRA COLLAÇO
ATIVIDADE DO VENENO DE Tityus bahiensis EM PREPARAÇÕES
NEUROMUSCULARES E AUTÔNOMAS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutora em
Farmacologia.
ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON ANTUNES
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. EDWARD GERARD ROWAN
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
RITA DE CÁSSIA DE OLIVEIRA COLLAÇO,
ORIENTADA PELO PROF. DR. EDSON ANTUNES
E CO-ORIENTADA PELO PROF. DR. EDWARD
GERARD ROWAN.
CAMPINAS
2019
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Collaço, Rita de Cássia de Oliveira, 1989- C683a Atividade do veneno de Tityus bahiensis em preparações neuromusculares
e autônomas / Rita de Cássia de Oliveira Collaço. – Campinas, SP : [s.n.], 2019. Orientador: Edson Antunes. olCoorientador: Edward Gerard Rowan.
ColTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Col1. Canais iônicos. 2. Sistema nervoso periférico. 3. Sistema nervoso autônomo. 4. Eletrofisiologia. 5. Junção neuromuscular. 6. Junção neuroefetora. 7. Venenos de escorpião. I. Antunes, Edson, 1960-. II. Rowan, Edward Gerard. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Tityus bahiensis scorpion venom activities on somatic and autonomic preparations Palavras-chave em inglês: Ion channels Peripheral nervous system Autonomic nervous system Electrophysiology Neuromuscular junction Neuroeffector junction Scorpion venoms Área de concentração: Farmacologia Titulação: Doutora em Farmacologia Banca examinadora: Edson Antunes [Orientador] Luiz Ricardo de Almeida Kiguti Priscila Randazzo de Moura Fábio Bucaretchi Ana Leonor Abrahão Nencioni Data de defesa: 28-02-2019 Programa de Pós-Graduação: Farmacologia Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-2826-1603 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/1754761143036158
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE
DOUTORADO
RITA DE CÁSSIA DE OLIVEIRA COLLAÇO
ORIENTADOR: EDSON ANTUNES
COORIENTADOR: EDWARD GERARD ROWAN
MEMBROS:
1. PROF. DR. EDSON ANTUNES
2. PROF. DR. LUIZ RICARDO DE ALMEIDA KIGUTI
3. PROFA. DRA. PRISCILA RANDAZZO DE MOURA
4. PROF. DR. FÁBIO BUCARETCHI
5. PROFA. DRA. ANA LEONOR ABRAHÃO NENCIONI
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da
FCM.
Data de Defesa: 28/02/2019
Ao Zelão,
O maior coração do mundo,
uma pena que não bata para sempre.
AGRADECIMENTOS
Aos pais
Aqueles que, depois de uma gestação extremamente conturbada,
acompanharam meu primeiro choro, meu primeiro sorriso, meus primeiros passos,
minhas primeiras palavras, meus primeiros erros.
Compartilharam de todos os meus momentos, minhas expectativas, minhas
vitórias, minhas dificuldades, minhas dores. Doaram noites sem dormir,
ensinamentos, experiências, alegrias, carinhos, sorrisos, broncas, conversas... e amor
incondicional.
Meus mestres, meus primeiros professores. Eles que sempre me
relembram que “podemos perder tudo e todos, mas nunca perderemos o
conhecimento que obtivemos”.
Me encorajaram a sonhar, acreditar e seguir em frente. Me seguraram e
mesmo na turbulência não me deixaram desistir.
Se hoje isso pode ser lido, é por estímulo e apoio de vocês.
À família
Ao meu avô materno José (Zelão; in memoriam), que sempre me disse o
quanto se sentia orgulhoso de mim e, mesmo no hospital levantava a voz para contar
que sua neta estava “nas Escócia” para virar doutora. Obrigada por me esperar voltar
de Glasgow como prometeu, obrigada pela última páscoa e pelo último abraço. Sei
que de onde estiver, estará torcendo por mim.
Ao meu sobrinho Vitor (Pulga) e minha sobrinha Maria Fernanda (Piolhinha)
que, sempre me recebem com os abraços mais sinceros e os beijos mais gostosos do
mundo. Vocês deixam meus dias mais leves e coloridos. A “Ia” ama vocês.
Agradeço a minha avó materna Eva (a melhor cozinheira do mundo), meus
tios (em especial ao Odair, Helenaide e Garibaldi) e primos (que são tantos) pelo apoio
e por todas as risadas e as “cachetas” no sítio.
Ao meu irmão Tiago que, independente dos “tapas e beijos”, sempre me
arrancou sorrisos e sempre esteve “lá” por mim. A Elza Collaço (in memoriam), minha
avó paterna, que dedicou toda sua vida ao ensino e sempre apoiou nosso crescimento
acadêmico. Agradeço a minha cunhada Luciana, a minha “irmã” Adriana e meu
“sobrinho” Kaique, pelo interesse que sempre demonstraram em meu trabalho, pelo
apoio, pelos intensos momentos de descontração e por sempre impulsionarem meus
passos.
A Márcia, Carlos Eduardo, Bruna e Nilo pelos finais de semana divertidos
e por sempre se demonstrarem interessados pelo meu trabalho.
Ao Eduardo que foi quem esteve mais presente durante todos esses anos
de doutorado, seja de perto ou de longe. Obrigada pelo apoio, pelo empurrão, pelo
incentivo, pelo carinho, pela segurança. Obrigada pelas viagens, pelos shows, pelas
risadas, pela amizade. Por ser você, por ser minha dupla.
Aos mestres
Ao Prof. Dr. Edson Antunes que aceitou a tarefa de me orientar e por
gentilmente me receber em seu laboratório. Foi uma experiência nova para nós dois
mas não poderia ter recebido uma melhor orientação, nem escolhido um melhor tutor.
Obrigada pelas discussões e reflexões fundamentais ao longo desse percurso, por
sempre apoiar todos os passos que me levaram a esse momento, por mais “malucos”
que eles fossem. Obrigada pelos conselhos, pelas palavras ternas e pelos ocasiões
de descontração. Serei eternamente grata pela oportunidade e pela confiança.
Ao Dr. Eddie Rowan (University of Strathclyde) pela co-orientação, pelas
horas de Skype, por me receber em Glasgow, pela troca de vivência, pelos pints e
piadas, pela confiança e amizade. Obrigada por transmitir tamanho conhecimento que
em muito auxiliou para minha construção como eletrofisiologista.
Aos membros que compuseram a banca de qualificação (Profa. Dra.
Fabíola Iglesias, Dr. Luiz Ricardo Kiguti e Prof. Dr. Leonardo Elias) e banca de defesa
(Prof. Luiz Ricardo Kiguti, Profa. Priscila Randazzo de Moura, Profa. Ana Leonor
Abrahão Nencioni e Prof. Fábio Bucaretchi) pelas críticas e comentários construtivos
pertinentes para a finalização desse trabalho.
A todos os professores (em especial a Profa. Léa, Profa. Sisi, Prof.
Stephen, Prof. Gabriel) e funcionários (do biotério, especialmente ao Seu Miguel e
Ivani; e da secretaria, Gustavo, Cidinha e Maísa) do Departamento e do Programa de
Pós-graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas pelo apoio técnico, teórico, prático e burocrático que
possibilitaram minha evolução acadêmica e científica.
Ao Dr. Ewan Smith (University of Cambridge) pela confiança, pelo apoio e
por abrir as portas do laboratório para meu treinamento em biologia molecular.
A todos os professores e demais funcionários de todas as instituições que
um dia me abrigaram, sejam eles professores de Educação Infantil, Ensino
Fundamental, Ensino Médio, Graduação, Mestrado ou ainda aqueles que
simplesmente me transmitiram conhecimentos de cunho científico, acadêmico ou
cotidiano.
Cada um de vocês teve um papel fundamental para minha formação.
Aos amigos
Ao Alberto, que foi pra mim um grande companheiro durante todos esses
anos, estando perto ou longe. Foram várias horas de conversas e trocas de
mensagens, várias aulas desajeitadas de zumba, insuportável bom humor matinal,
“altos risos nas Europas”. Obrigada por ser meu Patrick, pela paciência de me ouvir,
por ter compartilhado comigo as angústias, tensões e incertezas, mas também ter
compartilhado tanto amor.
A Camila e Karol por todos os momentos descontraídos, pelas viagens e
passeios juntinhas, pela companhia no lab, na academia e na vida. Obrigada por me
ajudar, me emocionar, por cantar, dançar, entreter.
A Sandra e a Gabriela por me ouvirem, oferecerem conselhos, me darem
suporte, abraços e risadas. Obrigada pelas descobertas e surpresas, os
pensamentos, as histórias, os risos.
Aos todos os demais membros do grupo (Glaucia, Elen, Mari, Rafa Ceará,
Edith, Fabiano, Matheus, Charlie, Felipe, Luiz, Natalícia, e tantos outros) pela
companhia, pelos momentos de trocas de experiências e experimentos, pelos
momentos de descontração, pelas calorias acumuladas com todos os pães caseiros
e bolos de aniversário. Vocês foram um enorme presente que a Farmaco me deu.
Um obrigada especial aos demais amigos, colegas e agregados que
conheci no (ou pelo) Depto de Farmacologia da UNICAMP, por fazer da FCM-10 uma
grande família.
A minha família brasileira de Glasgow (Elaine, José, Isabela, Heloisa,
Juliana, Karla, Rheure, Renée, Camila, e outros). Nunca é fácil começar do zero,
mudar para um lugar novo, de cultura nova, e de uma língua nova (inglês glaswegian
é praticamente um outro idioma). Nunca é fácil ficar longe de tudo e todos que
conhecemos e amamos, mas o universo me trouxe vocês. Foram muitas viagens e
viagens, muitas risadas, MUITA CHUVA, aniversários, cinema, pubs e Boteco do
Brasil, churrascos indoor, “Ski-bundas”, boneco de neve, Carna-Glasga, e nosso
reencontro nas férias do tijolinho (dezembro 2018 no Rio de Janeiro). Nunca me senti
sozinha, vocês estavam comigo.
Aos demais amigos que fiz “por aí” enquanto na Escócia (Sophie,
Francesca, Haitham, Aoibheann) por deixarem meus dias mais animados; aos colegas
da Strathclyde (Hadi, Ruby, Rachel, Panagiotis, Jennifer, Aisya e Harvey, Chloe,
Molly) pelos almoços, pelas risadas, pelo bolo de parabéns; ao Moa que estava
sempre pronto para aprender as “melhores frases e músicas” em português, pelas
saídas, pelos burguers, pela guerra na neve, pela amizade. Ao Graeme, meu
professor de “escocês” (Aye! Belter! Gaun yersel lassie!), por ser meu melhor amigo
em Glasgow, por estar sempre lá por mim, pelas palhaçadas, pela confiança, pelo
jogo do Rangers, pela cia na academia e por continuar se importando mesmo longe.
Ao Crespinho, por sempre estar disposto a me ajudar, me acolher, carregar
a mala (rs), compartilhar os quitutes e bebidas portuguesas.
Ao bonde (Nátalia a quase médica paraguaia, Marcela odalisca geóloga e
a futura presidenta do México Itzel) por todas as abobrinhas, babados, risadas,
conversas e carinho. Sinto a falta de vocês no meu dia a dia, mas feliz que mesmo
com o passar de tantos anos estamos “juntas”.
A Família Holand que me recebeu em Cambridge durante as 4 semanas.
Agradeço a todos aqueles que se interessaram e me apoiaram durante todo
o processo de elaboração e realização desse trabalho. Perdoem-me não os listar, mas
cada um sabe o quão importante é para mim.
Agradeço também ao CNPq pelo suporte inicial (processo n. 142460/2014-
1, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e à FAPESP
(processos n. 2016/11319-6 e 2016/23829-9, Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo) pelo suporte financeiro que permitiu a continuidade e finalização
desse trabalho, incluindo o período no exterior.
A Universidade Estadual de Campinas, a University of Strathclyde e a
University of Cambridge pelo suporte técnico/estrutural/acadêmico.
E por fim, mas não menos importante, agradeço a todos os animais que
possibilitaram a realização desse estudo. Tenho em mente a importância de cada vida
que esteve em minhas mãos, o que me levou a agir com intenso respeito,
planejamento e responsabilidade.
“Hoje me sinto mais forte
Mais feliz quem sabe
Só levo a certeza de que muito pouco eu sei...”
(Almir Sater e Renato Teixeira)
RESUMO
O escorpionismo é caracterizado principalmente por manifestações locais, mas que
podem evoluir à sistêmicas, sendo acompanhadas por uma massiva liberação de
catecolaminas e acetilcolina por nervos periféricos. Essa atividade é causada por
peptídeos neurotóxicos presentes nestes venenos, que tem alta especificidade e
afinidade por canais iônicos. Tityus bahiensis (T. bahiensis) é uma das espécies de
importância médica no Brasil sendo responsável por grande parte dos acidentes
escorpiônicos no estado de São Paulo (segundo maior causa de escopionismo no
país), entretanto, apesar de sua relevância epidemiológica, seu veneno permanece
pobremente estudado, especialmente em relação a sua farmacologia no sistema
nervoso periférico. Este trabalho estudou a atividade do veneno de T. bahiensis na
neurotransmissão somática motora e simpática por meio de abordagens miográficas
(preparações neuromusculares de camundongo e ave, e canal deferente isolado de
ratos), eletrofisiológicas (MEPP, EPP, SEJP, potenciais de membrana em repouso,
formas de ondas perineurais, potenciais de ação compostos e whole-cell patch-
clamp), e de imagem de cálcio (neurônios do GRD e linhagem ND7-23, e fibras
musculares). Nossos resultados mostram que os maiores efeitos tóxicos promovidos
pelo veneno de T. bahiensis na função neuromuscular e neuroefetora são de origem
pré-sináptica. Baixas concentrações de veneno prolongam o potencial de ação axonal
levando a uma despolarização prolongada do terminal nervoso que
consequentemente promove a liberação de neurotransmissores e a facilitação da
contração muscular. O veneno também estimulou a liberação espontânea de
neurotransmissores provavelmente através da despolarização parcial do terminal
nervoso. Altas concentrações de veneno bloqueiam a geração de potencial de ação e
a contração muscular neurogênica. A farmacologia do veneno pode ser revertida por
baixas concentrações de TTX, indicando que os canais de sódio dependentes de
voltagem neuronais são um dos principais alvos dessas toxinas. O resultado deste
trabalho sugere que a maioria da neurotoxicidade promovida pelo veneno de T.
bahiensis são causados provavelmente por toxinas α e β interagindo com canais
iônicos pré-sinápticos sensíveis a TTX em ambos axônios e terminais nervosos.
Palavras-chave: Canais iônicos; sistema nervoso periférico; junção neuromuscular;
junção neuroefetora; eletrofisiologia; venenos de escorpião.
ABSTRACT
Scorpionism is characterized by marked local symptoms that can evolve to systemic
which is frequently accompanied by a massive release of catecholamines and
acetylcholine from peripheral nerves caused by neurotoxic peptides present in theses
venoms, which have high specificity and affinity for ion channels. Tityus bahiensis (T.
bahiensis) is a medically important scorpion specie in Brazil (responsible for the major
scorpion accidents in Sao Paulo State) but, despite its epidemiological relevance, its
venom remains scarcely studied, especially with regarding to its pharmacology on
peripheral nervous system. Here, we evaluated the activity of T. bahiensis venom on
motor somatic and autonomic neurotransmission using myographic (chick and mouse
neuromuscular preparations, and isolated rat vas deferens), electrophysiological
(MEPP, EPP, SEJP, resting membrane potentials, perineural waveforms, compound
action potentials) and calcium imaging (on DRG and ND7-23 neurons and muscle
fibres) techniques. Our results show that the major toxic effects of T. bahiensis venom
on neuromuscular function are presynaptically driven. Low concentrations of venom
prolong the axonal action potential leading to a longer depolarization of the nerve
terminals that enhances neurotransmitter release and facilitates nerve-evoked muscle
contraction. The venom also stimulates the spontaneous release of neurotransmitters,
probably through partial neuronal depolarization. Higher concentration of venom
blocks the generation of the action potential and resulting muscle twitches. The venom
pharmacology was reversed by low concentrations of TTX, indicating voltage-gated
sodium channels as one of the primary target of the venom toxins. These results
suggest that major neurotoxicity promoted by T. bahiensis venom are probably caused
mainly by α- and β-toxins interacting with presynaptic TTX-sensitive ion channels on
both axons and nerve terminals.
Key-words: Ion channels; peripheral nervous system; neuromuscular junction;
neuroeffector junction; electrophysiology; scorpion venom.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Anatomia externa dos escorpiões. O corpo é dividido em prossoma (de
onde surgem os apêndices articulados) e opistossoma que, por sua vez, se divide em
mesossoma (tronco) e metassoma (cauda). Ilustração própria. ................................ 38
Figura 2. Arquitetura dos canais de sódio dependentes de voltagem (Nav). A
subunidade α consiste em 4 domínios homólogos DI (rosa), DII (verde), DIII (amarelo)
e DIV (azul) conectados por alças intracelulares e cada domínio contem seis
segmentos (S1 – S6) em α-hélices transmembranas; os sinais positivos (+)
encontrados nos segmentos S4 representam o sensor de voltagem positivamente
carregado; os segmentos S5 e S6 juntamente com a alça que liga esses dois
segmentos formam o poro, enquanto o movimento dos segmentos S6 levam a
abertura dos canais em resposta a despolarização, a alça intracelular que conecta DIII
S6 e DIV S1 atua como uma comporta, inativando o poro. A subunidade α se associa
a uma ou mais subunidades β (laranja), que por sua consistem em um grande domínio
extracelular, um único segmento transmembrana e um pequeno domínio intracelular.
Ilustração própria a partir da pesquisa em diversas fontes. ...................................... 50
Figura 3. Espécimes macho e fêmea do escorpião Tityus bahiensis no estado de
São Paulo (213) e sua distribuição geográfica (A, B, respectivamente). A área em
vermelho indica o estado de São Paulo, de onde T. bahiensis é endêmico sendo o
maior causador de acidentes. As áreas em laranja indicam os estados do Paraná,
Santa Catarina, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e Goiás estados onde acidentes
por T. bahiensis também são frequentes. Poucos acidentes foram reportados nos
estados do Rio de Janeiro, Espírito Santo, Rio Grande do Sul, Bahia e Mato Grosso
(áreas em amarelo claro). ......................................................................................... 56
Figura 4. Desenho experimental deste trabalho. Foram realizados ensaios
funcionais seguidos de ensaios eletrofisiológicos em diferentes preparações
neuromusculares e autônomas. Na sequência, realizou-se o estudo da movimentação
espontânea de cálcio intracelular. EDL: extensor digitorum longus; BCP: biventer
cervicis de pintainho; NFD: nervo frênico – diafragma. MEPP: potencial de placa
terminal em miniatura; EPP: potencial de placa terminal; SEJP: potencial juncional
excitatório espontâneo; PMR: potencial de membrana em repouso. ........................ 65
Figura 5. Atividade neuromuscular do veneno bruto de Tityus bahiensis em
preparações extensor digitorum longus (EDL) de camundongo. Os músculos
foram submetidos à estímulo de campo (1Hz, 0.2ms, voltagem supramáxima) e
incubados com solução Tyrode na ausência (controle) ou presença do veneno (1 -
10μg/mL) por 120 min a 37 °C. Os resultados são expostos em forma gráfica (painel
A) e traçado representativo do registro das preparações incubadas com 1 µg/mL
(painel B) e 10 µg/mL (painel C). Note que a concentração mais baixa (1 µg/mL)
promove facilitação enquanto altas concentrações (10 µg/mL) causam bloqueio
neuromuscular. Os pontos representam a média ± EPM de 4 experimentos. *p<0.05
comparado com o controle. ....................................................................................... 92
Figura 6. Atividade neuromuscular do veneno bruto de Tityus bahiensis em
preparações nervo frênico – diafragma (NFD) de camundongo. Os músculos
foram estimulados de forma indireta (contrações neurogênicas) (A) ou direta (B) e
incubados com solução Tyrode na ausência (controle) ou presença do veneno (1 – 30
μg/mL) por 120 min a 37 °C. Note i) em músculos indiretamente estimulados, a
concentração menor (1 μg/mL) promoveu facilitação da contração enquanto a mais
alta concentrações (30 µg/mL) causa bloqueio neuromuscular ii) a facilitação da
contração não é observada em músculos diretamente estimulados, visualizando-se
apenas bloqueio parcial e dependentes do tempo e concentração. Os pontos
representam a média ± EPM de 5-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
.................................................................................................................................. 94
Figura 7. Registros representativos da atividade do veneno de Tityus bahiensis
em preparações nervo frênico – diafragma (NFD) de camundongos. Os músculos
foram indiretamente (A, B) ou diretamente estimulados (C, D) e incubados com
solução Tyrode (controle), na presenta e ausência do veneno de T. bahiensis (A,C: 1
µg/mL. B, D: 30 µg/mL). Note que a facilitação da contração muscular promovida por
baixa concentração de veneno foi observada apenas em músculos indiretamente
estimulados, indicando que tal efeito facilitatório é de origem pré-sináptica. Em relação
ao bloqueio promovido por alta concentração de veneno (30 µg/mL), embora também
seja observado em músculos diretamente estimulados, este foi mais rápido e efetivo
em preparações indiretamente estimuladas do que diretamente estimuladas,
indicando que bloqueio total também tem origem pré-sináptica................................ 95
Figura 8. Atividade do veneno bruto de Tityus bahiensis na velocidade de
contração e relaxamento do diafragma. Os músculos foram indiretamente (A) e
diretamente estimulados (B) após incubação com solução Tyrode na ausência
(controle) e presença do veneno (10 µg/mL). Note que em contrações evocadas pelo
nervo e após a adição do veneno, a contração e o relaxamento foram mais lentos que
o valor basal. Por outro lado, não houve alteração significativa nos músculos
diretamente estimulados. Os pontos representam a média ± EPM de 5-6
experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal............................................... 97
Figura 9. Atividade neuromuscular do veneno de T. bahiensis em preparações
biventer cervicis de pintainho sob estimulação indireta. A) Os músculos foram
indiretamente estimulados (estímulo de campo, 1Hz, 0.2ms, voltagem supramaxima)
e incubados com solução Krebs na ausência (controle) ou presença do veneno de T.
bahiensis (1 – 30 μg/ml) por 120 min a 37 ºC. B) Contraturas em resposta ao KCl (110
μM), ACh (20 nM) e carbacol (CCh; 8µM) foram obtidas antes da adição do veneno
(basal) e após 120 min. Note i) baixas concentrações promovem facilitação enquanto
a mais alta (30 µg/mL) causa bloqueio da contração muscular. Os pontos e barras
representam a média ± EPM de 4-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
.................................................................................................................................. 99
Figura 10. Atividade neuromuscular do veneno de T. bahiensis em preparações
biventer cervicis de pintainho (BCP) sob estimulação direta. Os músculos foram
diretamente estimulados (1Hz, 20ms, voltagem supramáxima) e incubados com
solução Krebs na ausência (controle) ou presença do veneno de T. bahiensis (1 – 30
μg/mL) por 120 min a 37 ºC. O bloqueio da transmissão pré-sináptica foi obtido pela
pela pré-incubação dos músculos com dTC (50μM; A) em Krebs usual ou pela
ausência do cálcio na solução nutritiva (B). Os pontos representam a média ± EPM de
4-5 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle. .......................................... 101
Figura 11. Traçados representativos da resposta contrátil dos músculos
biventer cervicis de pintainho (BCP) após incubação com o veneno de Tityus
bahiensis (30 µg/mL). Os músculos foram indiretamente estimulados (contrações
evocadas via nervo) ou diretamente estimulados após pré-incubação com d-
Tubocurarina (dTC) ou em solução na ausência completa de Ca2+. Note que o veneno
promoveu um marcante retardo no relaxamento muscular (↑); tal atividade foi completa
e rapidamente revertida (*) após a adição de TTX (5 nM). ..................................... 102
Figura 12. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis em
preparações biventer cervicis de pintainho (BCP). Os músculos foram indireta (A)
ou diretamente estimulados após pré-incubação com dTC (B) ou mantidos solução na
ausência de cálcio (C). O veneno (30 µg/mL) promoveu bloqueio da contração
muscular sendo esse total (estimulação indireta; A) ou parcial (estimulação direta; B).
Note que contratura promovida pelo veneno (A) foi essa inibida pela pré-incubação
com dTC e pela ausência do cálcio na solução nutritiva. V: adição de veneno. ..... 103
Figura 13. Registro representativo da atividade do veneno T. bahiensis nas
contraturas do biventer cervicis de pintainho (BCP). Os músculos foram
inicialmente indiretamente estimulados para testar a viabilidade da preparação em
solução Krebs na ausência (A) e presença de toxina botulínica (BoNT-A; 10 ug/mL;
B). Após a estimulação ser desligada (antes da adição de veneno), foram adicionados
30 µg/mL do veneno de T. bahiensis à preparação (V). A contratura é prontamente
revertida pela adição de dTC (↑). ............................................................................ 104
Figura 14. Atividade do veneno de T. bahiensis em canais deferentes
biseccionados de ratos. As contrações fásica (A; referente à porção prostática de
resposta predominantemente purinérgica) e tônica (B; referente à porção epididimal
de resposta predominantemente noradrenérgica) foram obtidas via estímulo de campo
(10 Hz, 5 ms, 60 V) por meio de trens de 1 e 10 s, respectivamente, a cada 2 min.
Todos os músculos foram incubados com solução Tyrode na ausência (controle) e
presença do veneno de T. bahiensis (1 – 30 μg/mL). Note i) baixas concentrações
promovem facilitação enquanto a mais alta (30 µg/mL) causa bloqueio total da
contração muscular. Os pontos representam a média ± EPM de 4-6 experimentos.
*p<0.05 comparado com o controle......................................................................... 105
Figura 15. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis nas
porções epididimal (E) e prostática (P) de canais deferentes de ratos. Os
músculos foram incubados com 1 (A), 3 (B), 10 (C) ou 30 (D) µg/mL de veneno e
indiretamente estimulados (estímulo de campo; 10Hz, 5ms, 60V) por meio de trens de
1 (porção prostática; P) e 10s (porção epididimal; E) a cada 2 min. O veneno promoveu
facilitação da contração muscular em baixas concentrações ou bloqueio em altas
concentrações. Foram observadas contrações mantidas (elevações da linha de base)
em resposta a concentrações ≥3 µg/mL do veneno. Fasciculações (↑) após a adição
do veneno foram observadas nas porções epididimais. V: adição de veneno. ....... 106
Figura 16. Registros representativos na porção epididimal de canal deferente de
ratos incubados com veneno de T. bahiensis. Os músculos foram inicialmente
estimulados (estímulo de campo, 10Hz, 5ms, 60V; trens de 10s a cada 2 min; n=4) e
pré-incubados com solução Tyrode na ausência (A; controle), ou presença de TTX (B;
200 nM), Prazosina (C; 1 µM), PPADS (D; 30 µM) ou d-Tubocurarina (E; dTC; 50
µg/mL). Após estabilização dos efeitos das drogas, o estímulo elétrico foi desligado e
o veneno adicionado (V; 10 µg/mL). As contrações mantidas foram inibidas nas
preparações pré-incubadas com TTX e PPADS. W: lavagem. ............................... 108
Figura 17. Registros representativos na porção prostática de canal deferente de
ratos incubados com veneno de T. bahiensis. Os músculos foram inicialmente
estimulados (estímulo de campo, 10Hz, 5ms, 60V; trens de 1s a cada 2 min; n=4) e
pré-incubados com solução Tyrode sozinho (A; controle), ou na presença de TTX (B;
200 nM), Prazosina (C; 0,1 µM), PPADS (D; 300 µM) e d-Tubocurarina (E; dTC; 50
µg/mL). Após estabilização dos efeitos das drogas, o estímulo elétrico foi desligado e
o veneno adicionado (V; 10 µg/mL). As contrações mantidas foram inibidas pela pré-
incubação da preparação com TTX e PPADS. W: lavagem. .................................. 109
Figura 18. Atividade do veneno de T, bahiensis (10 µg/mL) na curva
concentração-resposta a noradrenalina em porção epididimal do canal
deferente de ratos. curvas concentração-resposta a noradrenalina foram realizadas
em músculos pré-incubados ou não com TTX (200nM) (A). Em músculos pré-
incubados com TTX, o veneno não foi capaz de produzir uma contração e não teve
atividade sobre a curva concentração-resposta (B). Por outro lado, em preparações
não pré-incubadas com TTX, o veneno promoveu uma marcante contração na
preparação impedindo a resposta dependente da concentração dos músculos a
noradrenalina (C). Os pontos representam a média ± EPM de 3-4 experimentos. . 110
Figura 19. Atividade do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL) na curva
concentração-resposta ao ATP em porção prostática do canal deferente de
ratos. As curvas concentração-resposta ao ATP foram realizadas em músculos pré-
incubados ou não com TTX (200nM) (A). Em preparações não pré-incubadas com
TTX, o veneno promoveu uma marcante contração na preparação impedindo a
resposta dependente da concentração dos músculos ao ATP (B). Os pontos
representam a média ± EPM de 4-7 experimentos ................................................. 111
Figura 20. Atividade do veneno de T. bahiensis no potencial de membrana em
repouso. Os potenciais foram registrados por meio de microeletrodos inseridos
intracelularmente nas células musculares esqueléticas do hemidiafragma de
camundongos (A) e lisas da região prostática de canal deferente de ratos (B). O
veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu despolarização em ambas preparações
nos primeiros 30 min em NFD e 60 min em canal deferente. Os pontos representam a
média ± EPM de 6-11 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle. ............. 113
Figura 21. Atividade do veneno bruto de Tityus bahiensis nos Potenciais de
Placa terminal em miniatura (MEPPs) em preparações nervo frênico – diafragma
(NFD). Os potenciais foram registrados em NFD por meio de microeletrodos. O
veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu um aumento na frequência dos MEPPs,
sem alterar o tempo de despolarização, repolarização e amplitudes. B) Curvas
gaussianas da relação entre frequência e amplitude. Os pontos representam a média
± SEM de 8-11 experimentos. A equação gaussiana foi utilizada para plotar as linhas.
*p<0.05 comparado ao tempo zero. ........................................................................ 115
Figura 22. Atividade do veneno de Tityus bahiensis nos Potenciais de Placa
Terminal (EPPs). Os potenciais foram registrados por meio de microeletrodos em
preparações nervo frênico - diafragma submetidas à técnica de cut muscle. A) O
veneno bruto de T. bahiensis promoveu um aumento na amplitude dos EPPs, sem
afetar o tempo de despolarização e repolarização. B) Múltiplos EPPs por estímulo
foram observados após 90 min de incubação com o veneno. Os pontos representam
a média ± EPM de 6-11 experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal. ..... 117
Figura 23. Relação entre frequência e distribuição dos potenciais excitatórios
juncionais espontâneos em situação controle. Os potenciais pós-juncionais
espontâneos da porção prostática do canal deferente foram registrados por meio de
microeletrodos intracelulares. Os resultados são expostos em forma gráfica (painel A)
e traçado representativo do registro (B). As barras representam a media ± EPM de 6
experimentos. A equação gaussiana foi utilizada para plotar a linha. ..................... 118
Figura 24. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis (0,3
µg/mL) nos potenciais juncionais excitatórios espontâneos (SEJP). Os potenciais
pós-juncionais espontâneos da porção prostática do canal deferente biseccionados
foram registrados por meio de microeletrodos intracelulares antes (A; basal) e após 5
(B), 15 (C), 30 (D), 60 (E) e 90 (F) min a adição do veneno. Note que o veneno
promoveu um aumento na amplitude e frequência dos potenciais, especialmente nos
primeiros 15 minutos de incubação. Registros representam 4-6 experimentos. ..... 119
Figura 25. Atividade do veneno de Tityus bahiensis (0,3 µg/mL) nos potenciais
de ação em nervo ciático isolado de camundongos. Os resultados são expostos
em forma gráfica (A) e traçado representativo do registro (B). Note que o veneno
promoveu redução na amplitude dos potenciais de forma dependente do tempo, e
retardou a repolarização do nervo. Também foi observada alteração no tempo de
despolarização, que se tornou mais lenta. Os pontos representam a media ± EPM de
5 experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal. ......................................... 121
Figura 26. Onda perineural obtida de preparações triangular sterni (transverso
do tórax) de camundongos em situação controle. As deflexões negativas estão
associadas as correntes de influxo de Na+ (primeiro pico negativo) e principalmente
efluxo de K+ (segundo pico negativo). ..................................................................... 122
Figura 27. Efeito do veneno de Tityus bahiensis nas formas de ondas
perineurais. A) O veneno (0,3 µg/mL) causou bloqueio significativo em ambos
componentes das formas de ondas, sendo o componente referente as correntes de
K+ (segundo pico) afetado primeiramente que os referentes ao Na+ (primeiro pico). B)
Registros representativos dos registros antes (em preto) e após 45 (cinza) e 90 (azul)
min de incubação. Os pontos representam a media ± EPM de 5 experimentos. *p<0.05
comparado com os valores basais. ......................................................................... 123
Figura 28. Efeitos da tetrodoxina (TTX) no retardo da repolarização induzido pelo
veneno de T. bahiensis. A) Área sob a curva do segundo componente das formas
de ondas foi significativamente aumentada após incubação com veneno (0,3 µg/mL),
sendo tal efeito revertido pela tetrodotoxina (TTX, 20 nM). B e C) Registros
representativos antes (preto), e aos 45 (cinza escuro), 60 (cinza claro) e 90 (azul
escuro) min de incubação com o veneno; Note a presença de múltiplas formas de
ondas por estímulo (↑), que aumentaram conforme o passar do tempo de incubação
se fundirem aos 90min (azul escuro); esse retardo na repolarização foi revertido por
TTX (azul claro). As barras representam a média ± EPM de 5 experimentos. *p<0.05
comparado com os valores basais; #p<0.05 comparado com o valor de 90 min de
incubação. ............................................................................................................... 124
Figura 29. Atividade do veneno de T. bahiensis nas correntes de sódio em ND7-
23 (wild type). A) A curva da relação entre a densidade das correntes e o potencial
de comando demonstram que o veneno (10 µg/mL) deslocou a curva para potenciais
mais negativos. B) O veneno promoveu um aumento significativo na densidade do
pico das correntes de sódio. Os pontos e barras representam a média ± EPM de 15 a
18 experimentos. *p<0,05 comparado com controle. .............................................. 126
Figura 30. Atividade do veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) na condutância de
canais de sódio em células ND7-23 (wild type). As curvas de Bolzmann das médias
normalizadas das condutâncias foram plotadas contra o potencial de comando em
experimentos controle (Inclinação 9 ± 0.72) e após incubação com o veneno
(Inclinação 9.7 ± 0.43). O veneno promoveu um deslocamento à esquerda da curva
de ativação. Os pontos e barras representam a média ± EPM de 15 a 18 experimentos.
*p<0.05 comparado com o controle......................................................................... 127
Figura 31. Atividade do veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) no movimento
intracelular de Ca2+ ND7-23 (wild type). O monitoramento foi realizado por meio de
células carregadas com marcador fluorescente sensível ao Ca2+, Fluo-4AM (N
controle = 11; N tratado = 22 células). O veneno promoveu o aumento da concentração
de cálcio no interior dos neurônios. Escala de fluorescência (do menor para o maior):
azul claro < azul escuro < verde < amarelo < vermelho. Magnificação: 100x. ........ 128
Figura 32. Imagens representativas do efeito do veneno de T. bahiensis (10
µg/mL) no movimento intracelular do cálcio em somas dos neurônios do GRD e
em miócitos do triangular sterni. As mudanças na fluorescência após a adição do
veneno refletem o aumento do conteúdo intracelular de cálcio. Essas mudanças foram
particularmente marcantes em neurônios (↑) mas não muito aparentes em fibras
musculares. Escala de fluorescência (do menor para o maior): azul claro < azul escuro
< verde < amarelo < vermelho. Magnificação: neurônios 100x; células musculares:
400x ........................................................................................................................ 129
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Isoformas das subunidades α dos canais de sódio dependentes de
voltagem de mamíferos, sua principal localização, sensibilidade a TTX e
canalopatia associada (149,153,154). .................................................................... 51
Tabela 2. Frequência dos Potenciais de Placa Terminal em miniatura (MEPP). A
incubação dos hemidiafragmas com o veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) levou a um
aumento na liberação espontânea de quantas de acetilcolina (ACh). ..................... 114
Tabela 3. Influência da concentração de cálcio na facilitação máxima da
amplitude do Potenciais de Placa Terminal (EPP). As preparações NFD foram
incubadas com solução Tyrode usual de cálcio (1,8 mM) ou níveis baixos do mesmo
(0,4 mM). Foram avaliadas as amplitudes dos EPPs em diferentes tempos (zero a 90
min). A amplitude máxima (Amax, % da resposta em relação a amplitude em 90 min)
foi avaliada pela adição de 3’4-diamonipiridina (DAP) na preparação. ................... 116
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
A
ACh: Acetilcolina
AChE: Acetilcolinesterase
ALP: alanina aminotransferase
AM (Fluo-4 AM): acetoxymethyl ester
ANOVA: Análise de variância
AST: Aspartato aminotransferase
ATP: Trifosfato de adenosina, adenosine 5’-triphosphate
B
BCP: Músculo biventer cervicis de pintainho
BoNT-A: Toxina botulínica tipo A
C
CaCl2: Cloreto de cálcio
CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
CEUA: Comitê de Ética no Uso de Animais
CO2: Dióxido de carbono
CPK: Creatinofosfoquinase
C6H12O6: Glicose
D
DMSO: Dimetilsulfóxido
dTC: d-Tubocurarina
E
EDL: Músculo extensor Longo dos dígitos - extensor digitorum longus
EGTA: ácido egtálico, egtazic acid
EPM: Erro padrão da média
EPP: Potencial de placa terminal, do inglês end-plate potential
F-G
FDA: Food and Drug Administration
GRD: Gânglio da raíz dorsal
H-J
HEPES: Ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinaetanosulfónico, hydroxyethyl
piperazineethanesulfonic acid
HBSS: Solução balanceada de Hanks, Hank’s balanced salt solution
IFN γ: Interferon- γ
IL: Interleucina
JNM: Junção neuromuscular
K-L
KCl: Cloreto de potássio
kHz: Quilohertz
KH2PO4: Fosfato monopotássico
KOH: Hidróxido de potássio
KTx: Toxinas de canais de potássio
LD: Lactato deidrogenase
M
MEPP: Potencial de placa terminal e miniatura, do inglês miniature end-plate
potential
mg: Miligrama
MgCl2: Cloreto de magnésio
MgSO4: Sulfato de magnésio
Min: Minuto
mL: Mililitro
mM: Milimolar
mm: Milímetro
ms: Milissegundos
mV: Milivolts
MΩ: Mega-Ohm
N - O
nAChR: Receptor nicotínico de acetilcolina
NaCl: Cloreto de Sódio
NaHCO3: Bicarbonato de sódio
NaH2PO4: Fosfato de sódio
NaOH: Hidróxido de sódio
Nav: Canal de sódio dependente de voltagem
NFD: Preparação nervo frênico - Diafragma
nM: Nanomolar
NO: Oxido nítrico, do inglês nitric oxide
NOR: Noradrenalina
O2: Oxigênio
P
pA: Pico-Ampere
PAF: Fator de ativação plaquetária, do inglês platelet-activating factor
PEG: Polietilenoglicol
pF: Pico-Farad
PPADS: pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic acid
R
RNS: Espécies reativas de nitrogênio, do inglês reactive nitrogen species
ROS: Espécies reativas de oxigênio, do inglês reactive oxygen species
Rpm: Rotações por minuto
RPMI: Meio de cultura “Roswell Park Memorial Institute”
RyR: Receptores de rianodina, do inglês ryanodine receptor
S
SARA: Síndrome da Angústia Respiratória Aguda
SBCAL: Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
SEJP: Potencial juncional excitatório espontâneo, do inglês spontaneous
excitatory junction potential
SIPBS: Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences
SNAP-25: Proteína de 25kDa associada a sinaptossoma
SNARE: Proteína de ligação ao fator solúvel sensível à N-Etilmaleimida
SNC: Sistema nervoso central
SRIS: Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica
T - V
T. bahiensis: Tityus bahiensis
TEA-Cl: Cloreto de tetrametilamônio, Tetraethylammonium Chloride
TNF- α: Fator de necrose tumoral-α, do inglês tumor necrosis factor- α
TGO: transaminase glutâmico oxalacético
TGP: transaminase glutâmico pirúvica
TRPV1: Receptores de Potencial Transitório Tipo 1
TTX: Tetrodotoxina
UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas
VAMP: Proteínas de membrana associadas a vesículas, Vesicle-associated
membrane proteins
Outros
α-LTX: α-Latrotoxina
µg: Micrograma
µM: Micromolar
3’4 DAP: 3,4-Diaminopiridina.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 37
1.1 Biologia e distribuição geográfica dos escorpiões ................................. 37
1.2 Epidemiologia do escorpionismo ................................................................. 39
1.2.1 Observações clínicas ................................................................................ 39
1.2.1.1 Sintomas locais ................................................................................... 40
1.2.1.2 Sintomas sistêmicos ........................................................................... 41
Efeitos no sistema nervoso central ....................................................... 41
Efeitos somáticos ..................................................................................... 41
Efeitos autonômicos ................................................................................ 42
Efeitos cardiovasculares ......................................................................... 42
Efeitos gastrointestinais .......................................................................... 44
Efeitos hepatorenais ................................................................................ 44
Complicações metabólicas ..................................................................... 45
Resposta inflamatória ............................................................................. 45
1.3 Venenos escorpiônicos ................................................................................... 46
1.3.1 Peptídeos neurotóxicos ............................................................................ 46
1.3.1.1 Toxinas peptídicas de cadeia curta ................................................. 47
Toxinas de canais de potássio (KTx) ................................................... 47
Toxinas de canal de cálcio sensíveis a rianodina .............................. 48
Toxinas de canal de cálcio dependentes de voltagem do tipo T ..... 48
1.3.1.2 Toxinas peptídicas de cadeia longa ................................................ 48
Os canais de sódio dependentes de voltagem ................................... 49
Toxinas do tipo α (α-toxinas).................................................................. 52 Toxinas do tipo β (β-toxinas).................................................................. 52
1.3.2 Venenos de escorpião como ferramentas para estudo e
desenvolvimento de novas terapias ................................................................................ 53
1.4 Os Tityus sp. do Brasil..................................................................................... 55
1.4.1 Tityus bahiensis (Perti, 1834) .................................................................. 55
1.4.1.1 Estudo das frações isoladas ............................................................. 58
1.5 Relevância deste trabalho .............................................................................. 59
2. OBJETIVOS............................................................................................. 61
2.1 Objetivos gerais ................................................................................................. 61
2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 61
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 63
3.1 Veneno bruto de Tityus bahiensis, reagentes e linhagem celular ....... 63
3.2 Animais ................................................................................................................ 64
3.3 Desenho experimental ..................................................................................... 64
3.4 Ensaios miográficos ......................................................................................... 66
3.4.1 Junção neuromuscular.............................................................................. 66
3.4.1.1 Preparação extensor digitorum longus de camundongo .............. 68
3.4.1.2 Preparação nervo-frênico diafragma de camundongo ................. 69
3.4.1.3 Preparação biventer cervicis de pintainho ...................................... 70
3.4.2 Junção neuroefetora ................................................................................. 71
3.4.2.1 Preparação de canal deferente de ratos ......................................... 73
3.5 Estudo eletrofisiológico em tecidos ............................................................ 75
3.5.1 Potencial de membrana em repouso ..................................................... 75
3.5.1.1 Músculo esquelético ........................................................................... 75
3.5.1.2 Músculo liso ......................................................................................... 76
3.5.2 Potenciais pós-juncionais ......................................................................... 77
3.5.2.1 Potencial de placa terminal em miniatura (MEPPs) ...................... 77
3.5.2.2 Potencial de placa terminal (EPP) ................................................... 78
3.5.2.3 Potencial excitatório juncional espontâneo (SEJP)....................... 79
3.5.3 Potenciais pré-sinápticos.......................................................................... 80
3.5.3.3 Potencial de ação nervoso ................................................................ 80
3.5.3.4 Formas de ondas perineurais ........................................................... 81
3.6 Cultura de células neuronais ......................................................................... 82
3.6.3 Cultura celular de neuroblastoma ........................................................... 82
3.6.4 Cultura primária de neurônios do GRDs ................................................ 83
3.7 Eletrofisiologia em célula isolada - Whole cell patch-clamp ................. 84
3.7.3 Análise dos dados ..................................................................................... 86
3.7.3.3 Curva da relação entre corrente e voltagem (Curva I/V) ............. 86
3.7.3.4 Condutância macroscópica ............................................................... 87
3.7.3.5 Curva de ativação (G/Gmax) ............................................................ 88
3.8 Imagem de cálcio .............................................................................................. 89
3.9 Análise Estatística ............................................................................................ 90
4. RESULTADOS ........................................................................................ 91
4.1 Ensaios miográficos ......................................................................................... 91
4.1.1 Junção neuromuscular.............................................................................. 91
4.1.1.1 Extensor digitorum longus de camundongo (EDL) ....................... 91
4.1.1.2 Nervo frênico - diafragma de camundongo (NFD) ........................ 93
4.1.1.3 Biventer cervicis de pintainho (BCP) ............................................... 98
4.1.2. Junção neuroefetora (canal deferente de rato) ................................. 104
4.2 Estudos eletrofisiológicos em tecidos inteiros ...................................... 112
4.2.1 Potencial de membrana em repouso. .................................................. 112
4.2.2 Potenciais pós-juncionais ....................................................................... 114
4.2.2.1 Potencial de placa terminal em miniatura (MEPPs) .................... 114
4.2.2.2 Potencial de placa terminal (EPP) ................................................. 116
4.2.2.3 Potencial excitatório juncional espontâneo (SEJPs)................... 118
4.2.3 Potenciais pré-sinápticos........................................................................ 120
4.2.3.2 Potencial de ação nervoso em nervo ciático ................................ 120
4.2.3.2 Formas de ondas perineurais ......................................................... 122
4.3 Eletrofisiologia em célula isolada - Whole cell patch-clamp ............... 125
4.4 Imagem de cálcio ............................................................................................ 127
5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 130
6. SUMÁRIO DE CONCLUSÕES .......................................................... 140
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................... 141
ANEXOS .......................................................................................................... 179
37
1. INTRODUÇÃO
1.1 Biologia e distribuição geográfica dos escorpiões
Escorpiões são artrópodes quelicerados (Filo Arthropoda, Subfilo
Quelicerata), membros da classe Arachnida e pertencentes à ordem Scorpiones. É o
aracnídeo mais antigo conhecido, cujo fóssil, encontrado nas colinas de Pentland
(sudoeste de Edimburgo, Escócia), data o meio do Período Siluriano há cerca de 430
milhões de anos (1,2). A maioria das grandes mudanças morfológicas nestes animais
ocorreram durante o Paleozoico, quando da sua transição do ambiente aquático para
terrestre (3). Poucas alterações morfológicas ocorreram desde que se tornaram
completamente terrestres há 340 milhões de anos (4).
Tais invertebrados peçonhentos têm seus corpos compostos por dois
segmentos principais, sendo estes o prossoma (ou cefalotórax) que compreende a
porção cefálica e apêndices articulados, e o opistossoma (ou abdômen) que por sua
vez é subdividido em mesossoma e metassoma (Figura 1). Este último segmento inclui
a cauda erétil, que culmina no telson onde se localiza o aparato produtor da peçonha,
que consiste de um par de glândulas exócrinas e um acúleo (aguilhão) (5). Embora
exista a diferença conceitual entre animais peçonhentos (aqueles que possuem
aparato especializado para inoculação, como os escorpiões) e venenosos (aqueles
que produzem veneno mas não possuem aparelho inoculador e causam
envenenamento de forma passiva, como taturanas e sapos), assim como peçonha
(produzida pelos animais peçonhentos) e veneno (produto dos animais venenosos,
este trabalho adotou o termo veneno para tratar da secreção tóxica produzida pelos
escorpiões.
Atualmente estão descritas cerca de 2417 espécies de escorpiões em todo
o mundo (6), no entanto, um limitado número de espécies - provavelmente menos de
50 e em sua grande maioria pertencentes à família Buthidae – podem vir a causar
envenenamentos graves a humanos e, em caso de acidentes, exigem intervenção
médica (7).
38
Figura 1. Anatomia externa dos escorpiões. O corpo é dividido em prossoma (de onde surgem os apêndices articulados) e opistossoma que, por sua vez, se divide em mesossoma (tronco) e metassoma (cauda). Ilustração própria.
Atualmente estão descritas cerca de 2417 espécies de escorpiões em todo
o mundo (6), no entanto, um limitado número de espécies - provavelmente menos de
50 e em sua grande maioria pertencentes à família Buthidae – podem vir a causar
envenenamentos graves a humanos e, em caso de acidentes, exigem intervenção
médica (7).
Tityus sp. é o mais numeroso dentre os gêneros, abrigando 220 espécies
(6). Rotulado como do “Novo Mundo” (“New World Scorpions”), é exclusivo às
Américas do Sul e Central (incluindo o Caribe), sendo que a maior diversidade se
encontra no continente sul americano (8).
Dentre as 160 espécies de escorpiões que se distribuem por todo o
território brasileiro, há registro da ocorrência de 57 espécies de Tityus (9) - neste
39
gênero também se incluem todas as espécies de relevância toxicológica do país, mas
apenas Tityus bahiensis, Tityus serrulatus, Tityus obscurus e Tityus stigmurus são de
importância clínica e podem levar a envenenamentos graves e letais (10,11); também
foram reportados acidentes por T. metuendus, T. silvestres, T. brazilae, T. confluens,
T. costatus, T. fasciolatus, T. neglectus, T. matogrossensis (12); entretanto, a
gravidade e frequência destes são muito inferiores às quatro primeiras.
1.2 Epidemiologia do escorpionismo
Envenenamento por escorpiões é um grande problema de saúde em todo
o mundo, sendo reportados mais de 1,2 milhões de casos anualmente. Embora o
escorpionismo ocorra em quase todos os continentes, sua incidência e gravidade são
maiores em países em desenvolvimento como norte do Saara, sul e leste África,
Oriente médio, sul da Índia, México, Brasil e na bacia amazônica (Guianas, Venezuela
e norte Brasil) (13).
No Brasil, o número de casos reportados aumentou 322% nos últimos 10
anos, chegando a mais de 124 mil casos em 2017 e são a primeira causa de
envenenamentos por animais venenosos no país. Ainda que a mortalidade seja menor
que acidentes causados por serpentes, o risco de morte é existente (14).
1.2.1 Observações clínicas
Embora existam notáveis diferenças zoológicas, genotípicas e fenotípicas
entre as diversas espécies de escorpiões ao redor do mundo – até mesmo entre os
membros da família Buthidae – e apesar dos sintomas observados nos
envenenamentos humanos serem similares, em algumas espécies é possível se
observar diferenças na sintomologia dos envenenamentos. Por exemplo, acidentes
por Centruroides e Parabuthus sp. promovem inicialmente toxicidade neuromuscular
40
(15); venenos de Androctonus, Buthus e Mesobuthus sp. levam principalmente à
cardiotoxicidade (16,17); e vítimas de acidentes por Tityus obscurus reportam uma
típica sensação de “choque elétrico” (18,19).
As manifestações clínicas após a picada de escorpião são muitas vezes
classificadas como “Síndrome da Picada de Escorpião” (do inglês Scorpion sting
syndrome) (20), tipicamente descrita por efeitos locais, embora menos de um terço
das vítimas venha a desenvolver manifestações sistêmicas. Os envenenamentos
sistêmicos devem ser tratados como urgência, uma vez que as vítimas se encontram
em risco de morte. Embora os casos de morte sejam raros, estes estão comumente
relacionados a complicações cardiovasculares como hipotensão, choque
cardiogênico, disfunção e lesão cardíaca e edema pulmonar (12,21,22).
Acidentes que evoluem a sistêmicos são de grande risco especialmente
para crianças, estimando-se que a taxa de mortalidade infantil seja cerca de dez vezes
maior que em adultos (13,23).
1.2.1.1 Sintomas locais
A maioria das picadas resultam apenas em reações locais. O principal
sintoma local é dor imediata, descrita como sensação ardente que tende a irradiar ao
longo do membro afetado; tal sintoma é normalmente atribuído a estimulação
persistente de canais nociceptivos como os receptores de potencial transitório
vanilóide tipo 1 (TRPV1) (24). Devido à dor intensa, taquicardia transiente,
hipertensão e suor também podem estar presentes.
Além da dor, também se observa edema, parestesia (formigamento,
dormência ou queimação), espasmos musculares, hiperemia (aumento do fluxo de
sangue local), eritema e inflamação local.
Embora não seja observada lesão tecidual como necrose, pequenas
marcas vermelhas podem ser observadas no exato local onde o telson fora introduzido
(25–27).
41
1.2.1.2 Sintomas sistêmicos
Envenenamentos sistêmicos são caracterizadas por excitação neuronal e
massiva liberação de neurotransmissores induzindo efeitos centrais, neuromusculares
(efeitos nos nervos somáticos e cranianos) e autonômicos (tanto adrenérgico quanto
colinérgico) (26).
Efeitos no sistema nervoso central
Estudos clínicos de todo o mundo têm apontado a presença de efeitos
centrais como edema, isquemia e acidente vascular cerebral isquêmico, neuropatia
óptica, hemiplegia, paralisia do nervo facial, convulsão e Síndrome de encefalopatia
posterior reversível (27–38). Os mecanismos envolvidos em tais efeitos continuam em
debate, mas alguns estudos sugerem que tais efeitos são produzidos indiretamente,
uma vez que os componentes do veneno são incapazes de ultrapassar a barreira
hematoencefálica (39). Por outro lado, em indivíduos muito jovens cuja barreira
hematoencefálica não é totalmente formada, o veneno pode exercer ação direta no
sistema nervoso central (40,41).
Efeitos somáticos
Efeitos neuromusculares diretos e indiretos provocados pelo
envenenamento incluem mioclonia (contração involuntária), ataxia (falta de
coordenação voluntária dos movimentos musculares), disartria (desordem de fala
causado por fraqueza muscular), fasciculações, agitação psicomotora, tremores,
paralisia, contrações musculares, hiperreflexia (reflexos hiper-responsivos), agitação,
distúrbios visuais e nistagmo (movimento involuntário dos olhos) (18,19,26,35,36,42–
44).
Algumas espécies de escorpiões como Tityus obscurus também podem
causar manifestações neuromusculares peculiares, como sensação de “choque
elétrico” a qual é relatada minutos após a picada (18,19,43).
42
Efeitos autonômicos
A hiperestimulação parassimpática produzida pela liberação de acetilcolina
pode desencadear hipersalivação, sudorese profusa (suor excessivo), lacrimação,
miose, diarreia, vômito, bradicardia, vasodilatação, hipotensão, aumento das
secreções brônquicas, broncoespasmos e priapismo (ereção persistente
acompanhada de dor) (45). Por outro lado, manifestações simpáticas, produzidas pela
liberação massiva de noradrenalina, estão também presentes e incluem taquicardia,
hipertensão, midríase, irritabilidade, hiperglicemia, agitação e inquietação.
Quando comparados aos efeitos simpáticos, os parassimpáticos são
menos graves e tendem a ocorrer logo após a picada, contribuindo para o prejuízo
respiratório. Em contraste, os efeitos simpáticos são persistentes e são os
responsáveis pela maioria dos efeitos graves observados nos estágios tardios dos
envenenamentos sistêmicos, que culminam em insuficiência respiratória, insuficiência
múltipla de órgãos, coma e morte (26).
Efeitos cardiovasculares
Os efeitos cardiovasculares são as mais importantes complicações do
escorpionismo associados a liberação massiva de catecolaminas. O mecanismo
responsável por tais manifestações ainda é controverso e pobremente estudado
(46,47); alguns pesquisadores acreditam que são secundários aos efeitos vasculares
periféricos e cardíacos (48,49) enquanto outros consideram ser causado por sintomas
associados à Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SRIS) (50).
Dentre os efeitos cardiovasculares, o edema pulmonar é o mais comum
(46,51) e contribui com aproximadamente 25% da mortalidade (52,53). Este efeito
vem sendo relacionado a i) origens cardíacas como alterações na pressão pulmonar,
ii) origens não cardíacas como aumento na resistência vascular pulmonar, na
permeabilidade da membrana alveolocapilar e na agregação plaquetária; ou ainda iii)
anormalidades reversíveis no movimento das paredes do ventrículo esquerdo
(48,49,54–57). O tempo entre o acidente e a administração do antiveneno, a dose de
peçonha injetada e a intensidade dos efeitos adrenérgicos têm grande influência na
predominância dos fatores cardíacos e os não cardíacos (58).
43
Os danos cardíacos provocados pelos venenos de escorpião incluem
alterações no eletro e ecocardiograma, elevação das enzimas cardíacas (marcadores
de necrose miocárdica) como a creatinofosfoquinase (CPK), creatinoquinase-MB e
lactato deidrogenase (LD) (49,59–65). Tais efeitos são atribuídos a i) liberação
massiva de catecolaminas (49,53) que se assemelha a cardiopatias induzidas por
catecolaminas; ii) efeito direto nos cardiomiócitos (47,66,67), e/ou iii) ação de
citocinas, como evidenciada em pacientes admitidos como SRIS (50,68–70) por
apresentar similaridades à depressão miocárdica induzida pela sepse (71–73).
Por meio da redução da atividade da Na+/K+-ATPase, Do aumento da
liberação de catecolaminas dos neurônios, gânglios e adrenal, ou mesmo devido a
efeitos de citocinas e/ou neuropeptídio Y nos vasos coronários (74), os venenos de
escorpiões podem levar ao aumento na demanda de oxigênio pelo miocárdio, que
está com o suprimento de sangue comprometido (75). Tal aumento leva a isquemia
cardíaca, facilitação a agregação plaquetária e consequentemente trombose (76). A
análise histopatológica de dois casos de miocardite fatal por escorpionismo revelaram
um quadro misto de miocardite tóxica (inflamação nas células do miocárdio) e
miocitólise coagulativa (necrose com bandas de contração) semelhante à observada
na cardiomiopatia induzida por catecolamina, a Síndrome de Takotsubo (77).
É comum ocorrerem alterações no eletrocardiograma após escorpionismo
sistêmico. Os tipos de arritmias mais observados são bradicardia sinusal e taquicardia
ventricular. Entretanto, também foram reportados i) a elevação ou depressão do
segmento ST e presença de ondas Q sugerindo infarto miocardial, ii) distúrbios no
ritmo como dissociação atrioventricular, bloqueio sinoatrial e taquicardia atrial, iii)
fibrilação e extrassístole ventricular e iv) bloqueio do ramo cardíaco (56,78–83).
Embora menos comum em envenenamentos mais graves, a hipertensão
pode preceder a hipotensão conforme o decorrer do envenenamento, o que
normalmente requisita intervenção como vasopressores, fluidos e ressuscitação (26).
Essa complicação pode resultar em edema pulmonar (principal causa de óbitos) e
falência cardíaca que pode evoluir a um choque cardiogênico e morte (77,84,85).
44
Efeitos gastrointestinais
Náusea, vômitos, distensão abdominal, alterações no esvaziamento
gástrico, dor abdominal, aumento ou retardo da motilidade intestinal e diarreia são
observados durante envenenamento por escorpião (13,27,45). Todos esses efeitos
têm sido relacionados a liberação massiva de catecolaminas.
Pancreatite aguda, edematosa, hemorrágica e necrótica também foram
reportadas (25,84,86–89). Muitos autores acreditam que tais efeitos ocorram devido
ao i) efeito local e direto no pâncreas (90,91); ii) isquemia gastrointestinal e acidose
lática causada por liberação de catecolamina (69); iii) inibição da conversão da
angiotensina levando a acumulação da bradicinina (41); e/ou iv) hiperestimulação do
sistema nervoso parassimpático no pâncreas (26,92).
Efeitos hepatorenais
O fígado e rim podem também ser afetados nos estágios tardios do
envenenamento sistêmico. As principais lesões reportadas são edema, necrose,
hemorragia e infiltração de células inflamatórias, que resultam em hepato e
nefrotoxicidade (93–96).
É frequente alterações no níveis plasmáticos i) das enzimas
citoplasmáticas aspartato aminotransferase (AST; também chamada de transaminase
glutâmico oxalacético, TGO) e alanina aminotransferase (ALP; também conhecida
como transaminase glutâmico pirúvica, TGP), indicando hepatotoxicidade (94,97–99)
e ii) ureia e ácido úrico, provavelmente devido a distúrbios na função renal (100).
Devido ao aumento na permeabilidade vascular nos rins e fígado e
consecutivo infiltrado inflamatório, é comumente observado um aumento na produção
de óxido nítrico (NO, do inglês nitric oxide) e de espécies reativas de oxigênio (ROS,
do inglês reactive oxigen species) e de nitrogênio (RNS, do inglês reactive nitrogen
species) (99,101–103). Essas alterações são concomitantes com o aumento da
peroxidação lipídica nos tecidos hepáticos e renais, que podem contribuir com a
amplificação da resposta inflamatória e danos na membrana celular (95,99,104,105).
O dano renal agudo normalmente requisita o uso de diálise.
45
Complicações metabólicas
Hiperglicemia é uma manifestação comum no escorpionismo e tem sido
relacionada ao aumento na gliconeogênese e na resistência à insulina assim como o
aumento nos níveis de hormônios tireoidianos e hormônios contra-regulatórios
(cortisol e glucagon). O nível reduzido de insulina e aumento da glicose sérica
parecem ser dependentes da gravidade da intoxicação (53,92,106–108). Tais
disfunções parecem agravar a disfunção do ventrículo esquerdo ao induzir a secreção
de endotelina-1 pelas células do miocárdio, causando acumulação de cálcio nos
miócitos e bloqueio da contratilidade do miocárdio (109), além de estimular as
plaquetas e agravar a isquemia pré-existente (110).
Também for a reportados hipertermia e hipotermia, que agravam a
toxicidade (40).
Resposta inflamatória
A resposta inflamatória que acompanha durante envenenamentos por
escorpião é desencadeada pela liberação de citocinas, cininas, eicosanoides, fator de
ativação plaquetária (PAF, do inglês platelet-activating factor) e NO. Tais mediadores
parecem estar direta ou indiretamente relacionados às manifestações reportadas,
como Síndrome da Angústia Respiratória Aguda (SARA), SRIS, falência múltipla de
órgãos, dano tecidual, choque e morte (111). Venenos de escorpiões estimulam o eixo
neuroendócrino-imunológico por meio da liberação de catecolaminas,
corticosteroides, bradicinina e prostaglandina, que por sua vez, induzem a produção
de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6, TNF-α e IFN-γ e anti-inflamatória como
IL-10 (50,69,111–122).
Enquanto os mediadores pró-inflamatórios desempenham um importante
papel na manifestação inflamatória sistêmica, choque, falência múltipla dos órgãos e
mortalidade nos pacientes em estado crítico (123,124), a citocina anti-inflamatória é
crucial para a inibição do processo inflamatório; porém; sua produção extensiva pode
resultar em imunossupressão e falha na depuração do veneno, tendo efeitos
igualmente deletérios (120,125–127). Portanto, o balanço entre ambos mediadores
determina o grau e extensão da inflamação (121,128).
46
Venenos de diferentes espécies podem induzir diferentes padrões na
resposta inflamatória. Tityus serrulatus e Centruroides noxius são caracterizados pelo
rápido aumento de citocinas pro-inflamatórias, especialmente IL-1 e IL-6
(50,69,114,118,119,121,122) enquanto acidentes causados por Leiurus
quinquestriatus e Tityus serrulatus promovem um rápido aumento do nível de IL-8 que
pode ser responsável pelo edema e acidente vascular cerebral isquêmico
(115,116,119). Por outro lado, Tityus serrulatus, Androctonus australis hector e
Centruroides noxius aumentam a produção da citocina anti-inflamatória IL-10 (129).
1.3 Venenos escorpiônicos
Escorpiões desenvolveram as glândulas de veneno e o sistema de
inoculação para defesa e captura de suas presas. Esses venenos são uma complexa
mistura compreendendo uma ampla variedade de componentes orgânicos e
inorgânicos.
Os venenos de escorpiões podem ser compostos por substâncias não-
proteicas (muco, nucleotídeos, amino ácidos livres, histamina, serotonina, triptamina,
glicosaminoglicanos, sulfato de condroitina, ácido hialurônico, hexosaminas livres,
sais, água, entre outras) e substâncias proteicas como enzimas (fosfolipases,
acetilcolinesterases, hialuronidades, lipases, fosfatases alcalinas, gelatinases e outras
enzimas proteolíticas) e peptídeos de baixo peso molecular, chamados de peptídeos
neurotóxicos (130–135).
1.3.1 Peptídeos neurotóxicos
Do ponto de vista toxicológico e clínico, os peptídeos neurotóxicos são os
componentes mais importantes, os quais apresentam grande afinidade e
especificidade por canais iônicos de vertebrados e invertebrados, sendo responsável
47
pela liberação de neurotransmissores, conforme mencionado anteriormente (136–
138).
Neurotoxinas de escorpiões são classificadas de acordo com sua estrutura,
modo de ação e local de ligação aos canais (132,139,140). Tais componentes são
divididos por seu tamanho em peptídeos de cadeia curta (~29 a 43 resíduos) e
peptídeos de cadeia longa (~58 a 76 resíduos). As toxinas de cadeia curta bloqueiam
seletivamente os canais de potássio e cálcio em membranas excitáveis enquanto os
de cadeia longa interferem com o influxo de sódio, sendo estes subdivididos em
toxinas do tipo α e tipo β (141).
1.3.1.1 Toxinas peptídicas de cadeia curta
Toxinas de canais de potássio (KTx)
Os canais de potássio, encontrados em praticamente todos os tecidos
excitáveis, são a maior e mais diversa classe de canais iônicos. Podem ser
amplamente divididos em dependentes de voltagem ou regulados por ligantes sendo
ambas as classes-alvo de um grande número de toxinas bloqueadoras de canais de
potássio (KTx). Na realidade, venenos de escorpiões vêm sendo amplamente
empregadas como ligantes a canais de potássio. Dos 400 ligantes catalogados no
“UniPro Knowledgebase”, 250 provém de peçonha de escorpiões; (142).
Considerando-se a grande variedade de canais de potássio e o vasto
número de toxinas que interagem com estes, as KTx foram agrupadas em seis famílias
(α-KTx, β-KTx, γ-KTx, toxinas- κ, toxinas- δ e toxinas-λ) (4,139), sendo cada família
subdividida em diversas outras famílias. Todas as toxinas conhecidas agem
bloqueando o poro do canal iônico (143).
Por serem frequentemente ativas em concentrações nanomolares (ou até
mesmo sub-nanomolares) e possuírem diferentes afinidades a diferentes subtipos dos
canais de potássio (144), essas toxinas têm considerável valor científico.
48
Toxinas de canal de cálcio sensíveis a rianodina
Nos músculos estriados (cardíado e esquelético) e lisos, os receptores de
rianodina, localizados no retículo sarcoplasmático, desempenham grande importância
biológica. São envolvidos nos mecanismos de contração muscular uma vez está
associados à despolarização muscular e a liberação de cálcio intracelular que culmina
na contração.
Diversas toxinas isoladas de venenos de escorpiões atuam com o ligantes
destes canais (136,144–147). A maurocalcina isolada do escorpião Maurus palmatus,
por exemplo, é um agonista seletivo do RyR1 (isoforma dominante no músculo
esquelético) (148,149); já a imperatoxina A por sua vez é agonista RyR1, mas não
RyR2 (encontrado no músculo cardíaco) (150) enquanto imperatoxina I inibe ambas
isoformas (cardíaco e esquelético), ambas, isoladas do veneno do escorpião Pandinus
imperator (151,152).
Toxinas de canal de cálcio dependentes de voltagem do tipo T
Muitas toxinas de escorpiões são capazes de atuar em canais de cálcio
ativados por altas voltagens, porém, poucas substâncias são capazes de agir
seletivamente em canais ativados por baixa voltagem, como é o caso dos canais de
cálcio do tipo T (transiente). A kurtoxina isolada do veneno de Parabuthus transvalicus
por exemplo, é um potente bloqueador e modificador das correntes transientes (153).
1.3.1.2 Toxinas peptídicas de cadeia longa
As toxinas peptídicas de cadeia longa afetam os canais de sódio
dependentes de voltagem e atualmente estão divididas em duas classes baseando
em seus efeitos fisiológicos: toxinas do tipo α (que agem no sítio 3 desses canais) e β
(que agem no sítio 4). Tidas como as mais importantes do ponto de vista médico, a
49
maioria dos efeitos tóxicos observados em envenenamentos humanos são atribuídos
a esse grupo de toxinas (143).
Os canais de sódio dependentes de voltagem
Os canais de sódio dependentes de voltagem são os responsáveis por
iniciar os potenciais de ação em nervos, músculos e demais células excitáveis em
diversos tecidos de diferentes organismos. Tais canais são compostos por
subunidades proteicas transmembranas dispostas de maneira a formar um canal
central altamente seletivo a íons, compreendendo a subunidade α que se associam
com uma ou mais subunidades β (154,155).
A subunidades α, cujo peso molecular é de aproximadamente 260kDa, é
organizada em quatro domínios homólogos (DI – IV) e cada domínio por sua vez
possui seis segmentos em α-hélices transmembranas (S1 – S6) ligados por alças
(154). O poro seletivo localiza-se entre os segmentos S5 e S6 de cada domínio,
enquanto os segmentos S4 possuem resíduos positivamente carregados cujos quais
apresentam um papel importante na ativação desse canal. Já a alça proteica
intracelular que conecta os domínios DIII e DIV funciona como uma comporta,
controlando a inativação desses canais (154,156) (Figura 2).
Embora as subunidades α formem a estrutura de um canal funcional, estas
são acopladas a uma ou mais subunidades β consistem em um grande domínio
extracelular, um único segmento transmembrana e um pequeno domínio intracelular
(Figura 2). Menores do que as α, as subunidades β (peso molecular de
aproximadamente 30 – 40kDa) possuem funções cruciais na cinética e expressão dos
canais (156). Tais subunidades auxiliares modulam a dependência de voltagem dos
mecanismos de abertura e fechamento (154) e (devido à similaridade a moléculas de
adesão) sugere-se que possam estar relacionadas a migração neuronal, extensão
axonal e interações com o substrato e outras células, podendo guiar a formação de
áreas especializadas com alta densidade de canais de sódio como os nodos de
Ranvier e os segmentos iniciais dos axônios (157).
50
Figura 2. Arquitetura dos canais de sódio dependentes de voltagem (Nav). A subunidade α consiste em 4 domínios homólogos DI (rosa), DII (verde), DIII (amarelo) e DIV (azul) conectados por alças intracelulares e cada domínio contem seis segmentos (S1 – S6) em α-hélices transmembranas; os sinais positivos (+) encontrados nos segmentos S4 representam o sensor de voltagem positivamente carregado; os segmentos S5 e S6 juntamente com a alça que liga esses dois segmentos formam o poro, enquanto o movimento dos segmentos S6 levam a abertura dos canais em resposta a despolarização, a alça intracelular que conecta DIII S6 e DIV S1 atua como uma comporta, inativando o poro. A subunidade α se associa a uma ou mais subunidades β (laranja), que por sua consistem em um grande domínio extracelular, um único segmento transmembrana e um pequeno domínio intracelular. Ilustração própria a partir da pesquisa em diversas fontes.
Até o momento, nove isoformas da subunidade α dos canais de sódio
dependentes de voltagem de mamíferos foram completamente expressas e
caracterizadas (154,155). Os canais Nav1.1, 1.2, 1.3 e 1.7 compartilham similaridades
na sequência, nas características biofísicas e na sensibilidade à tetrodotoxina (TTX).
Por outro lado, embora os canais Nav1.5, 1.8 e 1.9 possuam 75% de similaridade ao
grupo acima quanto a sequência de aminoácidos, esses apresentam resistência à
TTX (154,155). As outras duas isoformas (Nav1.4 e 1.6) tem grande similaridade na
51
sequencia e funcionalidade (incluindo a sensibilidade à TTX) entretanto estão mais
distantes dos demais do ponto de vista evolutivo (154).
Além das similaridades e diferenças em relação à sequência de
aminoácidos e sensibilidade à TTX, as isoformas também apresentam peculiaridades
quanto sua expressão nas fases do desenvolvimento e quanto a sua localização
(Tabela 1), apontando papeis distintos de cada isoforma.
Tabela 1. Isoformas das subunidades α dos canais de sódio dependentes de voltagem de mamíferos, sua principal localização, sensibilidade a TTX e canalopatia associada (154,158,159).
Nav Tecidos principais Sensível a TTX?
Doença associada
1.1 - SNC (soma dos neurônios); - SNP (neurônios do GRD).
Sim Epilepsia.
1.2 - SNC (axônios não mielinizados). - Tecidos neuronais embrionários.
Sim Epilepsia.
1.3 - SNC (na soma dos neurônios); - Tecidos neuronais embrionários.
Sim Dor neuropática.
1.4 - Músculo esquelético de adultos. Sim Paralisia periódica hipocalêmica; Paramiotonia congénita; Miotomia agravada por potássio.
1.5 - Músculo cardíaco; - Músculo esquelético imaturo.
Não Síndrome do QT longo; Diversas arritmias.
1.6 - SNP (nos nodos de Ranvier em adultos);
- SNC (adultos).
Sim Disfunções neurológicas.
1.7 - SNP (abundantes em axônios, iniciam e conduzem os potenciais de ação);
- Células de Swann; - SNP (GRD).
Sim
1.8 - SNP (GRD).
Não Hipersensibilidade sensorial.
1.9 - SNP (GRD). Não Hiperalgesia. SNC: Sistema nervoso central; SNP: Sistema nervoso periférico; GRD: Gânglio da raíz dorsal.
52
Toxinas do tipo α (α-toxinas)
As toxinas α são comumente encontradas nas espécies de escorpiões do
“Velho mundo” (Old world scorpions) embora também estejam presentes em
escorpiões do gênero Tityus sp. São caracterizadas por sua ligação ao segmento 3
do domínio IV dos canais de sódio dependentes de voltagem (143,160,161). Essa
toxinas induzem o prolongamento dos potenciais de ação nervosos e musculares,
uma vez que inibem o processo de inativação rápida dos canais de sódio
(132,140,160,162–167). Tais toxinas estabilizam o canal em seu estado aberto (sem
alteração significativa em sua ativação e inativação a partir do estado fechado) e este
retardo na inativação também pode resultar em deflagração repetitiva de potenciais
de ação (161).
Toxinas do tipo β (β-toxinas)
As toxinas do tipo β são comumente encontradas em espécies de escorpião
do Novo Mundo (New World species). Tais toxinas se ligam ao segmento 4 do domínio
II dos canais de sódio dependentes de voltagem, e modificam o limiar de ativação para
potenciais mais negativos levando a superativação do canal por meio do
aprisionamento do sensor de voltagem (168).
De acordo com os modelos clássicos de canais de sódio dependentes de
voltagem, estes canais possuem quatro sensores de voltagem que podem se ativar
de forma independente, entretanto, pelo menos três destes sensores devem estar um
sua posição ativada para promover a abertura do canal (169–171). Acredita-se que
essas toxinas possam ativar um sensor de voltagem (sítio 4 do domínio II) e
potencializar a ativação dos outros três sensores de voltagem para potenciais mais
hiperpolarizados (172–177).
Um grupo especial de toxinas de cadeia longa é encontrado no veneno do
escorpião brasileiro Tityus serrulatus, a tityustoxina γ, principal componente do veneno
desta espécie. Esta toxina é capaz de alterar a curva da relação corrente-voltagem (I-
V curve) para valores mais hiperpolarizados à semelhança das β-toxinas; porém, ao
invés de retardar a inativação como α-toxinas, as γ-toxinas reduzem a amplitude do
pico das correntes de sódio e bloqueiam a atividade do canal (173,178).
53
1.3.2 Venenos de escorpião como ferramentas para estudo e
desenvolvimento de novas terapias
Tanto as partes corporais quanto os venenos dos escorpiões são usados
na medicina tradicional desde o surgimento das culturas antigas, especialmente na
Ásia e África (161,179). Com o advento da ciência e o aperfeiçoamento das
metodologias para o estudo e caracterização dos componentes, muitas substâncias
biologicamente ativas foram isoladas dos venenos de escorpiões (180).
Foram isoladas diversas toxinas com propriedades antimicrobianas, como
a hadrurina, isolada do veneno de Hadrurus aztecus (181), a escorpina (182) e
pandinina (183) de Pandinus imperator, a IsCTs de veneno de Opisthacanthus
madagascariensis (184), a opistoporina de O. carinatus e a parabutoporina de
Parabuthus schlechteri (185). Embora tais toxinas possuam alta potência, sua
aplicação clínica é restrita uma vez que a margem de segurança é relativamente
estreita, ou seja, a concentração que apresenta potencial efeito terapêutico não é tão
diferente daquela que é citotóxica às células eucarióticas (180). Garcia e
colaboradores (186) combinaram doses baixas (não tóxicas) de potentes toxinas à
antibióticos clássicos, o que abriu um novo capítulo para os estudos da aplicação
clínica destas substâncias.
Toxinas com atividade antifúngica, antimalárica, antiviral, potencializadora
da bradicinina, bloqueadora de canais de potássio (visando a terapêutica de
desordens autoimunes) e imunomoduladora também foram isoladas (180,187).
Toxinas isoladas a partir de venenos de escorpiões vem sendo também
utilizadas como ferramentas no estudo e na terapêutica do câncer. A bengalina,
isolada do veneno de Houbaropsis bengalensis, por exemplo, possui efeitos
apoptogênicos, antiproliferativos e citotóxicos em cultura celular de leucemia mielóide
crônica e de linfoma histiocítico (188). Já um peptídeo isolado do veneno de Buthus
martensi tem propriedades apoptogênicas, antiproliferativas e citotóxicas em células
de câncer de próstata (189).
Uma das toxinas com potencial aplicação terapêutica mais estudada é a
clorotoxina, um peptídeo isolado do veneno de Leiurus quinquestriatus. Apesar de sua
classificação como toxina e de suas propriedades inseticidas e antiangiogênicas
(190,191), a clorotoxina parece ser um agente seguro para humanos ao não promover
54
alteração no número de plaquetas, hemácias, linfócitos e eletrólitos, ou às funções
renais e hepática, ou ainda dano celular aos principais órgãos humanos (192). Por
sua habilidade em se ligar especificamente às células tumorais e atravessar a barreira
hematoencefálica, este peptídeo tem promissores aplicações terapêuticas, tendo sido
descrito os seguintes usos:
• Marcador/coloração em procedimentos cirúrgicos: quando conjugado a um
marcador fluorescente (192), a clorotoxina auxilia na visualização das áreas
tumorais e não tumorais durante ressecção cirúrgica. A BLZ-100
(Clorotoxina conjugada com verde de indocianina) foi aprovada pela
agência reguladora americana FDA (Food and Drug Administration) para
fase I dos ensaios clínicos em humanos com glioma, sarcoma, tumores
sólidos, de pele e do sistema nervoso central (Números identificadores dos
ensaios clínicos: NCT02464332, NCT02234297, NCT02496065,
NCT02097875 e NCT02462629 respectivamente).
• Ferramenta nanotecnológica para exame de imagem de tumores e delivery
de drogas: a clorotoxina tem sido usada para o delivery de nanomarcadores
ou agentes contraste para ressonância magnética (Fu et al., 2012), e de
drogas às células tumorais (193).
• Radioterapia: a clorotoxina vem sendo radiomarcada com iodo radioativo
(131I) e usada no controle da progressão de tumor e detecção de sua
localização (194,195). A 131I-TM601 (Clorotoxina sintética) atingiu grandes
resultados na Fase II dos ensaios clínicos e, após sua conclusão, os direitos
de propriedade intelectual deste composto foram adquiridos pela Morphotek
Incorporation.
Dado o exposto, toxinas provindas de venenos de escorpiões vêm sendo
também valiosas ferramentas de estudo da estrutura e fisiologia dos canais iônicos,
na fisiopatologia de diversas canalopatias e desenvolvimentos de drogas (196,197).
55
1.4 Os Tityus sp. do Brasil
Quase todos os casos de escorpionismo no Brasil são causados por
escorpiões do gênero Tityus, sendo o Tityus serrulatus (escorpião amarelo) e o T.
bahiensis (escorpião marrom) os mais clinicamente importantes (198), particularmente
nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Bahia e Pernambuco (199). Outras espécies
envolvidas em acidentes incluem o T. obscurus (18,19) e T. silvestris na bacia
amazônica (200) e T. stigmurus na região nordeste (201). Até o presente momento, o
veneno mais estudado e caracterizado é o do T. serrulatus (30,202,203).
Análises transcriptômicas e proteômicas demonstraram que os venenos de
Tityus possuem uma variedade de toxinas, sendo a maior parte delas de baixo peso
molecular (<10 kDa) (204–207) e são responsáveis por grande parte dos efeitos
simpáticos e parassimpáticos observados no escorpionismo (137,203). Pouco se sabe
sobre seus efeitos na neurotransmissão esquelética e, no geral, os estudos se
concentram no veneno de T. serrulatus (35,208,209).
1.4.1 Tityus bahiensis (Perti, 1834)
Tityus bahiensis é conhecido popularmente como escorpião-marrom
devido à sua coloração marrom-escuro nos apêndices, assim como no seu prossoma
e mesossoma (Figura 3A). Embora endêmica do Estado de São Paulo, esta espécie
pode ser encontrada em outros estados da região sudeste (Minas Gerais), assim
como nas regiões sul (Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul), nordeste (Bahia)
e centro-oeste (Mato Grosso do Sul e Goiás) (Figura 3B). Por serem sinantrópicos
(encontrados em ambientes urbanos), essa espécie é a segunda maior causadora de
envenenamento por escorpiões no Brasil e a maior causadora de acidentes no estado
de São Paulo (12).
Além de sua distribuição pelo território brasileiro, T. bahiensis também
ocorre na Argentina [Províncias Misiones, Corrientes, Entre Ríos, Santa Fé; Chaco e
Formosa; (210,211)] e Paraguai [Províncias Cordillera, Guairá, Alto Paraná e Itapuá;
56
(212,213)], em regiões próximas à Tríplice Fronteira (bordas entre Brasil, Argentina e
Paraguai). Existem registros do aparecimento dessa espécie na Venezuela, entretanto
acredita-se que este fato esteja relacionado ao fluxo de turistas entre Venezuela e
Brasil (214,215). Em contraste com o Brasil, T. bahiensis não possui importância
clínica nos demais países uma vez que nenhum caso de envenenamento grave ou
morte fora reportado (210,216).
Embora tenha sido a primeira espécie de Tityus sp. descrita no Brasil
(inicialmente como Scorpio bahiensis por Perty, 1833), seu veneno assim como as
frações cromatográficas e toxinas isoladas permanecem pobremente estudados,
totalizando hoje pouco mais de 25 artigos em periódicos indexados no PubMed.
Figura 3. Espécimes macho e fêmea do escorpião Tityus bahiensis no estado de São Paulo (7) e sua distribuição geográfica (A, B, respectivamente). A área em vermelho indica o estado de São Paulo, de onde T. bahiensis é endêmico sendo o maior causador de acidentes. As áreas em laranja indicam os estados do Paraná, Santa Catarina, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e Goiás estados onde acidentes por T. bahiensis também são frequentes. Poucos acidentes foram reportados nos estados do Rio de Janeiro, Espírito Santo, Rio Grande do Sul, Bahia e Mato Grosso (áreas em amarelo claro).
A B
57
Recentemente, foi publicado o transcriptoma da glândula produtora de
veneno do T. bahiensis (217). Foram identificados transcritos similares aos de
compostos que atuam em canais de potássio (8,1%) e de sódio (13%). Foram também
identificados transcritos de metaloproteinases (33%), que supostamente estão
envolvidos com a desregulação da secreção pancreática observada nos
envenenamentos (218), assim como na degradação de fibrinogênio in vitro (219).
Identificou-se, ainda, substâncias do tipo hipotensivas (4,5%). Em relação às
atividades enzimáticas, o veneno bruto de T. bahiensis apresenta atividades
hialuronidásicas e proteolíticas, mas não fosfolipásica (220).
Dorce e colaboradores vêm estudando os efeitos do veneno de T. bahiensis
no sistema nervoso central e em ratas prenhas/lactantes e suas respectivas proles.
Foram observados efeitos sistêmicos transitórios (alteração na frequência respiratória
e aumento das secreções salivares e nasais) e locais (dor e rigidez) após exposição
de ratas prenhas ao veneno. A ninhada dessas ratas também sofreu alterações em
seu desenvolvimento físico e comportamental (221–223); ou seja, os filhotes machos
tiveram comprometimento motor, enquanto as fêmeas apresentaram comportamentos
similares a estados depressivos, além de se mostrarem mais ansiosas que os machos;
nos dois casos foi observada diminuição no número de células do hipocampo (224).
O envenenamento materno durante a lactação diminuiu o número de células no
hipocampo e aumentou os níveis de IFN-γ no cérebro, e retardou o desenvolvimento
físico, reflexo e motor da ninhada. Estes efeitos podem se dar por ação direta - o
veneno atinge o leite materno e atingindo os filhotes - ou indiretos – o veneno promove
alterações deletérias na progenitora levando a diminuição no volume e alteração na
composição do leite (225). A injeção intraperitoneal do veneno de T. bahiensis induziu
alterações eletrográficas e comportamentais; entretanto, não foi observada perda
neural no hipocampo ou alterações nos níveis extracelulares de alguns
neurotransmissores (glutamato, glicina, GABA, 5-HIAA e DPOCA), porém houve
aumento nos níveis de ácido homovanílico (HVA), indicando que o veneno pode
ultrapassar a barreira hematoencefálica (226).
O veneno de T. bahiensis apresenta atividade edematogênica e promove
infiltração de neutrófilos (227). Além disso, estimula a atividade pancreática e a
hipersecreção de saliva por meio da liberação de acetilcolina dos nervos pancreáticos
e por estimulação colinérgica sistêmica, respectivamente (228).
58
Apenas um trabalho envolvendo o veneno bruto e canais iônicos foi
publicado (229). Neste, demonstrou-se que o veneno de T. bahiensis, quando
incubado a neurônios do gânglio da raiz dorsal, reduz significativamente a taxa de
inativação, aumenta a amplitude das correntes e causa mudança negativa na ativação
e inativação dos canais de sódio dependentes de voltagem e sensíveis a tetrodotoxina
(TTX). Porém, embora seja observada uma pequena diminuição na amplitude das
correntes dos canais resistentes à TTX, o mecanismo de abertura e fechamento
desses canais não foram afetados. Já em nos canais de sódio cardíacos (Nav 1.5,
resistentes a TTX), o veneno inibiu em aproximadamente 50% a corrente de sódio e
promoveu um grande retardo na ativação e inativação da corrente restante.
1.4.1.1 Estudo das frações isoladas
A primeira publicação envolvendo frações e toxinas isoladas do veneno de
T. bahiensis data de 1993 (230), onde se descreveu o isolamento parcial e
caracterização de dois peptídeos: TbTx-VI e IV-5b. Dois anos depois, publicou-se a
primeira caracterização bioquímica completa da IV-5b e o estudo de sua atividade em
canais de sódio dependentes de voltagem. Relatou-se que esse peptídeo causa
retardo na inativação desses canais, porém pouco afeta sua ativação (231).
Um estudo posterior identificou que as frações IV, V e VIII são tóxicas e a
fração VI é letal para camundongos. Da fração VI foram então isoladas 3 toxinas: γ-
bahiensis (toxina letal que corresponde a 10% do veneno bruto, e que demonstra 90%
de similaridade à toxina γ do T. serrulatus), III-8-bahiensis (III-8b) e TbTx-VI (toxina
não letal) (232). Do veneno de escorpião também foram isoladas duas toxinas com
atividades inseticidas (TbIT-I e Tb2-II) os quais tiveram a sequência de aminoácidos
e caracterização bioquímica parcial publicadas (233).
Em 2002, Lourenço e colaboradores (137) estudaram os efeitos de 6
frações isoladas (P2 – P7) no sistema nervoso central de ratos. A injeção intravenosa
das frações de baixo peso molecular (P5, P6 e P7) induziram convulsão espontânea
(reforçando a habilidade dos componentes do veneno em atravessar a barreira
hematoencefálica) enquanto as injeções intrahipocampais promoveram dano neural
(P5), alterações comportamentais (P5 – P7) e alterações eletrográficas (P5, P6). A
59
partir da P5 foi purificada a toxina TbV-4, apontada como a responsável pelos efeitos
epilépticos e alterações encefalográficas; os efeitos convulsivos foram concomitantes
com altos níveis de glutamato e dano neural (234).
1.5 Relevância deste trabalho
Os venenos escorpiônicos são compostos principalmente por peptídeos
neurotóxicos capazes de interagir com elevada afinidade e especificidade com canais
iônicos, podendo inativar, ativar, bloquear ou mesmo alterar o mecanismo de abertura
e fechamento desses canais. Essa atividade neurotóxica é de grande relevância
clínica, pois os principais efeitos observados durante acidentes escorpiônicos estão
relacionados à liberação massiva de neurotransmissores no sistema nervoso central
e periférico. Toxinas isoladas a partir de venenos de escorpiões têm sido empregadas
como ferramentas para estudo da estrutura e fisiologia dos canais iônicos, assim como
de doenças como canalopatias, epilepsia, paralisia facial, doenças musculares,
arritmias cardíacas e síndromes da dor.
O Tityus bahiensis é segundo maior responsável por acidentes
escorpiônicos no Brasil e principal responsável no Estado de São Paulo, porém, ainda
são pouco numerosos os trabalhos envolvendo o veneno de Tityus bahiensis ou suas
frações isoladas. Grande parte dos trabalhos publicados envolve a gestação e sistema
nervoso central e apenas um trabalho estudou as atividades biológicas das frações
isoladas do veneno (137), sendo que a partir desse trabalho foi isolada uma toxina
com atividades no SNC (234). Foram também isoladas toxinas com atividade
inseticida (233). Outros cinco trabalhos estão voltados ao isolamento e
sequenciamento de toxinas, proteômica da glândula de veneno e atividades
enzimáticas do veneno bruto (217,230,232,233).
Em relação a canais iônicos propriamente ditos, foram publicados apenas
um trabalho com veneno bruto (229) e um segundo envolvendo uma toxina isolada
(231). Não há trabalhos avaliando a atividade do veneno bruto de T. bahiensis no
60
sistema nervoso periférico (somático ou autônomo) e na musculatura lisa ou
esquelética, o que justifica a originalidade e importância deste estudo.
61
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Avaliar a atividade do veneno bruto de T. bahiensis em diferentes
preparações neuromusculares e autônomas por meio de abordagens miográficas,
eletrofisiológicas e de imagem de cálcio.
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar a atividade neuromuscular por meio do estudo miográfico em
preparações de biventer cervicis de pintainho, nervo-frênico diafragma de
camundongo e extensor digitorum longus de camundongo;
• Em preparação nervo frênico – diafragma, realizar estudo eletrofisiológico do
veneno bruto sobre os potenciais de membrana em repouso, de placa terminal
e de placa terminal em miniatura;
• Em preparação de canal deferente de camundongos, realizar estudo miográfico
para avaliar a interação do veneno com os receptores purinérgicos P2X e
adrenérgico α1 na musculatura lisa;
• Aferir a atividade do veneno de T. bahiensis no potencial de membrana em
repouso e nos potenciais juncionais excitatórios espontâneos em preparações
de canal deferente de camundongos;
• Estimar a ação do veneno sobre o potencial de ação nervoso e condução
nervosa em nervo ciático isolado de camundongos;
• Estudar as formas de ondas perineurais (influxo de sódio e efluxo potássio no
terminal nervoso) em preparação de triangular do esterno isolada de
camundongos;
62
• Avaliar a interação do veneno bruto com as correntes de sódio por meio de
whole-cell voltage-clamp em cultura celular de neurônios ND7-23 (linhagem
híbrida de neuroblastoma e GRD);
• Estudar o movimento espontâneo de cálcio intracelular após incubação do
veneno de T. bahiensis com neurônios ND7/23, cultura primária de neurônios
do gânglio da raíz dorsal (GRD) e células musculares esqueléticas (músculo
triangular do esterno isolado).
63
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Veneno bruto de Tityus bahiensis, reagentes e linhagem
celular
O veneno bruto liofilizado de Tityus bahiensis foi adquirido em colaboração
com a Profa. Dra. Valquíria Abrão Coronado Dorce do Laboratório de Farmacologia
do Instituto Butantan, São Paulo, Brasil. Este trabalho está regularmente cadastrado
no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento
Tradicional Associado (SisGen) sob o identificador “A5F1946”.
O anestésico inalatório isoflurano foi adquirido da Cristália Produtos
Químicos e Farmacêuticos (Itapira/SP) enquanto a d-Tubocurarina (dTC) foi obtida da
Abbott (Lake Bluff, IL, E.U.A.) e a toxina botulínica tipo A (BoNT-A; Dysport) da Ipsen
(Paris, França).
As soluções e meios usados para cultura Gibco® RPMI 1640 e Gibco®
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) foram obtidos da Life Technologies Ltd.
(Paisley, Reino Unido) (Life Technologies Ltd., Paisley, Reino Unido), assim como o
Gibco® TrypLE™ Express.
A linhagem ND7-23 wild type (células híbridas de neuroblastoma e
neurônios do GRD) e o Cytosine β D arabinofuraside foram obtidos da Sigma–Aldrich
Chemical Co. Ltd. (Irvine, Reino Unido).
Os sais de alto grau de pureza para preparo das soluções nutritivas e
tampões foram adquiridos da J.T. Baker Chemicals (Center Valley, PA, E.U.A.),
Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, E.U.A.), Mallinckrodt (Staines-upon-
Thames, Reino Unido) ou Merck KgaA (Darmstadt, Alemanha). O marcador
fluorescente sensível ao cálcio Fluo-4AM foi obtido da Invitrogen™ Life Technologies
Corp. (Paisley, Reino Unido).
Demais reagentes, enzimas e químicos aqui utilizados foram obtidos da
Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, E.U.A.) ou da Merck KgaA (Darmstadt,
Alemanha), dependendo da disponibilidade.
64
3.2 Animais
Pintainhos machos da linhagem HY LINE W36 pesando de 40 a 50 g (4 a
12 dias) foram obtidos da Granja Flamboyant (Mogi Mirim, SP).
Camundongos machos (linhagem Balb/C) com peso entre 20 a 35 g (8
semanas) e ratos Wistar pesando entre 300 e 400 g (12 semanas) foram obtidos do
"Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica" (CEMIB) da UNICAMP
(Campinas, SP) ou do “Biological Procedures Unit” da Strathclyde Institute of
Pharmacy and Biomedical Sciences (SIPBS, Glasgow, Reino Unido).
Todos os animais foram mantidos em gaiolas abastecidas com água
clorada e ração industrial ad libitum, em ambiente com temperatura constante (22 ± 3
ºC) e iluminação controlada (ciclo de 12h claro/escuro). Os experimentos realizados
na UNICAMP estavam de acordo com as normas estabelecidas pela Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e os protocolos foram
submetidos a certificação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UNICAMP)
sob os números 4068-1 e 4189-1 (Anexos 1, 2 e 3). Os experimentos realizados no
SIPBS estavam de acordo com a “European Communities Council Directive of 24
November 1986 (86/609/EEC)” e o “UK Government Animals (Scientific Procedures)
Act 1996”.
3.3 Desenho experimental
Este trabalho se iniciou pelos ensaios funcionais (estudo miográfico) em
diferentes preparações neuromusculares (EDL, BCP e NFD) e autônoma (canal
deferente biseccionados). A partir dos resultados obtidos nos ensaios funcionais,
cujos quais sugeriram atividade pré-sináptica do veneno de Tityus bahiesis, iniciou-se
o estudo eletrofisiológico afim de se obter a atividade do veneno sobre a liberação
espontânea (MEPP e SEJP) e evocada (EPP) de neurotransmissore assim como o
65
potencial de membrana em repouso da musculatura esquelética (NFD) e lisa (canal
deferente).
Em seguida, foram realizadas as seguintes abordagens acerca dos
potenciais pré-sinápticos: i) avaliação das formas de ondas perineurais, que nos
oferece informações relativas a atividade do veneno sobre as ondas de sódio e
potássio em terminais nervosos, e ii) potenciais de ação compostos axonais. Levando
em consideração a grande importância dos canais de sódio dependentes de voltagem
na farmacologia do veneno de T. bahiensis, as correntes de sódio foram estudadas
posteriormente por Patch-clamp. Para finalizar, foram analisadas as movimentações
espontâneas do cálcio intracelular em neurônios e fibras musculares esqueléticas,
conforme esquematizado na Figura 4.
Figura 4. Desenho experimental deste trabalho. Foram realizados ensaios funcionais seguidos de ensaios eletrofisiológicos em diferentes preparações neuromusculares e autônomas. Na sequência, realizou-se o estudo da movimentação espontânea de cálcio intracelular. EDL: extensor digitorum longus; BCP: biventer cervicis de pintainho; NFD: nervo frênico – diafragma. MEPP: potencial de placa terminal em miniatura; EPP: potencial de placa terminal; SEJP: potencial juncional excitatório espontâneo; PMR: potencial de membrana em repouso.
66
3.4 Ensaios miográficos
3.4.1 Junção neuromuscular
O sistema nervoso somático é composto por neurônios motores (fibras
eferentes que conduzem sinais do sistema nervoso central aos músculos
esqueléticos) e neurônios sensoriais (fibras aferentes que conduzem estímulos
externos para o sistema nervoso central). Os corpos celulares dos neurônios motores
se localizam no corno anterior da coluna espinal e seus axônios se ramificam e cada
terminação inervam uma única fibra muscular em mamíferos. A estrutura localizada
entre o terminal nervoso motor e a fibra muscular esquelética é chamada de junção
neuromuscular (JNM) (235).
A JNM é basicamente constituída por i) um terminal nervoso equipado com
vesículas sinápticas onde são armazenados os neurotransmissores (acetilcolina,
ACh) ii) uma zona ativa na membrana pré-sináptica onde ocorre a exocitose dos
neurotransmissores para a fenda sináptica (236) e iii) a placa motora, localizada na
membrana celular pós-sináptica (sarcolema) onde se distribuem os receptores
nicotínicos de ACh (237).
Grande parte dos axônios do sistema nervoso periférico somatomotor, em
especial aqueles de maior calibre, são envolvidos pela bainha de mielina que funciona
como isolante elétrico. Essa camada rica em lipídeos, originada das células de
Schwann, são segmentadas ao longo do axônio deixando espaços expostos (nodos
de Ranvier) onde ocorrerá a condução saltatória, aumentando a velocidade de
propagação impulso nervoso (238,239). Próximo ao terminal nervoso, o axônio motor
perde sua bainha de mielina e os botões sinápticos se aderem à superfície muscular
deixando um espaço preenchido entre membrana pré e pós-sináptica de
aproximadamente 50 a 100 nm, chamado fenda sináptica (239).
Dentro das vesículas sinápticas estão armazenadas de 5000 a 10000
moléculas de ACh que são internalizadas pelo transportador vesicular de ACh; o
conteúdo de neurotransmissores em uma vesícula é referido como uma quanta. A
síntese dessas moléculas é mediada pela enzima citoplasmática colina
67
acetiltransferase a partir da acetil-coenzima A (formada nas mitocôndrias) e a colina
(capturada diretamente do plasma ou recicladas após hidrólise da ACh) (240).
Quando o impulso nervoso atinge e despolariza o botão sináptico,
desencadeia-se a abertura dos canais de cálcio dependentes de voltagem localizados
na zona ativa, permitindo o influxo de cálcio que irá facilitar o ancoramento e a
exocitose de milhares de moléculas de ACh. Esse complexo processo envolve três
das proteínas de ligação a fator solúvel sensível a N-etilmaleimida (SNARE), sendo
elas a proteína de membrana associada à vesículas (VAMP; Sinaptobrevina) e as
proteínas de membrana plasmática sintaxina e a de 25kDa associada ao
sinaptossoma (SNAP-25) (241,242). No processo de fusão, outras proteínas também
são essenciais para a exocitose como o sensor de cálcio sinaptotagmina e seu co-
fator complexina: a ligação do cálcio aos seus domínios culmina na ativação do
mecanismo de fusão das membranas mediada pela sua interação com os fosfolipídios
e com complexo SNARE (236). A maioria da liberação espontânea de
neurotransmissores também é dependente de cálcio, entretanto este não parece
depender da concentração intracelular basal, mas sim de picos na concentração
gerado pela liberação de reservas internas ou do influxo de cálcio (243).
As moléculas liberadas na fenda sináptica interagem com os receptores
nicotínicos de acetilcolina (nAChR) pré-sinápticos e pós-sinápticos, e as
acetilcolinesterases (AChE). A membrana pós-sináptica da junção neuromuscular é
caracterizada por várias dobras, estando os nAChR em grande densidade nas dobras
mais rasas (mais próximas ao terminal nervoso) enquanto as AChEs, estão ancoradas
nas dobras mais profundas (240). As moléculas ACh que não se ligam imediatamente
ou que são liberadas após sua interação com o receptor são quase instantaneamente
hidrolisadas pelas AChE em colina (que então será reciclada) e acetato, terminando
a neurotransmissão colinérgica (241,244). Próximo às placas motoras estão as zonas
perijuncionais que, por possuírem uma grande densidade de canais de sódio
dependentes de voltagem, amplificam a despolarização da placa motora e iniciam os
processos que levam a contração muscular (241).
As fibras musculares são em geral células alongadas e multinucleadas,
podem ser classificadas segundo seu metabolismo energético dominante e velocidade
de contração podendo os músculos possuírem diferentes composições dependendo
de sua função. O músculo extensor digitorum longus (EDL), por exemplo, que é um
músculo de contração rápida, é composto principalmente por fibras musculares do tipo
68
IIb (rápidas glicolíticas; mais 60% das fibras), seguido pelas do tipo IIx (intermediárias
entre IIa e IIb) e uma pequena concentração de fibras IIa (rápidas intermediárias entre
I e IIb) (245–247). Por outro lado, diafragmas de camundongos, exemplo de músculo
de contração lenta, têm uma grande concentração de fibras intermediárias do Tipo IIa
(40%) e, diferente de EDL, são encontradas fibras de contração lenta do Tipo I (12%)
(248).
Diferente das junções neuromusculares de mamíferos que possuem
inervação focal (os nAChR estão localizados apenas na região da placa motora), os
músculos de aves como o biventer cervicis de pintainho possuem inervação multifocal,
ou seja, os nAChR estão ao longo da fibra. Essa propriedade permite que se possa
examinar a atividade farmacológica de agonistas colinérgicos exógenos (como ACh e
carbacol) e do KCl.
3.4.1.1 Preparação extensor digitorum longus de camundongo
Os camundongos foram eutanasiados sob anestesia com isoflurano (via
inalatória) e posteriormente exsangüinados. Para a dissecação do músculo extensor
digitorum longus (EDL), uma ampla incisão foi realizada na face ântero-lateral de uma
das patas posteriores do animal, com a exposição dos tendões dos músculos EDL e
tibial. Seccionou-se o tendão do músculo tibial para sua retirada, causando a
exposição total do músculo EDL. Amarrou-se o segmento da parte superior e a
extremidade inferior (tendões ligados aos dedos) do músculo, isolando-o do animal.
Durante todo o procedimento a preparação foi mantida umedecida com solução
nutritiva de Tyrode (composição em mM: NaCl 137; KCl 2,7; CaCl2 1,8; MgCl2 0,49;
NaH2PO4 0,42; NaHCO3 11,9 e C6H12O6 11,1), constantemente gaseificada com
carbogênio (mistura de 95 % O2 e 5 % CO2) e mantida à 37C.
Os músculos EDL foram mantidos sob tensão constante de 1 g e expostos
à estimulação elétrica indireta [estimulador GRASS S48 (Grass Medical Instruments,
Quincy, MA, E.U.A.) voltagem supramáxima, 0,1 Hz, 0,2 ms]. As contrações
musculares foram registradas em fisiógrafo de 4 canais PowerLab ML866, ligado a
amplificadores Quad Bridge ML224 (ADInstruments, New South Wales, Austrália) e a
um microcomputador Dell munido do software LabChart7.
69
Após um período de estabilização (20 min), diferentes concentrações do
veneno (1-10 µg/mL) foram adicionados à cuba e a resposta contrátil registrada por
120 min. A amplitude das respostas contráteis foi mensurada a cada 10 min e os
resultados foram apresentados como porcentagem da resposta basal (antes da adição
do veneno).
3.4.1.2 Preparação nervo-frênico diafragma de camundongo
Os camundongos foram eutanasiados sob anestesia com isoflurano (via
inalatória) e posteriormente exsangüinados. Para a dissecção do diafragma, a pele ao
redor da região torácica e abdominal foi removida, expondo a caixa torácica e parte
da parede abdominal. Fez-se então uma incisão na parede abdominal abaixo da caixa
torácica e o diafragma foi cuidadosamente isolado do fígado, esôfago e aorta
adjacente. Os músculos peitorais foram removidos para expor a caixa torácica, que
foi aberta por meio de uma incisão iniciada no esterno e continuada ao longo do
espaço intercostal do lado esquerdo e direito a essa incisão inicial. O coração e
pulmões foram gentilmente afastados e os nervos frênicos cuidadosamente isolados
juntamente com o diafragma e as costelas adjacentes. Os hemidiafragmas foram
separados juntamente com seus nervos frênicos correspondentes e as preparações
fixadas a partir das costelas em cuba contendo 5 mL da solução nutritiva de Tyrode
(ver 3.4.1.1) constantemente gaseificada com carbogênio (mistura de 95 % O2 e 5 %
CO2) e mantida à 37C. Os músculos diafragmas foram mantidos por sua porção
tendinosa sob tensão constante de 5 g.
As preparações foram expostas à estimulação elétrica indireta (voltagem
supramáxima, 0,1 Hz, 0,2 ms) ou direta (70 V, 0,1 Hz, 20 ms) através de estimulador
GRASS S48 (Grass Medical Instruments, Quincy, MA, E.U.A.). As contrações
musculares foram registradas em fisiógrafo de 4 canais PowerLab ML866, ligado a
amplificadores Quad Bridge ML224 (ADInstruments, New South Wales, Austrália) e a
um microcomputador Dell munido do software LabChart7.
Para estimulação direta, os músculos foram pré-incubado com d-
Tubocurarina (dTC; bloqueador dos nAChR) evitando que a contração seja
70
neurogênica, ou seja, que a ACh liberada das terminações nervosas durante a
estimulação elétrica ative os nAChR e promova a contração muscular.
Após um período de estabilização (20 min), diferentes concentrações do
veneno (1-30 µg/mL) foram adicionados à cuba, e a resposta contrátil registrada por
120 min. A amplitude das respostas contráteis foi mensurada a cada 10 min e os
resultados foram apresentados como porcentagem da resposta basal (antes da adição
do veneno).
3.4.1.3 Preparação biventer cervicis de pintainho
Os pintainhos foram anestesiados utilizando isoflurano (via inalatória). Para
a dissecação dos músculos biventer cervicis, fez-se uma incisão na pele da parte de
trás do pescoço dos pintainhos iniciando na linha mediana do crânio e finalizando na
base do pescoço para expor os dois músculos em ambos os lados da linha média,
logo abaixo da pele. Após a dissecação, o músculo foi suspenso a uma tensão de 1 g
em uma cuba de 5 mL, contendo solução nutritiva de Krebs (composição em mM:
NaCl 118,6; KCl 4,69; CaCl2 1,88; KH2PO4 1,17; MgSO4 1,17; NaHCO3 25,0 e C6H12O6
11,65), gaseificada de modo constante com carbogênio (95% O2 e 5% CO2) e mantida
à 37C em banho de órgãos PanLab acoplado a um termostato PanLab LE13206
(Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A.). A preparação foi então, por meio de
eletrodos bipolares, estimulada indiretamente (estimulação de campo; voltagem
supramáxima, 0,1 Hz, 0,2 ms) ou diretamente (70 V, 0,1 Hz, 20 ms, estimulador
GRASS S48 - Grass Medical Instruments, Quincy, MA, E.U.A.). As respostas foram
registradas em fisiógrafo de 4 canais PowerLab ML866 ligado a amplificadores Quad
Bridge ML224 (ADInstruments, New South Wales, Austrália) acoplado a um
microcomputador Dell munido do Software LabChart7, por meio de transdutores
isométricos PanLab TRI201AD (Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A.).
Nos ensaios em que os músculos foram diretamente estimulados foram
utilizados dois diferentes protocolos para evitar contração neurogênica. No primeiro
as preparações foram pré-incubado com d-Tubocurarina (dTC; bloqueador dos
nAChR) enquanto no segundo os músculos foram mantidos em solução Krebs na
71
ausência de Ca2+, uma vez que o cálcio extracelular é essencial para a exocitose dos
neurotransmissores.
Após um período de estabilização de 20 min, foram registradas as
contraturas em resposta ao ACh (20 nM) e carbacol (CCh; 8 µM) para se avaliar a
interação com receptores nicotínicos, e ao KCl (110 M) para se avaliar a integridade
da membrana pós-sináptica.Tendo em vista que a ACh é rapidamente hidrolisada
pelas AChE enquanto o CCh é resistente à essa hidrólise, quando a contratura ao
CCh não é afetada (ou seja, os receptores e responsividade pós-sináptica estão com
funcionalidade normal) porém a contratura à ACh mostrou-se alterada, pode-se
indiretamente inferir que o veneno afetou a atividade da AChE, alterando a velocidade
de hidrólise da ACh. Estes agonistas foram adicionados no início (antes da adição do
veneno) e no final do experimento, na ausência de estimulação elétrica.
Posteriormente ao registro inicial das contraturas e um breve período de
estabilização, diferentes concentrações do veneno de T. bahiensis (1-30 µg/mL) foram
adicionados à cuba e a resposta contrátil foi registrada por 120 min. Mensurou-se a
amplitude das respostas contraturantes em resposta a agonistas exógenos (amplitude
máxima) e contráteis (amplitude da contração a cada 10 min, sob estimulação
elétrica), sendo as respostas mostradas como porcentagem do valor basal (amplitude
antes da adição do veneno).
Em um outro protocolo experimental, os músculos foram indiretamente
estimulados (para se testar a viabilidade da preparação) e, após o bloqueio
neuromuscular promovido por BoTN-A e por dTC, a estimulação elétrica foi desligada
e o veneno foi adicionado (30 µg/mL). Fora adicionada tetrodotoxina (TTX; 5nM) em
alguns ensaios afim de se avaliar sua atividade a atividade da mesma frente ao retardo
no relaxamento das contrações musculares.
3.4.2 Junção neuroefetora
O sistema nervoso autônomo é responsável pela regulação das funções
corporais relacionadas a manutenção da homeostase, regulação termal, motilidade
gastrointestinal, funções excretoras, reprodutivas, metabólicas e endócrinas, e
respostas adaptativas ao estresse como respostas de fuga e luta. Tanto o sistema
72
parassimpático quanto o simpático consistem em duas populações de neurônios em
série que controlam os órgãos-alvo de forma antagônica, sinérgica ou independente -
muitos órgãos recebem ambas inervações tornando sua funcionalidade dependente
da regulação entre estímulos de ambos os ramos (249,250). A primeira população de
neurônios (neurônios pré-ganglionares) possui os corpos celulares no SNC e se
conectam ao segundo grupo de neurônios por meio de fibras mielinizadas e não
mielinizadas. Os corpos celulares do segundo grupo de neurônios (pós-ganglionares)
se agrupam formando um gânglio autonômico e seus a axônios não mielinizados se
projetam aos órgãos-alvo (251).
Já o sistema nervoso parassimpático tem sua funcionalmente muito além
da comumente referenciada como apenas “descansar e digerir”. Suas fibras pré-
ganglionares são longas e a sinapse com as pós-ganglionares ocorre nas
proximidades do órgão-alvo (252). Muitas fibras podem também conter outros
neurotransmissores, porém o principal neurotransmissor é a ACh, que age em nAChR
(fibras pré- ganglionares) ou muscarínicos (fibras pós-ganglionares).
O sistema nervoso simpático é comumente referenciado como a divisão da
“fuga e luta”, entretanto este também regula os órgãos em situações não
emergenciais. Possui axônios pré-ganglionares relativamente curtos e a sinapse com
os neurônios pós-ganglionares ocorre em uma cadeia bilateral adjacente a coluna
espinal mediada por ACh em nAChR (252). Embora a principal neurotransmissão pós-
ganglionar ocorre por meio da noradrenalina (NOR) em receptores adrenérgicos α e
β, existem casos de co-transmissão como observado no canal deferente.
Em ambos os casos, a inervação pós-ganglionar apresenta inúmeras
ampliações (varicosidades) ao longo do axônio (252). Uma vez que a liberação
também ocorre pelas varicosidades conforme a propagação do impulso pelo axônio,
um simples neurônio pode afetar diversas células musculares lisas (252). Diferente da
junção neuromuscular que possui uma estrutura especializada e uma sinapse bem
definida, as varicosidades estão constantemente se movendo e sua relação com as
membranas musculares mudam ao longo do tempo (253,254).
As células musculares lisas são alongadas e fusiformes com núcleo único
e central. Suas contrações também são iniciadas por cálcio entretanto a proporção da
composição dos filamentos de actina e miosina assim como os mecanismos
regulatórios divergem da JNM (255). Outra particularidade da musculatura lisa é a
presença das junções comunicantes (junções gap) que são aglomerados de canais
73
intercelulares de baixa resistência e permite a propagação do impulso elétrico através
da difusão direta de íons entre as células adjacentes proporcionando elos de
comunicação e regulando a contração do músculo como um todo (254,256).
3.4.2.1 Preparação de canal deferente de ratos
O canal deferente é ricamente inervado por fibras simpáticas (em sua
maioria provindas do tronco hipogástrico) e por fibras pós-ganglionares
parassimpáticas (originadas do gânglio pélvico) (257,258). É um exemplo muito
estudado de co-transmissão simpática envolvendo ATP e noradrenalina, que parecem
ser armazenados em vesículas sinápticas separadas (259) e quando eletricamente
estimulados, promovem resposta contrátil bifásica onde ATP produz uma fásica
seguida da noradrenalina produzindo uma resposta tônica (260).
O ATP ao ativar os P2X1 pós-juncionais, promove o influxo de cálcio
gerando uma despolarização da membrana do miócito e consequentemente a
abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem (260). Esse aumento
intracelular de cálcio induz a liberação de mais cálcio do retículo sarcoplasmático e
consecutivamente uma rápida contração muscular (fásica). Já a noradrenalina, ao
interagir com receptores α1 pós-juncionais, inicia uma cascada de sinalização que
culmina no aumento intracelular de trifosfato de inositol e consequentemente a
liberação de cálcio dos retículos e a contração tônica da musculatura lisa (260,261).
Existe uma variação regional na resposta contrátil que, apenas de ambas
extremidades apresentarem os dois tipos de receptores, o motivo pelo qual o
segmento prostático é mais sensível ao ATP enquanto o epididimal é mais sensível a
noradrenalina continua sob investigação. Entretanto, tal variação permite que as
respostas sejam estudadas separadamente ao biseccionar o canal deferente em duas
porções, a prostática e a epididimal.
Os ratos foram eutanasiados sob anestesia com isoflurano (via inalatória).
Para a dissecção dos canais deferentes, foi realizada uma incisão abdominal acima
do pênis, expondo a cavidade abdominal. Os canais deferentes de ambos os lados
foram isolados a partir da cauda do epidídimo até a próstata. Após sua dissecação,
os canais deferentes foram seccionados em duas porções (epididimal e prostática) e
74
suspensos em uma cuba de 5 mL, contendo solução nutritiva de Tyrode (composição
no tópico 3.4.1.1), constantemente gaseificada com carbogênio e mantida à 37C.
As preparações foram submetidas a tensão de 1 g e estimuladas por meio
de eletrodos bipolares via estímulo de campo (10Hz, 5ms, voltagem supramáxima;
estimulador GRASS S48 - Grass Medical Instruments, Quincy, MA, E.U.A.) por meio
de trens de 1 e 10s na porção prostática e epididimal respectivamente. As contrações
musculares foram registradas em fisiógrafo de 4 canais PowerLab ML866, ligado a
amplificadores Quad Bridge ML224 (ADInstruments, New South Wales, Austrália) e a
um microcomputador Dell munido do software LabChart7, por meio de transdutores
isométricos PanLab TRI201AD (Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A).
Após um período de estabilização (30 min), diferentes concentrações do
veneno (1-30 µg/mL) foram adicionados à cuba e a resposta contrátil registrada por
120 min. A amplitude das respostas contráteis das duas porções (fásica da porção
prostática e tônica da epididimal) foram mensuradas a cada 10 min, respectivamente,
calculando-se a porcentagem dessa amplitude em relação ao valor basal (antes da
adição dos tratamentos).
Foram realizados ensaios na ausência de estimulação elétrica onde as
contrações foram induzidas por agonistas exógenos em músculos. Após o período de
estabilização (30 min), foram realizadas curvas concentração-resposta a
Noradrenalina (0,1 nM – 1mM) e ao ATP (100nM – 1mM) na ausência e após a adição
do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL). Tais curvas também foram realizadas em
tecidos pré-incubados com TTX (200 nM), afim de se retirar o componente pré-
juncional.
75
3.5 Estudo eletrofisiológico em tecidos
3.5.1 Potencial de membrana em repouso
O potencial de membrana em repouso corresponde a diferença de
potencial elétrico entre o meio extracelular (sendo esse o valor 0) e o meio intracelular
de uma célula em seu estado de repouso. Esses potenciais elétricos podem ser
medidos por meio de técnica eletrofisiológica utilizando microeletrodos.
3.5.1.1 Músculo esquelético
A preparação nervo frênico - hemidiafragma de camundongos, isolada
conforme descrito anteriormente (ver 3.4.1.2), foi fixada em cuba revestida de resina
e silicone (Sylgard; Dow Corning, Midland, MI, E.U.A), preenchida com 2 mL de
solução de Tyrode em temperatura ambiente (composição no tópico 3.4.1.1) e
constantemente areada com carbogênio à temperatura ambiente.
Para a medida do potencial de membrana das fibras musculares, utilizamos
microelétrodos com resistência entre 15-25 MΩ, confeccionados em puxador
horizontal P-30 Sutter Instruments (Novato, CA, E.U.A) a partir de capilares de vidro
borosilicato (1.5mm de diâmetro externo x 0.86mm de diâmetro interno; GC150F;
Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A). Estes foram preenchidos com KCl (3 mM)
e inseridos intracelularmente sobre as fibras musculares superficiais.
A diferença de potencial entre o eletrodo de referência (inserido na solução
nutritiva) e o microeletrodo de registro (inserido intracelularmente) foi medida por um
eletrômetro de alta impedância de entrada (modelo Electro 705; World Precision
Instruments, Hertfordshire, Reino Unido). O potencial elétrico do microelétrodo foi
ampliado por meio de um transdutor CED 1902 (Cambridge Electronic Design,
Cambridge, Reino Unido) e digitalizado por um conversor Analógico/Digital BCN-2110
(National Instruments, Newbury, Reino Unido), e então registrados e analisados
76
através do software WinEDR (John Dempster, University of Strathclyde, Glasgow,
Reino Unido).
Foram realizadas leituras nos tempos zero (controle) e em 5, 10, 15, 30,
60, 90 e 120 min após a adição do veneno (0,3 µg/mL).
3.5.1.2 Músculo liso
Os canais deferentes foram isolados de camundongos conforme
metodologia descrita anteriormente (ver 3.4.2.1), biseccionados, abertos
longitudinalmente e o epitélio luminal removido. A porção prostática foi
cuidadosamente fixada em cuba de perfusão revestida de resina e silicone (Sylgard;
Dow Corning, Midland, MI, E.U.A.) conectada a um controlador de temperatura (Sachs
elektronic, Munique, Alemanha) e preenchida com solução de Tyrode (composição no
tópico 3.4.1.1) constantemente areada com carbogênio à 37 ºC.
Para a medida do potencial de membrana das células musculares,
utilizamos microeletrodos de vidro borosilicato (1.2mm de diâmetro externo x 0.69mm
de diâmetro interno; GC120F; Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A) com
resistência entre 40-80 MΩ e preenchidos com 3 mM de KCl. A estratégia utilizada foi
semelhante àquela descrita anteriormente para músculo esquelético (ver 3.4.1.1). Os
empalamentos aceitos foram apenas os que satisfaziam os seguintes critérios: i)
penetração na célula abrupta e o potencial registrado mais negativo do que o potencial
inicial; ii) potencial de membrana estável. Foram realizadas leituras nos tempos zero
(controle) e em 5, 10, 15, 30, 60, 90 e 120 min após a adição do veneno (0,3 µg/mL).
77
3.5.2 Potenciais pós-juncionais
3.5.2.1 Potencial de placa terminal em miniatura (MEPPs)
Ocasionalmente durante o estado de repouso, pequenas quantidades de
acetilcolina são espontaneamente liberadas na fenda sináptica pelo nervo motor que,
ao ativar os nAChR, gera uma pequena despolarização na membrana pós-juncional
chamada potencial de placa termina em miniatura (MEPP de miniature end-plate
potential). Embora essa despolarização não seja suficiente para deflagrar um
potencial de ação muscular e embora a função biológica não esteja totalmente
elucidada, este mecanismo parece ser essencial para a manutenção do estado
responsivo do músculo (241,243,262).
Tais potenciais foram avaliados em preparação nervo frênico -
hemidiafragma de camundongos (ver 3.4.1.2) fixadas em cuba revestida de resina e
silicone (Sylgard; Dow Corning, Midland, MI, E.U.A.), preenchida com 2 mL de solução
de Tyrode em temperatura ambiente (composição no tópico 3.4.1.1) constantemente
areada com carbogênio.
Para a medida dos MEPPs, os microeletrodos de vidro borosilicato (1.5mm
de diâmetro externo x 0.86mm de diâmetro interno; GC150F; Harvard apparatus,
Holliston, MA, E.U.A), com resistência entre 15-25 MΩ e preenchidos com KCl (3 mM),
foram inseridos intracelularmente sobre as fibras musculares superficiais, na região
da placa motora. Esta região é caracterizada por ramificações nervosas ao
microscópio, sendo que os MEPPs com tempos de despolarização menores que 1 ms
são indicadores de que o empalamento foi realizado próximo à região pretendida. Os
MEPPS foram medidos nos tempos zero (tempo 0) e 5, 10, 15, 30, 60, 90 e 120 min
após a adição de 0,3 µg/mL de veneno de T. bahiensis.
78
3.5.2.2 Potencial de placa terminal (EPP)
Após um potencial de ação nervoso percorrer o axônio do nervo motor e
atingir o botão sináptico, ocorre a liberação sincronizada de acetilcolina para a fenda
sináptica que ao se ligar ao receptor nicotínico na membrana celular pós-sináptica,
promove um potencial elétrico decorrente da despolarização, que leva a um potencial
de ação muscular e posterior contração do músculo. Esse potencial pós-juncional é
chamado de potencial de placa terminal (EPP de end-plate potential).
Os EPPs foram avaliados em preparação nervo frênico - hemidiafragma de
camundongos (ver 3.4.1.2) que foi isolada e fixada em cuba revestida de resina e
silicone (Sylgard; Dow Corning, Midland, MI, E.U.A.), preenchida com 2 mL de solução
de Tyrode em temperatura ambiente (composição no tópico 3.4.1.1) e constantemente
areada com carbogênio, entretanto com baixa concentração de cálcio (0,4 mM) afim
de se reduzir o conteúdo quântico e evitar que que, em caso de facilitação, esta não
seja subestimada.
Para evitar que se houvesse deflagração do potencial de ação
muscular/contração pela estimulação elétrica do nervo (o que prejudica a leitura ao
causar o deslocamento do microeletrodo), adotou-se a técnica de cut muscle que
consiste no corte dos feixes musculares conectados ao tendão central e às cartilagens
costais e costelas. Tal técnica permite a despolarização das fibras musculares que
não são capazes de gerar potenciais de ação.
Os EPPs foram obtidos em resposta à estimulação elétrica indireta por
meio de eletrodo de platina posicionados no coto distal do nervo frênico (voltagem
sendo o dobro do threshold, 1 Hz, 0,2 ms; estimulador GRASS S48; Grass Medical
Instruments, Quincy, MA, E.U.A.).
Para a medida dos EPPs, os microeletrodos de vidro borosilicato (1.5mm
de diâmetro externo x 0.86mm de diâmetro interno; GC150F; Harvard apparatus,
Holliston, MA, E.U.A) com resistência entre 15-25 MΩ e preenchidos com KCl 3 mM
foram inseridos intracelularmente sobre as fibras musculares superficiais, na região
da placa motora, conforme detalhado acima (ver 3.4.2.1). Os EPPs foram medidos
nos tempos zero (tempo 0) e 5, 10, 15, 30, 60, 90 e 120 min após a adição de 0,3
µg/mL de veneno de T. bahiensis.
79
3.5.2.3 Potencial excitatório juncional espontâneo (SEJP)
Assim como observado na junção neuromuscular, os neurotransmissores
liberados dos terminais nervosos autonômicos de forma espontânea e evocada
interagem com os receptores ionotrópicos e promovem uma mudança transitória no
potencial da membrana, aqui denominados de potenciais juncionais excitatórios
espontâneos (liberação espontânea) e potenciais juncionais excitatórios evocados
(263–265). Embora a exocitose dos neurotransmissores ocorra também pelas
varicosidades durante a condução do impulso, os potenciais de junção inibitórios e
excitatórios ocorrem apenas nas proximidades da junção neuroefetora (253,254).
Durante o período refratário e repouso, os nervos simpáticos que inervam
os canais deferentes espontaneamente liberam pequenas quantidades de
neurotransmissores na fenda sináptica, que é essencial para a manutenção das
junções neuroefetoras no músculo liso do canal deferente. No canal deferente
especificamente, as alterações nos potenciais elétricos pós-sinápticos são devidas às
respostas purinérgicas (266,267) quando a interação do ATP com seu receptor
ionotrópico P2x na membrana do músculo liso produz o chamado potencial excitatório
juncional espontâneo (SEJP de spontaneous excitatory junction potential).
Os SEJPs foram avaliados em canais deferentes de camundongos
conforme metodologia descrita anteriormente (ver 3.4.2.1), biseccionados, abertos
longitudinalmente e cujo epitélio luminal foi removido. Uma vez que a contração da
porção prostática é gerada principalmente por estimulação purinérgica, os
experimentos foram realizados utilizando esta porção, que foi cuidadosamente fixada
em cuba de perfusão revestida de resina e silicone (Sylgard; Dow Corning, Midland,
MI, E.U.A.) conectada a um controlador de temperatura (Sachs elektronic, Munique,
Alemanha) e preenchida com solução de Tyrode (composição no tópico 3.4.1.1)
constantemente areada com carbogênio a 37 ºC.
Para a medida do potencial de membrana das células musculares, os
microelétrodos de vidro borosilicato (1.2mm de diâmetro externo x 0.69mm de
diâmetro interno; GC120F; Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A) com (resistência
entre 40-80 MΩ e preenchidos com KCl (3 mM) foram inseridos intracelularmente
sobre as células superficiais, conforme detalhado anteriormente (ver 3.5.1.2). Os
80
SEJPs foram medidos nos tempos zero (tempo 0) e 5, 10, 15, 30, 60, 90 e 120 min
após a adição de 0,3 µg/mL de veneno de T. bahiensis.
3.5.3 Potenciais pré-sinápticos
3.5.3.3 Potencial de ação nervoso
O impulso nervoso é propagado por meio de despolarização causada pelo
fluxo de íons ao longo do axônio do nervo. No botão sináptico, esse impulso resulta
na liberação dos neurotransmissores na fenda sináptica. Esse impulso nervoso é
chamado de potencial de ação nervoso.
Para registro extracelular do potencial de ação nervoso, nervos-ciáticos de
camundongos foram dissecados e acondicionados em solução nutritiva Tyrode
(composição no tópico 3.4.1.1). O nervo foi disposto horizontalmente sobre uma cuba
composta por 3 poços isolados entre si, e preenchidos com Solução Tyrode. A porção
inicial do axônio foi submersa no primeiro poço e estimulada eletricamente (voltagem
sendo o dobro do threshold, 1 Hz, 0,05 ms; estimulador GRASS S48; Grass Medical
Instruments, Quincy, MA, E.U.A.); a porção mediana e mais extensa do nervo foi
alocada no poço central juntamente com o eletrodo de referência; e por último, uma
pequena porção da extremidade final foi submersa no último poço, onde também
estava submerso um eletrodo de registro.
A diferença de potencial entre o eletrodo de referência e o microeletrodo de
registro foi ampliada por meio de um transdutor CED 1902 (Cambridge Electronic
Design, Cambridge, Reino Unido), digitalizada por um conversor Analógico/Digital
BCN-2110 (National Instruments, Newbury, Reino Unido) e então registrada e
analisada através do software WinEDR (John Dempster, University of Strathclyde,
Glasgow, Reino Unido).
Foram realizadas leituras nos tempos zero (tempo 0) e 5, 10, 15, 30, 60, 90
e 120 min após a adição de 0,3 µg/mL de veneno de T. bahiensis.
81
3.5.3.4 Formas de ondas perineurais
As formas de ondas perineurais são registros pré-sinápticos obtidos da
bainha perineural do terminal nervoso e a partir dos mesmos é possível observar a
ação das substâncias sobre as correntes de sódio, potássio e cálcio do terminal
nervoso. O registro é composto por duas grandes correntes negativas distintas, sendo
que a primeira está relacionada à entrada de sódio no nervo e a segunda corrente
relaciona-se principalmente a saída de potássio mas também ao influxo de cálcio no
terminal nervoso que só pode ser observado quando há o bloqueio das correntes de
potássio (268).
Esses registros de ondas perineurais foram obtidos em preparação nervo-
músculo triangularis sterni (transverso do tórax ou triangular do esterno) de
camundongo. Após eutanasia dos animais com CO2 (via inalatória), a caixa torácica
foi removida e transferida a uma placa de Petri conectada a um sistema de perfusão
de fluxo constante (20 a 25 mL/min) preenchida por Solução Tyrode (composição no
tópico 3.4.1.1) e constantemente gaseificada.
Todo tecido conjuntivo, camadas de músculos peitorais e intercostais
(externos e internos), costelas (3º a 5º costela) e vasos torácicos internos foram
cuidadosamente removidos para a exposição do triangular do esterno e terminais
nervosos. A preparação foi transferida e fixada com a face torácica virada para baixo
em cuba de registro revestida de resina e silicone (Sylgard; Dow Corning, Midland, MI,
E.U.A) contendo solução Tyrode gaseificada com carbogênio.
O axônio do nervo intercostal correspondente foi conectado a um
estimulador (voltagem sendo o dobro do threshold, 0,5 Hz, 50 µs de duração;
estimulador GRASS S48; Grass Medical Instruments, Quincy, MA, E.U.A.) via eletrodo
de sucção para que se produza potencial de ação nervoso. Para evitar que houvesse
deflagração do potencial de ação muscular/contração pela estimulação elétrica do
nervo (que prejudicaria a leitura ao causar o deslocamento do microelétrodo), fez-se
necessário o uso de d-Tubocurarina (14,7 µM) e emprego da técnica de cut muscle
(ver em 4.4.2.2) adaptada da preparação NFD para triangularis sterni.
Para a medida das formas de ondas perineurais, os microelétrodos de vidro
borosilicarto (1.5mm de diâmetro externo x 0.86mm de diâmetro interno; GC150F;
Harvard apparatus, Holliston, MA, E.U.A) com (resistência entre 5-25 MΩ e
82
confeccionados em puxador vertical 700 D (David Kopf Instruments, CA, E.U.A.) foram
posicionados sobre as ramificações do nervo intercostal e inserido superficialmente à
região perineural.
A diferença de potencial entre o eletrodo de referência e o microeletrodo de
registro inserido na face extracelular da membrana neuronal foi medida por um
eletrômetro de alta impedância de entrada modelo Electro 705 (World Precision
Instruments, Hertfordshire, Reino Unido). O potencial elétrico do microeletrodo foi
ampliado por meio de um transdutor CED 1902 (Cambridge Electronic Design,
Cambridge, Reino Unido) e digitalizado por um conversor Análogo/Digital BCN-2110
(National Instruments, Newbury, Reino Unido) e então registrados e analisados
através do software WinEDR (John Dempster, University of Strathclyde, Glasgow,
Reino Unido).
Foram realizadas leituras nos tempos zero (tempo 0) e 5, 10, 15, 30, 60, 90
e 120 min após a adição de 0,3 µg/mL de veneno de T. bahiensis.
3.6 Cultura de células neuronais
3.6.3 Cultura celular de neuroblastoma
A linhagem celular ND7-23 wild type (Sigma–Aldrich Chemical Co. Ltd.,
Irvine, Reino Unido) é uma linhagem híbrida de neuroblastomas de camundongo com
neurônios do GRD de ratos neonatos, fundidos quimicamente pelo uso de
polietilenoglicol (PEG).
A cultura foi mantida em meio suplementado Gibco® RPMI 1640 (Life
Technologies Ltd., Paisley, Reino Unido) suplementado com soro fetal bovino (10%),
estreptomicina (1%), penicilina (1%), L-glutamina (1%), piruvato de sódio (1%) e
aminoácidos não essenciais (1%) à 37 ºC em atmosfera úmida e controlada com 5%
de CO2. As células cresceram in frascos de cultura de 25 cm2 e o meio de cultura foi
trocado sempre que necessário, não ultrapassando três dias. A dissociação celular foi
83
realizada pela adição de Gibco® TrypLE™ Express (Life Technologies, Paisley, Reino
Unido) por 3 min, seguida pela centrifugação (1000 rpm, 2,5 min), ressuspensão em
meio RPMI e inserção em coverslips de 13 mm (para imagem de cálcio, ver em 4.7)
ou solução externa (para patch-clamp, ver em 4.6).
3.6.4 Cultura primária de neurônios do GRDs
Filhotes de ratos Wistar de ambos os sexos (idade entre 3 e 8 dias) foram
eutanasiados por decapitação. Os gânglios da raiz dorsal de todos os níveis espinais
foram removidos assepticamente como descrito por Sleigh e colaboradores (269) e
transferidos imediatamente para um meio Gibco® RPMI 1640 (Life Technologies Ltd.,
Paisley, Reino Unido). O tecido conjuntivo e axônios remanescentes foram
cuidadosamente removidos.
Os gânglios limpos foram centrifugados (1000 rpm por 4 min) e
ressuspendidos em 5 mL Gibco® Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (Life
Technologies Ltd., Paisley, Reino Unido) contendo 1,5 mg/mL de dispase (tipo II,
Roche Life Sciences, Burgues Hill, UK) e colagenase (tipo P, Worthington Biochemical
Corporation, Lakewood, NJ, E.UA.) por 1 hora a 37 ºC.
Após a dissociação enzimática, os gânglios foram gentilmente triturados
utilizando pipetas de 1000µL e 200µL para induzir a dissociação mecânica. A
suspensão de células foi então centrifugada (1000rpm por 4min), re-suspendida em
Gibco® RPMI 1640, incluída sobre uma coverslip (13mm) pré-revistida com HBSS
contendo Poli-D-lisina (0,1 mg/mL) e Laminina (0,01 mg/m L) e deixada para de
acomodar por 20 – 30 min a 37 ºC.
Após assentadas na coverslip, a cultura celular foi mantida em meio Gibco®
RPMI 1640 media suplementado com soro fetal bovino (10%), estreptomicina (1%),
penicilina (1%), L-glutamina (1%), piruvato de sódio (1%), aminoácidos não-essenciais
(1%) a 37 ºC em atmosfera úmida e constantemente gaseificada carbogênio (95% O2,
5%CO2) para ser utilizada dentro de 5 dias. Cytosine β D arabinofuraside (10µM;
Sigma-Aldrich, Gillingham, Reino Unido), também foi adicionado à cultura para evitar
o crescimento de células não-neurais.
84
3.7 Eletrofisiologia em célula isolada - Whole cell patch-clamp
O método de patch-clamp é a versão contemporânea mais comum do
voltage-clamp tradicional (de dois eletrodos) sendo que a principal diferença entre as
duas técnicas é que este último, por empregar dois eletrodos intracelulares, tem o uso
restrito a células de grande diâmetro como neurônios de lula e oócitos de Xenopus sp.
enquanto o patch-clamp emprega apenas um eletrodo em uma minúscula parte
(patch) da membrana, podendo ser utilizado em células de menor diâmetro. Nos dois
casos, é possível que o potencial ou voltagem (voltage, em inglês) da membrana seja
controlado/fixado (“clamped”, em inglês) em níveis pré-determinados e as variações
no potencial de membrana sejam registradas (que indicam o fluxo de corrente pela
abertura dos canais iônicos; controlados por ligantes ou voltagem).
A instrumentação utilizada foi configurada para whole-cell patch-clamp e
consistiu de:
• uma mesa anti-vibratória que garante a estabilidade mecânica ao equipamento,
reduzindo consequentemente ruídos e vibrações externas que poderiam vir a
atrapalhar os registros;
• uma gaiola de Faraday montada sobre a mesa anti-vibração, que evita a
interferência de ondas eletromagnéticas na corrente registrada;
• um microscópio invertido Olympus CK 2 (Olympus Optical CO, LTD., Londres,
Reino Unido) que permite a visualização das células e da micropipeta ao mesmo
tempo; o microscópio era acoplado a uma câmera USB3 Grasshopper3 modelo
GS3-U3-15S5M-C (FLIR Integrated Imaging Solutions Inc.);
• um micromanipulador Hydraulic Micromanipulator MHW-3 (Narishige Co., Ltd.,
Tóquio, Japão) que permite, por meio de controle hidráulico, movimentar a
micropipeta em três eixos;
• um amplificador AxoPatch 1D (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, E.U.A.)
utilizado para amplificar e filtrar os sinais obtidos e para compensação de
capacitâncias e resistências;
85
• Microcomputador Dell munido de um software para análise “Whole Cell Analysis
Program” - WCP (John Dempster, University of Strathclyde), cujo qual recebe e
analisa os dados, gera pulsos e pode também controlar o AxoPatch 1D.
• Conversor A/D e D/A BNC-2110 (National Instruments Co. Ltd., Austin, TX,
E.U.A.), que converte o sinal digital gerado pelo WinWCP para analógico, assim
como o sinal emitido pela célula para digital (registrado pelo WCP).
Para o registro da corrente de sódio, neuroblastomas (ND7-23 wild type,
ver cultura em 4.6.1) foram mantidos em solução externa (composição em mM: NaCl
129, KCl 3,25, CaCl2 2, MgCl2 2, HEPES 10, Glicose 11, TEA-Cl 20, pH 7,2 a 7,4
ajustado com NaOH) em temperatura ambiente (20–22°C).
Foram utilizadas pipetas polidas com fogo confeccionadas a partir de
microcapilares de vidro (GC150F-10, Harvard Apparatus Ltd., Holliston, MA, E.U.A.)
utilizando puxador P-87 (Sutter Instrument Co., Novato, CA, E.U.A) cuja resistência
deve estar entre 1,5 e 3 MΩ quando preenchida com solução interna (composição em
mM: CsF 120, NaCl 10, HEPES 10, EGTA 11, TEA-Cl 10, CaCl2 1, MgCl2 1, pH entre
7,2 e 7,4 ajustado com KOH). Tal pipeta, ao ser pressionada contra a membrana
plasmática das células, forma um selo (seal em inglês) entre pipeta e célula
aumentando a resistência do sistema; este selo, que deve possuir a resistência e
estabilidade mecânica altas (normalmente referidas como gigaseal), é essencial para
melhorar o isolamento do patch (“pedaço”) de membrana à solução externa e para
diminuir o “vazamento” de corrente. Após atingir o gigaseal, o transiente capacitivo da
micropipeta era eletronicamente cancelado.
Posteriormente, o patch da membrana é rompido por sucção com a pipeta
ainda vedada à célula, fornecendo acesso ao interior da célula (whole-cell traduz-se
para célula-inteira). Essa condição era percebida com o aumento brusco do transiente
capacitivo da célula, que foi eletronicamente cancelado e os erros de voltagem foram
minimizados ao aplicar uma compensação de resistência em série entre 75 e 95%. As
correntes lineares de vazamento foram subtraídas off-line usando-se o protocolo de
subtração P/4. Os artefatos de voltagem, capacitância da célula e resistência em série
foram devidamente cancelados antes da execução dos protocolos.
A corrente total de sódio foi evocada a partir do potencial de membrana
(holding potential, - 120 mV) para um potencial de comando. A curva de relação entre
voltagem e corrente foi obtida por pulsos de 25 ms iniciando em degraus de 5 mV (de
86
−90 a +80 mV), a cada segundo; tais correntes foram amostradas a 10 kHz após
serem filtrados a 2 kHz.
Os registros foram realizados antes e 10 minutos após a adição do veneno
bruto de T. bahiensis (10 µg/mL).
3.7.3 Análise dos dados
3.7.3.3 Curva da relação entre corrente e voltagem (Curva I/V)
A Curva I/V relaciona a corrente (I) obtida pela a aplicação das diferentes
voltagens (V) conforme o protocolo acima (step de voltagens). A corrente é obtida
após normalizar o valor registrado da corrente (pA) em cada step de voltagem pela
capacitância da célula (pF).
𝐼 =𝑝𝐴
𝑝𝐹
A capacitância das células pode ser obtida diretamente no amplificador
após a compensação da capacitância da célula.
87
3.7.3.4 Condutância macroscópica
A condutância macroscópica da célula (G) foi obtiva a partir da curva I-V e
calculada conforme a Lei de Ohms:
𝐺 =𝐼
𝑉 − 𝑉𝑟𝑒𝑣
Onde:
- I é a corrente já normalizada relativa a determinada voltagem de comando
(V).
- Vrev é o Potencial de reversão.
O potencial de reversão é a voltagem que, quando excedida, promove a
mudança na direção (ou inibição) do fluxo de íons (no caso de sódio) através da
membrana. Tal potencial pode ser obtido teoricamente por meio da Equação de
Nernst (descrita abaixo) ou diretamente na curva I/V (voltagem de comando cuja
corrente se torna novamente 0 ou positiva).
𝑉𝑟𝑒𝑣 = 𝑅 𝑇
𝑧 𝐹ln
[í𝑜𝑛]𝑒𝑥𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎
[í𝑜𝑛]𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎
Onde:
- R é a constante dos gases (8.314 J. K-1 . mol-1);
- T é a temperatura em Kelvin (ºC + 273,15);
- z é a valência dos íons (+1 no caso de sódio);
- F é a constante de Faraday (96485,3 C. mol-1);
- [íon] é a concentração externa (solução externa utilizada) e interna dos
íons.
88
3.7.3.5 Curva de ativação (G/Gmax)
A condutância máxima de cada célula (Gmax) foi obtida seguindo a seguinte
equação:
𝐺𝑚𝑎𝑥 =𝐼𝑚𝑎𝑥
𝑉𝐼𝑚𝑎𝑥 − 𝑉𝑟𝑒𝑣
Onde:
- Imax é pico de corrente, ou seja, o máximo de corrente levando em conta
todos os steps de voltagem;
- Voltagem de comando que originou Imax;
- Vrev é o Potencial de reversão.
Para a curva de ativação, os valores das condutâncias referentes às
diferentes voltagens de comando (G) foram normalizados à Gmax (G/Gmax). Os
resultados foram então plotados contra os potenciais de comando e ajustados à
equação de Boltzmann a seguir:
𝐺 = 𝐺𝑚𝑎𝑥 [1 + exp( 𝑉1 2⁄ − 𝑉
𝑘⁄ )]
Onde:
- Gmax é a condutância máxima da célula;
- V1/2 é a voltagem onde metade dos canais estão ativados;
- V é a voltagem de comando;
- k é a inclinação da curva.
89
3.8 Imagem de cálcio
Os movimentos intracelulares de Ca2+ foram monitorados em neurônios
ND7-23 (ver cultura em 3.5.3), neurônios do GRD (ver 3.5.4) e em fibras musculares
de preparações triangular do esterno (ver 3.4.3.4) utilizando indicador fluorescente
sensível ao Ca2+ (Fluo-4 AM; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, E.U.A.). As
soluções estoque dos indicadores fluorescentes foram preparadas a 1 mM em
dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich) e armazenadas em -20 ºC o momento do uso.
Neste trabalho utilizou-se o Fluo-4AM (Fluo-4 acetoximetil ester) uma vez
que esta forma é permeável à membrana plasmática. Tal composto não se liga por si
só ao cálcio, porém adentra as células por difusão e, quando em ambiente intracelular,
os grupos ésteres são hidrolisados enzimaticamente a Fluo-4 por esterases
endógenas, se tornando impermeáveis à membrana, permanecendo assim em
ambiente intracelular. Caso ocorra alteração na concentração de Ca2+ dentro da
célula, o indicador se liga a este íon, exibindo aumento na fluorescência.
As coverslips (lamínulas redondas para cultivo de células em placa de
cultura) contendo as células (ND7-23 e GRDs) e tecidos (triangular do esterno) foram
incubadas com Fluo-4AM (4 µM em meio de cultura e 8 µM em solução Tyrode,
respectivamente) por pelo menos 1 h, estando as células em incubador de cultura
celular (a 37 ºC em atmosfera úmida e controlada com 5% de CO2) e tecidos em
ambiente escuro a temperatura ambiente e constantemente aerados com carbogênio.
Após incubação as células foram lavadas com solução Tyrode (ver composição em
ver 3.3.1.1) para remover os indicadores que não incorporaram à célula, e deixadas
para equilibrarem por 20 min antes da adição do veneno (0,3 µg/mL em neurônios
ND7-23 e 10 µg/mL em neurônios do GRD e fibras musculares). Todos os registros
foram realizados à temperatura ambiente.
As imagens foram capturadas utilizando uma câmera USB3 Grasshopper3
modelo GS3-U3-15S5M-C (FLIR Integrated Imaging Solutions Inc.; Richmond, BC,
Canadá) acoplada a um microscópio invertido epifluorescente Zeiss Axioskop 50 (Carl
Zeiss, Oberkochen, Alemanha). A luz de excitação foi provida por uma lâmpada de
mercúrio de aro curto 50W (Osram, Munique, Alemanha) e filtrada através do jogo de
90
filtros 9 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), que consiste em um filtro de excitação
(BP 450–490 nm), um divisor de feixe (FT 510 nm) e um filtro de emissão (LP 520 nm).
Todas as imagens foram adquiridas por meio do software WinFluor (John
Dempster, University of Strathclyde, Glasgow, Reino Unido) a 2 frames/s e tempos de
exposição entre 100 e 500 ms. Para as análises quantitativas, plano de fundo e células
foram demarcados como regiões de interesse e o sinal de fluorescência do plano de
fundo foi subtraído do sinal das células. Os dados foram expressos em % do valor
basal (antes de adição do veneno).
3.9 Análise Estatística
Os resultados são representados pela média de experimentos erro
padrão da média conforme indicado nas legendas.
Para comparar os tratamentos utilizou-se t-Student (pra avaliar as médias
entre dois grupos) ou ANOVA (análise de variância quando em para medidas
repetidas) seguida de teste post-hoc de Dunnet (comparar os grupo ao controle) ou
Tukey (comparar todos os grupos), dependendo do conjunto de dados submetidos à
análise. Valores de p < 0,05 indicam significância.
91
4. RESULTADOS
4.1 Ensaios miográficos
4.1.1 Junção neuromuscular
4.1.1.1 Extensor digitorum longus de camundongo (EDL)
O veneno de Tityus bahiensis foi inicialmente testado em extensor
digitorum longus (EDL), uma preparação muito utilizada como modelo representativo
de músculos de contração rápida. As preparações EDL foram indiretamente
estimuladas (contrações obtidas por estimulação do nervo) sob estímulo de campo,
na ausência e na presença de diferentes concentrações do veneno bruto de Tityus
bahiensis.
A menor concentração testada (1 µg/mL) promoveu facilitação na
contração muscular e à medida em que a concentração de veneno aumentou (> 3
µg/mL), o efeito facilitatório foi abolido, dando lugar ao bloqueio da contração
muscular. Em concentrações acima de 10 µg/mL o bloqueio neuromuscular foi total e
irreversível (Figura 5A). O bloqueio neuromuscular promovido pela concentração de
30 µg/mL (dados não mostrados) foi semelhante ao promovido pela de 10 µg/mL. As
preparações não sofreram contratura (Figura 5B e 5C).
92
Figura 5. Atividade neuromuscular do veneno bruto de Tityus bahiensis em preparações extensor digitorum longus (EDL) de camundongo. Os músculos foram submetidos à estímulo de campo (1Hz, 0.2ms, voltagem supramáxima) e incubados com solução Tyrode na ausência (controle) ou presença do veneno (1 - 10μg/mL) por 120 min a 37 °C. Os resultados são expostos em forma gráfica (painel A) e traçado representativo do registro das preparações incubadas com 1 µg/mL (painel B) e 10 µg/mL (painel C). Note que a concentração mais baixa (1 µg/mL) promove facilitação enquanto altas concentrações (10 µg/mL) causam bloqueio neuromuscular. Os pontos representam a média ± EPM de 4 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
93
4.1.1.2 Nervo frênico - diafragma de camundongo (NFD)
Os músculos hemidiafragma isolados com seus respectivos nervo-frênicos
foram indiretamente estimulados. A menor concentração do veneno bruto de T.
bahiensis (1 µg/mL) promoveu facilitação da resposta contrátil e, ao aumentar a
concentração do veneno (3 e 10 µg/mL), esta facilitação diminuiu de amplitude,
chegando a bloqueio total e irreversível na concentração de 30 µg/mL (Figura 6A) aos
50 ± 12 min (n=5; média ± EPM). Nota-se que uma marcante facilitação nos primeiros
10 minutos precedeu o bloqueio neuromuscular induzido pela alta concentração (30
µg/mL).
Por meio de preparações previamente curarizadas foi possível mensurar a
atividade do veneno em músculos diretamente estimulados. Nessas condições, foi
observado bloqueio da contração muscular dependente do tempo de incubação e da
concentração de veneno utilizada. O bloqueio máximo (86 ± 7% de bloqueio) na maior
concentração utilizada (30 µg/mL), entretanto não houve diferença significativa entre
as duas maiores concentrações (10 e 30 µg/mL) (Figura 6B).
94
Figura 6. Atividade neuromuscular do veneno bruto de Tityus bahiensis em preparações nervo frênico – diafragma (NFD) de camundongo. Os músculos foram estimulados de forma indireta (contrações neurogênicas) (A) ou direta (B) e incubados com solução Tyrode na ausência (controle) ou presença do veneno (1 – 30 μg/mL) por 120 min a 37 °C. Note i) em músculos indiretamente estimulados, a concentração menor (1 μg/mL) promoveu facilitação da contração enquanto a mais alta concentrações (30 µg/mL) causa bloqueio neuromuscular ii) a facilitação da contração não é observada em músculos diretamente estimulados, visualizando-se apenas bloqueio parcial e dependentes do tempo e concentração. Os pontos representam a média ± EPM de 5-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
A
B
95
A figura 7 (A-D) mostra registros representativos para estimulação indireta
e direta na presença do veneno em concentração baixa (1 µg/mL) e alta (30 µg/mL).
Figura 7. Registros representativos da atividade do veneno de Tityus bahiensis em preparações nervo frênico – diafragma (NFD) de camundongos. Os músculos foram indiretamente (A, B) ou diretamente estimulados (C, D) e incubados com solução Tyrode (controle), na presenta e ausência do veneno de T. bahiensis (A,C: 1 µg/mL. B, D: 30 µg/mL). Note que a facilitação da contração muscular promovida por baixa concentração de veneno foi observada apenas em músculos indiretamente estimulados, indicando que tal efeito facilitatório é de origem pré-sináptica. Em relação ao bloqueio promovido por alta concentração de veneno (30 µg/mL), embora também seja observado em músculos diretamente estimulados, este foi mais rápido e efetivo em preparações indiretamente estimuladas do que diretamente estimuladas, indicando que bloqueio total também tem origem pré-sináptica.
A
B
C
D
96
A partir dos registros miográficos das preparações NFD pode-se avaliar a
atividade do veneno na velocidade de contração e relaxamento muscular, calculados
pelo tempo entre a tensão basal até o pico, e do pico ao basal, respectivamente. Em
músculos indiretamente estimulados (Figura 8A), a velocidade de contração e o
relaxamento tornaram-se significativamente mais lentos após a incubação do veneno
bruto (10 µg/mL). Não foram observadas alterações significativas em músculos
curarizados e diretamente estimulados (Figura 8B), sugerindo mais uma vez atividade
predominantemente pré-sináptica do veneno.
A adição de altas concentrações de veneno bruto (>10 µg/mL) à
preparação induziu fasciculações e contrações espontâneas da preparação, mesmo
após bloqueio neuromuscular. Esta atividade se mostrou ausente ou muito reduzida
em preparações curarizadas (dados não mostrados).
97
Figura 8. Atividade do veneno bruto de Tityus bahiensis na velocidade de contração e relaxamento do diafragma. Os músculos foram indiretamente (A) e diretamente estimulados (B) após incubação com solução Tyrode na ausência (controle) e presença do veneno (10 µg/mL). Note que em contrações evocadas pelo nervo e após a adição do veneno, a contração e o relaxamento foram mais lentos que o valor basal. Por outro lado, não houve alteração significativa nos músculos diretamente estimulados. Os pontos representam a média ± EPM de 5-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal.
A
B
98
4.1.1.3 Biventer cervicis de pintainho (BCP)
Em preparações BCP, o veneno de T. bahiensis mostrou o mesmo padrão
de resposta que o observado nas preparações de mamíferos (EDL e NFD). Ou seja,
baixas concentrações de veneno (1 e 3 µg/mL) promovem facilitação enquanto alta
concentração (30 µg/mL) promove rápido bloqueio da contração muscular (Figura 9A).
Foram realizadas contraturas em resposta à adição exógena de ACh (20
nM), KCl (110 µM) e carbacol (CCh; 8µM) (Figura 9B). Tal resultado mostra o veneno
não possui efeitos diretos importantes no sarcolema, uma vez que a resposta ao KCl
não foi significativamente alterada. O veneno não parece ter atividade direta nos
nAChRs, uma vez que, embora exista uma tendência ao aumento na contratura, esse
aumento é observado apenas com ACh e não com CCh, sugerindo que essa
tendência no aumento da resposta à ACh não está relacionada a ação do veneno
nesses receptores.
Levando em consideração que o CCh é resistente à hidrólise pela AChE, o
aumento na resposta da ACh (que é rapidamente hidrolisada pela AChE) sem
alteração na resposta ao CCh pode indiretamente sugerir que o veneno possui algum
efeito anticolinesterásico - reduz a hidrólise levando a um aumento na resposta à ACh.
Porém, como as diferenças não são estatisticamente significantes, não se pode
afirmar tal fato.
99
Figura 9. Atividade neuromuscular do veneno de T. bahiensis em preparações biventer cervicis de pintainho sob estimulação indireta. A) Os músculos foram indiretamente estimulados (estímulo de campo, 1Hz, 0.2ms, voltagem supramaxima) e incubados com solução Krebs na ausência (controle) ou presença do veneno de T. bahiensis (1 – 30 μg/ml) por 120 min a 37 ºC. B) Contraturas em resposta ao KCl (110 μM), ACh (20 nM) e carbacol (CCh; 8µM) foram obtidas antes da adição do veneno (basal) e após 120 min. Note i) baixas concentrações promovem facilitação enquanto a mais alta (30 µg/mL) causa bloqueio da contração muscular. Os pontos e barras representam a média ± EPM de 4-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
A
B
100
Em preparações BCP curarizadas e diretamente estimuladas, a incubação com
veneno também produziu o efeito dependente da concentração: menores concentrações
(1-10 µg/mL) promovem facilitação e maior concentração (30 µg/mL) leva o bloqueio
(Figura 10A).
O efeito facilitatório promovido pelo veneno (1 - 3 µg/mL) em preparações
curarizadas diretamente estimuladas em solução Krebs usual (Figura 10A) foi totalmente
inibido em preparações não curarizadas incubadas meio desprovido de cálcio (Figura
10B), sugerindo que tal efeito facilitatório seja de origem pré-sináptica. Nessa condição, a
facilitação deu lugar a um bloqueio da contração muscular não dependente da
concentração, sendo o bloqueio máximo de 54,5 ± 9%, 66,2 ± 9% e 59,6 ± 4% para 3, 10
e 30 µg/mL respectivamente após 120 min de incubação.
101
Figura 10. Atividade neuromuscular do veneno de T. bahiensis em preparações biventer cervicis de pintainho (BCP) sob estimulação direta. Os músculos foram diretamente estimulados (1Hz, 20ms, voltagem supramáxima) e incubados com solução Krebs na ausência (controle) ou presença do veneno de T. bahiensis (1 – 30 μg/mL) por 120 min a 37 ºC. O bloqueio da transmissão pré-sináptica foi obtido pela pela pré-incubação dos músculos com dTC (50μM; A) em Krebs usual ou pela ausência do cálcio na solução nutritiva (B). Os pontos representam a média ± EPM de 4-5 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
A
B
102
A Figura 11 ilustra de forma qualitativa a atividade do veneno de T.
bahiensis no formato das contrações (velocidade de contração e relaxamento). A
incubação das preparações BCP com alta concentração de veneno (30 µg/mL) induz
um marcante retardo no tempo de relaxamento dos músculos sendo tal efeito
facilmente observado em músculos diretamente estimulados tanto nos pré-incubados
com dTC quanto nos mantidos em solução na ausência de Ca2+. Porém este efeito
não foi visualizado sob estímulo indireto uma vez que é observado aos 10 min de
incubação, quando a contração indireta já está praticamente bloqueada. A adição de
uma baixa concentração de tetrodotoxina (TTX, bloqueadora de canais de sódio)
reverte imediata e completamente tal retardo, sugerindo ação direta do veneno nos
canais de sódio dependentes de voltagem da musculatura esquelética, Nav 1.4 (Figura
11).
Figura 11. Traçados representativos da resposta contrátil dos músculos biventer cervicis de pintainho (BCP) após incubação com o veneno de Tityus bahiensis (30 µg/mL). Os músculos foram indiretamente estimulados (contrações evocadas via nervo) ou diretamente estimulados após pré-incubação com d-Tubocurarina (dTC) ou em solução na ausência completa de Ca2+. Note que o veneno promoveu um marcante retardo no relaxamento muscular (↑); tal atividade foi completa e rapidamente revertida (*) após a adição de TTX (5 nM). Os registros estão na mesma escala de duração mas não estão na mesma escala de amplitude para se otimizar a visualização do retardo no relaxamento muscular.
*
103
Alta concentração de veneno (30 µg/mL) foi capaz de promover contratura
dos músculos, observada nos registros como elevação da linha de base (Figura 12A).
Essa contratura mostrou-se ausente em preparações pré-incubadas com d-
Tubocurarina (Figura 12B) ou em tecidos mantidos na ausência de cálcio (Figura
12C).
Figura 12. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis em preparações biventer cervicis de pintainho (BCP). Os músculos foram indireta (A) ou diretamente estimulados após pré-incubação com dTC (B) ou mantidos solução na ausência de cálcio (C). O veneno (30 µg/mL) promoveu bloqueio da contração muscular sendo esse total (estimulação indireta; A) ou parcial (estimulação direta; B). Note que contratura promovida pelo veneno (A) foi essa inibida pela pré-incubação com dTC e pela ausência do cálcio na solução nutritiva. V: adição de veneno.
A contratura promovida por alta concentração de veneno em preparações
pôde também ser observada na ausência completa de estimulação elétrica, indicando
que tal efeito não é dependente de potencial de ação nervoso ou da liberação evocada
de neurotransmissores. Além de prevenir, a adição de dTC às preparações também
reverteu essa contratura (Figura 13A).
104
Por fim, na figura 13B mostramos que a incubação das preparações com
toxina botulínica (BoNT-A; 10 µg/mL) não preveniu a contratura, porém reduziu a
duração desta resposta.
Figura 13. Registro representativo da atividade do veneno T. bahiensis nas contraturas do biventer cervicis de pintainho (BCP). Os músculos foram inicialmente indiretamente estimulados para testar a viabilidade da preparação em solução Krebs na ausência (A) e presença de toxina botulínica (BoNT-A; 10 ug/mL; B). Após a estimulação ser desligada (antes da adição de veneno), foram adicionados 30 µg/mL do veneno de T. bahiensis à preparação (V). A contratura é prontamente revertida pela adição de dTC (↑).
4.1.2. Junção neuroefetora (canal deferente de rato)
A incubação do veneno de T. bahiensis em ambas porções do canal
deferente (prostática e epididimal) produziu o mesmo padrão de atividade mencionado
acima para as três diferentes preparações neuromusculares. Ou seja, baixas
concentrações de veneno (1 e 3 µg/mL) promoveram facilitação da resposta contrátil
enquanto alta concentração (30 µg/mL) de veneno levou ao bloqueio total da
contração muscular (Figura 14 A,B).
105
Figura 14. Atividade do veneno de T. bahiensis em canais deferentes biseccionados de ratos. As contrações fásica (A; referente à porção prostática de resposta predominantemente purinérgica) e tônica (B; referente à porção epididimal de resposta predominantemente noradrenérgica) foram obtidas via estímulo de campo (10 Hz, 5 ms, 60 V) por meio de trens de 1 e 10 s, respectivamente, a cada 2 min. Todos os músculos foram incubados com solução Tyrode na ausência (controle) e presença do veneno de T. bahiensis (1 – 30 μg/mL). Note i) baixas concentrações promovem facilitação enquanto a mais alta (30 µg/mL) causa bloqueio total da contração muscular. Os pontos representam a média ± EPM de 4-6 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
A figura 15 mostra os registros representativos das respostas do canal
deferente. À semelhança do BCP, o veneno promoveu contração sustentada
A
B
106
(elevação da linha de base) em ambas porções, sendo este efeito observado a partir
de 3 µg/mL de veneno. Fasciculações também foram observadas, especialmente na
porção epididimal do canal deferente (Figura 15).
Figura 15. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis nas porções epididimal (E) e prostática (P) de canais deferentes de ratos. Os músculos foram incubados com 1 (A), 3 (B), 10 (C) ou 30 (D) µg/mL de veneno e indiretamente estimulados (estímulo de campo; 10Hz, 5ms, 60V) por meio de trens de 1 (porção prostática; P) e 10s (porção epididimal; E) a cada 2 min. O veneno promoveu facilitação da contração muscular em baixas concentrações ou bloqueio em altas concentrações. Foram observadas contrações mantidas (elevações da linha de base) em resposta a concentrações ≥3 µg/mL do veneno. Fasciculações (↑) após a adição do veneno foram observadas nas porções epididimais. V: adição de veneno.
E
P
E
P
E
P
E
P
107
A contração sustentada das porções epididimal (Figura 16) e prostática
(Figura 17) também foi observada na ausência de estimulação elétrica. Além disso
incubação das preparações com veneno também levou ao aparecimento de
fasciculações e contrações espontâneas em ambas porções (Figura 16A e 17A).
Quando as porções (epididimal e prostática) foram pré-incubadas com TTX
(200 nM; bloqueador de canais de sódio, utilizado aqui afim de inibir a atividade
neuronal), não se visualizou o efeito contrátil (Figuras 16B, 17B), indicando que este
pode ser de origem pré-juncional.
A incubação com antagonista α1-adrenérgico (prazosina) reduziu, mas não
inibiu totalmente a contratura em ambas as porções, porém, a prazosina preveniu o
aparecimento das fasciculações e contrações (Figura 16C, 17C).
Por outro lado, a pré-incubação das preparações com PPADS (antagonista
dos receptores purinérgicos P2X) inibiu completamente a contração mantida em
ambas porções, epididimal (Figura 16D) e prostática (Figura 17D), ressaltando o
envolvimento do componente purinérgico nesta atividade.
A pré-incubação com d-Tubocurarina não inibiu a contração mantida
indicando que o veneno não tem atividade direta sobre os receptores nicotínicos pré-
juncionais (Figura 16E, 17E).
108
Figura 16. Registros representativos na porção epididimal de canal deferente de ratos incubados com veneno de T. bahiensis. Os músculos foram inicialmente estimulados (estímulo de campo, 10Hz, 5ms, 60V; trens de 10s a cada 2 min; n=4) e pré-incubados com solução Tyrode na ausência (A; controle), ou presença de TTX (B; 200 nM), Prazosina (C; 1 µM), PPADS (D; 30 µM) ou d-Tubocurarina (E; dTC; 50 µg/mL). Após estabilização dos efeitos das drogas, o estímulo elétrico foi desligado e o veneno adicionado (V; 10 µg/mL). As contrações mantidas foram inibidas nas preparações pré-incubadas com TTX e PPADS. W: lavagem.
A
B
C
D
E
B
109
Figura 17. Registros representativos na porção prostática de canal deferente de ratos incubados com veneno de T. bahiensis. Os músculos foram inicialmente estimulados (estímulo de campo, 10Hz, 5ms, 60V; trens de 1s a cada 2 min; n=4) e pré-incubados com solução Tyrode sozinho (A; controle), ou na presença de TTX (B; 200 nM), Prazosina (C; 0,1 µM), PPADS (D; 300 µM) e d-Tubocurarina (E; dTC; 50 µg/mL). Após estabilização dos efeitos das drogas, o estímulo elétrico foi desligado e o veneno adicionado (V; 10 µg/mL). As contrações mantidas foram inibidas pela pré-incubação da preparação com TTX e PPADS. W: lavagem.
Contrações também foram induzidas por meio de agonistas exógenos. A
pré-incubação com TTX (afim de se inibir o componente pré-juncional) não alterou
significativamente a curva concentração-resposta a noradrenalina em situação
controle (Figura 18A). A adição do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL) após pré-
incubação com TTX também não induziu alterações significativas na curva
concentração-resposta à NOR (Figura 18B).
A
B
C
D
E
B
110
Por outro lado, quando as preparações não são incubadas com TTX, o
veneno promove uma marcante contração muscular (como observado acima). Aqui a
curva em resposta a NOR não se demonstrou dependente da concentração (Figura
18C).
Figura 18. Atividade do veneno de T, bahiensis (10 µg/mL) na curva concentração-resposta a noradrenalina em porção epididimal do canal deferente de ratos. curvas concentração-resposta a noradrenalina foram realizadas em músculos pré-incubados ou não com TTX (200nM) (A). Em músculos pré-incubados com TTX, o veneno não foi capaz de produzir uma contração e não teve atividade sobre a curva concentração-resposta (B). Por outro lado, em preparações não pré-incubadas com TTX, o veneno promoveu uma marcante contração na preparação impedindo a resposta dependente da concentração dos músculos a noradrenalina (C). Os pontos representam a média ± EPM de 3-4 experimentos.
Também foram realizadas as curvas concentração-resposta ao ATP nas
porções prostáticas do canal deferente. Assim como observado acima, a pré-
incubação das preparações com TTX não afetou a contração em resposta ao agonista
111
(Figura 19A). O veneno, quando na ausência da TTX, promoveu uma marcante
contração muscular, o que influenciou no efeito do ATP sob o músculo (Figura 19B).
Nesta situação, a pré-incubação com TTX também, impediu que o veneno
produzisse a contração (como observado na Figura 14), entretanto, de forma
inesperada, houve uma redução na resposta do músculo ao ATP (dados não
mostrados). Levando em consideração que a TTX não afetou a curva concentração-
resposta, que a contração é inibida por TTX e PPADS (sugerindo que seja relacionada
ao ATP, porém em nível pós-juncional), se faz necessária uma investigação mais
apurada para confirmar, afirmar e discutir tal resultado.
Figura 19. Atividade do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL) na curva concentração-resposta ao ATP em porção prostática do canal deferente de ratos. As curvas concentração-resposta ao ATP foram realizadas em músculos pré-incubados ou não com TTX (200nM) (A). Em preparações não pré-incubadas com TTX, o veneno promoveu uma marcante contração na preparação impedindo a resposta dependente da concentração dos músculos ao ATP (B). Os pontos representam a média ± EPM de 4-7 experimentos.
112
4.2 Estudos eletrofisiológicos em tecidos inteiros
Levando-se em consideração a importância do componente neuronal na
atividade induzida pelo veneno bruto observada nos experimentos funcionais,
realizamos ensaios eletrofisiológicos para avaliar os efeitos do veneno sobre os
potenciais pré e pós-sinápticos. Para o estudo dos efeitos facilitatórios, adotou-se a
concentração de 0,3 µg/mL uma vez que concentrações mais altas (1 e 3 µg/mL)
promovem grande atividade espontânea que impossibilitam o empalamento das
preparações ou deslocam o microeletrodo interrompendo o registro.
4.2.1 Potencial de membrana em repouso.
Em preparações NFD, o potencial de membrana variou entre -71 e -64 mV
durante os 120 min de experimento. Este potencial sofreu uma significativa
despolarização nos primeiros 30 min após adição do veneno bruto de T. bahiensis
(0,3 µg/mL; Figura 20A).
Já o canal deferente (porção prostática) apresentou potenciais de
membrana em repouso que variaram entre -101 e -72 mV. A adição do veneno de T.
bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu uma marcante despolarização no potencial de
membranas nos 60 primeiros minutos de incubação (Figura 20b).
113
Figura 20. Atividade do veneno de T. bahiensis no potencial de membrana em repouso. Os potenciais foram registrados por meio de microeletrodos inseridos intracelularmente nas células musculares esqueléticas do hemidiafragma de camundongos (A) e lisas da região prostática de canal deferente de ratos (B). O veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu despolarização em ambas preparações nos primeiros 30 min em NFD e 60 min em canal deferente. Os pontos representam a média ± EPM de 6-11 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
A
B
114
4.2.2 Potenciais pós-juncionais
4.2.2.1 Potencial de placa terminal em miniatura (MEPPs)
Os MEPPs foram obtidos em preparações NFD, conforme descrito em
Materiais e Métodos (item 3.4.2.1).
A adição de veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu um aumento
significativo na frequência de liberação espontânea de neurotransmissores nos
primeiros 30 min (Tabela 2; Figura 21A). Entretanto, os tempos de despolarização e
repolarização dos MEPPs não foram significativamente alterados na presença do
veneno (Figura 21A). O aumento na frequência dos MEPPs se deu de forma
concomitante com a despolarização do potencial de membrana (ver em 5.2.1).
Maiores concentrações do veneno (≥10 µg/mL) promoveram um bloqueio dos MEPPs
(dados não mostrados).
Tabela 2. Frequência dos Potenciais de Placa Terminal em miniatura (MEPP). A incubação dos hemidiafragmas com o veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) levou a um aumento na liberação espontânea de quantas de acetilcolina (ACh).
*p<0.05 comparado com o controle.
Frequência de MEPPs (Hz)
Tempo (min) Controle T. bahiensis
0 0,44 ± 0,05 0,4 ± 0,03 5 0,36 ± 0,04 0,7 ± 0,12* 30 0,44 ± 0,10 0,6 ± 0,08* 60 0,39 ± 0,04 0,5 ± 0,05 90 0,30 ± 0,03 0,4 ± 0,06
115
Embora a amplitude média dos MEPPs não tenha sido significativamente
alterada, pôde-se observar um deslocamento à esquerda na curva da relação entre
amplitude e frequência nos primeiros 5 min de incubação; ou seja, o veneno produziu
marcante aumento na frequência da liberação de ACh, porém as amplitudes dos
potenciais foram menores (Figura 21B).
Figura 21. Atividade do veneno bruto de Tityus bahiensis nos Potenciais de Placa terminal em miniatura (MEPPs) em preparações nervo frênico – diafragma (NFD). Os potenciais foram registrados em NFD por meio de microeletrodos. O veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu um aumento na frequência dos MEPPs, sem alterar o tempo de despolarização, repolarização e amplitudes. B) Curvas gaussianas da relação entre frequência e amplitude. Os pontos representam a média ± SEM de 8-11 experimentos. A equação gaussiana foi utilizada para plotar as linhas. *p<0.05 comparado ao tempo zero.
A
B
116
4.2.2.2 Potencial de placa terminal (EPP)
Uma vez que a técnica de cut muscle (corte das fibras musculares)
despolariza as fibras musculares reduzindo o potencial de membrana em repouso
para valores até menores que -30 mV, a variância entre o potencial basal e o valor
equivalente ao aumento máximo na amplitude dos EPPs pode ser subestimada.
Para aumentar o intervalo entre o potencial basal e o máximo, a amplitude
basal dos EPPs foi reduzida de 9,4 mV (em Tyrode comum) para 2,6mV ao se
empregar solução Tyrode a baixo cálcio (0,4 mM). Deste modo, a amplitude basal do
EPP não é maior que 10% do valor do potencial de membrana em repouso desses
músculos cortados. Note que a amplitude máxima dos EPPs (obtida pela adição de
3´4DAP) em músculos mantidos em Tyrode usual e em Tyrode a baixo cálcio é
próxima, entretanto a redução da amplitude basal permitiu uma maior variação entre
a amplitude basal e a máxima (Tabela 3). Esses resultados confirmam que o uso de
solução Tyrode com concentração usual de cálcio pode subestimar o aumento
máximo da liberação de ACh.
Tabela 3. Influência da concentração de cálcio na facilitação máxima da amplitude do Potenciais de Placa Terminal (EPP). As preparações NFD foram incubadas com solução Tyrode usual de cálcio (1,8 mM) ou níveis baixos do mesmo (0,4 mM). Foram avaliadas as amplitudes dos EPPs em diferentes tempos (zero a 90 min). A amplitude máxima (Amax, % da resposta em relação a amplitude em 90 min) foi avaliada pela adição de 3’4-diamonipiridina (DAP) na preparação.
Amplitude dos EPPs (mV)
Tempo (min) Tyrode - 1,8mM
Ca Tyrode - 0,4mM
Ca
0 9,4 ± 0,9 2,6 ± 0,3 30 6,7 ± 2,6 1,5 ± 0,5 60 7,1 ± 1,5 2,8 ± 0,8 90 6,1 ± 0,9 2,9 ± 0,9
+ 3’4-DAP 10,9 ± 0,5 12,1 ± 1,1 Amax (%) 179% 417%
117
A incubação das preparações com o veneno bruto de T. bahiensis
promoveu o aumento na amplitude dos EPPs (preparação NFD), sendo este aumento
significativo a partir de 30 min de incubação. Os tempos de despolarização e
repolarização não foram alterados (Figura 22A). Após incubação prolongada, o
veneno foi capaz de deflagrar múltiplos potenciais por estímulo (Figura 22B). Maiores
concentrações (≥ 10 µg/mL) promoveram um bloqueio dos EPPs (dados não
mostrados).
Figura 22. Atividade do veneno de Tityus bahiensis nos Potenciais de Placa Terminal (EPPs). Os potenciais foram registrados por meio de microeletrodos em preparações nervo frênico - diafragma submetidas à técnica de cut muscle. A) O veneno bruto de T. bahiensis promoveu um aumento na amplitude dos EPPs, sem afetar o tempo de despolarização e repolarização. B) Múltiplos EPPs por estímulo foram observados após 90 min de incubação com o veneno. Os pontos representam a média ± EPM de 6-11 experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal.
A
B
118
4.2.2.3 Potencial excitatório juncional espontâneo (SEJPs)
Os SEJPs foram acessados através de microeletrodos inseridos
intracelularmente nas células musculares lisas da porção prostática do canal
deferente, conforme descrito em Materiais e Métodos (ver 3.4.2.3). Nos registros
basais a amplitude dos SEJPs foi variável, sendo que a maior parte dos potenciais
registrados tiveram amplitudes entre 1,5 e 2,5mV; entretanto, potenciais maiores de
15 mV também foram observados (Figura 23).
Figura 23. Relação entre frequência e distribuição dos potenciais excitatórios juncionais espontâneos em situação controle. Os potenciais pós-juncionais espontâneos da porção prostática do canal deferente foram registrados por meio de microeletrodos intracelulares. Os resultados são expostos em forma gráfica (painel A) e traçado representativo do registro (B). As barras representam a media ± EPM de 6 experimentos. A equação gaussiana foi utilizada para plotar a linha.
119
O veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu alterações massivas nos
SEJPs, o que impossibilitou o estudo quantitativo dos registros. Notou-se, porém, um
marcante aumento na frequência e amplitude dos SEJPs (Figura 24). Essa atividade
coincide tanto com a despolarização no potencial de membrana acima relatadas
(seção 4.2.1) como com a contração sustentada da preparação nos experimentos
funcionais (seção 4.1.2). Maiores concentrações (≥ 10 µg/mL) promoveram um
bloqueio dos SEJPs (dados não mostrados).
Figura 24. Registro representativo da atividade do veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) nos potenciais juncionais excitatórios espontâneos (SEJP). Os potenciais pós-juncionais espontâneos da porção prostática do canal deferente biseccionados foram registrados por meio de microeletrodos intracelulares antes (A; basal) e após 5 (B), 15 (C), 30 (D), 60 (E) e 90 (F) min a adição do veneno. Note que o veneno promoveu um aumento na amplitude e frequência dos potenciais, especialmente nos primeiros 15 minutos de incubação. Registros representam 4-6 experimentos.
120
4.2.3 Potenciais pré-sinápticos
4.2.3.2 Potencial de ação nervoso em nervo ciático
O veneno bruto de T. bahiensis foi incubado com axônio do nervo ciático
isolado de ratos, e os potenciais de ação compostos foram captados por meio de
técnica eletrofisiológica de registro extracelular.
O veneno promoveu mudanças tanto na amplitude quanto no padrão de
despolarização e repolarização dos potenciais de ação nervosos tornando-os mais
lentos (Figura 25A,B). É importante frisar que o marcante retardo no tempo de
repolarização da fibra foi revertido pela incubação de baixas concentrações de TTX
(dados não mostrados).
Por conta dessas alterações ou por ação direta do veneno em algum
componente neuronal, a amplitude dos potenciais de ação foi reduzida (Figura 25A).
Maiores concentrações de veneno (≥ 10 µg/mL) promoveram um bloqueio
total da geração de potenciais de ação compostos em aproximadamente 20 minutos
(dados não mostrados).
121
Figura 25. Atividade do veneno de Tityus bahiensis (0,3 µg/mL) nos potenciais de ação em nervo ciático isolado de camundongos. Os resultados são expostos em forma gráfica (A) e traçado representativo do registro (B). Note que o veneno promoveu redução na amplitude dos potenciais de forma dependente do tempo, e retardou a repolarização do nervo. Também foi observada alteração no tempo de despolarização, que se tornou mais lenta. Os pontos representam a media ± EPM de 5 experimentos. *p<0.05 comparado com o valor basal.
A
B
122
4.2.3.2 Formas de ondas perineurais
As formas de ondas perineurais, obtidas da bainha perineural do terminal
nervoso, são compostas por duas ondas negativas, sendo a primeira onda referente
ao influxo de sódio enquanto a segunda reflete principalmente a saída de potássio do
terminal nervoso durante o potencial de ação (Figura 26).
Figura 26. Onda perineural obtida de preparações triangular sterni (transverso do tórax) de camundongos em situação controle. As deflexões negativas estão associadas as correntes de influxo de Na+ (primeiro pico negativo) e principalmente efluxo de K+ (segundo pico negativo).
O veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) promoveu um bloqueio significativo
nas duas ondas negativas quando comparadas ao controle. O componente associado
às correntes de K+ (segundo pico) foi reduzido antes do pico relacionado às correntes
de Na+ (Figura 27).
123
Figura 27. Efeito do veneno de Tityus bahiensis nas formas de ondas perineurais. A) O veneno (0,3 µg/mL) causou bloqueio significativo em ambos componentes das formas de ondas, sendo o componente referente as correntes de K+ (segundo pico) afetado primeiramente que os referentes ao Na+ (primeiro pico). B) Registros representativos dos registros antes (em preto) e após 45 (cinza) e 90 (azul) min de incubação. Os pontos representam a media ± EPM de 5 experimentos. *p<0.05 comparado com os valores basais.
O tempo e velocidade da despolarização assim como o período de latência
(tempo entre o estímulo elétrico e a resposta) das formas de ondas não foram
significativamente afetados (dados não mostrados). Por outro lado, o veneno levou ao
surgimento de múltiplas formas de ondas por estímulo, que com o passar do tempo
de incubação se fundiram resultando em marcante retardo no tempo de repolarização
do nervo; este retardo foi revertido após a adição de baixas concentrações de TTX
(20 nM) (Figura 28).
124
Figura 28. Efeitos da tetrodoxina (TTX) no retardo da repolarização induzido pelo veneno de T. bahiensis. A) Área sob a curva do segundo componente das formas de ondas foi significativamente aumentada após incubação com veneno (0,3 µg/mL), sendo tal efeito revertido pela tetrodotoxina (TTX, 20 nM). B e C) Registros representativos antes (preto), e aos 45 (cinza escuro), 60 (cinza claro) e 90 (azul escuro) min de incubação com o veneno; Note a presença de múltiplas formas de ondas por estímulo (↑), que aumentaram conforme o passar do tempo de incubação se fundirem aos 90min (azul escuro); esse retardo na repolarização foi revertido por TTX (azul claro). As barras representam a média ± EPM de 5 experimentos. *p<0.05 comparado com os valores basais; #p<0.05 comparado com o valor de 90 min de incubação.
* # A
B
C
125
4.3 Eletrofisiologia em célula isolada - Whole cell patch-clamp
Uma vez que o canal de sódio dependente de voltagem 1.7 (Nav 1.7) é o
responsável pela geração e condução dos potenciais de ação dos axônios periféricos,
e que muitas das atividades produzidas pelo veneno de T. bahiensis são pré-
sinápticas podendo ser revertidas pela adição de baixas concentrações de TTX,
estudamos em seguida a atividade do veneno em canais de sódio dependentes de
voltagem em linhagem de neuroblastoma ND7-23 (wild type).
Os neurônios tiveram seu potencial de membrana mantidos em potenciais
negativos (-120 mV) para assegurar que a maioria dos canais de sódio estivessem
disponíveis para o protocolo de pulsos. Este protocolo consistiu em uma série de graus
de despolarização de 5 mV (potenciais de comando de -90 a -80 mV).
A partir da curva da relação entre voltagem e corrente, observa-se que as
correntes de sódio foram ativadas quando o potencial de comando estava acima de -
35 mV; o pico dessas correntes foi de aproximadamente - 5mV e o potencial reverso
de 44,6 ± 2,3 mV (Figura 29). Após a adição do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL),
essa curva foi deslocada para potenciais mais negativos, sendo que a ativação se
iniciou em -55mV, o pico em aproximadamente em -25mV e o potencial reverso 20
± 2,8 mV (Figura 29A). Em relação à densidade do pico de corrente, embora
aparentemente maior, esta não alcançou diferença significativa em relação ao basal
(Figura 29B).
126
Figura 29. Atividade do veneno de T. bahiensis nas correntes de sódio em ND7-23 (wild type). A) A curva da relação entre a densidade das correntes e o potencial de comando demonstram que o veneno (10 µg/mL) deslocou a curva para potenciais mais negativos. B) O veneno promoveu um aumento significativo na densidade do pico das correntes de sódio. Os pontos e barras representam a média ± EPM de 15 a 18 experimentos. *p<0,05 comparado com controle.
A incubação do veneno (10 µg/mL) com as células alterou a condutância
dos canais de sódio, sendo V1/2 (voltagem que promove 50% da ativação máxima)
significativamente diferente do controle (-30 ± 0,5 e 21 ± 0,8 mV*, respectivamente).
Todavia, a inclinação da curva de ativação não se mostrou alterada. Além da V1/2, o
veneno deslocou a curva de ativação para a esquerda, para potenciais mais
hiperpolarizados (Figure 30).
A
B
127
Figura 30. Atividade do veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) na condutância de canais de sódio em células ND7-23 (wild type). As curvas de Bolzmann das médias normalizadas das condutâncias foram plotadas contra o potencial de comando em experimentos controle (Inclinação 9 ± 0.72) e após incubação com o veneno (Inclinação 9.7 ± 0.43). O veneno promoveu um deslocamento à esquerda da curva de ativação. Os pontos e barras representam a média ± EPM de 15 a 18 experimentos. *p<0.05 comparado com o controle.
4.4 Imagem de cálcio
O movimento intracelular de cálcio foi avaliado por meio do pré-
carregamento das células com marcador fluorescente sensível ao Ca2+, Fluo-4-AM.
Ensaios controle com ND7-23 mostraram que as células podem ser
mantidas por 80 min de experimentação sem muita alteração em sua fluorescência,
além de continuarem responsivas à despolarização por KCl. A adição do veneno de
T. bahiensis (0,3 µg/mL) elevou os níveis de fluorescência de forma dependente do
tempo, a partir dos 50 min de incubação (Figura 31). Esse aumento indica aumento
intracelular de cálcio e coincide com escala de tempo das alterações observadas em
potenciais de ação axonais e nas formas de ondas perineurais.
128
Nos primeiros 5 min de incubação das células com o veneno,
observaram-se vários picos curtos e rápidos de fluorescência, os quais ficaram
menos frequentes até desaparecerem conforme o passar do experimento.
Figura 31. Atividade do veneno de T. bahiensis (0,3 µg/mL) no movimento intracelular de Ca2+ ND7-23 (wild type). O monitoramento foi realizado por meio de células carregadas com marcador fluorescente sensível ao Ca2+, Fluo-4AM (N controle = 11; N tratado = 22 células). O veneno promoveu o aumento da concentração de cálcio no interior dos neurônios. Escala de fluorescência (do menor para o maior): azul claro < azul escuro < verde < amarelo < vermelho. Magnificação: 100x.
A
B
129
Neurônios do GRD e células musculares do triangularis sterni foram
também previamente incubados com Fluo-4-AM, e as mudanças na fluorescência
foram registradas antes e após adição do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL). Uma
vez que as células podem ser mantidas viáveis por apenas 15 minutos de
experimentação, testou-se uma concentração mais alta do veneno (10 µg/mL). O
veneno aumentou o nível de fluorescência nos neurônios do DRG, especialmente nos
primeiros 5 minutos de incubação (Figura 32); isso coincide com a facilitação
neuromuscular pré-sináptica e o aumento na frequência de MEPPs observada nos
ensaios funcionais (miografia) e eletrofisiológicos. Em contraste, não foram
observadas mudanças no conteúdo intracelular de cálcio em células musculares do
triangularis sterni.
Figura 32. Imagens representativas do efeito do veneno de T. bahiensis (10 µg/mL) no movimento intracelular do cálcio em somas dos neurônios do GRD e em miócitos do triangular sterni. As mudanças na fluorescência após a adição do veneno refletem o aumento do conteúdo intracelular de cálcio. Essas mudanças foram particularmente marcantes em neurônios (↑) mas não muito aparentes em fibras musculares. Escala de fluorescência (do menor para o maior): azul claro < azul escuro < verde < amarelo < vermelho. Magnificação: neurônios 100x; células musculares: 400x.
130
5. DISCUSSÃO
Anualmente, são reportados anualmente mais de um milhão de casos de
escorpionismo em todo o mundo. A gravidade desses acidentes varia de acordo com
a quantidade de veneno injetada, toxicidade da peçonha, espécie e tamanho do
escorpião, local da picada, idade da vítima e sensibilidade ao veneno, além de fatores
relacionados ao tempo decorrido entre o acidente e a soroterapia (11). Os acidentes
escorpiônicos caracterizam-se principalmente por efeitos locais, porém, em alguns
dos casos (especialmente aqueles envolvendo crianças e idosos) os efeitos podem
evoluir a sistêmicos, afetando o sistema nervoso periférico e central. Efeitos
periféricos vêm sendo atribuídos principalmente ao desbalanço dos sistemas
nervosos simpático, parassimpático e somático por meio de descargas adrenérgicas
e colinérgicas (27,198,203). A descarga adrenérgica pode levar à midríase,
hipertensão, sudorese profusa, hiperglicemia, leucocitose e hipopotassemia, ao passo
que a colinérgica provoca miose, bradicardia, arritmias, hipotensão arterial e aumento
da atividade exócrina. Podem ainda ser observados tremores e espasmos musculares
devido à descarga colinérgica em terminações neuromusculares (18,19,270). Tais
efeitos clínicos observados em vítimas de envenenamento por escorpiões são
comumente atribuídos a peptídeos neurotóxicos, maiores componentes desses
venenos, que possuem grande afinidade e especificidade em canais iônicos de
vertebrados e invertebrados (136–138).
Embora T. bahiensis tenha sido a primeira espécie de Tityus sp. descrita
no Brasil (inicialmente como Scorpio bahiensis por Perty, 1833) sendo a principal
causadora de acidentes escorpiônicos no estado de São Paulo (a segunda principal
no Brasil) (12), seu veneno permanece pobremente estudado, especialmente em
relação às suas atividades no sistema nervoso periférico (somático e autonômico).
No presente estudo, avaliamos a atividade do veneno bruto de T. bahiensis
no mecanismo de contração muscular esquelética, usando-se três diferentes
preparações neuromusculares, a saber, duas de mamífero [extensor digitorum longus
(EDL) e nervo frênico – diafragma (NFD)] e uma de ave (biventer cervicis, BCP).
131
Em todas as preparações, o veneno promoveu facilitação da contração
muscular em baixas concentrações e bloqueio contrátil em alta concentração. Foi
observada uma diferença na sensibilidade ao bloqueio neuromuscular entre as duas
preparações de mamíferos, onde o bloqueio neuromuscular total em EDL ocorreu em
concentrações menores que em NFD (10 e 30 µg/mL respectivamente). Por outro
lado, NFD foi mais sensível ao efeito facilitador da contração muscular.
Sabe-se que músculos de contração rápida, como é o caso do EDL,
possuem maior densidade de canais de sódio na junção neuromuscular e região
extrajuncional do sarcolema quando comparados a fibras de contração lenta, como é
o caso do diafragma (271–273). Uma vez que venenos de escorpiões possuem
componentes que agem em canais de sódio e que o bloqueio neuromuscular também
é de origem pós-sináptica (como observado em experimentos de estimulação direta),
a maior disponibilidade de canais de sódio em EDL quando comparado a NFD poderia
explicar o mecanismo pelo qual o veneno de T. bahiensis foi mais efetivo no bloqueio
da contração muscular em EDL do que em NFD. Entretanto, mais estudos precisam
ser realizados para apurar tal fato. Por outro lado, as preparações NFD foram mais
sensíveis à ação facilitatória produzida pelo veneno. Levando-se em consideração
que a facilitação é pré-sináptica, tal sensibilidade pode ser explicada pela diferença
no conteúdo quântico e disponibilidade de receptores nicotínicos das duas
preparações.
A hidrólise de ACh pelas acetilcolinesterase é menor em EDL que em NFD
(o que poderia levar a uma maior disponibilidade de ACh na fenda sináptica), mas o
conteúdo quântico dos EPPs (quantidade de neurotransmissor liberados por estímulo
nervoso) é 3,5 vezes maior em NFD que em EDL (274). Tal variação pode ser
explicada pela diferença na disponibilidade de sítios de liberação ou na extensão dos
terminais nervosos (275) ou pela diferença na disponibilidade dos canais de cálcio que
desencadeia a liberação evocada de ACh (276). Além da diferenciação pré-sináptica,
também existem diferenças na disponibilidade e número de receptores de acetilcolina,
que são maiores no NFD que em EDL (274). Isso poderia explicar o motivo pelo qual
NFD é mais sensível ao efeito facilitatório quando comparado a EDL.
Venenos dos escorpiões T. serrulatus (208,209), Centruroides (277) e
Odontobuthus doriae (278) também exercem efeito facilitatório pré-sináptico da
contração muscular, contrações espontâneas e retardo no relaxamento das
contrações inibidas pela adição de dTC em preparações NFD. Tal atividade pode ser
132
atribuída às alterações na liberação evocada de neurotransmissores que resulta no
aumento da amplitude/conteúdo quântico do EPP (278), efeito comprovado por meio
dos estudos eletrofisiológicos aqui apresentados, onde o aumento na amplitude dos
EPPs parece coincidir com a facilitação na contração neuromuscular.
O veneno de T. bahiensis não promoveu prolongamento dos EPPs, porém
promoveu disparos repetitivos e espontâneos, que podem também vir a potencializar
a contração muscular. Resultados semelhantes foram observados com veneno de
Centruroides e a TsTx (tityustoxina, isolada do veneno de T. serrulatus). Segundo
Warnick e colaboradores [1976; (279)], tal atividade pode ser relacionada ao
prolongamento do potencial nos terminais nervosos, uma vez que não foram
observados efeitos anticolinesterásicos claros, e a frequência dos MEPPs não estava
aumentada quando os disparos repetitivos foram registrados (90 min de incubação).
O prolongamento no potencial nervoso nos terminais nervosos foi confirmado por meio
de estudos eletrofisiológicos, discutidos em seguida.
Preparações biventer cervicis isoladas de pintainho (BCP) vêm sendo
utilizadas em estudos envolvendo a junção neuromuscular por sua maior densidade
de receptores nicotínicos que de mamíferos. Enquanto a inervação dos mamíferos é
focal (receptores nicotínicos se localizam apenas na placa terminal), as aves possuem
inervação multifocal (receptores nicotínicos estão dispostos em toda a fibra muscular).
Tal peculiaridade permite que agonistas nicotínicos provoquem uma despolarização
sustentada da fibra muscular gerando contratura do músculo. O veneno de T.
bahiensis promoveu alterações não estatisticamente significativas nas curvas em
resposta a ACh, KCl e CCh, indicando que a membrana e receptores pós-sináptica
estão íntegros, mesmo após bloqueio total da contração muscular.
Sabe-se que nesta preparação, a incubação com anticolinesterásicos leva
ao aumento da contratura promovida pela ACh porém não altera a resposta ao CCh
(280). Considerando que a incubação com o veneno levou a uma tendência de
aumento na resposta à ACh sem alterar a resposta ao CCh, poderíamos inferir que o
veneno possua um certo grau de atividade anticolinesterásica. Entretanto, não foi
registrada significância estatística.
Pequena alteração na sensibilidade pós-sináptica também foi observada
com outros venenos de escorpiões como por exemplo Androctonus crasicuda (281) e
Buthus tamulus (282).
133
Após a adição de altas concentrações do veneno bruto de T. bahiensis em
preparações BCP, observamos contração tônica da preparação, mesmo na ausência
de estímulo elétrico. Essa contração sustentada não se fez presente em NFD. Efeito
semelhante foi observado após incubação com o veneno de T. serrulatus onde este
veneno não promovem contração tônica, a menos que a preparação fosse submetida
à solução nutritiva de baixo cálcio uma vez que músculo e nervo tornam-se instáveis
(208). Sugerimos que o efeito do veneno seja de natureza pré-sináptica causada pela
estimulação da liberação espontânea de ACh, visto que não notamos alterações na
sensibilidade pós-sináptica; a redução na amplitude da contratura em preparações a
baixo Ca2+, assim como sua inibição ou reversão pela dTC confirmam ser a origem
pré-sináptica deste efeito. De modo semelhante, a α-LTX (α-latrotoxina, isolada da
aranha viúva negra, Latrodectus sp.) estimula a liberação espontânea de ACh,
promovendo contração sustentada na preparação independente da estimulação
elétrica; ou seja, a contração rapidamente atinge o máximo e a tensão do músculo
reduz gradativamente. Nestes experimentos, a sensibilidade do receptor nicotínico
pós-sináptico permaneceu inalterada (283).
Outro fato que aponta a contratura como sendo causada pela liberação
espontânea de ACh é o efeito estar presente mesmo após incubação das preparações
com toxina botulínica (BoNT-A). Sabe-se que BoNT-A bloqueia a liberação de ACh
pelos terminais colinérgicos sem alterar a condução do impulso nervoso ou a
sensibilidade dos receptores nicotínicos pós-sinápticos. Este bloqueio inibe apenas a
liberação evocada de neurotransmissores uma vez que MEPPs persistem mesmo
após abolição completa dos EPPs (284–286).
O aumento da liberação espontânea de ACh pelo veneno bruto de T.
bahiensis também pode ser observado por meio de estudo eletrofisiológicos. A
incubação das preparações com o veneno promoveu aumento na frequência dos
MEPPs sem alterar sua amplitude média ou tempos de despolarização e
repolarização, entretando, o veneno promoveu o deslocamento da distribuição
gaussiana de amplitudes para a esquerda, sendo observado um maior número de
potenciais de pequena amplitude. Atividade semelhante foi promovida pelo veneno do
escorpião Odontobuthus doriae, que não alterou o tempo de repolarização dos MEPP
nem promoveu alterações na amplitude média mas deslocou a distribuição das
amplitudes para a esquerda (278).
134
O retardo na inativação dos canais de sódio, assim como a alteração do
limiar para sua abertura pode ser responsabilizado pelo aumento da frequência dos
MEPPs, uma vez que o terminal nervoso se tornar parcialmente despolarizado,
permitindo a entrada de cálcio, o que desencadeia a liberação de neurotransmissores
(278).
A atividade do veneno bruto de T. bahiensis na junção neuroefetora foi
avaliada por meio de canal deferente isolado de ratos. O canal deferente é inervado
por fibras simpáticas, principalmente do gânglio e do tronco nervoso hipogástricos,
juntamente com fibras parassimpáticas (colinérgicas) (257). Por ser um exemplo de
co-transmissão simpática, o canal deferente isolado de diversas espécies vem sendo
utilizado como modelo para estudo de diversos aspectos da transmissão autonômica
(265).
Neste trabalho, os canais deferentes foram biseccionados afim de se testar
separadamente a porção epididimal e prostática. À semelhança das preparações de
junção neuromuscular, o veneno de T. bahiensis, em baixas concentrações, promoveu
a facilitação na resposta contrátil enquanto altas concentrações bloquearam a
contração.
Toxinas isoladas do veneno bruto de T. serrulatus também possuem
efeitos simpatomiméticos. Toxinas isoladas deste veneno parecem ter efeitos
predominantemente na liberação de diferentes neurotransmissores. As toxinas III
(Melito et al., 1983), T1VIII (Sampaio et al., 1983), XIII, IX5, e TsTX-IV (287,288)
aumentaram a sensibilidade do canal deferente ao promover a liberação de
noradrenalina. Por outro lado, a TsTX-I (isolada do T. serrulatus) promove liberação
seletiva de ATP (288). Tal efeito pré-juncional parece explicar o aumento na resposta
contrátil promovida pelo veneno de T. bahiensis; essa ação é capaz de ocasionar a
despolarização das membranas nervosas alterando o limiar para despolarização
(289).
Uma vez que o mesmo padrão de resposta foi observado nas duas porções
do canal deferente, independente da maior sensibilidade noradrenérgica ou
purinérgica, podemos inferir que o veneno promove liberação de ambos
neurotransmissores.
O veneno de T. bahiensis também promoveu contrações sustentada na
ausência de estimulação elétrica, sendo essa atividade observada a partir de 3 µg/mL.
O bloqueio dos canais de sódio pela TTX inibiu completamente a contração mantida,
135
indicando que esta tem origem pré-sináptica uma vez que a TTX inibe não inibe a
atividade da musculatura lisa (canais de sódio dependentes de voltagem não são
essencial para o mecanismo contrátil de tal tecido) podendo ser usada para o bloqueio
seletivo da atividade neuronal nessas preparações. Efeito semelhante foi produzido
pela TsTX-I, que age em canais de sódio, induzindo despolarização nervosa e
liberação de neurotransmissores (288).
A pré-incubação de ambas porções (epididimal e prostática) com prazosina
(antagonista não seletivo de receptores adrenérgicos α1) reduziu, mas não inibiu
totalmente, a contração induzida pelo veneno. Além disso, a pré-incubação com
PPADS (antagonista dos receptores P2X) preveniu a contração. Esses resultados
indicam que a contração induzida pelo veneno se dá pela liberação espontânea de
ambos neurotransmissores (uma vez que a contração foi minimizada pelo antagonista
adrenérgico e inibida pelo purinérgico), porém a resposta purinérgica parece ser
predominante nessa atividade.
A pré-incubação da porção epididimal (onde a resposta noradrenérgica é
predominante) com PPADS promoveu surgimento tardio de discreta contração, a qual
foi seguida por numerosas contrações rápidas e espontâneas. Uma vez que tal
resposta i) parece ser pré-sináptica (por sua ausência em músculos expostos à TTX),
ii) não ser evidente na porção prostática (de resposta purinérgica predominante), iii)
não ser afetada por ATP, e iv) também ser observada nas porções epididimais de
músculos eletricamente estimulados, sugerimos que tais fasciculações são resultado
da liberação noradrenérgica dos terminais nervosos, entretanto, maior investigação
deverá ser realizada afim de confirmar tal fato.
Sabe-se que contrações do músculo liso do canal deferente mediadas
podem ser também moduladas por ACh (290). A ativação dos receptores nicotínicos
pré-juncionais desencadeia a liberação ATP dos terminais nervosos (291). No
presente estudo, o bloqueio dos receptores nicotínicos pela dTC não causou
alterações significativas na contração mantida causada pelo veneno, destacando que
a ACh e os receptores nicotínicos pré-sinápticos não estão envolvidas nas atividades
aqui observadas.
Levando-se em consideração que a liberação de ATP espontânea se
mostra importante na contração promovida por T. bahiensis, realizamos experimentos
eletrofisiológicos afim de avaliar a atividade do veneno na liberação purinérgica
espontânea. Uma vez que ATP/P2X1 desencadeia potenciais elétricos na membrana
136
pós-juncional (SEJP e EJP) e que a quantidade de ATP liberada pela porção
epididimal é insuficiente para produzir tal efeito (292), é possível avaliar estes
potenciais por meio de ensaios eletrofisiológicos utilizando-se a porção prostática do
canal deferente.
Em nossos registros basais, a amplitude dos SEJPs foi variável
apresentando um amplo intervalo de amplitudes. Outros trabalhos demonstraram
grande variabilidade na amplitude dos potenciais espontâneos, sendo essa
variabilidade devida à atenuação das despolarizações em células distantes (293).
O veneno de T. bahiensis aumentou a amplitude e frequência dos SEJPs,
concomitante com a despolarização do potencial de membrana em repouso, que
retornou a níveis basais com o decorrer do experimento. Essa despolarização no
potencial de membrana coincide com as fasciculações musculares (que tornou o
empalamento dos microeletrodos mais difícil) e com a contração mantida observada
nos ensaios miográficos. O aumento na frequência dos SEJPs também foi observado
em músculos expostos a veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus (294).
Uma vez que a adição de ATP exógeno em preparações de cana deferente
isolado é capaz de induzir despolarização da membrana em repouso e consecutiva
contração do tecido (295), o aumento massivo na frequência e amplitude dos SEJPs
após a adição do veneno aparentemente é a causa da despolarização da membrana
e da contração espontânea do tecido.
Tanto a facilitação da contração muscular quando as contrações
espontâneas das preparações (neuromuscular e neuroefetoras), parecem ser eventos
promovidos pelo potencial de ação nervoso e por liberação espontânea de
neurotransmissores. Dessa forma, realizamos abordagens eletrofisiológicas para se
avaliar a atividade do veneno de T. bahiensis em tecido nervoso.
As ondas perineurais são caracterizadas por duas deflexões negativas
onde a primeira é relacionada às correntes de entrada de sódio nos nodos de Ranvier
e nas regiões não-mielinizadas dos terminais nervosos enquanto o segundo pico é
resultado principalmente das correntes de saída de K+ restritas às regiões terminais
(268). A segunda deflexão também é formada pelas correntes de entrada de Ca2+
originadas pelo terminal nervoso, porém estas estão “escondidas” na onda por serem
muito menores que as de K+; e o bloqueio dos canais de K+ resulta no aparecimento
de um pico positivo associado ao influxo de Ca2+ (296). Tal técnica pode ser utilizada
137
para o monitoramento dos canais iônicos no terminal ou em regiões próximas a eles
(297).
Uma vez que as formas de ondas correspondentes às duas diferentes
correntes se sobrepõem, o uso de toxinas e bloqueadores que interagem com canais
de sódio (ou até mesmo a redução da concentração extracelular de sódio) também
afetam a amplitude da segunda onda. Isso pode ser explicado pela redução da
propagação da despolarização no nervo que resulta na redução da ativação dos
canais de K+ dependentes de voltagem e consequentemente na redução da amplitude
do segundo pico (296).
Alguns venenos e toxinas de escorpiões foram estudadas em ondas
perineurais. O veneno bruto de Pandinus imperator não afetou o componente
relacionado ao Na+, entretanto, reduziu seletivamente o componente associado ao
canal de K+ (298). Os venenos de Buthus tamulus (282) e Odontobuthus doriae (278)
promoveram alterações similares às promovidas pelo veneno de T. bahiensis,
notando-se redução das duas ondas perineurais, assim como disparos repetitivos por
estímulo do terminal nervoso e um marcante retardo no segundo componente. A
redução na amplitude do segundo antes da redução no primeiro pode indicar que o
veneno de T. bahiensis exerce efeitos em canais de K+. O bloqueio desses canais no
terminal nervoso leva ao retardo na repolarização, permitindo que o terminal nervoso
fique despolarizado por mais tempo e que haja um maior influxo de sódio no terminal,
aumentando a liberação de neurotransmissores (268,299–301). Por outro lado, os
disparos repetitivos que também levam ao prolongamento das ondas indicam efeitos
na inativação dos canais de sódio, à semelhança de preparações expostas à toxina
ATX-II (isolada do cnidário Anemonia sulcata) (302), mesmo porque tal
prolongamento é revertido pela TTX (20 nM). Portanto, uma vez que o veneno bruto
é composto por uma mistura de componentes, os efeitos observados na liberação
evocada de neurotransmissores parecem ser promovidos por diferentes substâncias
que interagem com diferentes canais responsáveis pelo controle dos mecanismos de
despolarização e repolarização no nervo (282).
Efeito similar no retardo do tempo de repolarização foi também
observado em potenciais de ação composto em nervo ciático. O veneno bruto de T.
bahiensis tornou a despolarização do potencial de ação mais lenta e dobrou o tempo
de repolarização do potencial de ação, sendo esse prolongamento revertido por TTX.
138
Isto indica que, assim como nas ondas perineurais, os canais de sódio desempenham
papel importante no prolongamento do potencial.
Em seguida, utilizamos a linhagem celular de neuroblastomas ND7-23, uma
vez que 65% das correntes de entrada de sódio provém de Nav1.7 (303). Em
experimentos controle, as correntes de entrada de sódio iniciaram quando o potencial
de comando ficou acima de -35mV, sendo que o pico foi em torno de -5mV e o
potencial reverso em 44,6 ± 2,3mV, próximo aos obtidos por Kennedy e colaboradores
(304). O veneno de T. bahiensis deslocou esta curva de ativação a potenciais mais
negativos.
Esses resultados corroboram com os achados de Moraes e colaboradores
(229), que estudaram os efeitos do veneno de T. bahiensis em canais de sódio de
neurônios sensoriais (gânglio da raiz dorsal) e em cardiomiócitos ventriculares. Estes
autores mostraram que o veneno aumentou a amplitude da corrente e deslocou a
curva de ativação a potenciais mais negativos canais sensíveis à TTX de neurônios
sensoriais.
Por meio de protocolos de imagem de cálcio, pode-se observar que o
veneno promove picos de movimentos de cálcio nos primeiros minutos e aumento da
fluorescência média de forma constante com o passar do experimento. O aumento de
influxo de Ca2+ pode ocorrer por meio da ativação de receptores nicotínicos (com o
qual o veneno não parece interagir), de receptores glutamatérgicos, de canais de
cátions não seletivos como o TRPC, ou de canais de Ca2+ dependentes de voltagem.
O aumento citoplasmático de Ca2+ também pode ocorrer por liberação das reservas
internas (305,306). Tal aumento coincide com os eventos importantes observados nas
formas de ondas perineurais e no potencial de ação nervoso, que nos leva a crer que
o aumento intracelular de cálcio nos neurônios expostos ao veneno se dê por meio de
despolarização mantida do nervo, permitindo o maior influxo; entretanto, uma
investigação mais apurada é necessária para comprovar tal afirmação.
139
Os resultados deste trabalho mostram que em baixas concentrações, o
veneno de T. bahiensis prolonga o tempo em que axônio e terminal nervoso ficam
despolarizados. Essa despolarização persistente leva ao maior influxo de cálcio e
consequentemente maior liberação de neurotransmissores e marcante facilitação na
contração muscular neurogênica. O veneno também estimulou a liberação
espontânea de neurotransmissores provavelmente através da despolarização
neuronal parcial. Tais fenômeno pode ser observado tanto na junção neuromuscular
quanto na junção neuroefetora.
Embora a farmacologia do veneno bruto seja extremamente complexa
considerando a ampla variedade de componentes e suas diferentes atividades
biológicas, os principais efeitos neurotóxicos observados aqui foram dependentes da
TTX, revelando que os canais de sódio dependentes de voltagem sensíveis ao TTX
são provavelmente o principal alvo das toxinas presentes nestes venenos.
Este trabalho pretende contribuir para o entendimento da neurotoxicidade no
escorpionismo, especialmente os envenenamentos envolvendo Tityus bahiensis.
140
6. SUMÁRIO DE CONCLUSÕES
• O veneno T. bahiensis, em maiores concentrações, promoveu bloqueio da
condução nervosa e consequentemente da contração muscular;
• Em menores concentrações, o veneno promoveu efeito facilitador da
contração muscular, tanto em preparações neuromusculares quanto
neuroefetoras;
• A incubação do veneno com neurônios ND7-23 (wild-type) promoveu o
deslocamento da curva de ativação dos canais de sódio dependentes de
voltagem (principalmente Nav 1.7) para potenciais mais negativos, o que
facilita a ativação destes canais (visto por patch-clamp);
• O veneno afetou os potenciais de ação axonais ao prolongar o tempo em
que a membrana ficou despolarizada (visto em nervo ciático);
• A despolarização prolongada que percorre o axônio também atinge as
terminações nervosas, promovendo o aparecimento de múltiplas ondas de
despolarização (visto em formas de ondas perineurais) e maior influxo de
cálcio nos terminais (imagem de cálcio);
• O influxo aumentado de cálcio promove maior liberação evocada de
neurotransmissores (EPPs) e consecutivamente maior amplitude contrátil
das preparações (EDL, NFD, BCP e canal deferente observada em ensaios
funcionais).
• A exposição ao veneno também promove aumento na frequência de
liberação espontânea de neurotransmissores (MEPPs e SEJPs)
concomitante com a despolarização da membrana muscular (NFD e canal
deferente) e contração sustentada das preparações (ensaios funcionais).
141
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ANEXO 1 179
ANEXOS
ANEXO 2 180
ANEXO 3 181