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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
FERNANDA CRISTINA MACEDO RONDON
DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS PARA O
TRATAMENTO DA LEISHMANÍASE VISCERAL
FORTALEZA
2011
1
FERNANDA CRISTINA MACEDO RONDON
DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS PARA O
TRATAMENTO DA LEISHMANÍASE VISCERAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de
carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Leal
Bevilaqua
FORTALEZA
2011
2
R771d Rondon, Fernanda Cristina Macedo
Desenvolvimento de fitoterápicos para o tratamento da
Leishmaníase Visceral / Fernanda Cristina Macedo Rondon. —
Fortaleza, 2011.
137 p. ; il.
Orientadora: Profª. Drª. Claudia Maria Leal Bevilaqua.
Co-orientadora: Profª. Drª. Selene Maia de Morais.
Tese (Doutorado em Ciências Veterinária) – Universidade
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. Área de
Concentração: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros,
herbívoros e aves.
1. Produtos naturais. 2. Leishmaníase visceral. 3. Tratamento
alternativo. 4. Hamster. I. Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.089
3
FERNANDA CRISTINA MACEDO RONDON
DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS PARA O TRATAMENTO
DA LEISHMANÍASE VISCERAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 11 / 07 / 2011. Hora: 14:00
Conceito: Aprovado e Satisfatório Nota final: 9,5
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Universidade Estadual do Ceará
Orientador
_________________________________ ___________________________________
Profa. Dra. Selene Maia de Morais Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Júnior
Universidade Estadual do Ceará Universidade de São Paulo
Co-orientadora Examinador
_______________________________ _____________________________________
Profa. Dra. Maria Jania Teixeira Profa. Dra. Sthenia Santos Albano Amóra
Universidade Federal do Ceará Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Examinadora Examinadora
4
À Fabíola Pedreira minha maior incentivadora e à
minha irmã Alessandra Michele Rondon meu
exemplo de força, eu dedico.
5
“Não desista diante do primeiro obstáculo, tenha força
e confiança porque você nunca está sozinho”.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por tudo que aconteceu comigo até o momento e por tudo
que virá pela frente, obrigada por nunca me deixar sozinha e sempre iluminar o meu
caminho.
À minha mãe Regina Maria Macedo Rondon e ao meu pai Antônio Lara Marialva Meireles
Rondon por me lembrarem sempre que todo aprendizado é válido e que devemos valorizar
cada momento de forma única.
Aos meus irmãos Alessandra Michele, Alexandre Rodrigo e Antônio Lara Júnior pela
força, disposição e paciência.
Em especial à professora Drª Claudia Maria Leal Bevilaqua pela orientação, acolhimento e
aprendizagem durante todo este período de convivência de quase 9 anos que foram
essenciais para minha vida profissional e social. Agradeço também por toda a ajuda,
carinho, conselhos e às longas conversas em seu escritório e na sua casa, bem antes de eu
entrar em seu laboratório, ao longo deste tempo, aprendi o que é respeito e dedicação.
À professora Dra. Selene Maia de Morais e a todos do Laboratório de Química de Produtos
Naturais, em especial à Lyeghyna Karla Andrade Machado, por toda a ajuda na parte
experimental e química fornecida e co-orientação durante a realização desta tese.
Ao professor Dr. Heitor Franco de Andrade Júnior e todos os integrantes do Laboratório de
Protozoologia da Universidade de São Paulo por todo o apoio, acolhimento e aprendizagem
fundamental para a realização desta tese. A convivência com vocês foi revigorante para a
continuidade do meu trabalho.
À professora Dra. Maria Jania Teixeira por ter aceitado participar como membro efetivo da
minha banca e por ter sido tão prestativa, conseguindo ajudar-me a solucionar problemas
que enfrentei durante a etapa experimental.
À professora Dra. Sthenia Santos Albano Amóra por aceitar participar como membro
efetivo da minha banca e pela atualização dos assuntos referentes à leishmaníase visceral
canina em nosso país.
Aos amigos de profissão e colegas do Laboratório de Doenças Parasitárias, em especial
Marina Parissi Accioly, Eudson Maia de Queiroz Júnior, Rafaela Albuquerque Silva, Ana
7
Caroline Moura Rodrigues, Camila de Albuquerque Almeida, Maria Vivina Barros
Monteiro, Vitor Luz, Diana Romão, Ana Lourdes Camurça Vasconcelos, Juliana de
Carvalho Ribeiro, Rafaele Sampaio, João Batista Silva Júnior por toda a ajuda dada durante
o experimento, pelas diferentes formas de descontrações sempre bem-vindas e
extremamente agradáveis e por me mostrarem o quê realmente é importante nesta vida por
diferentes pontos de vistas.
Aos mestrandos e doutorandos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da
Universidade Estadual do Ceará pela companhia e companheirismo durante o curso.
Aos funcionários do Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, Adriana Maria
Sales Albuquerque, Cristina Sabóia do Nascimento e Frederico Rocha Cavalcanti, sempre
dispostos a ajudar, pelo profissionalismo e por tornarem o Programa um ambiente tão
tranqüilo e descontraído.
A todos os funcionários da biblioteca da Universidade Estadual do Ceará, em especial à
Leila Cavalcante Sátiro pela ficha catalográfica da Tese.
A todos os professores do PPGCV, pelos conhecimentos conquistados durante nossa
convivência.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico Tecnológico (FUNCAP)
pelo apoio financeiro durante todo o curso.
Às famílias Pedreira e Rondon, em especial à Fabíola Rodrigues Pedreira e a minha irmã
Alessandra Michele Macedo Rondon, pessoas de extrema importância em minha vida, por
toda a paciência, companheirismo e alegria proporcionadas durante todo este período,
reconheço que em muitos momentos me senti perdida e em todos estes períodos vocês
foram fundamentais para que eu encontrasse o meu foco e seguisse em frente.
Aos amigos Rafaell Caminha de Freitas, Isabele Caminha de Freitas, Francis Hellen,
Tatyane Mota, Marília Girão e Daniel de Araújo Viana pelos momentos de descontração e
apoio emocional durante toda esta etapa da minha vida e por todos os anos de amizade.
Aos animais por todo o real sentido de companheirismo, lealdade e amor incondicional,
obrigada Tito (hamster) você foi peça fundamental de todo o meu experimento. Aos meus
cachorros Shakira, Russa, Belinha, Rana e Rick e ao meu gato Lula, meus animais que são
8
participantes ativos nesta jornada me proporcionando momentos de muitas alegrias e
descontração.
Sou eternamente grata a todas as pessoas que mesmo em sua mais breve passagem ou curta
convivência me ofereceram contribuição, de qualquer natureza, para a realização deste
trabalho.
9
RESUMO
A ausência de resultados efetivos no controle da Leishmaníase Visceral (LV) incentiva a
pesquisa por novas alternativas que possam ser efetivas no combate a esta doença. Assim, o
objetivo deste estudo foi desenvolver fitoterápicos para o tratamento da LV. Das plantas
Aloe vera, Coriandrum sativum e Ricinus communis foram obtidos 3 extratos brutos. Do
extrato bruto foi obtida uma fração clorofórmica, uma fração acetato de etila e uma fração
metanólica. Além disso, foram obtidos óleos essenciais de C. sativum e Lippia sidoides e o
óleo-resina de Copaifera reticulata. Na primeira etapa, os produtos naturais foram
avaliados sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania chagasi e
citotoxicidade sobre células monocíticas de murinos RAW 264.7. Por meio dos testes in
vitro determinou-se o valor da CI50 de cada fração/óleo sobre promastigotas e amastigotas
de L. chagasi a partir do teste MTT e pelo imunoensaio ELISA in situ, respectivamente. Na
segunda etapa foram selecionados a fração e o óleo com maior eficácia in vitro e menor
citoxicidade para uso terapêutico in vivo. No teste in vivo hamsters foram infectados
intraperitonealmente por 1x107 promastigotas/0,1mL PBS 1x de L. chagasi e os animais
foram divididos em sete grupos com 10 animais em cada. A confirmação da infecção foi
feita 30 dias após a inoculação experimental, dois animais/grupo foram eutanasiados e
foram coletadas amostras de baço e fígado para realização das análises de imprints e
histopatológico. O tratamento dos animais durou 30 dias consecutivos, mas todo o
experimento durou 90 dias. O óleo e a fração foram administrados em duas doses
100mg/kg e 50mg/kg. O controle positivo usou 20mg Sbv/kg de antimoniato de meglumina
(Glucantime®
); controle negativo foi de animais infectados que não receberam tratamento e
o último grupo era apenas de animais sadios. Após 15 dias de tratamento (D45) dois
animais e no 30o dia pós-tratamento (D90) seis animais por grupo foram eutanasiados e
amostras do fígado e baço foram coletadas para análise. O óleo-resina de C. reticulata e a
fração acetato de etila de R. communis foram os mais eficientes com valores de CI50 sobre
promastigotas de 7,88 e 3,45 µg/mL e contra amastigotas de 0,52 e 17,28 µg/mL. Nenhum
produto natural diferiu do controle positivo pentamidina (CI50 de 0,17 – 23,11 µg/mL)
contra promastigotas e anfotericina B (CI50 de 0,08 – 51,87 µg/mL) em amastigotas. Com
10
relação a citotoxicidade o óleo-resina de C. reticulata e a fração acetato de etila de R.
communis não evidenciaram efeito tóxico. Nos testes in vivo, o histopatológico esplênico
sugere que nos animais tratados houve uma resposta imune celular estimulada. No fígado
os sinais mais óbvios observados foram focos inflamatórios com formações
granulomatóides. Focos de hemorragia foram mais evidentes no grupo dos animais
infectados e não tratados. Todos os tratamentos reduziram a carga parasitária esplênica e
hepática e o efeito foi dose-dependente. Estes resultados sugerem que os produtos naturais
obtidos de C. reticulata e R. communis podem ser eficazes para o tratamento da LV,
embora novos testes são necessários para avaliar os possíveis mecanismos de ação.
Palavras-chave: Produtos naturais. Leishmaníase visceral. Tratamento alternativo.
Hamster.
11
ABSTRACT
The absence of effective results on control of Visceral Leishmaniasis (VL) stimulates the
search for new alternative that can be effective on the combat of this disease. Thus the
objective of this study was to develop phytotherapics to treat VL. From the plants Aloe
vera, Coriandrum sativum and Ricinus communis were obtained three crude extracts. From
crude extracts it were obtained chloroform, ethyl acetate and methanol fractions for each
plant. It were also obtained C. sativum and Lippia sidoides essential oils and an oleoresin
from Copaifera reticulata. In the first step, the natural products were evaluated on
promastigotes and amastigotes of Leishmania chagasi and cytotoxicity on monocytic
murine RAW 264.7 cells. By the in vitro tests were determined IC50 values of each
fraction/oils on promastigotes and amastigotes of L. chagasi by MTT test e by
immunoassay ELISA in situ, respectively. In the second step, the most effective and the
least toxic fraction and oil in the first step were selected for therapeutic use in vivo tests.
On these assays, golden hamsters were infected intraperitonealy by 1x107
promastigotes/0.1mL PBS 1x of L. chagasi and the animals were divided in seven groups
with ten hamsters each. The infection confirmation was made in thirtieth day after
experimental inoculation, two animals for each group were euthanized and samples of liver
and spleen were collected to realize imprints and histopathological analysis. The animal’s
treatment was consecutives thirty days, but the whole experiment lasted 90 days. The oil
and fraction were administrated in two doses 100mg/kg and 50mg/kg. The positive control
used 20mg Sbv/kg from antimoniate of meglumine (Glucantime
®); negative control of
animals infected untreated and last group was just healthy animals. After fifteen days of
treatment (D45) two animals and on thirthief day pos-treatment (D90) six animals per
group were euthanized and samples of liver and spleen were collected to analysis. The
oleoresin of C. reticulata and ethyl acetate fraction of R. communis had more effectiveness
with IC50 values on promastigotes of 7.88 and 3.45 µg/mL and against amastigotes of 0.52
and 17.28 µg/mL. None natural product differ from positive control pentamidine (IC50 of
0.17 – 23.11 µg/mL) against promastigotes and amphotericin B (IC50 of 0.08 – 51.87
µg/mL) on amastigotes. In the cytotoxic test the oleoresin of C. reticulata and ethyl acetate
12
fraction from R. communis showed no toxic effect. The in vivo tests, the splenic
histopathology suggest that treated animals had a stimulated cellular immune response. In
the liver the more obvious signs observed were inflammatory foci and formations
granulomatoid. Hemorrhagic foci were evident in the untreated and infected group. All
treatments reduced spleen and liver parasite load and found to be dose-dependent. These
results suggest that natural products obtained from C. reticulata and R. communis can be
effective for the treatment of VL, although news tests are needed to evaluate the possible
mechanisms of action.
Keywords: Natural products. Visceral leishmaniasis. Alternative treatment. Hamster.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Médico e Cientista Gaspar de Oliveira Vianna ..................................... 23
Figura 2 – Antimoniato de meglumina (Glucantime®) ........................................... 24
Figura 3 – Alopurinol droga leishmaniostática de uso conjunto com antimoniato
de meglumina .......................................................................................................... 25
Figura 4 – Aminosidina antibiótico pertencente ao grupo de segunda escolha
para o tratamento da LV humana ............................................................................ 26
Figura 5 – Anfotericina B antibiótico e antifúngico pertencente ao grupo de
segunda escolha para o tratamento da LV humana ................................................. 27
Figura 6 – Miltefosina quimioterápico para o tratamento da LV humana .............. 27
Figura 7 – Produtos naturais utilizados para combater doenças ............................. 30
Figura 8 – Trajetória para validação de uso popular de plantas medicinais ........... 31
Figura 9 – Promastigotas cultivadas em meio M199 e coradas por kit Panótico.... 32
Figura 10 – Formas amastigotas observadas em imprint hepático em aumento de
100x ........................................................................................................................ 34
Figura 11 – Hamster dourado (Mesocricetus auratus) principal espécie animal
usada em estudos de infecção experimental por Leishmania spp........................... 36
Figura 12 – Planta do gênero Aloe........................................................................... 40
Figura 13 – Árvore do gênero Copaifera................................................................. 41
Figura 14 – Erva Coriandrum sativum..................................................................... 42
Figura 15 – A planta Lippia sidoides....................................................................... 44
Figura 16 – Planta Ricinus communis...................................................................... 45
Capítulo 1
Figure 1. Viability of RAW 264.7 cells treated with100 g/mL with either the
ethyl acetate, chloroform, or methanol fractions of A. vera, C. sativum, and R.
communis compared to positive (40µg/mL amphotericin B) and negative control
(Dulbecco medium) ……………………………………………………………….
59
Capítulo 2
Figure 1. Effect of C. sativum and L. sidoides essentials oils, and C. reticulata
oleoresin at a concentration of 100 µg/mL, on the viability of the murine
monocyte cell line, RAW 264.7. Amphotericin B (40 µg/mL) was used as a
reference, and Dulbecco medium served as the negative control ……………….
74
Capítulo 3
14
Figura 1: Carga Parasitária dos imprints esplênicos (A) e hepáticos (B) obtidos
no período de 30 dias pós-infecção (D30), 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias
pós-tratamento (D90) dos animais tratados com o óleo-resina de C. reticulata
comparados com os grupos controle positivo tratados com antimoniato de
meglumina e controle negativo composto por animais infectados e não tratados.
89
Figura 2: Imprint Baço: A – pequeno número de formas amastigotas de L.
chagasi (seta branca) – animal infectado e tratado com 100mg/Kg do óleo-resina
de C. reticulata, 100x; B – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
animal infectado sem tratamento, 100x. Tempo - 90 dias após a infecção.........
89
Figura 3: Imprint Fígado: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
animal tratado 100mg/kg de óleo-resina de C. reticulata, 40x; B – Ninho de
formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) – animal infectado sem
tratamento, 100x. Tempo - 90 dias após a infecção...........................................
90
Figura 4: Achado histopatológico de tumefação turva discreta e moderada
encontrado em todos os animais tratados após 90 dias de infecção, 20x............. 92
Figura 5: Aspecto granulomatóide de infiltrado inflamatório observado no fígado
em animal tratado com 100mg/Kg de óleo-resina de C. reticulata, 40x. Tempo –
90 dias pós-infecção........................................................................................
92
Figura 6: Hiperplasia de células de Kupffer em animal infectado e não tratado
após 90 dias de infecção, 100x......................................................................... 93
Figura 7: Hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito
periarteriolar, 100x.......................................................................................... 93
Figura 8: Hiperplasia folicular da polpa branca com confluência de folículos em
animal infectado e não tratado após 90 dias de infecção, 100x.......................... 94
Capítulo 4
Figura 1: Carga Parasitária dos imprints esplênicos (A) e hepáticos (B) obtidos
no período de 30 dias pós-infecção (D30), 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias
pós-tratamento (D90) dos animais tratados com a fração acetato de etila de R.
communis comparados com os grupos controle positivo Glucantime® e controle
negativo composto por animais infectados e não tratados..................................
109
Figura 2: Imprint Baço: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
animal tratado 100mg/kg da fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias
de experimento, 100x; B – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
110
15
animal infectado sem tratamento, após 90 dias de experimento, 100x................
Figura 3: Imprint Fígado: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
animal tratado 100mg/kg da fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias
de experimento, 100x; B – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) –
animal infectado sem tratamento, 40x...............................................................
110
Figura 4: Fígado: A – Degeneração hidrópica/tumefação turva discreta e foco
hemorrágico discreto 40x................................................................................... 112
Figura 5: Fígado: Infiltrado inflamatório epitelióide concêntrico, tipo
granulomatóide observado em animal tratado com 100mg/kg da fração acetato de
etila de R. communis, após 90 dias de tratamento, 40x.......................................
113
Figura 6: Hiperplasia de células de Kupffer em animal infectado e não tratado
após 90 dias de experimento, 100x.................................................................. 113
Figura 7: Hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito
periarteriolar em animal tratado com 100mg/Kg da fração acetato de etila de R.
communis, após 90 dias de experimento, 20x....................................................
114
Figura 8: Hiperplasia folicular da polpa branca com confluência de folículos em
animal infectado e não tratado após 90 dias de experimento, 20x....................... 115
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Efeito leishmanicida in vitro de plantas ................................................ 37
Tabela 2 – Estudos in vivo de atividade leishmanicida de Plantas ..................... 38
Capítulo 1
Table 1: IC50 values of ethyl acetate, chloroform, and methanol fractions of Aloe
vera, Coriandrum sativum, and Ricinus communis on promastigotes and
amastigotes of Leishmania infantum……………………………………………..
58
Table 2: Chemical compounds of each fraction identified by phytochemical tests
according to Matos (2009) and Siddiqui et al. (2009)………………………………….. 60
Capítulo 2
Table 1: Relative percent composition of Coriandrum sativum and Lippia
sidoides essential oils, and Copaifera reticulata oleoresin……………………… 75
Capítulo 3
Tabela 1: Protocolo terapêutico instituído nos grupos experimentais. 87
Tabela 2: Redução da carga parasitaria esplênica de hamsters infectados
experimentalmente por Leishmania chagasi e tratados com óleo-resina de
Copaifera reticulata nas doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento
(D45) e 30 dias após o término do tratamento (D90), comparada aos animais
tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de meglumina.....................
91
Tabela 3: Redução da carga parasitaria hepática de hamsters infectados
experimentalmente por Leishmania chagasi e tratados com óleo-resina de
Copaifera reticulata nas doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento
(D45) e 30 dias após o término do tratamento (D90), comparada aos animais
tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de meglumina......................
91
Capítulo 4
Tabela 1: Protocolo terapêutico instituído nos grupos experimentais. 108
Tabela 2: Redução da carga parasitaria esplênica de hamsters infectados 111
17
experimentalmente por Leishmania chagasi e tratados com a fração acetato de
etila de Ricinus communis L. nas doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de
tratamento (D45) e 30 dias após o término do tratamento (D90), comparada aos
animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de meglumina.........
Tabela 3. Redução da carga parasitaria hepática de hamsters infectados
experimentalmente por Leishmania chagasi e tratados com a fração acetato de
etila de Ricinus communis L. nas doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de
tratamento (D45) e 30 dias após o término do tratamento (D90), comparada aos
animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de meglumina.........
111
18
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg – Microgramas
BA - Bahia
CI50 – Concentração de uma substância capaz de inibir 50% dos parasitos
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 – Gás carbônico
DL10 – Dose letal capaz de matar 10% dos animais
DL50 – Dose letal capaz de matar 50% dos animais
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
FUNCAP – Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico Tecnológico
IC50 – Concentration of drug able to inhibit 50% of parasites
IM – Intramuscular
IP – Intraperitoneal
kg – kilogramas
LABODOPAR – Laboratório de Doenças Parasitárias
LV – Leishmaníase visceral
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
mg – Miligramas
mL – Mililitros
MS – Ministério da Saúde
MTT – Brometo 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium
nm – Nanômetros
OMS – Organização Mundial da Saúde
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
SbIII
– Antimônio Trivalente
SbV – Antimônio Pentavalente
SDS – Sulfato Dodecil de Sódio
sp. – Espécie
spp. – Várias espécies
19
UECE – Universidade Estadual do Ceará
UFC – Universidade Federal do Ceará
UFERSA – Universidade Federal Rural do Semi-Árido
USP – Universidade de São Paulo
VL – Visceral leishmaniasis
VO – Via Oral
WHO – World Health Organization
20
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................... 23
2.1 Fármacos usados no tratamento da LV.................................................
2.2 Validação científica de plantas com ação leishmanicida.....................
2.3 Plantas com ação leishmanicida...........................................................
2.4 Plantas utilizadas no presente estudo...................................................
23
30
36
40
3 JUSTIFICATIVA........................................................................................... 47
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA............................................................................. 48
5 OBJETIVOS.................................................................................................... 49
5.1 Objetivo Geral......................................................................................
5.2 Objetivos Específicos...........................................................................
49
49
6 CAPÍTULO 1.................................................................................................. 50
7 CAPÍTULO 2.................................................................................................. 66
8 CAPÍTULO 3.................................................................................................. 81
9 CAPÍTULO 4.................................................................................................. 101
10 CONCLUSÕES............................................................................................... 122
11 PERSPECTIVAS............................................................................................ 123
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 124
21
1 INTRODUÇÃO
A leishmaníase visceral (LV) é uma zoonose parasitária de caráter crônico e em
casos não tratados pode ser fatal (MIRÓ et al., 2008). Isto porque suas características
clínicas, histopatológicas e imunológicas dependem da virulência do protozoário infectante
e da suscetibilidade do hospedeiro (PEARSON; DE QUEIROZ SOUSA, 1996). Esta
enfermidade tem como agente etiológico nas Américas Central e do Sul o protozoário
Leishmania chagasi que possui duas formas bem características, a promastigota, flagelada
metacíclica infectante, presente no vetor biológico e a amastigota, parasito intracelular
obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear (LAINSON; RANGEL, 2005).
O único reservatório do ambiente urbano é o cão, Canis familiaris, e no ambiente
silvestre a raposa, Cerdocyon thous (ASHFORD, 2000). O principal vetor responsável pela
transmissão da LV no Brasil é o díptero Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae)
(LAINSON; RANGEL, 2005), entretanto, na região do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul,
o flebotomíneo L. cruzi tem sido implicado na transmissão da doença (MISSAWA et al.,
2011). Mais recentemente, um estudo tem sugerido ao inseto L. migonei o papel de possível
vetor da LV na cidade de La Banda, na Argentina (SALOMÓN et a., 2010).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) ocorrem 500 mil novos casos
humanos por ano de LV. Sendo Brasil, Índia, Bangladesh, Nepal e Sudão responsáveis por
90% dos casos humanos de LV no Mundo (WHO, 2010). No Brasil, o Nordeste brasileiro,
até a década de 90 concentrava 90% dos casos de LV humana. No entanto, atualmente tem-
se observado uma expansão territorial desta doença, pois o número de notificações nesta
região tem diminuído enquanto que em outras regiões brasileiras aumentou. Em 2006 e em
2008 foram registrados em torno de 55% e 48%, respectivamente, de casos positivos para
LV no Nordeste (BRASIL, 2010). Outro aspecto favorável para esta expansão foi a
urbanização da LV, através da adaptação do inseto vetor às áreas urbanas associada à
aproximação entre o reservatório canino e o homem (HARHAY et al., 2011).
A endemicidade da LV no estado do Ceará é comprovada e as cidades de Fortaleza,
Sobral e Barbalha apresentam a maior incidência da doença em humanos (CEARÁ, 2008).
No que diz respeito à população canina, um levantamento realizado no ano de 2007 em
22
Fortaleza demonstrou prevalência da LV de 26,2% (196/750) em cães domiciliados e de
21,4% (135/631) em cães de rua (RONDON et al., 2008). Cães infectados têm sido
encontrados em todos os focos onde há doença humana, deste modo, representam o
principal elo na cadeia de transmissão (GRAMICCIA; GRADONI, 2005).
O tratamento com substâncias sintéticas da LV humana e canina utiliza como
fármacos de primeira escolha os antimoniais pentavalentes. Porém devido aos graves
efeitos tóxicos surgiram outras drogas como alopurinol, anfotericina B e sua forma
lipossomal, aminosidina/paramomicina, quinolonas, metronidazol, pentamidina e mais
recentemente miltefosina (CROFT; COOMBS, 2003; SHARIEF et al., 2006; BIZZETI et
al., 2006, OLIVA et al., 2010). No entanto, o efeito tóxico das drogas usadas no protocolo
terapêutico e o aparecimento de parasitos resistentes em casos humanos na Índia (CROFT;
COOMBS 2003; SHARIEF et al., 2006) e a comprovação da ineficácia do tratamento
canino (OLIVA et al., 2010) reforçaram a ausência de medidas curativas eficientes que
comprovam a necessidade do desenvolvimento de drogas leishmanicidas eficazes e menos
tóxicas tanto para o cão quanto para o homem. Estes fatos foram corroborados em diversos
estudos realizados no Brasil (SCHETTINI et al., 2005) e na Europa (NIETO et al., 2003;
CORRALES, 2007). Na ausência de cura parasitológica, o tratamento contra a LV em cães
com medicamentos utilizados no tratamento humano é proibido no Brasil de acordo com a
Portaria Interministerial MAPA/MS 1.426/2008 (BRASIL, 2008).
Nesse contexto, sabe-se que o uso empírico de plantas medicinais pela população
tem demonstrado a existência de constituintes bioativos em todas as partes de plantas com
poder de curar diversas enfermidades, suscitando assim grande interesse no estudo
científico destes componentes. Ademais, um quarto dos medicamentos do mercado
farmacêutico possui bioativos extraídos de plantas em sua composição, alguns dos quais
têm sido usados como matéria-prima de drogas semi-sintéticas (ROSSI-BERGMANN et
al., 1997). Desta forma a pesquisa avaliando plantas medicinais na busca de novos
princípios ativos realmente efetivos no tratamento da leishmaníase canina é relevante.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Fármacos usados no tratamento da LV
2.1.1 Fármacos de Primeira Escolha
Desde a antiguidade os antimônios são usados na medicina para diversos fins
terapêuticos, mas apenas em 1912 Gaspar de Oliveira Vianna (Figura 1) observou que o
tártaro emético, um antimonial trivalente (SbIII
), tinha efeito terapêutico em casos de
leishmaníase tegumentar americana (LTA) e em 1915 foi demonstrado a sua eficácia no
tratamento da LV (RATH et al., 2003). No entanto, devido aos seus graves efeitos tóxicos e
colaterais este foi substituído pelos antimoniais pentavalentes (SbV), tais como o
estibogluconato de sódio (Pentostam®) e o antimoniato de meglumina (Glucantime
®) que
são os fármacos de primeira escolha para o tratamento humano (BERMAN, 1997) e canino
(ALVAR et al., 1994), este último realizado apenas na Europa. Além do mais, estas drogas
são 10 vezes menos tóxicas que os antimoniais trivalentes (ROBERTS et al., 1995).
Figura 1: Médico e cientista Gaspar de Oliveira Vianna (11 de maio de 1885 – 14 de junho de 1914). Fonte:
http://www. historyofmedicine.blogspot.com.
24
O antimoniato de meglumina (Figura 2) é obtido sinteticamente pela associação do
ácido antimônico e da N-metil-D-glucamina, no entanto, sua fórmula estrutural não é
definida, sabe-se apenas que este composto é solúvel em água e pouco em solventes
orgânicos (RATH et al., 2003). Entretanto, em 2008 um estudo trouxe uma nova
perspectiva para a estrutura química do antimoniato de meglumina a partir, da análise de
espectrometria de massa de ionização por eletrospray (FRÉZARD et al., 2008).
Figura 2 – Antimoniato de meglumina: Estrutura química proposta por Frézard et al. (2008) (A); Antimoniato
de Meglumina na forma comercial (Glucantime®) (B). Fonte: http://www.oasportal.policia.gov.co.
Este medicamento apesar de ser utilizado desde a década de 50, ainda hoje, se
desconhece o mecanismo de ação e a toxicidade seletiva. Existem três hipóteses que tentam
explicar a ação deste fármaco, a primeira cita que o mecanismo de ação deste pentavalente
pode ser pela formação de complexos de carboidratos e antimônio, os quais facilitariam a
distribuição da droga nos macrófagos do hospedeiro. A segunda sugere que o antimoniato
de meglumina seja uma pró-droga, convertida no interior do macrófago em SbIII
, composto
tóxico para as formas amastigotas de Leishmania spp. (ROBERTS et al., 1995), e este
composto trivalente iria interferir no processo de β-oxidação dos ácidos graxos e na
glicólise do parasito levando a uma depleção dos níveis de ATP intracelular (BALAÑA-
FOUCE et al., 1998). A terceira hipótese relata que existe na forma amastigota uma
metaloprotease zinco dependente, que poderia ser inativada se o antimônio substituísse o
zinco nesta enzima, o qual por sua vez, é essencial para o desenvolvimento do parasito
(BANGS et al., 2001).
A B
25
2.1.2 Outros fármacos usados no combate à leishmaníase visceral
O alopurinol (Figura 3) é outro fármaco muito utilizado no protocolo terapêutico da
LV, normalmente associado ao antimoniato de meglumina por possuir efeito apenas
inibitório do crescimento de Leishmania spp. Entretanto, sua toxicidade quando comparado
aos antimônios e sua administração oral são características que favorecem seu uso. Porém,
os resultados obtidos na terapia com o uso apenas do alopurinol ou mesmo em associação
não tem se mostrado eficaz na cura da LV canina (DENEROLLE; BOURDOISEAU,
1999).
Figura 3 – Alopurinol droga leishmaniostática de uso conjunto com antimoniato de meglumina: Estrutura
química do Alopurinol (A). Fonte: http://dailymed.nlm.nih.gov; formulação comercial (B). Fonte:
http://www.medicalook.com.
Neste contexto, muitos estudos têm demonstrado que a terapia do antimoniato de
meglumina sozinho ou associado com alopurinol no protocolo terapêutico de cães natural
ou experimentalmente infectados por Leishmania spp. foi capaz de induzir parcial ou
completamente a redução dos sinais clínicos, contudo após o tratamento, os animais
permaneceram positivos de acordo com diagnóstico molecular em amostras da medula
óssea, vale ressaltar que estes animais permaneceram em observação por 48 meses
(MORITZ et al., 1999).
Outros efeitos adversos observados na terapia do antimônio com o alopurinol são
letargia e distúrbios gastrintestinais e, além disso, foi observado foco inflamatório no local
de administração do antimônio em quase todos os animais tratados, permanecendo como
fonte de infecção de Leishmania spp para os flebotomíneos (ALVAR et al., 1994).
A B
26
O sulfato de paromomicina (Figura 4), cujo nome comercial é aminosidina, é um
antibiótico aminoglicosídeo extraído de Streptomyces rimosus. Seu mecanismo de ação
envolve a inibição da síntese protéica e a alteração da permeabilidade da membrana
plasmática dos parasitos. No entanto, esta droga tende a ser nefrotóxica e ototóxica
(RIBEIRO, 2001).
Figura 4 – Aminosidina antibiótico pertencente ao grupo de segunda escolha para o tratamento da LV
humana: Estrutura química do sulfato de paromomicina (A). Fonte: http://www.uspbpep.com; Forma
comercial do sulfato de paromomicina (B). Fonte: http://www.cheminter.com.gt.
Um estudo realizado em Teresina demonstrou que cães assintomáticos naturalmente
infectados por L. chagasi e tratados com aminosidina em geral obtiveram uma melhora
clínica, porém apresentaram reicidiva clínica e parasitológica entre 50 e 100 dias do início
da terapia e 12 animais apresentaram cegueira e ototoxicidade evoluindo para surdez
(VEXENAT et al., 1998).
A anfotericina B (Figura 5), antibiótico antifúngico que atua rompendo a membrana
celular, provocando a morte do parasito, é outro fármaco muito indicado para o tratamento
da leishmaníase mucocutânea, porém é altamente nefrotóxico, sendo necessário um
acompanhamento rigoroso do paciente (SHARIEF et al., 2006).
A B
27
Figura 5 – Anfotericina B antibiótico e antifúngico pertencente ao grupo de segunda escolha para o
tratamento da LV humana: Estrutura química (A). Fonte: http://www.bmb.leeds.ac.uk; Apresentação
comercial do medicamento (B). Fonte: http://www.stanford.edu.
Pesquisas utilizando a anfotericina B têm demonstrado que este fármaco foi eficaz
em pacientes infectados por Leishmania donovani resistentes ao estibogluconato de sódio
(SHARIEF et al., 2006) e quando é incorporado em lipossomas o efeito tem sido superior
ao da anfotericina B convencional (PAUL et al., 1997). Contudo, um estudo realizado na
Itália utilizando 13 cães naturalmente infectados com L. infantum e tratados com
anfotericina B lipossomal demonstrou a melhora clínica rápida, regressão de
linfoadenomegalia e esplenomegalia e cura das lesões de pele. No entanto, os cães
permaneceram positivos nos exames parasitológicos após 8 meses de observação (OLIVA
et al., 1995).
A miltefosina (Figura 6), hexadecilfosfocolina, é a mais recente arma no combate as
leishmaníases. Este quimioterápico foi sintetizado a partir de um análogo do
alquilisofosfolipídico que demonstrou efeito citotóxico e originalmente foi investigado para
o tratamento contra o câncer (RATH et al., 2003).
Figura 6 – Miltefosina quimioterápico para o tratamento da LV humana: Estruturam química (A). Fonte:
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov; Formulação da OMS/WHO para o tratamento da LV humana (B). Fonte:
http://www.stanford.edu.
A B
A B
28
A miltefosina foi capaz de ativar macrófagos de camundongos infectados por
Leishmania spp. e inibir a síntese de lipídeos destes protozoários (SINDERMANN et al.,
2004). A avaliação in vitro da atividade leishmanicida de miltefosina sobre formas
promastigotas de L. donovani e L. infantum obteve como resultado concentração inibitória
de 50% (CI50) de 0,89 e 2,25 µg/mL, respectivamente. Em testes in vivo utilizando
camundongos Balb/c foi observada supressão parasitária esplênica após 4 semanas de
tratamento (KUHLENCORD et al., 1992).
Um estudo realizado na Itália utilizando 28 cães infectados naturalmente com L.
infantum demonstrou que a associação da miltefosina com alopurinol agem fortemente
sobre a replicação de L. infantum, mas não foi capaz de eliminar os parasitos nos
linfonodos detectados por PCR em tempo real, o que sugere que a presença dos parasitos
foi responsável pela recidiva da doença nos 4 animais após 6 meses do início do tratamento.
Outro fato observado através de PCR em tempo real foi a presença de DNA dos parasitos
no sangue de todos os animais. Vale ressaltar que não foi observada a completa eliminação
dos parasitos em nenhum animal do estudo (MANNA et al., 2008).
O uso da miltefosina sozinha no tratamento da LV canina já foi estudado no Brasil
com animais naturalmente infectados por L. chagasi e apesar da melhora clínica em 50%
dos cães e redução da parasitemia na medula óssea, o teste com PCR demonstrou
amplificação de DNA do parasito nos animais acompanhados por 300 dias após o
tratamento, comprovando assim que os estes cães continuam portadores do parasito e
podem ainda manter o ciclo de transmissão ativo, portanto, os autores recomendam que este
tipo de tratamento não seja usado em áreas endêmicas do país (ANDRADE et al., 2011).
Outros fármacos antimicrobianos como as quinolonas (ibafloxacina,
marbofloxacina, enrofloxacina), derivados do imidazol (metronidazol), derivados
antifúngicos dos azóis (cetonocazol, fluconazol, itraconazol) e terbinafina têm sido
avaliados para serem usados na terapia da LV canina. Gangneux et al. (1999)
demonstraram que os antifúngicos fluconazol, itraconazol e terbinafina foram menos
efetivos que o antimoniato de meglumina na redução da parasitemia esplênica em murinos
infectados por L. infantum. No entanto, foi observado um efeito sinérgico entre o
cetoconazol e o antimônio.
29
Um trabalho realizado em Fortaleza/Ceará/Brasil, utilizando o antifúngico
terbinafina sozinho ou associado ao antimoniato de meglumina (Glucantime®) no
tratamento de hamsters experimentalmente infectados com L. chagasi demonstrou que o
uso da terbinafina não reduziu a carga parasitária esplênica e também não teve efeito
sinérgico com o Glucantime® (SIMÕES-MATTOS et al., 2002).
Com relação às quinolonas, Bizzeti et al. (2006) avaliaram a eficácia da associação
da ibafloxacina com metronidazol em cães naturalmente infectados uma cepa de L.
infantum intolerante ou resistente ao antimoniato de meglumina. Foi relatado que após 120
dias todos os animais apresentaram remissão dos sinais clínicos e todos os parâmetros
laboratoriais regrediram para a normalidade. Contudo, os títulos de anticorpos sorológicos
permaneceram altos, além disso, a PCR permaneceu positiva em 33,3% (2/6) dos animais,
demonstrando assim que esta associação não foi efetiva para a cura parasitológica da
doença.
A quinolona marbofloxacina, utilizada por 28 dias em cães naturalmente infectados
por Leishmania spp. causou melhora clínica em todos os animais durante 9 meses e após
este período 3 cães tiveram recidiva da doença. A redução na densidade de amastigotas no
interior dos macrófagos foi observada após 3 meses de tratamento. No entanto, os autores
recomendam que os animais devam ser protegidos por inseticidas e colares impregnados
com deltametrina para evitar aproximação dos flebotomíneos e possíveis re-infecções
(ROUGIER et al., 2008).
Apesar deste arsenal de fármacos usados no protocolo terapêutico contra a LV
canina, esta doença continua cada vez mais disseminada. Além disso, a literatura demonstra
que estas drogas não são capazes de eliminar todos os parasitos, tornando os animais
assintomáticos, fonte de infecção e responsáveis por manterem o ciclo de transmissão da
doença. Desta forma, a demanda por novas drogas leishmanicidas tem sido estimulada nos
últimos anos e o uso de plantas pode ser uma alternativa, haja vista que são fontes de
compostos químicos para os medicamentos sintéticos usados atualmente. Além do mais, os
produtos bioativos oriundos das plantas precisam ser validados cientificamente para sua
comercialização junto às empresas farmacêuticas.
30
2.2 Validação científica de plantas com ação leishmanicida
O uso de produtos oriundos de plantas, de minerais e de animais, na terapia de
diversas doenças infecciosas ou não, foi uma prática muito utilizada pelas civilizações
antigas, principalmente quando ainda não existiam produtos farmacêuticos sintéticos
(RATES, 2001) (Figura 7).
Figura 7 – Produtos naturais utilizados para combater doenças. Fonte://www.amnh.org.
O uso de plantas medicinais ficou esquecido principalmente em países ou
comunidades desenvolvidas e com alto poder aquisitivo após o desenvolvimento da
indústria farmacêutica (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2005). No entanto, diversos
problemas têm surgido com o uso dos fármacos atualmente empregados no combate a LV
canina, como o aparecimento de cepas resistentes do protozoário Leishmania spp.
(SEIFERT; CROFT, 2006) e o aumento de casos de co-infecção por Erlichia sp.
(OLIVEIRA et al., 2008).
Além disso, a ineficácia das drogas sintéticas usadas atualmente no tratamento da
LV canina é comprovada porque o uso destes fármacos é exclusivamente para minimizar os
danos causados nos órgãos pelo alto parasitismo e remissão dos sinais clínicos, permitindo
um bem-estar adequado para a vida do animal (OLIVA et al., 2010). Os trabalhos com
plantas medicinais vêm se tornando cada vez mais necessários para a descoberta de novos
compostos que sejam eficazes contra o parasito e auxiliem no controle desta enfermidade
(CORRALES, 2007).
31
A pesquisa com plantas e a produção de medicamentos oriundos de plantas com
atividade medicinal comprovada cientificamente envolve várias etapas desde a seleção da
planta, até a comercialização do produto final, podendo seguir a trajetória traduzida
apresentada por Camurça-Vasconcelos et al. (2005) do original publicado por Rates, (2001)
(Figura 8).
Figura 8 – Trajetória para validação de uso popular de plantas medicinais. Fonte: CAMURÇA-
VASCONCELOS et al (2005) traduzido de RATES (2001).
A primeira etapa da validação científica corresponde ao levantamento dos dados
botânicos da planta incluindo sua identificação vegetal e dados sobre uso popular, que irão
determinar a parte da planta a ser usada, a forma de administração, as doses e o tempo de
tratamento. A segunda etapa da validação envolve testes farmacológicos pré-clínicos e
clínicos para avaliar o uso popular, quando são realizados testes que determinam a eficácia
contra os agentes causadores da enfermidade a ser combatida e a segurança da
administração para a espécie a ser tratada. A parte clínica, por sua vez, envolve testes
monitorados na espécie alvo do hospedeiro que possibilitam o registro da planta ou produto
a ser utilizado. As três últimas etapas constituem o processo final da validação, que envolve
a população alvo para que se torne possível o uso correto da planta medicinal. Estas são as
etapas para que o produto final possa ser produzido ou consumido de forma correta. O
cálculo da margem de segurança é normalmente realizado em animais de laboratório e visa
32
determinar efeitos tóxicos da administração da planta em organismos animais
(CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2005).
2.2.1 Testes in vitro para validação de bioativos leishmanicidas
Nas leishmaníases, estudos químicos e imunofarmacológicos in vitro têm sido
realizados com o intuito de encontrar novos compostos menos citotóxicos, economicamente
viáveis, de efeito específico e que sejam uma alternativa para a resistência do parasito às
drogas atualmente utilizadas. Neste contexto são usadas diversas técnicas in vitro
específicas para avaliar a atividade leishmanicida das plantas contra promastigotas,
amastigotas e amastigotas axênicas (FUMAROLA et al., 2004). As quais serão relatadas
apenas as que são mais utilizadas em promastigotas e amastigotas axênicas e intracelulares.
I. Testes sobre promastigotas
As formas promastigotas flageladas (Figura 9) multiplicam-se no interior do
intestino dos flebotomíneos e esta fase é denominada logarítmica até a formação da
promastigota metacíclica. Esta forma infectante encontra-se apenas na chamada fase
estacionária onde não haverá mais divisões. Durante novo repasto sanguíneo, o
flebotomíneo regurgita a forma metacíclica na corrente sanguínea, assim este parasito
estará pronto para infectar os macrófagos dos mamíferos. Todas estas etapas do
desenvolvimento podem ser mimetizadas no cultivo laboratorial (SACKS; PERKINS,
1985).
Figura 9 – Promastigotas cultivadas em meio M199 e
coradas por kit Panótico. Aumento de 100x. Fonte: Rondon,
F. C. M. – LABODOPAR.
33
A inibição do crescimento de promastigotas pode ser avaliada através do teste de
contagem direta. Neste teste é observada a atividade leishmanicida de produtos bioativos
sobre a presença e motilidade de promastigotas cultivadas em microplacas de 96 poços com
o auxílio de um microscópio invertido (CHAN-BACAB et al., 2003). Os parasitos imóveis
também podem ser avaliados usando azul de Tripan e vermelho neutral (DUTTA et al.,
2005). Este método calcula os valores da concentração do fármaco capaz de inibir 50% dos
parasitos (CI50).
Os métodos colorimétricos são: azul alamar; atividade da fosfatase ácida e o MTT.
O azul de alamar é um indicador de óxido-redução usado exclusivamente em
promastigotas. É uma técnica simples e recomendada em triagens farmacológicas de grande
escala. Os parasitos viáveis coram em vermelho e os não-viáveis em azul, a leitura é feita
em leitor de microplacas com fluorescência a 540-590nm (HABTEMARIAM, 2003). A
atividade da fosfatase ácida é dosada para avaliar o crescimento parasitário na presença de
compostos bioativos, a partir da lise das células e adição de p-nitrofenil fosfatase. A leitura
é realizada em leitora de microplacas no comprimento de onda de 405nm (CARRIÓ et al.,
2001). O MTT, redução do brometo 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium em
formazan insolúvel, tem sido empregado como um parâmetro de viabilidade parasitária nas
respostas aos compostos bioativos (SERENO et al., 2001). A reação é interrompida com a
adição de 50% de isopropanol e 10% de sulfato dodecil de sódio (SDS) e a leitura é feita a
570nm. Infelizmente, o MTT interage com algumas drogas como o antimoniato de
meglumina e assim diminui a acurácia do teste (SERENO et al., 2001, BRAGA et al.,
2007).
II. Testes sobre amastigotas intracelulares e amastigotas axênicas
As técnicas empregadas sobre as amastigotas intracelulares (Figura 10) são
consideradas mais laboriosas do que as usadas nas promastigotas devido à necessidade de
cultivo celular. No entanto, são as de maior relevância clínica por ser a forma parasitária
encontrada nos hospedeiros mamíferos (FUMAROLA et al., 2004).
34
Figura 10 – Formas amastigotas observadas em imprint hepático em aumento de 100x (setas pretas). Fonte:
Rondon, F. C. M. – LABODOPAR.
Uma maneira de caracterizar os efeitos dos compostos bioativos para esta forma do
protozoário é utilização da citometria de fluxo que possibilita caracterizar os efeitos dos
compostos bioativos de plantas sobre as funções celulares de Leishmania spp. e o uso
combinado de compostos fluorescentes permite uma descrição mais detalhada das formas
celulares para evidenciar a inibição causada pelo composto bioativo (PLOCK et al., 2001).
Outro método usado é o de contagem direta onde também é feita a leitura com auxílio do
microscópio invertido para avaliar a carga parasitária dos macrófagos (CARRIÓ et al.,
2001).
Outra técnica analisada em parasitos intracelular é o imunoensaio ELISA in situ que
já foi estudado em outro tripanosomatídeo, o Trypanosoma cruzi. Neste estudo esta técnica
mostrou ser de fácil aplicação e por ser um método colorimétrico sua análise é feita por um
espectrofotômetro de microplacas, eliminando assim, o erro induzido pela subjetividade
que é presente em análises feita sob microscópio (PIAZZA et al., 1994). Portanto, esta
técnica se mostra promissora na análise de produtos bioativos com eficácia utilizando
amastigotas intracelulares.
35
Os ensaios usados sobre amastigotas axênicas são os métodos de cultivo mais
difíceis e onerosos, pois devem mimetizar o ambiente adequado para a transformação da
promastigota em amastigota respeitando a temperatura de 31 a 38ºC, pH 4,5 a 7,2 e 5 a 7%
de CO2, dependendo da espécie de Leishmania. Além disso, os meios para cultivo celular
são acrescidos de soro fetal bovino, cuja concentração de promastigotas varia de acordo
com a espécie de Leishmania spp (GUPTA et al., 2001). Os testes para avaliar a atividade
leishmanicida de compostos bioativos sobre a viabilidade desta forma do parasito são a
contagem direta do protozoário com microscópio invertido e uso do MTT (SERENO et al.,
2001).
Vale ressaltar que os compostos bioativos mais eficazes nos testes in vitro devem
ser submetidos aos testes toxicológicos para obtenção das doses letais capazes de matar
10% (DL10) e 50% (DL50) dos animais de laboratório, permitindo-se delimitar as doses
que possam ser usadas nos testes in vivo (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2005).
2.2.2 Testes in vivo para validação de bioativos leishmanicidas
A identificação de novos alvos de fármacos em parasitos e de terapias mais efetivas
tem aumentado o número de estudos de triagem e de desenvolvimento de produtos
bioativos leishmanicidas (WYLLIE; FAIRLAMB, 2006). Desta maneira, os programas de
desenvolvimento de fármacos são estimulados pela facilidade em reproduzir a infecção por
Leishmania spp. no modelo animal apropriado. O modelo experimental mais usado em
estudos de infecção visceral progressiva e disseminante é o hamster (Figura 11) onde os
sinais clínicos de hepato-esplenomegalia, hipoalbuminemia e pancitopenia são semelhantes
aos achados no homem infectado (MELBY, 2002). Após a inoculação dos parasitos, o
estabelecimento da infecção é monitorado através da biópsia esplênica de 3 a 4 hamsters de
cada grupo após 30 dias da inoculação (MANANDHAR et al., 2008).
36
Figura 11 – Hamster dourado (Mesocricetus auratus) principal espécie animal usada em estudos de infecção
experimental por Leishmania spp. Fonte: Fonte: Rondon, F. C. M. – LABODOPAR.
Finalmente, os animais usados no teste com a espécie alvo, podem ser natural ou
experimentalmente infectados, fato este comprovado por PCR e/ou métodos
parasitológicos. No entanto, somente os animais assintomáticos ou oligossintomáticos são
adicionados ao experimento, sendo distribuídos de forma aleatória nos grupos. Os grupos
tratados recebem o composto natural mais eficaz nos testes in vivo em hamster em
diferentes concentrações pré-estabelecidas pelo cálculo da DL10. Ademais, quanto maior o
tempo de observação pós-tratamento dos animais mais confiável serão os resultados
(BRASIL, 1996; NOLI; AUXILIA, 2005).
2.3 Plantas com ação leishmanicida
2.3.1 Estudos in vitro
Os diversos estudos in vitro realizados com os mais variados extratos e/ou
compostos bioativos de plantas sobre as diferentes espécies de leishmânias que
demonstraram resultados promissores para a obtenção de novos princípios ativos no
combate as leishmaníases estão apresentados na tabela 1.
37
Tabela 1: Efeito leishmanicida in vitro de plantas
Planta Protozoário
Leishmania spp.
Concentração
Inibitória (CI50)
promastigotas
Concentração
Inibitória
(CI50)
amastigota
Fonte
Aloe vera
(Babosa) L. donovani <115 µg/mL 3 - 11 µg/mL DUTTA et al., 2008
Annona muricata
(Graviola)
L. amazonensis
L. braziliensis
L. donovani
25 µg/mL
25 µg/mL
25 µg/mL
- OSORIO et al., 2007
Byrsonima
crassifólia
(Orelha de veado)
L. mexicana 14 µg/mL - PERAZA-SÁNCHES et
al., 2007
Calophyllum
caledonicum
(Árvore de santa
maria)
L. donovani
L. amazonenses
5 µg/mL
-
-
12,5 µg/mL BILLO et al., 2005
Conobea
scoparioide
(Vassourinha do
brejo)
L. amazonensis
L. braziliensis
L. infantum
L. panamensis
Muito Ativo
Muito Ativo
Muito Ativo
-
-
-
-
1,3 µg/mL
WENINGER et al., 2001
Hiamatanthus
sucuuba
(Agoniada ou
Sucuúba)
L. amazonenses 20 µg/mL 5 µg/mL CASTILLO et al., 2007
Piper hispidum
(Aperta-Ruão) L. amazonenses 5 µg/mL 69 µg/mL ESTEVEZ et al., 2007
Tabernaemontana
sananho
(Sanango)
L. amazonenses 9 µg/mL 58 µg/mL ESTEVEZ et al., 2007
(-) não houve avaliação dos extratos e/ou compostos sobre a forma promastigota/amastigota de Leishmania
spp.
As substâncias isoladas a partir de plantas que obtiveram bom desempenho in vitro
foram: chalconas em Piper spp. (CHEN et al. 1993), aminoglicosteróides e aminosteróides
de Holarrhena curtisii (KAM et al., 1997), flavonóides de Centrolobium sclerophyllum
(ARAÚJO et al., 1998), naftoquinonas (KAYSER et al., 2000; TEIXEIRA et al., 2001),
neolignanas de Virola surinamensis (BARATA et al., 2000), fenóis como timol de Lippia
spp. (TEIXEIRA, 1999), polifenólicos de Cocos nucifera (MENDONÇA-FILHO et al.,
2004); taninos (KOLODZIEJ; KIDERLEN, 2005), diterpenos de Laetia procera
(JULLIAN et al., 2005), alcalóides de Zanthoxylum chiloperone (FERREIRA et al., 2002),
Piper spp. (NAKAMURA et al., 2006), Dysoxylum binectariferum (LAKSHMI et al.,
38
2007), Tabernaemontana spp. (ESTEVEZ et al., 2007; SOARES et al., 2007), iridóides
espirolactonas de Himanthus sucuuba (CASTILLO et a., 2007), iridóides glicosídicos de
Scrophularia lepidota (TASDEMIR et al., 2008) e Stachytarpheta cayennensis (MOREIRA
et al., 2007).
2.3.2 Estudos in vivo
Os estudos sobre a atividade leishmanicida de plantas in vivo, utilizando tanto o
modelo do Balb/c como o do hamster, não têm obtido resultados semelhantes aos in vitro,
em alguns casos. As frações diclorometano e éter de petróleo de Peperomia galioides
(canela branca) e seus constituintes ativos difenólicos exibiram propriedades in vitro, no
entanto, esta atividade não foi observada no estudo in vivo utilizando camundongos Balb/c
infectados com L. amazonensis (FOURNET et al., 1996). Na tabela 2 estão relatados alguns
estudos que avaliaram o efeito leishmanicida de plantas em modelo experimental in vivo.
Tabela 2: Estudos in vivo de atividade leishmanicida de Plantas
Planta Animal Leishmania spp
Redução da
Carga
Parasitária
Composto
isolado
Efeito do
Composto Fonte
Dysoxylum
binectariferum
Hamster L. donovani 38 - 69% no
baço ―Rohitukine‖ -
LAKSHMI et al.,
2007
Aloe vera Balb/c L. donovani
>90% no
fígado, medula
óssea e baço
- - DUTTA et al.,
2008
Ocimun
gratissimum Hamster L. braziliensis -
Timol - TEIXEIRA, 1999
Lippia sidoides
Tabebuia spp Lapachol -
Zanthoxylum
chiloperone Balb/c L. amazonensis - ―Canthin-6-one‖
Reduziu
70% das
lesões
FERREIRA et al.,
2002
Chenopodium
ambrosioides Balb/c L. amazonensis
Reduziu o
tamanho das
lesões
- - PATRÍCIO et al.,
2008
Mimusops elangii Hamster L. donovani - ácido Bassic
45, 62 e
78% no
baço
LALA et al., 2006
39
Maesa balansae Balb/c L. infantum - maesabalide III >90% no
fígado
GERMONPREZ
et al., 2005
(-) não houve avaliação dos extratos e/ou compostos sobre a redução parasitária esplênica ou hepática ou na
medula óssea, bem como na redução do tamanho da lesão dos protozoários de Leishmania spp.
2.3.2.1 Mecanismos de ação dos componentes derivados de Plantas
Alguns estudos in vitro e in vivo evidenciam ação direta sobre o parasito e/ou
atividade indireta, onde ocorre uma ação imunestimulante. Dentre as diversas plantas com
potencial na modulação da resposta imune à leishmaníase, Kalanchoe pinnata (folha-da-
fortuna) tem demonstrado efeito sobre a redução das lesões de camundongos Balb/c
infectados experimentalmente por L. amazonensis pelo aumento da produção de NO por
macrófagos (DA SILVA et al., 1999). Outro estudo demonstrou que o extrato da parte
externa de Aloe vera aumentou a produção de NO de macrófagos oriundos de Balb/c
infectados experimentalmente por L. donovani e o efeito citotóxico mostrou um pequeno
percentual de células mortas, de 12% e 18% sobre células humanas monocíticas e
macrófagos de murinos, respectivamente (DUTTA et al., 2008).
Uma planta que demonstrou atividade direta sobre o parasito foi a
Tabernaemontana catharinensis (leiteiro-de-vaca), sua fração etanólica rica em alcalóides,
demonstrou efeito citotóxico sobre o parasito L. amazonensis. No entanto, não foi
observado citotoxicidade sobre os macrófagos infectados (SOARES et al., 2007), bem
como na fração hidroalcóolica de Stachytarpheta cayennensis (gervão) que apresentou
efeito direto sobre promastigotas de L. braziliensis (MOREIRA et al., 2007).
Até o presente momento nenhuma substância sintética foi realmente efetiva no
tratamento das leishmaníases e os estudos realizados com produtos e/ou metabólitos ativos
de plantas têm demonstrado resultados in vitro e in vivo promissores, porém ainda
apresentam-se muito divergentes. Este fato reforça a necessidade de mais pesquisas com
plantas para encontrar um fitoterápico capaz de eliminar as diferentes formas de
Leishmania spp., potencializando o efeito imunomodulador do hospedeiro e com baixa
toxicidade. Funcionando assim, como uma alternativa para o tratamento e, que consiga
maximizar o controle da doença nas populações canina e humana.
40
2.4 Plantas utilizadas no presente estudo
Cinco plantas foram estudadas para verificar a atividade leishmanicida in vitro e in
vivo, são elas: Aloe vera (babosa), Copaifera reticulata (copaíba), Coriandrum sativum
(coentro), Lippia sidoides (Alecrim-pimenta) e Ricinus communis (mamona).
2.4.1 Aloe vera
As plantas do gênero Aloe (Figura 12) pertencem à família Liliaceae, têm folhas
espinhosas verdes com um líquido viscoso no interior, originárias da África e há tempos
são utilizadas pela medicina popular no Japão para cura de injúrias na pele, além disso, as
plantas deste gênero possuem uma enzima, a carboxipeptidase é capaz de hidrolisar a
bradicinina o que evidencia o seu efeito anti-inflamatório (FUJITA et al., 1979).
Figura 12 – Planta do gênero Aloe. Fonte: http://www.bbc.co.uk.
Outros compostos já foram isolados e identificados através de cromatografia de alta
eficiência e pela cromatografia eletrocinética micelar: antraquinonas barbaloina e
isobarbaloina que são usados como purgativos, além da aloenina e de outros compostos
fenólicos como aloesina, 2'-O-feruloylaloesina e aloeresina A (OKAMURA et al., 1996;
KUZUYA et al., 2001). Outro efeito atribuído a plantas deste gênero é a atividade
antimicrobiana e efeito catártico (OKAMURA et al., 1996).
Mais recentemente, foi demonstrado o efeito antineoplásico da Aloe arborescence
em camundongos com neoplasia pancreática (FURUKAWA et al., 2002). Dutta et al.
41
(2008) demonstraram que o extrato da parte externa da folha de Aloe vera, popularmente
conhecida como ―babosa‖ foi eficaz contra cepas de L. donovani com CI50 variando de 70
a 115µg/mL em promastigotas e 3,1 a 11,4 µg/mL em amastigotas. Mas, não demonstrou
toxicidade sobre células monocíticas e macrófagos. Neste mesmo estudo, o resultado do
teste in vivomostrou que o extrato da babosa sobre Balb/c infectados experimentalmente
com L. donovani, na dose de 15mg/kg/5 dias reduziu a parasitemia em mais de 90% no
fígado, baço e medula óssea sem alterar as funções hepáticas e renais.
2.4.2 Copaifera reticulata Ducke
A família Fabaceae abrange todas as plantas do gênero Copaifera (Figura 13). Este
gênero possui importantes espécimes de plantas medicinais, principalmente, na região
Amazônica. A espécie Copaifera reticulata é conhecida popularmente como ―copaíba‖,
esta árvore é bastante conhecida na Região Amazônica. Tudo indica que o uso deste óleo-
resina veio da observação dos índios ao comportamento de certos animais que, quando
feridos, esfregavam-se nos troncos das copaibeiras (PLOWDEN, 2004).
Figura 13 – Árvore do gênero Copaifera. Fonte: http:// http://www.ciflorestas.com.br
42
O óleo-resina obtido a partir do tronco destas árvores é amplamente comercializado
em todo o país devido a suas propriedades antiinflamatórias e cicatrizantes (BASILE et al.,
1988; MACIEL et al., 2002; VEIGA JR; PINTO, 2002) e contra larvas de Culex
quinquefasciatus e Aedes aegypti (SILVA et al., 2003; GERIS et al., 2008). As atividades
anti-Trypanosoma e anti-Leishmania já foram mencionadas em estudos etnofarmacológicos
(MACIEL et al., 2002; VEIGA JR; PINTO, 2002). Mais recentemente, um estudo realizou
triagem com oito óleos-resinas de Copaifera spp. e C. reticulata demonstrou ter melhor
atividade contra as formas promastigotas, amastigotas axênicas e amastigotas intracelulares
de Leishmania amazonensis (SANTOS et al., 2008).
2.4.3 Coriandrum sativum
Coentro é o nome popular da planta Coriandrum sativum (Figura 14), esta erva é
muito utilizada na Europa e Ásia, pertencente à família Umbelliferae, originária da região
do Mediterrâneo, é amplamente utilizada na culinária brasileira, principalmente na região
Nordestina (MELO et al., 2003). Foi empregada como medicamento nos países europeus e
asiáticos. Possui ação depurativa, podendo ser utilizada na forma de chá e/ou tintura. É
indicada para problemas hepáticos leves. Sua ação digestiva é muito boa, podendo também
ser empregada para combater cólicas intestinais e problemas de gases. Planta anual, de
ciclo curto, utiliza-se seus frutos secos moídos ou mesmo suas folhas frescas. (MENEZES
JR, 2002).
Figura 14 – Erva Coriandrum sativum. Fonte: http://www.gardeninginfozone.com.
43
Sujatha e Srinivas (1995) analisaram diferentes extratos aquosos de especiarias e
vegetais indianos avaliando o efeito antioxidante sobre a peroxidação lipídica na membrana
de eritrócitos humanos e o extrato aquoso das sementes de coentro, dentre outros inibiu em
67% a peroxidação lipídica. O coentro possui outras atividades como: efeito
hipoglicemiante (CHITHRA; LEELAMMA, 1999), efeito preventivo em intoxicações por
chumbo em camundongos (AGA et al., 2001), efeito protetor contra o metabolismo de
lipídeos no câncer do cólon experimental (CHITHRA; LEELAMMA, 2000),
antimutagênico (CORTÉS-ESLAVA et al., 2004), antidiabético (GALLAGHER et al.,
2003), diurético (AISSAOUI et al., 2007), gastroprotetor (AL-MOFLEH et al., 2006),
antifúngico (ATANDA et al., 2007), ansiolítico (EMAMGHOREISHI et al., 2005) e anti-
helmíntico sobre Haemonchus contortus de ovinos (EGUALE et al., 2007).
2.4.4 Lippia sidoides Cham
A planta Lippia sidoides Cham (Figura 15) pertence à família Verbenaceae, é
popularmente conhecida como ―alecrim-pimenta‖ (MATOS, 2002). As folhas e flores
constituem a parte medicinal desta planta. Seu óleo essencial possui elevado valor
comercial, pois contém timol ou uma mistura de timol e carvacrol, dois terpenos fenólicos
com fortíssima propriedade antimicrobiana e anti-séptica (MATOS, 2000; BOTELHO et
al., 2007).
44
Figura 15 – A planta Lippia sidoides. Fonte:http://www.lyndha.com
A atividade antihelmíntica do óleo essencial de L. sidoides foi comprovada sobre
Haemonchus contortus, um nematóide de pequenos ruminantes, Syphacia obvelata e
Aspiculuris tetraptera de camundongos (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007).
Assim como sua atividade larvicida contra larvas de Aedes aegypti (CARVALHO et al.,
2003; CAVALCANTI et al., 2004). Outras atividades também relatadas do óleo essencial
de L. sidoides são ação: antiinflamatória, gastroprotetora, antioxidante (MONTEIRO et al.,
2007) e antifúngica (FONTENELLE et al., 2007).
2.4.5 Ricinus communis
A planta Ricinus communis (Figura 16), popularmente conhecida como ―mamona‖,
pertence à família Euphorbiaceae, que engloba vasto número de plantas nativas da região
tropical, é uma planta arbustiva, com diversas colorações de caule, folhas e racemos,
podendo ou não possuir cera no caule e pecíolo (RODRIGUES et al., 2002).
45
Figura 16 – Planta Ricinus communis. Fonte: Rondon, F. C. M. – LABODOPAR.
Os frutos, em geral, possuem espinhos. As sementes apresentam-se com diferentes
tamanhos, formatos e grande variabilidade de coloração. O óleo de mamona ou de rícino,
extraído pela prensagem das sementes, contém 90% de ácido graxo ricinoléico, o qual
confere ao óleo características singulares, possibilitando ampla gama de utilização
industrial, tornando a cultura da mamoneira importante potencial econômico e estratégico
para o país. O óleo de rícino, obtido das sementes, além do seu emprego medicinal e em
cosméticos, tem sido utilizado na produção de biodiesel (SCARPA; GUERCI, 1982). A
torta de mamona, por sua vez, é utilizada como adubo orgânico possuindo efeito nematicida
(SAVY FILHO, 2001).
Os trabalhos elaborados com esta planta têm sido executados principalmente com
suas sementes, devido à fração protéica das sementes. Em suas folhas foram identificados
os seguintes compostos químicos: triterpenos, alcalóides, flavonóides, glicosídeos,
saponinas e taninos e estas partes da planta costumam ser empregadas como
antimicrobianas, acaricidas, filaricidas, moluscicidas e antivirais. Além disso, as folhas de
mamona são usadas popularmente no Brasil como hipoglicemiante e como diurético
(RODRIGUES et al., 2002). A influência de uma dieta à base de plantas sobre infecções
46
por Leishmania spp. em Phlebotomus papatasi demonstrou que a dieta com R. comunnis,
causou mais de 50% de mortalidade e deformação nos parasitos em 88% das infecções dos
flebotomíneos infectados (SCHLEIN; JACOBSON, 1994).
47
3 JUSTIFICATIVA
As tentativas de tratamento da LV canina com drogas sintéticas comercialmente
utilizadas em humanos não têm sido efetivas, pois o emprego desses medicamentos apenas
melhora temporariamente os sinais clínicos do animal, não revertendo a parasitemia. Os
cães tratados permanecem portadores da doença e, portanto, capazes de infectar o vetor,
mantendo a doença ativa no ambiente. Este fato associado à grande variedade de efeitos
colaterais e ao alto custo em manter a terapêutica, assim como, ao aparecimento de
parasitos resistentes às drogas sintéticas atualmente empregadas, estimula a pesquisa de
novas alternativas de tratamento. Neste contexto, o uso de plantas medicinais a partir da
validação científica, possibilitará o desenvolvimento de um fitoterápico eficaz no
tratamento da LV humana e canina e, por sua vez, poderá auxiliar no controle da
leishmaníase visceral em ambas as populações.
48
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
As plantas A. vera, C.reticulata, C. sativum, L. sidoides e R. communis possuem
atividade leishmanicida.
49
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
Desenvolver fitoterápicos com atividade leishmanicida a partir das plantas A. vera,
C. reticulata, C. sativum, L. sidoides e R. communis.
5.2 Objetivos Específicos
Caracterizar quimicamente as frações e óleos obtidos de cada planta;
Determinar a eficácia in vitro das frações obtidas de A. vera, C. sativum e R.
communis sobre as formas promastigotas e amastigotas de L. chagasi;
Determinar a eficácia in vitro dos óleos essenciais de C. sativum e L. sidoides e do
óleo-resina de C. reticulata sobre as formas promastigotas e amastigotas de L.
chagasi;
Avaliar a citotoxicidade das frações e dos óleos sobre monócitos murinos RAW
264.7;
Avaliar a eficácia in vivo dos bioativos com maior eficácia in vitro e menor
toxicidade, em hamsters dourados (Mesocricetus auratus) experimentalmente
infectados por L. chagasi.
50
6 CAPÍTULO 1
Efeito in vitro de frações de Aloe vera, Coriandrum sativum e Ricinus communis sobre
Leishmania infatum e contra células monocíticas de murinos
(In vitro effect of Aloe vera, Coriandrum sativum and Ricinus communis fractions on
Leishmania infantum and on murine monocytic cells)
Periódico: Veterinary Parasitology 178:235-240, 2011 (Qualis A2). Submetido em 01
de Setembro de 2010. Aceito em 07 de Janeiro de 2011.
doi:10.1016/j.vetpar.2011.01.007.
51
RESUMO
Na América do Sul, a leishmaníase visceral (LV) é uma zoonose causada pelo protozoário
Leishmania infantum (sinonímia = L. chagasi) e é primeiramente transmitida pela picada de
fêmeas de Lutzomyia longipalpis. O principal reservatório do ambiente urbano é o cão. A
aplicação das medidas de controle recomendadas pelos órgãos de saúde não tem surtido o
efeito desejável na redução da incidência da LV humana e a falta de drogas efetivas no
tratamento canino resultaram em sua proibição no Brasil. Portanto, é necessário pesquisar
por novas alternativas para o tratamento da LV humana e canina. Os objetivos deste estudo
foram avaliar o efeito in vitro das frações de Aloe vera (babosa), Coriandrum sativum
(coentro) e Ricinus communis (mamona) sobre promastigotas e amastigotas de L. infantum
e analisar a toxicidade contra células monocíticas murinas RAW 264.7. Para determinar a
CI50 das frações sobre promastigotas foi usado o teste MTT e contra amastigotas foi
realizada a técnica ELISA in situ. Todas as frações foram efetivas contra as promastigotas
e não diferiram do controle positivo pentamidina (p>0.05). Entretanto, as frações acetato de
etila e clorofórmica de R. communis , assim como, a fração metanólica de C. sativum foram
as mais eficientes contra as formas amastigotas e não diferiram do controle positivo
anfotericina B (p>0.05). A fração acetato de etila de R. communis foi a menos tóxica,
apresentando uma viabilidade de 83,5% sobre células RAW 264.7. Este resultado foi
similar ao controle positivo anfotericina B (p>0.05). Estes estudos evidenciam que a fração
acetato de etila de R. communis pode ser utilizada no estudo in vivo porque apresentou
eficácia contra promastigotas e amastigotas de L. infantum e a menor toxicidade contra
células monocíticas de murinos.
Palavras-chaves: Atividade leishmanicida; Leishmania infantum; amastigotas;
promastigotas; citotoxicidade.
52
In vitro effect of Aloe vera, Coriandrum sativum and Ricinus communis fractions on
Leishmania infantum and on murine monocytic cells
Fernanda C. M. Rondona, Claudia M. L.
Bevilaqua
a,*, Marina P.
Accioly
a, Selene M.
Moraisb, Heitor F. Andrade-Junior
c, Lyeghyna K. A. Machado
b, Roselaine P. A. Cardoso
c,
Camila A. Almeida
a, Eudson M.
Queiroz-Junior
a, Ana Caroline M. Rodrigues
a
aLaboratório de Doença Parasitárias/Universidade Estadual do Ceará, Brazil
bLaboratório de Produtos Naturais/Universidade Estadual do Ceará, Brazil
cLaboratório de Protozoologia/Universidade de São Paulo, Brazil
*Corresponding author
Av. Dedé Brasil, 1700, 60740-913 Fortaleza, Ceará, Brazil
Tel.: +55.85.31019853; fax: +55.85.31019840
E-mail address: [email protected]
ABSTRACT
In South America, visceral leishmaniasis is a zoonosis caused by the protozoan species
Leishmania infantum (syn. L. chagasi) and is primarily transmitted through the bite of the
female Lutzomyia longipalpis. Its main reservoir in urban areas is the dog. The application
of control measures recommended by health agencies have not achieved significant results
in reducing the incidence of human cases, and the lack of effective drugs to treat dogs
resulted in the prohibition of this course of action in Brazil. Therefore, it is necessary to
search new alternatives for the treatment of canine and human visceral leishmaniasis. The
objectives of this study were to evaluate the in vitro effect of fractions from Aloe vera
(aloe), Coriandrum sativum (coriander), and Ricinus communis (castor) on promastigotes
and amastigotes of L. infantum and to analyze the toxicity against the murine monocytic
cells RAW 264.7. To determine the viability of these substances on 50% parasites (IC50),
we used a tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay (bromide 3-4.5-dimethylthiazol-2-yl-
53
2,5-dephenyltetrazolium), and on amastigotes we performed an in situ ELISA. All fractions
were effective against L. infantum promastigotes and did not differ from the positive
control pentamidine (p>0.05). However, the R. communis ethyl acetate and chloroform
fractions, as well as the C. sativum methanol fraction, were the most effective against
amastigotes and did not differ from the positive control amphotericin B (p>0.05). The R.
communis ethyl acetate fraction was the least toxic, presenting 83.5% viability of RAW
264.7 cells, which was similar to the results obtained with amphotericin B (p>0.05). Based
on these results, we intend to undertake in vivo studies with R. communis ethyl acetate
fractions due the high effectiveness against amastigotes and promastigotes of L. infantum
and the low cytotoxicity towards murine monocytic cells.
Keywords: Leishmanicidal activity; Leishmania infantum; Amastigotes; Promastigotes;
Cytotoxicity.
1. Introduction
Leishmaniasis comprises a group of diseases caused by several species of
Leishmania and expresses a variety of clinical symptoms. In addition, this group of diseases
is the third largest among infectious diseases transmitted by vectors, behind malaria and
filariasis (Solano-Gallego et al., 2009). This complex disease is endemic in many tropical
and sub-tropical areas of the Old and New World, reaching 88 countries with over 350
million people at risk (WHO, 2005). Leishmaniasis is an infectious disease that affects poor
people living in rural and suburban settings (Alvar et al., 2006). Visceral leishmaniasis
(VL) is the most serious of these diseases because it can be fatal if not treated and is
extremely important in veterinary medicine because dogs are considered the main domestic
reservoir for human infection (Gramiccia and Gradoni, 2005).
In Brazil, the control measures to combat VL employed by health agencies advocate
euthanasia of positively tested dogs as the primary action. However, this measure has not
yielded the expected results, demonstrating the need for new alternatives to help control the
disease. In Europe, the objectives of anti-Leishmania treatment in dogs are typically to
induce a general reduction of the parasite load, to treat organ damage caused by the
parasite, to restore efficient immune responses, to stabilize a drug-induced clinical
54
improvement, and to treat clinical relapse (Oliva et al., 2010). But the drugs currently
available have not proven parasitological cure effective in dogs, and therefore the use of
these drugs is prohibited in Brazil (Brazil, 2008), although this position is not been
accepted by the most veterinary practitioners.
New alternatives of control are used like the anti-sand fly measures with
deltamethrin impregnated collars or permethrin-based spot-on that have higher efficacy
(Maroli et al., 2010). Moreover, the use of plants to obtain new drugs has increased due to
the need to control parasites with multidrug-resistance and to maximize the control of
endemic diseases like VL (Croft and Coombs, 2003; Sharief et al., 2006). The use of
secondary metabolites from certain plants was effective in in vitro studies on different
forms of Leishmania spp., demonstrating the feasibility of obtaining new compounds to
combat this parasite (Chen et al., 1993; Schinor et al., 2007; Soares et al., 2007).
Aloe vera belongs to Liliaceae family and was selected for this study due to the
effectiveness of the leaf extract against Leishmania donovani in vitro and its ability to
reduce more than 90% of the in vivo parasite burden in the spleen, liver, and bone marrow
of Balb/c mice (Dutta et al., 2007, 2008). Ricinus communis L, known as castor bean, is a
Euphorbiaceae that has bioactivity in mammalian cells, including effects as an antioxidant,
anti-inflammatory, antibacterial and antiviral (Beattie et al., 2005; Ghosh, 2005). While the
oil of the Coriandum sativum, the coriander of the family Umbelliferae, show pronounced
antibacterial and antifungal effects (Matasyoh, 2009).
Thus, the objectives of this study were to evaluate the in vitro effect of fractions of
A. vera, C. sativum, and R. communis against promastigotes and amastigotes of L. infantum
and their cytotoxicity on the murine monocytic cells, RAW264.7.
2. Materials and methods
2.1. Obtaining the fractions
The leaves of R. communis were collected on the campus of State University of
Ceará in Fortaleza in northeast Brazil, and the leaves of A. vera and the seeds of C. sativum
were purchased commercially. The samples were dried at room temperature for 7 days to R.
communis and C. sativum and 14 days for A. vera. The leaves were cut and the seeds were
55
crushed in an industrial blender, the material was then immersed in 96% ethanol for a
week. After passing the extracts through a rotary evaporator, they were subjected to liquid
chromatography with silica filtration and repeated washings with hexane, chloroform, ethyl
acetate, and methanol. The solvent of each organic phase was rotary-evaporated to obtain
hexane, chloroform, ethyl acetate, and methanol fractions of each plant (Degani et al.,
1998; Conegero et al., 2003).
2.2. Phytochemical tests
The qualitative phytochemical tests of phenols, tannins, catechins, leuco-
anthocyanidins, flavonoids, steroids, terpenes, quinones, saponins, and alkaloids were
performed according to Matos (2009) and Siddiqui et al. (2009). These tests are based on
the visual observation of the colorimetric changes or the precipitate formation after an
addition of specific reagents.
2.3. Cultivation of L. infantum
Promastigotes of L. infantum strain MHOM46/LC/HZ1 were grown in M199
(Cultilab®
) plus 10% fetal calf serum (FCS) (Cultilab®), HEPES (Sigma-Aldrich
®), bovine
Hemin (Inlab®), sodium bicarbonate (Sigma-Aldrich
®), gentamicin (40 mg/mL) (Inlab
®),
and 5% human male sterile urine. Cultures were maintained in a BOD incubator at 23.6 °C
and peal was done every three or four days.
Amastigotes were cultured with murine monocyte RAW 264.7 cells in 96-wells
microplates. Murine monocyte RAW 264.7 cells were counted in a Neubauer chamber and
the concentration used was 1x104 cells/well. The promastigotes were added at a ratio of
10:1 parasites to cell. These cells were cultured in Dulbecco's (Cultilab®) plus 5% fetal
bovine serum, sodium bicarbonate, and gentamicin (Inlab®) at a concentration of 40
mg/mL. The bottles were kept ajar for cultivation under glass with 5% CO2 at 36.6 °C.
2.4. Tests on promastigotes of L. infantum
Promastigotes were counted in a Neubauer chamber and the concentration used was
1x105 promastigotes/well. The fractions of each plant were dissolved in milli Q water, and
56
they were evaluated at 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 μg/mL according to Tempone et al.
(2005). After 24 h incubation of parasites with the fractions, a MTT test was performed to
determine the IC50 of each plant fraction on the promastigotes. The positive control was 40
μg/mL pentamidine and the negative control was M199 media only (Cultilab®). All
fractions were tested in triplicate. The results were read with a Multiskan MS
(UNISCIENCE®
) microplate reader at a wavelength of 570nm.
2.5. Tests on amastigotes of L. infantum
The fractions of plants were dissolved in milli Q water, and they were used at
concentrations of 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µg/mL was added to microplates containing
the confluent layer of cells with amastigotes. The in situ immunoassay to determine the
IC50 was performed by ELISA according to Piazza et al. (1994). Before starting the tests,
the infected cells were stained and parasites observed under a microscope. When we
observed more than 50% of infected cells in a microscopic field, the parasite load was
considered appropriate to perform the test. Briefly, after 24 h incubation with the plant
fractions, the microplate wells were incubated with 0.01% saponin (Sigma-Aldrich®
) in 1x
PBS plus 1% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich®) for 30 minutes at 37 °C. The
blocking reaction was done with 1x PBS plus 5% skimmed milk (Nestle®) for 30 minutes at
37 °C. The microplates were washed and dried three times, then we added the serum from
immunized rabbits diluted 1:500 in 1 x PBS followed by 3% skimmed milk in 0.05%
Tween 20 (PBSLT) plus 10% FCS, and kept the plates at 37 °C overnight. The conjugated
anti-rabbit IgG (Sigma-Aldrich®) was diluted 1:10,000 in PBSLT and after further washing,
orthophenylenediamine chromogen (OPD) (Sigma-Aldrich®) was added. In order to stop
the reaction 4N chloric acid (Novaquímica®
) was added, and the reading was performed
using a 492 nm filter in a microplate reader. The positive control for this assay was 40
µg/mL amphotericin B (Sigma-Aldrich®) and the negative control was the Dulbecco
medium alone (Cultilab®). The rabbits were immunized against promastigotes of
Leishmania infantum. The serum was obtained 30 days after the immunization.
57
2.6. Cytotoxicity test
Monocytic lineage cells from murine RAW 264.7 were grown in 96-well
microplates, 100 g/ mL of plant fractions were added. Subsequent testing was performed
in situ by ELISA using the methodology of Piazza et al. (1994). The positive control in this
step was 40 µg/mL amphotericin B (Sigma-Aldrich®) and the negative control was
Dulbecco medium (Cultilab ®). The reading was performed using a 492 nm filter in a
microplate reader.
2.7. Statistical Analysis
IC50 values (drug concentration able to inhibit 50% of parasites) in the range of
95% (Confidence interval of 95%) were calculated using a nonlinear regression curve. One-
way ANOVA and comparative analysis between treatments was performed by Tukey's
parametric test using and 100% survival was based on the OD of the viability control
containing only promastigotes or amastigotes, and/or murine monocytic cells after
normalization using the statistical software GraphPad Prism 5.0.
3. Results
IC50 values of ethyl acetate, chloroform, and methanol fractions of Aloe vera,
Coriandrum sativum, and Ricinus communis on promastigotes and amastigotes of L.
infantum were summarized on Table 1. Besides, the drug reference used in the in vitro tests
on promastigotes was pentamidine and on amastigotes was amphotericin B. Briefly, all
fractions were effective against L. infantum promastigotes and did not differ from the
positive control pentamidine (p>0.05). However, the R. communis ethyl acetate and
chloroform fractions, as well as the C. sativum methanol fraction, were the most effective
against amastigotes and did not differ from the positive control amphotericin B (p>0.05).
58
Table 1: IC50 values of ethyl acetate, chloroform, and methanol fractions of Aloe vera,
Coriandrum sativum, and Ricinus communis on promastigotes and amastigotes of
Leishmania infantum.
Fractions of
Plants
Promastigotes
IC50 (µg/mL) CI95%
Amastigotes
IC50 (µg/mL) CI95%
Ethyl acetate
A. vera 1.49a 0.51 – 4.31 1,038
cd 96.49 – 11,175
C. sativum 7.10ab
1.26 – 39.97 27,334d 10,340 – 72,290
R. communis 3.45ab
0.88 – 13.50 17.28ab
15.16 – 19.69
Chloroform
A. vera 26.20ab
11.11 – 61.78 96.59c 65.93 – 141.50
C. sativum 33.21ab
8.55 – 128.90 34.20b 29.33 – 39.87
R. communis 2.85ab
0.42 – 19.49 17.32abc
1.93 – 155.20
Methanol
A. vera 1.54ab
6.11 – 30.01 79.82c 56.93 – 111.90
C. sativum 3.18ab
0.70 – 14.39 0.57a 0.02 – 17.56
R. communis 11.12ab
1.14 – 108.40 146.60c 82.71 – 259.80
Positive
Control
Pentamidine 0.17 – 23.11ab
0.07 – 58.14 - -
Amphotericin B - - 0.08 – 51.87abc
0.01 – 263.40
Equal letter in same column has not statistical difference on positive control (p>0.05)
The cytotoxicity test on murine RAW 264.7 cells demonstrated that 100 µg/mL of
the ethyl acetate fraction from R. communis was the least toxic, resulting in 83.5% cell
viability and was not different from the positive control amphotericin B that demonstrated
90% viability (Fig. 1).
59
Co
ntr
ole
Neg
ati
vo
An
ph
ote
ricin
(C
+)
A.
vera
fr.
ac.
eti
la
A.
vera
fr.
clo
rof.
A.
vera
fr.
meta
no
l
C.s
ati
vu
m f
r. a
c.
eti
la
C.s
ati
vu
m f
r. c
loro
f.
C.s
ati
vu
m f
r. m
eta
no
l.
R.
co
mm
un
is f
r. a
c.
eti
la
R.c
om
mu
nis
fr.
clo
rof.
R.
co
mm
un
is f
r. m
eta
no
l.
0
20
40
60
80
100Amphotericin B (C+)
A. vera ethyl acetate fraction (1)
A. vera chloroform fraction. (2)
A. vera methanol fraction (3)
C.sativum ethyl acetate fraction (4)
C.sativum chloroform fraction (5)
C.sativum methanol fraction (6)
R. communis ethyl acetate fraction (7)
R.communis chloroform fraction(8)
R. communis methanol fraction (9)
Control Negative (C-)
Percen
tag
e o
f v
iab
le c
ell
s R
AW
26
4.7
The phytochemical tests showed the presence of various metabolites in the different
plant fractions and these are summarized in Table 2.
C- C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figure 1. Viability of RAW 264.7 cells treated with100 g/mL with
either the ethyl acetate, chloroform, or methanol fractions of Aloe
vera, Coriandrum sativum, and Ricinus communis compared to
positive (40µg/mL amphotericin B) and negative controls (Dulbecco
medium).
* p<0.05
90%
100%
83.5%
*
44.6%
*
35%
*
37.9% *
27.9%
*
47.1%
*
35.5%
*
52.1%
*
61.2%
60
Table 2: Chemical compounds of each fraction identified by phytochemical tests according
to Matos (2009) and Siddiqui et al. (2009).
Fraction Tannins Flavonoids Steroids Terpenoids Alkaloids Saponins Quinones
Ethyl Acetate
A. vera - X X - - - X
C. sativum X - - - - - -
R. communis X - X - X - -
Chloroform
A. vera X X X - X - X
C. sativum - X - X X - -
R. communis - - X - - - -
Methanol
A. vera X X - - X - X
C. sativum X X X - X - -
R. communis X X X - X X -
4. Discussion
The effectiveness of these plants is probably due to the secondary metabolites
present in the plant fractions. The compounds identified by the phytochemical tests have
been evaluated in different species of Leishmania. For instance, naphthylisoquinoline
alkaloids reduced the growth of L. major promastigotes and the infection rate of
macrophages. These effects were not associated with the production of nitric oxide (NO) or
the secretion of cytokines by macrophages, and were probably due to direct action on the
parasite (Ponte-Sucre et al., 2007).
Some terpenoids have also demonstrated leishmanicidal action, such as citral
61
derived from the essential oil of Cymbopogon citratus, which had a significant effect on L.
amazonensis, reducing the survival of promastigotes by 100%. Apparently the citral acts on
the division cycle of the parasite (Santin et al., 2009). Linalool, another terpenoid found in
C. sativum fruit, stimulates the production of reactive oxygen species such as NO by
inhibiting the activity of the mitochondrial respiratory chain and decreasing levels of ATP
and glutathione in cells (Usta et al., 2009). This finding reinforces the theory of indirect
action of linalool, favoring NO production by macrophages in an attempt to eradicate the
intracellular parasite. Other terpenoids and flavonoids obtained from Chresta scapigera
were active against amastigotes of L. amazonensis, inhibiting the replication of the parasites
(Schinor et al., 2007).
The flavonoid quercetin isolated from leaves of R. communis and fruits of C.
sativum (Rodrigues et al., 2002; Ali et al., 2008) interferes with the iron metabolism in L.
donovani, reducing splenic burden in golden hamsters by 75 to 95% (Sen et al., 2008).
Therefore, the inhibitory effect on promastigotes and amastigotes observed in fractions of
C. sativum and R. communis may be due to the presence of terpenoids and flavonoids,
suggesting the action on NO production of macrophages and/or iron dependent enzymes.
Anthraquinones are secondary metabolites belonging to the group of quinones and
are found abundantly in the plants of the genus Aloe. The mechanism of action of
anthraquinones is to inhibit the synthesis of nucleic acids and therefore inhibit the
formation of proteins in bacteria (Levin et al., 1988). Thus, the effect observed in L.
infantum promastigotes may have been due to the inhibition of protein synthesis by
quinones present in the A. vera fractions studied, but the low efficiency on amastigotes and
its high toxicity preclude its use in in vivo testing.
The saponins are steroid substances with various biological activities. It is believed
saponins increase the membrane permeability of the parasite causing their lysis, and this is
likely the effect of the R. communis ethyl acetate and chloroform fractions on L. infantum.
This activity can be explained by the affinity of this metabolite for cholesterol present in
the cell membrane, forming insoluble complexes (Francis et al., 2002).
Phytosterols are a group of steroid alcohols naturally occurring in plants. β-
sitosterol and stigmasterol were identified and although there are no studies that report
62
leishmanicidal action, the antimicrobial, anti-inflammatory (Nishioka et al., 2002), anti-
carcinogenic (Awad and Fink, 2002), and cholesterol-lowering (Law, 2000) activities of
these phytosterols have been demonstrated. Bouic and Lamprecht (1999) reported β-
sitosterol increased the activity of T-lymphocytes and natural killer cells. Nishioka et al.
(2002) reported that the antimicrobial and anti-inflammatory actions of Mallotus peltatus
were due to a combination of several substances, among them β-sitosterol. The same anti-
inflammatory effects of β-sitosterol and stigmasterol isolated from the leaves of Croton
pullei were observed by Rocha et al. (2008), although the mechanisms responsible for these
effects are not yet fully understood.
Among the nine fractions tested, the ethyl acetate fraction of R. communis showed
the best results. This fraction was highly efficacious against L. infantum promastigotes and
amastigotes while having low cytotoxicity on RAW 264.7 monocytic cells. The presence of
flavonoids, alkaloids, saponins, and phytosterols suggests the action is due to iron-
dependent enzymes and membrane lysis of the parasite, but more studies are needed to
determine the most prevalent metabolite and whether its action is independent or
synergistic.
5. Acknowledgements
We would like to thank from FUNCAP for financial support. Dr. Bevilaqua has a
grant from CNPq.
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66
7 CAPÍTULO 2
Eficácia in vitro de Coriandrum sativum, Lippia sidoides e Copaifera reticulata sobre
Leishmania chagasi
(Efficacy of Coriandrum sativum, Lippia sidoides and Copaifera reticulata against
Leishmania chagasi in vitro)
Periódico: Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária (Qualis B3). Submetido em
11 de Abril de 2011.
67
RESUMO
O aumento na incidência da Leishmaníase Visceral (LV) no Brasil deve-se à ineficácia das
medidas de controle da doença. Além disso, não há tratamento efetivo para LV canina, o
objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos óleos essenciais de Coriandrum sativum e de
Lippia sidoides e do óleo-resina de Copaifera reticulata sobre promastigotas e amastigotas
de Leishmania chagasi e analisar o grau de toxicidade sobre células monocíticas murinas
RAW 264.7. Para determinar a CI50 sobre promastigotas foi usado teste MTT e sobre
amastigotas foi realizado imunoensaio in situ pela técnica de ELISA. Os resultados obtidos
comprovaram que o óleo-resina de C. reticulata foi o mais eficaz contra as formas
promastigotas (CI50 de 7,88µg/mL) e amastigotas (CI50 de 0,52µg/mL) e em nenhum dos
dois testes diferiu do controle pentamidina que obteve CI50 de 0,17-23,11µg/mL, no teste
sobre promastigotas, e anfotericina B que obteve CI50 de 0,08-51,87µg/mL nos testes com
amastigotas (p>0.05). Quanto à citotoxicidade, apenas o óleo-resina de C. reticulata não
apresentou toxicidade, com 78,45% de monócitos viáveis. Os resultados obtidos sobre
promastigotas e amastigotas e a ausência de citotoxicidade do óleo-resina de C. reticulata
evidenciam que este óleo-resina pode ser viável para a análise de seus efeitos terapêuticos
em testes in vivo.
Palavras-chave: Plantas leishmanicidas, óleos, citotoxicidade, amastigotas e promastigotas
68
Efficacy in vitro of Coriandrum sativum, Lippia sidoides and Copaifera reticulata
against Leishmania chagasi
Eficácia in vitro de Coriandrum sativum, Lippia sidoides e Copaifera reticulata sobre
Leishmania chagasi
Fernanda Cristina Macedo Rondon
1, Claudia Maria Leal Bevilaqua
1*, Marina Parissi
Accioly1; Selene Maia de Morais
2, Heitor Franco de Andrade-Júnior
3, Camila Aparecida de
Carvalho3, Josemar Coelho Lima
4, Hilton César Rodrigues Magalhães
4
1Laboratório de Doenças Parasitárias, Universidade Estadual do Ceará – UECE
2Laboratório de Química de Produtos Naturais, Universidade Estadual do Ceará – UECE
3Laboratório de Protozoologia, Universidade de São Paulo – USP
4Laboratório de Análise de Alimentos, Embrapa Agroindústria Tropical
*Corresponding author:
Claudia Maria Leal Bevilaqua
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Laboratório de Doenças Parasitárias, Programa de Pos-graduação em Ciencias Veterinarias
da Faculdade de Veterinaria da Universidade Estadual do Ceará
Av. Dedé Brasil, 1700, CEP 60.714-903, Fortaleza, Ceará, Brasil;
Tel. 55.85.31019853 Fax 55.85.31019840
E-mail: [email protected]
Dr. Bevilaqua, Dr. Morais and Dr. Andrade-Junior are CNPq researchers.
Abstract
The increased incidence of visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is due to a lack of effective
disease control measures. In light of the fact that no effective treatment exists for canine
VL, the objective of this study was to evaluate the effect of the essential oils of Coriandrum
sativum and Lippia sidoides, and oleoresin from Copaifera reticulata, on Leishmania
69
chagasi promastigotes and amastigotes. We also examined the toxicity of these treatments
on the murine monocyte cell line RAW 264.7. To determine the IC50 of each oil, an MTT
test was performed on promastigotes, and an in situ ELISA assay was conducted on
amastigotes. Here, were demonstrated that oleoresin from C. reticulata was effective
against both promastigotes (IC50 of 7.88 µg/mL) and amastigotes (IC50 of 0.52 µg/mL),
and neither of the two treatments differed significantly (p>0.05) from pentamidine (IC50 of
0.17 – 23.11 µg/mL) and amphotericin B (IC50 of 0.08 – 51.87 µg/mL). Of the three plant
oils tested, only oleoresin showed no toxicity toward monocyte, with 78.45% viability after
treatment. Inhibition of promastigote and amastigote growth and the lack of cytotoxicity by
C. reticulata demonstrated that oleoresin may be a viable option for analyzing the
therapeutic effects of leishmanicidal plants in vivo.
Keywords: Leishmanicidal plants, oils, cytotoxicity, amastigotes and promastigotes
Introduction
The World Health Organization (WHO) considers visceral leishmaniasis (VL) to be
a major tropical zoonotic disease (MISHRA et al., 2009). VL, which continues to resist
modern control efforts, is most common in northeastern Asia, eastern Africa and
northeastern Brazil, but cases also occur in southern Europe and elsewhere. Each year,
there are approximately 500,000 new cases and more than 50,000 deaths worldwide;
however, because leishmaniasis is not a commonly reported disease in many countries,
these values are probably underestimated (WHO, 2010). In Brazil, this disease has
expanded throughout the canine and human populations in various regions (RONDON et
al., 2008; BRASIL, 2009). In addition, infected dogs have been associated with all human
disease outbreaks, representing the main link in the chain of transmission, and, despite
the existence of other Leishmania reservoirs, such as horses and cats, dogs are the only
confirmed domestic reservoir (GRAMICCIA; GRADONI, 2005).
Until now, canine visceral leishmaniasis (CVL) has proven to be resistant to
available synthetic antiparasitic drugs, thus reinforcing the need for alternatives in disease
control. CVL therapies aim to reduce the parasite load, minimize organ damage by the
parasites, and redirect the immune response to improve animal health and prevent relapse
70
(OLIVA et al., 2010).
Alternative methods of parasite control, including deltamethrin-impregnated collars
or spot-on permethrin-based topical insecticides, are being employed in an attempt to block
transmission (MAROLI et al., 2010). Furthermore, the use of plants for new medicines has
increased, both to combat multidrug-resistant parasites and to maximize disease control
(CROFT; COOMBS, 2003; SHARIEF et al., 2006).
Essential oils are natural products of great medical importance because they already
possess proven antifungal, antimicrobial, and antileishmanial activities (LEAL-
CARDOSO, 2000; ANTHONY et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2009). The objective of this
study was to evaluate the effect of the essentials oils of Coriandrum sativum and Lippia
sidoides and oleoresin from Copaifera reticulata on L. chagasi promastigotes and
amastigotes, as well as their cytotoxicities in the murine monocyte cell line RAW 264.7.
Materials and Methods
Extraction of essential oils and oleoresins
The essential oil of L. sidoides (alecrim-pimenta; family: Verbenaceae) was
purchased from PRONAT (Produtos Naturais LTDA). C. reticulata (copaiba balsam;
family: Fabaceae) oleoresin was purchased at a street fair in the state of Para, Brazil. C.
sativum (coriander; family: Umbelliferae) seeds were dried for one week, and the essential
oil was extracted by steam distillation.
Phytochemical tests
Qualitative phytochemical tests of phenols, tannins, catechins, leucoanthocyanidins,
flavonoids, steroids, terpenes, alkaloids, and saponins were performed according to Matos
(2009) and Siddiqui et al. (2009). These tests are based on the visual observation of
colorimetric changes or on the formation of a precipitate after the addition of specific
reagents.
71
Chemical analysis
The oils were chemically analyzed at the Laboratório de Análise de Alimentos,
EMBRAPA/Agroindústria using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) on a
5971 GC/MS (Hewlett–Packard®) at a temperature of 270 °C. Constituent molecules were
identified by their retention indices and mass spectra compared to a database of known
chemical signatures (ALENCAR et al., 1984; ADAMS, 1989).
Cultivation of Leishmania chagasi
Promastigotes of L. chagasi strain MHOM46/LC/HZ1 were grown in M199
(Cultilab®
) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (Cultilab®), HEPES (Sigma–
Aldrich®), bovine hemin (Inlab
®), sodium bicarbonate (Sigma–Aldrich
®), gentamicin (40
mg/mL) (Inlab®), and 5% human male sterile urine. Cultures were maintained in a BOD
incubator at 23.6 °C, and were passaged every three to four days.
Amastigotes were cultured with the murine monocyte cell line RAW 264.7 in 96-
well microplates. Cells were counted in a Neubauer chamber and plated at a density of
1x104 cells/well. Promastigotes were added at a ratio 10:1 parasites to cell. Cells were
cultured in Dulbecco’s medium (Cultilab®) with 5% FCS, sodium bicarbonate, and 40
mg/mL gentamicin. Bottles were kept ajar and cultivated under glass with 5% CO2 at
36.6°C.
Assays on L. chagasi promastigotes
Promastigotes were counted in a Neubauer chamber and used at a concentration of
1x105 promastigotes/well. The oils of each plant were dissolved in milli-Q water, and were
evaluated at 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µg/mL, according to Tempone et al. (2005). After a
24-h incubation with the relevant compound, a tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay
(bromide 3-4.5-dimethylthiazol-2-yl- 2.5-dephenyltetrazolium) was performed on
promastigotes to determine viability, and the IC50 of each treatment was calculated. The
positive control for this assay was pentamidine, and the negative control was M199
medium. All oils were assayed in triplicate. The MTT assay was analyzed on a Multiskan
MS (UNISCIENCE®) microplate reader at a wavelength of 570 nm.
72
Assays on L. chagasi amastigotes
Plant oils were diluted in milli-Q water to 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 µg/mL and
then added to microplates containing a confluent layer of cells and amastigotes. An in situ
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the IC50 was performed
according to the method of Piazza et al. (1994). Prior to treatment, infected cells were
stained, and parasites were observed by microscopy. Experiments were performed on cells
exhibiting greater than 50% infection in a given microscope field. Briefly, after a 24 h
incubation with the indicated plant oil, a solution of 0.01% saponin (Sigma–Aldrich®) and
1% bovine serum albumin (BSA; Sigma–Aldrich®) in 1X phosphate-buffered saline (PBS)
was added to each well, and plates were incubated for 30 min at 37 °C. Wells were
subsequently blocked with 5% nonfat dry milk (Nestle®) in PBS for 30 min at 37 °C.
Microplates were washed and dried three times and then anti-L. chagasi serum, diluted
1:500 in 1X PBS containing 3% milk, 0.05% Tween 20 (PBSLT) and 10% FCS, was
added, and plates were incubated at 37°C overnight. Horseradish peroxidase-conjugated
anti-rabbit IgG (Sigma–Aldrich®) was diluted 1:10,000 in PBSLT and, after further
washing, ortho-phenylenediamine chromogen (OPD) (Sigma–Aldrich®) was added. To stop
the reaction, 4 N chloric acid (Novaquímica®
) was added, and plates were read on a
microplate reader using a 492-nm filter. The positive control for this assay was 40 µg/mL
amphotericin B (Sigma–Aldrich®), and the negative control was Dulbecco medium alone.
To generate anti-L. chagasi antibodies, rabbits were immunized with promastigotes, and
serum was obtained 30 days after immunization.
Cytotoxicity assay
RAW 264.7 cells were grown in 96-well microplates and treated with 100 µg/mL of
plant oils. Subsequent testing was performed in situ by ELISA, as described above. The
positive control in this step was 40 µg/mL amphotericin B (Sigma–Aldrich®), and the
negative control was Dulbecco medium. Readings were performed using a 492-nm filter in
a microplate reader.
Statistical analysis
73
The drug concentrations that achieved a 50% inhibition in the growth of parasites
(IC50) were calculated using a nonlinear regression curve, with a 95% confidence interval.
One–way ANOVA and comparative analysis between treatments was performed on
normalized values with Tukey’s parametric test with the statistical software GraphPad
Prism 5.0. For normalization, 100% survival was computed as the OD of the control
containing only promastigotes or amastigotes, and/or cells alone.
Results
When applied to promastigotes, L. sidoides essential oil exhibited an IC50 of 19.76
µg/mL (95% CI, 11.00 – 38.98) with an effectiveness value of 56.3%, and C. reticulata
oleoresin exhibited an IC50 of 7.88 µg/mL (95% CI, 1.52 – 40.86) with an effectiveness
value of 60.2%. These results confirmed that both oils were most efficient on L. chagasi
promastigotes and did not differ significantly from pentamidine, which had an IC50
ranging from 0.17 to 23.11 µg/mL (95% CI, 0.07 – 58.14). The essential oil of C. sativum
was the least effective on promastigotes (27.5% effectiveness), with an IC50 of 181.00
µg/mL (95% CI, of 57.53 – 269.60).
Treatment of amastigotes with essential oils generated IC50 values of 5.07 µg/mL
(95% CI, 0.47 – 54.33) for L. sidoides, 1.51 µg/mL (95% CI, 0.06 – 37.64) for C. sativum,
and 0.52 µg/mL (95% CI, 0.05 – 5.39) for C. reticulata oleoresin. These results did not
differ significantly from amphotericin B, which had an IC50 ranging from 0.08 to 51.87
(95% CI, 0.01 – 163.40). The most potent extract against amastigotes was C. reticulata
with 91.4% effectiveness, followed by L. sidoides with 73.4% effectiveness; the least
efficient was the essential oil of C. sativum with 68.8% effectiveness. These values did not
differ significantly from amphotericin B, which demonstrated 90.9% effectiveness
(p>0.05).
The oleoresin from C. reticulata was not toxic to RAW 264.7 cells; the cells
displayed 78.45% cell viability, which did not differ significantly from positive and
negative controls (p>0.05). In contrast, the other oils demonstrated some toxicity; 49.9%
viability was observed in cells treated with C. sativum, and 57.8% viability was observed in
74
cells treated with L. sidoides. These results were significantly different from the positive
control (p<0.05) (Figure 1).
Figure 1. Effect of C. sativum and L. sidoides essentials oils, and C. reticulata oleoresin at a
concentration of 100 µg/mL, on the viability of the murine monocyte cell line, RAW 264.7.
Amphotericin B (40 µg/mL) was used as a reference, and Dulbecco medium served as the
negative control. * p<0.05.
Phytochemical analysis revealed the presence of terpenoids in the extracted oils.
Further characterization determined that the principal constituents of L. sidoides essential
oil, C. sativum essential oil and C. reticulata oleoresin were thymol, β-linalool and β-
caryophyllene, respectively (Table 1).
C- C+ 1 2 3 0
20
40
60
80
100
C- (only Medium Dulbecco) C+ (Amphotericin B) Essential Oil of C. sativum (1)
Essential oil of L. sidoides (2)
Resin-oil of C. reticulata (3)
100%
90.03%
* 49.9%
* 57.8%
78.45%
Per
cen
tag
e o
f m
uri
ne
mo
no
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s R
AW
26
4.7
cel
ls v
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via
ble
75
Table 1: Relative percent composition of Coriandrum sativum and Lippia sidoides essential
oils, and Copaifera reticulata oleoresin.
Plants Constituents Percentage
%
β-Caryophyllene 43.18
Copaifera reticulata α-Bergamotene 8.76
Copaene 8.69
β-linalool 73.21
Coriandrum sativum Camphor 4.25
α-Pinene 4.20
Thymol 59.65
Lippia sidoides β-Caryophyllene 10.60
Cymene 9.08
Discussion
A study among eight plant species of the genus Copaifera (C. multijuga, C.
officinalis, C. reticulata, C. lucens, C. langsdorffii, C. paupera, C. martii, and C.
cearensis), related that C. reticulata demonstrated the greatest efficacy against Leishmania
amazonensis, with IC50 values of 5 µg/mL on promastigotes and 20 µg/mL on amastigotes.
This oil also exhibited a low level of toxicity toward the murine macrophage cell line
J774G8 (SANTOS et al., 2008). The results obtained here were similar, with C. reticulata
oleoresin proving to be even more effective against L. chagasi promastigotes (IC50 of 0.52
µg/mL). The differing IC50 values obtained with C. reticulata oleoresin on amastigotes of
L. amazonensis and L. chagasi can be explained by differences in the expression of
membrane proteases, such as gp63 and gp42, and other ligands, such as lipophosphoglycan,
because these molecules directly regulates parasite virulence (BURNS et al., 1993; CHEN
et al., 2000; YAO et al., 2002).
76
Oliveira et al. (2009) had previously investigated the activity of essential oils from
Cymbopogon citratus, L. sidoides and Ocimum gratissimum against promastigotes of L.
chagasi. In this study, the most effective compound was C. citratus, with an IC50 of 45
µg/mL, followed by the oil of O. gratissimum, with an IC50 of 75 µg/mL; the least
effective essential oil was L. sidoides, with an IC50 of 89 µg/mL. Another study performed
on promastigotes and amastigotes of L. chagasi reported that essential oils from plants of
the genus Lippia were effective in inhibiting promastigote infection, with IC50 values of
4.4 μg/mL for L. origanoides, 5.2 μg/mL for L. citriodora, 18.9 μg/mL for L. alba, and
51.8 μg/mL for L. micromera. No oil had demonstrated inhibition of intracellular
amastigotes in the human monocyte line THP-1 (ESCOBAR et al., 2010). In contrast, in
the present work, L. sidoides oil exhibited the greatest activity against both promastigotes
and amastigotes of L. chagasi. The difference between the IC50 values may be due to the
composition of the oils, which is highly variable, depending on the soil where the plant was
grown, the time of collection, environmental factors and other effects (MARTINS et al.,
2006; NOGUEIRA et al., 2007).
The main constituents of C. sativum, L. sidoides and C. reticulata oils were the
monoterpenes β-linalool and thymol, and the sesquiterpene β-caryophyllene, respectively.
Similar findings were obtained by Ghannadi e Sadeh (1999) for C. sativum, Camurça-
Vasconcelos et al. (2007) for L. sidoides and Santos et al. (2008) for C. reticulata.
The mechanism of action of linalool found in the fruit of C. sativum is to stimulate
the production of reactive oxygen species, such as nitric oxide (NO), to inhibit the activity
of mitochondrial respiratory chain and to decrease levels of ATP and glutathione in the
cells (USTA et al., 2009). It reinforces the model that linalool acts indirectly to favor NO
production by macrophages to eradicate the infection with Leishmania spp.
Thymol, a terpenoid, causes structural and functional damage to the cell membrane
and acts directly on the synthesis and activity of ATPase and on the concentration of
potassium and phosphate ions in the parasite. These activities have been characterized in
bacteria, and this is the likely mechanism of action against Leishmania its possible
(LAMBERT et al., 2001; OSORIO et al., 2006). Synthetic thymol compounds exhibited an
IC50 of 194.3 μg/mL against promastigotes of Leishmania panamensis (ROBLEDO et al.,
77
2005). In another study, a thymol-rich L. sidoides essential oil showed an IC50 of 89
μg/mL against L. chagasi (OLIVEIRA et al., 2009). The essential oil of L. citriodora,
which is also rich in thymol, demonstrated an IC50 of 4.4 μg/mL on L. chagasi
promastigotes (ESCOBAR et al., 2010). In this report, the essential oil of L. sidoides
proved to be rich in thymol and yielded an IC50 of 19.76 μg/mL on promastigotes of the
same species. Synthetic thymol exhibited higher IC50 values than the essential oils, which
are composed of natural thymol and other substances. Thus, the more effective action of
the oils may be due to the synergistic effect of other compounds, such as caryophyllene and
cymene, or perhaps thymol is not as potent against L. panamensis compared to L. chagasi.
While the mechanism of action of β-caryophyllene is not well understood, it is
effective against L. amazonensis (SANTOS et al., 2008) and exhibits anti-inflammatory
(SHIMIZU et al., 1990), antimicrobial and antioxidant properties (SAHIN et al., 2004).
Investigations using natural products have shown great potential in finding new
agents to fight tropical diseases, and the results here demonstrate that C. reticulata
oleoresin is highly effective against promastigotes and amastigotes of L. chagasi, while
exhibiting no toxicity toward the RAW 264.7 cell line. While further research is needed to
prove its efficacy in vivo, C. reticulata oleoresin may be a promising new treatment for
visceral leishmaniasis caused by L. chagasi.
Acknowledgements
We would like to thank FUNCAP for financial support. Dr. Bevilaqua, Dr. Morais
and Dr. Andrade-Junior have a grant from CNPq.
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81
8 CAPÍTULO 3
Eficácia do óleo-resina de Copaifera reticulata em hamsters dourados (Mesocricetus
auratus) infectados experimentalmente por Leishmania chagasi
(Efficacy of Copaifera reticulata oleoresin in golden hamsters (Mesocricetus auratus)
experimentally infected by Leishmania chagasi)
Periódico Veterinary Parasitology (Qualis A2).
82
ABSTRACT
Natural products appear as a viable alternative against Visceral Leishmaniasis (VL)
because there is no proven parasitological cure by synthetic therapy. This study evaluated
the effectiveness of the oleoresin of Copaifera reticulata in Golden hamsters
experimentally infected by Leishmania chagasi. All experiment lasted for ninety days, but
the treatment only lasted for thirty days. The test groups used 50 and 100mg/kg IP of
oleoresin from C. reticulata and positive control 20mg Sbv/kg IP de meglumine
antimoniate (Glucantime®). In D30, D45 and D90 after the animal’s euthanasia, samples of
liver and spleen were collected for histopathology and imprints from organs to determine
the parasite burden per gram of organ. The animals euthanized in D45 with the higher dose
of the oeloresin of C. reticulata showed 80.2% reduction in liver’s parasite load and this
result did not differ statistically (P>0.05) from control positive drug, 92.2%. At the same
time, the spleen reduction parasite load was 49.5% and differed statistically (P<0.05) from
reference drug 91.7%. In the D90 the efficacy with the higher dose (100mg/kg) was 74.7%
in spleen samples and 72.7% in liver samples, however these results differed of control
positive that obtained efficacy of 97.4% and 96% in spleen and liver samples (P<0.05).
Histopathologic findings in the liver and spleen of hamsters that were treated showed
compatibility with the histological aspects of infection by viscerotropic Leishmania.
Therefore, the oleoresin of C. reticulata can be an alternative for the treatment of the VL, it
showed efficacy equivalente to the reference drug for the treatment of liver samples and the
histological findings suggest immune response stimulation. However, futher studies are
needed to determine the mechanism of action of this oleoresin against the protozoan L.
chagasi.
Keywords: Oleoresin. Alternative treatment. Experimental infection. Hamster. Leishmania
chagasi.
83
Eficácia do óleo-resina de Copaifera reticulata em hamsters dourados (Mesocricetus
auratus) infectados experimentalmente por Leishmania chagasi
Fernanda C. M. Rondon1, Claudia M. L. Bevilaqua
1*, Daniel A. Viana
2, Selene M. de
Morais1, Eudson M. Queiroz-Júnior
1, Ana Caroline M. Rodrigues
1, Juliana C. Ribeiro
1,
João B. Silva Júnior1, Rafaele A. Sampaio
1
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará,
Brasil; 2
Rede Nordeste de Biotecnologia, Universidade Estadual do Ceará
*Autor para Correspondência
Av. Dedé Brasil, 1700, 60714-903 Fortaleza, Ceará, Brazil.
Tel.: +558531019853; fax:+558531019840.
E-mail: [email protected],
Resumo
Os produtos naturais surgem como alternativa viável contra leishmaníase visceral (LV)
porque não há cura parasitológica comprovada pela terapia sintética. Este trabalho avaliou a
eficácia do óleo-resina de Copaifera reticulata em hamsters dourados infectados
experimentalmente por Leishmania chagasi. Todo o experimento durou 90 dias, mas o
tratamento ocorreu durante 30 dias. Os grupos testes usaram 50 e 100mg/kg IP de óleo-
resina de C. reticulata e controle positivo 20mg Sbv/kg IP de antimoniato de meglumina
(Glucantime®
). No D30, D45 e D90 após eutanásia dos animais foram coletadas amostras
hepáticas e esplênicas para histopatologia e imprints dos órgãos para determinação da
parasitemia. Os animais eutanasiados no D45 com a maior dose do óleo-resina de C.
reticulata demonstraram redução de 80,2% na carga parasitária hepática e este resultado
não diferiu (P>0,05) da droga de referência, 92,2%. No mesmo momento a redução do
parasitismo esplênico foi de 49,5% e diferiu estatisticamente (P<0,05) da droga de
referência que obteve 91,7%. No D90 a eficácia com 100mg/kg foi de 74,7% nas amostras
do baço e 72,7% no fígado, contudo estes resultados diferiram do controle positivo com
84
eficácia de 97,4% no baço e 96% no fígado (P<0.05). Os achados histopatológicos no
fígado e baço dos hamsters tratados foram compatíveis com os aspectos histológicos de
infecção por Leishmania viscerotrópica. Portanto, o óleo-resina de C. reticulata pode ser
uma alternativa para o tratamento da LV, pois apresentou eficácia equivalente a droga
padrão em amostras hepáticas durante o tratamento e os achados histológicos sugerem um
efeito imunoestimulante. Contudo, novos estudos são necessários para determinar o
mecanismo de ação deste óleo sobre o protozoário L. chagasi.
Palavras-chave: Óleo resina. Tratamento alternativo. Infecção experimental. Hamster.
Leishmania chagasi.
Introdução
A leishmaníase visceral (LV) é uma zoonose de característica crônica e em alguns
casos não-tratados pode ocasionar óbito (Desjeux, 2004). O cão é o único reservatório
doméstico comprovado, sendo, portanto, o elo responsável pela transmissão no ambiente
urbano (Gramiccia e Gradoni, 2005). Uma das medidas de controle preconizadas pelos
órgãos de saúde no Brasil determina que o cão soropositivo deve ser eutanasiado.
Entretanto, esta medida é encarada de forma negativa tanto pelos veterinários, quanto pelos
proprietários dos animais. Além disso, o impacto desta ação não tem demonstrado
resultados favoráveis na redução da incidência da LV humana. Acrescenta-se o fato de que
esta doença encontra-se em plena expansão no território brasileiro (Brasil, 2010a). Na
região Sul do Brasil, antes considerada área indene, em 2009 foram identificados os
primeiros casos autóctones de LV canina e humana (Brasil, 2009; Brasil, 2010b).
Alternativas voltadas para o animal tentam auxiliar o controle desta enfermidade,
como o uso de colares impregnados com deltametrina e permetrina com aplicação de spot
on (Maroli et al., 2010). O tratamento canino com drogas sintéticas também é uma opção,
exceto no Brasil porque esta prática é proibida. Entretanto, esta medida visa minimizar os
efeitos deletérios ocasionados pelo parasito, pois até o momento não há cura parasitológica
comprovada (Oliva et al., 2010). Vários estudos têm sido realizados sobre a eficácia de
plantas contra parasitos do gênero Leishmania (Costa et al., 2006; Brenzan et al., 2007;
85
Sartoreli et al., 2007; Santos et al., 2008). Este fato reforça a afirmativa de que as plantas
fornecem uma ampla fonte de moléculas que apresentam diferentes efeitos na homeostase
humana (Lorenzi e Matos, 2000). Produtos naturais têm sido extensivamente reconhecidos
como fontes de componentes ativos com importantes atividades efetivas na terapêutica
medicinal. Fato este comprovado, pois a maioria das substâncias sintéticas é originária de
produtos naturais (Harvey, 2008). Antes do advento das triagens de alta tecnologia e dos
feitos pós-genômico mais de 80% das drogas sintéticas eram originadas de produtos
naturais (Sneader, 1996). Portanto, deve-se evidenciar o importante papel dos produtos
naturais para a saúde humana e animal.
O gênero Copaifera possui importantes espécimes de plantas medicinais,
principalmente, na região Amazônica. O óleo-resina obtido a partir do tronco destas
árvores é amplamente comercializado em todo o país devido a suas propriedades
antiinflamatória e cicatrizante (Basile et al., 1988; Maciel et al., 2002; Veiga Jr e Pinto,
2002). As atividades anti-Trypanosoma e anti-Leishmania já foram mencionadas em
estudos etnofarmacológicos (Maciel et al., 2002; Veiga Jr e Pinto, 2002). Mais
recentemente, um estudo realizou triagem com oito óleos-resinas de Copaifera spp. e a
espécie C. reticulata demonstrou ter melhor atividade contra as formas promastigotas,
amastigotas axênicas e amastigotas intracelulares de Leishmania amazonensis (Santos et
al., 2008). Outro estudo realizado com C. reticulata evidenciou eficácia contra
promastigotas e amastigotas de Leishmania chagasi. Portanto, o objetivo deste trabalho foi
determinar o efeito do óleo-resina de C. reticulata em hamsters infectados
experimentalmente por L. chagasi (dados não publicados).
Material e Métodos
Comitê de Ética
O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética para uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará registrado sob número 08670094-4 (18/2009).
86
Obtenção e caracterização química do óleo-resina
O óleo-resina de C. reticulata da família Fabaceae foi adquirido comercialmente em
feira-livre no Estado do Pará, Brasil.
A caracterização química foi determinada de forma qualitativa pela análise de
fenóis, taninos, catequinas, flavonóides, alcalóides e terpenóides descrita por Matos (2009)
e Siddiqui, et al. (2009), e quantitativamente pela técnica de cromatografia gasosa acoplada
a espectrometria de massa (CG/EM) para caracterizar a estrutura química de cada
substância presente no óleo (Alencar et al., 1984).
Estudo in vivo
Promastigotas de L. chagasi
As promastigotas de L. chagasi cepa BA-262 foram cultivadas em meio M199
(Cultilab®
) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab®), HEPES (Sigma-
Aldrich®), Hemina bovina (Inlab
®), bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich
®), gentamicina na
concentração de 40mg/mL (Inlab®
) e 5% de urina humana masculina estéril. O cultivo foi
mantido em estufa tipo BOD em temperatura de 23.6 °C. Após sete dias de cultivo as
promastigotas foram coletadas e centrifugadas a 2.000 g por 15 minutos, lavadas com
tampão fosfato salina 1x concentrado (PBS, pH 7,2) e suspensas, novamente, em PBS. Os
parasitos foram então contados em câmara de Neubauer. A suspensão final foi ajustada para
fornecer o número de promastigotas necessário para o inóculo.
Animais e Infecção
Cinqüenta hamsters dourados (Mesocricetus auratus) de ambos os sexos de 6 a 8
semanas de vida, foram mantidos livres de patógenos em gaiolas com acesso livre à ração
pelletizada e água. Os animais foram divididos em cinco grupos com 10 hamsters em cada.
A infecção dos animais foi realizada por via intraperitoneal (IP) com promastigotas de L.
chagasi na concentração de 1x107 parasitos/0,1mL em PBS. Os animais foram
acompanhados por 90 dias (D90) com avaliação clínica onde se observou o aparecimento
de sinais clínicos sugestivos de infecção por L. chagasi, como: perda de peso, apatia,
desidratação e descamação das extremidades (Requena, et al. 2000).
87
Protocolo Terapêutico
Após confirmação da infecção que foi realizada pela visualização de amastigotas
nos imprinsts do baço e fígado dos animais do D30 e pela constatação dos sinais sugestivos
de infecção por L. chagasi, pôde-se realizar o tratamento nos animais seguindo o protocolo
demonstrado na tabela 1. A duração dos tratamentos foi de 30 dias consecutivos, do 30° dia
pós-infecção (D30) ao 60° dia pós-infecção (D60). No D30 e D45 (15° dia de tratamento)
dois animais de cada grupo foram submetidos à anestesia dissociativa com 200mg/kg de
Ketamina e 10mg/kg de Xilazina, ambas por via intramuscular e eutanasiados com
200mg/kg tiopental IP (Paiva et al., 2005). Amostras de fígado e baço foram colhidas para
histopatologia e imprints destes órgãos foram realizados e corados por panótico rápido para
determinação da carga parasitária (Coelho, et al. 2006). No final do experimento (D90),
todos os animais remanescentes (6 hamsters/grupo) foram submetidos ao mesmo protocolo
de eutanásia e amostras dos órgãos-alvos foram coletadas para posterior análise.
Tabela 1: Protocolo terapêutico instituído nos grupos experimentais.
Grupos Tratamento Via de
Administração
Animais
Infectados
T1 100mg/kg C. reticulata IP Sim
T2 50mg/kg C. reticulata IP Sim
Controle
Positivo
20mg Sbv/kg Antimoniato
de meglumina
(Glucantime®
)
IP Sim
Controle
Negativo - - Sim
Sadio - - Não
Estudo Histopatológico e Carga Parasitária
A análise histopatológica foi realizada a partir da preservação destas amostras em
formalina tamponada a 10%. Fragmentos de fígado e baço sofreram processamento
histológico de rotina: desidratação em álcool, diafanização em xilol e impregnação em
88
parafina. Os blocos de parafina foram cortados por micrótomo com espessura de 4µm e
corados pela hematoxilina-eosina para posterior observação em microscópio óptico com
auxílio do óleo de imersão em aumento de 1000x (Riça-Capela, et al. 2003). O controle
para aspectos de normalidade dos órgãos considerados foram dois animais pertencentes ao
grupo sadio que apresentam animais não infectados.
A carga parasitária de cada órgão foi calculada a partir da fórmula: número de
amastigotas por núcleo de célula x peso do órgão (grama) x (107) de acordo com Buffet et
al. (1995). A eficácia foi calculada de acordo com Ferreira et al. (2010) a partir da relação
entre: média de amastigotas no grupo tratado/média de amastigotas no grupo não tratado
(controle negativo 1) X 100.
Análise Estatística
Todos os valores de carga parasitária obtidos foram descritos como média ± desvio-
padrão e estão apresentados nas Figuras 4 e 5. A comparação dos grupos foi feita através da
análise de variância ANOVA two-way seguida pelo teste de Bonferroni. O nível de
significância usado foi de 5%. Todas as análises foram realizadas pelo software estatístico
GraphPad Prism 5.0.
Resultados
O oleo-resina de C. reticulata demonstrou ser rico em terpenóides e os compostos
de maior predominância foram β-Cariofileno (43,18%), α-Bergamoteno (8,76%) e copaeno
(8,69%).
Os valores da carga parasitária dos animais tratados com o óleo-resina nas duas
doses e com a droga de referência estão representados na figura 1.
89
Figura 1: Carga Parasitária dos imprints esplênicos (A) e hepáticos (B) obtidos no período de 30 dias pós-
infecção (D30), 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias pós-tratamento (D90) dos animais tratados com o óleo-
resina de C. reticulata comparados com os grupos controle positivo tratados com antimoniato de meglumina e
controle negativo composto por animais infectados e não tratados.
Nas análises microscópicas dos imprints esplênicos (figura 2) e hepáticos (figura 3)
observou-se redução na visualização dos parasitos nos grupos tratados quando comparados
com o controle negativo com animais infectados e não tratados.
Figura 2: Imprint Baço: A – pequeno número de formas amastigotas de L. chagasi (seta branca)– animal
infectado e tratado com 100mg/Kg do óleo-resina de C. reticulata, 100x; B – Formas amastigotas de L.
chagasi (seta branca) – animal infectado sem tratamento, 100x. Tempo - 90 dias após a infecção.
Baço
D30 D45 D901.0×1007
1.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
C - (Infectados e não tratados
C + (Antimoniato de meglumina)
100mg/kg óleo-resina de C. reticulata
50mg/kg óleo-resina de C. reticulata
Tempo pós-infecção
Parasit
os g
-1
A
Fígado
D30 D45 D901.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
1.0×1011
C- (Infectados e não tratados)
C+ (Antimoniato de meglumina)
100mg/kg óleo-resina de C. reticulata
50mg/kg óleo-resina de C. reticulata
Tempo pós-infecção
Parasitos g
-1
B
A B
90
Figura 3: Imprint Fígado: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) – animal tratado 100mg/kg de
óleo-resina de C. reticulata, 40x; B – Ninho de formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) – animal
infectado sem tratamento, 100x. Tempo - 90 dias após a infecção.
A eficácia obtida nos dias D45 e D90 no baço e no fígado está demonstrada nas
tabelas 2 e 3, respectivamente. Os principais resultados comprovam que a eficácia do óleo-
resina de C. reticulata foi dose-dependente no período de 15 dias de tratamento (D45) e a
dose de 100mg/kg obteve eficácia de 80,2% semelhante estatisticamente (P>0,05) a droga
de referência antimoniato de meglumina com 92,2% de redução da carga parasitária no
fígado, contudo, a redução da carga parasitária no baço foi de apenas 49,5% e diferiu
estatisticamente da droga de referencia que obteve 91,7% (P<0,05). Após 30 dias do
término do tratamento (D90) a eficácia na dose de 100mg/kg foi de 74,7% nas amostras do
baço e 72,7% no fígado. Estes resultados diferiram do controle positivo antimoniato de
meglumina que apresentou eficácia de 97,4% no baço e 96% no fígado (P<0,05).
A B
91
Tabela 2: Redução da carga parasitaria esplênica de hamsters infectados experimentalmente
por Leishmania chagasi e tratados com óleo-resina de Copaifera reticulata nas doses de
100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias após o término do tratamento
(D90), comparada aos animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de
meglumina.
Dias de
Experimento
100mg/kg
C. reticulata óleo-
resina
50mg/kg
C. reticulata óleo-
resina
20mg Sbv/kg
Antimoniato de
meglumina
D45 49,5%bB
40%bB
91,7%aA
D90 74,7%bC
60,3%cC
97,4%aA
Letras minúsculas representam a análise comparativa entre colunas e as letras maiúsculas a análise
comparativa entre linhas. O valor de P<0,05 foi considerado.
Tabela 3: Redução da carga parasitaria hepática de hamsters infectados experimentalmente
por Leishmania chagasi e tratados com óleo-resina de Copaifera reticulata nas doses de
100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias após o término do tratamento
(D90), comparada aos animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de antimoniato de
meglumina.
Dias de
Experimento
100mg/kg
C. reticulata óleo-
resina
50mg/kg
C. reticulata óleo-
resina
20mg Sbv/kg
Antimoniato de
meglumina
D45 80,2%abB
65,5%bB
92,2%aA
D90 72,7%bC
58,8%cC
96,0%aA
Letras minúsculas representam a análise comparativa entre colunas e as letras maiúsculas a análise
comparativa entre linhas. O valor de P<0,05 foi considerado.
Os achados histopatológicos no fígado evidenciaram em todos os animais tratados
as seguintes alterações patológicas: degeneração hidrópica/tumefação turva variando de
92
discreta (figura 4). Nos animais infectados e não tratados estes achados apresentaram-se de
forma mais severa.
Figura 4: Achado histopatológico de tumefação turva discreta e moderada encontrado em todos os animais
tratados após 90 dias de infecção, 10x.
Foi observado a presença de infiltrado inflamatório com predominância de células
linfóides, plasmócitos e macrófagos, estes últimos formando, por vezes, arranjos
granulomatóides (figura 5). Estes achados foram observados nos animais dos grupos
tratados.
Figura 5: Aspecto granulomatóide de infiltrado inflamatório observado no fígado em animal tratado com
100mg/Kg de óleo-resina de C. reticulata, 40x. Tempo – 90 dias pós-infecção.
93
Nos animais do grupo controle negativo com animais infectados e não tratados
também foram observados infiltrados inflamatórios e hiperplasia de células de Kupffer
(figura 6).
Figura 6: Hiperplasia de células de Kupffer em animal infectado e não tratado após 90 dias de infecção, 100x.
No baço os achados histológicos comprovaram que nos grupos tratados o principal
achado foi hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito periarteriolar
(figura 7).
Figura 7: Hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito periarteriolar, 10x.
Nos animais do controle negativo com animais infectados e não tratados os achados
esplênicos destacaram a hiperplasia folicular, com alguns casos de confluência entre
folículos (figura 8), presença de células de Mott com vesículas de Russel. Nos animais do
94
grupo controle negativo com animais não infectados não foram evidenciadas qualquer
alteração histopatológica hepática e/ou esplênica.
Figura 8: Hiperplasia folicular da polpa branca com confluência de folículos em animal infectado e não
tratado após 90 dias de infecção, 10x.
Com relação aos achados sugestivos de LV, os mais evidentes em todos os animais
infectados dos grupos tratados até 30 dias pós-infecção (D30) foram: perda de peso e a
desidratação. Porém os sinais de apatia e descamação das extremidades foram mais
observados nos animais do grupo controle negativo composto por hamsters infectados e não
tratados. Após o tratamento, todos os sinais sugestivos de perda de peso, apatia,
desidratação e descamação ficaram mais evidentes apenas nos animais do grupo controle
negativo composto por hamsters infectados e não tratados. Nos animais dos grupos tratados
nenhum sinal sugestivo de LV foi observado do D45 até o final do experimento (D90).
Discussão
O modelo mais adequado para a infecção experimental da LV, de acordo com
alguns estudos, é o hamster, Mesocricetus auratus, pois esse animal mimetiza a patogenia e
a clínica da doença humana e canina, manifestando hepatoesplenomegalia, supressão da
resposta das células T, hipoalbuminemia, pancitopenia e hipergamaglobulinemia (Goto e
Lindoso, 2004; Melby, 2002; Oliveira et al., 2004). Além de apresentar os sinais sugestivos
de perda de peso, apatia, desidratação e descamação das extremidades (Requena et al.,
2000).
95
Os achados histológicos em humanos e em cães infectados naturalmente e
infectados experimentalmente por Leishmania spp. são do tipo viscerotrópicas revelando no
baço um quadro que comprova a predominância da resposta imune do tipo humoral, devido
a quantidade elevada de plasmócitos/células de Mott com vesículas de Russel e ausência de
imunidade celular. Além disso, as lesões histopatológicas no fígado do homem e dos
animais infectados evidenciam a degeneração hidrópica/tumefação turva, presença de focos
hemorrágicos e infiltrados inflamatórios celulares, podendo apresentar formação de
granulomas e hiperplasia de células de Kupffer (Slappendel, 1988; Riça-Capela et al.,
2003). Estas histopatologias tornam-se cada vez mais severas com o aumento da carga
parasitária nos órgãos-alvos. Estes achados também foram observados neste estudo sendo
que de forma mais severa nos animais do controle não tratado.
A pesquisa de amastigotas foi positiva em baço e fígado de todos os animais
infectados, confirmando as observações feitas em infecções experimentais, e em casos
caninos e humanos de leishmaníase visceral submetida à necropsia (Melby et al., 2001;
Riça-Capela et al., 2003; Prakash et al., 2006; Wyllie e Fairlamb, 2006).
A eficácia in vivo de plantas já foi documentada em estudo realizado na Índia com
Dysoxylum binectariferum em hamsters experimentalmente infectados por Leishmania
donovani, o extrato etanólico na dose de 500mg/kg demonstrou ser tóxico, e na dose de
250mg/kg apresentou no final do 30° dia pós-tratamento eficácia de 69% na redução
parasitária esplênica. As frações clorofórmica e n-hexânica desta mesma planta na dose de
100mg/kg apresentaram eficácia de 64,3% e 47,8%, respectivamente. Todavia o composto
alcalóide Rohitukine foi ineficaz no teste in vivo (Lakshmi et al., 2007).
Outro estudo utilizando nanopartículas polilactidas e microemulsões do composto
ácido Bassic, um ácido triterpenóide insaturado, oriundo de Mimusops elangii contra
hamsters experimentalmente infectados por L. donovani demonstrou uma redução na carga
parasitária esplênica de 45, 62 e 78% após 15 dias de tratamento (Lala et al., 2006).
Pode-se observar que os resultados obtidos no presente estudo na dose de 50mg/kg
de C. reticulata foram similares, entretanto, o óleo-resina na dose de 100mg/kg apresentou
eficácia superior. Este fato pode ser explicado devido à composição do óleo-resina de C.
reticulata que demonstrou ser rico em terpenóides, entretanto o mecanismo de ação destes
96
compostos ainda não foi elucidado. Entretanto, já existem relatos que o óleo-resina possui
atividade anti-Leishmania amazonensis, antiinflamatória, antimicrobiana e antioxidante
(Shimizu et al., 1990; Sahin et al., 2004; Santos et al., 2008). Outros terpenóides já tiveram
seus mecanismos de ação documentados em outros parasitos, como bactérias, o linalool
obtido do óleo essencial de Coriandrum sativum possui ação estimuladora de espécies
reativas de oxigênio, tais como o óxido nítrico (Usta et al., 2009). Outro terpenóide, o timol
comprovou ter uma ação direta na síntese e atividade da ATPase e na concentração de íons
de potássio e de ferro em microorganismos, esta atividade causa sérios danos na membrana
celular de caráter estrutural e funcional (Lambert et al., 2001; Osorio et al., 2006).
Além disso, estes resultados sugerem que o óleo-resina de C. reticulata pode ser
uma alternativa para o tratamento da LV, pois foi eficaz na redução da carga parasitária
hepática equivalente a droga referência e os achados histopatológicos sugerem um estímulo
de área T no baço responsável pela produção de células característica da resposta imune do
tipo celular. Contudo, novos estudos são necessários para determinar o mecanismo de ação
deste óleo sobre o protozoário L. chagasi.
Agradecimentos
Agradecemos pelo apoio financeiro da FUNCAP sob forma de bolsa de doutorado e
ao CNPq pelo financiamento do projeto (nº. 47792/2007-6).
Dr. Bevilaqua e Dr. Morais são pesquisadoras do CNPq.
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101
9 CAPÍTULO 4
Eficácia da fração acetato de etila de Ricinus communis L. em hamsters dourados
(Mesocricetus auratus) infectados experimentalmente por Leishmania chagasi
(Efficacy of Ricinus communis L. ethyl acetate fraction in golden hamster
(Mesocricetus auratus) experimentally infected by Leishmania chagasi)
Periódico Acta Tropica (Qualis B1).
102
ABSTRACT
The Visceral Leishmaniasis (VL) in Brazil is the focus of much debate about the euthanized
and the treatment in canine species, due ethical’s discussion and to lack of proven
parasitological cure. This study evaluated the effectiveness of the ehtyl acetate fraction of
Ricinus communis in golden hamsters experimentally infected with Leishmania chagasi.
All experiment lasted for ninety days, but the treatment only lasted for thirty days. Tests
groups used 50 and 100mg/kg IP of fraction and the positive control group used 20mg
Sbv/kg IP of meglumine antimoniate (Glucantime
®). At D30, D45 and D90 after infection,
the animals were euthanized and samples from liver and spleen were collected for
histopathology and imprints of organs to determine the parasite load. In the D45, the
treatment with the higher dose of fraction obtained efficacy of 71.4% in liver samples and
did not differ statistically from positive control (P>0.05) with 92.2%. The reduction of
splenic parasitism was 53.7% and differed statistically of reference drug (P<0.05) with
91.7%. The efficacy with 100mg/kg on D90 was 71.2% in liver and spleen samples, but
these results were differ (P<0.05) from positive control that obtained efficacy of 97.4% and
96% in spleen and liver, respectively. Histopathologic findings in the liver and spleen were
found in the groups treated consistente with the histological aspects of infection with
Leishmania viscerotropic. Therefore, the ethyl acetate fraction of R. communis can be an
alternative for the tretament of VL, it showed efficay equivalent to reference drug in liver
samples during tretament and histological findings suggest to stimulate the imune response.
However, futher studies are needed to determine the principal compound and the
mechanism of action of this fraction of the protozoan L. chagasi.
Keywords: Ricinus communis. Alternative treatment. Experimental infection. Hamster.
Leishmania chagasi.
103
Eficácia da fração acetato de etila de Ricinus communis L. em hamsters dourados
(Mesocricetus auratus) infectados experimentalmente por Leishmania chagasi
Fernanda C. M. Rondon1, Claudia M. L. Bevilaqua
1*, Daniel A. Viana
2, Selene M. de
Morais1, Eudson M. Queiroz-Júnior
1, Ana Caroline M. Rodrigues
1, Juliana C. Ribeiro
1,
João B. Silva-Júnior1, Rafaele A. Sampaio
1.
1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará;
2 Rede Nordeste de
Biotecnologia, Universidade Estadual do Ceará.
*Autor para Correspondência
Av. Dedé Brasil, 1700, 60714-903 Fortaleza, Ceará, Brazil.
Tel.: +55.85.31019853; fax:+55.85.31019840.
E-mail: [email protected],
Resumo
A LV (LV) no Brasil é foco de grandes discussões quanto ao tratamento na espécie canina,
devido a questões éticas e a inexistência de cura parasitológica comprovada. Este trabalho
avaliou a eficácia da fração acetato de etila de Ricinus communis em hamsters dourados
infectados experimentalmente por Leishmania chagasi. Todo o experimento durou 90 dias,
mas o tratamento foi de 30 dias: grupos testes usaram 50 e 100mg/kg IP da fração e grupo
controle positivo 20mg Sbv/kg IP de antimoniato de meglumina (Glucantime
®). No D30,
D45 e D90 após eutanásia dos animais foram coletadas amostras hepáticas e esplênicas
para histopatologia e imprints dos órgãos para determinação da parasitemia. No D45 o
tratamento com a maior dose da fração obteve uma eficácia de 71,4% no fígado e não
diferiu (P>0,05) da droga de referência, 92,2%. A redução do parasitismo esplênico foi de
53,7% e diferiu estatisticamente (P<0.05) da droga de referência que obteve 91,7%. No
D90 a eficácia com 100mg/kg foi de 71,2% nas amostras do baço e fígado, contudo estes
resultados diferiram do controle positivo com eficácia de 97,4% no baço e 96% no fígado
(P<0,05). Os achados histopatológicos no fígado e baço encontrados nos grupos tratados
foram compatíveis com os aspectos histológicos de infecção por Leishmania viscerotrópica.
104
Portanto, a fração acetato de etila de R. communis pode ser uma alternativa para o
tratamento da LV, pois apresentou eficácia equivalente a droga padrão na redução da
parasitemia hepática durante tratamento e achados histológicos sugerem efeito
imunoestimulante. Contudo, novos estudos são necessários para determinar o principal
composto químico presente e o provável mecanismo de ação desta fração sobre o
protozoário L. chagasi.
Palavras-chave: Ricinus communis. Tratamento alternativo. Infecção experimental.
Hamster. Leishmania chagasi.
Introdução
O protozoário Leishmania chagasi, agente etiológico da leishmaníase visceral (LV),
é um parasito intracelular obrigatório de células do sistema fagocítico mononuclear
(Lainson e Rangel, 2005). Os órgãos de saúde no Brasil preconizam como medidas de
controle da LV o diagnóstico precoce e o tratamento dos casos humanos, uso de inseticidas
de ação residual e medidas de saneamento do meio doméstico para redução da densidade
vetorial e a identificação e eliminação dos cães soropositivos, pois são fonte de infecção
para o vetor (Brasil, 2010). Esta última medida tem levantado diversas polêmicas tanto
pelos proprietários dos animais quanto por profissionais de saúde, pois sua aplicação não
tem surtido o efeito desejável na diminuição da incidência dos casos humanos (Andrade et
al., 2007).
No Brasil, esta zoonose encontra-se em ampla expansão, sendo identificados novos
casos autóctones em áreas anteriormente consideradas indenes. Em 2009, foram
identificados os primeiros casos humano e canino de LV na região Sul e 21 casos humanos
na região Centro-Oeste em estudo retrospectivo (Brasil, 2009; Carranza-Tamayo, et al.
2010).
No Mundo, diversas medidas alternativas têm sido empregadas para prevenir e/ou
controlar a LV canina (LVC), como o uso de colares e spots-on impregnados com
deltametrina e permetrina, respectivamente, bem como o uso das vacinas Leishmune® e
Leish-Tec®. Entretanto, o impacto destas últimas medidas tem demonstrado resultados
105
limitados (Maroli et al., 2010). Outra opção é o tratamento sintético dos cães infectados.
Contudo, este método é proibido no Brasil quando usado com drogas sintéticas de escolha
para a terapêutica nos humanos ou com fármacos não autorizados pelo Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Brasil, 2008).
Além disso, nos países onde é permitido o tratamento sintético da LVC, o principal
objetivo desta terapêutica é minimizar os efeitos deletérios ocasionados pelo alto
parasitismo, proporcionando assim, somente sobrevida de qualidade e bem-estar ao animal,
pois ainda não há cura parasitológica comprovada (Oliva et al., 2010). Portanto, uma
alternativa para o controle da LVC é o uso de plantas, pois há vários séculos têm-se
encontrado diversas utilidades terapêuticas, fato este resultante de uma série de influências
culturais de colonizadores europeus, povos indígenas e africanos (Amorim, et al. 2003).
A Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) reconheceu no início dos anos 70
os benefícios das plantas utilizadas na medicina chinesa, e a partir disso, diversos
levantamentos demonstraram que dentre 90 novas substâncias com potencial farmacológico
analisadas, 68% delas eram derivados semi-sintéticos de plantas e/ou eram oriundas de
produtos naturais (Sixel e Pecinalli, 2002; Newman et al., 2003).
A planta Ricinus communis L., pertencente à família Euphorbiaceae, é uma planta
arbustiva e característica de áreas tropicais e subtropicais do mundo, sendo muito presente
no Nordeste brasileiro (Beltrão, et al. 2005). Esta planta apesar de ser extremamente tóxica
é amplamente empregada na medicina popular e tradicional com diferentes tipos de
atividades biológicas, como antiinflamatória, hepatoprotetora, antinoceptiva, inseticida,
antifúngica, antimicrobiana e antioxidante (Rodrigues et al., 2002; Singh et al., 2009; Taur,
et al. 2011). Recentemente, a ação in vitro de R. communis contra formas promastigotas e
amastigotas de L. chagasi e sua atoxicidade sobre células monocíticas de murinos RAW
264.7 foi comprovada (Rondon, et al. 2011). Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
avaliar a eficácia in vivo de R. communis em hamster dourados (Mesocricetus auratus)
infectados experimentalmente por L. chagasi.
106
Material e Métodos
Comitê de Ética
O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética para uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará registrado sob número 08670094-4 (18/2009).
Coleta da planta e obtenção da fração acetato de etila
A coleta das folhas de R. communis foi realizada no campus da Universidade
Estadual do Ceará em Fortaleza no Nordeste do Brasil. As amostras foram secas à
temperatura ambiente por 7 dias. As folhas foram cortadas e imersas em etanol a 96% por
uma semana. O extrato bruto foi obtido após o solvente ter sido retirado em evaporador
rotatório. Em seguida, o extrato foi submetido à cromatografia líquida com filtração em
sílica e recebeu repetidas lavagens com diferentes solventes como hexano, clorofórmio,
acetato de etila e metanol. O solvente de cada fase orgânica foi rota-evaporado e as
respectivas frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e metanólica foram obtidas
(Degani et al., 1998; Conegero et al., 2003). A análise química qualitativa foi realizada de
acordo com protocolo de Matos (2009) e Siddiqui et al., (2009) para determinar a presença
de alcalóides, taninos, fenóis, terpenos, flavonas e fitoesteróides.
Estudo in vivo
Promastigotas de L. chagasi
As promastigotas de L. chagasi cepa BA-262 foram cultivadas em meio M199
(Cultilab®
) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab®), HEPES (Sigma-
Aldrich®), Hemina bovina (Inlab
®), bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich
®), gentamicina na
concentração de 40mg/mL (Inlab®
) e 5% de urina humana masculina estéril. O cultivo foi
mantido em estufa tipo BOD em temperatura de 23,6 °C. Após sete dias de cultivo as
promastigotas foram coletadas e centrifugadas a 2.000 g por 15 minutos, lavadas com
tampão fosfato salina 1x concentrado (PBS, pH 7,2) e suspensas, novamente, em PBS. Os
parasitos foram então contados em câmara de Neubauer. A suspensão final foi ajustada para
fornecer o número de promastigotas necessário para o inóculo.
107
Animais e Infecção
Cinqüenta hamsters dourados (Mesocricetus auratus) de ambos os sexos de 6 a 8
semanas de vida, foram mantidos livres de patógenos em gaiolas com acesso livre à ração
pelletizada e água. Os animais foram divididos em cinco grupos com 10 hamsters em cada.
A infecção dos animais foi realizada por via intraperitoneal (IP) com promastigotas de L.
chagasi na concentração de 1x107 parasitos/0,1mL em PBS. Os animais foram
acompanhados por 90 dias (D90) com avaliação clínica onde se observou o aparecimento
de sinais clínicos sugestivos de infecção por L. chagasi, como: perda de peso, apatia,
desidratação e descamação das extremidades (Requena, et al. 2000).
Protocolo Terapêutico
Após confirmação da infecção que foi realizada pela visualização de amastigotas
nos imprinsts do baço e fígado dos animais do D30 e pela constatação dos sinais sugestivos
de infecção por L. chagasi, pôde-se realizar o tratamento nos animais seguindo o protocolo
demonstrado na tabela 1. A duração dos tratamentos foi de 30 dias consecutivos, do 30° dia
pós-infecção (D30) ao 60° dia pós-infecção (D60). No D30 e D45 (15° dia de tratamento)
dois animais de cada grupo foram submetidos à anestesia dissociativa com 200mg/kg de
Ketamina e 10mg/kg de Xilazina, ambas por via intramuscular e eutanasiados com
200mg/kg de Tiopental IP (Paiva et al., 2005). Amostras de fígado e baço foram colhidas
para histopatologia e imprints destes órgãos foram realizados e corados por panótico rápido
para determinação da carga parasitária (Coelho, et al. 2006). No final do experimento,
todos os animais remanescentes (6 hamsters/grupo) foram submetidos ao mesmo protocolo
de eutanásia e amostras dos órgãos-alvos foram colhidas para posterior análise.
108
Tabela 1: Protocolo terapêutico instituído nos grupos experimentais.
Grupos Tratamento Via de
Administração
Animais
Infectados
T 1 100mg/kg Fração Acetato
de Etila de R. communis IP Sim
T 2 50mg/kg Fração Acetato de
Etila de R. communis IP Sim
Controle
Positivo
20mgSbv/kg Antimoniato de
meglumina (Glucantime®)
IP Sim
Controle
Negativo - - Sim
Sadio - - Não
Estudo Histopatológico e Carga Parasitária
A análise histopatológica foi realizada a partir da preservação destas amostras em
formalina tamponada a 10%. Fragmentos de fígado e baço sofreram processamento
histológico de rotina: desidratação em álcool, diafanização em xilol e impregnação em
parafina. Os blocos de parafina foram cortados por micrótomo em espessuras de 4µm e
corados em hematoxilina-eosina para posterior observação em microscópio óptico com
auxílio do óleo de imersão em aumento de 1000x (Riça-Capela, et al. 2003). O controle
para aspectos de normalidade dos órgãos considerado foram dois animais pertencentes ao
grupo controle negativo 2, animais não infectados e sadios.
A carga parasitária de cada órgão foi calculada a partir da fórmula: número de
amastigotas por núcleo de célula x peso do órgão (grama) x (107) de acordo com Buffet, et
al. (1995). A porcentagem de supressão parasitária foi calculada de acordo com Riça-
Capela et al. (2003), a partir da relação entre: média de amastigotas contadas no grupo
tratado/média de amastigotas contadas no grupo não tratado (controle negativo 1 ) X 100.
109
Análise Estatística
Todos os valores de carga parasitária obtidos foram descritas como média ± desvio-
padrão e estão apresentados nas figuras 4 e 5. A comparação dos grupos foi feita através da
análise de variância ANOVA two-way seguida pelo teste de Bonferroni. O nível de
significância usado foi de 5%. Todas as análises foram realizadas pelo software estatístico
GraphPad Prism 5.0.
Resultados
Quatro frações foram obtidas a partir da planta R. communis a fração hexânica,
acetato de etila, clorofórmica e metanólica. Todavia, a fração hexânica não obteve volume
suficiente para os testes e análises químicas e, portanto, não foi utilizada. Os resultados in
vitro demonstraram que a fração acetato de etila foi a mais eficaz e não demonstrou
citotoxicidade e, portanto, foi a escolhida para os testes in vivo.
Com relação à carga parasitária os resultados obtidos nos grupos tratados com as
duas doses da fração acetato de etila de R. communis e com os animais tratados com 20mg
Sbv/kg de antimoniato de melgumina estão representados na figura 1.
Figura 1: Carga Parasitária dos imprints esplênicos (A) e hepáticos (B) obtidos no período de 30 dias pós-
infecção (D30), 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias pós-tratamento (D90) dos animais tratados com a
fração acetato de etila de R. communis comparados com os grupos controle positivo Glucantime® e controle
negativo composto por animais infectados e não tratados.
Baço
D30 D45 D901.0×1007
1.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
C - Infectados e não tratados
C + (Antimoniato de meglumina)
100mg/kg F. A. E. de R. communis
50mg/kg F. A. E. de R. communis
Dias de experimento
Parasit
os g
-1
Fígado
D30 D45 D901.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
1.0×1011
C- Infectados e não tratados
C+ (Antimoniato de meglumina)
100mg/kg F. A. E. de R. communis
50mg/kg F. A. E. de R. communis
Dias de experimento
Parasitos g
-1
A B
110
Nas análises microscópicas dos imprints esplênicos (Figura 2) e hepáticos (Figura
3) observou-se redução na visualização dos parasitos nos grupos tratados quando
comparados com o controle negativo composto por animais infectados e não tratados.
Figura 2: Imprint Baço: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) – animal tratado 100mg/kg da
fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias de experimento, 100x; B – Formas amastigotas de L.
chagasi (seta branca) – animal infectado sem tratamento, após 90 dias de experimento, 100x.
Figura 3: Imprint Fígado: A – Formas amastigotas de L. chagasi (seta branca) – animal tratado 100mg/kg da
fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias de experimento, 100x; B – Formas amastigotas de L.
chagasi (seta branca) – animal infectado sem tratamento, 40x.
Os valores percentuais de redução da carga parasitária no baço e no fígado dos
grupos tratados comparados com os resultados obtidos no grupo controle positivo
Glucantime® estão representados nas tabelas 2 e 3.
A B
A B
111
Tabela 2: Redução da carga parasitaria esplênica de hamsters infectados experimentalmente
por Leishmania chagasi e tratados com a fração acetato de etila de Ricinus communis L. nas
doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias após o término do
tratamento (D90), comparada aos animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de
antimoniato de meglumina.
Dias de
experimento
100mg/kg Fração
Acetato de Etila de
R. communis
50mg/kg Fração
Acetato de Etila de
R. communis
20mg Sbv/kg
Antimoniato de
meglumina
D45 53,7 %bB
42,0%cB
91,7%aA
D90 71,2%bC
54,1%cC
97,4%aA
Letras minúsculas representam a análise comparativa entre colunas e as letras maiúsculas a análise
comparativa entre linhas. O valor de P<0,05 foi considerado.
Tabela 3. Redução da carga parasitaria hepática de hamsters infectados experimentalmente
por Leishmania chagasi e tratados com a fração acetato de etila de Ricinus communis L. nas
doses de 100 e 50 mg/kg, aos 15 dias de tratamento (D45) e 30 dias após o término do
tratamento (D90), comparada aos animais tratados com dose de 20mg Sbv/kg de
antimoniato de meglumina.
Dias de
experimento
100mg/kg Fração
Acetato de Etila de R.
communis
50mg/kg Fração
Acetato de Etila de R.
communis
20mg Sbv/kg
Antimoniato de
meglumina
D45 71,4%abB
64,0%bB
92,2%aA
D90 71,2%bC
48,17%cC
96,0%aA
Letras minúsculas representam a análise comparativa entre colunas e as letras maiúsculas a análise
comparativa entre linhas. O valor de P<0,05 foi considerado.
Os principais resultados demonstraram que a fração acetato de etila de R. communis
foi dose dependente. No período D45 a dose de 100mg/kg a eficácia de 71,4% foi obtida na
nas amostras hepáticas e este valor foi similar ao do controle positivo com 92,2% (P>0,05).
112
Todavia, o valor de eficácia no baço foi de 53,7% e diferiu estatisticamente da droga de
referencia que obteve 91,7% (P<0,05). Após 30 dias do término do tratamento (D90) os
valores de eficácia na dose de 100mg/kg mantiveram-se altos com 71,2% tanto nas
amostras do baço quanto no fígado, contudo estes resultados diferiram do controle positivo
Glucantime® que apresentou eficácia de 97,4% no baço e 96% no fígado (P<0.05).
Os achados histopatológicos no fígado evidenciaram nos animais dos grupos
tratados as seguintes alterações patológicas: degeneração hidrópica/tumefação turva
variando de discreta (Figura 4). Nos animais do grupo controle negativo composto por
animais infectados e não tratados estes achados apresentaram-se de forma mais severa.
Figura 4: Fígado: A – Degeneração hidrópica/tumefação turva discreta e foco hemorrágico discreto 20x.
Quanto à inflamação foi observado a presença de infiltrado inflamatório com
predominância de células linfóides, plasmócitos e macrófagos, estes últimos formando, por
vezes, arranjos granulomatóides (figura 5). Estes achados foram observados nos animais de
todos os grupos tratados.
113
Figura 5: Fígado: Infiltrado inflamatório epitelióide concêntrico, tipo granulomatóide observado em animal
tratado com 100mg/kg da fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias de tratamento, 20x.
Nos animais do grupo controle negativo com animais infectados e não tratados
também foram observados infiltrados inflamatórios e hiperplasia de células de Kupffer
(figura 6).
Figura 6: Hiperplasia de células de Kupffer em animal infectado e não tratado após 90 dias de experimento,
100x.
No baço os achados histológicos provaram que nos grupos tratados o principal
achado foi hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito periarteriolar
(figura 7).
114
Figura 7: Hiperplasia da polpa branca com predominância de manguito periarteriolar em animal tratado com
100mg/Kg da fração acetato de etila de R. communis, após 90 dias de experimento, 10x.
Nos animais do controle negativo composto por animais infectados e não tratados os
achados esplênicos foram de hiperplasia folicular, com alguns casos de confluência entre
folículos (figura 8) e presença de células de Mott com vesículas de Russel. Nos animais do
grupo controle negativo composto por animais não infectados não foram evidenciadas
qualquer alteração histopatológica hepática e/ou esplênica.
Figura 8: Hiperplasia folicular da polpa branca com confluência de folículos em animal infectado e não
tratado após 90 dias de experimento, 20x.
Com relação aos achados sugestivos de LV, os mais evidentes em todos os animais
infectados dos grupos tratados até 30 dias pós-infecção (D30) foram: perda de peso e a
desidratação. Entretanto, os sinais de apatia e descamação das extremidades foram mais
115
observados nos animais infectados e não tratados. Após 15 dias de tratamento (D45) e até o
final do experimento (D90), todos os sinais sugestivos de perda de peso, apatia,
desidratação e descamação ficaram mais evidentes apenas nos animais do grupo infectados
e não tratados. Nos animais dos grupos tratados nenhum sinal sugestivo de LV foi
observado do D45 (15 dias de tratamento) até o final do experimento (D90).
Discussão
Diversos estudos comprovam que o uso do hamster dourado M. auratus é a melhor
opção como modelo experimental para avaliar os efeitos da infecção por Leishmania spp.
viscerotrópica. Isto porque esta espécie de animal consegue reproduzir os mesmo sinais
patológicos sugestivos de LV que já foram identificados em pacientes humanos e em cães
infectados naturalmente, como hepatoesplenomegalia, supressão da resposta imune do tipo
celular e predominância de resposta imune humoral, hipoalbunemia, pancitopenia e
hipergamaglobulinemia (Melby, 2002; Goto e Lindoso, 2004; Oliveira et al., 2004). Outros
achados também são encontrados nesta espécie que representam sinais sugestivos de LV
são: perda de peso, apatia, desidratação e descamação das extremidades (Requena et al.,
2000).
Trabalhos com análise histopatológica em pacientes humanos e caninos infectados
por L. chagasi revelaram em amostras esplênicas alterações que confirmaram a
predominância da resposta imune humoral, devido à hiperplasia folicular da polpa branca,
com presença de células de Mott com vesículas de Russel (plasmócitos ativados) e
supressão de linfócitos T, responsáveis pela resposta imune celular. Outros achados
encontrados estão localizados no fígado e os aspectos mais encontrados são degeneração
hidrópica/tumefação turva, além de focos hemorrágicos e infiltrados inflamatórios
celulares, podendo ocorrer formações granulomatóides e hiperplasias de células de Kupffer
(Slappendel, 1988; Riça-Capela et al., 2003). Estes achados histológicos tornam-se cada
vez mais severos com o aumento do parasitismo nos órgãos-alvos. Estes achados foram
bem evidentes nos animais infectados e não tratados ao longo do experimento.
A pesquisa de amastigotas foi positiva no baço e fígado de todos os animais
infectados, confirmando as observações de infecções experimentais, e em casos caninos e
116
humanos de leishmaníase visceral submetida à necropsia (Melby et al., 2001; Riça-Capela
et al., 2003; Prakash et al., 2006; Wyllie e Fairlamb, 2006).
O uso alternativo de plantas contra Leishmania viscerotrópica é amplamente
pesquisado em todo o mundo (Tempone et al., 2005; Ponte-Sucre et al., 2007; Schinor et
al., 2007; Oliveira et al., 2009; Rondon et al., 2011). Contudo, estes resultados nem sempre
são promissores quando são realizados de forma in vivo o trabalho realizado com a
substancia Rohitukine oriundo da planta Dysoxylum binectariferum que obteve efeito sobre
promastigotas e amastigotas de L. donovani, porém não foi eficaz em hamsters
experimentalmente infectados por esta espécie de parasito (Lakshmi et al., 2007).
Outros estudos in vivo demonstraram efeitos promissores para o tratamento da LV
como pode ser observado no estudo realizado com o composto clerodano diterpeno 16α-
hidroxicleroda-3,13(14)z-dien-15,16-olido extraído das folhas de Polyalthia longifolia na
dose de 250mg/kg reduziu em 91% e 87,5% a carga parasitária no baço e fígado em
hamsters infectados experimentalmente por L. donovani (Misra et al., 2010). O exsudato de
folhas de A. vera administrado por via oral na dose de 45mg/kg em Balb/c infectados
experimentalmente por L. donovani obteve redução de 96,6% e 99,9% da carga parasitária
no fígado e baço, respectivamente (Dutta et al., 2008).
A substância maesabalide III obtida a partir da planta Maesa balansae utilizado na
dose 0,4 mg/kg para tratar Balb/c infectados experimentalmente por Leishmania infantum e
proporcionou uma redução maior que 90% da carga parasitária hepática (Germonprez et al.,
2005). Nanopartículas polilactidas e microemulsões do composto ácido básico, obtido de
Mimusops elangii, administrado na dose de 2mg/kg a hamsters infectados
experimentalmente por L. donovani obteve redução na carga parasitária esplênica que
variou de 45 a 78% (Lala et al., 2006). A maioria dos estudos são contra a espécie L.
donovani, provavelmente, porque este parasito é responsável pela LV antroponótica e
atualmente encontra-se resistente à maioria das drogas sintéticas usadas para o tratamento
desta enfermidade.
Pode-se observar que diferentes produtos naturais já foram testados em espécies de
Leishmania viscerotrópica e os resultados obtidos demonstraram que em alguns casos estes
compostos naturais foram promissores, fato também observado em nossos resultados que
117
evidenciaram que o tratamento com a fração acetato de etila de R. communis reduziu a
carga parasitária hepática similar a droga de referência. Os achados histopatológicos dos
animais tratados pelo produto natural oriundo da planta R. communis sugerem também que
ocorreu uma estimulação da resposta imune celular porque foi observada uma hiperplasia
da polpa branca com predominância da área do manguito no baço e esta área é responsável
pela produção de células T. Contudo, novos estudos são necessários para determinar a
possível substância responsável por esta atividade, capaz de reduzir a carga parasitária, bem
como para determinar o mecanismo de ação.
Agradecimentos
Agradecemos pelo apoio financeiro da FUNCAP sob forma de bolsa de doutorado e
ao CNPq pelo financiamento do projeto (nº. 47792/2007-6).
Dr Bevilaqua e Dr. Morais são pesquisadoras do CNPq.
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122
10 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos demonstraram que as plantas C. reticulata e R. communis são
promissores na obtenção de fitoterápicos para o tratamento da leishmaníase visceral canina
e humana e conseqüentemente poderá auxiliar no controle desta doença porque ambos
produtos naturais demonstraram eficácia similar às drogas sintéticas usadas no tratamento
da doença tanto nos testes in vitro quanto no in vivo. Também foram observados achados
histopatológicos que sugerem uma resposta imunoestimulante predominantemente de
caráter celular.
Estes resultados demonstram que a pesquisa para a validação científica de produtos
naturais é válida, promissora e necessária para determinar a atividade biológica e assim
garantir um fitoterápico de confiança e que realmente tenha sua ação efetiva comprovada
para o tratamento da doença possivelmente em cães e humanos.
123
11 PERSPECTIVAS
Novos estudos são necessários para obter a composição química da fração acetato de
etila de R. communis e do óleo-resina de C. reticulata a fim de avaliar seu provável
mecanismo de ação e se esta atividade é resultado de ação individual ou sinérgica com
outros compostos químicos presentes.
Os resultados do experimento in vivo foram promissores porque sugerem que estes
dois fitoterápicos possuem atividade imunoestimulante, porém nas doses utilizadas não
foram suficientes para eliminar a carga parasitária de forma efetiva. Entretanto, novos
trabalhos devem ser realizados para avaliar a utilização de doses superiores, além da
possibilidade do uso de forma associada com outras drogas sintéticas mais eficazes, como o
próprio antimoniato de meglumina.
124
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