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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
DIVERSIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM CLONES DE
Eucalyptus spp. SOB TESTE EM GOIÁS
JOÃO PAULO CAIXETA DE SOUZA
Goiânia/GO
Julho/2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
DIVERSIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM CLONES DE
Eucalyptus spp. SOB TESTE EM GOIÁS
JOÃO PAULO CAIXETA DE SOUZA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Escola de Agronomia da UFG, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Engenheiro Florestal.
Orientador: Profº Dr. Evandro Novaes
Goiânia/GO
Julho/2016
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JOÂO PAULO CAIXETA DE SOUZA
DIVERSIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM CLONES DE Eucalyptus spp.
SOB TESTE EM GOIÁS
Trabalho de Conclusão de Curso Defendido e Aprovado em ___/___/____, pela Banca Examinadora constituída pelos membros:
Nota:_______
_____________________________________
Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________
Dra. Ludmila Ferreira Bandeira
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________
Prof. Dr. Evandro Noaves
Universidae Federal de Goiás - Orientador
Goiânia/GO Julho/2016
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Aos meus amados pais Paulo Francisco de Souza e Kátia Caixeta de Faria
DEDICO
5
AGRADECIMENTOS
A Deus por proporcionar a força necessária para que eu continue esta caminhada
Ao meu pai Paulo, por seus conselhos e amizade sincera e incondicional.
À minha mãe por ter me acompanhado e ser exemplo de grandes valores.
Às minhas irmãs pelas brincadeiras e carinho dado e recebido em todos esses anos.
À toda minha família com seu apoio eterno e acolhida nos momentos difíceis.
Ao Prof. Dr. Evandro Novaes por ter me guiado e acompanhado, demonstrando sempre o
verdadeiro significado de ser professor.
A Profa. Ludmila Ferreira Bandeira pelo acompanhamento e grande paciência em seus
ensinamentos.
A Georgia do Laboratório de Melhoramento por ceder seu tempo e paciência.
A todos os meus amigos e, em especial, ao Rodrigo Oliveira e Thaís Vieira Webber pela
ajuda na construção deste trabalho.
Muito Obrigado!
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DIVERSIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM CLONES DE
Eucalyptus spp. SOB TESTE EM GOIÁS
JOÃO PAULO CAIXETA DE SOUZA
RESUMO
As espécies do gênero Eucalyptus tem, cada vez mais, alcançado lugar de destaque nos programas de melhoramento genético, principalmente pelo seu imenso potencial produtivo e diversidade de usos. No decorrer destes programas genótipos são selecionados para critérios de crescimento e qualidade da madeira. Este trabalho analisou 48 genótipos desenvolvidos em empresas e ambientes diferentes através da amplificação e genotipagem de 9 marcadores microssatélites organizados em 3 sistemas multiplex. A eletroforese capilar foi realizada na plataforma ABI-3100 (Applied Biosystems) e a genotipagem no programa GeneMapper (Applied Biosystems). A análise de diversidade genética envolveu a estimativa da frequência alélica, heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He) e índice de fixação intrapopulacional (f) utilizando os programas Fstat e GDA. Para análise da divergência genética foi construído uma matriz de distância genética pelo método de Rogers (1972), obtendo-se um dendrograma pelo método das médias aritméticas não ponderadas (UPGMA) na plataforma R. De forma geral os dados encontrados foram condizentes com os descritos na literatura, indicando alta diversidade e baixa estruturação genética entre os genótipos avaliados. A média de alelos por loco foi de 14,71, com uma variação de 11 a 21 alelos. A heterezigosidade observada se mostrou maior (Ho = 0,88) que a esperada (He = 0,846). Com isso, o índice de fixação intrapopulacional apresentou uma média negativa (-0,042), o que evidencia uma baixa fixação de alelos devido a baixa taxa de endogamia do eucalipto. Através da análise dos componentes principais fica claro a falta de formação de grupos entre os genótipos selecionados, mesmo havendo um distanciamento genético significativo. Esse resultado indica ausência de estruturação genética entre os clones amostrados. A análise do dendograma revelou possíveis enganos na nomeação de genótipos potencialmente idênticos.
Palavra-chave: Eucalipto; marcadores moleculares, diversidade genética,
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GENETIC DIVERSITY AND DIVERGENCE AMONG CLONES OF Eucalyptus
spp. UNDER EVALUATION IN GOIÁS
JOÃO PAULO CAIXETA DE SOUZA
ABSTRACT
The species of the Eucalyptus genus have increasingly reached prominence in breeding programs, mainly for their high productivity and diversity of uses. During these programs some genotypes are selected for wood growth and quality traits. This study analyzed 48 genotypes developed in various companies and environments through the amplification and genotyping of 9 microsatellite markers combined in three multiplex systems. Cappilary electrophoresis was performed in the ABI 3100 platform (Applied Biosystems) and genotyping with the GeneMapper software (Applied Biosystems). The genetic diversity was evaluated by estimating allele frequency, observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He) and intrapopulational fixation index (f) using the programs GDA and FStat. For the analysis of genetic divergence, a Rogers (1972) genetic distance matrix was estimated to construct a dendrogram based on groups obtained with the unweighted arithmetic average (UPGMA) using the R platform. In general the results indicated high genetic diversity and low genetic structure among the sampled clones. The average number of alleles per locus was 14.71, ranging from 11 to 21 alleles. The observed heterezygosity was larger (Ho = 0.880) than expected (He of 0.846). As such, the average intrapopulation fixation index was negative (-0.042), which shows a low fixation of alleles due to low eucalyptus inbreeding rate. The principal component analysis did not show the existence of consistent groups among the sampled genotypes, even with significant genetic distances among them. This result indicates a lack of genetic structure among the analyzed clones. The analysis of the dendrogram revealed mistakes in the nomination of potentially identical genotypes.
Keywords: Eucalyptus; molecular markers; genetic diversity.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................9
2. REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................11
2.1 Gênero Eucalyptus........................................................................................11
2.2 Melhoramento Florestal do Eucalipto no Brasil...........................................12
2.3 Marcadores Moleculares...............................................................................13
2.4 Microssatélites..............................................................................................13
2.5 Diversidade e Divergência Genética.............................................................14
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................16
3.1 Área de Coleta e Material Vegetal................................................................16
3.2 Extração de DNA..........................................................................................17
3.3 Amplificação dos Locos Microssatélites......................................................18
3.4 Genotipagem do Material..............................................................................19
3.5 Análise dos Dados.........................................................................................20
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................22
5. CONCLUSÃO....................................................................................................27
6. REFERÊNCIAS..................................................................................................28
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1. INTRODUÇÃO
O Brasil reúne uma das melhores combinações de características
edafoclimáticas existentes no mundo para o desenvolvimento de florestas. A grande
cobertura florestal nativa, aliado ao grande desenvolvimento tecnológico já existente no
âmbito das florestas plantadas são prova do grande potencial de competitividade do setor
florestal brasileiro (JUVENAL & MATTOS, 2002).
De acordo com o relatório do IBA (2015), o setor florestal brasileiro conta com
7,74 milhões de hectares de florestas plantadas, o que corresponde a apenas 0,9% da área
do território nacional, sendo responsável por 91% de toda madeira produzida para fins
industriais. É importante lembrar que o setor florestal não se restringe aos produtos
madeireiros e também é composto por outras atividades como a extração de óleos
essenciais, látex, apicultura, etc.
O gênero florestal mais plantada no país é o Eucalyptus, com aproximadamente
5,59 milhões de hectares. Minas Gerais é o Estado que possui a maior área plantada com
1,4 milhões de hectares (IBA, 2015). Estes números se devem, em grande parte, a
disponibilidade de materiais genéticos altamente produtivos e adaptados a diferentes
condições ambientais, bem como a diversos usos (XAVIER, 2003)
Apesar dos avanços das pesquisas com esse gênero, o recente avanço da
eucliptocultura para as regiões interioranas do país trouxe uma série de desafios. As
dificuldades vão desde a necessidade de re-adequação de operações básicas, como as de
implantação e manejo, do espaçamento e protocolos de adubação, até a seleção e
melhoramento de materiais genéticos adaptados a essa nova realidade. Apesar do inerente
avanço da eucaliptocultura nas regiões Norte e Centro-Oeste, Goiás ainda se mostra
estagnado, apresentando em alguns anos até uma diminuição da área plantada com
florestas (IBA, 2015). Essa realidade contrasta bastante com o crescimento de estados
vizinhos como o Mato Grosso do Sul, que já possui 803.699 hectares plantados, e
Tocantins que é o Estado com maior crescimento em silvicultura nos últimos anos
O Estado de Goiás possui apenas 138.384 hectares de florestas plantadas,
destes 124.297 são cultivados com Eucalyptus (IBA, 2015). Essa área plantada contrasta
com o grande potencial para o estabelecimento de florestas plantadas no estado, sobretudo
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devido a sua posição geográfica no centro do País, o que facilita o escoamento interno da
produção (MORALES et al, 2002).
Com uma área de mais de 4 milhões de hectares de pastagens degradas que
poderiam ser utilizadas para o cultivo de florestas, sem interferir na produção agrícola,
Goiás tem um excelente potencial de produtividade florestal, contudo a falta de
informações e apoio técnico dificulta o planejamento de uma estratégia para o
desenvolvimento da silvicultura no Estado (MORALES et al, 2012).
Dado o potencial produtivo do Estado de Goiás e a falta de material
genético adaptado às condições edafoclimáticas do Cerrado, a UFG em parceria com a
Suzano Papel e Celulose, Clonar Resistência a Doenças e três empresas de base florestal de
Goiás (Anglo American, FL Florestal e JPFlorestal), instalou três testes clonais para avaliar
o potencial produtivo de 113 diferentes clones de Eucalyptus spp. no estado (MACIEL,
2014). O objetivo desse trabalho é analisar a diversidade e a divergência genética em uma
amostra com 48 desses clones sob teste no estado, utilizando marcadores microssatélites.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Gênero Eucalyptus.
Pertencendo a família Myrtaceae, o gênero Eucalyptus abrange mais de 700
denominações diferentes, entre espécies, híbridos e variedades, possui uma ocorrência
ampla, se estendo, principalmente, pela Austrália, Indonésia e ilhas adjacentes. Sua grande
diversidade permite que este ocorra em uma grande gama de condições ambientais que vão
desde áreas pantanosas, até muito secas, solos arenosos muito pobres, solos de baixada e
de alta fertilidade. É também encontrado em ambientes com índices de precipitação e
temperatura bastante variáveis (ASSIS, 1996).
As espécies do gênero Eucalyptus que se destacam mundialmente são, E.
grandis, E. camaldulensis, E. tereticornis, E. globulus, E. urophylla, E. viminalis, E.
saligna, E. deglupta, E. enxerta, E. pellita e E. citriodora. Sendo que as cinco primeiras
são as mais importantes em termos de incremento anual de madeira (ELDRIDGE et al,
1993).
No Brasil as espécies mais utilizadas são E. grandis e E. urophylla, bem como
o híbrido entre elas, destacando-se por apresentarem ampla adaptação às condições
edafoclimáticas do país (BERTOLLUCI et al., 1993). Além dessas, o E. saligna também
merece destaque na produção de híbridos com E. grandis e E. urophylla.
A espécie Eucalyptus grandis é originária da Austrália, possui uma boa
adaptação a diversos tipos de solos, mas se desenvolve de forma ótima em solos profundos
e bem drenados, com moderada fertilidade, não tolerando ambientes alagados
(ELDRIDGE et al., 1993).
O Eucalyptus urophylla não ocorre naturalmente na Austrália e tem como
origem as regiões tropicais da Indonésia. Tem uma elevada resistência ao déficit hídrico e
ótima adaptação a climas quentes. Sua madeira é de boa qualidade para celulose, serraria e
carvão, além de apresentar resistência ao fungo Cryphonectria cubensis, responsável pelo
cancro (TONACO, 2002).
A maioria das espécies de eucalipto são alógamas, mesmo assim possuem
sistema reprodutivo misto, podendo ocorrer até 30% de autofecundação (PRYOR, 1976).
Um fator que favorece a alogamia do eucalipto é a protandria, que é definida pela
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maturação dos pólens ocorrer antes do estigma se tornar receptivo, porém uma mesma
planta pode apresentar flores em diferentes níveis de desenvolvimento, o que deixa uma
margem a autofecundação (ELDRIDGE, 1977).
Segundo Pryor (1976) existe outro mecanismo que dificulta a autofecundação,
consistindo de um sistema de autoincompatibilidade controlado geneticamente que pode
variar sua intensidade de espécie para espécie. Se observa então que populações formadas
por eucalipto tendem a ter mais indivíduos heterozigotos.
2.2 Melhoramento florestal do eucalipto no Brasil
O primeiro relato de introdução do eucalipto no Brasil data de 1904, por
Edmundo Navarro de Andrade (FERREIRA, 2001). Este era utilizado nos motores a vapor
do sistema ferroviário e também fornecia madeira para postes e dormentes no Estado de
São Paulo. Após este período Edmundo Navarro de Andrade iniciou a introdução e
avaliação de 144 espécies de Eucalyptus para identificação de indivíduos promissores para
a silvicultura. Entretanto foi Carlos Arnaldo Krug que iniciou, em 1941, um programa de
melhoramento genético da espécie no Instituto Agronômico de Campinas visando atender
a Companhia Paulista de Estrada de Ferro.
Mesmo possuindo um dos programas de melhoramento mais avançados, Krug
ainda não isolava os talhões selecionados da entrada de pólen indesejado o que fazia com
que as sementes geradas possuíssem metade de seu genoma oriundo de indivíduos não
selecionados (FERREIRA & SANTOS, 1997).
Após este período, a Aracruz Celulose S/A se destacou por financiar e
desenvolver projetos de melhoramento genético com alto nível tecnológico, sendo os
pioneiros na utilização da clonagem em escala comercial. O melhoramento e a clonagem
geraram um aumento expressivo na produtividade de madeira por hectare e tornaram os
plantios de eucalipto mais homogêneos, melhorando a rentabilidade dessas florestas
(REZENDE, 2001; VENCOVSKY & RAMALHO, 2000).
Em 1979 esta mesma empresa estabeleceu o primeiro plantio comercial de
clones de eucalipto após diversos testes com multiplicação sexuada e assexuada
(IKEMORI, 2000). Os altos investimentos no melhoramento desta cultura atraíram
diversas empresas que também criaram programas de melhoramento visando
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características como rendimento em celulose, qualidade e volume da madeira e teor de
lignina (VENCOVSKY & RAMALHO, 2000).
2.3 Marcadores Moleculares
A palavra marcador, em seu significado genérico, remonta a um fator
morfológico, fisiológico, bioquímico ou genético passível de ser identificado e
acompanhado (SAKIYAMA, 1993). O marcador molecular age da mesma maneira, sendo
definido como uma ferramenta para identificar o genótipo molecular derivado de um
polimorfismo específico da sequência de DNA (GRATTAPAGLIA, 2001).
Após a descoberta das enzimas de restrição e do advento da PCR foi possível
identificar diversos tipos de marcados moleculares, entre os mais usados estão o AFLP
(Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados), RFLP (Fragmento
Polimórfico Amplificado ao Acaso), RAPD (DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso) e
SSR (Sequências Simples Repetitivas ou microssatélites) (CAETANO-ANOLLES, 1996).
Estes marcadores podem ser empregados em diversas áreas, como na seleção
de germoplasma em programas de melhoramento, caracterização de diferentes genótipos
(fingerprinting), construção de mapas genéticos, estabelecimento de filogenias, clonagem
de genes baseadas em mapas, seleção assistida por marcadores, proteção de cultivares,
entre outras (GRATTAPAGLIA et al., 1992).
2.4 Microssatélites
Dentre as classes de marcadores moleculares existentes os microssatélites se
destacam por possuirem maior informatividade, dado seu multi-alelismo e alto taxa de
polimorfismo. Assim, os microssatélites são amplamente utilizados em estudos para avaliar
a diversidade genética seja em populações naturais ou de melhoramento genético
(GRATTAPAGLIA et al., 1992). Esses marcadores são baseados na amplificação de
sequências repetitivas em tandem, com 2 a 6 pares de base de comprimento (HAMADA &
KAKUNAGA, 1982).
O DNA repetitivo é interessante para os estudos genéticos por apresentar
uniformidade em sua distribuição no genoma. Em vegetais, em média a cada 20 a 23 Kb
pode-se se encontrar um microssatélite (WANG et al., 1994). Características como
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codominância, ser altamente multialélico, possuir um maior conteúdo informativo por loco
em relação aos outros marcadores, possibilidade de avaliação em sistemas multiplex e
comparação com outros trabalhos fazem com que os microssatélites se sobreponham a
outros marcadores (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). O uso de sistemas multiplex
com grande número de microssatélites pode parecer uma forma de simplificar o processo e
obter resultados mais acurados.
A desvantagem principal para o uso dos microssatélites é a dificuldade em
desenvolver estes marcadores, já que é necessária mão de obra especializada e altos
investimentos em equipamentos de sequenciamento bastante precisos. Mesmo com esses
empecilhos existem diversas pesquisas para descoberta de novos marcadores, como o
trabalho de Smith & Devey (1994) com pinus e White & Powell (1997) com o mogno.
2.5 Diversidade e Divergência Genética
A diversidade genética é a base para a adaptação e sobrevivência das espécies
frente às mudanças provocadas em seu ambiente. É também uma das maiores
preocupações em programas de melhoramento, uma vez que os ganhos de seleção
dependem completamente da existência de diversidade genética em suas populações.
Conhecer o nível a estruturação da diversidade genética são imprescindíveis tanto para a
conservação dos recursos naturais como em programas de melhoramento genético
(SEBBEN et al., 1999).
Vencovsky (1987) afirma a necessidade de se preservar populações naturais e
desenvolver germoplasmas para conservação da diversidade genética, sem os quais as
atividades de pesquisa e melhoramento genético ficariam bastante depreciadas. O motivo
para tal se deve ao próprio cerne do melhoramento, que se baseia na eliminação de alelos e
combinações alélicas consideradas negativas através da seleção. Nota-se então que se
houver pequena variabilidade genética na população base do programa de melhoramento, a
seleção se torna precária graças ao pequeno pool de alelos disponíveis (FONSECA, 2010).
Para o estudo da divergência genética entre indivíduos de populações, seja de
melhoramento ou naturais, os pesquisadores se utilizam de diversos métodos
multivariados, como a análise por componentes principais e por variáveis canônicas e os
métodos de agrupamento (CRUZ, 1990). Os métodos de agrupamento se dividem em duas
clases, hierárquivos e de otimização.
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O método de otimização tem sua formação de grupos baseada no nível de
adequação a algum critério de agrupamento pré-definido. Ou seja, objetiva-se descobrir
uma parcela dos indivíduos que otimize este critério, podendo maximizar caso o critério
seja positivo ou minimizar caso não seja (CRUZ & CARNEIRO, 2003).
Já os métodos hierárquicos de agrupamento se baseia na repetição de um
processo em vários níveis até que se possa construir um dendrograma onde será possível
visualizar a relação entre os acessos. O dendograma é um diagrama em forma de árvore
que demonstra a subdivisão dos grupos formados (MARTEL et al., 2003).
A diversidade e divergência genética entre genótipos de programas de
melhoramento de Eucalyptus foram previamente obtidas em diversos trabalhos. Caixeta et
al (2003) utilizaram marcadores RAPD para detectar cruzamentos favoráveis em 44
híbridos naturais de Eucalyptus. O objetivo foi o de maximizar a variabilidade dos
genótipos nas progênies segregantes, através da seleção de genitores divergentes para
cruzamento. Souza et al. (2010) avaliou a diversidade genética em 39 indivíduos utilizando
14 primers microssatélites com intuito de formar um banco de informações envolvendo
genótipos de diferentes programas de melhoramento. Ribeiro et al. (2009) desenvolveu um
protocolo de avaliação do parentesco analisando a diversidade e divergência genética entre
125 indivíduos com 16 microssatélites para auxiliar no desenvolvimento de programas de
melhoramento mais eficientes.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de Coleta e Material Vegetal
O material vegetal foi coletado em uma área de experimento de teste clonal
pertencente a empresa JP Florestal, situada em Corumbá de Goiás, GO. A fazenda possui
as seguintes coordenadas geográficas: Latitude 15º 55’ 27’’ Sul e Longitude 48º 48’ 32’’
Oeste. Esta região está inserida no bioma Cerrado, apresentando clima tropical sub-úmido
e altitude média de 962 metros. O solo utilizado é do tipo latossolo vermelho com pH
ácido, apresentando valores de 4,9 na faixa dos 0 a 20 cm e 4,6 na faixa dos 20 aos 40 cm.
As plantas amostradas foram obtidas de um teste clonal com 93 clones de
Eucalyptus spp. potencialmente importantes para a eucaliptocultura em Goiás (MACIEL,
2014). Foram selecionados aleatoriamente 48 clones para participar desta análise. Na
tabela 1 se encontra a relação dos clones selecionados.
Tabela 1. Relação das espécies que compõem a amostra de 48 clones selecionados para as análises genéticas do presente projeto.
Empresa Doadora Origem Espécie
Número de
Clones
Clonar Faz. Guaxupé E. urophylla 25
Plantar
Plantar
E. urophylla x E. grandis 2
E. urophylla 2
E. grandis 1
E. grandis x E. urophylla 1
Suzano E. grandis 1
Veracel E. grandis x E. urophylla 1
E. grandis 1
Cenibra E. grandis x E. urophylla 2
Suzano
Bahia E. grandis 1
Maranhão
E. urophylla x E. grandis 9
E. urophylla 1
E. grandis x E. pellita 1
A coleta do material vegetativo de cada clone foi feita utilizando um podão
para obtenção de uma pequena porção da parte aérea da árvore. A coleta priorizou tecidos
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foliares mais juvenis, que rendem maior quantidade e melhor qualidade no processo de
extração do DNA.
Após coleta, o material foi acondicionado em envelopes de papel e
armazenados em uma caixa de isopor com gelo para transporte até o Laboratório de
Genética e Genômica de Plantas da Universidade Federal de Goiás. No laboratório o tecido
foi armazenado em freezer -20o C até o momento da extração.
3.2 Extração do DNA
Para a extração do DNA do material coletado foi utilizada a metodologia de
Doyle & Doyle (1987) descrita por Ferreira & Grattapaglia (1998). Esse método se baseia
na utilização do detergente CTAB para extração do DNA. A extração das amostras foi
dividida em duas rodadas, respeitando a capacidade de 24 amostras da centrífuga.
Para extração, as folhas foram cortadas em forma de tiras de aproximadamente
3 a 5 mm de largura e armazenadas em tubos de 2 ml. Nitrogênio líquido foi adicionado
aos tubos e, com a ajuda de uma chave Phillips, o tecido congelado foi macerado até
atingir aspecto visual de pó.
Após a maceração cada frasco recebeu 700 µL de solução CTAB 2X e foi
incubado em banho-maria por 1 hora. A cada dez minutos foi realizada a homogeneização
do material invertendo os tubos manualmente. Terminado este período, 600 µL de CIA
(clorofórmio-álcool isoamílico 24:1) foram adicionados a cada frasco. Após este processo,
os frascos foram agitados e invertidos manualmente por 5 minutos até atingirem o ponto de
uma emulsão homogênea.
Os tubos foram centrifugados a 13.000 rpm por 5 minutos para que houvesse a
separação em uma solução bifásica. O sobrenadante foi retirado cuidadosamente com a
ajuda de uma pipeta e realocado para frascos de 2 ml. A estes novos tubos foi adicionado
aproximadamente 50 µL da solução CTAB 10% para novamente ser realizada a extração
através de agitação manual por 5 minutos e aplicação de 600 µL de CIA. É necessário mais
uma agitação manual antes dos frascos serem levados a centrífuga com 13.000 rpm por 5
minutos.
O sobrenadante desta nova operação foi realocado para um terceiro conjunto de
tubos, agora com volume de 1,5 ml. A estes tubos foi adicionado 400 µL de uma solução
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aquosa de isopropanol frio (-20ºC). Após serem misturados gentilmente por inversão, os
frascos foram levados ao freezer para precipitação do DNA overnight (~12h).
Após precipitação do DNA, os frascos foram centrifugados a 6000 rpm durante
4 minutos até a formação do pellet, constituído pela aglutinação do DNA no fundo do tubo.
O sobrenadante resultante foi descartado, e o pellet lavado duas vezes com 1 ml de etanol a
70%. Em cada lavagem o pellet foi submerso em etanol por 5 minutos e o sobrenadante
formado foi descartado.
Após as lavagens com etanol, o pellet foi seco ao ar. Terminada a secagem este
foi ressuspendido em aproximadamente 50 µL de tampão TE com RNAse. As amostras de
DNA resultantes então foram armazenadas em freezer -80o C.
3.3 Amplificação dos Locos Microssatélites
Para avaliar a diversidade genética na amostra dos 48 clones, foram utilizados
9 locos microssatélites (SSR – do inglês simple sequence repeats) já descritos por Faria et
al. (2011). Para avaliar os fragmentos amplificandos em analisador de DNA automático, os
primers foram marcados com três fluorocromos diferentes (6-FAM, HEX e NED, cujas
cores são azul, verde e amarelo, respectivamente). Com isso, foram criados 3 conjuntos
triplex combinando três locos marcados com com fluorocromos diferentes. O processo de
amplificação foi realizado através de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando o kit
Multiplex PCR da Qiagen.
Tabela 2. Relação dos tríplex utilizados na análise, seus locos constituintes e a cor da fluorescência para cada loco.
Triplex Loco Cor da Fluorescência
1
EMBRA157 Azul
EMBRA204 Verde
EMBRA003 Amarelo
2
EMBRA011 Azul
EMBRA186 Verde
EMBRA333 Amarelo
3
EMBRA028 Azul
EMBRA041 Verde
EMBRA681 Amarelo
19
A solução utilizada para a amplificação teve um volume de 5 µL, constituídos
de: 2,5 µL de Master Mix, 0,25 µL de cada um dos primers a 100 M, 0,5 µL de Q-Solution,
0,25 µL de Água Milli-Q e 1 µL de DNA a concentração de 3ng/µL. O programa da PCR
foi iniciado com a etapa de desnaturação do DNA a 96ºC por cinco minutos, seguida de 10
ciclos com os seguintes passos: 94ºC por um minuto, 64ºC por 1 minuto e 72ºC por dois
minutos. Após esta etapa, inicia-se 20 ciclos com 94ºC por 1 minuto, 56ºC por 1 minuto e
72ºC por 2 minutos, totalizando 30 ciclos de amplificação durante todo o processo. A etapa
de extensão final aconteceu a 72ºC por sete minutos.
3.4 Genotipagem do Material
Com a utilização da plataforma semi-automática de genotipagem ABI-3100
(Applied Biosystem) foi possível realizar a eletroforese capilar para se obter os genótipos
dos clones analisados. A solução de reação foi preparada utilizando 1 µL do produto da
PCR, 0,6 µL de uma mistura de fragmentos de tamanho conhecido marcados com
fluorescência ROX (BRONDANI & GRATTAPAGLIA, 2001) e 8,4 µL de formamida Hi-
Di (Applied Biosystems) por amostra. A mistura foi mantida por cinco minutos a 95ºC,
sendo imediatamente transferida para um recipiente com gelo para desnaturação das
moléculas de DNA. A injeção das amostras na plataforma ABI – 3100 foi feita de acordo
com o protocolo padrão do equipamento. Os dados obtidos da plataforma ABI 3100 foram
analisados com o programa GeneMapper (Applied Biosystem) para detecção semi-
automatizada dos fluorocromos ligados a cada primer. O programa permite, através do
padrão fornecido pelos fragmentos marcados com fluorocromo ROX, identificar o número
de bases dos fragmentos microssatélites.
Por apresentar uma genotipagem com qualidade questionável, os locos
EMBRA157 e EMBRA003 foram excluídos das análises subsequentes de modo a
minimizar a chance de viés nos resultados.
3.5 Análise dos Dados
A diversidade genética dos clones de Eucalyptus spp. foi estimada com base no
número de alelos por loco, na heterozigosidade esperada e observada. Além disso, também
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foi estimado o índice de fixação dos alelos na população. Estes dados foram obtidos
através de análises nos programas Fstat (GOUDET, 2002) e GDA (LEWIS & ZAYKIN,
2001).
Para o cálculo da divergência genética foi utilizada a plataforma R
possibilitando a formulação de uma matriz de distância genética baseado no cálculo de
distância proposto por Rogers (1972). Esta estimativa de Rogers (1972) é uma modificação
do método euclidiano, possibilitando a comparação de estimativas de divergência obtidas
em estudos diferentes. Para essas análises de divergência foi considerado que cada
indivíduo representaria uma população.
A partir da matriz de distância foi possível construir um dendograma através do
método de agrupamento UPGMA (unweighted pair-group using arithmetic averages)
utilizando o programa R. O UPGMA, também conhecido como método de ligação média
não ponderada, é bastante utilizada em ecologia e sistemática (JAMES e McCULLOCH,
1990) e em taxonomia numérica (SNEATH & SOKAL, 1973. Trata-se da utilização das
médias aritméticas não ponderadas das medidas de dissimilaridade para posterior
agrupamento em diferentes níveis de grupos. Por exemplo, para se calcular a distância
entre um grupo de genótipos formados por a e b e um genótipo c utiliza-se a equação:
𝐷 !" ! =!!"!!!"
!
Onde 𝐷!" é a distância entre o genótipo a e c, 𝐷!" é a distância entre o
genótipo b e c e 𝐷 !" ! é a distância entre o grupo (ab) e o genótipo c.
Para uma segunda opção de visualização da distância genética optou-se pela
construção de um gráfico de componentes principais também na plataforma R. O objetivo
é explicar as variações descritas na matriz de distância genética em poucos componentes.
21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O loco EMBRA041 apresentou o menor número de alelos, com um valor de 11
(tabela 3). Sendo o loco EMBRA028 o detentor do maior número de alelos, sendo 21 no
total. A média do número de alelos por loco foi de 14,71. Outros trabalhos similares
envolvendo análise e caracterização dos microssatélites em diversas espécies de
Eucalyptus também detectaram locos com um grande e variável número de alelos
(BRONDANI et al., 1998; BYRNE et al., 1996; MARCUCCI et al., 2003). Alta
diversidade genética é comumente encontrada em espécies florestais ainda pouco
domesticadas como as do gênero Eucalyptus. Nas espécies arbóreas de alta longevidade e
com fluxo gênico eficiente, a perda de alelos por deriva genética ocorre de forma lenta e
em baixa frequência (HAMRICK & GODT, 1996).
Os principais indicadores de diversidade são os valores de heterozigosidade
esperada e observada, além do índice de fixação intrapopulacional, pois demonstram a
concentração de indivíduos heterozigotos em uma população além da taxa de endogamia.
A heterozigosidade observada foi maior, em média, que a esperada (Tabela 3). Resultados
como este também foram encontrados em outros trabalhos (FARIA et al., 2010) sendo que
a média da He foi de 0,880 semelhante a encontrada por Souza et al (2010) onde em duas
populações as média da heterozigosidade esperada foram de 0,869 e 0,843. O trabalho de
Maciel (2010), utilizando a mesma população de clones sob teste em Goiás, demonstrou
valores bastante próximos onde a média do valor de He foi de 0,791 e de Ho foi de 0,849.
O resultado da análise do índice f, mostrou, em sua maioria, um valor muito próximo de
zero ou até negativo, com média de -0,042 (Tabela 3). Esse resultado evidencia uma baixa
taxa de fixação dos alelos, possivelmente devido a uma baixa taxa de endogamia. Esse
resultado difere do trabalho de Silva (2010), que apresentou uma média de f de 0,326 com
valores variando de 0,017 a 0,703. A hipótese provável para explicar valores negativos de f
é de que a endogamia diminui a frequência de homozigotos em locos com alelos deletérios.
Esses alelos são, em sua maioria, recessivos e resultam em características fenotípicas
negativas do ponto de vista do melhorista, o que levaria a uma exclusão destes indivíduos
durante os ciclos de melhoramento. Dado seu hábito alógamo, aliado a sua alta
diversidade, é possível que o Eucalyptus ainda concentre um grande número de alelos que
prejudicam o crescimento quando em homozigose.
22
Estes dados revelam uma maior porcentagem de indivíduos heterozigotos do
que o sugerido pelo modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Uma provável explicação
para este fenômeno pode vir do fenômeno da heterose, onde, principalmente, em condições
de estresse o indivíduo heterozigoto apresenta melhores características fenotípicas do
ponto de vista do melhoramento, resultando em uma maior participação destes indivíduos
nos programas de melhoramento (ODA et al., 1989). Outra hipótese é o resultado do
cruzamento conduzido entre indivíduos de populações ou até espécies diferentes em
programas de melhoramento. Esses cruzamentos conduzidos artificialmente modificam as
condições naturais de reprodução e pode alterar as frequências de heterozigotos e
homozigotos já que há uma seleção prévia dos genitores, sendo que a taxa de homozigotos
pode se apresentar em menor número do que o descrito por Hardy-Weinberg em uma
situação natural.
Tabela 3. Variáveis da diversidade genética descrita por loco microssatélite (A = número de alelos por loco, He = heterozigosidade esperada, Ho = heterozigosidade observada, f = índice de fixação dos alelos, N = número de indivíduos genotipados).
Loco A N He Ho f
EMBRA204 13 39 0,890 1,000 -0,125
EMBRA186 15 40 0,791 0,825 -0,044
EMBRA011 12 45 0,863 0,977 -0,134
EMBRA333 16 45 0,768 0,777 -0,012
EMBRA028 21 44 0,883 0,795 0,099
EMBRA681 15 38 0,867 0,789 0,090
EMBRA041 11 20 0,862 1,000 -0,165
Média 14,71 38,71 0,846129 0,880 -0,042
As frequências alélicas demonstram a grande diversidade genética obtida
comos diferentes locos (Figura 1). Para a grande maioria dos locos, o número de alelos é
alto e não existe predominância de um ou outro alelo. O microssatélite EMBRA333 foi o
loco onde houve uma maior concentração de apenas um alelo, com o alelo de 221 pb sendo
responsável por 45,6% do total de alelos genotipados neste loco. Por outro lado, o
EMBRA204 demonstrou maior uniformidade nas frequências alélicas, com o alelo mais
frequente (221 pb) representando apenas 19,2% do total (Figura 1).
23
Figura 1. Frequências alélicas dos locos microssatélites.
O dendograma da Figura 2 foi construído com base nos valores encontrados na
matriz de distância genética de Rogers (1972). Este gráfico tem o objetivo de reunir em
grupos os clones menos divergentes, usando como fator de agrupamento a distância
genética entre eles. É observado que alguns clones são geneticamente idênticos como o
3336 e 1270 além do grupo formado pelo clone 3335 e BA7346, demonstrando uma
possível binomeação do mesmo clone.
A correlação cofenética dada entre este dendrograma e a matriz de distância
genética base foi de 0.7617 com um p-valor de 9,999𝑒!!, mostrando uma forte correlação
24
e, consequentemente, que o dendrograma representa bem os dados da matriz de distância.
Essa correlação cofenética é próxima do valor encontrado por Marcucci et al (2003)
(0,749) em seu trabalho com Eucalyptus dunni usando o mesmo método de agrupamento
(UPGMA). O p-valor indica que a chance desta correlação ser devido ao acaso é bastante
ínfima, comprovando que a correlação é significativa.
Figura 2. Dendrograma construído através do método UPGMA para representear as distâncias genéticas entre os 48 clones analisados neste trabalho. A correlação cofenética foi de 0,7617 (p-valor = 9,999𝑒!!).
A análise do gráfico de componentes principais (Figura 3) apresenta uma
distribuição que não demonstra a formação aparente de grupos. Esse resultado indica a não
existência de estruturação genética aparente na amostra de clones genotipada. Isso era
25
esperado já que a seleção de clones deste trabalho foi feita de forma aleatória e envolve
materiais genéticos de diversas empresas. O primeiro componente principal conseguiu
explicar somente 13% das variação contida na matriz de distâncias. Já o segundo
componente explicou 9,3%.
Mesmo com os primeiros componentes explicando somente uma pequena
fração dos dados contidos na matriz de distância, o gráfico representa relativamente bem as
distâncias entre os clones. A correlação cofenética neste caso foi de 0,4308, indicando um
correlação moderada, com a matriz de distância genética, mas significativa já que o valor
encontrado para o p-valor foi de 9,999𝑒!!.
Figura 3. Distância genética entre clones através da análise dos componentes principais.
Correlação cofenética de 0,4308 (p-valor = 9,999𝑒!!) com a matriz de distâncias.
26
5. CONCLUSÃO
A partir das análises e seus resultados é possível afirmar que a diversidade
genética dos clones em questão se apresenta elevada e os valores se assemelham aos
encontrados em trabalhos semelhantes.
A análise de divergência genética entre os clones não indica a formação de
subpopulações estruturadas, demostrando o grande esforço de cruzamento e hibridização
presentes nos programas de melhoramento florestal.
Observa-se também a grande possibilidade de engano na nomeação de alguns
clones, que pode ocorrer nas diversas etapas do processo de melhoramento e que
necessitam de investigação adicional para esclarecimento.
27
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