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Coleta, Avaliação e Criopreservação

de Sêmen

4ª Aula:

Priscila Marques Moura de LeonDoutoranda PPGB, Médica Veterinária

Setembro, 2011

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Manipulação de Gametas e Embriões

Conceitos...

• Sêmen: suspenção celular contendo espermatozoides e

fluído secretado pelos órgãos acessórios do trato genital

masculino.

• Porção Celular: espermatozoides (formados no interior dos

túbulos seminíferos dos testículos)

• Porção fluída: plasma seminal (transportador e protetor dos

espermatozoides, fonte varia de acordo a espécie)

• Sêmen: suspenção celular contendo espermatozoides e

fluído secretado pelos órgãos acessórios do trato genital

masculino.

• Porção Celular: espermatozoides (formados no interior dos

túbulos seminíferos dos testículos)

• Porção fluída: plasma seminal (transportador e protetor dos

espermatozoides, fonte varia de acordo a espécie)

Cauda do Espermatozoide

Peça Intermediária

Cabeça do Espermatozoide

Acrossomo

Célula Espermática

Célula Espermática

• Morfologia Espermática:

– Cabeça do Espermatozóide → núcleo achatado de forma oval contendo cromatina altamente condensada (DNA + protaminas);

– Acrossomo → cobertura com dupla camada de membrana que envolve o núcleo (Acrosina, hialuronidase, enzimas hidrolíticas)

– Cauda do Espermatozóide → colo, peças intermediária, principal e terminal. (*intermediária: numerosas mitocôndrias)

Principais componentes:

• Ácidos nucléicos

• Proteínas

• Lipídeos

* 1/3 do peso é constituído pelo núcleo

Comparação de espermatozoides de animais domésticos

EquinoBovino Suíno

CaprinoHumano Rato

Camundongo Canino

* Seleção prévia ao processamento e congelamento de sêmen para comercialização.

1. Zootécnicos:– teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores,

leva-se em consideração o desempenho obtido. Ex.: produção de carne, performanceesportiva.

– Teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valordo que o exame de sua genealogia. Ex.: produção de leite das vacas filhas.

2. Sanitários:– devem ser livres de doenças infectocontagiosas, devendo ser submetidos a exame

andrológico e a testes de diagnóstico. Ex.: Brucelose, Leptospirose, Tuberculose

3. Nutricional:– Deficiências nutricionais podem provocar infertilidade. Machos selecionados para

congelamento de sêmen devem receber alimentação de alta qualidade.

4. Reprodutivos:– Exame andrológico completo (teste de comportamento sexual, genitália externa e

interna, Espermograma,

5. Burocráticos:– medidas de credenciamento junto às associações de criadores para a exploração

comercial

* Seleção prévia ao processamento e congelamento de sêmen para comercialização.

1. Zootécnicos:– teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores,

leva-se em consideração o desempenho obtido. Ex.: produção de carne, performanceesportiva.

– Teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valordo que o exame de sua genealogia. Ex.: produção de leite das vacas filhas.

2. Sanitários:– devem ser livres de doenças infectocontagiosas, devendo ser submetidos a exame

andrológico e a testes de diagnóstico. Ex.: Brucelose, Leptospirose, Tuberculose

3. Nutricional:– Deficiências nutricionais podem provocar infertilidade. Machos selecionados para

congelamento de sêmen devem receber alimentação de alta qualidade.

4. Reprodutivos:– Exame andrológico completo (teste de comportamento sexual, genitália externa e

interna, Espermograma,

5. Burocráticos:– medidas de credenciamento junto às associações de criadores para a exploração

comercial

Seleção de Machos para Criopreservação de Sêmen

• Vagina Artificial

• Eletroejaculação

• Método de Excitação Mecânica

• Vagina Artificial

• Eletroejaculação

• Método de Excitação Mecânica

Métodos de Coleta de Sêmen

• Vagina Artificial:

– Corresponde à melhor técnica de coleta de sêmen, pois simula a cópula

natural.

– Método utilizado para: Bovinos, Equinos, Caprinos e Ovinos, coelhos.

– A vagina artificial é composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de

borracha, cone flexível e tubo coletor, recoberto por capa de térmica.

Através da válvula do tubo coloca-se a água a temperatura de 39-45°C e

regula-se a pressão.

– A temperatura interna deve estar entre 39 e 42°C.

– Vantagens: obtêm sêmen com maior densidade e concentração, menor risco

de contaminação ambiental.

– Desvantagem: necessidade de treino para os machos doadores.

• Vagina Artificial:

– Corresponde à melhor técnica de coleta de sêmen, pois simula a cópula

natural.

– Método utilizado para: Bovinos, Equinos, Caprinos e Ovinos, coelhos.

– A vagina artificial é composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de

borracha, cone flexível e tubo coletor, recoberto por capa de térmica.

Através da válvula do tubo coloca-se a água a temperatura de 39-45°C e

regula-se a pressão.

– A temperatura interna deve estar entre 39 e 42°C.

– Vantagens: obtêm sêmen com maior densidade e concentração, menor risco

de contaminação ambiental.

– Desvantagem: necessidade de treino para os machos doadores.

Métodos de Coleta de Sêmen – Vagina Artificial

Coleta de Sêmen por Vagina Artificial

Vagina Artificial de Ovinos e Caprinos

Vagina Artificial de Equinos

Vagina Artificial de Bovinos

Coleta de Sêmen Equino - Vagina Artificial

Manequim Artificial Égua em Cio

Coleta de Sêmen Bovino- Vagina Artificial

Vaca em Cio

• Eletroejaculação:

– Método consiste em induzir a passagem de uma corrente alternada pela

medula ao nível da 4a vértebra lombar, este estímulo produz a ejaculação.

– O eletroejaculador é inserido no reto, com eletrodos em forma de anéis ou

longitudinais irão promover a estimulação elétrica.

– A eletroejaculação é particularmente indicada para coleta de sêmen de touros

e carneiros.

– Desvantagens: correspondem ao estresse gerado e maior diluição seminal

quando comparado à coleta com vagina artificial (eletroejaculador exacerba a

secreção das glândulas sexuais acessórias) que pode ocasionar problemas de

congelabilidade desse sêmen.

• Eletroejaculação:

– Método consiste em induzir a passagem de uma corrente alternada pela

medula ao nível da 4a vértebra lombar, este estímulo produz a ejaculação.

– O eletroejaculador é inserido no reto, com eletrodos em forma de anéis ou

longitudinais irão promover a estimulação elétrica.

– A eletroejaculação é particularmente indicada para coleta de sêmen de touros

e carneiros.

– Desvantagens: correspondem ao estresse gerado e maior diluição seminal

quando comparado à coleta com vagina artificial (eletroejaculador exacerba a

secreção das glândulas sexuais acessórias) que pode ocasionar problemas de

congelabilidade desse sêmen.

Métodos de Coleta de Sêmen - Eletroejaculação

Coleta de Sêmen por Eletroejaculação

Sistema de Eletroejaculação

Coleta de Sêmen Bovino

Coleta de Sêmen de Animais Silvestres

• Método de Excitação Mecânica:

– utilizado por Spalanzani (1780) para a obtenção de sêmen de cão. Foi

o método utilizado para realizar a primeira inseminação artificial em

um animal de fecundação interna.

– A técnica consiste na excitação manual do corpo do pênis.

– Utilizado em Cães e Suínos.

– Suínos → Método da Mão Enluvada

– Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e

oferece um risco potencial de contaminação do sêmen por sujidades

ambientais.

• Método de Excitação Mecânica:

– utilizado por Spalanzani (1780) para a obtenção de sêmen de cão. Foi

o método utilizado para realizar a primeira inseminação artificial em

um animal de fecundação interna.

– A técnica consiste na excitação manual do corpo do pênis.

– Utilizado em Cães e Suínos.

– Suínos → Método da Mão Enluvada

– Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e

oferece um risco potencial de contaminação do sêmen por sujidades

ambientais.

Métodos de Coleta de Sêmen – Excitação Mecânica

O sêmen canino é composto de três frações distintas:• 1ª fração: é constituída por um líquido claro, aquoso, que representa o

produto de secreção das glândulas uretrais e seu volume pode variar de 0,25 a 5 ml;• 2ª fração: de cor branca e consistência viscosa, contém os espermatozoides,

o volume pode variar de 0,5 a 3 ml;• 3ª fração: clara, aquosa, pouco consistente, cujo volume varia de 3 a 30 ml,

representa a secreção prostática.* A concentração média da ejaculação completa seria de 12.500.000 por ml.

O sêmen canino é composto de três frações distintas:• 1ª fração: é constituída por um líquido claro, aquoso, que representa o

produto de secreção das glândulas uretrais e seu volume pode variar de 0,25 a 5 ml;• 2ª fração: de cor branca e consistência viscosa, contém os espermatozoides,

o volume pode variar de 0,5 a 3 ml;• 3ª fração: clara, aquosa, pouco consistente, cujo volume varia de 3 a 30 ml,

representa a secreção prostática.* A concentração média da ejaculação completa seria de 12.500.000 por ml.

Coleta de Sêmen Canino - Excitação Mecânica

.Sêmen é coletada em 3 frações:• Fração Pré-espermática: translúcida• Fração rica em espermatozoides: esbranquiçada e opaca• Fração Pós-espermática: translúcida

.Sêmen é coletada em 3 frações:• Fração Pré-espermática: translúcida• Fração rica em espermatozoides: esbranquiçada e opaca• Fração Pós-espermática: translúcida

Coleta de Sêmen Suíno – Mão Enluvada

Outros métodos de coleta de sêmen

• Coleta de Sêmen de Aves – Massagem Abdominal

• Coleta de Sêmen de Camundongos – Retirada do Epidídimo e

ducto deferente

• Coleta de Sêmen de Peixes – Massagem Abdominal

• Coleta de Sêmen de Aves – Massagem Abdominal

• Coleta de Sêmen de Camundongos – Retirada do Epidídimo e

ducto deferente

• Coleta de Sêmen de Peixes – Massagem Abdominal

Testículo

* A avalição do sêmen deve ser realizada logo após a coleta;

* Nenhum teste isolado é capaz de predizer a fertilidade, é necessário um conjunto de testes;

• Análises:

– Análises Imediatas

– Análises Morfológicas

– Análises de Viabilidade

– Sondas Fluorescentes

– Sistemas Automatizados

* Importante: todo material deve ser sempre mantido 37°C

* A avalição do sêmen deve ser realizada logo após a coleta;

* Nenhum teste isolado é capaz de predizer a fertilidade, é necessário um conjunto de testes;

• Análises:

– Análises Imediatas

– Análises Morfológicas

– Análises de Viabilidade

– Sondas Fluorescentes

– Sistemas Automatizados

* Importante: todo material deve ser sempre mantido 37°C

Métodos de Avaliação de Sêmen

• Aparência e Volume:– Coloração uniforme e aparência opaca (indica alta concentração

espermática);– Volume é utilizado para cálculo da dose espermática (estimativa

do número total de células);

Volume médio ejaculado :

• Bovino: 5 – 8 mL

• Ovino: 0,8 – 1,2 mL

• Caprino: 0,8 – 1,2 mL

• Suíno: 150 – 200 mL

• Equino: 60 – 100 mL

• Galo: 0,2 – 0,5 mL

• Aparência e Volume:– Coloração uniforme e aparência opaca (indica alta concentração

espermática);– Volume é utilizado para cálculo da dose espermática (estimativa

do número total de células);

Volume médio ejaculado :

• Bovino: 5 – 8 mL

• Ovino: 0,8 – 1,2 mL

• Caprino: 0,8 – 1,2 mL

• Suíno: 150 – 200 mL

• Equino: 60 – 100 mL

• Galo: 0,2 – 0,5 mL


Sêmen Bovino

• Motilidade e Vigor:– Estimativa subjetiva da viabilidade e qualidade espermática;– Análise realizada em Microscópio óptico;– Avaliação pode ser dificultada em altas concentrações

espermáticas;– 10 a 20µL de sêmen são colocados entre lâmina e lamínula;

– Motilidade: células móveis são contadas e estimado o percentual;

– Vigor: velocidade que as células atravessam o campo e formam ondas;

• Motilidade média do ejaculado é 70 a 90%;

• Vigor é estimado entre 0 a 5, média e ideal entre 3 e 4;

• Motilidade e Vigor:– Estimativa subjetiva da viabilidade e qualidade espermática;– Análise realizada em Microscópio óptico;– Avaliação pode ser dificultada em altas concentrações

espermáticas;– 10 a 20µL de sêmen são colocados entre lâmina e lamínula;

– Motilidade: células móveis são contadas e estimado o percentual;

– Vigor: velocidade que as células atravessam o campo e formam ondas;

• Motilidade média do ejaculado é 70 a 90%;

• Vigor é estimado entre 0 a 5, média e ideal entre 3 e 4;


http://www.youtube.com/watch?v=H2ORu0fkY5Y&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=unmKOt6Ee0w

Vídeos Motilidade Espermática

Valores médios de Motilidade:

•Bovino: 40 – 75%

•Ovino: 60 – 80%

•Caprino: 60 – 80%

•Suíno: 50 – 80%

•Equino: 40 – 75%

•Galo: 60 – 80 %

• Sistemas de análises computadorizadas da motilidade espermática estão disponíveis;

• O Sistema de Análise Espermática Computadorizado - CASA

(Computer Assisted Sperm Analysis): – sistema automatizado (Hardware e Software) para visualizar e digitalizar

imagens sucessivas dos espermatozoides;

– processando, analisando e fornecendo informações da cinética individual das células e valores estatísticos

• Têm sido propostos e aplicados na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional do sêmen,

• Incrementar o estudo da andrologia através da análise de diversos parâmetros de motilidade;

• Sistemas de análises computadorizadas da motilidade espermática estão disponíveis;

• O Sistema de Análise Espermática Computadorizado - CASA

(Computer Assisted Sperm Analysis): – sistema automatizado (Hardware e Software) para visualizar e digitalizar

imagens sucessivas dos espermatozoides;

– processando, analisando e fornecendo informações da cinética individual das células e valores estatísticos

• Têm sido propostos e aplicados na tentativa de minimizar os efeitos da avaliação convencional do sêmen,

• Incrementar o estudo da andrologia através da análise de diversos parâmetros de motilidade;

Análise Computadorizada de Motilidade

CASA - Computer

Assisted Sperm Analysis

• Motilidade Total (%),• Motilidade Progressiva (%)• Velocidade de Trajeto (VAP, μm/s)• Velocidade Progressiva (VSL, μm/s)• Velocidade Curvilinear (VCL, μm/s)

• Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH, μm)• Freqüência de Batimentos (BCF, Hz)• Retilinearidade (STR, %)(VSL/VAP)• Linearidade (LIN, %) (VSL/VCL)• Velocidade Rápida (%; Arruda, 2000).

• Concentração Espermática:– Pode ser determinada por: Hemocitômetro e Espectrofotômetro

– Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água para facilitar a contagem (10X - 100X);

– Rotineiramente é utilizada Câmara de Neubauer para contagem celular;

Concentração média espermática milhões/mL :

• Bovino: 800 – 2000 x 106 sptz/mL

• Ovino: 2000 – 6000 x 106 sptz/mL

• Caprino: 2500 – 5000 x 106 sptz/mL

• Suíno: 200 – 300 x 106 sptz/mL

• Equino: 150 – 300 x 106 sptz/mL

• Galo: 3000 – 7000 x 106 sptz/mL

• Concentração Espermática:– Pode ser determinada por: Hemocitômetro e Espectrofotômetro

– Sêmen deve ser diluído em formol salina ou água para facilitar a contagem (10X - 100X);

– Rotineiramente é utilizada Câmara de Neubauer para contagem celular;

Concentração média espermática milhões/mL :

• Bovino: 800 – 2000 x 106 sptz/mL

• Ovino: 2000 – 6000 x 106 sptz/mL

• Caprino: 2500 – 5000 x 106 sptz/mL

• Suíno: 200 – 300 x 106 sptz/mL

• Equino: 150 – 300 x 106 sptz/mL

• Galo: 3000 – 7000 x 106 sptz/mL


Câmara de Neubauer Contagem Espermática

• Contagem de 5 quadrantes;• Contar as Linhas em “L”;• Contar nos 2 compartimentos (diferença

deve ser menor de 10%);• Caso haja disparidade fazer nova amostra;

• Diluir amostra (formol salina ou água);

• Montar câmara;• Esperar 5 min para contagem;

• Morfologia:– Estimativa do percentual de células normais e das patológicas;– Amostra é diluída e conservada em formol salina;– Avaliação através de esfregaço e coloração (Hematoxilina-eosina ou

Giemsa, Rosa de Bengala)– 100 a 200 sptz devem ser avaliados;

• Morfologia espermática ideal para congelamento é de 90%;

Espermatozóides morfológicamente normais:

• Bovino: 65 – 95%

• Ovino: 80 – 95%

• Caprino: 80 – 95%

• Suíno: 70 – 90%

• Equino: 60 – 90%

• Galo: 85 – 90%

• Morfologia:– Estimativa do percentual de células normais e das patológicas;– Amostra é diluída e conservada em formol salina;– Avaliação através de esfregaço e coloração (Hematoxilina-eosina ou

Giemsa, Rosa de Bengala)– 100 a 200 sptz devem ser avaliados;

• Morfologia espermática ideal para congelamento é de 90%;

Espermatozóides morfológicamente normais:

• Bovino: 65 – 95%

• Ovino: 80 – 95%

• Caprino: 80 – 95%

• Suíno: 70 – 90%

• Equino: 60 – 90%

• Galo: 85 – 90%


Confecção Esfregaço Espermático


– Classificação das Anormalidades espermáticas:

• Primárias: associadas a cabeça e acrossomo;

• Secundárias: gotas citoplasmáticas;

• Terciárias: defeitos de cauda;


– Classificação das Anormalidades espermáticas:

• Primárias: associadas a cabeça e acrossomo;

• Secundárias: gotas citoplasmáticas;

• Terciárias: defeitos de cauda;

• Avaliação automatizada da morfometria espermática - ASMA

(Automated Sperm Morphometry Analyses): avaliações da morfometria espermática pelo sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x);

• As imagens destinadas à avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software;

• Concentração de 200 x 106 sptz/mL

• Padrões morfométricos médios para equino:– cabeças espermáticas com 5,85 μm de comprimento, 2,97 μm de largura,

13,15 μm2 de área, 14,85 μm de perímetro e 0,51 μm para o coeficiente largura/comprimento.

* Espermatozoides são mais delgados quando subférteis

• Avaliação automatizada da morfometria espermática - ASMA

(Automated Sperm Morphometry Analyses): avaliações da morfometria espermática pelo sistema computadorizado realizadas por esfregaços corados (1.000 x);

• As imagens destinadas à avaliação da morfometria da cabeça dos espermatozoides são avaliadas pelo software;

• Concentração de 200 x 106 sptz/mL

• Padrões morfométricos médios para equino:– cabeças espermáticas com 5,85 μm de comprimento, 2,97 μm de largura,

13,15 μm2 de área, 14,85 μm de perímetro e 0,51 μm para o coeficiente largura/comprimento.

* Espermatozoides são mais delgados quando subférteis

Avaliação automatizada da morfometria espermática

ASMA - Automated Sperm Morphometry Analyses

• Testes de Viabilidade de membrana:

– Teste Hiposmótico:

• em uma solução hiposmótica (150 mOsm) a água entra no espermatozoide na tentativa de se alcançar o equilíbrio osmótico;

• capacidade do flagelo de se dobrar na presença de uma solução hiposmótica indica que a membrana está íntegra e funcional;

• O Teste Hiposmótico é um teste simples, prático e confiável;



– Live/Dead (Invitrogen):

• SYBR® 14 e Iodeto de Propídio;

• PI cora células com danos de membrana;

• O Live/Dead é um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento;


– Live/Dead (Invitrogen):

• SYBR® 14 e Iodeto de Propídio;

• PI cora células com danos de membrana;

• O Live/Dead é um kit para teste de viabilidade de membrana utilizado após congelamento/descongelamento;


Sêmen Bovino Sêmen Equino

– FITC-PSA:

• para avaliar a integridade do acrossomo de células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas

• Teste utilizado para avaliar crioinjúrias após Congelamento/Descongelamento;

* Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisum sativum agglutinin

– FITC-PSA:

• para avaliar a integridade do acrossomo de células espermáticas, através da capacidade de ligação a glicoproteínas específicas

• Teste utilizado para avaliar crioinjúrias após Congelamento/Descongelamento;

* Fluorescein Isothiocyanate-conjugated-Pisum sativum agglutinin


Sêmen Caprino Sêmen EquinoSêmen

Camundongo

Parâmetros seminais humanos segunda a

Organização Mundial de Saúde

• A criopreservação do sêmen busca a suspensão do

metabolismo espermático e a manutenção de suas

características por um período de tempo prolongado;

Criopreservação de Sêmen

• O sucesso da criopreservação do sêmen depende damanutenção do potencial fertilizante dos espermatozóides(integridade e funcionalidade):

– Flagelo (para garantir produção de ATP e motilidade);

– Núcleo (para manter estável o armazenamento do DNA);

– Acrossomo (para manter a fecundação);

– Segmento Equatorial (para que ocorra a ativação do oócito);

• Uso do Sêmen Congelado:

– Comercialização nacional e internacional;

– Biobancos (armazenamento de material genético);

– Inseminação Artificial;

– Produção in vitro de embriões (FIV e ICSI);

– Transferência de Gametas (GIFT);

– Programa de Transferência de embriões;

– Pesquisa Científica;


• A preservação das estruturas espermáticas aocongelamento/descongelamento é obtida através douso de:

� Diluidores e Crioprotetores;

• Curvas de Resfriamento buscam minimizar osdanos causados pelo choque térmico, formação decristais de gelo e desidratação celular;

• A preservação das estruturas espermáticas aocongelamento/descongelamento é obtida através douso de:

� Diluidores e Crioprotetores;

• Curvas de Resfriamento buscam minimizar osdanos causados pelo choque térmico, formação decristais de gelo e desidratação celular;


Resfriamento: altera as propriedades físicas da membrana celular.

Crioprotetores: alteram o volume celular, com desidratação e penetrando na célula

Armazenamento: estado de dormência celular.

Descongelamento: reidratação celular, com a recuperação e expansão da membrana

Verificação dos danos celulares

Espermatozoides Equino Criopreservados


• Passos da criopreservação do sêmen:

1. Diluição

2. Resfriamento

3. Congelamento

4. Armazenamento

5. Descongelamento

• Passos da criopreservação do sêmen:

1. Diluição

2. Resfriamento

3. Congelamento

4. Armazenamento

5. Descongelamento

1. Diluição:

� Diluentes

– Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, pH (6,5 a 6,9) e osmolaridade

adequados (300mOsm) , e atividade antibacteriana;

– O sêmen logo após a coleta deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte);

– Diluição na Proporção 1:1 (sêmen:diluente)

1. Diluição:

� Diluentes

– Seus componentes devem garantir nutrição, proteção, pH (6,5 a 6,9) e osmolaridade

adequados (300mOsm) , e atividade antibacteriana;

– O sêmen logo após a coleta deve ser diluído em meio de manutenção para dar suporte até o processamento de criopreservação (transporte);

– Diluição na Proporção 1:1 (sêmen:diluente)

Criopreservação de Sêmen - Diluição

Sêmen EquinoSêmen Bovino

Exemplo de Diluidores de Sêmen

Sêmen Suíno

1. Diluição:

� Crioprotetores

– Classificados como Externos e Internos de acordo a capacidade de penetração da membrana plasmática ;

– Devem provocar a desidratação celular, proteger e

estabilizar a membrana plasmática e evitar

formação de cristais de gelo;

1. Diluição:

� Crioprotetores

– Classificados como Externos e Internos de acordo a capacidade de penetração da membrana plasmática ;

– Devem provocar a desidratação celular, proteger e

estabilizar a membrana plasmática e evitar

formação de cristais de gelo;


� Crioprotetores

– Crioprotetores Internos:

• São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática;

• glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida;

� atuam nos meios intra e extracelulares;

� possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água;

� aumentam a osmolaridade do meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial);

� evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular;

� Crioprotetores

– Crioprotetores Internos:

• São moléculas pequenas que atravessam a membrana plasmática;

• glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, propanodiol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida;

� atuam nos meios intra e extracelulares;

� possuem o ponto de congelação muito mais baixo do que o da água;

� aumentam a osmolaridade do meio extracelular e promovem a saída de água da célula (até recuperar volume inicial);

� evitando o acúmulo de água e a formação de cristais de gelo intracelular;


� Crioprotetores

– Crioprotetores Externos:

• são moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática;

• Proteínas (da gema do ovo - LDL - e do leite desnatado),

• Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose)

• Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose)

• agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula

� Crioprotetores

– Crioprotetores Externos:

• são moléculas grandes e não conseguem atravessar a membrana plasmática;

• Proteínas (da gema do ovo - LDL - e do leite desnatado),

• Açúcares (frutose, glicose, manose, rafinose ou trealose)

• Polímeros sintéticos (polivinilpirrolidona e metilcelulose)

• agem como solutos ou colóides, pois contribuem para as propriedades osmóticas e afetam o movimento de água para dentro e para fora da célula


• Toxicidade dos Crioprotetores:

• Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos;

• Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetoresdesestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos;

• Enquanto que em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação;

* Bovinos: Tris-gema e Glicerol melhores resultados

* Equino: Dimetilformamida é mais usada

* Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol

1949: Christopher Polge criopreserva sêmen bovino com sucesso

• Toxicidade dos Crioprotetores:

• Crioprotetores são tóxicos ao espermatozoide, pois causam injúrias bioquímicas e danos osmóticos;

• Altas concentrações (10 a 20%) de crioprotetoresdesestabilizam os lipossomos, dissolvendo os fosfolipídeos;

• Enquanto que em concentrações moderadas, previnem os efeitos prejudiciais da desidratação;

* Bovinos: Tris-gema e Glicerol melhores resultados

* Equino: Dimetilformamida é mais usada

* Caprinos: leite desnatado + glicose + glicerol

1949: Christopher Polge criopreserva sêmen bovino com sucesso


Sêmen EquinoSêmen Bovino

Exemplo de Crioprotetores de Sêmen

Kit Sêmen Humano

2. Resfriamento:

– O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa;

– O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular.

– A taxa de resfriamento ideal: resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos de cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento.

* A velocidade de descongelamento deve ser compatível a velocidade

utilizada de congelamento.

2. Resfriamento:

– O resfriamento lento abaixo de 0°C promove maior saída de água da célula, podendo levar a desidratação celular intensa;

– O resfriamento rápido é insuficiente para permitir a saída da água, o que acarreta a formação de cristais de gelo intracelular.

– A taxa de resfriamento ideal: resulta em suficiente retirada de água intracelular, formando pequenos de cristais de gelo intracelulares e sobrevivência após o descongelamento.

* A velocidade de descongelamento deve ser compatível a velocidade

utilizada de congelamento.


• Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min (0,25 °C/min);

• Curva de Congelamento até -80°C (-15°C/min);


• Imersão em Nitrogênio líquido (-196°C);

• Armazenagem

• Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min (0,25 °C/min);



• Imersão em Nitrogênio líquido (-196°C);

• Armazenagem

Curva de Resfriamento/Congelamento

Palhetas para Criopreservação de Sêmen

Palhetas de 0,5mL e 0,25mL

Raques

Banho-Maria na geladeira Sistemas de transporte e resfriamento de sêmen

Curva de Resfriamento

Curva de Resfriamento/Congelaamento

Bio Cool:

• Sistema que resfria por curva padrão até – 80°C;• Utilizado para sêmen, embriões e outras células

Curva de Resfriamento - Congelamento

4. Armazenamento:

– Em Botijões de Nitrogênio Líquido (-196°C);

– As palhetas são colocadas em raques identificadas;

– Nível do NL é verificado e mantido periodicamente (15 dias);

– Armazenamento por tempo ilimitado;

4. Armazenamento:

– Em Botijões de Nitrogênio Líquido (-196°C);

– As palhetas são colocadas em raques identificadas;

– Nível do NL é verificado e mantido periodicamente (15 dias);

– Armazenamento por tempo ilimitado;


5. Descongelamento:

– Retira do Nitrogênio líquido e coloca em Banho-Maria;

– Em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;

– Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen;

5. Descongelamento:

– Retira do Nitrogênio líquido e coloca em Banho-Maria;

– Em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;

– Cortar uma das extremidades da palheta para retirada do sêmen;


Coleta de Sêmen

Avaliação Seminal

Congelamento/Descongelamento

Avaliação Seminal

Seleção do Macho Doador

� Sêmen é centrifugado (eliminado plasma seminal e diluente);

� Ressuspendido na concentração de 100 x 106 sptz/mL;

� Após a diluição, o sêmen é mantido a 37°C/10 min para estabilização;

� Homogeneização e Envase nas palhetas de 0,5mL ou 0,25mL;

� Identificação das palhetas;

� Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min;

� Curva de Congelamento até -80°C ;


� Palhetas são imersas em Nitrogênio líquido (-196°C);

� Palhetas são raqueadas e armazenadas em botijões de NL;

� Descongelamento: em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;

� Sêmen é centrifugado (eliminado plasma seminal e diluente);

� Ressuspendido na concentração de 100 x 106 sptz/mL;

� Após a diluição, o sêmen é mantido a 37°C/10 min para estabilização;

� Homogeneização e Envase nas palhetas de 0,5mL ou 0,25mL;

� Identificação das palhetas;

� Curva de Resfriamento 5°C/1h e 15min;



� Palhetas são imersas em Nitrogênio líquido (-196°C);

� Palhetas são raqueadas e armazenadas em botijões de NL;

� Descongelamento: em Banho-Maria a 37°C/30 segundos;

Protocolo de Criopreservação de Sêmen

universidade federal de pelotas graduação em ... · sêmen caprino sêmen equino sêmen...

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