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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
DIVERSIDADE GENÉTICA E POTENCIAL TOXIGÊNICO DE POPULAÇÕES DE Fusarium graminearum ASSOCIADAS AO TRIGO
NO SUL DO BRASIL
Paula Astolfi Bacharel e Licenciada em Ciências Biológicas/UPF
Dissertação apresentada como um dos requisitos à obtenção do Grau de Mestre em Fitotecnia
Ênfase em Fitopatologia
Porto Alegre (RS), Brasil Fevereiro de 2010
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Dedico este trabalho aos dois professores que me ensinaram a acima de tudo, acreditar.
À minha mãe,
mestra de longa data e alicerce inabalável, e ao Professor Emerson,
pai científico que apostou no meu potencial e me fez ver mais longe.
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AGRADECIMENTOS
Gostaria expressar os seguintes agradecimentos:
Em especial às minhas fiéis escudeiras Liara e Luana, peças únicas nessa caminhada. Sem vocês este trabalho estaria longe de ser concluído e com certeza não seria tão divertido. Espero que vocês levem na bagagem experiências tão satisfatórias quanto as que eu tive dividindo o laboratório com vocês! Aos meus colegas Piérri, Juliano e Thiago pelos incessantes conselhos e ajudinhas de última hora. Devo a vocês mais do que uma caixa de doces, devo todo o respeito pelos excelentes profissionais que são e incríveis companheiros. Aos demais colegas de laboratório que certamente contribuíram, de uma forma ou outra, para a conclusão desse trabalho. A amizade de vocês significa muito para mim. Ao Rubens, André, Raquel, Larissa, Marcelo, Carlos, Priscila, Nicole e Dudu. Às castelhanas Maria Laura Ramirez e Maria Marta Reynoso, da Universidade Nacional de Rio Cuarto - Argentina, que além do espanhol, me ensinaram a gostar do mate amargo e a me apaixonar cada vez mais pela biologia molecular. À amiga Tatiane, pela guarida em Maringá, pizzas e milhares de géis de agarose. Aos professores Sofia Chulze e Dauri Tessmann, por abrirem as portas de seus laboratórios. As experiências que tive em Rio Cuarto e Maringá para sempre farão parte de mim. Meu sincero obrigado. Ao professor Emerson, figura única em minha vida. Agradeço por toda a confiança depositada em mim, pelos ensinamentos infindáveis e por constantemente me lembrar que o cientista também é um ser humano... Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) do Ministério da Educação (MEC), pelo suporte financeiro na forma de bolsa de estudos integral e à Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), pela infra-estrutura e excelência de ensino. Á família Fonseca que me recebeu como parte dela e fez de Porto Alegre a minha casa. Em especial ao Diego, por todo o amor dedicado. Aos meus pais do coração Kika e Joel, e a Karla, irmãzinha que sempre sonhei ter. E por fim, a minha família, símbolo constante de perseverança, honestidade e carinho. Vô, vó, João, Tio Cezar,Tia Lilian, Grê, Rá e mãe, amo muito vocês!
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As reticências são os três primeiros passos do pensamento que continua por
conta própria o seu caminho.
Mário Quintana
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DIVERSIDADE GENÉTICA E POTENCIAL TOXIGÊNICO DE POPULAÇÕES DE Fusarium graminearum ASSOCIADAS AO TRIGO NO SUL DO BRASIL1
Autor: Paula Astolfi Orientador: Emerson Medeiros Del Ponte RESUMO
O agente causal da giberela do trigo Fusarium graminearum Schwab. é descrito como um complexo de distintas linhagens ou espécies filogenéticas (Complexo Fg) já relatadas em associação com o trigo, cevada e outros hospedeiros no Brasil e em outros países. O presente trabalho objetivou ampliar o conhecimento sobre a diversidade genética de populações do Complexo Fg no Estado do Rio Grande do Sul – Brasil ao caracterizar o perfil toxigênico de toxinas da classe dos tricotecenos-B, assim como determinar a estrutura populacional e a identificação de espécies filogenéticas deste complexo, considerando diferentes níveis de hierarquia espacial (população regional e população local). No nível regional (município), amostras de grãos de trigo sintomáticos foram obtidas de três municípios na safra 2007: Cruz Alta, Ernestina e Nonoai, resultando em três populações do Complexo Fg. No nível local (campo), safra 2008, duas populações de isolados foram obtidos de espigas sintomáticas georeferenciadas e coletadas de forma sistemática em dois campos de trigo, localizados nos municípios de Vacaria e Sarandi. Após purificação e extração de DNA, todos os isolados estudados foram submetidos ao singleplex-PCR espécie-específico para o Complexo Fg e uma multiplex-PCR para a determinação de três genótipos tricoteceno-B: 3-acetil-desoxinivalenol (3-ADON), 15-acetil-desoxinivalenol (15-ADON) e nivalenol (NIV). Para identificar as espécies filogenéticas e determinar a estrutura das populações do nível regional, marcadores AFLP foram utilizados. Nas três populações regionais, houve predominância da linhagem 7 (F. graminearum sensu stricto) (91,5%) com genótipo 15-ADON. Um isolado 3-ADON foi identificado como pertencente à linhagem 8 (F. cortaderiae). Dos 6 isolados NIV estudados, todos pertenceram à linhagem 2 (F. meridionale), com exceção de um isolado que foi identificado como linhagem 5 (F. acaciae-mearnsii). Quanto à diversidade genética, os altos índices de GST (fixation index) e baixa taxa de migração encontrados indicam a possível limitação do fluxo gênico entre as três populações e o possível isolamento reprodutivo entre elas, não excluindo uma alta diversidade dentro destas. Na escala local foi observado também a predominância de isolados 15-ADON nos dois campos de trigo (média de 95,2 %), além de isolados NIV e 3-ADON, os quais se apresentaram agregados espacialmente, sugerindo contribuição de fontes locais de inóculo para a epidemia. Os resultados desse estudo permitem concluir que a giberela do trigo é causada principalmente pela linhagem 7 com genótipo 15-ADON, além de pelo menos mais três linhagens do Complexo Fg com genótipos 3-ADON e NIV.
1 Dissertação de Mestrado em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (97p.) Fevereiro, 2010.
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GENETIC DIVERSITY AND TOXIGENIC POTENTIAL OF Fusarium graminearum POPULATIONS ASSOCIATED WITH WHEAT IN SOUTHERN BRAZIL2
Autor: Paula Astolfi Orientador: Emerson Medeiros Del Ponte ABSTRACT The causal agent fusarium head blight of wheat Fusarium graminearum Schwab.
is described as a complex of distinct lineages or phylogenetic species (Fg Complex), already reported in association with wheat, barley and other host crops in Brazil and other countries. The present work had the objective to broaden the knowledge about genetic variability of Fg Complex populations in Rio Grande do Sul state – Brazil characterizing the toxigenic profile of trichothecene-B toxins, as determine the populational structure and the phylogenetic species identification, considering different spatial hierarchic levels (regional and local populations). At the regional level (municipality) wheat grain samples were obtained from three municipalities at 2007 growing season: Cruz Alta, Ernestina and Nonoai, resulting in three Fg Complex populations. At a local level (field), 2008 growing season, two populations were obtained from georeferenced symptomatic spikes collected in a systematic form in two wheat fields located at the Vacaria and Sarandi municipalities. After purification and DNA extraction, all isolates were submitted to a singleplex specie-specific PCR and a multiplex-PCR for the determination of three trichothecene-B genotypes: 3-acetyl-desoxynivalenol (3-ADON), 15-acetyl-desoxynivalenol (15-ADON) and nivalenol (NIV). To identify the phylogenetic species and populations structure of the regional populations, AFLP markers were used. On three regional populations there was the predominance of lineage 7 (F. graminearum sensu stricto) (91,5%) with genotype 15-ADON. One isolate 3-ADON was identified as lineage 8 (F. cortaderiae). Of the 6 NIV isolates determined, 5 belonged to lineage 2 (F. meridionale), with the exception of one isolate that belonged with lineage 5 (F. acaciae-mearnsii). Considering the genetic diversity, the higher GST index (fixation index) and low migration rates founded indicate possible restrained genetic flow between the three populations and possible reproductive isolation within them not excluding a high diversity between them. At a local scale it was also observed the predominance of 15-ADON isolates in the two wheat fields (average of 95,2%), beyond NIV and 3-ADON isolates, which presented themselves spatially aggregated, suggesting the contribution of local inoculum sources for the epidemic. The results of this study allow to conclude that fusarium head blight of wheat is caused mainly by lineage 7, the genotype 15-ADON, and by at least three more lineages of Fg Complex of the genotypes 3-ADON and NIV.
2 Master of Science dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (97p.) February, 2010.
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SUMÁRIO
Página 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 5
CAPÍTULO I - A giberela .......................................................................................... 5 1.1 Importância da doença ......................................................................................... 5
1.1.1 Impacto econômico ............................................................................... 6 1.1.2 Impactos na produção e qualidade dos cereais ..................................... 7 1.1.3 Levantamentos de ocorrência e padrões de tolerância de micotoxinas 9
1.2 Sintomatologia ................................................................................................... 10 1.3. Etiologia ............................................................................................................ 11 1.4 Ciclo da doença e epidemiologia ....................................................................... 13 1.5 Estratégias de manejo ........................................................................................ 16
CAPÍTULO II - Potencial toxigênico de Fusarium graminearum .......................... 18 2.1 Biossíntese e estrutura de tricotecenos .............................................................. 18 2.2 Implicações toxicológicas .................................................................................. 21 2.3 Detecção do perfil toxigênico de F. graminearum ............................................ 23 2.4 Distribuição mundial de genótipos tricoteceno-B de F. graminearum ............. 24
2.4.1 Europa ................................................................................................. 25 2.4.2 Ásia ..................................................................................................... 26 2.4.3 América do Norte ................................................................................ 27 2.4.4 América do Sul ................................................................................... 28
2.5 Quimiotipos e patogenicidade ........................................................................... 29
CAPÍTULO III – Taxonomia Molecular e Genética Populacional de F. graminearum ............................................................................................................ 31 3.1 Conceitos de espécie .......................................................................................... 31 3.2 Estrutura populacional ....................................................................................... 35 3.3 Implicações epidemiológicas e de manejo ........................................................ 37
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 39
3.1 Origem das amostras de trigo para obtenção de isolados monospóricos de F. graminearum ............................................................................................................ 39 3.2 Isolamento e purificação dos isolados de F. graminearum ............................... 41 3.3 Preservação dos isolados monospóricos de F. graminearum ............................ 42 3.4 Produção de biomassa fúngica e extração de DNA ........................................... 42 3.5 Singleplex-PCR para identificação de espécie ................................................... 43
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3.6 Determinação de genótipos tricotecenos por Multiplex-PCR ............................ 44 3.7 Análises de AFLP .............................................................................................. 47
3.7.1 Estimativas de similaridade genética .............................................. 49 3.7.2 Análises de genética populacional .................................................. 50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 51
4.1 Determinação de genótipos tricotecenos-B e identificação de espécies filogenéticas do Complexo Fusarium graminearum ............................................... 51
Resultados ........................................................................................................... 51 Discussão ............................................................................................................ 54
4.2 Estrutura populacional do Complexo Fusarium graminearum no Sul do Brasil ................................................................................................................................. 59
Resultados ........................................................................................................... 59 Discussão ............................................................................................................ 61
4.3 Distribuição de genótipos tricotecenos-B em populações de Fusarium graminearum dentro de lavouras comerciais ........................................................... 66
Resultados ........................................................................................................... 66 Discussão ............................................................................................................ 69
5 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 75 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 77! APÊNDICES .............................................................................................................. 89!
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RELAÇÃO DE TABELAS Página
1. Espécies filogenéticas do Complexo Fusarium graminearum.……......... 34
2. Sequências de primers, condições para PCR e tamanho de fragmentos obtidos de diferentes quimiotipos de Fusarium graminearum.…......................................................................................... 45
3. Número e freqüência dos genótipos tricotecenos-B 3-ADON (3-acetil-desoxinovalenol), 15-ADON (15-acetil-desoxinivalenol) e NIV (nivalenol) em distintas populações no Estado do Rio Grande do Sul – Brasil.......................................................................................................... 50
4. Diversidade genética entre três populações distintas de F. graminearum isoladas de três Regiões do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil.......................................................................................................... 59
5. Diferenciação genética entre três populações de F. graminearum (Cruz Alta, Ernestina e Nonoai) calculadas a partir de todos os locus polimórficos, e para os 103 locus onde as freqüências de ambos os alelos (presença e ausência de banda) foi >5%............................................................................................................ 60
6. Número e freqüência dos genótipos tricoteceno-B 3-ADON (3-acetil-deoxinovalenol), 15-ADON (15-acetil-desoxinivalenol) e NIV (nivalenol) em distintas lavouras no Estado do Rio Grande do Sul – Brasil.......................................................................................................... 66
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RELAÇÃO DE FIGURAS Página
1. Sintoma de giberela em espiga de trigo..................................................... 11
2. Ciclo da doença.......................................................................................... 15
3. Estrutura de tricotecenos tipo A e B........................................................... 19
4. Diagrama do cluster gênico Tri5 da biossíntese dos tricotecenos de uma cepa de Fusarium graminearum produtora de nivalenol.......................... 21
5. Mapa geográfico do RS com indicação da origem das amostras de trigo, safra 2007................................................................................................... 40
6. Amostragem de espigas sintomáticas de trigo em distintos campos no Estado do Rio Grande do Sul, safra 2008.................................................. 41
7. Produção de biomassa fúngica................................................................... 43
8. Amplificação espécie-específica Fg16F/R para F. graminearum; Multiplex-PCR tri3 e tri12 para determinar os genótipos tricoteceno das populações Cruz Alta, Ernestina e Nonoai.......................................... 51
9. Dendrograma gerado com base no coeficiente de similaridade (UPGMA) para isolados de trigo do Sul do Brasil.................................... 53
10. Distribuição espacial de genótipos tricotecenos-B (3-acetil-desoxinivalenol, 15-acetil-desoxinivalenol e nivalenol) em dois campos comerciais de trigo localizados no município de Vacaria (A) e de Sarandi (B)................................................................................................. 67
11. Genótipos tricotecenos-B detectados por Multiplex-PCR Tri3 e Multiplex-PCR Tri12 para isolados de F. graminearum obtidos de duas lavouras comerciais do Estado do Rio Grande do Sul – Brasil................. 68
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1 INTRODUÇÃO
A giberela ou fusariose da espiga de cereais é uma doença de importância
econômica mundial, principalmente para a cultura do trigo (Triticum aestivum L.). No
Sul do Brasil, a doença é considerada como re-emergente devido ao aumento na
freqüência de epidemias a partir do início da década de 1990.
Níveis severos da doença afetam a produtividade, causando redução no tamanho
e peso de grãos, assim como danos na qualidade devido ao acúmulo de micotoxinas
sintetizadas pelo fungo durante a patogênese. Nesse sentido, a contaminação de grãos e
subprodutos do trigo com micotoxinas de Fusarium tem atingido níveis preocupantes
em várias regiões do mundo, representando um risco à segurança alimentar humana e
animal em função de suas implicações toxicológicas.
A etiologia da doença é considerada complexa pelo fato de mais de uma espécie
do gênero Fusarium, isolada ou concomitantemente, poder estar associada com os
sintomas típicos da doença, variando em diferentes regiões produtoras no mundo. No
entanto, destaca-se em importância a espécie Fusarium graminearum Schwab. [tel.
Gibberella zeae (Schwabe) Petch.], a qual tem sido sugerida constituir um complexo
(Complexo Fg) devido a evidências de ocorrência de linhagens e, mais recentemente,
em espécies filogenéticas dentro desta espécie, em seu sentido amplo.
As principais classes de micotoxinas produzidas por F. graminearum são a
zearalenona e diversos compostos da classe dos tricotecenos, onde se destacam, em
2
número de estudos, nivalenol (NIV), desoxinivalenol (DON) e seus derivados acetilados
3- e 15- acetildesoxinivalenol (3-ADON e 15-ADON).
A capacidade de identificar o potencial de síntese das micotoxinas por F.
graminearum é de fundamental importância para a segurança alimentar, uma vez que, o
grau de toxicidade varia muito entre estes compostos. Para prevenir e controlar os níveis
de micotoxinas em grãos para consumo, alguns países tem adotado medidas regulatórias
como padronização de níveis de tolerância em alimentos e rações. A contaminação com
DON tem gerado críticas e debate sobre os níveis aceitáveis em alimentos. O nível
recomendado para consumo humano em grãos de trigo varia de 0,5 a 2 ppm nos Estados
Unidos, Canadá e alguns países europeus. Um dos impactos com a regulamentação está
na diminuição do valor pago pela indústria, podendo também ser rejeitado pelo
comércio quando os lotes encontram-se com contaminação acima dos padrões. Diversos
estudos no Brasil tem alertado quanto à presença de toxinas em alimentos derivados de
trigo em níveis eventualmente superiores aos índices recomendados internacionalmente,
mas o país não possui até o momento uma legislação específica para toxinas de
Fusarium.
Além de questões toxicológicas e patogênicas relacionadas com a diversidade
genética de populações do patógeno, estudos taxonômicos recentes tem sugerido a
separação de F. graminearum em linhagens filogenéticas constituindo um complexo
(Complexo Fg). Tais estudos filogenéticos encontram-se mais avançados na América do
Norte, Europa e Ásia. Na América do Sul, especialmente no Brasil, as informações são
ainda incompletas e resultados preliminares sinalizaram para a presença de pelo menos
duas espécies filogenéticas associadas a grãos sintomáticos de trigo, com distinto perfil
toxigênico (Scoz et al., 2009), embora outras linhagens tenham sido previamente
relatadas em outros hospedeiros (Martinelli et al., 2004).
3
O conhecimento da diversidade genética, principalmente quanto ao perfil
toxigênico das populações regionais e as condições que levam à síntese de toxinas por
F. graminearum, são informações críticas para que estratégias de manejo de risco não
desconsiderem os fatores locais associados ao desenvolvimento da doença. Ainda, tal
conhecimento é útil para orientar que toxinas devem ser alvo de monitoramento em
alimentos e ração animal.
No Brasil, populações regionais e locais foram analisadas quanto à presença de
espécies filogenéticas do Complexo Fg (Scoz et al., 2009). Neste trabalho, a detecção
de porções gênicas preditivas da síntese de tricotecenos-B como forma de ampliar o
conhecimento e o entendimento sobre a estrutura e a biodiversidade de populações de F.
graminearum objetivou estabelecer um primeiro e importante passo para a
fundamentação de estratégias de manejo e controle da contaminação de grãos com
micotoxinas.
Com base na sugestão prévia da existência de uma estrutura filogeográfica,
diversidade de quimiotipos e distinta habilidade de causar giberela em trigo em
diferentes regiões produtoras do mundo, hipotetiza-se que populações de isolados de F.
graminearum provenientes de amostragem em dois diferentes níveis de hierarquia
espacial (regional e local) no Estado do Rio Grande do Sul: (1) constituem um
complexo de espécies filogenéticas; (2) possuem diferentes genótipos tricotecenos-B
(duas formas acetiladas de DON e NIV); (3) fazem parte de uma população panmítica
com altos índices de diversidade genética.
Desta forma, os objetivos do trabalho foram: (1) estabelecer uma coleção de
isolados monospóricos representativos de diferentes escalas amostrais (populações
regionais e locais); (2) avaliar a diversidade genética inter e intra-específica a partir da
caracterização molecular de três populações do patógeno; (3) verificar a relação entre
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genótipos tricotecenos e espécies filogenéticas; (4) determinar os padrões de dispersão
de distintos genótipos tricoteceno em duas lavouras comerciais de trigo.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
CAPÍTULO I - A giberela
1.1 Importância da doença
A partir da década de 1990, tem sido mais freqüente o registro de epidemias de
giberela em várias regiões produtoras do mundo (Goswami & Kistler, 2004). Relatada
pela primeira vez em 1884, na Inglaterra (Stack, 2003), a doença foi registrada nas
principais regiões produtoras de cereais do mundo e tem se tornando uma ameaça
crescente para a produção de grãos de trigo e cevada nas Américas do Norte e do Sul,
em alguns países europeus e na Ásia (Bai & Shanner, 1994; Bottalico & Perrone, 2002;
Lori et al., 2003; Clear et al., 2006; Brennan et al., 2007; Suga et al., 2008). No Brasil,
o comportamento é similar, com danos severos na produtividade do trigo em anos de
severa epidemia, com intensidades diferentes conforme a cultivar (Panisson et al.,
2003).
A ressurgência da importância da giberela tem gerado um problema para a
cadeia produtiva de trigo causando impactos na produtividade e no risco à segurança
alimentar, nesse caso, devido ao acúmulo de micotoxinas nocivas à saúde de humanos e
animais. A presença de micotoxinas em grãos giberelados ou mesmo assintomáticos
vem preocupando alguns países, os quais já implementaram medidas regulatórias para
níveis aceitáveis de algumas micotoxinas em grãos e subprodutos para consumo
6
humano e animal (Munkvold, 2003; Xu et al., 2004; Demeke et al., 2005; Brennan et
al., 2007).
1.1.1 Impacto econômico
Na última década, diversos estudos têm apontado conseqüências econômicas
referentes à ocorrência da giberela na cultura de trigo (Windels, 2000; Casa et al., 2004;
Wu, 2007). A doença vem assumindo destacada expressão econômica nos Estados
Unidos e no Canadá, resultando em perdas significativas. O impacto econômico de até
$2,7 bilhões de dólares foi estimado na produção nos Estados Unidos entre as safras de
1998 a 2000 (Ngange et al., 2004) e de até $500 milhões entre as safras de trigo de 1993
e 1998 no Canadá (Windels, 2000). Na China, maior produtor mundial de trigo,
epidemias com 50 a 100% de severidade foram relatadas (Bai & Shaner, 1994). Na
América Latina, a região produtora de trigo da Argentina sofreu alguns surtos
epidêmicos de giberela, sendo o mais importante o ano de 1993 onde as perdas foram
estimadas em cerca de 50% (Dalcero et al., 1997).
No Brasil, quantificações de dano foram realizadas em parcelas experimentais
entre os anos de 1984 e 1994, no Estado do Rio Grande do Sul, sendo que os danos
quantificados apresentaram média de 5,4%, variando entre 0,4 a 14% (Reis et al., 1996).
Panisson et al. (2003) verificaram que os danos na safra de 2000 alcançaram valores
três vezes superiores aos apontados por Reis et al. (1996), onde o dano médio das sete
cultivares de trigo foi de 640 kg.ha-1 ou 17,5%.
Já na safra de trigo de 2001, o dano médio foi de 13,4%, variando de 6,4 a
23,1%, enquanto que, na safra de 2002, o dano médio foi de 11,6%, variando de 3,1 a
20,5% (Casa et al., 2004). Nas duas safras, o dano médio por giberela, nas diferentes
cultivares, foi de 375,3 kg.ha-1 ou 6,26 sacos de trigo/ha (Casa et al., 2004).
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1.1.2 Impactos na produção e qualidade dos cereais
Os cereais constituem a base da alimentação mundial. Em ordem de importância
econômica, o trigo (Triticum aestivum L.) ocupa o primeiro lugar em volume da
produção de cereais de inverno (FAO, 2004). Sua matéria prima é usada para a
confecção de pães, massas alimentícias, bolos e biscoitos e como ração animal, quando
essa não atinge a qualidade exigida para consumo humano (COMISSÃO SUL-
BRASILEIRA DE PESQUISA DE TRIGO, 2005).
A produção brasileira de trigo é de aproximadamente 5 a 6 milhões de toneladas,
onde cerca de 90% da produção está concentrada na região Sul do país (CONAB,
2009).
Os danos causados pela giberela podem ser tanto de cunho quantitativo quanto
qualitativo. O primeiro está relacionado diretamente às perdas econômicas em função
da redução da produtividade e o segundo, engloba danos que incluem a redução no teor
de proteínas nos grãos, a redução do poder germinativo e vigor das sementes, além da
contaminação com toxinas sintetizadas pelo fungo. A causa de danos específicos na
qualidade é difícil de determinar, pois a infecção causa uma gama de eventos
interligados e muitas vezes dependentes um do outro (Wolf-Hall, 2007). Diversas
características de qualidade podem ser influenciadas diretamente pelo ambiente,
genótipo, rotação de culturas e práticas de gestão (Jones & Mirocha, 1999; Mackintosh
et al., 2006; Browne, 2007; Wolf-Hall, 2007).
A maioria dos componentes nutricionais dos grãos encontra-se acumulados no
endosperma da semente. As membranas externas do grão, onde significante parte da
comunidade microbiana está localizada, incluindo agentes patogênicos, consistem
basicamente de celulose, hemicelulose e lignina, contendo pequenas quantidades de
proteína (Olkku et al., 2005). A infecção de F. graminearum em grãos de trigo leva a
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diferenças pronunciadas na composição do grão, aumentando em geral, o nível de
carboidratos solúveis em água assim como a quantidade de ácidos graxos livres. O
crescimento de micélio de F. graminearum impede o transporte de nutrientes ao
endosperma em desenvolvimento e reduz significativamente a produtividade, resultando
na diminuição do número e na redução da massa total de grãos, além da infecção
fúngica aumentar a degradação de amido devido à presença de enzimas como a alfa-
amilase (Mcmullen et al., 1997).
A qualidade do trigo para uso final é determinada por testes específicos de
laboratório. No Brasil, os testes reológicos de alveografia e farinografia descritos por
Guarienti (1993) são os mais utilizados. Alguns parâmetros de qualidade industrial que
usualmente são determinados através destes testes avaliam aspectos como o conteúdo
protéico dos grãos, força de glúten, o peso de mil grãos e as características de moagem e
panificação. Não somente o vigor das sementes é alterado pela infecção por F.
graminearum como também a qualidade da farinha. A perda da funcionalidade das
proteínas envolvidas na qualidade da farinha é atribuída à presença de proteases
fúngicas que influenciam diretamente no potencial de panificação ao enfraquecer a
firmeza do glúten e alterar a textura da massa (Nightingale et al., 1999). Da mesma
forma, as alfa-amilases de F. culmorum assim como as de F. graminearum podem
danificar os grãos de amido resultando na qualidade panificadora insatisfatória destas
farinhas (Wang et al., 2005).
A produção de tricotecenos e zearalenona é provavelmente a conseqüência mais
negativa associada à contaminação de trigo por Fusarium. Muito se conhece sobre os
efeitos deletérios de F. graminearum nos grãos de trigo, destacando o efeito de DON no
refinamento da farinha, onde sua presença reduz consideravelmente a proporção de
gluteninas resultando na perda da qualidade de panificação (Dalcero et al., 1997).
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1.1.3 Levantamentos de ocorrência e padrões de tolerância de micotoxinas
Os poucos estudos e levantamentos feitos no Brasil têm alertado quanto a
presença e concentração de micotoxinas de Fusarium (Geraldo et al., 2006). No Brasil,
amostras de trigo do Estado de São Paulo analisadas para conteúdo de tricotecenos,
apresentaram concentrações de DON entre 0,47-0,59 µg.g-1 para quatro amostras e o
conteúdo de 0,16-0,40 µg.g-1 de NIV em três amostras (Geraldo et al., 2006). Um estudo
posterior demonstrou uma alta freqüência de contaminação de grãos no Brasil para
DON em que 94% (47/50) das amostras de trigo provenientes de diferentes locais do
Sul do Brasil apresentaram níveis variáveis de DON (Calori-Domingues et al., 2007).
Na década de 80, cerca de 60% do trigo europeu apresentava-se contaminado
com DON em níveis variando entre 0,002 a 3,96 µg.g-1 (Gareis et al., 1989). No
Canadá, detectou-se entre 0,005 a 0,74 µg.g-1 de DON e no Japão o nível máximo
detectado foi de 9,18 µg.g-1 de DON em 50-75% das amostras analisadas (Clear et al.,
2005). A ocorrência e os níveis de tricotecenos encontrados em amostras de trigo no
Brasil não parecem ser tão alarmantes quando comparado a dados da Europa, EUA,
Canadá e Japão, embora os escassos e esporádicos estudos no Brasil não permitam
inferir sobre o panorama real.
Em função dos problemas de saúde humana e animal e as implicações
toxicológicas causadas por tricotecenos, alguns países possuem regulamentação para
níveis de tolerância de micotoxinas em alimentos e rações, onde grãos contaminados
implicam numa queda de valor e podem até ser rejeitados pelo comércio (Wang et al.,
2006).
As condições climáticas no Brasil são, de maneira geral, favoráveis ao
desenvolvimento de fungos toxigênicos. Entretanto, apesar da área territorial para a
produção de alimentos no país ser muito extensa, a implantação de padrões nacionais e
10
medidas de fiscalização para o controle de micotoxinas é dificultada. O país não possui
legislação para níveis aceitáveis de tricotecenos em cereais. Porém, a legislação
referente à aflatoxina, também presente em cereais e oleaginosas como o amendoim,
encontra-se harmonizada no Mercosul, abrangendo o Brasil, Argentina, Paraguai e
Uruguai. Na América do Sul, o Uruguai e a Argentina adotam padrões de tolerância
para DON (Furlong et al., 1995).
1.2 Sintomatologia
O sintoma mais aparente e característico para o diagnóstico da giberela é a
descoloração das espigas (Figura 1). O fungo também infecta o pedúnculo logo abaixo
da espiga, causando lesões necróticas marrom-avermelhada no tecido. Indicações
adicionais da infecção por F. graminearum são os esporodóquios, massas de esporos
rosa-alaranjadas do fungo, geralmente vistos nas espiguetas infectadas e glumas caso
expostas ao clima úmido por tempo prolongado. Os grãos de trigo infectados
geralmente perdem a aparência translúcida, aparentando mais opacos. Apresentam-se
chochos, descoloridos e diminutos, entretanto, caso a infecção for tardia no
desenvolvimento dos grãos, estes podem sofrer menor alteração no tamanho, mas
normalmente terão uma aparência rosada (Goswami & Kistler, 2004; Xu et al., 2004).
11
FIGURA 1. Sintoma de giberela em espiga de trigo. Laboratório de Epidemiologia de Plantas – UFRGS,
2009.
1.3. Etiologia
As características etiológicas da giberela conferem com a co-ocorrência ou a
rápida sucessão de várias espécies de Fusarium, usualmente referidas como um
“complexo”. De fato, em algumas regiões, é comum isolar até 9 espécies diferentes de
Fusarium de um fragmento de tecido infectado ou até 17 espécies diferentes de
amostras de trigo numa área limitada (Leslie, 1995). Entretanto, apenas um número
restrito de espécies tem sido reconhecidas como patogênicas e geralmente poucas
predominam em um determinado sistema agroclimático (Miedaner et al., 2004).
As espécies encontradas predominantemente associadas com a giberela do trigo
e outros cereais são Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) Sacc., e Fusarium avenaceum
(Fr.) Sacc. (Gibberella avenacea R.J. Cooke), entre outras espécies menos freqüentes
12
como Fusarium poae (Peck) Wollenw., Fusarium crookwellense L.W. Burgess, P.E.
Nelson & T.A. Toussoun (sin. Fusarium cerealis Cooke), Fusarium equiseti (Corda)
Sacc. (sin. Fusarium scirpi) (Gibberella intricans Wollenw.), Fusarium
sporotrichioides Sherb., e Fusarium tricinctum (Corda) Sacc. Entretanto, em trigo,
Fusarium graminearum e seu teleomorfo Gibberella zeae (Schw.) Petch é considerado
o principal agente causal, representando a espécie prevalente nas regiões produtoras do
Brasil (Angelloti et al., 2006) e em outras regiões produtoras do mundo (Bottalico,
1998; Starkey et al., 2007; Suga et al., 2008).
Atualmente, um estudo englobando representantes de regiões produtoras
distribuídas em todos os continentes revelou a divisão da espécie original denominada
F. graminearum em 13 espécies distintas baseadas na distinção filogenética (O’Donnell
et al., 2000; O’Donnell et al., 2004; Starkey et al.,2007; O’Donnell et al., 2008, Yli-
Mattila et al., 2009). Esta divisão não é aceita por muitos pesquisadores de Fusarium,
porém, o interessante é que determinadas linhagens filogenéticas ocorrem em
hospedeiros específicos, diferentes regiões do mundo ou, certas condições climáticas
(Leslie & Bowden, 2008). Apesar da morfoespécie F. graminearum ser considerada
uma espécie panmítica, ou seja, que possui habilidade de cruzar livremente entre
distintas sub-populações, o reconhecimento de espécies filogenéticas a partir de
concordâncias genealógicas demonstra que o agente causal da giberela compreende na
verdade, de pelo menos 13 espécies filogenéticas diferentes. Detalhes sobre as espécies
filogenéticas do Complexo Fg serão tratados no capítulo 3.
13
1.4 Ciclo da doença e epidemiologia
A giberela é uma doença extremamente dependente das condições ambientais,
principalmente chuvas prolongadas e alta umidade do ar por ocasião da floração e o
desenvolvimento dos grãos na espiga. No campo, a giberela é desencadeada pela adesão
de esporos dispersos no ar nas espiguetas, os quais germinam e entram na planta através
de aberturas naturais na base da lema e da pálea, ou pelos tecidos degenerados da antera
(Pritsch et al., 2000). No início da infecção, o fungo cresce intercelularmente sem
sintomas aparentes (Jansen et al., 2005). A partir do ponto de infecção, o fungo cresce
radialmente, necrosando o tecido colonizado e expressando o sintoma típico da doença,
a descoloração das espiguetas infectadas.
Por se tratar de um ascomiceto, geralmente é encontrado na fase haplóide
durante grande parte do ciclo, persistindo e se multiplicando como saprófito em
resíduos culturais de cereais e palhada de milho (Mcmullen et al., 1997). Desta forma, é
capaz de produzir esporos assexuais, também conhecidos como macroconídios, que são
disseminados pela ação da chuva e do vento. Sob condições ótimas de umidade e
molhamento, o desenvolvimento da fase sexual se deve pela formação de hifas
dicarióticas (binucleadas) capazes de formar corpos de frutificação conhecidos como
peritécios. Estes dão origem às ascas, que abrigam e liberam os esporos sexuais do
fungo, denominados ascósporos. Os ascósporos são carreados pela ação do vento
através da turbulência atmosférica e podem alcançar longas distâncias da fonte de
origem. O mecanismo de expulsão dos ascósporos é revisado por diversos autores (Trail
et al., 2002; Trail et al., 2005; Hallen & Trail, 2008). Nos Estados Unidos, Schmale et
al. (2006a) observaram que populações atmosféricas têm a capacidade de se disseminar
a longa distância, o que contribui para o fluxo gênico entre as populações do patógeno.
14
O transporte de inóculo entre os diferentes locais sugere que o manejo de resíduos na
propriedade podem não ser suficientes para o controle efetivo da giberela (Figura 2).
O desenvolvimento sexual é parte crítica no estabelecimento da doença (Trail,
2009). No campo, os ascósporos são considerados o inóculo primário da doença, que
devido ao curto período de vulnerabilidade à infecção, é considerada monocíclica. As
fontes de inóculo local e regional em abundância nos resíduos vegetais devido à ampla
adoção de práticas conservacionistas e a falta de resistência nas cultivares comerciais
são fatores que incrementam o risco da doença (Del Ponte et al., 2004).
Após a infecção, o fungo possui a capacidade de expressar genes ligados a
síntese de toxinas, principalmente aqueles envolvidos na biossíntese de DON
(desoxinivalenol), um fator de virulência que causa necrose nos tecidos adjacentes a
infecção e permite a evolução do fungo pela raquis, colonizando as espiguetas vizinhas
(Desjardins et al., 1996). A colonização de F. graminearum em grãos é acompanhada
da acumulação de DON e esta relação está elucidada na interação com trigo (Trail,
2009).
Apesar de descrita como uma doença de clima quente e úmido, o fungo pode
crescer em uma ampla gama de temperatura, sendo observado um crescimento rápido
entre 12 e 28ºC (Bai & Shanner, 1996). Os principais fatores que influenciam a
ocorrência e a severidade de epidemias de giberela conferem com temperaturas acima
de 25ºC e molhamento maior que 24 horas (Sutton, 1982). As condições favoráveis para
o desenvolvimento da doença são períodos prolongados (48 a 72h) de alta umidade e
temperaturas variando entre 28 e 30°C. Entretanto, a infecção ocorre a temperaturas
mais amenas quando a umidade persiste por mais de 72h. Infecções precoces podem
contribuir para a produção de esporos, responsáveis pelo inóculo secundário da doença,
especialmente se a cultura tem períodos de florescimento desiguais.
15
Cultivares de trigo são suscetíveis a infecção durante a floração e o enchimento
dos grãos. Uma vez que a giberela depende das condições climáticas desde o
florescimento até o enchimento de grãos, a ocorrência e severidade da doença variam
entre os anos. A combinação de fatores em alguns anos com severas perdas na
qualidade e produtividade dependem da abundância do inóculo, períodos prolongados
de chuva e umidade durante a floração e desenvolvimento de grãos, além do uso de
cultivares suscetíveis (Sutton, 1982; Bai & Shanner, 1996; Brennan et al., 2007).
FIGURA 2. Ciclo da doença. Adaptado de Trail (2009).
Estudos de modelagem sugeriram que o aumento da importância da doença no
Brasil nas últimas décadas, além da ampla adoção do plantio direto, que contribui para
manter os resíduos infectados na superfície, pode estar relacionado com a maior
variabilidade climática a partir da década de 1990, em função da maior freqüência de
16
eventos El Niño que promovem aumento das chuvas no período da primavera (Del
Ponte et al., 2008).
Dentre os fatores epidemiológicos, o conhecimento da estrutura populacional do
patógeno presente em uma região é necessário para responder questões fundamentais
sobre a adaptabilidade do patógeno às novas práticas culturais ou cultivares; mudanças
na sensibilidade dos patógenos aos fungicidas mais utilizados; fluxo gênico entre as
populações; perfil e potencial toxigênico das populações e o risco de dispersão de
variantes genotípicas que sejam mais agressivas ou toxigênicas entre lavouras e regiões
(Gale et al., 2002; Zeller et al., 2003; Cumagun & Miedaner, 2004).
1.5 Estratégias de manejo
Com o objetivo de minimizar o impacto negativo da giberela na produção de
grãos assim como reduzir os níveis de toxinas associadas a esta doença, inúmeras
estratégias de manejo tem sido tomadas desde o planejamento da lavoura até a pós-
colheita. O manejo de risco envolve a adoção de medidas integradas para prevenção da
doença no campo principalmente devido às dificuldades relacionadas com a
descontaminação dos grãos na pós-colheita (Del Ponte et al., 2004). Estratégia que
inclui o uso de cultivares resistentes e aplicação de fungicidas são as mais utilizadas no
controle da giberela (Bai & Shaner, 1994). Na América do Sul, estudos sobre etiologia,
epidemiologia e controle da doença vêm sendo conduzidos na Argentina e no Brasil, os
principais produtores (Reis et al., 1996; Lima et al., 2002; Del Ponte et al., 2004).
Um dos desafios para o manejo satisfatório tem sido a busca de genótipos
resistentes, mas mesmo os novos materiais são insuficientes para evitar epidemias sob
alta pressão de inóculo e ambiente eventualmente favorável (Tamburic-Ilincic et al.,
2006).
17
O controle químico da giberela por aplicações de fungicidas geralmente tem
moderada eficiência. Um estudo recente de meta análise de resultados de centenas de
ensaios conduzidos nos Estados Unidos apontou uma significativa redução no índice de
giberela no campo, entretanto observou-se uma variabilidade no efeito de diferentes
compostos. O uso de protioconazol+tebuconazol (52%) foi mais eficaz na redução da
doença no campo, seguido de metconazol (50%), protioconazol (48%), tebuconazol
(40%) e propiconazol (32%). Contudo, a redução da micotoxina DON associada ao uso
de fungicidas não alcançou níveis satisfatórios sob condições ótimas para a expressão
da doença como a alta densidade de inóculo, umidade prolongada, altas temperaturas e
cultivares suscetíveis. Entretanto, neste caso, o fungicida mais eficiente na redução de
DON (desoxinivalenol) foi o metconazol (45%) (Paul et al., 2008).
Um dos fatores que contribui para a redução da eficiência relativa de controle
por fungicidas comparado com outras doenças é tecnologia de aplicação, que deve
promover uma boa cobertura dos tecidos da espiga no momento ideal, de forma a
protegê-las antes de uma situação de alto risco de infecção. Para auxiliar na tomada de
decisão quanto ao momento ideal de aplicação, modelos epidemiológicos de risco têm
sido desenvolvidos e implementados em sistemas de previsões de larga escala a fim de
alertar para situações de risco utilizando previsões de tempo e clima (Del Ponte et al.,
2004).
O conhecimento básico sobre a estrutura e variabilidade populacional do fungo
é, dentre os fatores de risco, o menos explorado, mas de suma importância na definição
de estratégias de manejo como melhoramento para a resistência e controle químico.
Uma vez que isolados de diferentes perfis toxigênicos presentes nas populações podem
ter variada virulência no hospedeiro ou sensibilidade à fungicidas além das questões de
implicações toxicológicas para a população consumidora.
18
CAPÍTULO II - Potencial toxigênico de Fusarium graminearum
Fungos patogênicos sempre tiveram sua importância relacionada com os danos
causados à produtividade de commodities agrícolas e as doenças em animais. No
entanto, o maior interesse científico pelo caráter toxigênico dos fungos teve início a
partir da segunda metade do século XX, com a demonstração de que metabólitos
secundários de fungos induziam câncer e doenças hepáticas em animais. Dentre os
gêneros de fungos que mais afetam a produção agrícola e a saúde animal, destaca-se o
gênero Fusarium, fungo cosmopolita capaz de produzir em cereais uma ampla gama de
metabólitos secundários tóxicos, encontrados freqüentemente em rações e alimentos.
Entre os metabólitos produzidos por Fusarium, destaca-se, além de zearalenona e
fumonisinas, a classe de tricotecenos, compostos sintetizados por F. graminearum
responsáveis por uma gama de micotoxicoses que acometem humanos e animais numa
escala global (Bryden, 2007).
2.1 Biossíntese e estrutura de tricotecenos
A principal classe de micotoxinas produzidas por Fusarium graminearum é
representada por tricotecenos, metabólitos secundários que atuam como potentes
inibidores da síntese protéica em eucariotos, podendo causar sérias toxicoses em
humanos e animais. Os tricotecenos possuem uma estrutura básica sesquiterpenóide e
podem ser divididos em classes do tipo A, B, C e D, dependendo da presença ou
ausência de grupos funcionais característicos (Krska et al., 2001). Os principais
tricotecenos sintetizados por F. graminearum pertencem ao tipo B, que contém um
ceto-grupo na posição C8 do anel sesquiterpenóide (Snijders, 1990). Dentre estes,
destacam-se as toxinas Desoxinivalenol (DON), que pode ainda possuir um derivado
acetil-éster na posição 15 do oxigênio (15-ADON) e um na posição 3 do oxigênio (3-
19
ADON), e Nivalenol (NIV), um derivado oxigenado C-4 de DON (Desjardins et al.,
1993).
Os tricotecenos são formados a partir de uma molécula sesquiterpenóide (15
carbonos) denominada farnesil-pirofosfato. A biossíntese de tricotecenos decorre desta
molécula por intermediário de tricodieno, considerado o precursor dos tricotecenos.
Desta forma, a síntese de tricotecenos compreende a ciclização do anel sesquiterpeno
catalizada pela enzima tricodieno sintase, seguida de oito oxigenações e quatro
esterificações (Desjardins & Proctor, 2007). A seqüência de oxigenações,
isomerizações, ciclizações e esterificações levam a molécula básica tricodieno a formar
complexas estruturas de tricotecenos tais como diacetoxiscirpenol (DAS), toxina T-2,
desoxinivalenol e nivalenol (Goswami & Kistler, 2004) (Figura 3).
FIGURA 3. Estrutura de tricotecenos tipo A e B. Exemplos do Tipo A compreendem a toxina T-2 e HT-2,
diacetoxiscirpenol (4,15-DAS) enquanto que o Tipo B compreende nivalenol (NIV),
desoxinivalenol (DON), 3-O-acetil DON (3-ADON) e 15-O-acetil DON (15-ADON). Fonte:
(Foroud & Eudes, 2009).
Esta rota metabólica requer a expressão de uma proteína transportadora e uma
rede intrincada de genes regulatórios. Tanto a rota metabólica quanto os genes
envolvidos nela foram mapeados em 4 loci no genoma de F. graminearum. A enzima
tricodieno sintase (TRI5) é a primeira a ser clonada e constitui o centro topográfico de
um cluster de 25 Kb de 12 genes co-regulados (Kimura et al., 2007) (Figura 04). Este
20
cluster contém um núcleo central de genes envolvidos na biossíntese da estrutura básica
dos tricotecenos (genes Tri4 e Tri5) e os genes flanqueadores geralmente são
responsáveis pelas diferenças estruturais entre os diferentes quimiotipos desta classe de
toxinas (genes Tri3 e Tri13). Estudos de perda de função destes genes indicaram que 10
deles são requeridos para a biossíntese de tricotecenos. Adjacente ao gene Tri5
encontra-se os genes regulatórios Tri6 e Tri10. A ruptura de qualquer um desses genes
resulta na redução completa da síntese de tricotecenos. O produto do gene Tri6 pertence
a uma classe de proteínas zinc-finger, a qual regula a transcrição da maioria dos genes
envolvidos na síntese de tricotecenos, sendo regulado pelo produto de Tri10. O cluster
TRI5 também contem o gene Tri12, que codifica enzimas que catalizam as oxigenações
de C-1, C-3, C-12,13 (Tri4) a C-15 (Tri11) e C-4 (Tri13); e outros três genes: Tri3, Tri7
e Tri8, que codificam enzimas que adicionam ou removem ésteres (Goswami & Kistler,
2004).
Apesar da maioria dos genes codificantes da via metabólica dos tricotecenos
estarem fortemente ligados ao cluster TRI5, genes adicionais foram localizados em
outros loci do genoma de F. graminearum (Tri1, Tri101, etc) (Mccormick et al., 1996;
Mccormick et al., 2004; Kimura et al., 2007).
Genes encontrados nas extremidades do cluster TRI5 estão envolvidos
fortemente na biossíntese de quimiotipos específicos, codificando proteínas envolvidas
na determinação das diferenças entre estes. Isso é observado na síntese da 15-O-acetil-
transferase pelo gene Tri3, que aparenta ser essencial na formação do quimiotipo 15-
ADON (Mccormick et al., 1996). Em contraste, o gene Tri13 codifica uma oxigenase
que hidroxila o C-4 e resulta na toxina nivalenol (Lee et al., 2002). Tanto os
quimiotipos 15-ADON quanto 3-ADON possuem um pseudogene não funcional Tri13
consistente com a incapacidade de produzir nivalenol (Kimura et al., 2003). Da mesma
21
forma, o gene Tri7 não é funcional nos quimiotipos DON encontrado como um
pseudogene em 15-ADON e deletado em 3-ADON (Kimura et al., 2003).
FIGURA 4. Diagrama do cluster gênico Tri5 da biossíntese dos tricotecenos de uma cepa de Fusarium
graminearum produtora de nivalenol. Caixas indicam a posição relativa dos genes no cluster.
Em isolados 15-ADON, tanto Tri7 quanto Tri13 são pseudogenes. Em isolados 3-ADON, Tri8
e Tri13 são pseudogenes e Tri7 é deletado. Abaixo da representação do cluster, exibe-se uma
legenda apontando a função chave de cada gene. Adaptado de: Goswami & Kistler (2004).
2.2 Implicações toxicológicas
Evidências históricas associam epidemias em humanos com o consumo de grãos
contaminados com tricotecenos. No Japão, surtos de toxicoses foram associados ao
consumo de grãos infectados com F. graminearum, o caso akakabi-byo. Esses
ocorreram principalmente nos anos de 1890, 1901, 1914, 1920 e 1923; com nova
incidência após 1945. Os sintomas clínicos desta toxicose incluíam náusea, vômito,
diarréia, tontura e alucinações. Sintomas similares foram observados na Rússia e outras
regiões da Ásia como China e Coréia, em pacientes que consumiram pão feito com
farinha de grãos contaminados por Fusarium. As enfermidades são raramente letais e
tricotecenos como DON e NIV são evidenciados como principais agentes causais de
akakabi-byo e síndromes relacionadas à ingestão de farinhas contaminadas (Desjardins
22
et al., 2006). Além disso, DON e seus derivados são responsáveis por até 35 toxicoses
nas áreas rurais da Índia, China e Japão em 1961 (Ehling et al., 1998).
DON e NIV podem ocorrer concomitantemente, com valores acima dos
aceitáveis, em algumas regiões de produção de cereais. Quanto às implicações
toxicológicas, as espécies animais como suínos e aves apresentaram sensibilidade aos
tricotecenos. Diversos sintomas são atribuídos a contaminação com estas toxinas,
diferindo entre as espécies animais afetadas, entre os níveis de contaminação e as vias
de exposição (Snijders, 1990; Bryden, 2007; Wolf-Hall, 2007). Em experimentos com
baixa dosagem de tricotecenos, foi possível reproduzir sintomas característicos de
animais acometidos de toxicoses referentes à ingestão de grãos contaminados por
fungos, tais como imunosupressão, anemia, hemorragia e recusa alimentar em porcos e
aves (Wu, 2007). Além disso, estudos de nutrição animal sugeriram que os tricotecenos
possuem um caráter teratogênico, mas não carcinogênico (Bottalico, 1998). DON é
também conhecido como vomitoxina, responsável por sintomas como recusa alimentar,
diarréia, vômito, hemorragia e dermatite de contato em animais. Em humanos, o
decréscimo na taxa de leucócitos, náusea, vômito, anorexia e convulsões estão
relacionados a contaminações por F. graminearum (Desjardins et al., 1993; Ehling et
al., 1998; Bryden, 2007).
Devido ao potencial de risco que as micotoxinas podem exercer sobre a saúde
humana e animal, com relevante destaque dos tricotecenos, surge a necessidade de
discutir e regulamentar os níveis aceitáveis de toxinas, assim como, desenvolver
estratégias de detoxificação e redução da concentração de micotoxinas em grãos, que
constituem a base da alimentação humana e ração animal. Muitos países adotam
regulamentações de níveis de tolerância, principalmente para as aflatoxinas (FAO,
2004). Alguns dos regulamentos têm forma de lei e outros são de caráter consultivo ou
23
de recomendação. Infelizmente, apenas alguns países possuem regulamentação para
níveis de tolerância para tricotecenos em alimentos e rações, com o objetivo de prevenir
sua entrada na cadeia alimentar.
2.3 Detecção do perfil toxigênico de Fusarium graminearum
Do ponto de vista toxigênico, determinou-se a quimiotaxonomia de F.
graminearum de forma que os isolados são classificados em quimiotipos, conforme o
tricoteceno que produzem via detecção por análise química (Ichinoe et al., 1983). Os
quimiotipos tricotecenos comumente encontrados nessa espécie são DON
(desoxinivalenol) e NIV (nivalenol). Quimiotipos DON podem ainda ser classificados
em 3-ADON e 15-ADON, em função da posição do derivado acetil-éster do oxigênio,
C-3 ou C-15, respectivamente. O quimiotipo nivalenol (NIV) é um derivado oxigenado
C-4 de DON (Desjardins et al., 1993; Goswami et al., 2006).
Classicamente, a quimiotipagem consiste na caracterização de uma ou mais
toxinas produzidas in vitro ou in vivo pelo fungo por meio de métodos cromatográficos
(Ramirez et al., 2006). Uma variedade de métodos cromatográficos têm sido utilizados
para a determinação de tricotecenos, incluindo técnicas como TLC (thin-layer
chromatography), HPLC (high-performance liquid chromatography) e GC (gas
chromatography) (Krska & Molinelli, 2007). Durante os últimos anos, a detecção por
métodos imunológicos também tem sido feita (Schneider et al., 2004; Deng et al.,
2006). Porém, a determinação baseada em GC associada a métodos como a captura de
elétrons (ECD) ou espectrometria de massa (MS) são os métodos mais utilizados
(Schollenberger et al., 1998; Sagawa et al., 2006; Krska & Molinelli, 2007).
Com o avanço recente nos métodos moleculares para identificar e caracterizar o
cluster gênico da biossíntese de tricotecenos (Lee et al., 2001; Ward et al., 2002),
24
oligonucleotídeos iniciadores tem sido usados como preditores dos quimiotipos pela
reação em cadeia da polimerase (PCR) (Lee et al., 2001; Jurado et al., 2005; Li et al.,
2005; Sarlin et al., 2006). Diversos trabalhos desenvolveram ensaios de PCR baseados
nas seqüências Tri3, Tri5 e Tri7 que permitiram classificar consecutivamente os
isolados em NIV, 3-ADON e 15-ADON, analisando populações de diversas regiões da
Europa (Jennings, 2004; Quarta et al., 2006). Da mesma forma, um ensaio de PCR
baseado nas seqüências dos genes Tri7 e Tri13 permite distinguir acuradamente os
quimiotipos DON de NIV para F. graminearum, F. culmorum and F. cerealis (Chandler
et al., 2003).
2.4 Distribuição mundial de genótipos tricoteceno-B de Fusarium
graminearum
Com a disponibilidade de métodos rápidos como os baseados em PCR, uma
série de trabalhos tem sido feitas nos últimos anos com o objetivo de mapear a
distribuição mundial dos quimiotipos de F. graminearum. A capacidade de
identificação dos diferentes tricotecenos potencialmente sintetizados por F.
graminearum ao redor do globo, é uma informação importante para orientar estratégias
de melhoramento vegetal que visam a resistência aos patógenos e o acúmulo de toxinas
(Konietzny & Greiner, 2003; Logrieco et al., 2003; Tóth et al., 2005). Da mesma forma,
associar as distintas espécies filogenéticas nas regiões produtoras do mundo ao seu
potencial toxigênico permite o monitoramento da mudança do perfil populacional do
patógeno em relação a síntese de diferentes toxinas (Qu et al., 2008b). De maneira
geral, os quimiotipos DON e NIV parecem não estar distribuídos de maneira uniforme
nas zonas climáticas do mundo como a Europa (Waalwijk et al., 2003; Gagkaeva & Yli-
Mattila, 2004; Jennings, 2004; Láday et al., 2004; Tóth et al., 2005), Ásia (Gale et al.,
25
2002; Ji et al., 2007; Zhang et al., 2007; Suga et al., 2008; Yang et al., 2008) e América
do Norte (Gale et al., 2007; Ward et al., 2008). A seguir, serão destacados numa escala
mundial, os principais estudos de detecção de tricotecenos sintetizados por populações
de Fusarium graminearum (Complexo Fg), nas regiões produtoras de grãos nos últimos
anos.
2.4.1 Europa
O monitoramento de toxinas em grãos produzidos no continente europeu aponta
que ambos quimiotipos DON e NIV estão presentes em diversos países, entre eles, a
Alemanha (Muthomi et al., 2000), a Holanda e Itália (Gang et al., 1998), Noruega
(Langseth et al., 1999) e França (Bakan et al., 2001).
Ambos quimiotipos NIV e DON e suas formas acetiladas 3-ADON e 15-ADON,
foram encontrados em isolados de F. graminearum na Europa (Qu et al., 2008a). O
quimiotipo DON prevalecia na porção central, predominando a forma acetilada
DON/15-ADON (Ward et al., 2002; Tóth et al., 2005). Em contraste, na porção norte
foram observados exclusivamente quimiotipos DON/3-ADON (Langseth et al., 1999).
O mesmo foi observado para isolados de F. graminearum da porção européia da Rússia,
onde 43 de 46 isolados pertenciam ao quimiotipo DON/15-ADON enquanto que os
isolados da Finlândia, num total de 40 indivíduos, foram exclusivamente produtores de
DON/3-ADON (Yli-Mattila et al., 2009).
A co-ocorrência dos quimiotipo NIV, 3-ADON e 15-ADON foi relatada na
Inglaterra, onde se observou 95% de prevalência do quimiotipo 15-ADON entre 1997-
2002, sendo encontrado também o quimiotipo NIV distribuído na região oeste e
sudoeste da Inglaterra (Jennings, 2004).
26
2.4.2 Ásia
Resultados de inúmeras pesquisas demonstram o potencial toxigênico de
espécies relacionadas com a indução da giberela no continente asiático. Diferenças entre
a distribuição geográfica dos quimiotipos e a preferência por hospedeiros estão
relacionadas com a freqüência das espécies filogenéticas encontradas neste continente.
Desta forma, isolados de F. graminearum (anteriormente conhecido linhagem 7 sensu
O´Donnell et al. (2000)) recuperados a partir de milho entre 1999-2001 no norte da
província de Gangwon, Coréia do Sul, foram exclusivamente produtores de DON,
enquanto que, isolados da espécie filogenética F. asiaticum (anteriormente conhecido
linhagem 6 sensu O´Donnell et al. (2000)), isolados de arroz nas províncias do sul da
Coréia do Sul, produziam quase que exclusivamente a toxina NIV (97%) (Lee et al.,
2004). Trabalhos apontando freqüências semelhantes foram relatados por Gale et al.
(2002), Zhang et al. (2007), Yang et al. (2008) na China e por Suga et al. (2008) no
Japão.
A população chinesa de F. graminearum em trigo e cevada é capaz de produzir
15-ADON predominantemente ou exclusivamente, em contraste com as populações de
F. asiaticum, que produzem predominantemente 3-ADON ou NIV, dependendo da
região produtora (Yang et al., 2008). Da mesma forma, no Japão, isolados de F.
asiaticum e F. graminearum, respectivamente, produziam NIV e 3-ADON (Suga et al.,
2008).
Da mesma forma, ao avaliar a presença de tricotecenos em amostras de um
campo experimental em Kumanoto, Japão, de um total de 183 isolados, 80 eram
produtores de NIV (44%) e 103 eram produtores de 3-ADON (56%). Neste experimento
não foi detectado o quimiotipo 15-ADON (Karugia et al., 2009).
27
Na China, um grande número de isolados de F. graminearum representando
todas as regiões produtoras de trigo foi analisado quanto ao potencial de produzir
tricotecenos. De 299 isolados analisados, 231 produziram DON e NIV, sendo que a
forma acetilada DON/3-ADON prevaleceu entre as regiões (Zhang et al., 2007). Neste
mesmo país, um estudo recente apontou a maior freqüência de genótipos DON/15-
ADON associados ao trigo e do genótipo DON/3-ADON associado a cevada (Ji et al.,
2007).
2.4.3 América do Norte
Inúmeros trabalhos apontam o potencial toxigênico de populações de F.
graminearum na América do Norte (Gale et al., 2007; Ward et al., 2008).
Nos EUA, 95% (104/110) dos isolados de populações atmosféricas de F.
graminearum no estado de Nova Iorque eram do quimiotipo 15-ADON e 4%
correspondiam ao genótipo DON/3-ADON (Schmale et al., 2005). O genótipo NIV não
foi observado nestas populações. No Estado de Louisiana, a prevalência do quimiotipo
NIV de populações recuperadas de espigas sintomáticas contrasta drasticamente com a
situação nas outras regiões americanas, predominantemente compostas por quimiotipos
DON forma acetilada 15-ADON (Gale et al., 2007).
No meio-oeste americano, populações de F. graminearum do genótipo DON/3-
ADON apresentava-se mais freqüente e esta situação vem progredindo gradativamente
durante os anos (Gale et al., 2007). O mesmo é observado em populações canadenses
apontando a predominância deste quimiotipo em diversas regiões (Guo et al., 2008).
Desta forma, Ward et al. (2008) ao monitorar a presença dos distintos quimiotipos entre
os anos de 1984 e 2004 no Canadá, aponta significativa mudança na freqüência do
28
quimiotipo 3-ADON, com pronunciado aumento nos períodos de 1998, 2000-2001 e
2004.
Para contrastar com a hipótese de predominância de quimiotipos em algumas
regiões, como o 15-ADON na América do Norte e o 3-ADON em algumas áreas da
Ásia, na Austrália e Nova Zelândia (Li et al., 2005; Akinsanmi et al., 2006; Schmale et
al., 2006a), as mudanças no perfil toxigênico das populações de F. graminearum que
tem sido verificadas recentemente com o monitoramento ao longo dos anos, podem
estar ocorrendo em função da adaptabilidade do patógeno às práticas de manejo e clima
devido à ampla variabilidade genética do fungo (Ward et al., 2008).
2.4.4 América do Sul
Na América do Sul, populações de F. graminearum em uma região produtora de
trigo da Argentina apresentaram predominância do quimiotipo DON, com alguns
representantes produzindo 3-ADON, não sendo encontrados os tipos 15-ADON e NIV
por meio de análises cromatográficas (Ramirez et al., 2006). Neste país, são
freqüentemente encontradas outras espécies, além de F. graminearum, potencialmente
produtoras de tricotecenos e outras toxinas, possivelmente relacionado com as
diferentes condições climáticas como o clima temperado (Lori et al., 2003). Entretanto,
em um estudo recente, foi detectado pela primeira vez em amostras de trigo afetadas por
giberela em 2001 e 2002, o quimiotipo nivalenol (13/33) (Pinto et al., 2008).
No Brasil, o monitoramento do perfil toxigênico de F. graminearum é escasso,
com informação baseada na análise de toxinas em amostras de grãos com a detecção por
métodos cromatográficos. Furlong et al. (1995) avaliaram amostras de grãos de trigo do
estado de São Paulo e averiguaram que as amostras contaminadas com micotoxinas de
Fusarium, ocorrendo as toxinas DON e NIV concomitantemente na mesma amostra,
29
apresentando níveis que variaram de 400 a 580 µg/kg. Geraldo et al. avaliaram a
produção in vitro de micotoxinas em 24 diferentes isolados de F. graminearum
coletados de grãos de trigo, triticale e cevada afetados pela fusariose na região Sul do
Brasil e verificaram que 33% dos isolados produziram DON. A contaminação com
DON foi avaliada também por Calori-Domingues et al. (2007) em 100 amostras de
trigo, sendo 50 de trigo nacional. As amostras foram coletadas entre maio e dezembro
de 2005 indicando que, do total de amostras avaliadas, 94% do trigo nacional foram
positivas quanto a presença de DON e os níveis médios de contaminação (332 µg/kg)
foram maiores do que do trigo importado (90 µg/kg). Apenas 2 amostras (4%) do trigo
nacional apresentaram níveis de contaminação maiores que 1.250 µg/kg, teor máximo
aceitável pela Comunidade Européia.
Um estudo recente com uma amostra de 82 isolados de F. graminearum obtidos
de amostras de grãos de trigo sintomáticos da Região Sul do país, demonstrou, usando
métodos moleculares, a predominância de isolados 15-ADON, não sendo detectado o
tipo 3-ADON. Isolados NIV foram detectados em 6 indivíduos obtidos de amostras de
distintos locais, distribuídos de maneira aleatória e em co-ocorrência com o tipo DON/
15-ADON na mesma amostra (Scoz et al., 2009).
2.5 Quimiotipos e patogenicidade
Naturalmente existe variação genética que leva a diferenças de agressividade
entre isolados de Fusarium. Essas diferenças podem ser atribuídas ao fitness do
patógeno sugerindo que fatores de agressividade contribuem para o desenvolvimento da
doença. Em um estudo de patogenicidade, a perda da capacidade de um isolado em
produzir tricotecenos não prejudicou, por exemplo, a habilidade de infectar trigo e
milho, mas afetou negativamente o processo de colonização (Desjardins et al., 1996).
30
Levantou-se então a hipótese de que tricotecenos não são fatores de patogenicidade,
mas sim, desempenham um papel como fatores de virulência. Diferentes quimiotipos de
tricotecenos tem sido descritos para F. graminearum, mas, até o momento, não está bem
elucidada a relação entre o quimiotipo e a patogenicidade de F. graminearum sobre
diferentes hospedeiros assim como a relação entre a diversidade genética das
populações e o desenvolvimento da doença.
A capacidade de identificação e relação entre os diferentes tricotecenos e
espécies de Fusarium é de fundamental importância, uma vez que o grau de toxicidade
varia grandemente entre estes compostos. O potencial de diferentes isolados de F.
graminearum em produzir diferentes tricotecenos é fundamental ao tentar relacionar o
acúmulo de toxinas com fatores ambientais em função do desenvolvimento da giberela.
A freqüência relativa de DON e NIV é importante uma vez que, o grau de toxicidade
destes compostos varia. Estudos apontaram que isolados produtores de NIV foram mais
agressivos em milho, mas menos agressivo que DON em trigo (Carter et al., 2002).
Estes resultados indicam haver uma diferenciação no fitness e agressividade do
patógeno de diferentes quimiotipos em hospedeiros particulares, revelando uma
vantagem competitiva para alguns quimiotipos. Entretanto, mais estudos são necessários
para caracterizar as relações entre diversidade genética, quimiotipos e virulência de
populações do complexo F. graminearum.
31
CAPÍTULO III – Taxonomia Molecular e Genética Populacional de Fusarium graminearum
3.1 Conceitos de espécie
Espécies de fungos podem ser definidas de acordo com conceitos baseados na
morfologia, ecologia, biologia ou filogenia. No caso de F. graminearum, todos estes
conceitos têm sido aplicados de modo a estabelecer os limites da determinação de
espécie (Taylor et al.,2000).
Representantes do gênero Fusarium foram inicialmente separados em função de
características morfológicas. A utilização deste “conceito morfológico” foi proposta por
Link em 1809 para classificar as espécies de Fusarium, ainda aceito atualmente (Leslie
& Summerell, 2006). O conceito de espécie morfológica é o mais utilizado ao longo da
história por ser uma forma simples e prática de caracterização e identificação de
espécies. No entanto, conforme tem se ampliado o conhecimento sobre as populações,
nem sempre o marcador morfológico se aplica às diferentes espécies, que são melhor
definidas por outros critérios de classificação (Nicholson et al., 2003). Além disso, a
percepção dos caracteres morfológicos depende do treinamento do observador e de
condições específicas de crescimento das culturas.
A utilização de caracteres morfológicos distintos como forma de classificação
ainda preconiza a identificação de espécies, entretanto, existem situações em que apenas
características fenotípicas não são suficientes para separar indivíduos distintos. Desta
forma, o “Conceito de Espécie Biológica” se torna uma alternativa de distinção. A
definição de espécie biológica caracteriza uma população composta de indivíduos
capazes de produzir cruzamentos férteis entre si ou que tenham potencial para tal,
compartilhando o mesmo material genético (Leslie et al., 2001). Estes, por sua vez, não
produzem cruzamentos férteis com membros de outra espécie biológica. Desta forma,
32
em populações de Fusarium onde ocorre a reprodução sexuada, determina-se este
conceito a partir de grupos de acasalamento (mating-types). Porém, por se tratar de um
ascomiceto, este gênero possui alta freqüência na reprodução assexuada e nem sempre a
fase perfeita (reprodução sexuada) é encontrada (Yun et al., 2000).
Outra forma de classificação tem base na capacidade de indivíduos semelhantes
de colonizar o mesmo nicho ou habitat. O Conceito de “Espécie Ecológica” deriva do
Conceito de Espécie Biológica e implica em diversos fatores de pressão de seleção
exercidos pelo ambiente. Desta forma, se recorre a conceitos de formae specialis,
caracterizando o patógeno de acordo com a família ou espécie de planta que ele é capaz
de infectar (Taylor et al., 2000; Leslie et al., 2001).
O conceito mais recentemente utilizado na classificação de espécies é o de
“Espécie Filogenética”. Este conceito compreende um grupo de indivíduos que
compartilham a mesma tendência evolutiva e uma origem em comum (ancestral), ou
seja, é sempre um grupo monofilético, também chamado de clado. Neste conceito,
variantes na seqüência de DNA conservada são utilizados para rastrear linhagens entre
um grande número de isolados (Leslie et al., 2001). O conceito mais abrangente no
reconhecimento de espécies filogenéticas é descrito como Genealogical Concordance
Phylogenetic Species Recognition (GCPSR), no qual a genealogia é traçada com base na
comparação de mais de um gene (Taylor et al., 2000).
A identificação e caracterização de espécies do gênero Fusarium ainda está em
progresso. No momento, muitas das espécies morfológicas são aceitas e poucas
descrições existentes têm sido rigorosamente desafiadas com ferramentas usadas para
delimitar conceitos biológicos de filogenéticos, ficando em aberto a questão da
integridade morfológica (Skovgaard et al., 2003).
33
Referentes à F. graminearum, ambos os conceitos vem sendo inferidos e a
distinção do nível de espécie não é tão simples neste caso. Considerada uma morfo-
espécie, F. graminearum não é distinguível de F. pseudograminearum, do ponto de
vista morfológico. Inicialmente estas populações foram classificadas em dois grupos
ecológicos (Grupo II e Grupo I) de F. graminearum em função da capacidade de
induzir, respectivamente, giberela da espiga ou podridão do colmo (Francis & Burgess,
1977). Mais tarde, estes foram formalmente divididos em espécies distintas, baseados
em conceitos biológicos (respectivamente, homotálicos e heterotálicos) e através de
relações filogenéticas (Aoki & O’Donnell, 1999). A distinção destas espécies está
consolidada e é aceita pela comunidade científica.
Outra questão quanto à classificação de F. graminearum é se este pode ser
subdividido, uma vez que, se observa grande diversidade intra-especifica. Uma forma
de acessar esta informação é pelo conceito de Espécie Filogenética (Taylor et al., 2000;
O’Donnell et al., 2000; O’Donnell et al., 2004; Starkey et al., 2007). Ao reconstruir a
filogenia de F. graminearum pela análise conjunta de 11 genes de vários locos no
genoma, O’Donnell et al. (2004) propôs a subdivisão da espécie biológica G. zeae em
nove grupos filogenéticos, sugerindo novas linhagens filogeográficas. Inicialmente a
descrição de espécie incluía a análise do polimorfismo para cada espécie, mas a
descrição mais recente agrupa as espécies filogenéticas ao calcular a identidade das
seqüências de diversos genes neutros, onde a concordância da seqüência de diferentes
genes é capaz de classificar isolados em um grupo semelhante. Desta forma, Starkey et
al. (2007) propuseram a denominação de mais duas espécies. Pouco tempo depois,
O’Donnell et al. (2008), sugeriram que 22 isolados da Etiópia analisados através da
genotipagem multilocus (MLGT) pertenciam a uma nova espécie filogenética, assim
como Yli-Mattila et al. (2009) apontam uma nova espécie filogenética pertencente ao
34
clado de F. asiaticum. Estes estudos totalizaram a classificação de 13 espécies
recentemente descritas como espécies filogenéticas do complexo F. graminearum (Fg),
muitas vezes referenciadas como linhagens do Complexo Fg (Tabela 1).
TABELA 1. Espécies filogenéticas do Complexo Fusarium graminearum.
Espécie Filogenética Linhagens* Geografia** Referência
F. austroamericanum
F. meridionale
F. boothii
F. mesoamericanum
F. acaciae-mearnsii
F. asiaticum
F. graminearum
F. cortaderiae
F. brasilicum
F. vorosii
F. gerlachii
F. aethiopicum
F. ussurianum
01
02
03
04
05
06
07
08
09
Hemisfério Sul
Hemisfério Norte e Sul
Hemisfério Norte e Sul
Hemisfério Norte
Hemisfério Sul
Hemisfério Norte e Sul
Hemisfério Norte e Sul
Hemisfério Sul
Hemisfério Sul
Hemisfério Norte
Hemisfério Norte
Hemisfério Norte
Hemisfério Norte
O’Donnell et al. (2004)
Starkey et al. (2007)
O’Donnell et al. (2008)
Yli-Mattila et al. (2009)
*Linhagens propostas por O´Donnell et al. (2000). **Distribuição geográfica dos isolados analisados.
Entretanto, Leslie et al. (2007) aponta que a genealogia de genes individuais
nem sempre é suficiente para identificar uma espécie. Um exemplo disso é o cluster
gênico dos tricotecenos, que não é consistente com a distribuição de espécies proposta
para F. graminearum (Ward et al., 2002). Nesse sentido, a validade da delimitação
destas espécies filogenéticas tem sido questionada, uma vez que existe a possibilidade
de algumas linhagens representarem populações geneticamente distintas do que
propriamente diferentes espécies (Zeller et al., 2004), além de ter sido observado o
cruzamento fértil entre diferentes linhagens, o que refuta o conceito biológico (Bowden
35
& Leslie, 1999). Devido a esta taxonomia não tão bem definida e controversa, gera o
estímulo de analisar populações de F. graminearum quanto à relação de
linhagens/espécies filogenéticas. Para isto, diversas ferramentas moleculares são
utilizadas para analisar a diversidade genética em populações de F. graminearum.
Dentre as técnicas, pode-se incluir a análise com marcadores moleculares RFLP
(restriction fragment lenght polymorphisms), mini e microssatélites e marcadores AFLP
(amplified fragment lenght polymorphisms) (Suga et al., 2008; Zeller et al., 2004,
Schmale et al. 2006a).
Marcadores AFLP possuem a vantagem de acessar o genoma como um todo na
busca de diferenças capazes de delimitar as diferentes espécies, porém, se tratando de
um marcador dominante, nem sempre é uma ferramenta utilizada como marcador
filogenético. Ferramenta adequada para caracterizar grupos distintos, os marcadores
AFLP são muito utilizados para determinar relações genéticas entre diferentes isolados
pertencentes à mesma espécie, os quais foi sugerido compartilhar mais de 60% de
similaridade, enquanto que espécies diferentes dividem menos de 40% (Leslie et al.,
2005).
3.2 Estrutura populacional
Uma população é definida como um grupo de indivíduos originados de uma área
limitada, partilhando de características genéticas em comum (Taylor et al., 1999). Desta
forma, a genética populacional é resultado de todos os processos evolucionários que
influenciam diretamente a população (Taylor et al., 1999). Taxas de recombinação,
fluxo gênico e mutações aumentam a variabilidade genética assim como reduzem a
deriva gênica entre os indivíduos. Conhecer a natureza da variabilidade genética em
níveis populacionais e sua associação com fenótipos é uma forma de predizer o
36
potencial evolucionário destes patógenos em mecanismos de patogenicidade e síntese
de toxinas.
Importantes avanços têm sido observados em estudos de ecologia e biologia
molecular de F. graminearum onde a diversidade genética foi avaliada com vários
marcadores moleculares de AFLP (Zeller et al., 2004, Schmale et al. 2006), RAPDs
(Fernando et al., 2006) e RFLPs (Gale et al., 2005; Tóth et al., 2005). Estudos de
genética populacional tem sido vislumbrados como importantes para fornecer as bases
para o manejo da doença, seja pela obtenção de cultivares resistentes ou de controle
químico eficiente para as populações regionais, ou mesmo para avaliação de riscos e
segurança alimentar (Goswami & Kistler, 2004).
Na Europa, múltiplas linhagens do Complexo Fg têm sido observadas (Láday et
al., 2004; Tóth et al., 2005). A linhagem 7, denominada F. graminearum sensu stricto, é
predominante nos Estados Unidos (Zeller et al., 2003; Schmale et al., 2006a) enquanto
que a linhagem 6, Fusarium asiaticum, predomina nos países asiáticos (Gale et al.,
2002).
Na Argentina, um estudo recente com 113 isolados de duas regiões produtoras,
permitiu inferir, pela análise de AFLP, que todos apresentaram similaridade com a
linhagem 7 (Ramirez et al., 2006). Esses resultados foram consistentes com os
apresentados por Zeller et al. (2004) que encontram a linhagem 7 como a predominante
em um pequeno grupo de isolados de F. graminearum do Uruguai e regiões do Sul do
Brasil.
No Brasil, estudos prévios verificaram outras linhagens, que não a linhagem 7,
como a linhagem 1 (F. austroamericanum), linhagem 2 (F. meridionale) e a linhagem 8
(F. cortaderiae) (Martinelli et al., 2004). Os autores ainda demonstraram que os
representantes das linhagens 2 e 8 eram capazes de sintetizar, na sua maioria, a toxina
37
NIV. Scoz et al. (2009) evidenciaram, por meio de seqüenciamento de quatro genes, a
presença de duas linhagens diferentes envolvidas com a giberela do trigo no Brasil: a
linhagem 7 (F. graminearum stricto sensu), de ocorrência predominante e a linhagem 2
(Fusarium meridionale), previamente encontrada na soja. O percentual de identidade e
divergência das seqüências permitiu classificar isolados dos dois genótipos tricotecenos,
DON e NIV, em F. graminearum stricto sensu e F. meridionale, respectivamente. Esse
foi o primeiro relato detalhado da diversidade de genótipos produtores de tricotecenos
do Brasil e membros do Complexo Fg sugerido por O’Donnell et al. (2004) a partir da
análise de isolados provenientes de diversas regiões produtoras de trigo em três estados
do sul do Brasil.
3.3 Implicações epidemiológicas e de manejo
Dentre os fatores epidemiológicos, o conhecimento da estrutura populacional do
patógeno presente em uma região é importante para responder questões fundamentais
sobre a adaptabilidade do patógeno às novas práticas culturais ou cultivares; mudanças
na sensibilidade dos patógenos aos fungicidas mais utilizados; fluxo gênico entre as
populações; perfil e potencial toxigênico das populações e o risco de dispersão de
variantes genotípicas que sejam mais agressivas ou toxigênicas entre lavouras e regiões
(Cumagun & Miedaner, 2004; Mackintosh et al., 2006; Ward et al., 2008). Além disso,
as implicações toxicológicas e a preocupação mundial com micotoxinas, principalmente
na questão do comércio internacional de grãos com a adoção de níveis de tolerância em
vários países importadores e consumidores, tornam urgente o esclarecimento das
características das populações patogênicas ao redor do mundo (FAO, 2004). Ainda, tais
resultados são essenciais na definição de micotoxinas alvo para o monitoramento da
produção em algumas regiões produtoras, por meio de tecnologias que permitam a
38
avaliação rápida e eficiente de características dos fungos que são preditoras de
características de virulência às plantas e maior implicações toxicológicas à saúde
humana e animal consumidora de cereais (Nordby et al., 2004).
A existência de distintas linhagens/espécies filogenéticas de F. graminearum
resulta em um desafio para a vigilância sanitária. Atualmente, as exigências nas trocas
comerciais entre países visam à prevenção de entrada de agentes etiológicos
estrangeiros conhecidos por espécies quarentenárias. No caso do Complexo Fg, a
morfologia por si só não é capaz de distinguir estas diferentes espécies, sendo
necessária a utilização de ferramentas de diagnóstico molecular para evitar a entrada
destes patógenos em diferentes regiões produtoras (Konietzny & Greiner, 2003).
Conhecimentos adquiridos como os aqui descritos, fornecem uma base para o
acompanhamento das mudanças na diversidade genética e potencial toxigênico ao longo
do tempo, ambas fundamentais para o controle efetivo e redução desta doença
economicamente devastadora.
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Com o intuito de obter populações de isolados de F. graminearum provenientes
de trigo, utilizou-se um protocolo para obter cultivos monospóricos do patógeno a partir
de grãos exibindo sintomas e/ou sinais de giberela. Todos os procedimentos podem ser
sumarizados da seguinte maneira: os cultivos monospóricos isolados a partir de material
vegetal colonizado foram preservados pelo método Castellani e em papel de filtro. Os
isolados preservados e caracterizados conforme a morfologia típica de Fusarium
graminearum foram cultivados em meio líquido completo para produção de micélio, o
qual foi submetido a uma extração de DNA genômico total pelo método CTAB 2%. A
identidade dos isolados e os genótipos preditivos da produção de tricotecenos foram
determinados por PCR usando oligonucleotídeos específicos para espécies do
Complexo Fg e as toxinas NIV e duas formas acetiladas de DON (3-ADON e 15-
ADON), respectivamente. Isolados representantes de três populações regionais foram
selecionados para caracterização da diversidade genética por AFLP.
3.1 Origem das amostras de trigo para obtenção de isolados monospóricos
de F. graminearum
Ao final da safra agrícola de 2007 foram recebidas amostras (500g) de grãos de
trigo oriundos de diversas localidades da região noroeste e norte do Estado do Rio
Grande do Sul, principal região produtora de trigo do Estado. Isolados'foram'obtidos'a
partir de grãos sintomáticos de'três'amostras'de'regiões'distintas'do'Estado'do'Rio'
40
Grande' do' Sul,' denominados' de' população3' ' “CA”' (Município' de' Cruz' Alta),'
população' “EN”' (Município de Ernestina) e população “NO” (Município de Nonoai)
(Figura 5), totalizando na recuperação de 100 isolados por população.''
'
FIGURA 5. Mapa geográfico do RS com indicação da origem das amostras de trigo, safra 2007.
Laboratório de Epidemiologia de Plantas – UFRGS, 2009.
Na Safra agrícola de 2008, foram selecionadas duas lavouras de trigo no Estado
do Rio Grande do Sul, uma no município de Vacaria (Campo “A”) e outra em Sarandi
(Campo “B”), distantes 192 Km uma da outra. Estas foram divididas visualmente em
quatro quadrantes, sendo definidos aleatoriamente, 5 pontos de coleta de espigas
sintomáticas por quadrante. Em cada ponto de coleta foram amostradas quatro espigas
gibereladas em plantas adjacentes em um raio de 25 cm. Cada ponto foi georeferenciado 3 Neste'caso,'fazemos'referência'ao'termo'população'para'o'conjunto'de'isolados'recuperados'em'cada'região.
41
com auxílio de GPS (Figura 6). Um total de 80 espigas sintomáticas foram coletadas por
lavoura.
FIGURA 6. Amostragem de espigas sintomáticas de trigo em distintos campos no Estado do Rio Grande
do Sul. Divisão visual dos campos em quatro quadrantes (QA, QB, QC, QD), sendo
amostrados cinco pontos georeferenciados por quadrante, coletando-se quatro espigas por
ponto (20 cm de distância entre estas) Laboratório de Epidemiologia de Plantas – UFRGS,
2009.
3.2 Isolamento e purificação dos isolados de F. graminearum
Os isolamentos fúngicos foram feitos a partir de grãos de trigo apresentando
sintomas típicos de giberela. Esses foram cultivados em meio semi-seletivo para
crescimento de Fusarium descrito por Nash e Snyder (1962) com modificações de
Nelson et al. (1983), por 3 a 5 dias, a 25°C sob fotoperíodo de 12h (Leslie &
Summerell, 2006). Fragmentos de micélio resultantes deste cultivo foram transferidos
para o meio de cultivo Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA) (Leslie & Summerell,
2006) para esporulação e identificação conforme Nelson et al. (1962). No caso das
espigas sintomáticas, estas foram seccionadas em três partes e plaqueadas em meio
Nash e Snyder (1962). Os isolamentos monospóricos foram realizados com fragmentos
de micélio crescido sobre as espigas plaqueadas, conforme citado anteriormente.
42
Para a Safra 2007, cada população foi constituída de 100 isolados monospóricos
obtidos de grãos sintomáticos de trigo por Região. Destes isolados recuperados, 50
foram selecionados para ensaios de genotipagem por PCR e 20 para ensaios com
marcadores moleculares AFLP.
3.3 Preservação dos isolados monospóricos de F. graminearum
Isolados caracterizados morfologicamente como F. graminearum foram
purificados por cultivos monospóricos, crescidos em meio agarizado SNA e mantidos
pelo método Castellani e em papel de filtro esterilizado. Estes foram catalogados com o
código que identifica a safra, o número da lavoura e do isolado sendo depositados em
uma coleção no Laboratório de Epidemiologia de Plantas, UFRGS.
3.4 Produção de Biomassa Fúngica e Extração de DNA
Os isolados purificados foram cultivados em 50 mL de meio completo líquido
(Leslie & Summerell, 2006), sob agitação durante 3-4 dias a 25ºC. Após o crescimento
do micélio, esse foi filtrado com auxílio de uma bomba de vácuo e lavado três vezes
com água destilada estéril, para remoção de qualquer interferente do meio de cultura. O
micélio coletado foi armazenado em envelopes de papel alumínio a -20°C até o
momento da extração de DNA. As extrações de DNA genômico foram realizadas em
duplicatas pelo método CTAB 2% descrito por Doyle e Doyle (1987), com algumas
modificações. Para isso, triturou-se o micélio produzido em nitrogênio líquido.
Utilizaram-se 250-300 mg de tecido por tubo de reação. Adicionou-se ao micélio
triturado, 750 µl de tampão de extração CTAB 2% (CTAB 2% (p/v); NaCl 1,4M; Tris
HCl 100 mM pH 8,0; EDTA 20 mM) e 15 µl de 2-β-mercaptoetanol, incubando-se por
15 min a 65°C. Após, adicionou-se 520 µl de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1)
43
agitando-se em vórtex por 2 minutos e centrifugando a 13.000 rpm por 10 min para a
separação das fases. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de reação onde
se acrescentou igual volume de isopropanol e 50% do volume do sobrenadante de
acetato de amônio 7,5 M, para remoção dos polissacarídeos. Os tubos foram
centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos. Descartou-se o líquido e o DNA
precipitado foi lavado com 100 µl de etanol 70% e centrifugado a 13.000 rpm por 5
min. Após, secou-se o DNA precipitado pela inversão dos tubos em papel toalha. Após
seco, este foi ressuspendido em 50-100 µl de água bidestilada estéril. A quantidade e
qualidade do DNA extraído foram estimadas através de leitura em um fluorômetro
Qubittm (Invitrogen) e o DNA armazenado a -20 ºC até o momento das análises de PCR.
FIGURA 7. Produção de biomassa fúngica. (a) Aparato para coleta de micélio produzido em meio de
cultura líquido completo (b) Detalhe de etapas do processo de produção de micélio (c)
Biomassa fúngica produzida e coletada, sobreposta em folha de papel alumínio onde foi
empacotada e armazenada a -20°C. Laboratório de Epidemiologia de Plantas – UFRGS,
2008.
3.5 Singleplex-PCR para identificação de espécie
(b) (c) (b) (a) (b) (c)
44
Cada isolado, compreendendo as três populações de isolados obtidos de grãos de
trigo (Safra 2007) e de espigas sintomáticas (Safra 2008) foram submetidos a análises
de PCR (polymerase chain reaction) para confirmação da espécie F. graminearum
através de um Singleplex-PCR utilizando o primer Fg16 segundo Nicholson et al.
(1998) (Tabela 2).
As condições de amplificação consistiram de um passo inicial a 95°C por 3 min,
seguido de 38 ciclos a 95°C por 20s, 62°C por 20s e 72°C por 45s e de uma extensão
final a 72°C por 5 min. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese
em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio (EtBr) numa concentração final
de 0,5 µg mL-1 e visualizado sob luz UV.
3.6 Determinação de genótipos tricotecenos4 por Multiplex-PCR
Para todos os isolados de F. graminearum obtidos foram determinados três
genótipos tricotecenos: NIV (nivalenol), DON/3-ADON (desoxinivalenol forma
acetilada posição C-3 do derivado acetil-éster do oxigênio) e DON/15-ADON
(desoxinivalenol forma acetilada posição C-15 do derivado acetil-éster do oxigênio)
(Ward et al., 2002) por meio de uma Multiplex-PCR das regiões dos genes Tri3 e Tri12.
A amplificação com estas duas regiões serviam como duplo controle e aqueles isolados
que não amplificaram nenhum fragmento esperado para uma ou outra reação, foram
descartados das análises. Para a confirmação da distinção entre DON e NIV também se
utilizou o oligonucleotídeo-iniciador Tri13F/R através de um Singleplex-PCR segundo
Chandler et al. (2003).
4 O termo “genótipo tricoteceno” será utilizado em referência aos resultados obtidos por ensaios de genotipagem por PCR, os quais são capazes de predizer a síntese de quimiotipos. O termo “quimiotipo tricoteceno” será empregado quando fizer referência à detecção química destes compostos (Em menção a Desjardins (2008)).
45
Os ensaios de PCR foram conduzidos utilizando 10-20 ng de DNA fúngico ao
qual foi adicionado 1,5 mM de MgCl2, 20 mM de dNTPs, 2U de Taq-DNA polymerase
(Invitrogen) para uma reação de volume final igual a 25 µL. Seqüências e condições de
primers estão listados na Tabela 2.
46
TABELA 2. Sequências de primers, condições para PCR e tamanho de fragmentos obtidos de diferentes
quimiotipos de Fusarium graminearum.
Ref. (1) Nicholson et al. (1998); (2, 3) Ward et al. (2002); (4) Chandler et al. (2003).
As condições de amplificação de Tri3, Tri12 e Tri13 consistiram de um passo
inicial a 94°C por 10 min, seguido de dois ciclos a 94°C por 30s, 59°C por 30s e 72°C
por 30s. A temperatura de anelamento foi diminuída a cada dois ciclos em 58, 56, 54,
53, 52, 51°C e então mantida a 50°C por mais 21 ciclos, procedido de um passo final a
72°C por 10 min. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel
de agarose a 1%, corados com brometo de etídio (EtBr) numa concentração final de 0,5
µg mL-1 e visualizado sob luz UV.
Primer
Seqüência de Primers
Gene
alvo
Prod.
Ampl.
(bp)
Genótipo
Tricoteceno
Ref.
Fg16 F
Fg16 R
3 CON
3 NA
3 D15 A
3 D3A
12 CON
12 NF
12-15F
12-3F
Tri13F
Tri13DONR
Tri13R
Tri13NIVF
CTCCGGATATGTTGCGTCAA
GGTAGGTATCCGACATGGCAA
TGGCAAAGACTGGTTCAC
GTGCACAGAATATACGAGC
ACTGACCCAAGCTGCCATC
CGCATTGGCTAACACATG
CATGAGCATGGTGATGTC
TCTCCTCGTTGTATCTGG
TACAGCGGTCGCAACTTC
CTTTGGCAAGCCCGTGCA
CATCATGAGACTTGTKCRAGTTTGGG
GCTAGATCGATTGTTGCATTGAG
TTGAAAGCTCCAATGTCGTG
CCAAATCCGAAAACCGCAG
Fg16
Tri3
Tri 12
Tri 13
450
243
610
840
410
670
840
282
312
-
3-ADON
15-ADON
NIV
3-ADON
15-ADON
NIV
DON
NIV
1
2
3
4
47
3.7 Análises de AFLP
Com' o' objetivo' de' ampliar' o' conhecimento' sobre' a' presença' de' distintas'
linhagens'e'a'diversidade'genética'de'populações'do'patógeno'no'Sul'do'Brasil,'a'
geração' de' marcadores' moleculares' por' AFLP' (amplified) fragment) length)
polymorphism)'visou acessar a distribuição das linhagens sugeridas por O’Donnell et
al. (2004) e a possível co-relação com os quimiotipos inferido por trabalhos prévios
(Scoz et al., 2009). Os isolados analisados foram escolhidos conforme resultados
referentes à quimiotipagem através de multiplex-PCR e sua distribuição entre as
populações. Tanto isolados DON quanto NIV foram submetidos à técnica para verificar
a variabilidade entre os isolados e a similaridade entre os genótipos tricotecenos.
As análises de AFLPs foram realizadas em isolados provenientes de 3
populações trigo, amostrados na safra 2007. Os isolados analisados foram selecionados
com base nos resultados da quimiotipagem por PCR e sua localização geográfica. Tanto
isolados DON quanto NIV foram submetidos à técnica para verificar a variabilidade
entre os isolados e a similaridade entre os quimiotipos, da mesma forma que visou
acessar a distribuição das linhagens sugeridas por O’Donnell et al. (2004) e a possível
correlação com os quimiotipos inferido por trabalhos prévios (Scoz et al., 2009).
As análises foram conduzidas segundo Vos et al. (1995) modificado por Leslie e
Summerell (2006) em um PC-2000 termoclicador (MJ research, Inc.). Todos os
tampões e enzimas foram utilizados conforme as instruções do fabricante. Os
fragmentos foram amplificados utilizando extensões de duas bases das extremidades
dos fragmentos gerados tanto por EcoRI (AA, CC e TG) quanto por MseI (AT, TT e
CC), marcados com γ33P para detecção das bandas por autoradiografia.
O DNA genômico total diluído em tampão TE teve sua concentração ajustada
para 100 ng.µL-1 diluindo-se o DNA em água bi-destilada. O DNA genômico ajustado
48
para 100 ng.µL-1 de cada amostra foi incubado por 12h à temperatura ambiente para
digestão pelas enzimas de restrição EcoRI e MseI e ligação dos adaptadores de AFLP
em uma simples reação, a temperatura ambiente. A reação de pré-amplificação do
DNA se realizou ao diluir em 9 volumes de tampão TE 1X a mescla de DNA-digerido-
ligado.
O DNA pré-amplificado foi diluído em 49 volumes de tampão TE 1X. Esta
diluição foi utilizada nas amplificações seletivas. Nas reações de amplificação seletiva,
utilizaram-se dois oligonucleotídeos iniciadores: EcoRI (AA, CC e TG) e MseI (AT, TT
e CC). O primeiro foi marcado radioativamente com [γ33P]ATP, juntamente com T4
quinase (concentração conforme indicado pelo fabricante), incubando-se durante 1h a
37°C e 15 min a 70°C.
Os produtos de amplificação foram diluídos em igual volume de formamida,
desnaturados a 90°C durante 3 min e sendo rapidamente resfriados em gelo antes de
serem aplicados no gel de poliacrilamida desnaturante. Previamente, polimerizou-se um
gel de poliacrilamida 6% (Long Ranger, FMC, Rockland, ME, USA) em um aparato de
eletroforese vertical adequado. Para a corrida das amostras o gel foi aquecido no aparato
de eletroforese vertical até 60°C para então aplicar as amostras de DNA amplificado e
desnaturado (3,7 µL). Após a corrida das amostras, o gel foi transferido a um papel
filtro que depois de seco em manta térmica por 2h a 80°C foi transferido a um filme de
autoradiografia (Classic Blue Sensitive, Molecular Technologies, St. Louis, MO, USA)
e incubado em escuro por 3 a 4 dias, à temperatura ambiente, até a revelação e
identificação das bandas.
Para revelar a autoradiografia seguiu-se recomendação do fabricante, na qual foi
imersa em um líquido fixador durante 4 min, lavou-se com água, foi imersa uma vez
49
mais em um líquido revelador por 4 min. Enxaguou-se com água corrente, secando a
temperatura ambiente.
3.7.1 Estimativas de similaridade genética
As bandas de AFLP foram analisadas manualmente para cada combinação de
pares de primer (EcoRI AA/MseI AT; EcoRI CC/MseI CG e EcoRI TG/MseI TT) entre
200 e 600 pb. Em todas as análises se incluíram como padrões, DNA de isolados de G.
zeae previamente caracterizadas como representantes das espécies filogenéticas do
Complexo (O’Donnell et al., 2004).
As bandas de mesmo tamanho molecular nos diferentes isolados foram
consideradas representantes de um mesmo alelo e cada banda foi tratada como um loco
independente com dois alelos. Cada fragmento amplificado foi considerado como um
caracter binário: presença (1) ou ausência (0). A partir destes caracteres, foi construída
uma matriz binária para cada isolado. O grau de similaridade genética foi estimado com
o programa SinQual (NTSYS.pc versão 2.01, F. J. Rohlp, Exeter Software, NY; Rohlf,
1990) levando em consideração todos os isolados conforme o coeficiente de Dice (Sd):
Sd = 2 Nxy / (Nx + Ny)
onde Nx e Ny representam os números dos fragmentos amplificados no isolado X e Y,
respectivamente e, Nxy representa o número de fragmentos amplificados compartilhados
por ambos os isolados (Dice, 1945). Os dendogramas de similaridade genética foram
construídos usando o método de médias aritméticas UPGMA com o programa SAHN
de NTSYS. O dendrograma com a melhor topologia foi eleito baseado no valor
cofenético de MXCOMP, um programa de comparação de matrizes de NTSYS. Os
50
cálculos de similaridade genética foram obtidos por meio do programa SAS, version
6.11 (SAS Institute, Cary, NC). Os valores de bootstrap dos dendrogramas foram
obtidos com o programa PAUP versão 4.0.
3.7.2 Análises de Genética Populacional
Com o intuito de relatar a diversidade genética comparativa entre distintas
populações de membros do Complexo Fg (Fusarium graminearum) no Sul do Brasil,
foram analisados todos os isolados pertencentes à linhagem 1 a 9 (O´Donnell et al.,
2004) de três populações da Safra 2007.
A diversidade genética a nível populacional e a diferenciação genética entre as
populações foram analisadas utilizando o programa POPGENE versão 1.32. Através
deste programa foi possível estimar (1) a freqüência alélica de locus polimórficos e a
diversidade genética entre e dentro das populações como descrito por Nei (1973); (2) o
índice de Fixação (Gst) como descrito por Nei (1973); (3) a taxa de migração efetiva
(Nm) como descrito por McDermott e McDonald (1993) e (4) a identidade genética
conforme Nei (1978). O índice de Fixação (Gst) e o número efetivo de migrantes (Nm)
foram utilizados para diferenciar as populações. O índice de fixação é a medida
estandardizada da diferenciação populacional baseado no polimorfismo genético dos
indivíduos de cada população. A medida do número efetivo de migrantes (Nm) onde
“N” é o número efetivo do tamanho da população e “m” é a taxa de migração por
geração, ou seja, a medida no nível de fluxo gênico entre a população por geração.
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Determinação de genótipos tricotecenos-B e identificação de espécies
filogenéticas do Complexo Fusarium graminearum
Resultados
Dos 50 isolados monospóricos de cada população selecionados para as análises
de genotipagem para tricotecenos-B, foi possível analisar todos, exceto na população
EN em que foram analisados 41 isolados, perfazendo um total de 141 isolados. Esses se
mostraram positivos para o Complexo F. graminearum pela reação' com' o'
oligonucleotídeoRiniciador' Fg16F/R,' verificados' através' da' amplificação' de' um'
fragmento'de'450'pb'(Nicholson'et)al.,'1998).''
TABELA 3. Número e freqüência dos genótipos tricotecenos-B 3-ADON (3-acetil-desoxinovalenol), 15-
ADON (15-acetil-desoxinivalenol) e NIV (nivalenol) em distintas populações no Estado do
Rio Grande do Sul – Brasil.
POPULAÇÃO 3-ADON 15-ADON NIV TOTAL
N* % N* % N* % N Cruz Alta (CA) 1 2 48 96 1 2 50 Ernestina (EN) 0 0 40 97,6 1 2,4 41 Nonoai (NO) 0 0 41 82 9 18 50 TOTAL 1 0,7 129 91,5 11 7,8 141
* Número de isolados
O genótipo tricoteceno-B predominante foi o 15-ADON em todas as populações
(Tabela 3). O genótipo NIV foi detectado em baixa freqüência em todas as populações,
52
variando de 2 a 2,4%, exceto na população Nonoai que apresentou 18% de isolado NIV,
uma proporção relativamente alta em relação às demais populações. Somente um
indivíduo da população CA amplificou os fragmentos esperados para o quimiotipo 3-
ADON. A Figura 8 mostra as amplificações para as porções gênicas Tri3 e Tri12.
'
FIGURA 8. Amplificação espécie-específica Fg16F/R para F. graminearum (A); Multiplex-PCR tri3
para determinar 3-ADON (243 pb), 15-ADON (610 pb) e NIV (840 pb) (B); Multiplex-PCR
tri12 para determinar 3-ADON (410 pb), 15-ADON (670 pb) e NIV (840 pb) (C). Marcador
de peso molecular de 100 pb em cada extremidade (M), controle negativo (C), controle 3-
ADON (3A), controle Nivalenol (NIV) e controle 15-ADON (15A).'Nas análises AFLP, a leitura dos marcadores moleculares foi entre 200 e 600 pb,
revelando a presença de 174 bandas polimórficas em um total de 55 isolados de F.
53
graminearum representantes das três populações (N=19 para a população CA, N=19
para Ernestina e N=17 para a Nonoai). Para esses isolados, a combinação de primers
EcoRI-AA/MseI-AT amplificou 36 bandas; a combinação EcoRI-CC/MseI-CG
amplificou 47 bandas; enquanto que a combinação EcoRI-TG/MseI-TT amplificou 91
bandas.
A similaridade genética média entre os isolados de F. graminearum foi de 74%
(entre 40-100%). Para ser considerados indivíduos da mesma espécie, os coeficientes de
similaridade médios devem ser acima de 65%, sendo todos os isolados aqui analisados
pertencentes ao Complexo Fg (Figura 9).
A identificação de espécies por AFLP demonstrou a predominância da linhagem
7 (F. graminearum sensu stricto) em representantes de ambas as populações. Também
foi possível agrupar representantes das populações com as linhagens 2 (F. meridionale),
5 (F. acaciae-mearnsii) e 8 (F. cortaderiae) (Figura 9). Houve uma forte associação
entre as diferentes linhagens com genótipos tricotecenos específicos uma vez que todos
os isolados que agruparam com a linhagem 7 apresentaram o genótipo 15-ADON e os
que agrupavam as linhagens 2 e 5 apresentavam o genótipo NIV. O genótipo 3-ADON
agrupou com padrões da linhagem 8.
53
FIG
UR
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. Den
drog
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A) p
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pop
ulaç
ões C
ruz
Alta
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), Er
nest
ina
(EN
) e N
onoa
i (N
O).
53
54
Discussão
Este% foi% o% primeiro% trabalho% no% Sul% do% Brasil% que% realizou% estudos%
comparativos%entre%populações%de%F.#graminearum,%com%um%número%considerável%
de% isolados%em%cada,% a% fim%de%determinar%as%distintas% linhagens%do%Complexo%Fg%
presentes% e% a% possível% relação% com% o% potencial% de% síntese% de% alguns% genótipos%
tricotecenoDB.%
Assim%como%já%demonstrado%para%populações%de%diversas%regiões%do%mundo%
(Ji%et#al.,%2007;%Schmale%et#al.,%2006b),%o%genótipo%15DADON%também%predominou%
no%Sul%do%Brasil.%A%proporção%de%15DADON%encontrada%no%presente%trabalho%(91%)%
confirma%um%estudo%anterior%que%verificou%a%predominância%de%15DADON%(92,7%)%
em% isolados% obtidos% de%mais% de% 20%municípios% no% Sul% do%Brasil.% Para% o% genótipo%
NIV,% os% valores% também% foram% consistentes% com% os% encontrados% por% Scoz% et# al.%
(2009),%7,3%%comparado%com%7,8%%encontrado%no%presente%trabalho.%No%entanto,%
naquele%trabalho%foram%analisados%poucos%isolados%por%município,%não%permitindo%
determinar%a% freqüência%destes%genótipos%em%populações%do%mesmo% local.%Ainda,%
esta%foi%a%primeira%vez%que%foi%detectado%o%genótipo 3-ADON associado a trigo no Sul
do Brasil.%
Vários autores têm discutido uma hipótese de uma possível transição no perfil
do metabolismo secundário de F. graminearum. No Canadá e centro-oeste dos EUA
estudos recentes mostraram um aumento na freqüência de detecção de genótipos 3-
ADON nos últimos anos (Zeller et al. 2004; Ward et al., 2007; Starkey et al., 2007;
Gale et al., 2007). Tal mudança poderia estar relacionada com características
adaptativas do patógeno, uma vez que isolados 3-ADON destas localidades
apresentavam maiores taxas de crescimento e produziam significativamente maior
quantidade tricotecenos que os isolados 15-ADON quando inoculados in planta ou
55
crescimento in vitro (Ward et al., 2002; Ward et al., 2007; Ward et al., 2008).
Entretanto, existe a possibilidade de a detecção desses genótipos estar comprometida
pela amplitude de detecção das técnicas disponíveis até então ou pela amostragem
insuficiente. A detecção de 3-ADON em campos do Sul do Brasil não significa,
necessariamente, que esteja ocorrendo esta mudança de perfil nas populações locais,
pois ainda são necessários trabalhos de monitoramento em longo prazo com um grande
número de isolados para se verificar se existirá um padrão similar de mudança.
Ao% seqüenciar% três% genes% em% isolados% representativos% de% quimiotipos% 15D
ADON% e%NIV,% Scoz% et# al.% (2009)% determinaram%que% os% isolados%NIV% tiveram% suas%
seqüências%alinhadas%com%F.#meridionale#(linhagem%2).%A%suposição%da%ocorrência%
de%distintas%linhagens%se%deu%devido%a%amplificação%de%um%fragmento%de%500%pb%em%
uma%reação%de#PCR%com%o%par%de#primers%Fg16F/R,%o%qual%amplifica%um%fragmento%
de%450%pb%como%forma%de%identificar%representantes%pertencentes%ao%Complexo%Fg%
(Nicholson%et#al.,%1998).%Este%polimorfismo%foi%detectado%somente%em%isolados%com%
genótipo%NIV,%o%que%também%foi%demonstrado%nos%isolados%analisados%no%presente%
trabalho% (Figura% 8).% O% polimorfismo% encontrado% para% esta% reação% de% PCR% serviu%
como% uma% triagem% de% ocorrência% de% outras% linhagens% nas% distintas% populações%
além% da% linhagem% predominante.% Entretanto,% a análise filogenética do presente%
trabalho% permitiu% observar% a presença de pelo menos quatro linhagens segundo
O’Donnell et al. (2004), sendo% que% a% reação% com% o% par% de# primers% Fg16F/R% não%
distinguiu% as% formas% acetiladas% de% DON% (3DADON% e% 15DADON% =% 450% pb)% nem% a%
linhagem% 2% da% 5,% ambas% com% genótipo% tricoteceno% NIV% que% apresentaram% o%
polimorfismo%de%500%pb.%
A presença de mais de uma linhagem para populações de trigo aqui analisadas
está de acordo com trabalhos anteriores que detectaram diferentes linhagens em outros
56
hospedeiros, observando a presença das linhagens 1 (F. austroamericanum), linhagem 2
(F. meridionale) e a linhagem 8 (F. cortaderiae) em isolados provenientes de soja,
demonstrando que as linhagens 2 e 8 eram capazes de sintetizar na sua maioria a toxina
NIV e quantidades pequenas de 3-ADON (Martinelli et al., 2004).
O resultado da ocorrência de múltiplas linhagens concorda com informações de
estudos conduzidos na Europa (Gagkaeva%&%YliDMattila%2004,%Tóth%et%al.%2005) e Ásia
(Gale et al., 2002; Yli-Mattila et al., 2009).% Em% populações% da% América% latina% a%
distribuição% das% linhagens% é% contrastante.% Enquanto% em% populações de F.
graminearum do Uruguai foram detectadas múltiplas linhagens, com o predomínio da
linhagem 7 (62 de 64 isolados) e um isolado da linhagem 1 (F. austroamericanum) e 8
(F. cortaderiae) (Pereyra et al., 2008), na Argentina, um%estudo%com%113%isolados%de%
dois% locais% na% região% produtora% de% trigo,% observouDse% que% todos% foram%
pertencentes% à% linhagem% 7% (Ramirez% et# al.,% 2007).% Da% mesma% forma,% trabalhos%
realizados% por% Zeller% et# al.% (2003)% e% Schmale% % et# # al.% (2006a),% afirmam% que% a%
linhagem%7%prevalece%também%nos%Estados%Unidos.
A% relação% da% espécie% filogenética% do% Complexo% Fg% com% a% síntese% de% um%
quimiotipo% tricoteceno% específico% não% é% tratada% em% muitos% trabalhos,% mas% é%
aparentemente% presente% em% populações% do% Sul% do% Brasil% onde% a linhagem 7 foi
exclusivamente genótipo 15-ADON. O único exemplar da linhagem 8 detectado no
presente estudo, apresentou o genótipo tricoteceno 3-ADON enquanto que as linhagens
2 e 5 foram NIV.
A% relação% entre% genótipo% tricoteceno% 15DADON% e% linhagem% 7% traça% um%
paralelo%com%estudos%na%China#onde%Zhang%et#al.%(2007)%detectaram%as%linhagens%6%
(F.# asiaticum)% e% 7% (F.# graminearum),% sendo% 100%% dos% isolados% da% linhagem% 7%
57
determinados% como% 15DADON,% enquanto% que% os% isolados% da% linhagem% 6% foram%
principalmente%genótipo%tricoteceno%3DADON%e%alguns%NIV.%%
Na%Coréia%do%Sul,%populações%do%Complexo%Fg%isoladas%a%partir%de%grãos%de%
milho% sintomáticos% também% demonstraram% a% associação% da% linhagem% com% o%
quimiotipo%produzido,%sendo%que%a%linhagem%7%consistia%apenas%de%produtores%de%
DON% e% a% linhagem% 6% de%NIV% (Jeon# et# al.,% 2003).% Isto% também% foi% observado% para%
populações% do% Japão,% onde% isolados% da% linhagem% 6% produzem% quase% que%
exclusivamente% NIV% enquanto% que% a% linhagem% 7% produz% DON% e% suas% formas%
acetiladas%(Suga%et#al.,%2008).%%
Na% América% do% Norte,% populações% nos% EUA% consistiam% de% apenas% uma%
linhagem,% sintetizando% predominantemente% 15DADON% (95%)% (Zeller# et# al.,% 2004;%
Schmale#et#al.,%2006a).%No entanto, no meio-oeste americano, o genótipo 3-ADON era
mais freqüente (Gale et al., 2005), enquanto que no estado de Louisiana, a prevalência
de NIV contrasta drasticamente com a situação nas outras regiões americanas,
predominantemente compostas por quimiotipos DON (Gale et al., 2005).
A distinção genética entre as linhagens do Complexo Fg pode ser relevante na
identificação e monitoramento de distintas micotoxinas contaminantes de grãos no Sul
do Brasil, principalmente pelo fato da especificidade da linhagem em relação ao
genótipo tricoteceno, onde a detecção da espécie filogenética do patógeno pode ser
utilizada para inferir sobre seu potencial toxigênico.
Este trabalho forneceu evidências de correlação entre quimiotipos x linhagens
para isolados do Complexo Fg no Sul do Brasil. A detecção de genótipos tricotecenos
com distinto potencial toxigênico, principalmente quanto à ocorrência de nivalenol, uma
toxina dez vezes mais tóxica que DON (Desjardins et al., 1993), alerta quanto a
necessidade da implantação de índices de tolerância a tricotecenos em produtos
58
derivados de cereais, o que ainda não está em vigor no Brasil. Para isso, estudos de
monitoramento da freqüência e distribuição destas toxinas são fundamentais no
desenvolvimento de estratégias de detecção e regulamentação quanto a estas toxinas.
59
4.2 Estrutura populacional do Complexo Fusarium graminearum no Sul do
Brasil
Resultados
Dos 55 isolados selecionados das três populações: CA (N=19), EN (N=19) e NO
(N=17), foram identificados um total de 150 marcadores AFLP entre 200-600 pb com o
uso de três combinações de oligo-iniciadores (EcoRI-AA/MseI-AT; EcoRI-CC/MseI-
CG e EcoRI-TG/MseI-TT).
Com base no número de alelos foi possível detectar alta variabilidade entre os
marcadores AFLP. Dos 150 locus detectados, 73% foram polimórficos na população
CA, 68% na EN e 75% na NO (Tabela 4), sendo apenas 2 locus de alelos monomórficos
entre as três populações.
Para verificar a real variabilidade entre as populações foram excluídos os 2 locus
de alelos monomórficos totalizando a análise de 148 locus, todos polimórficos. Para a
análise destes locus, a diversidade média detectada foi de 0,2 entre todos os isolados
(Tabela 5). Além disso, quando a freqüência de alelos raros foi <5% em ambas as
populações, estes foram removidos das análises (total de 45 locus de alelos polimórficos
raramente presentes em ambas as populações), sendo então estimada a diversidade
genética média para 103 locus, a qual foi 0,266 (Tabela 5).
Para o conjunto total de 148 locus, os valores de GST (fixation index ou
diferenças entre populações devido à subdivisão populacional) para locus individuais
variaram de um mínimo igual a zero (não existe divergência ou a freqüência alélica é
idêntica) para um máximo de 0,85 (Tabela 5). A média de valores GST entre todos os
148 locus foi igual a 0,146 (Nm>3 entre todos 148 locus). Resultados semelhantes
foram obtidos na análise do conjunto de 103 locus para qual a freqüência de alelos raros
60
foi >5% (média GST = 0,156 e Nm>3), o que sugere não ocorrer significativa troca
genética entre as três populações.
TABELA 4. Diversidade genética entre três populações distintas de F. graminearum isoladas de três
Regiões do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil.
População Cruz Alta Ernestina Nonoai
Tamanho da Amostra 19 19 17
Percentual de locus polimórficos (%) 73 68 75
Número de haplótipos 19 19 17
Número de alelos privados 13 9 15
Média da freqüência de alelos privados 0,117 0,058 0,184
Distância de alelos privados 0,053 – 0,895 0,053 – 0,105 0,053 – 0,412
Média da diversidade genéticaa
148 locus 0,144 0,137 0,238
103 locus 0,183 0,175 0,325
a Calculado segundo Nei (1973).
Para o cálculo do desequilíbrio de ligação (linkage desequilibrium) em
populações de F. graminearum, houve 10,876 mil possíveis comparações pair-wise para
a combinação de 148 locus AFLP. Rejeitou-se a hipótese nula do equilíbrio de ligação
entre dois locus (two-locus linkage equilibrium) (p<0.01) a favor da hipótese alternativa
de desequilíbrio de ligação entre dois locus para 100 pares de locus (0,92%) para a
população CA, para 37 pares (0,34%) para a EN e para 239 (2,2%) para a NO. Ao nível
de significância p<0.05, rejeitou-se a hipótese nula do equilíbrio de ligação entre dois
locus (two-locus linkage equilibrium) para 429 pares de locus (3,9%) na população CA,
305 pares de locus (2,8%) para a população EN e 483 pares de locus (4,4%) na
população de NO, totalizando 1427 pares de locus (12,8%) para as populações
combinadas.
61
TABELA 5. Diferenciação genética entre três populações de F. graminearum (Cruz Alta, Ernestina e
Nonoai) calculadas a partir de todos os locos polimórficos, e para os 103 locus onde as
freqüências de ambos os alelos (presença e ausência de banda) foi >5%.
Estatística 148 locus 103 locus
Freqüência de diversidade médiaa 0,173 0,266
Intervalo 0,033 – 0,468 0,070 – 0,498
Fixation index (GST)a 0,146 0,156
Intervalo 0 – 0,85 0 – 0,85
Taxa de migração efetiva (Nm)b 2,92 2,71
Intervalo 0,088 – 2,000 0,088 – 2,000
Identidade genéticac 0,954 0,929
a Calculado segundo Nei (1973).
b Calculado segundo McDermott and McDonald (1993).
c Calculado segundo Nei (1978).
Discussão
Este foi o primeiro trabalho a caracterizar a estrutura populacional e diversidade
genética do Complexo Fg no Sul do Brasil. Os altos índices de GST e baixa taxa de
migração encontrados indicam a possível limitação do fluxo gênico entre as três
populações e o possível isolamento reprodutivo entre elas (Taylor et al., 1999).
A grande maioria dos trabalhos realizados até o momento sobre a estrutura
populacional de F. graminearum aponta haver um alto índice de diversidade genética
em coleções deste patógeno pelo mundo, seja numa escala de campo ou em escala
geográfica (estado, província ou continente) (Zeller et al., 2004; Akinsanmi et al., 2006;
Schmale et al., 2006a). Da mesma forma, as populações analisadas no presente trabalho
apontam uma diversidade genética elevada, ratificada pela alta freqüência de alelos
privados e ausência de clones.
62
Patógenos com sistemas de reprodução assexuada e sexuada são mais complexos
em termos de controle e manejo, pois estes têm a capacidade de receber benefícios
adaptativos tanto de um sistema reprodutivo como de outro. A reprodução sexual
permite inúmeras recombinações de alelos que podem resultar em vantagens
adaptativas. Já a reprodução assexual permite que os indivíduos com o genótipo mais
adaptado (melhor fitness) se dispersem em forma de clones, geralmente alcançando
longas distâncias, mantendo as melhores características adaptativas entre a população
(O´Donnell et al., 2004; Leslie & Bowden, 2008).
A freqüência mínima de clones indica que F. graminearum cruza em taxas ideais
que mantém a heterogeneidade entre as populações (Ramirez et al., 2007). Como foi
demonstrado, não foram detectados clones nas populações analisadas no Sul do Brasil
(número de haplótipos foi igual ao número da amostra), o que sugere a ocorrência da
recombinação sexual entre isolados deste fungo homotálico em condições de campo.
Nos EUA, estudos realizados com duas populações de anos distintos (2000 e
2001) verificaram a existência de um número elevado de haplótipos distintos, ou seja,
reduzida freqüência de clones, o que corrobora com a hipótese de que a alta diversidade
genotípica destas populações aponta uma freqüência na recombinação sexual (Zeller et
al., 2003). Miedaner et al. (2008) demonstraram, ao revisar vários estudos
populacionais de F. graminearum, que proporção média de haplótipos entre populações
de 3 continentes chegou a 81%, com valores no intervalo de 30 a 100%, sendo que, em
17 de 29 populações revisadas neste trabalho, todos os isolados amostrados possuíam
um único haplótipo.
Os valores de fluxo gênico nas populações brasileiras foram baixos, o que indica
que a diferenciação genética entre as populações foi alta. As populações analisadas
estão separadas, aproximadamente, por 100 Km uma das outras, e os valores baixos de
63
migrantes entre as populações (Nm≈3) sugere haver isolamento reprodutivo entre elas.
A população NO apresentou os mais altos índices de diferenciação genética (pelo
grande número de locus polimórficos (111 locus) observados nesta população em
relação às demais), assim como o número de alelos privados em comparação às demais
populações. Estes dados confrontam diversos estudos que afirmam que as populações
de F. graminearum de diversas partes do mundo pertencem a uma população panmítica,
ou seja, que fazem parte de uma grande população geográfica.
O baixo índice de fluxo gênico detectado nas três populações analisadas sugere
que, embora exista uma grande capacidade de dispersão do inóculo pelo ar (Schmale et
al., 2006a), a abundância local de inóculo favorecida pelo uso extensivo e prolongado
do plantio direto pode ser um fator chave no isolamento das populações, mesmo em
distâncias relativamente curtas, uma vez que, pode haver maior contribuição de inóculo
local, comparado com o inóculo migrante.
Em regiões onde possivelmente as epidemias são iniciadas por inóculo originado
de longas distâncias, o elevado fluxo gênico (medido pelo número de migrantes)
contribui para eliminar qualquer potencial de diferenciação entre populações regionais,
sendo a dispersão de propágulos sexuais e assexuais fatores chave na disseminação
desta variabilidade (Gale et al., 2002; Zeller et al., 2003; Zeller et al., 2004; Fernando et
al., 2006; Schmale et al., 2006a). Nos EUA, por exemplo, o número de migrantes para
populações de F. graminearum chega a 2000 (Zeller et al., 2004: Schmale et al.,
2006b), entre 7 e 30 na China e entre 5 a 20 no Canadá (Gale et al., 2002; Mishra et al.,
2004). Da mesma forma, populações chinesas e australianas de F. graminearum
também demonstraram pouca ou nenhuma subdivisão (Gale et al., 2002; Akinsanmi et
al., 2006).
64
O alto índice de fixação (GST) encontrado para populações do Sul do Brasil, o
qual determina o possível isolamento destas populações, corrobora com Gale et al.
(2007), que distinguem populações dos EUA de acordo com o genótipo tricoteceno,
sendo as populações da linhagem 7 exclusivamente 3-ADON em Minnesota e Dakota
do Norte, padrão distinto em relação a população 15-ADON distribuída de maneira
geral nos EUA. Resultados similares foram apresentados por Ward et al. (2008) no
Canadá, que também demonstra um isolamento das populações genótipo tricoteceno 3-
ADON.
Na China, Karugia et al. (2009), além da distinção de populações das linhagens
6 e 7, também distinguiram as populações chinesas de acordo com o genótipo
tricoteceno e a distribuição geográfica. Os autores daquele trabalho sugerem que o fluxo
gênico entre as diferentes populações e mesmo dentro de espécie é comparativamente
limitado devido à co-existência de distintas linhagens, apesar de ainda não se saber
quais os fatores que influenciam o fluxo gênico entre as duas linhagens e o isolamento
geográfico de tais características.
Trabalhos preliminares demonstraram que a subdivisão populacional está
correlacionada com o tricoteceno-B sintetizado (Gale et al., 2007; Ward et al., 2008;
Karugia et al., 2009) onde diferentes isolados não somente apresentaram genótipos
tricotecenos distintos, mas também compuseram uma população genética distinta
mesmo co-ocorrendo em uma determinada área e havendo um sutil fluxo gênico entre
elas (Bowden & Leslie, 1999). A distinção entre a população NO das demais pode ser
explicada por este fato, onde apesar da maioria da população ser genótipo-tricoteceno
15-ADON, 18% apresentava genótipo NIV (ver resultados do capítulo 1). Sendo assim,
a não-distinção de linhagens entre as populações no presente estudo pode ter surtido
65
efeito na variabilidade sub-populacional pelo potencial de hibridação introgressiva entre
as distintas linhagens (Karugia et al., 2009).
A alta interconectividade populacional ilustrada por valores GST baixos na
grande maioria de populações mundiais e a regular recombinação genética sugere que as
tentativas para controlar fontes locais de inóculo baseado em assinaturas genéticas ou
diferenças nas freqüências alélicas provavelmente não será bem sucedida. A freqüência
na recombinação e no fluxo gênico entre populações, seja por mutações ou pela
migração de outras regiões geográficas, poderia rapidamente incorporar diversas
características genéticas favoráveis a patogenicidade em distintas populações (Zeller et
al., 2003). Desta forma, a caracterização prévia de populações brasileiras do Complexo
Fg sugere que o isolamento gênico entre elas pode gerar informações chave para
determinar estratégias fundamentais no controle da doença causada por este patógeno.
Entretanto, existe a necessidade de monitorar as populações do Sul do Brasil através de
uma caracterização populacional mais intensa, com maior número de isolados, em
função de detectar sub-populações de linhagens distintas, a possível recombinação
gênica entre elas e a confirmação do isolamento populacional no Sul do Brasil.
66
4.3 Distribuição de genótipos tricotecenos-B em populações de Fusarium
graminearum dentro de lavouras comerciais
Resultados
Nos dois campos de trigo onde se realizou a amostragem de isolados de F.
graminearum a partir de espigas gibereladas, não foi possível recuperar o número
planejado de isolados (80) em ambas as lavouras. Na lavoura Vacaria foram
recuperados 75 isolados enquanto que, na lavoura Sarandi, recuperaram-se 35. Na
lavoura Vacaria, não foi possível recuperar isolados em um dos 20 pontos de
amostragem (do quadrante A), enquanto que na lavoura Sarandi, não foram recuperados
isolados de 2 pontos em distintos quadrantes.
Os 110 isolados analisados mostraram-se positivos para o Complexo Fg pela
reação com o oligonucleotídeo-iniciador Fg16F/R, verificados através da amplificação
de um fragmento de 450 pb (Nicholson et al., 1998). Todos os isolados NIV
apresentaram um polimorfismo nesta reação (fragmento de 500 pb).
Na lavoura Vacaria foram detectados os três genótipos tricotecenos: 15-ADON,
3-ADON e NIV (Figura 11). Já na lavoura B foram detectados apenas 15-ADON e
NIV. Em ambos os campos observou-se a maior proporção de 15-ADON, sendo de 96%
na lavoura Vacaria e 94,3% na lavoura Sarandi. A proporção de NIV variou de 1,3%
(Vacaria) a 5,7% (Sarandi). A proporção de detecção de 3-ADON no Campo Vacaria
foi de 2,7%. Considerando os dois campos combinados, as proporções médias foram de
95,2% de 15-ADON, 3,5% de NIV e 1,4% de 3-ADON (Tabela 6).
67
TABELA 6. Número e freqüência dos genótipos tricotecenos-B 3-ADON (3-acetil-desoxinovalenol), 15-
ADON (15-acetil-desoxinivalenol) e NIV (nivalenol) em duas lavouras em diferentes
municípios do Estado do Rio Grande do Sul – Brasil.
LAVOURA
3-ADON 15-ADON NIV TOTAL N* % N* % N* % N*
Vacaria 2 2,7 72 96 1 1,3 75 Sarandi 0 0 33 94,3 2 5,7 35 TOTAL 2 1,4 105 95,2 3 3,5 110
* Número de isolados
Os mapas de distribuição espacial dos genótipos tricoteceno-B sugerem uma
agregação dos genótipos menos predominantes no mesmo quadrante amostrado. Por
exemplo, isolados 3-ADON agruparam no mesmo quadrante (QD) em pontos
adjacentes no campo A (Figura 10A). Já no campo B, os genótipos NIV foram
recuperados de dois pontos adjacentes amostrados (QA-02 e QA-01) (Figura 10B).
No mesmo ponto de coleta da lavoura Sarandi, detectou-se a co-ocorrência de
15-ADON e NIV (Figura 10). Já na lavoura Vacaria, foi verificada a co-ocorrência de
NIV e 15-ADON, assim como 3-ADON e 15-ADON, no mesmo ponto de coleta,
ambos isolados de espigas distintas. Nesta lavoura, os genótipos tricoteceno NIV e 3-
ADON foram detectados em quadrantes distintos, porém muito próximos um ao outro.
68
FIGURA 10. Distribuição espacial de genótipos tricotecenos-B (3-acetil-desoxinivalenol, 15-acetil-
desoxinivalenol e nivalenol) em dois campos comerciais de trigo localizados no
município de Vacaria (A) e de Sarandi (B). (*) Pontos de coleta onde não foi possível
recuperar isolados, (QA, QB, QC, QD) Quadrantes de amostragem seguidos pelo
número 01 a 04 referentes ao ponto de amostragem. Laboratório de Epidemiologia de
Plantas - UFRGS, 2009.
A
B
69
FIGURA 11. Genótipos tricotecenos-B detectados por Multiplex-PCR Tri3 e Multiplex-PCR Tri12 para
isolados de F. graminearum obtidos de duas lavouras comerciais do Estado do Rio Grande
do Sul – Brasil. (A) Lavoura comercial no município de Vacaria, amostras representantes dos
pontos do quadrante C e D (QC e QD); (B) Lavoura comercial no município de Sarandi,
amostras referentes ao quadrante A (QA). O código dos isolados ilustrados compreendem em
número e letra. O número corresponde ao ponto de coleta e a letra a uma das quatro espigas
sintomáticas coletadas por ponto. Marcador de peso molecular de 100 pb em cada
extremidade (M), Controle Negativo (C-), Controle nivalenol (NIV), 3-ADON (3A) e 15-
ADON (15A). Laboratório de Epidemiologia de Plantas - UFRGS, 2009.
Discussão
Enquanto que, na literatura são encontrados alguns trabalhos que objetivaram
analisar os padrões espaciais da incidência de giberela em campos comerciais (Shah et
al., 2001; Del Ponte et al., 2009), existe pouca informação disponível sobre a
variabilidade e a distribuição do patógeno causador da giberela (seja F. graminearum ou
outras espécies) na escala de campo de trigo, assim como, sua associação com a síntese
A
B
70
de micotoxinas (Wilhem et al., 2005; Xu et al, 2007). Este é o primeiro trabalho
exploratório sobre a ocorrência simultânea de genótipos tricoteceno-B de F.
graminearum levando em consideração a sua localização espacial dentro de lavouras
comerciais de trigo na América do Sul.
A predominância de 15-ADON encontrada neste trabalho (escala de lavoura)
condiz com os valores descritos por Scoz et al (2009) para populações regionais de F.
graminearum, distribuídas em três estados do Sul do Brasil. A magnitude de 96% de
15-ADON encontrada por estes autores também presume valores encontrados para
populações de três distintos municípios (91,5%), dados apresentados em capítulos
anteriores do presente trabalho. Desta forma, supõe-se que exista um reflexo da
proporção da diversidade de genótipos tricotecenos em distintas escalas, seja em
populações regionais, locais ou em lavouras isoladas. Entretanto, detectou-se uma
diversidade mais alta entre os genótipos tricotecenos quando se considerou a escala de
lavouras individuais, não combinadas entre si em populações. Isso se deve ao fato de ter
sido possível detectar o genótipo 3-ADON em amostragens mais intensas, no caso, em
escalas menores (municípios e lavouras).
Em ambos os campos foi observado uma aleatoriedade na distribuição do
genótipo tricoteceno 15-ADON entre os quadrantes amostrados, o que confere com
observações feitas por Schmale et al. (2006a), onde mais de 96% dos isolados de
populações atmosféricas de G. zeae em Nova Iorque eram do tipo 15-ADON e, menos
de 4% dos isolados correspondiam ao genótipo 3-ADON. Porém, existe a necessidade
de uma amostragem mais intensa, a fim de verificar se clusters de 3-ADON e NIV
distribuídos na lavoura poderia ser novamente observada.
O padrão de agregação da doença, observado em algumas situações,
provavelmente resulta da agregação do inóculo inicial e a subseqüente dispersão local
71
via conídios (Horberg, 2002) ou ascósporos em função da diferente concentração de
peritécios em restos culturais colonizados (Schmale et al., 2005), principalmente resteva
de milho, que resultam em uma abundante esporulação durante a próxima estação de
cultivo (Pereyra & Dill-Macky, 2008). Observações prévias também indicam que esta
agregação deve-se a interação indireta de fatores de variação microclimática (Trail et
al., 2002, Beyer et al., 2005; Fernandes et al., 2007; Paul et al., 2007;), suscetibilidade
de hospedeiro e colonização por outros patógenos (Xu et al., 2004).
Estudos recentes na América do Norte observaram a distribuição espacial de
giberela em quatro campos (Shah & Bergstrom, 2001). O padrão de distribuição da
doença foi completamente aleatório em três de quatro campos amostrados, indicando
que o inóculo primário na infecção estava distribuído ao acaso. Já em um trabalho
preliminar no Brasil (Spolti et al., 2009) onde há abundância de inóculo em função do
plantio direto, o padrão de distribuição espacial não foi afetado pela característica de
resteva, ou seja, cultura de verão, mas sim, pela intensidade das epidemias. Regiões
com alto índice de giberela apresentaram a maior proporção de campos com
distribuição agregada.
A agregação espacial detectada no presente trabalho, de isolados com genótipos
NIV em um campo e 3-ADON em outro, pode ser devido à colonização saprofítica,
uma vez que, o inóculo oriundo de longas distâncias, possivelmente, consistiria de uma
mistura homogênea de populações atmosféricas resultando em padrões aleatórios
(Schmale et al., 2006a). Outra possível explicação seria o fato de ocorrer o ciclo
secundário, onde o ciclo assexual pode ter contribuído para a agregação de genótipos
NIV e 3-ADON pela dispersão de macroconídios principalmente pela ação das chuvas,
que limita as distâncias alcançadas (Paul et al., 2003; Schmale et al., 2006b). Estas
informações são indicativos da importância do inóculo secundário na intensidade final
72
da doença, em locais onde o inóculo primário não é limitante. Além disso, podem
resultar no uso ou exclusão de táticas de manejo cultural, assim como o controle de
fontes potenciais de inóculo em escala local ou regional, levando-se em consideração a
característica populacional local do patógeno (variabilidade de genótipos tricotecenos
ligada a fatores de disseminação e taxa de esporulação).
A diferença entre quimiotipos pode afetar a ecologia e dinâmica populacional de
representantes do clado F. graminearum, principalmente devido às diferenças entre a
toxicidade e bioatividade de tricotecenos.
Diversos estudos demonstraram que DON atua como um fator de virulência para
F. graminearum (Desjardins & Plattner, 2003) e que este quimiotipo é mais agressivo
em relação ao NIV (Carter et al., 2002; Desjardins & Plattner, 2003), que, por final, é
menos fitotóxico a plantas do que DON. A diferença de agressividade entre as formas
acetiladas de DON (3-ADON e 15-ADON) ainda não estão bem elucidadas, mas a
predominância e ampla distribuição de 15-ADON sugere que estes isolados possuam
uma vantagem adaptativa modulando o fitness do patógeno em relação aos genótipos
NIV, menos freqüentes (Spolti et al., 2009). Nesse caso, a detecção de distintos
genótipos tricotecenos em um campo de produção de trigo no Sul do Brasil aponta que a
pressão de seleção sobre a virulência atua diretamente sobre a variabilidade
populacional (presença de distintos genótipos tricotecenos), podendo a agressividade ser
fator chave na predominância desse genótipo na população. Desta forma, um melhor
entendimento da distribuição espacial de genótipos tricoteceno-B em lavouras de trigo
pode indicar a origem da epidemia de giberela.
Uma série de experimentos envolvendo isolados produtores e não-produtores de
DON foram desenvolvidos para espécies de Fusarium. Em todos os casos, a síntese de
DON conferiu a habilidade de colonização entre espiguetas de trigo. Em contraste,
73
isolados produtores de NIV eram severamente comprometidos quanto à colonização de
tecidos da espiga infectada. Jansen et al. (2005) demonstrou que isolados incapazes de
sintetizar tricotecenos não colonizavam tecidos adjacentes e não se estendiam pela
ráquis. O crescimento das hifas era impedido pela fortificação da parede celular dos
nódulos da ráquis e pela deposição de compostos fenólicos (Vidhyasekaran et al.,
2007). Supostamente esta resposta de defesa da planta é inibida por tricotecenos. O
predomínio de 15-ADON em lavouras do Sul do Brasil pode ser em função das
vantagens adaptativas desse patógeno em relação aos demais genótipos tricoteceno,
principalmente pelo fato de que a capacidade de expansão da lesão é mais rápida que
NIV (Desjardins et al., 2003). Em situações onde os fatores climáticos são limitantes a
infecção e a janela de infecção se torna curta, o genótipo 15-ADON será mais bem
sucedido em termos de colonização e infecção.
A detecção de um polimorfismo na reação com Fg16F/R sugere a presença de
distintas linhagens no mesmo campo. Partindo do pressuposto que distintas linhagens
cruzam entre si, apesar de ser em taxas muito pequenas, não se pode descartar a
hipótese de que esteja ocorrendo troca genética entre essas e que durante o processo
evolutivo, linhagens genótipo NIV venham a possuir vantagens evolutivas de indivíduos
genótipo 15-ADON. Este fato é alarmante quando levamos em consideração que a
toxina NIV é dez vezes mais tóxica para humanos que DON. Numa situação onde a
adaptabilidade deste genótipo permita que o mesmo seja tão agressivo como 15-ADON,
surge à necessidade de certificar os produtos de cereais quanto aos níveis aceitáveis
desta toxina.
Não somente o presente trabalho nos fornece a informação da co-ocorrência de
genótipos tricotecenos no campo, mas fundamenta a necessidade de trabalhos no
monitoramento destas toxinas por métodos analíticos químicos (cromatografia, etc.),
74
relacionando com a variabilidade espacial dos quimiotipos. Desta forma, o potencial
toxigênico detectado por ferramentas moleculares pode ser validado, ou não, como um
método preditivo da presença destas toxinas no produto final, além de ser uma
importante ferramenta no estudo da epidemiologia molecular, caracterizando as fontes
de inóculo e possíveis origens da epidemia. Não somente, este trabalho impulsiona
trabalhos comparativos de agressividade de distintos genótipos tricotecenos, além da
verificação da presença de distintas linhagens e possível cruzamento entre essas.
75
5 CONCLUSÕES
1. A giberela do trigo no Sul do Brasil é conseqüência da infecção por múltiplas
linhagens do Complexo Fg. Isolados de F. graminearum provenientes de trigo
do Sul do Brasil constituem um complexo de espécies filogeográficas distintas,
sendo a espécie F. graminearum sensu stricto (linhagem 7) encontrada em maior
freqüência, ocorrendo também as linhagens 2 (F. meridionale), 5 (F. acaciae-
mearnsii) e 8 (F. cortaderiae);
2. A freqüência dos genótipos tricotecenos foi refletida em distintas escalas de
amostragem (populações regionais e locais) de representantes do Complexo Fg
no Sul do Brasil, encontrando-se o predomínio de 15-ADON em ambas e a
presença de genótipos NIV e 3-ADON;
3. Foi possível encontrar uma relação entre os genótipos tricotecenos e as distintas
espécies filogeográficas encontradas no Sul do Brasil, sendo todos os
representantes da linhagem 7 genótipo 15-ADON e da linhagem 2 genótipo
NIV, confirmando a relação descrita em trabalhos anteriores.
4. Os estudos populacionais revelaram um possível isolamento reprodutivo entre as
três populações amostradas não constituindo, aparentemente, uma população
panmítica. Porém, um alto fluxo gênico foi verificado dentre elas resultando em
uma alta diversidade genética, o que confere um poder adaptativo ao patógeno.
Entretanto, a distinção genética entre as três populações é um indicativo de que
certas características genéticas são exclusivas de uma população, onde estudos
76
genéticos e fenotípicos mais intensos poderão elucidar possíveis táticas eficazes
no manejo da doença em determinadas áreas.
5. A agregação espacial de genótipos tricoteceno menos predominantes como NIV
e 3-ADON, em lavouras comerciais sugere a importância do inóculo local no
desenvolvimento da epidemia.
77
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90
APÊNDICE 01. Potencial toxigênico de isolados obtidos de grãos de trigo de três municípios do RS – Brasil, Safra 2007.
! Tri$3$ Tri$12$ $! 3#ADON! 15#ADON! NIV! 3#ADON! 15#ADON! NIV! FG!CA01! !! +! !! !! +! !! +!CA02! !! +! !! !! +! !! +!CA03! !! +! !! !! +! !! +!CA04! !! +! !! !! +! !! +!CA05! !! +! !! !! +! !! +!CA06! !! +! !! !! +! !! +!CA07! !! +! !! !! +! !! +!CA08! !! +! !! !! +! !! +!CA09! !! +! !! !! +! !! +!CA10! !! +! !! !! +! !! +!CA11! !! +! !! !! +! !! +!CA12! !! +! !! !! +! !! +!CA13! !! +! !! !! +! !! +!CA14! !! +! !! !! +! !! +!CA15! !! +! !! !! +! !! +!CA16! !! +! !! !! +! !! +!CA17! !! +! !! !! +! !! +!CA18! !! +! !! !! +! !! +!CA19! !! +! !! !! +! !! +!CA20! !! +! !! !! +! !! +!CA21! !! +! !! !! +! !! +!CA22! !! +! !! !! +! !! +!CA23! !! +! !! !! +! !! +!CA24! !! +! !! !! +! !! +!CA25! !! !! +! !! !! +! BP*!CA26! !! +! !! !! +! !! +!CA27! !! +! !! !! +! !! +!CA28! +! !! !! +! !! !! +!CA29! !! +! !! !! +! !! +!CA30! !! +! !! !! +! !! +!CA31! !! +! !! !! +! !! +!CA32! !! +! !! !! +! !! +!CA33! !! +! !! !! +! !! +!CA34! !! +! !! !! +! !! +!CA35! !! +! !! !! +! !! +!CA36! !! +! !! !! +! !! +!CA37! !! +! !! !! +! !! +!CA38! !! +! !! !! +! !! +!CA39! !! +! !! !! +! !! +!
continuação APÊNDICE 01. Potencial toxigênico de isolados obtidos de grãos de trigo de três municípios do RS – Brasil, Safra 2007.
91
! Tri$3$ Tri$12$ !! 3#ADON! 15#ADON! NIV! 3#ADON! 15#ADON! NIV! FG!CA40! !! +! !! !! +! !! +!CA41! !! +! !! !! +! !! +!CA42! !! +! !! !! +! !! +!CA43! !! +! !! !! +! !! +!CA44! !! +! !! !! +! !! +!CA45! !! +! !! !! +! !! +!CA46! !! +! !! !! +! !! +!CA47! !! +! !! !! +! !! +!CA48! !! +! !! !! +! !! +!CA49! !! +! !! !! +! !! +!CA50! !! +! !! !! +! !! +!EN01! !! +! !! !! +! !! +!EN02! !! +! !! !! +! !! +!EN03! !! +! !! !! +! !! +!EN04! !! +! !! !! +! !! +!EN05! !! +! !! !! +! !! +!EN06! !! +! !! !! +! !! +!EN09! !! +! !! !! +! !! +!EN11! !! +! !! !! +! !! +!EN13! !! +! !! !! +! !! +!EN14! !! +! !! !! +! !! +!EN15! !! +! !! !! +! !! +!EN16! !! +! !! !! +! !! +!EN17! !! +! !! !! +! !! +!EN18! !! +! !! !! +! !! +!EN20! !! +! !! !! +! !! +!EN21! !! +! !! !! +! !! +!EN23! !! +! !! !! +! !! +!EN24! !! +! !! !! +! !! +!EN25! !! +! !! !! +! !! +!EN26! !! +! !! !! +! !! +!EN27! !! +! !! !! +! !! +!EN28! !! +! !! !! +! !! +!EN29! !! +! !! !! +! !! +!EN30! !! +! !! !! +! !! +!EN31! !! +! !! !! +! !! +!EN32! !! +! !! !! +! !! +!EN33! !! !! +! !! !! +! BP!EN34! !! +! !! !! +! !! +!
continuação APÊNDICE 01. Potencial toxigênico de isolados obtidos de grãos de trigo
de três municípios do RS – Brasil, Safra 2007.
92
! Tri$3$ Tri$12$ !! 3#ADON! 15#ADON! NIV! 3#ADON! 15#ADON! NIV! FG!EN35! !! +! !! !! +! !! +!EN36! !! +! !! !! +! !! +!EN37! !! +! !! !! +! !! +!EN39! !! +! !! !! +! !! +!EN40! !! +! !! !! +! !! +!EN41! !! +! !! !! +! !! +!EN42! !! +! !! !! +! !! +!EN43! !! +! !! !! +! !! +!EN44! !! +! !! !! +! !! +!EN45! !! +! !! !! +! !! +!EN47! !! +! !! !! +! !! +!EN48! !! +! !! !! +! !! +!EN49! !! +! !! !! +! !! +!NO01! !! +! !! !! +! !! +!NO02! !! +! !! !! +! !! +!NO03! !! +! !! !! +! !! +!NO04! !! +! !! !! +! !! +!NO05! !! !! +! !! !! +! BP!NO06! !! +! !! !! +! !! +!NO07! !! +! !! !! +! !! +!NO08! !! +! !! !! +! !! +!NO09! !! +! !! !! +! !! +!NO10! !! !! +! !! !! +! BP!NO11! !! +! !! !! +! !! +!NO12! !! +! !! !! +! !! +!NO13! !! !! +! !! !! +! BP!NO14! !! !! +! !! !! +! BP!NO15! !! +! !! !! +! !! +!NO16! !! +! !! !! +! !! +!NO17! !! +! !! !! +! !! +!NO18! !! +! !! !! +! !! +!NO19! !! +! !! !! +! !! +!NO20! !! +! !! !! +! !! +!NO21! !! +! !! !! +! !! +!NO22! !! +! !! !! +! !! +!NO23! !! +! !! !! +! !! +!NO24! !! +! !! !! +! !! +!NO25! !! +! !! !! +! !! +!NO26! !! +! !! !! +! !! +!
continuação APÊNDICE 01. Potencial toxigênico de isolados obtidos de grãos de trigo
de três municípios do RS – Brasil, Safra 2007.
93
! Tri$3$ Tri$12$ !! 3#ADON! 15#ADON! NIV! 3#ADON! 15#ADON! NIV! FG!NO27! !! +! !! !! +! !! +!NO28! !! !! +! !! !! +! BP!NO29! !! +! !! !! +! !! +!NO30! !! !! +! !! !! +! BP!NO31! !! +! !! !! +! !! +!NO32! !! +! !! !! +! !! +!NO33! !! +! !! !! +! !! +!NO34! !! +! !! !! +! !! +!NO35! !! +! !! !! +! !! +!NO36! !! +! !! !! +! !! +!NO37! !! !! +! !! !! +! BP!NO38! !! +! !! !! +! !! +!NO39! !! +! !! !! +! !! +!NO40! !! +! !! !! +! !! +!NO41! !! +! !! !! +! !! +!NO42! !! +! !! !! +! !! +!NO43! !! +! !! !! +! !! +!NO44! !! +! !! !! +! !! +!NO45! !! +! !! !! +! !! +!NO46! !! !! +! !! !! +! BP!NO47! !! +! !! !! +! !! +!NO48! !! !! +! !! !! +! BP!NO49! !! +! !! !! +! !! +!NO50! !! +! !! !! +! !! +!
*BP = banda polimórfica de 500 pb
94
APÊNDICE 02. Representantes do complexo Fusarium graminearum (FGSC) isolados de grãos de trigo – Safra 2007 – de três municípios do RS - Brasil.
Código isolado Município Hospedeiro Genótipo
tricoteceno Linhagem
CA10! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA11! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA12! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA13! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA14! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA15! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA17! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA18! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA19! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA20! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA21! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA22! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA23! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA24! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA27! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto CA28! Cruz Alta grão/trigo 3-ADON F. cortaderiae CA29! Cruz Alta grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto
EN15! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN32! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN33! Ernestina grão/trigo NIV F. acacie mearnsii EN34! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN35! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN36! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN37! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN39! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN40! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN41! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN42! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN43! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN44! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN45! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN47! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN48! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto EN49! Ernestina grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto
NO03! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO04! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO06! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto
95
continuação APÊNDICE 02. Representantes do complexo Fusarium graminearum (FGSC) isolados de grãos de trigo – Safra 2007 – de três municípios do RS - Brasil.
Código!isolado! Município Hospedeiro Genótipo tricoteceno Linhagem
NO07! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO08! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO09! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO10! Nonoai grão/trigo NIV F. meridionale NO12! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO13! Nonoai grão/trigo NIV F. meridionale NO15! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto NO28! Nonoai grão/trigo NIV F. meridionale NO30! Nonoai grão/trigo NIV F. meridionale NO46! Nonoai grão/trigo NIV F. meridionale NO48! Nonoai grão/trigo 15-ADON F. graminearum sensu stricto
96
APÊNDICE 03. Controle da quimiotipagem e amplificação espécie-específica para membros do Complexo Fusarium graminearum (FGSC) isolados de espigas sintomáticas da Safra 2008 de uma lavoura comercial no município de Vacaria – RS, Brasil.
Tri 3 Tri 12
Quadrante Ponto Coleta 3-ADON 15-ADON NIV 3-ADON 15-ADON NIV Fg16
QA
1A + + NF 1B + + + 1C + + + 1D + + + 2A + + + 2B + + + 2C + + + 2D + + + 3A + + + 3B + + + 3C + + + 3D + + + 4B + + + 4C + + + 4D + + + 5A + + + 5B + + + 5C + + + 5D + + +
QB
6A + + + 6B + + + 6D + + + 7A + + + 7B + + + 7C + + + 7D + + + 8A + + + 8B + + + 8D + + + 9A + + + 9B + + + 9C + + + 9D + + + 10A + + + 10B + + + 10C + + + 10D + + +
QC
11A + + + 11B + + + 11C + + + 11D + + + 12C + + + 12D + + + 13A + + +
continuação APÊNDICE 03. Controle da quimiotipagem e amplificação espécie-específica para membros do Complexo Fusarium
97
graminearum (FGSC) isolados de espigas sintomáticas da Safra 2008 de uma lavoura comercial no município de Vacaria – RS, Brasil.
Tri 3 Tri 12
Quadrante Ponto Coleta 3-ADON 15-ADON NIV 3-ADON 15-ADON NIV Fg16
QC
13B + + + 13C + + +
13D + + + 14A + + + 14B + + + 14C + + + 14D + + + 15A + + BP* 15B + + + 15C + + + 15D + + +
QD
16A + + + 16B + + + 16C + + + 16D + + + 17A + + + 17B + + + 17C + + + 17D + + + 18A + + + 18B + + + 18C + + + 18D + + + 19A + + + 19B + + + 19C + + + 19D + + + 20A + + + 20B + + + 20C + + + 20D + + +
*BP = banda polimórfica de 500 pb
98
APÊNDICE 04. Controle da quimiotipagem e amplificação espécie-específica para membros do Complexo Fusarium graminearum (FGSC) isolados de espigas sintomáticas da Safra 2008 de uma lavoura comercial no município de Sarandi – RS, Brasil.
Tri 3 Tri 12 Quadrante Ponto Coleta 3-ADON 15-ADON NIV 3-ADON 15-ADON NIV Fg16
QA
1B + + + 1C + + BP* 1D + + + 2C + + BP 3B + + + 3C + + + 5A + + + 5C + + +
QB
6C + + + 7C + + + 8B + + + 8C + + + 8D + + + 9A + + + 9C + + + 9D + + + 10B + + + 10D + + +
QC
11A + + + 11D + + + 12D + + + 13B + + + 13D + + + 15D + + +
QD
16B + + + 16C + + + 16D + + + 17B + + + 17C + + + 18A + + + 18D + + + 19D + + + 20A + + + 20B + + + 20C + + +
*BP = banda polimórfica de 500 pb