universidade federal rural do rio de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
Instituto de Biologia
Curso de Pós-Graduaça o em Medicina Veterinária
Parasitologia Veterinária
CARACTERÍSTICAS HUMORAIS DA HEMOLINFA DO CARRAPATO
Boophilus microplus (Canestrini, 1887), PROVENIENTES
DE BOVINOS INFESTADOS NATURALMENTE
LEUCIO CAMARA ALVES
1991
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
- PARASITOLOGIA VETERINÁRIA
CARACTERÍSTICAS HUMORAIS DA HEMOLINFA DO CARRAPATO
Boophilus microplus (CANESTRINI, 1887), PROVENIENTES
DE BOVINOS INFESTADOS NATURALMENTE
Leucio Camara Alves
SOB A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR DR. Carlos Luiz Massard
Tese submetida como requisito
parcial para obtenção do grau
Philosophiae Doctor em Medicina
Veterinária - Parasitologia Ve-
terinária.
Itaguaí, Rio de Janeiro
1991
CARACTERÍSTICAS HUMORAIS DA HEMOLINFA DO CARRAPATO
Boophilus microplus (Canestrini, 1887), PROVENIENTES
DE BOVINOS INFESTADOS NATURALMENTE
AUTOR
Leucio Camara Alves
Aprovada em: 07/08/1991
CARLOS LUIZ MASSARD
NICOLAU MAUÉS DA SERRA FREIRE
JOÃO LUIZ HORÁCIO FACCINI
GILBERTO GARCIA BOTELHO
ADIVALDO HENRIQUE DA FONSECA
iv
A ANA e RENATO pelo que vocês
significam e são para mim.
Aos meus pais LUIS e LUCIA
por todas as lições da vida.
vi
A minha sogra ,
IN MEMORIAN
vii
A G R A D E C I M E N T O S
Ao Professor CARLOS LUIZ MASSARD, pela orientação, apoio,
amizade e acima de tudo a confiança em mim depositada, meu
sincero agradecimento.
Ao Professor CARLOS WILSON GOMES LOPES, pelo apoio e in-
centivo constante.
Ao Professor GILBERTO GARCIA BOTELHO, pela cordialidade e
confiança que nos recebeu.
A minha esposa ANA, pelo companheirismo e colaboração em
todas as fases deste trabalho e ao meu filho RENATO, pela pa-
ciência de esperar-me para brincar, divido o mérito deste tra-
balho.
Ao Sr. ALEXADROS MOISAKIS, Sra. LUCIA ALVES MOISAKIS E
LUCIANA ALVES MOISAKIS, pelo estímulo, incentivo, apoio e
expressão de amizade, sem a qual seria muito difícil chegar a
conclusão deste trabalho, a minha admiração e gratidão.
Ao Sr. EVANDRO DE AZEVEDO E SILVA, CLAUDIO ROBERTO LEAL E
SILVA e GUSTAVO JOSE LEAL E SILVA, pelo apoio, que apesar da
distância ser grande sempre nos pareceu não existir.
Ao colega GUIDO FONTGALLAND COELHO LINHARES, pela inesti-
mável colaboração prestada na execução deste trabalho.
viii
Aos colegas do Curso de Pós-Graduação em Medicina Veteri-
nária -Parasitologia Veterinária e de Patologia Veterinária em
especial a SILVIA AHID, LUIS CARLOS LIZEU, KATIA FAMADAS,
MARGARETH QUEIROZ, RONALD FREIRE, MARY JANE MATTOS, JOSE AUGUSTO
DA SILVA, JOSE DIOMEDES BARBOSA, MARIA VERONICA BATISTA e MARCOS
GOMES pela expressão de amizade e união.
A todos os professores do Curso de pós-Graduação em Medicina
Veterinária - Parasitologia Veterinária em especial a
Profª. DAYSY WILWERTH DA CUNHA, PROFº. NICOLAU MAUES DA SERRA
FREIRE, Profº. ULISSES EUGÊNIO CAVALCANTI CONFALONIERI, Profº. HUGO
DE SOUZA LOPES (IN MEMORIAN) e Profº. JOÃO LUIZ HORACIO FACCINI,
com quem compartilhamos o ensino aprendizado.
Ao Profº. OMAR MIGUEL, pela orientação estatística, e ao
Profº.GABRIEL RIVAS, pela colaboração na análise dos resultados.
Ao Profº. PEDRO MANUEL LEAL GERMANO, pela cordialidade e
orientação informática.
Ao Profº. MAURO RODRIGUES DE OLIVEIRA, pelo apoio e expressão
de amizade.
Aos colegas do Laboratório da Parasitologia e Imunologia do
Hospital Evandro chagas da Fundação Oswaldo Cruz, em especial a
TÂNIA SCHUBACH, KATIA ASSIS, MARILÉIA ARAUJO, MARCOS ANTONIO DE
MELO, JANETE CUBA, SUELY CARVALHO, e INGBURG GEORG, pela ajuda
na confecção deste trabalho.
A Profª. ROSANGELA ZACARIAS MACHADO e ao Profº. JOAQUIN
PATARROYO-SALCEDO, pela cordialidade de cessão da cepa de Babesia
bigemina utilizada neste trabalho.
ix
Ao Departamento de Medicina Veterinária da Universidade
Federal Rural de Pernambuco, em particular ao Laboratório de
Doenças Parasitárias, na pessoa de Dra. IVONE HOLANDA DE OLIVEIRA
PEREIRA, Dra. LUCIA VIRGINIA BARBOSA RAMOS e Dr. JOSE GOMES
FILHO, pelo apoio constante durante nosso afastamento.
A grande amiga TOMOE NODA SAUKAS, pela amizade, incentivo e
apoio, o nosso respeito.
Ao amigo ANDRE CARVALHO, pela constante presteza e
colaboração.
A IRENE SILVA, pela dedicação e lealdade, nosso muito
obrigado.
Aos Professores que fazem parte do corpo docente da Clínica
Cirúrgica do Instituto de Veterinária da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, em particular ao Profº. RAFAEL BARBOSA
e ao Profº. LUIS FIGUEIRA PINTO, pelas intervenções cirúrgicas
necessários neste trabalho.
Aos funcionários da Estação para Pesquisas Parasitológicas
W.O. NEITZ em especial a ARCANJO GONÇALVES DA SILVA, SEVERINO
GONÇALVES DA SILVA, OSWALDO DA SILVA, WILSON ALMEIDA, VALERINO
ZEQUINI e WANDERLEY DE LIMA, pela colaboração em todas as horas.
Ao Programa Institucional de Capacitação de Docentes, pela
cessão da bolsa.
A todos aqueles, que direta ou indiretamente contribuíram
para realização deste trabalho.
X
BIOGRAFIA
LEUCIO CAMARA ALVES, filho de Luis Guimarães Alves e Lúcia
Câmara Alves, nasceu a 08 de setembro de 1960, na cidade do
Recife, Estado de Pernambuco.
Realizou o curse primário e ginásio no Colégio Marista,
Recife, Pernambuco.
O curso Colegial foi realizado no União Colégio e Curso,
naquela mesma cidade.
Em 1979, segundo semestre, ingressou no Curso de Medicina
Veterinária na Universidade Federal Rural de Pernambuco, tendo
obtido o título de Médico Veterinário em julho de 1983.
Durante a vida acadêmica, foi selecionado para monitoria de
Zoologia Geral e exerceu aquele mesmo cargo nas disciplinas de
Parasitologia I e Parasitologia II.
Em dezembro de 1983, foi aprovado no Concurso para Professor
Axiliar na disciplina de Doenças Parasitárias dos Animais
Domésticos no Departamento de Medicina Veterinária da
Universidade Federal Rural de Pernambuco.
Em março de 1985, ingressou no Curso de Pós-Graduação de
Epidemiologia Experimental e Aplicado às Zoonosas, a nível de
Mestrado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
xi
Universidade de São Paulo, obtendo o grau de Mestre em março de
1987.
Em julho de 1988, foi selecionado para fazer parte do VII
Curso de Sorologia em Doenças Parasitárias, realizado no
Instituto de Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo.
Em março de 1989, ingressou no Curso de Pós-Graduação a
nível de Doutorado em Medicina Veterinária-Parasitologia
Veterinária no Instituto de Biologia da Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro.
xii
S U M Á R I O
INTRODUÇÃO
REVISÃO DA LITERATURA
Potencial Hidrogeniônico
Cor da hemolinfa
Perfil Protéico
Presença de Imunoglobulina
MATERIAL E MÉTODOS
Colheita do material
Testes Imunológicos
Eletroforese
Imunoeletroforese
Soro Imune utilizado
Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI)
Conjugado utilizado
Soros Controle Positivo e Negativo
Realização dos testes de IFI
Análise estatística
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Colheita do material
Pág.
01
03
03
04
04
07
10
10
13
13
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15
15
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17
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19
20
20
Carrapatos
Hemolinfa
Testes Imunológicos
Eletroforese
Imunoeletroforese
IFI
CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
APÊNDICE
xiii
20
21
25
25
28
31
36
38
44
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1 -
Figura 2 -
Figura 3 -
Figura 4a -
Figura 4b -
Figura 5 -
Babesia bigemina em estiraço padrão
para o teste de IFI. Giemsa, 1000 x
Eletroforese em Papel (acetato celulose)
Coloração pelo Ponceau - S
Número médio de frações proteicas em
hemolinfa de B. microplus. Itaguaí, RJ, 1991
Hemolinfa de B. microplus positiva ao
teste de Imunoeletroforese. Coloração
pelo Preto de Amido
Reação Padrão do teste de Imunoeletroforese
soro bovino e seu respectivo antisoro produ-
zido em caprino. Coloração pelo Preto de
Amido
Hemolinfa de B. microplus em reação
positiva ao teste de IFI. 500 x
32
84
18
26
29
82
XV
Tabela I -
Tabela II -
Tabela III -
Tabela IV -
Tabela V -
ÍNDICE DE TABELAS
Freqüências absoluta e relativa para o poten-
cial hidrogeniônico em hemolinfa de teleó-
ginas de B. microplus provenientes de bovinos
infestados naturalmente. Itaguaí, RJ, 1991
Tabela de Contingência para cor e pH em hemo-
linfa de B. microplus provenientes do municí-
pio de Itaguaí. RJ, 1991
Distribuição, freqüência absoluta e relativa
das frações protéicas em hemolinfa de B.
microplus, obtidas pelo método de Eletrofore-
se em acetato celulose. ltaguaí, RJ, 1991
Tabela de Contingência para número de frações
protéicas e pH da hemolinfa de B. microplus.
Itaguaí, RJ, 1991
Hemolinfa de B. microplus, segundo as freqüên-
cias absoluta e relativa de reagentes ao tes-
te de IFI para B. bigemina. Itaguaí, RJ, 1991
22
24
27
30
35
Pág.
xvi
RESUMO
Amostras de hemolinfa provenientes de 291 teleóginas de
Boophilus microplus, foram analisadas para determinação da cor,
potencial hidrogeniônico (pH), perfil protéico e presença de
componentes séricos.
A mensuração do pH foi realizada por meio de fitas
indicadoras para determinação de pH e o resultado obtido variou
de 6.4 a 7.2, sendo que 95,19% das amostras mostraram um pH
variando entre 6,7 e 7,0. A hemolinfa mostrou ser um líquido
claro e incolor; contudo em rodas as amostras cujo o pH foi de
7,2 a cor observada foi rósea.
O fracionamento protéico foi efetuado por meio da
eletroforese em acetato celulose, revelando existir 6 a 15
frações proteicas, sendo que 79% das amostras analisadas
continham 11 a 13 frações. O método de Imunoeletroforese foi
utilizado para detectar a presença de componentes séricos,
usando-se para tanto antisoro bovino produzido em caprino. Para
testar a atividade das imunoglobulinas de origem bovina na
hemolinfa, foi realizado o teste de Imunofluorescência Indireta
(IFI), utilizando como antígeno Babesia bigemina.
xvii
SUMMARY
Analyses of pH, colour, proteins patterns and presente of
host's serum components in haemolymph of 291 engorged females of
the cattle tick Boophilus microplus were performed.
The haemolymph was a colourless clear fluid, excepted at pH
7.2. At this level it was pinkish. The pH of haemolymph was
meansured by strips indicator and ranged from ph 6.4 to 7.2,
with 95,19% of samples ranging from 6.7 to 7.0.
Six to fifteen proteins bands were found by acetate celulose
electrophoresis, being 79% of all samples had 11 to 13 bands.
immunoelectrophoretic analysis was performed to detect host's
serum components using Goat Anti-serum against Bovine serum. To
test immunoglobulin activity in the haemolymph, functional
antibodies to Babesia bigemina was determined by Indirect
Fluorescent Antibody (IFA).
I. INTRODUÇÃO
Os carrapatos da família Ixodidae Murray, 1877, na qual
incluem-se o gênero Boophilus (Curtice, 1891), são ectopara-
sitos obrigatórios dos animais, especialmente os bovinos, vivendo
as custas dos hospedeiros para seu completo desenvolvimento
durante a vida parasitária. Nestas condições, a sua fisiologia é
dependente do hospedeiro vertebrado, sobretudo da ingestão de
alimentos para o crescimento e posterior maturação dos ovos
durante sua vida reprodutiva.
Todos os nutrientes ingeridos no repasto sanguíneo, são
absorvidos através da parede intestinal e passam diretamente para
a hemolinfa, de onde serão distribuídos para todo o corpo do
carrapato.
A composição deste fluído que banha todos os órgãos é
variada, porém assim como o sangue nos animais superiores, a
hemolinfa é dividida em duas porções: celular, que contém os
hemócitos, e porção fluída ou plasma. Aliado a estas porções,
podemos encontrar ainda muitos elementos não hemocíticos como
fragmentos de músculos, glóbulos de gorduras, cristais livres,
protozoários, bactérias, nematóides e células tumorais entre
outros (Romoser, 1973). A hemolinfa é responsável pelo transporte
de substâncias químicas solúveis, como hormônios e neurohormônios,
assim como mediadores químicos do metabolismo, por todo o corpo
do carrapato.
Apesar da existência de literatura internacional sobre o
potencial hidrogeniônico, pressão osmótica, concentração
protéica, e presença de globulinas naquele fluído, nada existe
relatado no nosso país, sobre o estudo da hemolinfa deste
carrapato tão importante dentro da nossa pecuária.
O objetivo do presente trabalho foi estudar o potencial
hidrogeniônico, cor, perfil protéico e presença de
imunoglobulinas de origem bovina em hemolinfa de Boophilus
microplus (Canestrini, 1887). Com relação a este último ítem será
verificada a especificidade daquela classe de globulina.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 POTENCIAL HIDROGÊNIONICO
A determinação do potencial hidrogeniônico (pH), em
hemolinfa de diferentes classes de artrópodes tem sido descrita
na literatura. Na classe insecta, apesar de alguns fatores como
idade, sexo, ordem e espécie de inseto, contribuírem para
alterar o pH da hemolinfa (Ross, 1965; Chapman, 1980), o mesmo pode
ser ligeiramente ácido (Ross, 1965; Wigglesworth, 1974; Richards &
Davies, 1977) ou ligeiramente alcalino assumindo valores entre 5,9
a 7,2 (Chauvin, 1949), 6,0 a 7,0 (Romoser, 1973); 6,0 a 7,5
(Borror et al, 1976) e 6,0 a 7,7 (Chapman, 1980). Segundo Borror et
al (1976), a hemolinfa dos insetos possui um sistema tampão que
serve para manter um pH constante e relativo.
Em se tratando da classe Arachnida, poucos são os relatos no
qual mencionam o pH deste fluído. No que concerne a determinação
de pH da hemolinfa de carrapatos, a literatura é muito escassa.
Kaufman et al (1982), quantificaram o pH da hemolinfa do
carrapato Ornithodoros moubata (Murray, 1877), em torno de 6,82 ±
4
0,05 através da inoculação de inulina marcada diretamente na
cavidade celomática carrapato. A obtenção da hemolinfa foi feita
por meio da secção de uma ou mais patas e para mensuração de pH
foi utilizado o radiômetro capilar.
2.2 COR DA HEMOLINFA
A hemolinfa dos artrópodes geralmente é um líquido claro,
incolor e que banha todos os órgãos. Entre os insetos, este
fluído além de ser transparente, pode assumir colorações
suavemente amarelada ou esverdeada (Wigglesworth, 1974) e esta
mudança de cor pode estar associada a presença de pigmentos
(Romoser, 1973; Lara, 1979; Chapman, 1980).
Borror et al (1976), descreveram que via de regra o plasma
dos insetos é transparente e incolor, porém face a ocorrência de
pigmentos, pode ter tonalidades como amarelo, castanho, verde,
laranja e ainda vermelho.
Baker & Wharton (1952), assinalaram que muitos sistemas
circulatórios de Acarina, consistem somente de hemolinfa que é um
líquido incolor e que banha todos os órgãos. Entretanto a
coloração da hemolinfa de carrapatos pode ser suavemente túrbida
(Douglas apud Tyler, 1988, e Arthur, 1962) ou ainda possuir segundo
Obenchain & Oliver (1976), uma coloração esverdeada em certas
espécies de Amblyomma Koch, 1844.
2.3 PERFIL PROTÉICO
As proteínas da hemolinfa dos insetos ocorrem em
concentrações similares aquelas do sangue dos vertebrados e em
concentrações maiores do que aquelas encontradas em fluídos
internos de outros invertebrados (Florkin & Jeuniaux, 1974).
Diferentes frações protéicas tem sido demonstradas por meio de
métodos imunológicos entre os quais podemos citar, eletroforese
em acetato celulose, eletroforese em gel de agar ou agarose e
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).
A técnica de eletroforese em papel é a mais simples de todas
as ourtas e vários são os suportes utilizados, sendo a sua
interpretação feita através da densitometria. Ross (1968),
utilizando como suporte fitas de acetato celulose, demonstrou
existir diferenças entre as proteínas do ovo nas espécies A e B
de Anopheles gambiae (Giles, 1902).
Engelmann & Penney (1966), utilizando o suporte idêntico
para estudar as proteínas da hemolinfa durante a maturação dos
ovos em espécies da ordem Dictyoptera, observaram nove frações
protéicas naquele plasma, sendo que apenas duas delas estavam
presentes em todas as fases do ciclo sexual.
Devido ao processo de eletroendosmose presente no gel de
agar ou agarose, o fracionamento protéico por este método torna-
se mais lento e em consequência aumenta o número de frações
reveladas. Sande & Karcher (1960), demonstraram haver uma
estreita analogia entre as proteínas da hemolinfa de Triatoma
infestans (Klug, 1834), T. vitticeps (Stal, 1859), T. brasiliensis
6
(Neiva, 1911), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835),
Eutriatoma sordida (Stál, 1859), Rhodnius prolixus (Stál, 1859),
e R. palescens (Barber, 1932), quando utilizaram o método de
microeletroforese em gel de agar. Segundo Almeida (1982), o
perfil eletroforético em Triatoma spp, evidenciado em gel de
agar, varia de acordo com seu hábito alimentar.
A determinação do número de frações proteícas em hemolinfa
de diferentes espécies da família Ixodidae e Argasidae (Classe
Arachnida), utilizando o gel de agar como suporte, foi
demonstrado por Sande & Karcher (1960), os quais demonstraram 11
frações proteícas em hemolinfa de Hyalomma excavatum (Koch,
1844), e de H. impeltatum (Schulze & Scholottke, 1930), três
frações em hemolinfa de Argas reflexus (Fabricius, 1794), O.
moubata e O savignyi (Audouin, 1827) e cinco frações em A.
persicus (Oken, 1818), sendo que em neste último, uma das
proteínas mostrou-se com a mesma taxa de migração da albumina
humana.
Krasnobaeva et al (1973), demonstraram por meio da técnica
de eletroforese em gel de agarose, diferenças no perfil protéico
em adultos e 3º estádio ninfal de O. lahorensis Newmann, 1908.
O alto poder de resolução da eletroforese em gel de
poliacrilamida, e a possibilidade de se trabalhar somente com o
peso molecular das proteínas, sem a interferência da força
iônica tem atraido a atenção de vários pesquisadores.
Vários são os fatores que interferem na determinação do
número da frações proteícas em hemolinfa de artrópodes, em PAGE.
7
Segundo Bodnaryk & Morrison (1966), a quantidade de proteínas
reveladas em hemolinfa de Musca domestica (Linnaeus, 1758) foi
dependentes do fator alimentar.
Dolpy & Hamdy (1971), constataram que as frações proteícas
obtidas em hemolinfa de carrapatos das espécies A. persicus, A.
(Persicargas) arboreus Kaiser. Hoogstraal, Kohls, 1964, diminuíram
após o ingurgitamento e nas espécies H. excavatum e H. dromedarii
Koch, aumentaram após o mesmo período. Contudo o número real de
frações protéicas varia em dependência da espécie, sendo 15 para
a espécies B. microplus (Tatchell, 1971) e 16 para H. dromedarii
segundo Stepanchenock-Rudnik et al, (1976). Em se tratando de
Rhipicephalus sanguineus Laitrelle, 1806, a concentração da
proteína total solúvel aumentou durante a fase de crescimento,
diminuíndo durante a fase de ingurgitamento, sendo que o número
de proteínas observados na hemolinfa variou de 16 antes do
início da alimentação para 24 no início da vitelogênese
(Araman, 1980).
A detecção de proteínas específicas para espécies da
subordem Heteroptera, foi determinada por Yadav & Kumar, (1988)
por meio da técnica de PAGE com o uso concomitante do Duodecil
Sulfato de Sódio (SDS).
2.4 PRESENÇA DE IMUNOGLOBULINAS
A passagem de proteínas através da parede do intestino de
artrópodes (Classe Insecta), foi pela primeira vez demonstrada
8
por Wigglesworth (1943), quando detectou hemoglobina na hemocele
de R. prolixus. Entretanto, outros componentes plasmáticos, como
as imunoglobulinas, somente foram descritos mais tarde.
Schlein et al (1976), detectaram imunoglobulina tipo G
(IgG) de origem leporina, a qual retinha sua atividade
anticórpica, em hemolinfa, cérebro e músculos de Sarcophaga
falculata (Pandels, 1896), alimentadas em coelhos que foram
previamente imunizados contra aquele fluído ou tecidos daquele
díptero.
Ackerman et al (1981), observaram a passagem de componentes
séricos, como albumina, transferrina e IgG através do epitélio
intestinal de Dermacentor variabilis (Say) e detectaram as
mesmas proteínas na hemolinfa deste carrapato. Para demonstrar
que a classe de imunoglobulina permanecia com sua reatividade,
foram feitos testes imunológicos como imunodifusão e
imunofluorescência direta. IgG específica para Theileria sergenti
(Wenyon, 1926) foi detectada em hemolinfa de O. moubata e
Haemaphysalis longicornis (Packard) que foram alimentados em
bovinos que tinham sido infectados com aquele protozoário (Kozo
Fujisaki et al, 1984).
Ben-Yakir et al (1987), quantificaran a IgG de origem
leporina, ovina e bovina em hemolinfa de Amblyomma americanum
(Linnaeus, 1758), através de método imunoenzimático (ELISA). A
concentração desta globulina foi 1,000 a 3,000 vezes mais baixo
que no soro dos animais e em hemolinfa de D. variabilis a
concentração da IgG foi consistentemente maior do que no mesmo
9
fluído de A. americanum.
Com relação a classe e subclasses de globulinas, Tracey-
Patte et al (1987), demonstraram em hemolinfa de B. microplus,
provenientes de infestações de bovinos vacinados com antígenos
desta mesma espécie de carrapato, albumina, IgG1, IgG2, e
imunoglobulina tipo M (IgM) em altas concentrações, através da
técnica de radioimunoensaio. A atividade anticórpica das classes
de imunoglobulinas na hemolinfa foi avaliada por meio da técnica
de imunofluorescência indireta (IFI), sendo constatado que sua
habilidade para ligar-se a Babesia bovis (Babes, 1888) era
mantida.
Ben-Yakir (1989), trabalhando com H. excavatum,
O. tholozani (Laboulbene & Megnin), O. moubata, A. persicus, e R.
sanguineus, demonstraram que a IgG detectada em hemolinfa de
carrapatos nem sempre escava íntegra. Para tanto utilizou-se de
testes radioativos e também de anti-IgG específico e Proteína A,
a qual é específica para porção cristalizadora (Fc) daquela
classe de imunoglobulina. Desta forma observou que em hemolinfa
de H. excavatum e R. sanguineus 30 e 44% da IgG detectada
respectivamente, estavam intactas, entretanto em O. moubata,
rodas as moléculas de IgG permaneciam sem alteração.
10
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 COLHEITA DO MATERIAL
Foram utilizados carrapatos da espécie Boophilus microplus
provenientes da Fazenda do Instituto de Zootecnia da Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), localizada no município
de Itaguaí, Rio de Janeiro (RJ), após seu desprendimento natural
dos bovinos. Para tanto, antes dos animais que serviram como
doadores entrarem na área, a qual seria o local de recolhimento
dos carrapatos em questão, esta era limpa para que não houvesse a
possibilidade de se encontrar carrapatos já existentes no solo
oriundos de outros bovinos que por ali passaram no mesmo dia ou
em dias anteriores. O recolhimento foi feito em duas ocasiões com
intervalo inferior a 30 dias, estando na dependência da chegada
dos animais do campo.
Os animais doadores dos ixodídeos, perfizeram um total de 31
bovinos de ambos os sexos e das raças Mestiças de Holandesa Preta
e Branca (MHPB), e Pardo Suíça, identificadas assim pelos seus
caractéres fenotípicos apresentados. Todos os animais que foram
utilizados neste experimento estavam sob regime de criação
extensiva e não haviam recebido banhos com produtos
11
carrapaticidas por um período mínimo de 30 dias.
Após a chegada dos animais ao final da tarde, estes foram
examinados com relação a carga parasitária e deixados em um
curral limpo, até o dia seguinte, ocasião na qual era recolhido
os ixodídeos.
A captura dos carrapatos foi feita no período de 5:00 às
9:00 horas, por meio do recolhimento de todos os exemplares que
se encontravam no chão, os quais eram transportados em sacos
plásticos1, até o Laboratório de Protozoologia da Estação para
Pesquisas Parasitológicas Wilhelm Otto Neitz da UFRRJ.
Imediatamente após chegar no laboratório, os carrapatos
foram colocados em tamis de aço inoxidável de 7 cm de diâmetro e
lavados em água corrente com a finalidade de retirar detritos e
sujidades, por um período de 30 minutos. Decorrido este tempo, os
ixodídeos eram colocados em placas de petri com diâmetro de 14 cm
contendo papel de filtro2 de 18,5 cm de diâmetro, até a secagem
total dos carrapatos.
Todas as formas de larvas, ninfas e os exemplares machos
foram descartados. As teleóginas assim, eram selecionadas de
acordo com sua mobilidade e peso, sendo este verificado em
balança analítica3. Em seguida foram colocadas em frascos do
tipo penicilina respectivamente enumerados e deixados a
centímetros (cm).
1Embalagem plástica para alimentos Zippy com 22 x 18
2Papel de Fitro qualitativo, marca Reagen. 3Balança Analítica, marca Sartorius.
temperatura ambiente por 24 horas (Ben-Yakir et al, 1987),
ocasião na qual seria retirada a hemolinfa.
12
O número de indivíduos que constituiu a nossa amostragem foi
calculada com base na distribuição de Poisson (Miguel, 1982),
sendo o número requerido para o nosso trabalho de 97 carrapatos.
Contudo, considerando a grandeza da referida população, achamos
por bem triplicar, este número, e como resultado obtivemos o
tamanho da nossa amostra em 291 teleóginas.
A obtenção da hemolinfa foi feita por meio da secção do
primeiro par de patas na altura da coxa ou do fêmur com tesoura e
pinça tipo BD4. A pequena gota que fluía era imediatamente
colocada sobre papel indicador de pH5 o qual mensurava-se pela
comparação com a escala de cores contida no referido papel. Em
seguida, a gota subsequente formada era removida por capilaridade
com pipetas Pasteur adaptadas de tubos capilar para determinação
de microhematócrito6, com diâmetro interno de 1,0 milímetro (mm)
e diâmetro externo de 1,5mm e comprimento de 75 mm. A hemolinfa
então colhida, era transferida para tubos de eppendorf7, com
capacidade de 1,5 mililitros (ml), contendo no seu interior 50
microlitros (µl) de Solução Salina Tamponada8, mensurada assim
4Tesoura e Pinça BD, marca Aesculap
5Tiras de Papel indicador Especial (pH 6,4 a 8,0 ) com
escalas de cores.
6tubos capilar para Determinação de Microhematócrito, marca
Perfecta.
7Eppendorf Reaktionsgerafaβe, marca Geratebau.
8Vide Apêndice.
por meio de pipeta automática9 homogeinizada e armazenadas em
freezer a -20c Centígrado (C), para posterior. realização nos
testes imunológicos.
13
3.2 TESTES IMUNOLÓGICOS
Antes da realização dos testes, as amostras de hemolinfa
eram retiradas do freezer e deixadas a temperatura ambiente para
estabilização e posterior utilização nas referidas provas.
3.2.1 ELETROFORESE
Foi realizado o método de semi-microeletroforese,
utiilzando-se para tal fim o aplicador de amostras10, e como
suporte fitas de acetato celulose11. A corrida foi conduzida em
cuba para eletroforese12 contendo tampão Veronal13 com pH de
8,6 e com sua fonte14 ajustada para 110 Volts por um período de
30 minutos. Transcorrido este tempo, as fitas foram retiradas e
coradas com corante protéico15 por 5 minutos, passados os quais
9Pipeta automática Lancer (25µl), marca Sherwood.
11Polygel suporte para Eletroforese, marca Inlab.
10Aplicador de Amostras para Eletroforese, marca Chemetron.
13Vide Apêndice.
12Cuba para Eletroforese Universal UNIFO OE210, marca LMIM.
14Fonte para eletroforese UNIFO, marca LMIM.
15Corante Ponceau - S, marca Millipore.
14
eram descoradas em solução descorante16
, transparentizados em
solução diafanizadora17, e secas em estufas a 60ºC. A leitura
das frações obtidas foi realizada em densitómetro18.
3.2.2 IMUNOELETROFORESE
Esta técnica foi feita segundo Johstone & Thorpe (1982). As
amostras de hemolinfa foram analisadas em lâminas para
microscopia19, cobertas com gel de agar20, diluídas em tampão
Tris (Hidroximetil) aminometano e ácido clorídrico21, utilizando-
se da mesma cuba e fonte descritas anteriormente e usando como
ponte papel de filtro22. A voltagem aplicada foi de 6
miliampere (mA) por lâmina, durante 90 minutos. Decorridos este
tempo, as lâminas foram retiradas da tuba, o antisoro anti-
bovino, (vide adiante), adicicnado e colocados em câmara úmida
por 48 horas, passados os quais, aquelas eram vistas contra um
foco de luz, e somente aquelas com linhas de precipitação eram
então emergidas em solução Salina23 por mais 48 horas com duas
16Vide Apêndice.
17Vide Apêndice.
18Densitometro, marca Zenite.
19Lâminas para microscopia, marca Perfecta.
20Agar Noble, marca Difco
21Vide Apêndice.
22Papel de Filtro nº1, marca Wattmman.
23Vide Apêndice.
a três trocas diárias. Após este procedimento, as lâminas eram
lavadas em água corrente por alguns segundos, e cobertas com o
15
mesmo tipo de papel de filtro usado como ponte, sendo que estes
eram previamente umedecidos com água destilada e colocadas em
estufa a 60ºC para secagem. Seguindo este passo, as lâminas eram
coradas com corante protéico24 durante 10 minutos e descoradas
precipitação.
em solução descorantes25 até evidenciação de todos os arcos de
3.2.2.a SORO IMUNE UTILIZADO
presentes no soro bovino colhido de animal que desenvolveu um
quadro de piroplasmose aguda, tendo como agente causal a Babesia
bigemina (Smith & Kilborne, 1893).
O antisoro foi produzido em caprino Sem Raça Definida, macho
com idade aproximada de três meses contra as Gamaglobulinas
3.2.3 TESTE DE IMUNOFLUORESCENCIA INDIRETA
Foram utilizados dois bovinos de raça MHPB, com idade
variando entre quatro e cinco meses, machos, procedentes de Santa
Cruz, município de Itaguaí, RJ. Os animais foram adquiridos com
idade de 30 dias e após sua chegada foi feita avaliação clínica e
exames complementares. Em seguida, os animais foram banhados com
24Corante Protéico Preto de Amido, marca Reagen.
25Vide Apêndice.
16
produto carrapaticida a base de Decametrina26, e colocados em
piquetes individuais, sendo alimentados com leite em pó27,
ração para bezerros28, e água "ad libtum". Periódicamente, até o
momento da esplenectomia, os animais eram banhados novamente,
para evitar que houvesse infestação por carrapatos. Após a
intervenção cirúrgica, os animais foram tratados com
antibióticos29, para evitar-se a infecção por outros agentes
infecciosos.
No 5º dia pós-esplenectomia os animais receberam, por via
endovenosa 3,0 ml de sangue infectado com B. bigemina com título
de 36 x 10 ml, sendo esta cepa proveniente do Departamento de
Medicina Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (UFV)-
Minas Gerais. No dia seguinte à inoculação, os animais foram
monitorizados através da tomada de temperatura retal duas vezes
ao dia. Só um dos animais utilizados, serviu-nos como fonte de
antígeno. O animal tornou-se positivo no 6° dia pós-inoculação,
apresentando febre, apatia e uma parasitemia com tendência a
elevação. Quando esta atingiu 30 a 40 parasitas por campo
microscópio, foi retirado o sangue para confecção dos estiraços a
serem usados como antígenos nos testes de IFI. O sangue foi
colhido em erlemeyer com capacidade para 500 ml contendo solução
26Butox, marca Quuimio.
27Purileite, marca Purina.
28Ração Terneirina, marca Purina
29Pentabiótico, marca Schering.
17
de Alsever30. O processamento do sangue e a confecção do
antígeno, foi feita segundo Alves (1987), com apenas uma
modificação com relação ao estoque do referido antígeno.
Portanto, uma vez feito e secos, os estiraços foram cobertos com
fita gomada31 um a um e empacotados em blocos de 10 com papel
alumínio. O armazenamento foi feito em freezer a - 20ºC até o
momento do uso.
Antes da realização do teste de IFI, algumas lâminas foram
coradas para se saber a real morfologia e disposição dos
hematozoários naquele antígeno (Figura 1). Por ocasião do teste,
as lâminas a serem utilizadas, eram retiradas do freezer e
deixadas a temperatura ambiente para estabilização por 10 a 20
minutos.
3.2.3.a CONJUGADO UTILIZADO
O conjugado utilizado foi preparado no Departamento de
Imonologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de
São Paulo, segundo William & Chase (1976); Goldman (1968) e
camargo (1973). O antisoro marcado foi diluído em solução
salina tamponada, segundo Markson & Upcott (1971), e armazenado a
temperatura de -20ºC.
3.2.3.b SOROS CONTROLE POSITIVO E NEGATIVO
30Vide Apêndice.
31Fita Gomada Scoth, marca 3M.
18
Figura 1 - Babesia bigemina em estiraço
padrão para o teste de IFI.
Giemsa, 1000 x.
19
O soro controle positivo utilizado no teste de IFI, foi
obtido de animais recuperados de infecção aguda por B. bigemina.
O soro controle negativo foi procedente da UFV.
3.2.3.c REALIZAÇÃO DO TESTE DE IFI
A metodologia empregada foi aquela descrita por Alves
(1987), com algumas modificações no que concerne ao cartão usado,
diluições feitas. A leitura das lâminas foi realizada em
as lavagens das lâminas com o material incubado e o número de
microscópio de fluorescência32, com objetiva de imersão.
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foram feitas determinações da média aritmética e desvio
padrão para os valores do peso e pH e o número de frações
protéicas obtidas. Utilizou-se o coeficiente de correlação linear
de Pearson ao nível de significância de 5% para verificar
diferenças entre peso e pH. Foi ainda utilizado o coeficiente de
contigência com igual nível de significância para verificar
diferenças nas demais associações (Siegel, 1956; Hoel, 1976).
32Microscópio de Fluorescência, marca Leitz
20
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 COLHEITA DO MATERIAL
4.1.1 CARRAPATOS
Os carrapatos colhidos foram indentificados como sendo da
espécie B. microplus, seguindo-se as chaves de classificação
propostas por Cooley (1946), Aragão & Fonseca (1961) e Feldman-
Muhsam & Shechter (1970). O horário de colheita proposto neste
trabalho foi tido como satisfatório, já que o número de
teleóginas colhidas foi superior ao necessário nas duas colheitas
realizadas.
Algumas teleóginas foram descartadas devido ao baixo peso,
como também a alterações encontradas na sua cor externa e
ausência de alguma pata.
O peso das teleóginas, variou de 200,0 a 358,9 miligramas
(mg), tendo como média 255,60 ± 28,30 mg. Estes resultados estão
superiores aqueles encontrados por Davey & Ahrens (1984), quando
citaram o peso médio para este mesmo carrapato de 236 mg.
21
Contudo, os resultados aqui obtidos, foram discordantes aos
achados por Oliveira (1979), no qual observou pesos médios
variando entre 237,2 e 310,6 mg, com extremos de 105,6 e 440 mg
respectivamente. Fatores como condições climáticas, nutrição e
cepa dos carrapatos, podem ser responsáveis pelos resultados aqui
encontrados.
4.1.2 HEMOLINFA
A técnica para obtenção de hemolinfa por meio da secção do
primeiro par de patas ao nível da coxa ou do fêmur, mostrou ser
de fácil execução atendendo perfeitamente aos nossos objetivos. A
adaptação dos tubos para determinação de hematócrito foi de
grande valor na retirada daquele fluído. Entretanto, em virtude
de que em alguns casos ter não sido possível a obtenção da
hemolinfa por esta técnica, foi feito um pequeno ferimento no
tegumento do carrapato na região dorsal do propodosoma.
A mensuração de pH da hemolinfa em papel indicador foi
simples e rápida mostrando existir variação de 6,4 a 7,2 para
esta medida (Tabela I).
resultados são semelhantes daqueles descritos para Classe Insecta
Em se tratando do carrapato ser um artrópode, nossos
no qual o pH variou de 6,0 a 7,0 (Romoser, 1973; Borror et al,
1976) e 6,0 a 7,7 (Chapman, 1980). A média dos valores aqui
22
Tabela I - Freqüência absoluta e relativa para o potencial
Hidrogeniônico em hemolinfa de teleóginas de
B. microplus provenientes de bovinos infestados
naturalmente. Itaguaí, RJ. 1991.
23
encontrados, para o pH foi de 6,84 ± 0,17 estando bem próximos
daqueles descritos por Kaufman et al (1982), quando quantificaram
o pH da hemolinfa de O. moubata em torno de 6,82 ± 0,05.
O teste de correlação de Pearson demonstrou não existir
significância quando aplicado na associação peso x pH.
A avaliação da cor da hemolinfa revelou duas cores
distintas, ou seja incolor e roséo, sendo 97,25% e 2.75% os
valores encontrados respectivamente. Estes resultados estão
concordantes parcialmente com estudos realizados em insetos por
observados por Barker & Wharton (1952), que trabalhando com
Wiggleswoth (1974) e Borror et al (1976), que com aqueles
sistema circulatório de acarina, demonstrou ser incolor a
hemolinfa daquela classe de artrópode. Entretanto nossos achados
foram discordantes dos observados por Douglas Apud Tyler, (1988) e
Artur (1962), no qual observaram uma coloração túrbida para
hemolinfa de carrapatos e aqueles apresentados por Obenchain &
Oliver (1976), quando descreveram uma coloração esverdeada da
hemolinfa de certas espécies de Amblyomma. Em se tratando da cor
róseo, aqui encontrada, existe uma concordância parcial com os
estudos realizados em insetos por Romoser (1973); Lara (1979); e
Chapman (1980), quando colocam que a cor da hemolinfa pode estar
associada a presença de pigmentos. A tabela de contigência quando
aplicada a cor e pH (tabela II), revelou existir diferenças
significante entre os dois parâmetros estudados. Estes resultados
presentes na hemolinfa, tenham tendência a alcalinizar mais
levam-nos a pensar que as moléculas de pigmento que ora estão
24
Tabela II - Tabela de contingêneia para cor e pH em hemolinfa
de B. microplus provenientes do município de
Itaguaí, RJ, 1991.
aquele plasma.
25
4.2 TESTES IMUNOLOGICOS
Momentos antes da realização dos testes, a hemolinfa era
retirada do freezer a - 20ºC e deixadas estabilizar a temperatura
ambiente. Vale salientar que algumas amostras de hemolinfa apesar
do correto acondicionamento e armazenamento não estavam
congeladas. É provável que agentes anti-freeze existam na
hemolinfa de carrapatos em semelhança ao que é encontrado em
insetos e aranhas, segundo Husby & Zachariassen, (1980).
4.2.1 ELETROFORESE
O método de eletroforese em acetato celulose foi de fácil
execução e interpretação revelando diferentes frações proteicas
em hemolinfa de carrapato (fig. - 2)
Em concordância com Sande & Karcher (1960), uma das
proteínas aqui observada, em hemolinfa de B. microplus, mostrou-
se com a taxa de migração similar aquela observada para albumina
humana em hemolinfa de A. reflexus. A razão para frequência deste
fato talvez esteja na similaridade do peso molecular entre as
Na Tabela III podemos observar a distribuição e freqüência
melhor esta qüestão.
duas proteínas. Outros trabalhos serão precisos para elucidar
26
Figura 2 - Eletroforese em Papel acetato
celulose). Coloração pelo
Ponceau-S.
27
Tabela III - Distribuição, freqüência absoluta e relativa das
frações protéicas em hemolinfa de B. microplus
obtidas pele método de eletroforese em acetato
celulose, Itaguaí, RJ, 1991.
Legenda:
Nº de proteínas - Número de proteínas
F. absoluta - Frequência absoluta
F. relativa - Frequência relativa
28
das proteínas fracionadas por meio do método de eletroforese em
acetato celulose. Os resultados aqui encontrados estão em
concordância parcial com aqueles encontrados por Sande & Karcher
(1960), no qual demonstraram existir por meio da técnica de
microeletroforese em gel de agar três a 11 proteínas em hemolinfa
de H. excavatum, H. impeltatum, A. reflexus, A. persicus, e
O. moubata, Tatchell (1971), que detectou 15 frações em hemolinfa
de B. microplus, e próximos daqueles encontrados por
Stepanchenock-Rudnik et al (1975) que detectaram 16 frações em H.
dromedarii A razão desta parcialidade deve-se as diferentes
espécies estudadas e ao meio de fracionamento mais sensível
utilizado por aqueles autores.
Com relação ao número médio de frações proteicas obtidas no
presente trabalho (Fig.- 3), 79% das amostras avaliadas continham
11 a 13 frações.
A tabela de contigência quando aplicada aos valores para o
número de frações proteicas e pH (Tabela IV), revelou existir
dependência entre as variáveis estudadas, sendo seu resultado
significativo.
A ocorrência deste fato pode estar associada a atividade
das proteínas ser máxima, quando o pH está numa faixa de
neutralidade, não havendo portanto perdas ou desnaturação das
mesmas.
4.2.2 IMUNOELETROFORESE
A técnica de imunoeletroforese em gel de agar, foi de fácil
execução porém de difícil interpretação. Isto nos causou maior
Figura 3 - Número médio de frações proteicas em hemolinfa de Boophilus microplus. Itaguaí, RJ, 1991.
30
Tabela IV - Tabela de contingência para o número de frações
proteicas e pH de hemolinfa de Boophilus microplus,
Itaguaí, RJ, 1991.
31
rigor na avaliação dos resultados obtidos.
Apenas uma amostra revelou reação positiva (Fig.- 4). Este
resultado pode ser explicado pela pequena quantidade de anticorpo
presente, aliado ainda a diluição imposta por ocasião da obtenção
da hemolinfa. Contudo o arco de precipitação formado na reação da
hemolinfa com o antisoro bovino, mostrou uma semelhança muito
grande com a IgG1, quando comparada com aquela mesma subclasse de
imunoglobulina conforme demonstrada por Buttler (1983).
Este fato vem comprovar a presença de imunoglobulina de
origem bovina em hemolinfa de B. microplus. Resultados
semelhantes foram obtidos por Kozo Fujisaki et al (1984); Ben-
Yakir et al (1987); e Tracey-Patte et al (1987), que detectaram
IgG bovina em hemolinfa de várias espécies de carrapatos.
A razão para pequena freqüência de reagentes, pode também
estar associada a baixa sensibilidade do teste empregado. Com
relação a este último aspecto, Hyde & Patnode apud Carter &
Moojen, (1981) demonstraram a baixa sensibilidade do teste de
imunoeletroforese, assinalando que a quantidade mínima para
positividade de uma reação ser da ordem de 20 microgramas de
proteína/ml.
O teste de coeficiente de contigência utilizado para
analisar as variáreis imunoletroforese e eletroforese, revelou
existir dependência entre os dois parâmetros estudados. Trabalhos
nesta área devem ser realizados para responder esta questão.
4.2.3 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
32
Figura 4 - a - Hemolinfa de B. microplus positiva ao
teste de Imunoeletroforese. Coloração
pelo Preto de Amido.
b - Reação Padrão do teste de Imunoeletro-
forese com soro bovino e seu respecti-
vo antisoro produzido em caprino.
Coloração pelo Preto de Amido.
33
Nenhuma dificuldade foi vista na realização do teste de IFI.
A fita gomada utilizada não interferiu na qualidade do antígeno
utilizado (Fig.- 5).
A freqüência de positividade pode ser observada na Tabela V.
Essa alta taxa de reagentes pode ser explicada com base na maior
sensibilidade do teste empregado.
A ocorrência destes reagentes, nos leva a inferir a passagem
de imunoglobulina através do trato intestinal do carrapato e a
manutenção de sua atividade anticórpica em hemolinfa de
(1981); Kozo fujisaki et al (1984) e Tracey-Patte et al (1987).
B. microplus. Esta inferência está de acordo com Ackerman et al
Os anticorpos presentes na hemolinfa de teleóginas de
B. microplus, demonstraram ser específicos contra B. bigemina.
Resultados semelhantes foram observados por Kozo Fujisaki et al
(1984), no qual demonstraram anticorpos específicos contra
T. sergenti em hemolinfa de O. moubata e H. longicornis e Tracey-
Patte et al (1987), que detectaram anticorpos específicos para
B. bovis em hemolinfa de B. microplus.
34
Figura 5 - Hemolinfa de B. microplus em reação positiva ao teste de IFI. 500 x.
35
Tabela V - Hemolinfa de B. microplus, segundo a freqüência
absoluta e relativa de reagentes ao teste de IFI
para B. bigemina. Itaguaí, RJ, 1991.
Legenda:
IFI - Teste de Imunofluorescência Indireta
F. absoluta - Freqüência Absoluta
F. relativa - Freqüência Relativa
36
5. CONCLUSÕES
1. O potencial Hidrogeniônico da hemolinfa de B. microplus,
varia de 6,4 a 7,2, sendo modificado pela presença de pigmentos.
2. método de eletroforese em acetato celulose para
hemolinfa de B. microplus, é de fácil realização e interpretação.
3. O número de proteínas que compõe a hemolinfa de
teleóginas de B. microplus caídas naturalmente, varia de 6 a 15.
4. O método de imunoeletroforese pode ser usado para
identificar, componentes séricos na hemolinfa de B. microplus.
5. O método de IFI, é sensível para detectar anticorpos
específico anti-Babesia na hemolinfa de B. microplus.
6. A provável passagem de anticorpos de origem bovina
através do epitélio intestinal B. microplus deve ocorrer de
forma descontínua, o que explica a freqüência de reagentes ao
teste de imunoeletroforese.
37
7. Com relação a concentração proteica em hemolinfa de B.
microplus, 79% das amostras avaliadas continham 11 a 13 frações e
encontravam-se na faixa de pH entre 6,7 a 7,0.
38
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APÊNDICE
4,53g
4,73g
0,85g
500,0 ml
8,24 g
1000,0 ml
50,0 ml
1000,0 ml
14,0 ml
1000,0 ml
Solução Salina Tamponada
Fosfato monopotássico PA
Fosfato dissódico PA
Cloreto de Sódio PA
Água destilada q.s.p
Tampão Veronal
Ácido 5,5 Dietil Barbiturato de Sódio
Água destilada q.s.p
Ajustar o pH para 8,6
Solução Descorante para Eletroforese
Ácido Acético Glacial PA
Água destilada q.s.p
Solução Diafanizadora
Álcool Metílico PA 85,0 ml
Ácido Acético Glacial PA
Água destilada q.s.p
45
6,057 g
6,804 g
14,0 ml
1000,0 ml
8,5 g
1000,0 ml
50,0 ml
1000,0 ml
0,6 g
8,0 g
4,2 g
20,6 g
1000,0 ml
Tampão Tris-Hcl
Tris (hidoximetil) - aminometano
Acetato de Sodio. 3H2O
Ácido Clorídrico PA
Água destilada q.s.p
Solução Salina
Cloreto de Sódio PA
Água destilada q.s.p
Solução Descorante para Imunoeletroforese
Ácido Acético Glacial PA
Água destilada q.s.p
Solução de Alsever
Ácido cítrico monohidratado PA
Ácido Trissódico dihidratado PA
Cloreto de Sódio PA
Dextrose Anidra PA
Água destilada q.s.p
Ajustar o pH para 7,2