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UNIVERSIDADE VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOENGENHARIA
EMANUELLE PAIVA DE VASCONCELOS DANTAS
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DO CARYOCAR BRASILIENSE
São José Dos Campos, SP 2015
EMANUELLE PAIVA DE VASCONCELOS DANTAS
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DO CARYOCAR BRASILIENSE
Dissertação a ser apresentada ao programa de mestrado de Bioengenharia como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de mestre em Engenharia Biomédica. Profª. Drª. Andreza Ribeiro Simioni Profª. Drª. Josane Mittmann
São José Dos Campos, SP 2015
Autorizo exclusivamente para finsacadêmicos e científicos, a reprodução total ou
parcial desta dissertação, porprocessos fotocopiadores ou transmissão eletrônica,
desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 26 de junho de 2015.
_______________________________________
Autor (a) da Obra
Data: 26/ 06/ 2015.
EMANUELLE PAIVA DE VASCONCELOS DANTAS
AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL
DO CARYOCAR BRASILIENSE
Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de
Mestre em Bioengenharia, do Programa de Pós-graduação em Bioengenharia, do
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São
José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Profª. Drª. Andrea Santos Liu (IFSP) ______________________________
Profª. Drª. Fernanda Pupio Silva Lima (UNIVAP) ____________________
Profª. Drª. Andreza Ribeiro Simioni (UNIVAP) ______________________
.Drª.Josane Mittmann _________________________________________
Data da aprovação: 26 de junho de 2015.
DEDICATÓRIA
.
As minhas filhas Letícia e Mayana que sempre estiveram ao meu lado. As professoras Josane Mittmann e Fernanda Puppio pela acolhida sincera, apoio e incentivo para a conclusão deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
A todos da minha família que me apoiaram nesta jornada em especial à
minha mãe Ester,a minha irmã Érika, tia Fátima e vovó Lourdinha.Obrigada pelo
apoio e incentivo.
EPÍGRAFE
"Uma língua perfeita, em que cada ideia teria sua representação por um
termo próprio, evitaria muitas discussões, com uma palavra para cada coisa, todo o
mundo se entenderia."
Autor: Allan Kardec
Livro: Livro dos Espíritos (Introdução, p. 12).
RESUMO A leishmaniose visceral é uma doença endêmica, causada no Brasil pela Leishmania chagasi. Seus tratamentos convencionais são extremamente tóxicos, com muitos efeitos colaterais e contraindicações. Com base nessa alta toxicidade, estudos de novas substâncias no tratamento da leishmaniose sãoimportantes. Os pesquisadores demonstraram que os extratos de água e etanol de folhas e mesocarpo de pequi (Caryocar brasiliense) têm atividade leishmanicida, eo óleo essencial possui propriedades que podem ser interessantes para o tratamento e cura da leishmaniose. O objetivo deste estudo foi o de verificar a ação do óleo essencial de Caryocar brasiliense (Pequi) na proliferação Leishimaniose Tegumentar. Para ostestes, 1x106 promastigotas de L. chagasi MHOM / BR / 1974 / PP75, foram incubadas durante 72 horas em Meio LIT contendo concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 ug / ml do óleo essencial de pequi. Os efeitos do óleo essencial sobre os promastigotas em diferentes concentrações foram analisados por microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura, onde foi possível observaralterações na membrana, alterações nucleares e o tamanho e a morfologia do parasita tiveram redução crescente. Estes resultados sugerem que o óleo essencial pequi é eficaz contra Leishmania chagasi. Palavras-Chave: Leishmaniose, leishmania, promastigotes, óleo, pequi.
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis is an endemic disease caused by Leishmania in Brazil chagasi. Yours conventional treatments are extremely toxic, with many side effects and contraindications. Based on this high toxicity of new substances studies in the treatment of leishmaniasis are important. The researchers demonstrated that the water and ethanol extracts of leaves and mesocarppequi (Caryocar Brasilia) have leishmanicidal activity, and the essential oil has properties that may be of interest for the treatment and cure of leishmaniose. The aim of this study was to verify the action of the essential oil Caryocar Brasilia (Pequi) Cutaneous leishmaniasis in the proliferation. For the test, 1x106 promastigotes of L. chagasi MHOM / BR / 1974 / PP75, were incubated for 72 hours in LIT containing concentrations of 1000, 500, 250, 125, 62.5 and 31.25 ug / ml essential oil of pequi. The effects of essential oil on the promastigotes in different was analyzing concentrations by light microscopy and scanning electron microscopy, it was possible to see modifications membrane, nuclear changes and the size and morphology of the parasite had reduction forward. These results suggest that the essential oil Pequi is effective against Leishmaniachagasi.
Keywords: Leishmaniasis, leishmania, promastigotes, oil, pequi.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Formas de desenvolvimento de Leishmania A: promastigota, B: amastigota
- Corpos multivesiculares (MVBs) e Retículo endoplasmático (RE) .......................... 12
Figura 2: Ciclo biológico da Leishimania SP ............................................................. 13
Figura 3: Indivíduos com leishmaniose visceral ...................................................... 14
Figura 4: Imagens de lesões cutâneas ..................................................................... 15
Figura 5: Mapa representativo do número absoluto de casos de leishmaniose
cutânea no Brasil em 2007 ........................................................................................ 18
Figura6: Distribuição dos casos e óbitos de leishmaniose visceral americana por
município de residência, Brasil, 2006 ........................................................................ 19
Figura 7: Sobrevivência de promastigotas em cultivo, incubados com diferentes
concentrações de óleo de pequi. ............................................................................... 25
Figura8: Análise cronológica das alterações sofridas por promastigotas de L.
chagasi incubadas com concentrações crescentes do óleo essencial de pequi. ......
.................................................................................................................................. 26
Figura9:Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura L. chagasino
primeiro e quarto dia de incubação nas diversas concentrações de óleo essencial de
pequi ......................................................................................................................... 26
Figura 10: Análise das alterações sofridas,granulações,ao longo da membrana do
parasita L. chagasi incubadas com concentrações do óleo essencial de pequi. .......
.................................................................................................................................. 27
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................... 28
2.1. Objetivo Geral ....................................................................... 28
2.2. Objetivos Específicos ............................................................ 28
3 METODOLOGIA .................................................................... 29
3.1. Método da Pesquisa ............................................................. 29
3.2. Extração do Óleo .................................................................. 29
3.3. Atividade leishmanicida in vitro ............................................. 29
3.4. Análise estatística in vitro ..................................................... 30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. 31
5 DISCUSSÃO .......................................................................... 33
6 CONCLUSÃO ........................................................................ 35
7 REFERÊNCIAS ..................................................................... 36
12
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são doenças zoonóticas de transmissão vetorial, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) as considera como um importante problema
de saúde pública mundial. Elas representam um complexo de doenças com
importante espectro clínico e diversidade epidemiológica. Estima se que 350 milhões
de pessoas estejam expostas ao risco com registro aproximado de dois milhões de
novos casos das diferentes formas clínicas. Atualmente, a doença afeta 88 países
estimando-se uma prevalência de 14 milhões casos e 59 mil óbitos, número este
que, no caso de doenças parasitárias, só é superado pelas mortes causadas por
malária.
C. brasiliensis Camb. é um membro da família Caryocaraceae que ocorre na
América do Sul e Central. No Brasil essa espécie é nativa do Cerrado e é
encontrada nos estados do Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Tocantins,
Minas Gerais e Bahia (SEPTÍMIO, 1994). Essa planta produz um fruto conhecido
pelo nome indígeno: piqui ou pequi, que significa coberto por espinhos (ARAÚJO F.,
1995). C. brasiliensis floresce em período chuvoso (agosto a novembro),
predominando em setembro, e sua frutificação ocorre normalmente de novembro a
fevereiro (ALMEIDA et al., 1998). Além do grande uso na culinária regional esta
planta é amplamente empregada na medicina popular.
1.1 Leishimaniose
As leishimanioses são doenças infecciosas causadas por protozoários do
gênero Leishmania, pertencente à família do Trypanosomatidaesendo transmitida
pela picada da fêmea do mosquito da subfamília Phlebotominae durante o repasto
sanguíneo. Esse parasita apresenta duas formas principais: uma flagelada outra
promastigota encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e em alguns meios de
cultura artificiais e outra aflagelada ou amastigota como é vista nos tecidos dos
hospedeiros vertebrados (homem e outros animais superiores) (BRASIL, 2007). As
formas amastigotas da Leishimania são encontradas parasitando células do sistema
mononuclear fagocitário do hospedeiro vertebrado, principalmente, macrófagos.
Apesar da atividadelítica dos vacúolos formados, elas sobrevivem e se multiplicam
13
nessa célula, que é especializada na destruição de agentes estranhos (NEVES,
2005).
Figura 1: Formas de desenvolvimento de Leishmania. A: promastigota B: amastigota – Corposmultivesiculares (MVBs) e Retículo endoplasmático (RE).
14
Figura 2: Ciclo biológico da Leishimaniaspp.
Fonte: Adaptado de Centers for Disease Control and Prevention (2015).
Em 1998, a Organização Mundial de saúde, estimava que a prevalência das
Leishimanioses no mundo, era da ordem de 12 milhões de casos com incidência
anual de 2 milhões (1,5 milhões de forma cutânea e 500 mil casos de calazar)
(BRASIL, 2007).
Tendo com critério a espécie do parasito causador da infecção, a
manifestação clínica é diferente. Sendo assim, podem ser separadas em quatro
grupos:
- leishimaníase cutânea: produz exclusivamente lesões cutâneas, ulcerosas
ou não, porém limitadas;
- leishimaníase muco cutânea ou cutâneo mucosa: formas que se complicam
frequentemente com o aparecimento de lesões destrutivas nas mucosas do nariz,
boca e faringe;
-leishimaníase cutânea difusa: formas disseminadas cutâneas que se
apresentam em indivíduos alérgicos ou, tardiamente, em pacientes que haviam sido
tratados de calazar;
15
- leishimaníase visceral ou calazar: os parasitos apresentam acentuados
tropismos pelo baço, fígado, medula óssea e dos tecidos linfoides.
A leishimaníase cutânea é uma manifestação relativamente benigna enquanto
a mucocutânea chega a causar lesões mutilantes na face. Já o tipo visceral, é uma
doença de alta mortalidade quando não tratada adequadamente (REY, 2008).
Figura 3: Indivíduos com leishmaniose visceral.
16
Segundo a organização mundial de saúde, a leishmaniose visceral está entre
as seis doenças mais importantes do mundo (ALVAR, 2012) por causar alta
morbidade, além de ser uma doença endêmica capaz de produzir surtos epidêmicos
graves.As Leishimanias são doenças zoonóticas que afetam animais domésticos e
selvagens assim como ao homem (REY, 2002).
Alguns dos hospedeiros naturais que servem de reservatórios para o gênero
Leishimania estão os ratos selvagens, bicho preguiça, tamanduá, tatu, raposas,
marsupiais (gambás), cães e equinos (SUCEN, 2009). No Brasil, cães e raposas são
considerados os reservatórios mais importantes, pois apresentam um intenso
parasitismo cutâneo, permitindo assim, uma fácil infecção pelo inseto e desta
maneira, também são considerados os mais importantes elos na manutenção no
ciclo de transmissão da doença (SUCEN, 2009).
A Leishimaniose ocorre de forma endêmica em 88 países do velho mundo
(África Europa e Ásia) como no novo mundo (Américas), afetando cerca de dois
milhões de pessoas ao ano (FIOCRUZ, 2009). Estima-se que 350 milhões de
pessoas estejam expostas ao risco com registro aproximado de dois milhões de
novos casos das diferentes formas clinicas ao ano. Ela manifesta-se clinicamente
com febre irregular,esplenomegalia,anemia e, em sua fase terminal, quando não
tratada,caquexia (perca de peso e massa corpórea e enfraquecimento) e elevada
taxa de mortalidade (PAULAN, 2013; REY,2008).
As diferentes espécies de Leishimania produzem diferentes tipos de lesões
nos seres humanos, produzindo manifestações cutâneas nas mucosas e vísceras
(ROBBINS et.al., 2000) variando de lesões auto resolutivas às lesões desfigurantes
(ROCHA et al., 2002).
Figura 4: Imagens de lesões cutâneas.
17
A leishimaniose vísceral, também conhecida por “calazar” refere-se a uma
doença crônica grave e de alta letalidade. Os principais sintomas que caracterizam
essa doença são: hepatoesplenomegalia, anemia e manifestações hemorrágicas
(NEVES, 2005).
Ela era, primariamente, uma zoonose caracterizada como doença de caráter
eminentemente rural. Mais recentemente, vem se expandindo para áreas urbanas
de médioe grande portes e se tornou crescente problema de saúde pública no país e
em outras áreas do continente americano, sendo uma endemia em franca expansão
geográfica (BRASIL MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
No Brasil, duas espécies, até o momento, estão relacionadas com a
transmissão da doença,Lutzomyialongipalpise Lutzomyiacruzi. A primeira é
considerada a principal espécie transmissora da Leishmania (Leishmania chagasi),
mas a L. cruzitambém foi incriminada como vetora em uma área específica do
estado do Mato Grosso do Sul (BRASIL MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Trata-se de uma doença endêmica. Distribui-se em 17 dentre 27 estados
brasileiros, com maior incidência na região nordeste registrando 92% dos casos,
seguido pela região sudeste com 4%, norte 3% e finalmente centro oeste com 1%
dos casos. Tem-se registrado uma taxa de letalidade de 10% em alguns locais
(ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DE SÁUDE, 2009).
18
Figura 5: Mapa representativo do número absoluto de casos de leishmaniose cutânea no Brasil em 2007.
Fonte: Alvar (2012).
19
Figura 6: Distribuição dos casos e óbitos de leishmaniose visceral americana por município de residência, Brasil, 2006.
Fonte: Alves (2009).
A ocorrência da doença em uma área específica depende basicamente do
vetor susceptível e de um hospedeiro/reservatório,igualmente suscetíveis
(CONTIJO; MELO, 2004) sendo que a virulência do parasita pode variar entre
protozoários de uma mesma espécie levando a geração de processos clínicos de
mesmo hospedeiros ou hospedeiros distintos (GRIMMALDI JUNIOR, 1993).
O agente etiológico da leishmaniose visceral no Brasil é a Leishmania chagasi
um parasita protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, encontrado em
países do continente Americano (SILVEIRA; CORBETT, 2010).
20
Os protozoários do gênero leishimania tem – se mostrado oportunistas em
pessoas imunossuprimidas como, por exemplo, pacientes com o vírus HIV. Esse tipo
de infecção (HIV/LEISHIMANIA) tem sido cada vez mais frequente, acentuando a
importância clínica e epidemiológica da Leishimaniose (SILVA et al, 2002).
A leishmaniose tegumentar tem ampla distribuição mundial e no Continente
Americano, existem registros de casos desde o extremo sul dos Estados Unidos até
o norte da Argentina,com exceção do Chile e Uruguai. O período de incubação da
doença no ser humano é, em média, de dois a três meses, podendo variar de duas
semanas a dois anos.
A leishmaniose cutânea (LC) representa a manifestação clínica mais
frequente. Inicia-se com um único nódulo cutâneo que continua a se expandir até
que o corpo todo é coberto por lesões nodulares (ROBBINS, et al., 2000). Nela, as
lesões são exclusivamente cutâneas e tendem a cicatrização. Mais frequentemente,
são únicas ou em pequeno número. Em casos mais raros, as lesões podem ser
numerosas, caracterizando a forma denominada leishmaniose cutânea disseminada.
As lesões apresentam aspectos variados e a infecção secundaria bacteriana altera
este aspecto tornando-as mais inflamadas, dolorosas e purulentas (BRASIL, 2007).
A leishimaniose mucocutânea é uma das formas de LTA, também recebe os
nomes de “espúndia”, “úlcera de Bauru” e “ferida brava”, onde é caracterizada pelas
lesões cutâneas de vários tipos e lesões destrutivas nas regiões nasais e
bucofaríngea (REY, 2002).
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença causada por
protozoários do gênero Leishmania, transmitida ao homem pela picada de mosquitos
flebotomíneos (Ordem Diptera; Família Psychodidae; Sub-Família Phlebotominae).
No Brasil existem atualmente 6 espécies de Leishmania responsáveis pela doença
humana, e mais de 200 espécies de flebotomíneos implicados em sua transmissão.
Trata-se de uma doença que acompanha o homem desde tempos remotos e que
tem apresentado, nos últimos 20 anos, um aumento do número de casos e
ampliação de sua ocorrência geográfica, sendo encontrada atualmente em todos os
estados brasileiros, sob diferentesperfis epidemiológicos. É considerada um
problema de saúde pública em 88 países (distribuídos das Américas, África, Europa
e Ásia). No Brasil é considerada uma das afecções dermatológicas que merece mais
atenção devido ao alto risco de decorrência de deformidades e impacto social e
21
econômico que acompanham o desenvolvimento da doença. Afeta em 90% dos
casos crianças maiores de 10 anos e indivíduos do sexo masculino representam
60% dos casos (BRASIL, 2007).
Na década de 50 houve uma diminuição geral da ocorrência de casos de LTA,
porém, nos últimos anos, vem apresentando franco crescimento, observando-se
surtos epidêmicos por todo país relacionadas principalmente ao processo predatório
de colonização. Na década de 80, foi assinalada em 20 estados, no entanto foi
observada sua expansão geográfica, quando em 2003 foi confirmada a presença em
todos os estados brasileiros. No período de 1985 a 1999 foram registrados no país
388.155 casos. A região sudeste apresentou uma queda gradativa no período de
1994/97, entretanto em 1998 houve um acréscimo de 27% em relação ao ano
anterior (SÃO PAULO, 2006).
Essa expansão de casos de LTA se deve principalmente às modificações
feitas pelo homem nos ecossistemas, pela urbanização não planejada,resultando na
invasão do habitat natural dos insetos vetores da Leishimaniose (NUNES et. al.,
2006).
Em estados brasileiros, a natureza leishmaniótica das lesões cutâneas e
nasofaríngeas só foi confirmada, pela primeira vez, em 1909, por Lindenberg, que
encontrou formas de Leishmania idênticas à Leishmania tropica como as descritas
por WRIGHT em 1903, da leishmaniose do Velho Mundo, em lesões cutâneas de
indivíduos que trabalhavam nas matas do interior do Estado de São Paulo
(CAMARGO; BARCINSKI, 2003).
A LTA é uma doença não contagiosa, de evolução crônica, que acomete as
estruturas da pele e cartilaginosas da nasofaringe, de forma localizada ou difusa,
causada por várias espécies de protozoários digenéticos da ordem
Kinetoplastida.Causam primariamente infecções de caráter zoonótico, acometendo o
homem e seus animais domesticados de maneira secundária(CAMARGO;
BARCINSKI, 2003).
22
O tratamento pode ser realizado com antimoniato de meglumina,
estibogluconato de sódio, pentamidina, anfotericina B e alopurinol (REY, 2002),
porém estes tratamentos convencionais são extremamente tóxicos, com vários
efeitos colaterais, dentre eles artralgia, mialgia, inapetência, vômito, plenitude
gástrica, febre alta, fraqueza, cefaleia, tontura, palpitação, insônia insuficiência renal
aguda, além de ser contraindicado no caso de gestantes, portadores de cardiopatias
e nefropatias (SECRETRIA MUNICIPAL DE SÁUDE DE BELO HORIZONTE, 2012).
As espécies vegetais têm contribuído ao longo da História para o tratamento
das mais diversas enfermidades humanas, através de extratos e óleos fixos e
essenciais (NASCIMENTO et al., 2007). Os medicamentos tradicionais que tem
porbase produtos vegetais integrais ou extratos,vêm ganhando importância
mundialmente, tornando-se produtos comerciais de grande valor tanto em países
desenvolvidos como em desenvolvimento. Eles contemplam o emprego das mais
variadas partes do vegetal entre elas raízes, rizomas, frutas, sementes, flores,
folhas, caule, casca ou até mesmo a planta inteira (AVULA et al., 2010).
1.2 Pequi
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos
vegetais, prescritos com frequência, pelos efeitos medicinais que produzem, apesar
de não terem seus constituintes químicos conhecidos. Dessa forma, usuários de
todo o mundo, mantém em voga a prática do consumo de fitoterápicos, tornando
válidas informações terapêuticas que foram sendo acumuladas durante séculos
(MACIEL et al., 2002).
Óleos essenciais são produtos metabólicos voláteis presentes em diversos
órgãos vegetais onde estes estão associados a várias funções necessárias à
sobrevivência do mesmo, exercendo papel fundamental na defesa contra
microrganismos e na atração de polinizadores (LIMA et al., 2006). Ainda, tem sido
estabelecido cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem
propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas e muitos
possuem atividade anti-inflamatória (LIMA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2009).
23
Estudos de novas substâncias para tratar a leishmaniose são importantes
devido aos fatores de toxicidade já citados. Dentre as novas substâncias várias
pesquisas têm sido realizadas com óleos essenciais. Esses óleos são extraídos de
diversas espécies vegetais, a partir das suas folhas, frutos, caule, raízes, e possuem
intensa propriedade de reproduzir o odor e o sabor da fonte vegetal utilizada
(BELTRAME et al., 2010).Os óleos essenciais constituem, de uma maneira geral,
uma mistura muito complexa de hidrocarbonetos, alcoóis e aromáticos, encontrados
em todo tecido vivo de plantas, em geral estão concentrados na casca, nas flores,
nas folhas, nos rizomas e nas sementes (ARAÚJO J., 1995).Entre tais óleos
estudados destaca-se o óleo essencial de pequi (Caryocar brasiliense).
Na composição do óleo de pequi verifica-se a presença da vitamina A e de
diversos ácidos graxos como o palmítico, oléico,mirístico, palmitoléico, esteárico,
linoléico e linolênico(CRODA DO BRASIL, 2002; FACIOLI, GONÇALVES, 1998). A
presença destes ácidos graxos na pele é fundamental para manutenção da
hidratação cutânea,da barreira cutânea e do manto hidrolipídico (RIEGER, 1987).
O pequi é muito utilizado na alimentação regional pelo seu alto teor de
vitaminas, e seu óleo extraído é aplicado na indústria de cosméticos e também para
fins terapêuticos contra doenças pulmonares, apresenta atividade contra o
Biomphalariaglabrata,atividade antifúngica e seu álcool extraído apresentaram
resultados significativos em experimentos com Trypanossoma cruzi (HERZOG-
SOARES, 2010).Trabalhos como o de Batista et al. (2010) temmostrado que o óleo
essencial do pequi possui atividade cicatrizante, podendo possuir outras
propriedades que podem ser interessantes para o tratamento da leishmaniose.
O piquizeiro é uma árvore pertencente a família Caryocaraceae,que possui
dois gêneros: Caryocarcamb eAnthodiscus g. mey.O gêneroCaryocarpossui
dezenove espécies,das quais oito são encontradas no Brasil,são elas: C.
nuciferum,C. glabrumPres,C.glabrumvar. edule, C. brasiliense Cambess,C. villosum
var. planifolium,C. barbinerve,C. cuneatum e C. crenatum (SANO; ALMEIDA, 1999).
Diversas espécies do gênero Caryocar são conhecidas popularmente pelos
nomes de pequi e outros derivados como, piqui, piquiá e piquivinagreiro, diversidade
explicada pelo fato de o Brasil ser o centro de dispersão desse gênero. Por esse
24
motivo, ocorrem espécies em todas as regiões do País (PEIXOTO, 1973;
GIACOMETTI, 1993; ALMEIDA et al., 1998), do Amazonas a São Paulo, incluindo
Pará, Maranhão, Piauí, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Bahia, Ceará,
Minas Gerais, Rio de Janeiro e Tocantins (PEIXOTO, 1973; ALMEIDA; SILVA,
1994).
Por essa razão, tem sido considerada, por alguns, como árvore símbolo do
Cerrado (HERINGER, 1962; MACEDO, 2005). Algumas espécies, também, são
encontradas nas savanas (tipo de vegetação semelhante ao Cerrado brasileiro, da
Costa Rica ao Paraguai (FRANCO; UMMUS; LUZ, 2004).
O pequizeiro é uma planta perene, que pode ser classificada como frutífera ou
oleaginosa em razão das suas características e formas de utilização. A principal
utilização do fruto é no consumo direto do caroço em forma de pequizada, em
cozidos de carne de gado e de frango, no feijão, no arroz, e no conhecido baião de
dois (feijão com arroz). É um produto indispensável na alimentação das populações
que vivem ao redor das áreas de ocorrência das espécies, que fornece parte dos
aportes energéticos e nutricionais necessários, principalmente para as famílias
carentes, no período da safra. Como oleaginosa, da polpa do fruto é extraído um
óleo que, além de utilizado na culinária, é empregado na indústria cosmética, na
produção de sabão, e como produto medicinal, no combate à bronquite, gripes e
resfriados, dentre outros. Como fármaco, o suporte de informações é empírico,
porém é certo que a polpa do fruto tem alto teor de provitamina A, com média em
torno de 200.000 UI (PEIXOTO, 1973). Sua madeira, de cor castanho-amarelada,
também tem sido empregada para usos diversos, tais como berço de moendas,
calços de bate-estacas e aplicações semelhantes, moirões, construções civis e
navais, em virtude de ser resistente, com densidade em torno de 0,803 g/cm3
(OLIVEIRA et al.,2008).
As espécies conhecidas como pequizeiro, e nomes derivados, pertencem à
família Caryocaraceae, da ordem Theales (Rizobolácea),composta de 25 espécies
reunidas em dois gêneros,Caryocare Anthodiscus.O gênero Caryocar, segundo
Franco et al.(2004 ) possui 16 espécies,das quais, 12 são encontradas no território
brasileiro. Essa informação difere da obtida por Oliveira (1988) que relata que são 19
espécies,das quais apenas oito de ocorrência no Brasil. Giacometti (1993), sem
determinar o número, localizou as espécies de Caryocarem sete dos dez centros de
25
origem das frutíferas brasileiras,a seguir: Centro Alto Noroeste/Rio Negro, com
algumas espécies de piquiá (Caryocarspp); Centro Roraima/Manaus (quatro
espécies de Caryocar); Centro Sudoeste Acre/Rondônia,com o C. villosum; Centro
Nordeste/Caatinga com C. coriaceum; Centro Brasil Central/Cerrado com pequi
Caryocarspp; Centro Mata Atlântica, setor B; com piqui-vinagreiro (C. edulis); e
Centro Brasil/Paraguai, com C. brasiliense (OLIVEIRA et al.,2008).
A busca por fitoterápicos como alternativa aos quimioterápicos para
tratamento de diversas enfermidades, tem levado à identificação de diversas
espécies nativas com potencial de produção de substâncias de interesse
farmacológico. Entre essas, C. brasiliense tem apresentado propriedades
terapêuticas no tratamento de diversas enfermidades, como micoses, em virtude dos
efeitos colaterais dos antifúngicos convencionais, e redução dos efeitos adversos da
quimioterapia (PASSOS et al., 2002).
À planta e aos seus frutos são atribuídas diversas propriedades
medicinais,como a atividade antifúngica encontrada na folha,no óleo essencial da
semente, além da ação dos óleos fixos da amêndoa e da semente de C. brasiliense
sobre diversos microrganismos (Cryptococcus eofarmansvar.neoformans e
Cryptococcus neoformans var.gatti) (PASSOS et al., 2002).
Caryocar brasiliensis possui alto conteúdo de fenóis totais e atividade de
varredura contra radicais estáveis, (ROESLER et al.,2008). O óleo extraído da polpa
e da amêndoa do pequi é utilizado na medicina popular como anti-inflamatório, no
tratamento de gripes, bronquites e infecções bronco-pulmonares. Refere-se também
ao emprego externo do óleo em curativos de pequenos ferimentos e, na forma de
compressas e massagens, nos casos de dores musculares e reumáticas,contusões
e em massagens fitoterápicas (SILVA; MEDEIROS FILHO, 2006).
O valor terapêutico atribuído ao pequizeiro vem sendo pesquisado em ampla
variedade de experimentos científicos atestando sua real eficácia. Extrato da cera
epicular extraído das folhas do pequizeiro demonstraram atividade antifúngica, por
inibir o crescimento de Cryptococcus neoformans (PASSOS et al., 2002), além de
apresentarem atividade mulicida por combater o hospedeiro intermediário causador
da esquistossomose (ROMANCINI; AQUINO, 2007), efeito leishmanicida na inibição
à proliferação da forma promastigota da Leishmania amazonensise atividade
antimicrobiana por inibir o crescimento de enterobactérias (PAULA-JÚNIOR et al.,
26
2006). O extrato da casca do pequizeiro demonstrou interferência sobre a curva de
parasitemiado Trypanosomacruzi, reduzindo o número de parasitos no sangue
(HERZOG-SOARES et al., 2002). No óleo extraído da polpa foram encontrados
antioxidantes naturais que diminuíram o estresse oxidativo e, consequentemente,
promoveu proteção contra danos ao DNA (MIRANDA-VILELA; RESCK; GRISOLIA,
2008).
Levando em consideração as características das lesões cutâneas
apresentadas em indivíduos acometidos por leishimania, e considerando os efeitos
biológicos dos óleos essenciais, o presente trabalho propõe um estudo do efeito do
óleo essencial do Pequi sobre a proliferação de Leishmania braziliensisum dos
agentes etiológicos da Leishmaniose tegumentar em modelo in vitro.
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Verificar a ação do óleo essencial de Caryocar brasiliense (Pequi) na
proliferação Leishimaniose Tegumentar. Um estudo in vitro.
2.2 Objetivo Específico
Avaliar o efeito do óleo essencial de Caryocar brasiliense (Pequi) da fração
insaponificável e da fração saponificável sobre a proliferação de promastigotas de L.
braziliensis.
28
3 METODOLOGIA
3.1 Método da Pesquisa
A espécie utilizada no estudo foi a Leishmaniachagasi MHOM/BR/1974/PP75,
cultivada com o meio de cultura LIT (LiverInfusionTriptose) complementado com soro
fetal bovino (Cultilab) a 10%, 1% de Penicilina/Streptomicina (Cultilab) e 2,5 µM/ml
de hemina. As amostras foram mantidas em estufas de crescimento a 28°C e
repicadas a cada sete dias para manutenção de cultura.
3.2 Extração do Óleo
O óleo essencial de pequi foi obtido através do processo de hidrodestilação e
foi utilizada a fração hexano nos experimentos.
3.3 Atividade Leishimanicida in vitro
Para os ensaios, 1x106 de promastigotas foram incubados em
duplicatas em placa de Petri de 24 poços contendo meio LIT com 31.25, 62.5, 125,
250, 500 e 1000µg/ml de óleo essencial de pequi e duplicatas de controle de
parasitas sem tratamento e controle de parasitas tratados com Anfotericina B na
concentração de 100µM/mL. As culturas foram mantidas por cinco dias. Foram
realizados três ensaios independentes. Para avaliar as alterações morfológicas do
parasita ao longo dos dias de cultivo, foram coletados 10 µL da amostra diariamente
para realização de esfregaço em lâmina de vidro para a microscopia óptica. Após a
secagem, as lâminas foram coradas com coloração de May-Grünwald por quatro
minutos seguindo de corante Giemsa por vinte minutos. Após a secagem as lâminas
foram observadas em microscópio óptico Leica 2500 e fotografada em objetiva de
100x.
Para a análise por microscopia eletrônica de varredura as células obtidas a
partir do mesmo processo de incubação com óleo essencial de pequi foram aderidas
em lamínulas circulares tratadas previamente com poli-L-lisina e colocadas em placa
de Elisa de 24 poços. Após aderidas, foram fixadas em solução de cacodilato de
29
sódio 0,1M, 2,5% de glutaraldeido, 4% de paraformaldeido e cloreto de cálcio 2mM.
Depois de fixadas, as amostras foram lavadas com tampão cacodilato de sódio 0,1M
pH 7,4 por 3x com duração de 15 minutos e em seguida pósfixadas em solução
aquosa de tetróxido de ósmio a 1% por 60 minutos. Após a fixação lavou-se
novamente com tampão cacodilato de sódio 0,1M pH 7,4 foram desidratados por
concentrações crescentes de etanol (70%-100%), duas com etanol 100% absoluto e
a uma com etanol 100% super seco, todas com duração de 15 minutos cada. As
amostras foram secas com HMDS (hexametildisilazane) a 60 °C. As lamínulas foram
montadas em suportes e metalizadas com filme de 20nm de ouro (K550X,Emi-Tech)
e analisadas ao microscópio eletrônico de varredura (EVO MA10, Zeiss).
3.4 Análise Estatística in vitro
Para as análises estatísticas foi utilizado análise de variância (ANOVA)
utilizando o programa GraphPadPrism™
30
4 RESULTADOS
Os promastigotas cultivados em diferentes concentrações do óleo de pequi
cresceram menos ao longo do tempo quando comparados ao controle que não
recebeu nenhum tipo de tratamento. Não foram observadas diferenças nas primeiras
24 horas de cultivo (dia 1), estas diferenças estatisticamente significativas aparecem
apenas a partir do quarto dia de cultivo. Não foram observadas diferenças no
crescimento dos promastigotas entre as diferentes concentrações testadas.
Figura 7: Sobrevivência de promastigotas em cultivo, incubados com diferentes concentrações de óleo de pequi. Asteriscos representam diferenças significativas entre os tratamentos e o controle. *** p< 0,001 e * p<0,05.
A partir dos dados analisados por microscopia óptica, podem-se observar
nitidamente as alterações na forma do parasita que normalmente apresenta um
formato fusiforme e após o tratamento com o óleo essencial de pequi, apresentou
um formato mais arredondado ou oval.
Também são observadas granulações ao longo da membrana do parasita, o
que não é característico do gênero Leishmania. O núcleo apresenta deformações e
em algumas figuras como o terceiro e o quarto dia da concentração de 250µg/mL
31
são sugestivas de rompimento da membrana celular e nuclear, como mostra a figura
1, dias 2, 3 e 4. Observam-se também grânulos no interior do citoplasma, que
podem ser aumento dos grânulos de reserva ou indicar fragmentação do citoplasma
e do núcleo.
Figura 8: Análise cronológica das alterações sofridas por promastigotas de L. chagasi incubadas com concentrações crescentes do óleo essencial de pequi.
Não foram observadas alterações grosseiras na análise por microscopia
eletrônica de varredura, no que se refere a forma do parasita ou estrutura de
membrana, porém foi possível observar interferências na divisão celular, como é
possível observar no quarto dia da concentração de 1000µg/mL, além de algumas
formas promastigotas apresentarem rugosidades na membrana plasmática como no
primeiro dia da concentração de 250µg/mL observadas na figura 3.
Figura 9: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura L. chagasi noprimeiro e quarto dia de incubação nas diversas concentrações de óleo essencial depequi.
32
Análise das alterações sofridas, granulações, ao longo da membrana do
parasita L. chagasi incubadas com concentrações do óleo essencial de pequi.
Figura 10. Análise das alterações sofridas, granulações, ao longo damembrana do parasita L. chagasi incubadas com concentrações do óleoessencial de pequi.
33
5 DISCUSSÃO
Na medicina popular, os óleos de polpa de frutos e sementes de
Caryocarcoriaceumtêm sido utilizados como a cicatrização de feridas, anti-
inflamatória,para o tratamento de doenças do tracto respiratório, incluindotosse,
afecções brônquicas, asma (MATOS, 2007) e lesões gástricas induzidas
experimentalmente (LEITE et al, 2009; DA SILVA QUIRINO et al., 2009).Em 2007,
Matos também relata o uso do óleo em sua forma mais espessa usado me maneira
tópica sobre feridas expostas na pele onde observa-se a cura e sob forma de
massagens e compressas em doenças reumáticas e dores musculares.
Os óleos essenciais vêm sendo amplamente estudados pelas suas
propriedades terapêuticas podendo ser uma alternativa promissora no tratamento de
diversas doenças. Diversos óleos já tiveram bons resultados como o óleo essencial
de eucalipto sobre o protozoário tripanossomatídeo Herptomonas, que inibiu
significativamente o seu desenvolvimento e ainda mostrou ser efetivo contra o bacilo
Mycobacterium tuberculosis causador da tuberculose, e contra o vírus causador do
herpes (CASTRO, 2006).
Também foram constatadas alterações morfológicas em Leishmania
amazonensis quando submetidas ao tratamento utilizando óleo essencial de
Ocimumgratissimum, apresentando interferências na divisão celular, parasitas com
dois flagelos e alterações mitocondriais (GIL et al. 2008). Alterações morfológicas
observadas neste trabalho, tais como alterações nucleares, alterações no tamanho e
na forma do parasita sugerindo alterações em seus microtúbulos subpeliculares.
Paula-Júnior (2004) em experimentos com o extrato das folhas do pequizeiro
observou redução na viabilidade e alterações morfológicas em formas promastigotas
de Leishmania amazonensis Oliveira et al. (2009) demonstraram que o óleo
essencial de Cymbopogoncitratus, Lippiasidoides e Ocimumgratissimum afetaram o
crescimento e a ultra estrutura de promastigotas de L. chagasi, de forma semelhante
ao observado com o óleo de pequi, tais como aumento do volume da célula e
vacuolização, com acúmulo de gotas de lipídio no citoplasma. Neste
trabalhoporém,ao contrário do trabalho de Oliveira et al.(2009) a inibição do
crescimento não foi dose dependente, houve redução do crescimento em todas as
concentrações testadas.
34
Algumas espécies do gênero Caryocar foram submetidas a estudos
fitoquímicos e apresentaram, em sua composição, as seguintes classes de
metabólitos secundários: triterpenos, ácidos graxos, taninos, carotenoides,
saponinastriterpênicas, cumarinas, glicosídeos fenólicos, entre outros (ASCARI;
AKAHASHI; BOAVENTURA, 2013) sendo que Carvalho e Ferreira (2001) citam que
terpenóides e saponinas têm ação sobre formas promastigotasde L. amazonenses,
portanto é possível que substâncias pertencentes a estas classes sejam as
responsáveis pelos efeitos observados sobre as formas promastigotas de L chagasi
apresentadas neste estudo. Novos ensaios são necessários a fim de determinar a
citotoxicidade, dose letal, bem como experimentos para esclarecer ainda mais quais
são as alterações celulares e moleculares induzidas pelo óleo de pequi, como
ensaios com microscopia eletrônica de transmissão e de marcadores celulares de
morte celular programada.
35
6 CONCLUSÃO
Neste estudo foi demonstrado que o óleo essencial de pequi foi capaz de
reduzir o crescimento das formas promastigotas de L. chagasi, comprovando assim
o seu efeito sobre a redução na viabilidade do parasita.
As alterações observadas na microscopia óptica foram muito significativas
sendo sugestivas de ação sobre o núcleo do parasita e sua membrana plasmática e
citoesqueleto.
Com relação a análise por microscopia eletrônica de varredura não foi
possível observar alterações morfológicas significativas entre as concentrações
utilizadas neste estudo quando comparadas ao controle e apenas leves alterações
foram observadas e com isso torna-se necessários novos experimentos com
microscopia eletrônica de transmissão para estudar possíveis alterações com o
intuito de conhecer mais sobre a ação do óleo essencial sobre os parasitas.
36
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