universit À cattolica facolta di medicina e chirurgia scuola di specializzazione in fisica...
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UNIVERSITÀ CATTOLICAUNIVERSITÀ CATTOLICAFACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA
“SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN FISICA “SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN FISICA SANITARIA”SANITARIA”
Formazione e rivelazione di Formazione e rivelazione di aberrazioni cromosomicheaberrazioni cromosomiche
Alberto Panese
Interazione Radiazioni Interazione Radiazioni Ionizzanti con la MateriaIonizzanti con la Materia
• Eccitazioni• Ionizzazioni• Energia media dissipata per evento di ionizzazione
34 eV• Energia necessaria per rompere un legame
molecolare
2 - 5 eV
Effetti CellulariEffetti Cellulari
Induzione di aberrazioni cromosomiche e cromatidiche
Inattivazione o morte riproduttiva (necrosi, apoptosi)
Induzioni di mutazioni geniche
Trasformazione oncogenica “in vitro”
DNA, DNA, Principali Bersaglio delle Principali Bersaglio delle Radiazioni IonizzantiRadiazioni Ionizzanti
Recentemente è stata rivolta particolare attenzione non solo
al DNA come molecola, ma all’intera struttura
funzionale che lo contiene
Numerose evidenze mostrano che l’intera struttura possa
influenzare sia la produzione di lesioni sia
la loro riparazione
Doppia elica
Struttura nucleosomica
Cromosoma
Struttura CromosomicaStruttura Cromosomica
Raggi γ
DNA ~ 2 nm diameter
Istone
nucleosoma
1 MeV
Particelle α
10 nm
Ioni Carbonio-
3 MeV
1 MeV
0,3 MeV
Protoni
Fibra di Cromatina~25 nm diametro
..
1 MeV
Interazione tra Struttura della Interazione tra Struttura della Cromatina e Struttura di TracciaCromatina e Struttura di Traccia
Probabilità di lesioni al DNA e loro distribuzione spaziale
Lesioni al DNA Sulla Singola e Lesioni al DNA Sulla Singola e Sulla Doppia CatenaSulla Doppia Catena
Le lesioni sulla singola catena del DNA sono normalmente
riparate in modo efficace dal sistema e non sono
considerate critiche nell’inattivazione delle cellule
Al contrario, rotture sulle due eliche complementari del DNA
risultano più difficili da riparare e sono considerate quindi le
lesioni critiche del DNA
La mancata riparazione corretta delle doppie rotture del
DNA è causa potenziale di morte cellulare o aberrazioni
cromosomiche e mutazioni in generale
Il Ciclo CellulareIl Ciclo Cellulare
Le cicline sono proteine essenziali per la
progressione della cellula attraverso le diverse fasi
del ciclo cellulare
La transizione da una fase all’altra avviene solo in presenza dell’attività
enzimatica di una determinata cdk che attiva
la ciclina specifica necessaria per la
transizione
In interfase ciascun cromosoma si è duplicato e
la cellula possiede una quantità doppia di DNA
L’interfase o Fase G2L’interfase o Fase G2
La divisione cellulare o mitosi avviene in quattro fasi.
1. PROFASE
2. METAFASE
3. ANAFASE
4. TELOFASE
La Mitosi o Fase MLa Mitosi o Fase M
PROFASE
La membrana nucleare inizia a disfarsi e si spiralizzano
METAFASE
I cromosomi si dispongono al centro della cellula su un piano orizzontale
Profase e MetafaseProfase e Metafase
ANAFASE
La cellula si allunga, i cromosomi
si separano e si portano agli
estremi della cellula dove
incominciano a riformarsi i due
nuclei
TELOFASE
Intorno ad ogni nucleo si forma la membrana, il citoplasma si suddivide attorno ai due nuclei e la cellula si divide completamente in due cellule figlie attorno alle quali si completa la membrana cellulare
Anafase e TelofaseAnafase e Telofase
Metodi di rilevazione delle Metodi di rilevazione delle Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
Analisi mitotica dopo “colorazione standard”
Tecnica di collegamento
Incorporazione di BrDU (bromodeoxyridine)
durante il ciclo cellulare
Incorporazione di BrDU durante diversi cicli
Analisi mitotica dopoAnalisi mitotica dopo “colorazione standard” “colorazione standard”
Questo metodo classico di Questo metodo classico di colorazione fa apparire i colorazione fa apparire i cromosomi come piccoli cromosomi come piccoli
segmenti colorati segmenti colorati uniformementeuniformemente
Questi possono essere Questi possono essere classificati in accordo con classificati in accordo con la loro dimensione e dalla la loro dimensione e dalla posizione del centromeroposizione del centromero
Tecnica di CollegamentoTecnica di Collegamento
““Colorando” i cromosomi Colorando” i cromosomi con un farmaco si con un farmaco si
possono distinguere possono distinguere bande più o meno bande più o meno
fluorescentifluorescenti
(Q-Banding)(Q-Banding)
Tecniche DinamicheTecniche Dinamiche
Il metodo originale include l’incorporazione Il metodo originale include l’incorporazione di un composto chimico trovato nel DNAdi un composto chimico trovato nel DNA
Attualmente viene impiegato la Attualmente viene impiegato la Bromodeoxyridina BrDU. Bromodeoxyridina BrDU.
Questa guida alla visualizzazione del difetto Questa guida alla visualizzazione del difetto nella condensazione del cromosoma e nella condensazione del cromosoma e
all’alterazione della strutturaall’alterazione della struttura
Tecniche DinamicheTecniche DinamicheIncorporazione di BrDU durante il Ciclo CellulareIncorporazione di BrDU durante il Ciclo Cellulare
Se il BrDu è inserito durante la seconda metà Se il BrDu è inserito durante la seconda metà della fase S, la distribuzione delle bande è della fase S, la distribuzione delle bande è quella dell’ R-Banding mentre le G-Banding quella dell’ R-Banding mentre le G-Banding
rimangono scurerimangono scure
R-Banding = Iniziale DuplicazioneR-Banding = Iniziale Duplicazione
Tecniche DinamicheTecniche DinamicheIncorporazione di BrDU durante Diversi Cicli CellulariIncorporazione di BrDU durante Diversi Cicli Cellulari
Se il BrDU è inserito durante due cicli Se il BrDU è inserito durante due cicli cellulari i cromosomi mostrano una cellulari i cromosomi mostrano una
fluorescenza cromatidica e una scurafluorescenza cromatidica e una scura
Luminosita del cromatide ha sostituito BrDu Luminosita del cromatide ha sostituito BrDu solo su un lato della molecola del DNAsolo su un lato della molecola del DNA
Questa differenza di colorazione sulle due Questa differenza di colorazione sulle due cromatidi sorelle dimostra scambi tra lorocromatidi sorelle dimostra scambi tra loro
Dicentrici
Anelli
Traslocazioni
Delezioni
Principali Aberrazioni Principali Aberrazioni Cromosomiche e Cromosomiche e
CromatidicheCromatidiche
Aberrazioni Aberrazioni CromosomicheCromosomiche
Se due cromosomi sono rotti
prima della replicazione, i
frammenti possono scambiarsi
e ricongiungersi
Si forma così una traslocazione
che dà luogo a cellule alterate
dopo la replicazione
Cromosomi in G1
Se si ricongiungono tra loro i
due frammenti più corti e i
due frammenti più lunghi, si
forma una unione illegittima
Cromosomi in G1
Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
Oppure, se i frammenti
rotti non sono
ricongiunti, essi non
sono inclusi nella
mitosi successiva
Cromosomi in G1
Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
L’ unione illegittima, dopo la
replicazione, dà luogo ad un
cromosoma dicentrico e ad
un frammento acentrico
Cromosomi in G1
Aberrazioni Aberrazioni CromosomicheCromosomiche
Il cromosoma dicentrico ha due centromeri
Il cromosoma acentrico è privo di centromero
Le aberrazioni con cromosomi dicentrici sono letali per la
cellula
Cromosomi in G1
Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
Due rotture, una su ciascun
braccio di un cromosoma,
può
portare alla formazione
di un anello
Le aberrazioni
cromosomiche ad anello
sono anche’esse letali per la
cellula
Cromosomi in G1
Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
Se avvengono due rotture,
ciascuna su una cromatide
sorella dello stesso cromosoma
dopo la replicazione, le due
estremità di esso possono
ricongiungersi e formare una
unione tra cromatidi sorelle
Cromosomi in G2
Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche
Dose Risposta per Aberrazioni Dose Risposta per Aberrazioni CromosomicheCromosomiche