universitas indonesia optimasi metode analisis...
TRANSCRIPT
-
UNIVERSITAS INDONESIA
OPTIMASI METODE ANALISIS ASAM VALPROAT DALAM
PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI GAS
SKRIPSI
ANI SUSANTI
0606070503
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI FARMASI
DEPOK
JULI 2010
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
ii
UNIVERSITAS INDONESIA
OPTIMASI METODE ANALISIS ASAM VALPROAT DALAM
PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI GAS
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi
ANI SUSANTI
0606070503
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI FARMASI
DEPOK
JULI 2010
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
iii
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
iv
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
v
KATA PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat
dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini
dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar
Sarjana Science Jurusan Farmasi pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Indonesia.
Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari
masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya
untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih
kepada:
(1) Ibu Dr. Yahdiana Harahap, M.S, selaku Ketua Departemen dan pembimbing I
atas segala bimbingan, saran, dan bantuan, kesabaran, serta dukungan moril
selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
(2) Bapak Dr. Harmita, Apt., selaku pembimbing II atas segala bimbingan, saran,
bantuan serta dukungan moril selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
(3) Ibu Dr. Nelly D. Leswara, M. Sc, selaku pembimbing akademik yang telah
memberikan bimbingan selama penulis menempuh pendidikan di program S1
Reguler Farmasi UI.
(4) Bapak Drs. Hayun, M.Si, selaku ketua laboratorium Kimia Analisis Kuantitatif
dan Instrumen tempat penulis melakukan kegiatan penelitian atas segala
kepercayaan, bantuan, dan pengertian yang diberikan kepada penulis selama
penelitian.
(5) Seluruh dosen, laboran dan staf karyawan di Departemen Farmasi, atas segala
ilmu, dukungan, dan saran kepada penulis selama masa pendidikan di
Departemen Farmasi.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
vi
(6) PT. Mersifarma Tirmaku Mercusana yang telah memberikan bantuan bahan
baku natrium divalproat kepada penulis.
(7) Kedua orang tua dan adikku tercinta atas segala kasih sayang, do’a, dukungan
dan pengorbanan yang tiada terkira kepada penulis.
(8) Teman-teman seperjuangan di Laboratorium Analisis Instrumen : Ekope, Indra,
Yose, Hifdzi, Anisa, Jenny, Nindy, Ankie, Maul, Marvin, Sinta, Ka Anyu, dan
Ka Nila.
(9) Teman-teman senasib sepenanggungan : Anisa Suci Aprila, Dira Aztiani,
Yaserita Achiro, Eka Irmawati Achmad, Wahyu Astuti, dan Arikadia Noviani
dan teman-teman satu angkatan.
Penulis menyadari dalam penelitian dan penulisan skripsi ini masih jauh dari
sempurna. Namun kiranya, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak
yang membutuhkan.
Penulis
2010
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
vii
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
viii Universitas Indonesia
ABSTRAK
Nama : Ani Susanti
Program studi : Farmasi
Judul : Optimasi Metode Analisis Asam Valproat dalam
Plasma In Vitro Secara Kromatografi Gas
Asam valproat dan bentuk garamnya merupakan obat antikonvulsi yang
bekerja dengan meningkatkan kadar γ-aminobutyric acid (GABA).
Penetapan kadar asam valproat menjadi masalah yang cukup sulit karena
tidak terdapat gugus kromofor di dalam strukturnya. Metode analisis
menggunakan kromatografi gas (KG) dengan detektor ionisasi nyala untuk
penentuan asam valproat dalam plasma manusia in vitro telah
dikembangkan dan dioptimasi. Asam valproat diekstraksi dari plasma
dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan dietil eter. Kondisi analisis
optimum asam valproat dalam plasma in vitro dengan kromatografi gas
diatur pada suhu injektor dan detektor 250 oC dan pemrograman suhu yang
digunakan adalah dengan suhu awal 70 o
C dengan kenaikan suhu 5 o
C per
menit sampai suhu 100 o
C, kemudian ditahan selama 1 menit, lalu suhu
dinaikkan sebesar 2 o
C per menit sampai suhu kolom menjadi 150 o
C.
Kondisi optimum ini membutuhkan waktu analisa 32 menit. Pada range
konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan
koefisien korelasi (r) 0,9894. Akurasi (% diff) dari metode ini -13,67%
sampai 12,33% dengan presisi (KV) antara 9,33% sampai 14,92%, dan uji
perolehan kembali relatif sebesar 86,33% sampai 112,33%.
Kata kunci : asam valproat, kromatografi gas, optimasi, plasma in vitro.
xiii + 69 hlm ; 14 gambar; 12 tabel; 7 lampiran
Daftar Acuan : 25 (1977-2009)
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
ix Universitas Indonesia
ABSTRACT
Name : Ani Susanti
Study program : Pharmacy
Title : Analytical Method Optimation of Valproic Acid
in Plasma In Vitro using Gas Chromatography
Valproic acid an anticonvulsant drug that works by increasing the levels
of γ-aminobutyric acid (GABA). Determination of valproic acid is quite
difficult because it has no chromophore groups in its structure.
Analytical methods using gas chromatography (GC) with flame
ionization detector for the determination of valproic acid in human
plasma has been developed and optimized. Valproic acid extracted from
plasma by liquid-liquid extraction method using diethyl ether. The
optimum analysis conditions for valproic acid in plasma achieved by
regulated gas chromatography injector and detector at a temperature of
250oC and temperature programming was used with an initial
temperature of 70oC and 5
oC temperature rise per minute until a
temperature of 100oC, then held for 1 minute. Then the temperature is
increased by 2°C per minute until the column temperature to 150oC.
The optimum conditions of analysis takes 32 minutes. In the
concentration range from 40,0 to 100,0 μg/mL yielded a linear
calibration curve with correlation coefficient (r) of 0.9894. Accuracy
(% diff) of this method is -13.67% to 12.33% with precision (CV)
between 9.33% to 14.92%, and relative recovery test 86.33% to
112.33%.
Keywords : gas chromatography, optimation, plasma in vitro,
valproic acid
xiii + 69 pp ; 14 figures; 12 tables; 7 appendices
Bibliography : 25 (1977-2009)
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
x Universitas Indonesia
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN ..............................................................................iv
KATA PENGANTAR ........................................................................................... v
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS
AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ............................................ vii
ABSTRAK ......................................................................................................... viii
ABSTRACT ..........................................................................................................ix
DAFTAR ISI .......................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiii
BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1
1.2 Tujuan Penelitian .................................................................................. 3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 4
2.1 Natrium Divalproat ............................................................................... 4
2.2 Analisis Obat dalam Plasma ................................................................. 7
2.3 Kromatografi Gas ........................................................................................ 8
2.4 Validasi Metode Analisis ......................................................................... 13
2.5 Metode Analisis Asam Valproat ............................................................. 18
BAB 3. METODE PENELITIAN ............................................................................. 23
3.1 Lokasi ......................................................................................................... 23
3.2 Bahan .......................................................................................................... 23
3.3 Alat .............................................................................................................. 23
3.4 Cara Kerja .................................................................................................. 23
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 29
4.1 Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis
Asam Valproat dengan Kromatografi Gas ........................................... 29
4.2 Validasi Metode Analisis Asam Valproat Dalam Plasma
In Vitro ....................................................................................................... 32
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 36
5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 36
5.2 Saran ........................................................................................................... 36
DAFTAR ACUAN........................................................................................................ 37
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
xi Universitas Indonesia
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Rumus struktur natrium divalproat ................................................................ 4
4.1 Alat kromatografi gas Shimadzu GC-17A ................................................... 40
4.2 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/mL dengan laju alir gas He
1,0 mL/menit ................................................................................................ 41
4.3 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/mL dengan laju alir gas He
1,5 mL/menit ................................................................................................ 42
4.4 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/mL dengan laju alir gas He
2,0 mL/menit ................................................................................................ 43
4.5 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dengan suhu awal
kolom 70°C ................................................................................................... 44
4.6 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dengan suhu awal
kolom 90°C ................................................................................................... 45 4.7 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang
diekstraksi dengan metanol .......................................................................... 46
4.8 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang
diekstraksi dengan kloroform ....................................................................... 47
4.9 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang
diekstraksi dengan heksan ............................................................................ 48
4.10 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang
diekstraksi dengan dietil eter ........................................................................ 49
4.11 Kurva hubungan antara waktu vorteks dengan luas area dari larutan natrium
divalproat konsentrasi 100μg/mL yang diekstraksi dengan dietil eter ......... 50
4.12 Kurva hubungan antara waktu sentrifugasi dengan luas area dari larutan
natrium divalproat konsentrasi 100μg/mL yang diekstraksi dengan dietil
eter.. ............................................................................................................. .50
4.13 Kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma in vitro yang terdiri dari 7
sampel plasma dengan konsentrasi 40 sampai 100 μg/mL .......................... 51
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
xii Universitas Indonesia
DAFTAR TABEL Tabel Halaman
4.1 Hubungan waktu retensi, jumlah lempeng teoritis, dan faktor ikutan dari
larutan natrium divalproat terhadap perubahan laju alir gas pembawa……..52
4.2 Hubungan waktu retensi, jumlah lempeng teoritis, dan faktor ikutan dari
larutan natrium divalproat terhadap perubahan suhu awal kolom ................ 53
4.3 Hubungan luas area ekstrak plasma dari larutan natrium divalproat
terhadap pelarut organik yang digunakan sebagai pengekstrak .................... 54
4.4 Hubungan luas area ekstrak plasma dari larutan natrium divalproat
terhadap perubahan waktu vorteks ................................................................ 55
4.5 Hubungan luas area ekstrak plasma dari larutan natrium divalproat
terhadap perubahan waktu sentrifugasi ......................................................... 56
4.6 Data uji kesesuaian sistem ............................................................................ 57
4.7 Data kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma in vitro .................... 57
4.8 Data Lower Limit of Quantification (LLOQ) larutan natrium divalproat
dalam plasma in vitro .................................................................................... 58
4.9 Data uji selektivitas larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro ........ 59
4.10 Data akurasi larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro .................... 60
4.11 Data presisi larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro ..................... 61
4.12 Data uji perolehan kembali larutan natrium divalproat dalam plasma in
vitro ............................................................................................................... 62
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
xiii Universitas Indonesia
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Cara perhitungan nilai N, HETP, dan Tf ............................................................ 63 2. Cara memperoleh regresi linier dari persamaan garis y = a + bx ....................... 64 3. Cara perhitungan koefisien variasi dari fungsi ................................................... 65 4. Cara perhitungan presisi ..................................................................................... 66
5. Cara perhitungan akurasi .................................................................................... 67 6. Cara perhitungan uji perolehan kembali ............................................................ 68 7. Sertifikat analisis natrium divalproat ................................................................. 69
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
Universitas Indonesia
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Antiepilepsi digunakan terutama untuk mencegah dan mengobati kejang
epilepsi. Terdapat dua mekanisme antiepilepsi yang penting, yaitu mencegah
timbulnya letupan depolarisasi eksesif pada neuron epileptik dalam fokus epilepsi
dan mencegah terjadinya letupan depolarisasi pada neuron normal akibat
pengaruh dari fokus epilepsi (Gan & Utama, 1995).
Masing-masing obat antiepilepsi memiliki efektivitas yang berbeda dalam
mengobati tiap jenis kejang. Oleh karena itu, terapi antiepilepsi harus bersifat
individual dan pemilihan obat yang digunakan harus berdasarkan kepada jenis
kejang, sindrom epileptik, dan respon pasien. Secara umum, obat pilihan untuk
mengobati kejang tonik-klonik adalah fenitoin, karbamazepin, atau asam valproat
(Hoover, 2005). Untuk mengobati kejang lena, obat pilihan yang biasa digunakan
adalah etosuksimid atau asam valproat. Dapat dilihat bahwa asam valproat efektif
untuk mengobati jenis kejang umum. Sejauh ini, tidak ada bukti yang meyakinkan
bahwa bahwa obat ini efektif pada kejang parsial (Pitlick & Porter, 2006).
Asam valproat (asam-2-propilpentanoat) dan bentuk garamnya yaitu
natrium valproat dan natrium divalproat, merupakan senyawa golongan asam
karboksilat rantai sederhana yang digunakan dalam penanganan epilepsi karena
memiliki spektrum aktivitas yang cukup luas (Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-
Poulou, Rompotis, & Vavayannis, 2002). Obat ini biasa digunakan dalam
pengobatan bipolar disorders dan epilepsi, terutama dalam penanganan kejang
umum (Amini, Ghaeli, Kamalinia, & Rouini, 2009).
Berdasarkan fakta bahwa obat ini digunakan secara luas dalam
penanganan pasien dengan gangguan psikiatrik atau neurologik, penentuan kadar
asam valproat dalam plasma merupakan hal yang penting dalam studi monitoring
obat (Amini, Ghaeli, Kamalinia, & Rouini, 2009). Asam valproat merupakan obat
yang wajib untuk uji bioekuivalensi (Food and Drug Administration, 2007).
Untuk itu diperlukan suatu metode analisis obat yang terpercaya dalam matriks
1
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
2
Universitas Indonesia
biologis yang sesuai. Metode analisis yang selektif dan sensitif untuk penilaian
secara kuantitatif suatu obat dan metabolitnya penting agar berhasil menuntun uji
preklinik dan/atau biofarmasetik dan uji farmakologi klinik. Pengukuran analit
dalam matriks biologis harus divalidasi. Validasi metode bioanalisis mencakup
semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode khusus yang digunakan untuk
pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam matriks biologis, seperti darah,
plasma, serum, atau urin, dapat dipercaya dan dapat dilakukan ulang
(reproducible) untuk penggunaan yang diinginkan (Food and Drug
Administration, 2001). Validasi metode yang sempurna hanya dapat terjadi jika
metode tersebut sudah dikembangkan dan dioptimasi (Gandjar & Rohman, 2007)
Kadar asam valproat dalam plasma berkisar antara 40-90 μg/ml (Davis,
DeVane, Ennis, Figueroa, Smith, & Winter, 2007). Apabila kadar asam valproat
dalam plasma lebih dari 100 μg/ml, dikhawatirkan akan timbul efek samping yang
membahayakan seperti hepatotoksik, trombositopenia, dan ensefalopati akut (
Pitlick & Porter, 2006; Degel, Heidrich, Schmid, & Weidemann, 1984).
Penetapan kadar asam valproat dalam plasma merupakan masalah yang
cukup sulit karena asam valproat memiliki absorpsi UV yang rendah (Brega,
Lucarelli, Lombaradi, Prandini, & Villa, 1992). Oleh karena itu, sangat penting
untuk mengembangkan suatu metode analisis yang mudah dilakukan, cepat, dan
terpercaya untuk penetapan kadar asam valproat dalam cairan biologis, termasuk
dalam plasma (Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-Poulou, Rompotis, & Vavayannis,
2002).
Sejumlah metode, termasuk metode penetapan kadar dengan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT) detektor fluoresensi dan detektor UV-Vis telah
digunakan untuk menentukan kadar asam valproat dalam plasma (Amini, Ghaeli,
Kamalinia, & Rouini, 2009; Brega, Lucarelli, Lombaradi, Prandini, & Villa, 1992;
Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-Poulou, Rompotis, & Vavayannis, 2002). Ketiga
metode yang dikembangkan dengan menggunakan KCKT tersebut, memerlukan
proses derivatisasi untuk mengubah analit menjadi senyawa yang dapat dideteksi
oleh detektor. Hal ini memang memberikan hasil analisis yang akurat dan sensitif
namun proses analisis yang dilakukan menjadi rumit dan memakan waktu lama.
Sementara itu, metode yang dikembangkan dengan menggunakan kromatografi
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
3
Universitas Indonesia
gas lebih mengutamakan proses ekstraksi seoptimal mungkin dan penggunaan
instrumen yang lebih modern seperti kromatografi gas-spektrometri massa
sehingga diperoleh hasil analisis yang akurasi dan sensitifitasnya tidak kalah
dengan KCKT (Degel, Heidrich, Schmid, & Weidemann, 1984; Deng, Duan, Ji,
Li, Yang, & Zhang, 2006).
Oleh karena itu, dalam penelitian ini penulis ingin mengembangkan metode
analisis asam valproat dalam plasma in vitro dengan menggunakan kromatografi
gas detektor ionisasi nyala dan pengembangan teknik ekstraksi cair-cair sehingga
diperoleh metode yang sederhana dan sensitif untuk analisis asam valproat.
1.2 Tujuan Penelitian
1. Memperoleh kondisi analisis optimum untuk analisis asam valproat dalam
plasma in vitro secara kromatografi gas.
2. Memperoleh metode ekstraksi optimum untuk analisis asam valproat
dalam plasma in vitro secara kromatografi gas.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
4 Universitas Indonesia
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Natrium Divalproat
2.1.1 Monografi (Abbott Laboratories, 2009; Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia,
2006; Sweetman, 2005; Budavari, 1996)
Gambar 2.1 Rumus struktur natrium divalproat (Hoover, 2005)
Nama dagang : Depakote ®
Rumus molekul : C16H31NaO4
Bobot molekul : 310,4
Sinonim : Sodium hydrogen bis(2-propylpentanoate)
Fungsi : Antikonvulsi, antiepilepsi
Pemerian : Serbuk putih dengan bau spesifik
Kelarutan : Sangat larut dalam alkohol dan metanol
2.1.2 Sifat Farmakologi
Natrium divalproat merupakan obat antiepilepsi yang mengalami disosiasi
dalam saluran gastrointestinal menjadi dua molekul asam valproat. Oleh karena
itu, senyawa ini memiliki indikasi, efek samping, dan kontraindikasi yang sama
dengan asam valproat (Hoover, 2005).
Asam valproat efektif terhadap kejang umum, seperti kejang tonik-klonik
dan kejang lena, sedangkan terhadap kejang parsial efektivitasnya kurang
memuaskan. Walaupun efektivitasnya sebagai obat untuk kejang umum telah
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
5
Universitas Indonesia
diakui, hal ini tidak menjadikan asam valproat sebagai obat terpilih dalam
pengobatan epilepsi karena efek toksiknya terhadap hati (Gan & Utama, 1995).
Mekanisme aksi dari asam valproat sampai saat ini masih belum diketahui
secara pasti. Efek yang ditimbulkan dari pemberian obat ini diperkirakan
berkaitan dengan meningkatnya kadar γ-aminobutyric acid (GABA), suatu
neurotransmiter inhibitor di otak. Suatu studi mengindikasikan bahwa asam
valproat menghambat aktivitas neuron dengan meningkatkan konduktansi kalium
(McEvoy, 2002).
Toksisitas asam valproat berupa gangguan saluran gastrointestinal, sistem
saraf, hati, ruam kulit, dan alopesia. Efek terhadap sistem saraf pusat berupa rasa
kantuk, ataksia, dan tremor. Efek terhadap sistem saraf pusat ini akan menghilang
seiring dengan penurunan dosis. Gangguan pada hati berupa peningkatan aktivitas
enzim-enzim hati, dan pernah terjadi pula kasus nekrosis hati yang berakibat fatal
(Gan & Utama, 1995).
2.1.3 Sifat Farmakokinetika
2.1.3.1 Absorpsi
Natrium divalproat mengalami disosiasi menjadi asam valproat dalam
saluran gastrointestinal. Pemberian dosis oral yang ekuivalen antara natrium
divalproat dan asam valproat memberikan jumLah ion valproat yang ekuivalen
secara sistemik. Pemberian natrium divalproat bersama dengan makanan akan
memperlambat laju absorpsi namun tidak mempengaruhi jumlah zat yang
diabsorpsi.
Konsentrasi plasma puncak setelah pemberian oral dosis tunggal dari
natrium divalproat tercapai setelah 3-5 jam, dan pemberian natrium divalproat
tablet extended-release dosis ganda akan mencapai konsentrasi plasma puncak
setelah 7-14 jam (McEvoy, 2002).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
6
Universitas Indonesia
2.1.3.2 Distribusi
Asam valproat terdeteksi dalam cairan serebrospinal (sekitar 10% dari
kosentrasi serum) dan air liur (sekitar 1% dari konsentrasi plasma). Asam valproat
dapat melewati plasenta.
Ikatan protein plasma dari asam valproat merupakan tipe tergantung
dosis. Fraksi bebas dari obat meningkat dari 10% pada konsentrasi 40 μg/mL
sampai 18,5 % pada konsentrasi 130 μg/mL. Ikatan protein dari asam valproat
akan menurun pada pasien geriatrik, pasien dengan gangguan hati atau ginjal, dan
adanya obat lain yang dapat menggeser ikatan obat-protein (McEvoy, 2002).
2.1.3.3 Metabolisme
Valproat mengalami metabolisme di hati. Pada pasien dewasa yang
melakukan monoterapi, 30-50% dari dosis yang diberikan akan diekskresi di urin
dalam bentuk konjugat glukuronida. Kurang dari 3% dari dosis yang diberikan
akan diekskresi dalam bentuk yang tidak berubah di urin.
Hubungan antara dosis dan konsentrasi total valproat dalam plasma
bersifat nonlinier. Konsentrasi obat dalam plasma tidak meningkat sebanding
dengan dosis, karena adanya ikatan dengan protein yang bersifat dapat jenuh
(Abbott Laboratories, 2009).
2.1.3.4 Eliminasi
Klirens plasma dan volume distribusi dari total valproat berturut-turut
sebesar 0,56 L/jam/1,73 m2 dan 11 L/1,73 m
2. Waktu paruh dari valproat berkisar
antara 9 sampai 16 jam apabila rejimen dosis yang diberikan ada pada rentang
250-1000 mg.
Nilai-nilai perkiraan yang disebutkan di atas berlaku pada pasien yang
tidak mengonsumsi obat yang memengaruhi sistem metabolisme enzim hepatik.
Contoh, pasien yang mengonsumsi obat antiepilepsi yang bersifat induksi
(karbamazepin, fenitoin, dan fenobarbital) akan menyebabkan valproat
tereliminasi lebih cepat. Karena terjadi perubahan pada klirens valproat,
monitoring terhadap konsentrasi obat dalam darah harus dilakukan secara lebih
intensif (Abbott Laboratories, 2009).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
7
Universitas Indonesia
2.2 Analisis Obat dalam Plasma
Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh
karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam plasma.
Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga obat harus
dibebaskan terlebih dahulu. Beberapa cara yang bisa dilakukan untuk mencapai
tujuan di atas di antaranya dengan pengendapan protein, ekstraksi cair-cair, dan
ekstraksi fase padat (Evans, 2004).
2.2.1 Pengendapan Protein
Pada pengendapan protein, biasanya digunakan asam atau pelarut organik
yang dapat bercampur dengan air untuk memisahkan protein dari plasma. Asam
trikloroasetat dan asam perklorat sangat efisien sebagai pengendap protein, tetapi
asam yang terlalu kuat dapat menimbulkan efek kerusakan terhadap obat yang
diekstraksi. Pelarut organik seperti metanol, asetonitril, aseton dan etanol,
meskipun memiliki efisiensi yang relatif rendah dalam memisahkan protein, tetapi
pelarut ini telah digunakan secara luas dalam bioanalisis karena kompatibilitasnya
dengan fase gerak kromatografi cair kinerja tinggi.
Setelah dicampur (biasanya menggunakan bantuan vorteks), sampel
disentrifugasi untuk menghasilkan supernatan yang jernih, berisi komponen yang
diinginkan. Larutan yang telah bebas protein mungkin perlu diekstraksi lebih
lanjut dengan teknik ekstraksi cair-cair dengan pelarut organik yang tidak
bercampur, atau dapat langsung disuntikkan pada sistem analisis yang akan
digunakan, bila diyakini obat sepenuhnya larut dalam supernatan (Evans, 2004).
2.2.2 Ekstraksi Cair-cair
Ekstraksi cair-cair adalah proses pemindahan suatu komponen dari satu fase
cair ke fase cair lainnya yang tidak saling bercampur sesamanya. Prosesnya
disebut partisi atau distribusi.
Umumnya, salah satu fasenya berupa air atau larutan air. Cara paling umum
yang sering digunakan untuk pemisahan parsial adalah metode ekstraksi dengan
pelarut organik. Agar obat dapat terekstraksi dalam pelarut organik, maka obat itu
harus dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu, pH fase air harus dioptimasi
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
8
Universitas Indonesia
agar diperoleh bentuk tidak terionisasi dengan sempurna. Optimasi dapat
dilakukan dengan menghitung atau menentukan pKa obat.
Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik harus benar-benar bebas air.
Untuk mempercepat penguapan, dapat ditambahkan beberapa tetes etanol, dan air
dapat dihilangkan dari fase organik dengan penambahan sedikit natrium sulfat
anhidrat pada saat penyaringan. Penguapan dapat dilakukan dengan alat
evaporator vakum atau diuapkan pada temperatur kamar (Chamberlain, 1985).
2.2.3 Ekstraksi Fase Padat
Pada ekstraksi fase padat, analit ditahan oleh fase padat saat sampel
dilewatkan, kemudian dilanjutkan dengan elusi analit oleh pelarut yang sesuai.
Pada teknik ini digunakan kolom berukuran kecil dengan adsorben yang mirip
dengan yang digunakan pada saat analisis. Metode ekstraksi fase padat ini
berdasarkan prinsip dari kromatografi, yaitu adsorpsi obat dari larutan ke dalam
adsorben atau fase diam.
Pemilihan cara isolasi obat dalam plasma harus dilakukan karena akan
memberikan nilai perolehan kembali (recovery) yang maksimum dari obat yang
dianalisis. Selain itu juga untuk memperbaiki ketelitian, maka penggunaan baku
dalam dapat ditambahkan pada sampel (Evans, 2004).
2.3 Kromatografi Gas
2.3.1 Teori
Kromatografi gas adalah suatu cara untuk memisahkan senyawa atsiri
dengan meneruskan arus gas melalui fase diam. Bila fase diam berupa zat padat,
maka cara itu disebut sebagai kromatografi gas padat (KGP).Bila fase diam
berupa zat cair, cara tadi disebut kromatografi gas cair (KGC). Banyaknya macam
fase cair yang dapat digunakan sampai suhu 400oC mengakibatkan KGC
merupakan bentuk kromatografi gas yang paling serba guna dan selektif. KGC
digunakan untuk menganalisis gas, zat cair, dan zat padat.
Pada KGC, komponen yang akan dipisahkan dibawa oleh gas lembam (gas
pembawa) melalui kolom. Campuran cuplikan terbagi diantara gas pembawa dan
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
9
Universitas Indonesia
pelarut (fase diam) yang terdapat pada zat padat dengan ukuran partikel tertentu
(penyangga padat). Pelarut akan menahan komponen secara selektif berdasarkan
koefisien distribusinya sehingga terbentuk sejumlah pita yang berlainan pada gas
pembawa. Pita komponen ini meninggalkan kolom bersama aliran gas pembawa
dan dicatat sebagai fungsi waktu oleh detektor.
Keuntungan dari kromatografi gas yaitu :
a. Kecepatan
Seluruh analisis dapat diselesaikan dalam waktu singkat. Penggunaan gas
sebagai fase gerak mempunyai keuntungan, yaitu tercapainya kesetimbangan
antara fase gerak dan fase diam, dan dapat digunakan kecepatan gas pembawa
yang tinggi.
b. Daya pisah
Misalnya puncak C18, C18:1, dan C18:2 yang menyatakan ester metil asam
stearat, oleat, dan linoleat. Pemisahan ketiga senyawa ini dengan cara lain sangat
sukar atau tidak mungkin, perbedaan titik didihnya kecil sekali, hanya dalam
derajat ketidakjenuhan. Tetapi dengan menggunakan fase cair yang selektif, KGC
dapat memisahkan ketiganya, suatu hal yang tidak mungkin dilakukan dengan
cara penyulingan atau cara lain.
c. Analisis kualitatif
Waktu retensi adalah waktu sejak penyuntikan sampai maksimum puncak.
Sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan fase cair pada suhu tertentu. Waktu
retensi ini tidak terpengaruh oleh adanya komponen lain dan dapat digunakan
untuk mengidentifikasi puncak yang terbentuk.
d. Analisis kuantitatif
Luas tiap puncak yang terbentuk berbanding lurus dengan konsentrasi
puncak tersebut. Ini dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi yang tepat
dari setiap komponen.
e. Kepekaan
Alasan utama mengapa penggunaan kromatografi gas pada analisis begitu
meluas adalah karena kepekaannya. Bentuk sel penghantar panas yang paling
sederhana dapat mendeteksi sampai 0,01% (100 bpj = bagian per juta). Detektor
pengionan nyala dapat mendeteksi dengan mudah bagian per juta. Detektor
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
10
Universitas Indonesia
tangkap elektron dan detektor fosfor dapat mengukur pada skala pikogram (10-12
gram). Keuntungan tambahan dari kepekaan yang tinggi ini adalah cuplikan yang
diperlukan sedikit sekali. Beberapa mikroliter saja sudah cukup untuk analisis
lengkap.
f. Kesederhanaan
Penafsiran data yang diperoleh biasanya cepat dan langsung, serta mudah.
Bila dibandingkan dengan data yang diperoleh, harga instrumentasi ini termasuk
murah (McNair & Bonelli, 1988)
2.3.2 Instrumentasi
Bagian-bagian utama dari sebuah kromatografi gas yaitu silinder dengan gas
pembawa (carrier gas), pengukur tekanan dan pengontrol flow rate, tempat
injeksi sampel (injection port), kolom, detektor dan amplifier, rekorder/perekam,
dan oven dengan termostat untuk tempat injeksi (gerbang suntik), kolom, dan
detektor (Harmita, 2006).
2.3.3 Sistem Kromatografi
2.3.3.1 Gas Pembawa
Tangki gas bertekanan tinggi berlaku sebagai sumber gas pembawa. Suatu
pengatur tekanan digunakan untuk menjamin tekanan yang seragam pada
pemasok kolom sehingga diperoleh laju aliran gas yang tetap. Gas yang biasa
dipakai adalah hidrogen, helium, dan nitrogen. Gas pembawa harus memiliki sifat:
inert, untuk mencegah interaksi dengan cuplikan atau pelarut (fase diam), dapat
meminimumkan difusi gas, mudah didapat dan murni, murah serta cocok untuk
detektor yang digunakan (McNair & Bonelli, 1988).
2.3.3.2 Pemasukan Cuplikan
Cuplikan zat cair biasanya dimasukkan dengan semprit. Untuk cuplikan
berbetnuk zat padat, cara yang biasa digunakan adalah dengan melarutkannya
dalam suatu pelarut yang tidak mengganggu cuplikan yang dianalisis. Suatu cara
baku untuk memasukkan gas dan zat cair adalah dengan memasukkan jarum
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
11
Universitas Indonesia
suntik melalui septum yang dapat menutup kembali sendiri dan menyuntikkan
sejumlah volume terukur dari semprit (McNair & Bonelli, 1988).
2.3.3.3 Kolom
Pipa kolom dapat terbuat dari tembaga, baja nirkarat, aluminium, dan kaca
yang berbentuk lurus, lengkung, atau melingkar. Pada umumnya digunakan baja
nirkarat, yang dikemas dalam bentuk lurus agar kemasan seragam, kemudian
dilingkarkan agar dapat dipasang dalam ruang kolom yang terbatas. Kolom lurus
lebih efisien, tetapi dapat menjadi tidak praktis, terutama bila alat bekerja pada
suhu tinggi (McNair & Bonelli, 1988).
Kolom pada kromatografi gas dikelompokkan menjadi dua kelompok
utama, yaitu kolom yang terkemas (packed column) dan kolom kapiler (capillary
column). Kolom yang terkemas (packed column) mempunyai panjang antara 1-10
meter dengan diameter dalam antara 3-10 mm atau sampai lebih dari 10 cm bagi
kolom preparative. Kolom kapiler (capillary column) panjangnya dapat mencapai
10-50 meter dengan diameter dalam sangat kecil, yaitu 0,2-1,2 mm (Harmita,
2006).
Berdasarkan mekanisme pembuatannya, kolom kapiler dibagi menjadi tiga
jenis, yaitu :
a. Kolom WCOT (Wall Coated Open Tubular) adalah jenis kolom kapiler yang
fase diamnya terikat pada permukaan bagian dalam kolom kapiler.
b. Kolom SCOT (Support Coated Open Tubular Column) adalah jenis kolom
kapiler yang cairan fase diamnya masih ditambah partikel pendukung padat
seperti tanah diatom atau partikel silika yang telah disilinisasi.
c. Kolom FSOT (Fused Silica Open Tubuler) adalah jenis kolom kapiler yang fase
diamnya terikat secara kimia dengan permukaan bagian dalam kolom kapiler
sedangkan bagian luar dilapisi resin poliimida (Harmita, 2006).
2.3.3.4 Fase Diam
Pemilihan fase diam yang tepat mungkin merupakan parameter terpenting
pada KGC. Secara ideal fase diam tersebut harus mempunyai ciri sebagai berikut :
a. Cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang berbeda pada fase diam,
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
12
Universitas Indonesia
b. Cuplikan harus mempunyai kelarutan yang berarti dalam fase diam,
c. Fase diam harus mempunyai tekanan uap yang dapat diabaikan pada suhu kerja
(McNair & Bonelli, 1988).
2.3.3.5 Suhu
Dalam sistem kromatografi diperlukan sekali untuk memiliki tiga
pengendali suhu yang berlainan.
a. Suhu gerbang suntik
Gerbang suntik harus cukup panas untuk menguapkan cuplikan sedemikian
cepat sehingga tidak menghilangkan keefisienan yang disebabkan oleh cara
penyuntikan. Sebaliknya, suhu gerbang suntik harus cukup rendah untuk
mencegah peruraian akibat panas.
b. Suhu kolom
Suhu kolom harus cukup tinggi sehingga analisis dapat diselesaikan dalam
waktu yang layak, dan harus cukup rendah sehingga pemisahan yang dikehendaki
tercapai. Menurut pendekatan sederhana yang dilakukan oleh Giddings, waktu
retensi naik dua kali lipat tiap penurunan suhu kolom 30oC.
Untuk kebanyakan cuplikan, semakin rendah suhu kolom, semakin tinggi
koefisien partisi dalam fase diam sehingga hasil pemisahan semakin baik. Pada
beberapa kasus tidak dapat digunakan suhu rendah, terutama bila cuplikan terdiri
atas senyawa yang rentangan titik didihnya lebar. Untuk itu suhu perlu diprogram.
c. Suhu detektor
Pengaruh suhu pada detektor sangat bergantung pada jenis detektor yang
digunakan. Tetapi, sebagai patokan umum dapat dikatakan bahwa detektor dan
sambungan antara kolom dan detektor harus cukup panas sehingga cuplikan
dan/atau fase diam tidak mengembun. Pelebaran puncak dan menghilangnya
puncak komponen merupakan ciri khas terjadinya pengembunan (McNair &
Bonelli, 1988).
2.3.3.5 Detektor
Dalam kromatografi gas dikenal beberapa macam detektor yang lazim
digunakan dan setiap detektor mempunyai karakteristik dalam selektivitas,
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
13
Universitas Indonesia
linearitas, sensitivitas atau kemampuan mendeteksi pada jumlah terkecil (limit
detection).
a. Detektor daya hantar panas (Thermal Conductivity Detector/TCD)
Bersifat non dekstruktif, tidak selektif (bersifat umum), batas linearitas
104 dan jumlah terkecil yang masih dapat terdeteksi sampai 10
-5 g/mL.
b. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector/FID)
Bersifat dekstruktif, dapat mendeteksi semua senyawa organik, batas
linearitas 107 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10
-11 g/mL.
c. Detektor fotometrik nyala (Flame Photometric Detector/FPD)
Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa sulfur dan fosfor organik,
batas linearitas 103 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10
-12 g/mL.
d. Detektor termionik nyala (Flame Thermal Detector/FTD)
Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa nitrogen dan fosfor
organik, batas linearitas 103 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10
-10 g/mL.
e. Detektor penangkap elektron (Electrolytic Conductivity Detector/ECD)
Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa dengan sifat elektronegatif
seperti halogen organik, batas linearitas 5 x 102 dan batas terkecil pendeteksian
2 x 10-13
g/mL (Harmita, 2006).
2.3.3.8. Rekorder/Perekam
Pada kebanyakan peralatan kromatografi yang telah menggunakan teknologi
maju, peran pengolahan data dilakukan oleh suatu alat pengolah data atau
komputer. Informasi yang diperoleh dapat dimanfaatkan dalam analisis kualitatif
biasanya dilakukan dengan membandingkan waktu retensi contoh zat baku pada
kondisi analisis yang sama. Sedangkan untuk analisis kuantitatif biasanya
dilakukan dengan perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram
contoh terhadap zat baku melalui metode baku luar atau baku dalam (Harmita,
2006).
2.4 Validasi Metode Analisis
Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi
yaitu sebagai berikut :
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
14
Universitas Indonesia
a. Validasi lengkap (full validation)
Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode
dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini
penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.
b. Validasi parsial (partial validation)
Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang sudah
divalidasi. Beberapa tipe metode analisis yang termasuk dalam validasi parsial
antara lain :
1. Metode bioanalisis yang ditransfer antar laboratorium atau analisis.
2. Ada perubahan pada metode analisanya (misalnya ada perubahan pada sistem
deteksi).
3. Perubahan antikoagulan.
4. Perubahan matriks pada spesies yang sama (misalnya plasma manusia diganti
urin).
5. Perubahan prosedur proses sampling.
6. Perubahan spesies pada matriks yang sama (misalnya plasma mencit diganti
plasma tikus).
7. Perubahan kisaran konsentrasi.
8. Perubahan instrument atau platform software.
9. Volume sampel terbatas.
10.Matriksnya jarang.
c. Validasi silang (cross validation)
Validasi ini dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter
validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan
data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda. Pada validasi ini
digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode
bioanalisis lainnya sebagai komparator.
Analisis obat dalam matriks biologi memerlukan standar acuan (reference
standard) dan sampel yang digunakan sebagai quality control (QC). Standar
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
15
Universitas Indonesia
acuan yang digunakan sebaiknya identik dengan analit, apabila tidak bisa
digunakan basa bebas atau asamnya, maka dapat digunakan garam atau ester
dengan kemurnian yang diketahui. Standar acuan dapat berupa baku dalam dan
baku luar. Ada tiga macam standar acuan, antara lain :
a. Standar acuan yang mempunyai sertifikat (misalnya USP standar).
b. Standar acuan yang dijual secara komersil dari sumber yang mempunyai
reputasi.
c. Standar acuan yang disintesis oleh laboratorium analit, atau institusi non
komersial lainnya (Food And Drug Administration).
Parameter yang dibutuhkan untuk keseluruhan proses validasi metode
bioanalisis meliputi evaluasi dari selektivitas, akurasi, presisi, uji perolehan
kembali (% recovery), kurva kalibrasi, lower limit of quantification (LLOQ),
linearitas, dan stabilitas (Food and Drug Administration, 2001).
2.4.1 Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk mengukur kadar
analit dengan adanya komponen-komponen lain dalam sampel (cairan biologis).
Pada uji selektivitas ini dilakukan pengukuran pada 6 blanko plasma manusia
yang berbeda. Setiap sampel blanko sebaiknya diuji terhadap adanya gangguan
dan selektivitas pada lower limit of quantification (LLOQ) (Food and Drug
Administration, 2001).
2.4.2 Akurasi
Akurasi menggambarkan kedekatan hasil pengujian dengan kadar
sebenarnya. Akurasi dilakukan minimal 5 replikat untuk tiap kadar yaitu pada
konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Pengukurannya dapat dilakukan intra
assay (dalam satu kali analisis) dan inter assay (dilakukan analisis selama 5 hari).
Pengukuran akurasi memenuhi syarat jika nilai % diff tidak menyimpang ±15%,
kecuali jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh
menyimpang ±20% (Food and Drug Administration, 2001).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
16
Universitas Indonesia
2.4.3 Presisi
Presisi menggambarkan kedekatan antara hasil pengujian yang satu dengan
hasil pengujian lainnya. Pada pengukuran presisi dilakukan minimal 5 replikat
untuk tiap kadar yaitu pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi.
Pengukurannya dapat dilakukan intra assay (dalam satu kali analisis) dan inter
assay (dilakukan analisis selama 5 hari). Penentuan presisi pada tiap konsentrasi
memenuhi syarat jika koefisien variasi (KV) tidak menyimpang ±15%, kecuali
jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh menyimpang
±20% (Food and Drug Administration, 2001).
2.4.4 Uji Perolehan Kembali (% recovery)
Uji perolehan kembali (% recovery) merupakan perbandingan respon
detektor analit yang diekstraksi dari sampel biologis dengan respon detektor kadar
yang sebenarnya dari standar murni. Perolehan kembali dari analit tidak perlu
100% tetapi perolehan kembali dari analit dan baku dalam harus konsisten,
presisi, dan reprodusibel. Uji perolehan kembali dilakukan dengan
membandingkan hasil analisis dari sampel yang diekstraksi pada tiga konsentrasi
(konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dan standar yang tidak diekstraksi di
mana uji perolehan kembalinya 100%. Penentuan uji perolehan kembali (%
recovery) pada tiap konsentrasi memenuhi syarat jika % recovery berkisar antara
80-120% (Food and Drug Administration, 2001).
2.4.5 Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dengan
konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi harus terdiri dari 1 blank
sample (matriks tanpa baku dalam), 1 zero sample (matriks dengan baku dalam )
dan 6-8 non-zero samples yang mencakup kisaran konsentrasi pengukuran
(termasuk konsentrasi pada LLOQ). Standar terendah dari kurva kalibrasi yang
dapat diterima sebagai LLOQ jika memenuhi kondisi sebagai berikut :
a. Respon analit pada LLOQ sedikitnya lima kali respon blanko.
b. Respon analit (puncak analit) dapat diidentifikasi, terpisah, dan reproduksibel
dengan koefisien variasi 20% dan akurasi 80-120% (Food and Drug
Administration, 2001).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
17
Universitas Indonesia
2.4.6 Linearitas dan Rentang
Linearitas suatu metode bioanalisis harus diuji untuk mengetahui adanya
hubungan yang linear antara kadar zat dengan respon detektor. Linearitas
diperoleh dari koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier yang didapat dari
kurva kalibrasi. Dengan dilakukan uji ini, maka dapat diketahui batas-batas
konsentrasi dari analit yang memberikan respon detektor yang linear. Analisis
harus dilakukan pada konsentrasi yang termasuk batas-batas linier dari konsentrasi
yang telah dilakukan. Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi terendah dan
tertinggi analit yang dianalisis memberikan kecermatan, keseksamaan, dan
linearitas yang dapat diterima (Food and Drug Administration, 2001).
2.4.7 Stabilitas
Berbagai kondisi seperti panas, cahaya, kelembaban, dan pH yang
berbeda, kandungan kimia dari obat, matriks serta wadah penyimpanan dapat
mempengaruhi kestabilan obat, sehingga obat yang ada dalam matriks biologis
dapat terurai sewaktu penyimpanan dan tidak dapat terdeteksi sewaktu sampel
dianalisis. Untuk menentukan stabilitas obat dalam matriks biologis maka
digunakan beberapa sampel yang dipersiapkan dari larutan induk analit yang
dibuat segar dan analit dalam matriks biologi. Penentuan stabilitas obat dalam
matriks biologi dapat dilakukan dengan lima cara antara lain :
a. Stabilitas freeze dan thaw
Stabilitas sebaiknya ditentukan setelah tiga siklus pembekuan/pencairan.
Pengujian dilakukan paling sedikit pada tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi
rendah, sedang, tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada temperatur yang
diharapkan selama 24 jam dan pada temperatur kamar. Jika analit tidak stabil
selama penyimpanan pada temperatur yang diharapkan, maka sampel sebaiknya
disimpan pada temperatur -70o
C selama tiga siklus freeze dan thaw (Food and
Drug Administration, 2001).
b. Stabilitas temperatur jangka pendek
Pengujian dilakukan dengan menggunakan tiga konsentrasi sampel uji
(konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada
temperatur kamar selama 4 sampai 24 jam (Food and Drug Administration, 2001).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
18
Universitas Indonesia
c. Stabilitas jangka panjang
Pada stabilitas jangka panjang, pengujian dilakukan dengan menggunakan
tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma.
Pengujian dilakukan pada waktu mulai sampel dikumpulkan sampai tanggal
terakhir sampel dianalisis, misalnya selama 0, 20, 60, dan 90 hari. Selama periode
uji stabilitas, larutan uji disimpan pada lemari pendingin (-20oC). Konsentrasi
analit diukur setelah rentang waktu penyimpanan tersebut (Food and Drug
Administration, 2001).
d. Stabilitas larutan stok
Uji stabilitas larutan stok dilakukan dengan pengujian menggunakan larutan
stok obat dan baku selama 6 jam pertama pada temperatur kamar dan untuk hari
ke 20 pada penyimpanan di lemari pendingin (Food and Drug Administration,
2001).
e. Stabilitas post-preparative
Stabilitas post-preparative yaitu stabilitas selama analit berada pada
autosampler (Food and Drug Administration, 2001).
2.5 Metode Analisis Asam Valproat
Terdapat beberapa studi yang berkaitan dengan metode analisis asam
valproat dalam serum atau plasma yang sudah dipublikasikan, diantaranya yaitu :
a. Penetapan Kadar Asam Valproat dalam Plasma Manusia dengan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Detektor Fluoresensi (Rompotis,
Parissi-Poulou, Gikas, Kazanis, Vavayannis, & Panderi, 2002).
Preparasi sampel :
Dimasukkan 25 μL plasma manusia, 100 μL larutan asam valproat dengan
konsentrasi tertentu, dan 100 μL larutan asam sikloheksankarboksilat (baku
dalam), ditambahkan 275 μL asetonitril untuk mengendapkan protein.
Dikocok dengan vorteks selama 30 detik kemudian disentrifugasi pada 2890
g selama 5 menit. Diambil 50 μl supernatant kemudian direaksikan dengan
50 μL N-(4-Bromometil-7-hidroksi-2-okso-2H-6-kromenil)bromoasetamida
(senyawa penderivat), ditambahkan aseton sampai volume tepat 1 mL.
Diambil 100 μL larutan hasil derivatisasi, diencerkan dengan 100 μL fase
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
19
Universitas Indonesia
gerak. Disuntikkan 20 μL hasil pengenceran ke sistem kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT).
Kondisi Analisis :
Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan kolom
LiChrospher RP 18 (125 x 4,6 mm) ukuran partikel 5 μm (Merck, Germany)
dengan kolom pelindung BDS C-18 (10 x 4,6 mm) ukuran partikel 5 μm
pada kondisi isokratik. Fase gerak asetonitril-air (60:40) dengan laju alir 1,0
mL/menit. Detektor yang digunakan adalah detector fluoresensi dengan
λeksitasi = 345 nm dan λemisi = 435 nm.
Hasil :
Limit deteksi asam valproat dalam plasma sebesar 0,13 μg/mL. Nilai
perolehan kembali rata-rata sebesar 100,4 % dan akurasi metode sebesar -
0,5%-1,3% pada rentang konsentrasi 6,0-150,0 μg/mL.
b. N-(1-naftil)etilendiamin, Senyawa Penderivat UV untuk Penetapan Kadar
Asam Valproat dalam Plasma Manusia (Kamalinia, Rouini, Ghaeli, &
Amini, 2009).
Preparasi Sampel :
Dimasukkan 1 mL plasma yang sudah di-spike asam valproat konsentrasi
tertentu, 1 mL asam sikloheksanpropionat (baku dalam), 1 mL NaCl jenuh,
dan 1 mL asam fosfat ke dalam tube uji, dicampur selama 1 menit.
Ditambahkan 6 mL diklormetan, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm,
kemudian diambil lapisan organiknya. Ditambahkan Na2SO4 ke dalam
lapisan organik, kemudian dialiri dengan gas N2. Diambil residu yang
terbentuk, kemudian ditambahkan 200 μL asetonitril, 200 μL N-(1-
naftil)etilendiamin, 100 μL N-hidroksisuksinimid, dan 100 μL
disikloheksilkarbodiimida. Campuran kemudian dipanaskan pada suhu
85oC selama 1 jam. Setelah didinginkan, diambil 25 μL campuran, lalu
suntikkan ke sistem KCKT.
Kondisi Analisis :
Sistem KCKT yang terdiri dari injektor Rheodyne 20 μl dan detektor UV
486. Kolom yang digunakan adalah kolom Tecknokroma C18 (250 x 4,6
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
20
Universitas Indonesia
mm) ukuran partikel 5 μm. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril-air
(75:25) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit.
Hasil :
Kurva kalibrasi linier pada rentang 0,1-100 μg/mL. Batas deteksi sebesar 10
ng/mL dan batas kuantisasi sebesar 0,1 μg/mL.
c. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi untuk Analisis Asam Valproat
dan Obat Antiepilepsi Lain dalam Serum atau Plasma Manusia (Lucarelli,
Villa, Lombaradi, Prandini, & Brega, 1992)
Preparasi Sampel :
Dimasukkan 200 μL serum atau plasma yang mengandung asam valproat ke
dalam microtube, ditambahkan 200 μL asam nonanoat (baku dalam), 100
μL larutan penderivat (campuran 4-bromofenasil bromida dan
disikloheksan-18-crown-6, masing-masing dengan konsentrasi 20 μg/mL
dan 0,5 μg/mL), dan 25 μL dapar fosfat pH 7,0. Campuran dikocok dengan
vorteks, kemudian disentrifus 1000 g selama 10 menit. Diambil 200 μL
supernatan kemudian dipanaskan pada suhu 70 oC selama 15 menit. Setelah
didinginkan, diambil 40 μL aliquot untuk dianalisis menggunakan
kromatografi cair kinerja tinggi.
Kondisi Analisis :
Sistem KCKT Perkin Elmer 410 Series yang dilengkapi detektor LC 90 UV.
Kolom yang digunakan adalah kolom Pecosphere C18 (300 x 4,6 mm)
ukuran partikel 3 μm. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril-dapar
fosfat (70:30) dengan kecepatan alir 2,0 mL/menit.
Hasil :
Kurva kalibrasi linier pada rentang 12,5-100 μg/mL. Batas deteksi sebesar 3
ng/mL.
d. Metode Kromatografi Gas Cair Untuk Penetapan Kadar Asam Valproat
dalam Cairan Biologis (Jensen & Gugler, 1977)
Preparasi Sampel :
Masukkan 1 mL plasma dan 1 mL larutan baku dalam (40 μg/mL) ke dalam
tabung sentrifugasi. Larutan kemudian diasamkan dengan 1 mL HCl 0,5 N.
Campuran ini kemudian diekstraksi dengan pelarut organik (heksan –
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
21
Universitas Indonesia
kloroform, 1:1), lalu dikocok dengan vorteks selama 4 menit. Diambil 3,5
mL lapisan organik, dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi lain.
Ditambahkan 2 mL larutan NaOH 0,5 N, lalu dikocok dengan vorteks dan
sentrifus, kemudian diambil 1,5 mL lapisan air. Masukkan lapisan air ke
dalam tabung sentrifus lain, lalu tambahkan 1 mL larutan HCl 3N dan 50 μl
kloroform. Tabung sentrifugasi lalu dikocok dengan vorteks selama 30 detik
dan disentrifus selama 2 menit. Ambil 1 μl lapisan organik kemudian
disuntikkan ke instrumen kromatografi gas.
Kondisi Analisis :
Kromatografi gas dual kolom Hewlett-Packard Model 5736 A dengan
detektor ionisasi nyala. Suhu injektor dan detektor diatur pada suhu 250 oC,
sementara suhu kolom diatur pada suhu 170 oC, laju alir gas pembawa
(nitrogen) diatur sebesar 30 mL/menit.
Hasil :
Kurva kalibrasi linier pada rentang 0,5-150 μg/mL dalam plasma.
e. Metode Kromatografi Gas yang Mudah dan Cepat untuk Kuantitasi Asam
Valproat Bebas dan Kadar Asam Valproat Total dalam Serum Manusia
(Bigdeli, Falahat-Pisheh, & Neyestani, 2006)
Preparasi Sampel :
Masukkan 200 μL plasma dan 200 μL HCl 0,1 N, lalu dikocok dengan
vorteks, kemudian ditambahkan 400 μL campuran kloroform:metanol (1:1)
yanag sudah mengandung larutan baku dalam dengan konsentrasi 186
μg/mL. Larutan dihomogenkan kemudian disentrifus dengan kecepatan
3000 g selama 10 menit pada suhu kamar. Diambil 1,0 μL dari lapisan
terbawah kemudian disuntikkan ke kromatografi gas.
Kondisi Analisis :
Kromatografi gas Younglin Model M600 D dengan kolom Teknokroam
TRB-1 dan detektor ionisasi nyala. Suhu injektor 200oC dan suhu detektor
290oC. Elusi dilakukan dengan program temperatur mulai dari suhu 80
oC
hingga 100oC dengan kenaikan suhu 10
oC/menit, ditahan selama 1 menit,
kemudian dinaikkan hingga suhu 106oC dengan kenaikan suhu 5
oC/menit.
Laju alir gas pembawa (helium) diatur sebesar 20 mL/menit.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
22
Universitas Indonesia
Hasil :
Metode ini linier pada rentang 2,5-6400 μg/mL dengan % perolehan
kembali sebesar 92%. Presisi intra-assay dan inter-assay pada rentang 25-
100 μg/mL memberikan nilai koefisien variasi sebesar 1,49 dan 2,61.
f. Metode Kromatografi Gas Kapiler-Spektrometri Massa dalam Monitoring
Kadar Asam Valproat dan Tujuh Metabolitnya dalam Serum Manusia
(Darius & Meyer, 1994).
Preparasi Sampel :
Dimasukkan 100 μL plasma ke dalam microtube Effendorf, lalu
ditambahkan 50 μL dapar fosfat 1 M, 100 μL larutan asam 2-etil-2-
metilkaproat, dan 1 mL etil asetat, kemudian dikocok dengan vorteks.
Setelah pengocokan, campuran kemudian disentrifus selama 5 menit dengan
kecepatan 500 g. Diambil lapisan organik, kemudian dialiri dengan gas N2
hingga kering. Setelah itu, ditambahkan kembali 1 mL etil asetat dan 10 μL
asetonitril. Fase etil asetat kemudian dipekatkan hingga 20 μL. Fase etil
asett yang sudah dipekatkan selanjutnya ditambahkan 40 μL N-trimetilsilil-
N-metil-trifluorasetamida (senyawa penderivat) lalu dikocok dengan
vorteks. Larutan yang sudah dikocok dengan vorteks kemudian dipindahkan
ke dalam vial lalu dipanaskan selama 1 jam pada suhu 70oC.
Kondisi Analisis :
Kromatografi gas-spektrometri massa Hewlett- Packard dengan kolom non
polar kapiler HP1. Suhu injektor 250oC dan suhu detektor 250
oC. Elusi
dilakukan dengan program temperatur mulai dari suhu 90oC hingga 150
oC
dengan kenaikan suhu 5oC/menit, ditahan selama 1 menit, kemudian
dinaikkan hingga suhu 250oC dengan kenaikan suhu 40
oC/menit. Tekanan
gas pembawa yang digunakan (helium) diatur sebesar 75 kPa.
Hasil :
Metode ini memiliki limit deteksi 100 ng/mL. Presisi intra-assay pada
konsentrasi 18, 36, dan 72 μg/mL memberikan nilai koefisien variasi
sebesar 5,5; 3,2; dan 1,4 %.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
23 Universitas Indonesia
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumen,
Departemen Famasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Indonesia.
3.2 Bahan
Natrium divalproat (Katwijk Chemie bv), metanol p.a (Merck), kloroform
p.a (Merck), n-heksan p.a (Merck), dietil eter p.a (Merck), HCl (Merck), aquadest,
plasma darah (Palang Merah Indonesia).
3.3 Alat
Kromatografi Gas Shimadzu model GC 17A yang dilengkapi dengan
detektor ionisasi nyala (FID), kolom kapiler CBP-10 dengan panjang 50 meter
dan diameter dalam 0,25 mm, pemroses data Class GC Solution, dan integrator
CBM 102; microsyringe 5 μL (Hamilton Co, Nevada); sentrifugator (TGL-16);
mikropipet 100 dan 1000 μL (Soccorex); alat vorteks; microtube; blue tip; yellow
tip; lemari pendingin; timbangan analitik; alat-alat gelas yang umum digunakan
dalam analisis kuantitatif.
3.4 Cara Kerja
3.4.1 Penyiapan Bahan Percobaan
3.4.1.1 Pembuatan Larutan Induk Natrium Divalproat dan Larutan Uji
Natrium divalproat ditimbang 100,0 mg secara seksama, dimasukkan ke
dalam labu ukur 10,0 mL dan dilarutkan dengan metanol, ditambahkan hingga
batas, sehingga diperoleh larutan natrium divalproat dengan konsentrasi 10
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
24
Universitas Indonesia
mg/mL (10.000 μg/mL = 10.000 ppm). Pengenceran dengan aquadest dilakukan
untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi tertentu.
3.4.1.2 Pembuatan Larutan HCl 0,1 N
Larutan HCl pekat diambil sebanyak 10,0 mL dengan menggunakan pipet
volume, kemudian diencerkan dengan aquadest hingga diperoleh volume akhir
120,0 mL dengan konsentrasi 1 N. Diambil 60,0 mL larutan HCl 1 N, kemudian
diencerkan dengan aquadest hingga diperoleh volume akhir 600,0 mL dengan
konsentrasi 0,1 N.
3.4.2 Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis Asam Valproat dengan
Kromatografi Gas
Untuk mencari kondisi analisis optimum, dibuat larutan induk natrium
divalproat 100 ppm. Dipipet 1,0 mL larutan induk natrium divalproat 10.000 ppm,
dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan dicukupkan volumenya dengan
aquadest. Diperoleh larutan natrium divalproat 1000 ppm. Dipipet 1,0 mL larutan
baku natrium divalproat 1000 ppm, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan
dicukupkan volumenya dengan aquadest. Diperoleh larutan natrium divalproat
100 ppm. Sebanyak 1,0 μL larutan natrium divalproat 100 ppm disuntikkan pada
kromatografi gas.
3.4.2.1 Pemilihan Laju Alir Gas Pembawa untuk Analisis Asam Valproat secara
Kromatografi Gas
Larutan natrium divalproat konsentrasi 100 ppm disuntikkan sebanyak 1,0
μL pada alat KG dengan kondisi awal laju alir 2,0 mL/menit. Kemudian dilakukan
modifikasi laju alir menjadi 1,0 dan 1,5 mL/menit. Suhu injektor dan detektor
yang digunakan adalah 250°C. Elusi dilakukan dengan suhu kolom terprogram
80°C sampai 100oC dengan kenaikan suhu 5
oC per menit. Setelah itu, suhu kolom
ditahan selama 1 menit lalu dinaikkan sampai 150oC dengan kenaikan suhu 2
oC
per menit. Diperoleh waktu retensi, lalu dihitung faktor ikutan, jumlah pelat
teoritis dan HETP.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
25
Universitas Indonesia
3.4.2.2 Pemilihan Suhu Awal Kolom untuk Analisis Asam Valproat secara
Kromatografi Gas
Larutan natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm disuntikkan
sebanyak 1,0 μL pada alat KG dengan kondisi laju alir terpilih. Suhu injektor dan
detektor yang digunakan adalah 250°C. Suhu awal kolom divariasikan menjadi
70°C, 80°C, dan 90°C. Elusi dilakukan dengan suhu kolom terprogram dari suhu
awal sampai 100oC dengan kenaikan suhu 5
oC per menit. Setelah itu, suhu kolom
ditahan selama 1 menit lalu dinaikkan sampai 150oC dengan kenaikan suhu 2
oC
per menit. Diperoleh waktu retensi, lalu dihitung faktor ikutan, jumlah plat teoritis
dan HETP.
3.4.2.3 Pemilihan Pelarut Organik untuk Ekstraksi Asam Valproat dalam Plasma
Ke dalam microtube, dimasukkan 200 μL larutan HCl 0,1 N dan 200 μL
plasma yang mengandung natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm.
Setelah itu microtube ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30 detik hingga
homogen. Kemudian ditambahkan 400 μL pelarut organik ke dalam masing-
masing microtube. Digunakan empat macam pelarut organik dengan polaritas
yang berbeda yaitu metanol, kloroform, dietil eter, dan heksan. Setelah itu
microtube ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30 detik hingga homogen, lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Sebanyak1,0 μL
lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas. Untuk lapisan
organik kloroform, lapisan organik harus diuapkan terlebih dahulu hingga kering
dengan dialiri gas N2, Setelah dingin, residunya dilarutkan dengan 100 μL
metanol. Sebanyak 1,0 μL lapisan metanol kemudian disuntikkan ke dalam
kromatografi gas. Kemudian dihitung luas area asam valproat yang diekstrak dari
masing-masing pelarut organik.
3.4.2.4 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma
Ke dalam microtube, dimasukkan 200 μL larutan HCl 0,1 N dan 200 μL
plasma yang mengandung natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm.
Setelah itu microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen.
Kemudian ditambahkan 400 μL pelarut organik terpilih. Setelah itu microtube
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
26
Universitas Indonesia
ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30, 45, 60, dan 120 detik hingga
homogen, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.
Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas.
Kemudian dihitung luas area dari masing-masing waktu vorteks.
3.4.2.5 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Analisis Asam Valproat dalam
Plasma
Ke dalam microtube, dimasukkan 200 μL larutan HCl 0,1 N dan 200 μL
plasma yang mengandung asam valproat dengan konsentrasi 100 ppm. Setelah itu
microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen. Kemudian
ditambahkan 400 μL larutan organik terpilih. Setelah itu microtube ditutup,
dikocok dengan vorteks selama waktu terpilih hingga homogen, lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Sebanyak 1,0 μL
lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas. Kemudian dihitung
luas area dari masing-masing waktu sentrifugasi.
3.4.2.6 Uji Kesesuaian Sistem
Larutan standar natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm
disuntikkan sebanyak 1,0 μL pada alat KG dengan kondisi laju alir dan suhu awal
kolom terpilih. Waktu retensi dicatat, lalu dihitung jumlah pelat teoritis, HETP,
faktor ikutan, dan presisi pada enam kali penyuntikan.
3.4.3 Validasi Metode Analisis Asam Valproat dalam Plasma
3.4.3.1 Penyiapan Sampel Natrium Divalproat dalam Plasma
Ke dalam microtube, dimasukkan 200 μL larutan HCl 0,1 N dan 200 μL
plasma yang mengandung natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm.
Setelah itu microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen.
Kemudian ditambahkan 400 μL dietil eter. Setelah itu microtube ditutup, dikocok
dengan vorteks selama 2 menit hingga homogen, lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil
lalu disuntikkan ke kromatografi gas.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
27
Universitas Indonesia
3.4.3.2 Pengukuran LLOQ
Larutan natrium divalproat dalam plasma disiapkan dengan konsentrasi
30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL, kemudian diekstraksi
seperti cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil lalu
disuntikkan ke kromatografi gas pada kondisi terpilih. Kemudian dicari
konsentrasi natrium divalproat terendah dalam plasma yang masih dapat dideteksi
oleh instrumen. Kemudian dihitung persentase akurasi (% diff) dan koefisien
variasi (KV) dari konsentrasi tersebut.
3.4.3.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Plasma In Vitro
Sampel blanko serta larutan natrium divalproat dalam plasma dengan
konsentrasi 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL disiapkan,
kemudian diekstraksi seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL
lapisan organik dari masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat
kromatografi gas pada kondisi terpilih.
3.4.3.4 Uji Akurasi
Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi rendah (40,0
μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL) disiapkan, lalu diekstraksi
seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari
masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat kromatografi gas pada kondisi
terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Akurasi
dihitung sebagai perbedaan nilai terukur dengan nilai yang sebenarnya (% diff)
3.4.3.4 Uji Presisi
Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi rendah (40,0
μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL) disiapkan, lalu diekstraksi
seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari
masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat kromatografi gas pada kondisi
terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Presisi
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
28
Universitas Indonesia
dihitung sebagai nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi dari masing-
masing konsentrasi.
3.4.3.5 Uji Perolehan Kembali (% recovery)
Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi rendah (40,0
μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL) disiapkan, lalu diekstraksi
seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari
masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat kromatografi gas pada kondisi
terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Dihitung %
perolehan kembali relatif.
3.4.3.6 Uji Selektivitas Metode Analisis dalam Plasma
Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi LLOQ (40,0
μg/mL) disiapkan, setelah itu diekstraksi seperti pada penyiapan sampel.
Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari masing-masing larutan tersebut disuntikkan
ke alat kromatografi gas pada kondisi terpilih. Diuji terhadap plasma yang berasal
dari enam sumber yang berbeda. Dihitung nilai akurasinya (% diff).
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
29 Universitas Indonesia
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis Asam Valproat dengan
Kromatografi Gas
4.1.1 Pemilihan Laju Alir Gas Pembawa untuk Analisis Asam Valproat dengan
Kromatografi Gas
Kondisi analisis optimum untuk penetapan kadar asam valproat dalam
plasma adalah dengan laju alir gas pembawa 1,0 ml/menit. Suhu injektor dan
detektor diatur pada suhu 250ºC. Berdasarkan literatur, laju alir gas pembawa
yang digunakan sebesar 20 ml/menit. Namun, dalam penelitian ini digunakan
variasi laju alir gas pembawa, yaitu 1,0 ml/menit, 1,5 ml/menit, dan 2,0 ml/menit.
Pertimbangan variasi laju alir gas pembawa adalah diameter kolom yang
digunakan. Penelitian ini menggunakan kolom kapiler yang memiliki diameter
kecil sehingga laju alir yang digunakan memiliki rentang antara 0,2– 2 ml/menit.
Untuk semua elusi, suhu injektor dan detektor diatur pada suhu 250ºC.
Pertimbangan penetapan suhu injektor adalah suhu injektor harus diatur lebih
tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan menguap segera
setelah sampel disuntikkan sedangkan pertimbangan suhu detektor adalah
biasanya suhu detektor 15º–30ºC lebih tinggi dari titik didih senyawa yang
dianalisis. Selain itu, suhu detektor disesuaikan dengan detektor yang digunakan.
Untuk detektor ionisasi nyala, suhu detektor harus di atas 100ºC. Hal ini bertujuan
untuk mencegah terjadinya kondensasi uap air sehingga mengakibatkan
pengkaratan pada detektor ionisasi nyala atau penghilangan (penurunan)
sensitivitasnya (Gandjar & Rohman, 2007).
Kondisi optimum terpilih adalah yang memberikan nilai lempeng teoritis
(N) besar, ukuran efisiensi kolom (HETP) kecil, faktor ikutan (Tf) yang mendekati
satu, waktu retensi yang tidak terlalu lama, serta pada kromatogram plasma
blanko tidak ada puncak yang mengganggu pada waktu retensi asam valproat.
Pada laju alir 1,0 ml/menit diperoleh waktu retensi 24,1 menit dengan nilai N rata-
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
30
Universitas Indonesia
rata 13442,8; HETP rata-rata 0,0372 dan Tf masing-masing 1,055; 1,263; dan
0,857. Kemudian pada laju alir 1,5 ml/menit diperoleh waktu retensi 20,9 menit
dengan nilai N rata-rata 105481,4; HETP rata-rata 0,0474 dan Tf masing-masing
0,952; 1,509; dan 1,977. Selanjutnya, pada laju alir 2,0 ml/menit diperoleh waktu
retensi 18,9 menit dengan nilai N rata-rata 13442,8; HETP rata-rata 0,0372 dan Tf
masing-masing 1,055; 1,263; dan 0,857. Dari ketiga kondisi tersebut, dipilih laju
alir sebesar 1,0 ml/ menit karena memberikan nilai N terbesar dan HETP terkecil.
Data dan gambar selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.1, Gambar 4.2, Gambar
4.3, dan Gambar 4.4.
4.1.2 Pemilihan Suhu Awal Kolom untuk Analisis Asam Valproat secara
Kromatografi Gas.
Kondisi analisis optimum untuk penetapan kadar asam valproat dalam
plasma adalah dengan laju alir gas pembawa 1,0 ml/menit. Suhu injektor dan
detektor diatur pada suhu 250ºC. Elusi dilakukan pada suhu awal kolom 70oC
dengan kenaikan suhu 5oC per menit sampai suhu 100
oC dan ditahan selama 1
menit. Setelah itu suhu dinaikkan sampai 150 o
C dengan kenaikan suhu 2oC per
menit.
Berdasarkan literatur, suhu awal kolom yang digunakan adalah 80ºC.
Dalam penelitian ini, suhu awal kolom divariasikan menjadi 70ºC, 80ºC, dan
90ºC. Berdasarkan data pada tabel 4.2 dapat dilihat bahwa suhu awal kolom 70ºC
diperoleh nilai N terbesar dan HETP terkecil dibanding kedua kondisi lainnya.
Oleh karena itu, dapat disimpulkan kondisi analisis terpilih untuk analisis asam
valproat dalam plasma adalah elusi dengan suhu terprogram dimulai dari suhu
70ºC dengan kenaikan suhu 5ºC/menit sampai 100ºC, kemudian ditahan selama 1
menit. Setelah itu suhu dinaikkan sampai 150ºC dengan kenaikan 2ºC/menit. Data
dan gambar selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.2, Gambar 4.2, Gambar 4.5,
dan Gambar 4.6.
4.1.3 Pemilihan Pelarut Organik untuk Ekstraksi Asam Valproat dalam Plasma
Untuk memperoleh asam valproat dari plasma lebih optimal dicobakan
empat jenis pelarut organik pada saat ekstraksi, yaitu metanol, kloroform, dietil
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
31
Universitas Indonesia
eter, dan heksan. Pada saat ekstraksi dengan menggunakan metanol dan kloroform
ternyata asam valproat tidak dapat terekstraksi ke dalam pelarut organik tersebut.
Pada saat ekstraksi dengan menggunakan dietil eter, luas area rata-rata yang
diperoleh sebesar 20636,1. Pada saat ekstraksi dengan menggunakan heksan, luas
area rata-rata yang diperoleh sebesar 9704,2.
Sampel natrium divalproat dalam plasma sebelum disuntikkan ke alat
kromatografi gas harus diekstraksi terlebih dahulu untuk membebaskan ikatannya
dengan protein. Untuk memperoleh metode ekstraksi yang paling optimal,
dicobakan metode pengendapan protein menggunakan metanol dan metode
ekstraksi cair-cair dengan pelarut koroform, heksan, dan dietil eter. Setelah
dianalisis dengan menggunakan kromatografi gas, ternyata metanol dan kloroform
tidak dapat digunakan untuk ekstraksi natrium divalproat dalam plasma, yang
dapat digunakan adalah heksan dan dietil eter. Kemudian dari kedua pelarut
tersebut dibandingkan luas area yang terbentuk pada kromatogram. Karena luas
area natrium divalproat yang diekstraksi dengan dietil eter lebih besar dari luas
area yang diekstraksi dengan heksan, maka dalam penelitian ini, metode yang
akan digunakan untuk mengekstraksi natrium divalproat dalam plasma adalah
ekstraksi cair-cair dengan dietil eter. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel
4.3. Kromatogram dari masing-masing larutan pengekstraksi dapat dilihat pada
Gambar 4.7, Gambar 4.8, Gambar 4.9, dan Gambar 4.10.
4.1.4 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma
Untuk memperoleh natrium divalproat dari plasma lebih optimal dicobakan
empat kondisi waktu vorteks yaitu selama 30, 45, 60, dan 120 detik. Pada waktu
vorteks selama 30 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 8059,8. Pada waktu
vorteks selama 45 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 20809,0. Pada waktu
vorteks selama 60 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 15924,7. Pada waktu
vorteks selama 120 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 24472,6. Dari hasil
percobaan dipilih waktu vorteks selama 120 detik karena pada kondisi ini
diperoleh nilai luas area rata-rata paling besar. Data luas area rata-rata dari
natrium divalproat pada berbagai kondisi waktu vorteks dapat dilihat pada Tabel
4.4 dan Gambar 4.11
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
32
Universitas Indonesia
4.1.5 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma
Untuk memperoleh asam valproat dari plasma secara optimal dicobakan
empat kondisi waktu sentrifugasi yaitu selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Pada
sentrifugasi selama 5 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar 8492,2. Pada
sentrifugasi selama 10 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar 14692,2.
Pada sentrifugasi selama 15 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar
25326,9. Pada sentrifugasi selama 20 menit diperoleh nilai luas area rata-rata
sebesar 14692,2. Dari hasil percobaan dipilih waktu sentrifugasi selama 15 menit
karena pada kondisi ini diperoleh nilai luas area rata-rata paling besar. Data luas
area rata-rata dari asam valproat pada berbagai kondisi waktu sentrifugasi dapat
dilihat pada Tabel 4.5 dan Gambar 4.12.
4.2 Validasi Metode Analisis Asam Valproat dalam Plasma In Vitro
4.2.1 Pengukuran LLOQ
Berdasarkan literatur, diperoleh rentang konsentrasi natrium divalproat
dalam plasma adalah 40,0-90,0 μg/mL (Winter, et al., 2007). Oleh karena itu,
dibuat kurva kalibrasi untuk menentukan LLOQ dengan rentang konsentrasi 30,0;
40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL. Karena pada konsentrasi 30,0
μg/mL instrumen sudah tidak memberikan respons, maka konsentrasi 40,0 μg/mL
ditetapkan sebagai konsentrasi LLOQ, yaitu konsentrasi terendah analit dalam
sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif dan masih memenuhi syarat
akurasi dan presisi, dimana nilai % diff pada lima kali penyuntikan tidak lebih dari
±20% (Food and Drug Administration, 2001). Setelah dicoba lima kali
penyuntikan, didapatkan hasil nilai % diff tidak ada yang menyimpang lebih dari
+20% atau kurang dari -20%, maka ditetapkan nilai LLOQ adalah sebesar 40,0
μg/mL. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.8.
4.2.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Valproat dalam Plasma
Setelah diperoleh nilai LLOQ, dibuat kurva kalibrasi dan uji linearitas
dengan menghitung koefisien korelasi dari kurva kalibrasi, dengan rentang
konsentrasi lebih kurang 40,0-100,0 μg/mL, di mana nilai LLOQ harus menjadi
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
33
Universitas Indonesia
konsentrasi terendah dari kurva kalibrasi. Pada pembuatan kurva kalibrasi
disuntikkan plasma blanko (plasma tanpa penambahan natrium divalproat) dan
tujuh larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi 40,0; 50,0;
60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan100,0 μg/mL.
Dari hasil analisis diperoleh persamaan regresi linear y = 459,7 x -18964
dengan koefisien korelasi r = 0,9894, di mana kriteria linearitas untuk sediaan
dalam matriks biologis adalah r = 0,98 (Alizadeh, Mohammadi, & Shahdousti,
2007). Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis natrium divalproat dalam
plasma dengan rentang konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL memenuhi kriteria uji
linearitas. Data dan gambar kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma dapat
dilihat pada Tabel 4.7 dan Gambar 4.13.
4.2.3 Uji Selektivitas
Pada uji selektivitas, dilakukan analisis terhadap enam plasma dari sumber
yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu 40,0 μg/mL. Dari hasil analisis, yang
diperoleh, dihitung nilai KV kurang dari 20% , yaitu 11,57% dan % diff tidak
menyimpang lebih dari +20% atau kurang dari -20%, yaitu dalam kisaran 9,53%
sampai 13,79%, serta tidak ada puncak pengganggu pada waktu retensi asam
valproat. Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan adalah
selektif. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.9.
4.2.4 Uji Akurasi
Pada uji akurasi, dilakukan analisis terhadap tiga rentang konsentrasi yang
disebut sebagai Quality control sample (QC), yaitu konsentrasi rendah (40,0
μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL). Uji yang dilakukan
adalah hanya mencakup uji intra-day karena keterbatasan waktu. Hasil dari uji
akurasi adalah konsentrasi rendah (40,0 μg/mL) memberikan nilai % diff 8,06
sampai 12,33%, konsentrasi sedang (60,0 μg/mL) memberikan nilai % diff -11,63
sampai -9,95%, dan konsentrasi tinggi (80,0 μg/mL) memberikan nilai % diff -
13,67 sampai 9,41%. Nilai % diff yang diperoleh tidak menyimpang kurang dari -
15% atau lebih dari +15% untuk masing-masing konsentrasi.
Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010
-
34
Universitas Indonesia
Dari hasil pengujian akurasi yang telah dilakukan untuk analisis asam
valproat dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan. Data hasil
uji akurasi asam valproat dalam plasma dapat dilihat pada Tabel 4.10.
4.2.5 Uji Presisi
Pada uji presisi asam valproat dalam plasma, konsentrasi rendah (40,0
μg/mL) memberikan nilai koefisien variasi (KV) 10,49 %, konsentrasi sedang
(60,0 μg/mL) memberikan nilai KV 13,92 %, konsentrasi tinggi (80,0 μg/mL)
memberikan nilai KV 9,33 %, pada. Dari hasil percobaan uji presisi yang telah
dilakukan untuk analisis natrium divalproat dalam plasma sudah memenuhi
kriteria yang dipersyaratkan karena diperoleh nilai KV kurang dari 15% untuk
masing-masing konsentrasi. Data hasil uji presisi asam valproat dalam plasma
dapat dilihat pada Tabel 4.11.
4.2.6 Uji Perolehan Kembali (% recovery)
Pada penelitian ini dilakukan uji perolehan kembali relative (% relative
recovery). Berdasarkan perhitungan dari hasil penelitian, diperoleh % recovery
sebesar 108,06 sampai 112,32% untuk konsentrasi rendah, 81,91 sampai 103,17%
untuk konsentrasi sedang, dan 86,97 sampai 101,65% untuk konsentrasi tinggi.
Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh nilai persen perolehan kembali seluruhnya
berada dalam rentang yang dipersyaratkan, yaitu sebesar 80-120%. Data hasil uji
perolehan kembali dapat dilihat pada Tabel 4.11.
Berdasarkan jurnal yang menjadi acuan penulis dalam mengembangkan
metode analisis, rentang kalibrasi linier diperoleh pada konsentrasi 2,5-6400
μg/mL (Bigdeli, Falahat-Pisheh, & Neyestani, 2007). Berdasarkan hasil penelitian
yang dilakukan penulis, dapat dilihat bahwa validasi metode yang dilakukan
memberikan rentang kalibrasi yang linier pada konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL dan
nilai LLOQ yang diperoleh sebesar 40,0 μg/mL. Rentang kalibrasi linier yang
diperoleh dari jurnal acuan emang lebih sensitif dibanding metode ekstraksi cair-
cair yang dikembangkan oleh penulis, namun metode yang dikembangkan oleh
penulis ini masih valid untuk digunakan karena rentang asam valproat d