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UNIVERSITAT DE VALÈNCIA

MÁSTER INTERUNIVERSITARIO EN

INGENIERÍA AMBIENTAL

TRABAJO FIN DE MÁSTER

DIRECTORA: PILAR CAMPÍNS FALCÓ

KATERINE ELIZABETH PONCE OCHOA

VALENCIA – ESPAÑA

2012

ANÁLISIS DE SCREENING DE FTALATOS Y SUS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN EN AGUAS

2

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 3

1.1. CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE .................................................... 3

1.2. FTALATOS ................................................................................................................. 4

1.2.1. Características Generales ................................................................................... 4

1.2.2. Producción y Usos ............................................................................................... 6

1.2.3. Comportamiento en el medio ambiente ............................................................. 8

1.2.4. Métodos cromatográficos.................................................................................. 13

1.3. LEGISLACIÓN ......................................................................................................... 16

2. OBJETIVO ........................................................................................................................ 20

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 21

3.1. REACTIVOS Y DISOLUCIÓN ESTÁNDAR........................................................ 21

3.2. EQUIPAMIENTO Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ........................ 21

3.3. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA EN TUBO (IT – SPME) ................ 22

3.4. MUESTRAS REALES DE AGUA .......................................................................... 23

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 24

4.1. OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ....................... 24

4.2. PARÁMETROS ANALITICOS .............................................................................. 28

4.3. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES ............................................................... 31

5. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 34

6. REFERENCIAS ................................................................................................................ 35


3

1. INTRODUCCIÓN

1.1. CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE

La problemática socio – ambiental se deriva del actual modelo de desarrollo, cuando

hablamos de contaminación ambiental se hace referencia a la presencia en el

ambiente de cualquier agente, o combinación de agentes (físicos, químicos o

biológicos), en concentraciones que pueden resultar nocivos para la salud, el

bienestar de la población o perjudiciales para la vida vegetal o animal. En función del

medio afectado, la concentración puede tener diferente denominación;

contaminación hídrica (agua), contaminación atmosférica (aire) y contaminación del

suelo y sedimentos.

El agua es uno de los recursos más importantes con el que contamos, no está exenta

de problemas y su calidad puede verse fácilmente alterada. En España la

contaminación de las aguas subterráneas se debe principalmente a los vertidos

urbanos, de la industria o de la infiltración de fertilizantes depositados en el suelo,

procedentes de la agricultura intensiva y por las deyecciones del ganado. En la

actualidad la situación de los ríos españoles por contaminación orgánica es muy

diversa.

Una de las características del desarrollo económico de los países es la generación de

residuos, por tanto el volumen de éstos crece de manera exponencial con respecto al

grado de industrialización. Actualmente se tiene registro de unos cinco millones de

sustancias químicas, y se estima que cada año unas 1000 sustancias nuevas se

integran al registro.

A medida que las sociedades desarrolladas evolucionaban, tuvieron que enfrentarse

a problemas ambientales, sobre todo en función del uso del agua. Por tanto, en los

países desarrollados se han establecido estrategias y soluciones para revolver la

contaminación por altos niveles de metales pesados, uso intensivo de nutrientes

(principalmente nitratos y fosfatos) y contaminantes orgánicos, éstos últimos hasta

niveles de ultra-traza (< ng/L). Algunas de las herramientas utilizadas son el

tratamiento de efluentes industriales y municipales, desinfección de aguas,

limitación y sustitución de nitratos y fosfatos en productos de uso masivo, los

desarrollos en ingeniería para el tratamiento de agua, química analítica,

ecotoxicología, y una transferencia tecnológica cada vez más rápida de los centros de


4

investigación a la industria. Todas estas herramientas, sin embargo, no están

disponibles muy a menudo en los países en vías de desarrollo.

Se denominan contaminantes emergentes a contaminantes que vienen siendo

detectados en las aguas desde hace poco tiempo (fundamentalmente porque no

existían técnicas analíticas que los detectaran, o simplemente porque no se les había

prestado atención antes) y que a menudo no cuentan con una regulación específica.

Sin embargo, suelen ser candidatos a ser incluidos en normativas específicas,

dependiendo sobretodo de los resultados que la investigación aporte sobre sus

efectos nocivos sobre el medio ambiente (incluida la salud humana) y del monitoreo

de datos concerniente a su incidencia. Esto último es de especial importancia ya que

su presencia continuada en campañas de análisis medioambiental es indicadora de la

necesidad de regular su vertido y/o su utilización. Los compuestos que han surgido

recientemente, con una particular relevancia son los detergentes, productos

farmacéuticos, productos de higiene personal y aditivos de gasolinas. Estos grupos de

contaminantes tienen además la característica de que no necesitan ser muy

persistentes en el medio ambiente para causar un efecto negativo, ya que su alto

grado de transformación/eliminación es compensado por su constante ingreso en el

medio ambiente debido a su utilización masiva.

En este proyecto se va a incidir en los contaminantes denominados ftalatos y

particularmente en un producto de degradación del más abundante en el medio

ambiente el DEHP.

En el siguiente apartado se describe las características de los ftalatos y sus productos

y usos; comportamiento en el medio ambiente.

1.2. FTALATOS

1.2.1. Características Generales

Ftalato es el término genérico con el que se denomina a los esteres o diesteres

del ácido ftálico (acido 1,2 – bencenodicarboxilico). En la figura 1 se muestra la

estructura química del ácido ftálico, así como la estructura general de un ftalato.


5

Figura 1. Estructura del ácido ftálico

Su síntesis industrial consiste en la esterificación del ácido ftálico con el

correspondiente oxo alcohol en presencia de un ácido como catalizador. Se

trata de un grupo muy amplio de compuestos ya que hay una gran variedad de

alcoholes que pueden reaccionar con el ácido ftálico, para dar diferentes

ftalatos en los que solo variara la cadena carbonada (R). Sin embargo solo

alrededor de 60 tienen aplicaciones industriales, dentro de estos solo unos

pocos se producen a gran escala como el di (2 – etilhexil) ftalato (DEHP) es el de

mayor volumen de producción a nivel mundial.

En general los ftalatos son compuestos estables, en estado líquido a

temperatura ambiente, y con un ligero aroma. Presentan un rango muy amplio

de propiedades físico químicas en función de su peso molecular. En la tabla 1 se

indica algunos grupos característicos de los ftalatos.

NOMBRE ACRÓNIMO R1 Y R2

Ftalato de dimetilo DMP CH3

Ftalato de dietilo DEP CH2CH3

Ftalato de disobutilo DIBP CH2CH(CH3)2

Ftalato de dibutilo DBP (CH2)3CH3

Ftalato de bis(etoxietilo) DEEP (CH2)2OCH2CH3

Ftalato de di(2 – etilhexilo) DEHP CH2CH(CH2CH3)((CH2)3CH3)

Tabla 1. Grupos característicos de algunos ftalatos con aplicaciones industriales. (1)

En la tabla 2, se muestra la estructura y principales propiedades físico –

químicas de los cuatro ftalatos objeto de estudio en el presente trabajo y que

están incluidos en la lista de contaminantes prioritarios publicada por la EPA.


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Compuesto Nombre Estructura Ejemplo de usos

DEP Dietilftalato

Principalmente en PVC como plastificante; sigue presente en gomas de borrar, tintas, adhesivos y selladores, pinturas y fijadores.

DBP Dibutilftalato

Plásticos como el PVC, adhesivos, tintas de impresión, selladores, lechadas para la construcción, aditivos para perfumes, desodorantes, fijadores de pelo, esmalte de uñas e insecticidas.

DEHP Di(2-

etilhexil)ftalato

Perfumes, productos flexibles de PVC (cortinas de baño, mangueras de jardín, pañales, películas plásticas para envolver alimentos, bolsas para sangre, catéteres, guantes y otros utensilios médicos como tubos para fluidos, etc.).

MEHP monoetilhexilftalato

Perfumes, fijadores de pelo, adhesivos y colas, productos automotores, recubrimiento de vinilo para suelos.

Tabla 2. Estructura y propiedades físico químicas de los ftalatos objeto de estudio en el

presente trabajo. (2-4)

1.2.2. Producción y Usos

Los ftalatos de mayor peso molecular se pueden considerar poco solubles,

mientras que los de menor peso molecular son moderadamente solubles. (3). En

la tabla 3 se puede observar algunas características de los ftalatos.

Los ftalatos menos pesados, es decir, los de cadena carbonada más corta,

presentan presiones de vapor altas, por lo que, en estado puro son

relativamente volátiles. Sin embargo, sus valores de la constante de Henry son

bajos, lo que significa que el proceso de vaporización en disolución acuosa es

lento. Basándose en los valores para los compuestos de mayor peso molecular,

su vaporización desde el agua podría producirse de manera más rápida, pero

estos compuestos van a tener tendencia a fijarse en la materia sólida en

suspensión debido a su hidrofobicidad, por lo que su difusión de las aguas

naturales a la atmósfera es poco probable. (4)


7

Tabla 3. Caracteristicas de ftalatos según su peso molecular.

Los ftalatos son compuestos con diversos usos industriales, sintetizados a gran

escala. De hecho, se estima que la producción de ftalatos a nivel mundial en la

década de los 90 alcanzó los 4 millones de toneladas por año. (5) En cuanto a la

producción a nivel europeo, ésta se centra en los países del Este y puede llegar a

alcanzar el millón de toneladas al año.

La UE, según la Regulación del Consejo 793/93, (6) divide los productos químicos

en dos categorías, compuestos con alto volumen de producción (HVPC), los

cuales son producidos o importados en cantidades superiores a las 1000

toneladas por año, y compuestos con bajo volumen de producción (LVPC), que

se producen o importan en cantidades comprendidas entre 10 y 1000 toneladas

al año. La lista de HVPC incluye 22 ftalatos y 11 más se encuentran en la lista de

LVPC.

El ftalato más usado es el DEHP (representa alrededor del 50% del consumo

total europeo. En la figura 2 se indica los datos de consumo de los principales

ftalatos en la Unión Europea.


8

Figura 2. Consumo de principales ftalatos en la UE.

Los ftalatos de alto peso molecular, gracias a sus propiedades (alta solubilidad

en materiales poliméricos, estabilidad, fluidez y baja volatilidad), se emplean

como plastificantes no reactivos en la fabricación de distintos materiales,

aportándoles mayor flexibilidad y maleabilidad.

Su aplicación principal es en la producción del policloruro de vinilo (PVC),

aunque también se emplean en otros materiales como resinas epoxi, poliéster,

gomas sintéticas, naturales y cloradas, polisulfito, nitrocelulosa, etilcelulosa y

poliuretano. En estas aplicaciones la cantidad de ftalatos, puede llegar a

representar entre 5 y 60% del peso total del plástico o resina. El destino final de

estos materiales cubre un amplio espectro de productos, incluyendo juguetes,

ropa de lluvia, cortinas de ducha, envoltorios plásticos en productos

alimenticios. Alfombras, recubrimientos de paredes y suelos, zapatos, cableado,

material médico (bolsas de transfusión) automóviles y tapicerías.

Además de estas aplicaciones, los ftalatos también se usan en la producción de

lubricantes y cosméticos (fragancias, lacas, esmalte para uñas, desodorantes),

como aditivos en industrias textiles, como componentes de fluidos dieléctricos o

en la formulación de pesticidas. (7-8)

1.2.3. Comportamiento en el medio ambiente

La liberación de los ftalatos al medio natural puede ocurrir durante su

producción o durante la manufacturación de los materiales plásticos. (9-10)

Como no están químicamente unidos a la matriz polimérica de estos materiales,

también pueden llegar al medio ambiente por migración o volatilización desde

los productos finales durante su uso, o por lixiviación e incineración una vez que

estos productos son desechados. (9-10)


9

Debido a esta movilidad desde los productos comerciales, su gran volumen de

consumo y el amplio espectro de aplicaciones, los ftalatos se encuentran

distribuidos en los diferentes medios de la biosfera y se consideran

contaminantes ubicuos. (11-12)

Los ftalatos están presentes en el aire, tanto en fase vapor, como asociados a las

partículas atmosféricas, a un nivel de concentración bajo (ng/m3), aunque la

concentración en ambientes interiores puede llegar a ser hasta varios órdenes

de magnitud mayor (7). Muchos materiales de construcción contienen

cantidades importantes de ftalatos y la inhalación de estos compuestos puede

constituir una de las principales fuentes de exposición en humanos.

Por otra parte, la difusión a través del aire es el principal medio de distribución

de los ftalatos en el medioambiente, a pesar de sus bajas presiones de vapor. Su

detección en la superficie de nieve y en la capa de hielo, confirma que pueden

ser transportados a través de distintas largas sin sufrir degradación (13). Se

supone que la principal ruta de degradación en la atmosfera es la

fotodegradacion, y el tiempo de vida medio para la mayoría de los ftalatos es

inferior a un día.

La presencia de ftalatos en el medio acuático se debe a puntos de entrada, como

los efluentes de las plantas de tratamiento de agua residual, las industrias que

utilizan estos compuestos o los vertederos de desechos plásticos, todas fuentes

de origen antropogénico.

En la tabla 4 se recogen los niveles encontrados en aguas superficiales y

residuales para los cuatro ftalatos incluidos en este trabajo, publicados en

estudios recientes. (14-15)

Muestra DEP DBP DEHP MEHP AÑO Referencia

Agua de mar 0,03 – 398 1,0 – 1028 0,06 – 2307 2002 14

Agua de mar 1,4 – 1,8 1,3 – 1, 9 2,1 – 3,2 0,8 – 1,5 2001 16

Agua de rio 0,03 – 19,4 0,03 – 75,6 4,6 – 90,5 2002 14

Agua de rio 0,6 0,4 1,1 2001 16

Agua de manantial

0,04 0,02 2,88 nd 2002 17

Agua de escorrentías

2 - 33 1 - 23 3 - 460 nd 2003 18

Agua residual nd 2,2 3,8 3,4 2003 19

Agua residual 1,38 2002 20

Tabla 4. Concentraciones en (ng/mL) de los seis ftalatos estudiados encontrados en

distintas muestras de agua.


10

Las concentraciones encontradas son bastantes altas, en concreto, para DEHP y

para DBP.

Esto nos da una idea de la importancia de controlar los niveles de contaminantes

en las EDAR, ya que pueden convertirse en importantes fuentes de

contaminación de las aguas superficiales, así como, estudiar los fenómenos que

se producen durante la depuración.

Los ftalatos tienden a acumularse en los lodos de las plantas de tratamiento de

aguas residuales, por lo que estas son importantes para la degradación de estos

compuestos e impedir que lleguen al medio acuático. Las concentraciones

encontradas están entre 10 – 100 mg/kg peso seco, siendo el DEHP el ftalato

presente en mayor concentración.

El uso de los lodos de depuradora como fertilizantes agrícolas podría conducir a

la contaminación de los suelos y a una exposición directa o a través de la cadena

alimenticia de los seres humanos (21). En este sentido, la UE ha establecido

límites de concentración para algunos contaminantes orgánicos, incluyendo al

DEHP, para la mejora de la calidad de los lodos usados con fines agrícolas. (22)

La vida media por degradación aerobia, tanto en suelos como en aguas naturales

tiende a aumentar a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada

del compuesto. (13). Estimaron que en aguas naturales se encontraba entre

menos de 1 día y 2 semanas, y en sedimentos del orden de varios meses.

Existen varias publicaciones que confirman la presencia de ftalatos en biota,

incluyendo plantas, peces, ratas y vacas, que confirman la asimilación de los

compuestos disponibles en el medio por los organismos vivos; así como en

muestras biológicas humanas. Sin embargo los ftalatos se metabolizan

rápidamente a sus correspondientes alcoholes Mono ésteres y posteriormente,

mediante oxidación y conjugación, a otros metabolitos que se excretan a través

de la orina. (7-13)

En algunos estudios eco – toxicológicos, se ha demostrado que los mono ésteres

pueden ser tóxicos en mamíferos y su presencia, junto con otros productos de

degradación, como el ácido ftálico, se ha confirmado en distintas muestras de

agua, incluyendo agua de río y de escorrentía, por tanto, también deben ser


11

considerados a la hora de evaluar los riesgos ambientales de los ftalatos. En la

siguiente tabla se indica algunos ftalatos que se degradan a sus respectivos

mono esteres:

NOMBRE ABREVIATURA METABOLITO

PRINCIPAL UTILIDADES

Dietil ftalato DEP Mono-etilftalato Perfumes, colonias, champú,

lociones dermatológicas...

Dibutil ftalato DBP Mono-butilftalato Cosméticos, tintes,

insecticidas, plásticos adhesivos...

Benzilbutil ftalato

BzBP Mono-bencilftalato Cinturones, productos

adhesivos, productos del automóvil...

Diciclohexil ftalato

DCHP Monociclohexilftalato En laboratorios de

investigación

Di-2-etilhexil ftalato

DEHP Mono-2-etilhexilftalato

MEHP

Juguetes de niños, envoltura de alimentos, productos de uso médico (bolsas, tubos..)

Dioctil ftalato DOP Mono-n-octilftalato Suelos de plástico, cubierta de

libros...

Di-isononil ftalato

DINP Mono-isononilftalato Mangueras de agua, suelas de zapato, juguetes, materiales

de construcción

Tabla 5. Degradación de ftalatos a sus respectivos monoesteres. (19)

En organismos superiores, este proceso de metabolización se produce con

mayor rapidez, por lo que no se va a producir biomagnificación a través de la

cadena alimenticia. (23)

El DEHP suministrado vía tracto gastrointestinal es convertido a su monoéster

MEHP, por las lipasas intestinales antes de ser absorbidos por el sistema

circulatorio. En los primates adultos, incluyendo humanos, una proporción

pequeña de DEHP es hidrolizada y absorbida como monoéster (mayor que en

ratas), aparentemente por una actividad menor de la lipasa en el intestino de los

primates. el grado de biotransformación de DEHP al MEHP es importante ya que

el MEHP es considerado generalmente toxico testicular. (23). En la figura 3 se

muestra la degradación de DEHP a su monoéster MEHP.

Figura 3. Degradación DEHP


12

Cuando el DEHP es administrado intravenosamente, la conversión del DEHP a

MEHP es menor que si la exposición es vía tracto intestinal. En estudios a

pacientes incluyendo a niños, sometidos a hemodiálisis o transfusiones

sanguíneas se han registrado niveles significativos de MEHP en sangre después

de esta exposición paranteral. En estudio realizado sobre 11 pacientes

sometidos a tratamiento de hemodiálisis por fallo renal se detectaron mayores

concentraciones (entre 1/3 y 6 veces mayor) del metabolito MEHP que de

DEHP. (23)

Estos datos demuestran que una cantidad significativa de DEHP es convertida en

MEHP, aun después de la exposición intravenosa al DEHP. (23)

La toxicidad más importante del DEHP es mediada a través del MEHP aunque no

sea el único metabolito derivado de su transformación. El DEHP puede

contribuir al desarrollo de la enfermedad llamada membrana hiliana (es

conocida como síndrome de dificultad respiratoria o insuficiencia respiratoria

progresiva) en niños que precisan ventilación mecánica.

Uno de los problemas más importantes en el análisis de ftalatos en muestras de

agua, es la detección de estos compuestos en las muestras usadas como blancos

(2, 24, 17, 18, 24, 25, 26). Los ftalatos se han detectado en todos los tipos de

agua purificada que normalmente se utilizan en el laboratorio, como el agua

destilada y aguas comerciales especiales para la determinación de compuestos

orgánicos volátiles (VOCs) (24). En la Tabla 6 se recogen las concentraciones

encontradas en este tipo de aguas en algunos estudios.

Tipo de aguas

Ref. Método CONCENTRACIONES (µg/L)

DMP DEP DBP BBP DEHP

Desionizada 17 SPME-GC-

ECD nd 0.04 0.15 0.005 0.49

Destilada 27 HPLC-GC-

MS 0.005 0.002

Purificada 18 LLE-GC-MS <0.01 0.29 1.58 0.02 1.06

Redestilada 24 LLE-GC-FID nd 0.14 3.28 0.93

Comercial para VOCs

24 LLE-GC-FID nd nd 10.58 nd

Tabla 6. Concentraciones (en µg/L) de los ftalatos detectados en muestras de agua de uso común en

el laboratorio.


13

Los procedimientos de extracción y preconcentración de ftalatos más usados

con muestras de agua, son la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en

fase sólida (SPE), de hecho ambas técnicas han sido propuestas en métodos

oficiales (ver Tabla 7). Además, en los últimos años, otra técnica relativamente

nueva, la microextracción en fase sólida (SPME), está adquiriendo importancia

en el análisis de estos compuestos. (28-29)

Tabla 7. Métodos propuestos por la EPA para el análisis de ftalatos en diferentes muestras de agua

1.2.4. Métodos cromatográficos

Las técnicas cromatográficas son, sin duda, las más utilizadas para determinar

con fines cualitativos y/o cuantitativos determinados contaminantes. Tal como se

deriva de las observaciones de la tabla procedente. El gran potencial de éstos

métodos radica en su capacidad para llevar a cabo determinaciones multianalito,

en su especificidad, precisión, exactitud, reproducibilidad así como en su

excelente sensibilidad, que depende del detector utilizado. Estas características

han facilitado la implantación de los métodos cromatográficos como métodos de


14

validación de los demás métodos analíticos utilizados en la detección de ftalatos

en muestras biológicas, medioambientales, etc. (30)

La técnica cromatográfica mas utilizada para el análisis de ftalatos es la

cromatografía de gases, si bien se observa en la bibliografía una tendencia clara

a favor de la cromatografía liquida (28-30), dado los problemas de blanco que se

observa o que presenta la cromatografía de gases para estos compuestos. La

cromatografía liquida (CL) está ganando popularidad debido a que muchos de los

contaminantes ambientales son polares, presentan baja volatilidad y son lábiles.

Además, la cromatografía liquida facilita el procesado directo de las muestras en

línea. Un ejemplo de ello, es la utilización de la micro extracción en fase sólida

en tubo (IT-SPME) acoplada a la cromatografía liquida capilar. (31-32)

En HPLC la separación de estas sustancias se realiza generalmente mediante

columnas de fase inversa, con diferentes tipos de soportes (octadecil-, octil-,

fenil-, soportes poliméricos, etc.). A lo largo de los años se han publicado trabajos

evaluando el efecto de distintas variables cromatográficas sobre la separación

de los ftalatos, tales como: el tipo de columna, temperatura, concentración, la

naturaleza y contenido de modificador orgánico en la fase móvil, etc.

Una tendencia en esta técnica es la miniaturización, una condición para mejorar

el rendimiento analítico es la reducción del tamaño de diámetro de la

columna (micro-, capillary- nano-LC). (28-30). El presente trabajo aborda la

cromatografía liquida capilar.

Los sistemas de detección acoplados al HPLC son, habitualmente, la

espectrofotometría UV, el detector de fila de diodos integrados (DAD, del inglés

“diode array detector”), la fluorescencia y, más recientemente, la

espectrometría de masas (MS).

La absorción UV proporciona en general una sensibilidad adecuada para la

mayoría de los análisis de ftalatos, permite obtener información estructural y

está sujeta a múltiples interferencias, lo que hace necesario una etapa previa de

limpieza de muestra o bien, una derivatización de los compuestos (33). No

obstante, el uso del detector DAD ha permitido mejorar la selectividad del

método ya que permite la medida a distintas longitudes de onda, lo cual facilita

la minimización del efecto matriz mediante un sistema de compensación de los


15

efectos de la misma. Utilizando este tipo de métodos es posible la determinación

fiable de ciertos tipos de ftalatos en una gran variedad de matrices biológicas y

medioambientales.

La detección fluorimétrica no se ha utilizado tan extensamente como la de

absorción UV, ya que la mayoría de estos ftalatos no presenta fluorescencia

intrínseca. Sin embargo, este sistema de detección se ha aplicado ampliamente

al análisis de diferentes ftalatos (DEP, DBP,DEHP, MEHP)

La importancia y el potencial de los ensayos de cribado (Test de screening) se

ponen de manifiesto en el considerable incremento de trabajos científicos

relacionados con estas metodologías analíticas en los últimos veinte años.

El interés de estos métodos analíticos es doble: en primer lugar, por la necesidad

de abaratar los costes de los programas de vigilancia y control; en segundo lugar,

por la necesidad de conocer el origen, vías de distribución y destino de los

contaminantes que pueden ser perjudiciales para la salud y el medio ambiente.

Un ensayo de cribado o test de screening se define como “aquel método

analítico que es capaz de llevar a cabo la selección de aquellas muestras cuyo

contenido es similar o mayor que uno previamente establecido como umbral”

(34). Por lo tanto, la aplicación de estos métodos permite identificar las muestras

que probablemente están contaminadas las cuales serán sometidas a un análisis

más exhaustivo permitiendo determinar la presencia cualitativa y cuantitativa

fiable del residuo mediante un método analítico validado que, en la mayoría de

los casos, es cromatrográfico. En la figura 4 se muestra el esquema de

funcionamiento de los ensayos de barrido (34).

Figura 4. Esquema de aplicación de los ensayos de cribado

ENSAYO DE CRIBADO


16

Entre las ventajas de los ensayos de cribado cabe destacar su rapidez, simplicidad

y minimización de errores debido a la ausencia o aplicación de procedimientos

sencillos de tratamiento de muestra. Otros factores son el ahorro de tiempo y

dinero, ya que solo las muestras que proporcionan una respuesta positiva al

ensayo necesitaran ser confirmadas con otra técnica más sofisticada.

Las características fundamentales que diferencian los análisis convencionales de

los ensayos de cribado se resumen en los siguientes puntos (34):

La respuesta que proporciona el ensayo permite tomar una decisión

inmediata.

Los resultados obtenidos mediante estos métodos a menudo necesitan

ser confirmados mediante técnicas convencionales.

Suelen proporcionar respuestas, fundamentalmente, cualitativas

aunque, en menor medida, también pueden suministrar medidas

cuantitativas.

Requieren un escaso o nulo pretratamiento de muestra.

Son ensayos rápidos.

1.3. LEGISLACIÓN

Se indican a continuación las referencias legales vigentes con respecto a los ftalatos.

La Decisión nº 2455/2001/CE del parlamento europeo, de 20 de noviembre de 2001,

por la que se aprueba la lista de sustancias prioritarias en el ámbito de la política de

aguas y se modifica la Directiva 2000/60/CE, incluye al Di(2etilhexil)ftalato (DEHP) en

el listado de sustancias prioritarias añadido como Anexo X a la Directiva marco de

aguas.

La directiva 2006/11/CE, de 15 de febrero de 2006, relativa a la contaminación

causada por determinadas sustancias peligrosas vertidas en el medio acuático de la

Comunidad recoge un listado de categorías y grupos de sustancias, en el que no se

encuentran los ftalatos.

Mediante la directiva 2008/105/CE, de 16 de diciembre de 2008, relativa a las normas

de calidad ambiental en el ámbito de la política de aguas, por la que se modifican y

derogan ulteriormente las Directivas 82/176/CEE, 83/513/CEE, 84/156/CEE,

84/491/CEE y 86/280/CEE y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE, el anexo X


17

de la directiva 200/60/CE se sustituye por otro en el que se incorporan cinco

sustancias a la lista de sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas. Se

establecen también normas de calidad ambiental para sustancias prioritarias y para

otros contaminantes en las que se marcan los valores medios anuales que no deben

ser superados y las concentraciones máximas admisibles en aguas superficiales. Para

el Di(2-etilhexil)ftalato (DEHP) las normas de calidad ambiental (NCA) establecen un

valor máximo para la media anual de 1,3 µg/L para aguas superficiales, tanto

continentales como de otro tipo. Dejando sin marcar valores de concentración

máxima admisible. Las NCA pueden aplicarse a los sedimentos o a la biota, la directiva

deja la opción en manos de los estados. (35)

La orden MAM/85/2008 de 16 de enero, por la que se establecen los criterios

técnicos para la valoración de los daños al dominio público hidráulico y las normas

sobre toma de muestras y análisis de vertidos de aguas residuales, marca un valor de

referencia de 0,0013 mg/L para el Di(2-etilhexil)ftalato. El objetivo es la valoración del

daño a la calidad del agua y al dominio público hidráulico a efectos de determinar la

cuantía de las sanciones e indemnizaciones derivadas de las infracciones relacionadas

con los vertidos.

La ley 42/2007, de 13 de diciembre, del Patrimonio Natural y de la Biodiversidad en la

disposición final quinta de modificación de la ley 22/1988 de Costas, añade dos

anexos: el primero sobre sustancias peligrosas y objetivos de calidad y el segundo

relacionado con los métodos de medida de referencia para dichas sustancias. Sin

embargo no incluye ftalatos.

Relacionado con la sustancia objeto de estudio pero en ámbito distinto al de aguas

existe una directiva que limita la comercialización y el uso del DEHP y otros ftalatos en

juguetes y artículos de puericultura (Directiva 2005/84/CE), estableciendo valores

límite de 0,1% en masa para di(2-etilhexil)ftalato (DEHP), dibutilftalato (DBP),

butilbencilftalato (BBP), diisononilftalato (DINP), diisodecilftalato (DIDP) y din-

octilftalato (DNOP).

El Real Decreto 866/2008, de 23 de mayo, recoge un listado de sustancias permitidas

para la fabricación de materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto

con los alimentos (36). En el anexo III: lista de aditivos que pueden utilizarse en la

fabricación de materiales y objetos plásticos, sección A: lista de aditivos totalmente


18

armonizados a nivel comunitario figuran restricciones para el ftalato de bis(2-

etilhexilo) y para el ftalato de dibutilo. El primero se utilizará únicamente: a) como

plastificante en materiales y objetos de uso repetido que estén en contacto con

alimentos no grasos; b) como agente de apoyo técnico en concentraciones de hasta el

0,1% en el producto final. Límite de migración específica (LME) = 1,5 mg/kg de

simulante alimenticio. El dibutilftalato se utilizará únicamente: a) como plastificante

en materiales y objetos de uso repetido que estén en contacto con alimentos no

grasos; b) como agente de apoyo técnico en poliolefinas en concentraciones de hasta

el 0,05% en el producto final. LME = 0,3 mg/kg de simulante alimenticio. El límite de

migración específica indica la cantidad máxima de componente que el material u

objeto plástico puede ceder a los productos alimenticios en relación a los kilogramos

de producto alimenticio o simulante alimenticio.

El Real Decreto 508/2007, de 20 de abril, por el que se regula el suministro de

información sobre emisiones del Reglamento E-PRTR y de las autorizaciones

ambientales integradas (37), establece valores umbrales para las emisiones a la

atmósfera, al agua y al suelo y para transferencias de ftalato de bis (2-etilhexilo) a

partir de los cuales es necesario comunicar anualmente a la autoridad competente las

cantidades, indicando si la información se basa en mediciones, cálculos o

estimaciones. El valor umbral de información pública de emisiones a la atmósfera es

de 10 kg/año, el dato para emisiones al agua y para emisiones al suelo es de 1 kg/año.

En el reglamento (UE) Nº 143/2011 de la comisión de 17 de Febrero de 2011 se

modifica el anexo XIV del reglamento (CE) nº 1907/2006 del Parlamento Europeo y

del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las

sustancias y preparados químicos ( REACH) considerando que él ftalato de bis(2-

etilhexilo) (DEHP) cumple los criterios de clasificación como tóxico para la

reproducción (categoría 1B) de conformidad con el Reglamento (CE) nº 1272/2008 y,

por tanto, cumple los criterios para su inclusión en el anexo XIV del Reglamento (CE)

Nº 1907/2006 establecidos en el artículo 57, letra c), de dicho Reglamento. Se ha

determinado su inclusión en la lista de sustancias candidatas de conformidad con el

artículo 59 del mencionado Reglamento.


19

En la siguiente tabla se muestra un resumen de la normativa de ftalatos.

Decisión 2455/2001/CE Lista de sustancias prioritarias,aguas

Modifica Directiva 2000/60/CE

Incluye DEHP en lista Anexo X

Directiva 2006/11/CE Listado de sustancias No se encuentran los

ftalatos

Directiva 2008//CE Normas calidad ambiental

Modifica Dir.Marco Valor Máximo medio anual

DEHP 1.3μg/L aguas superficiales

Orden MAM/85/2008 Daños al DPH

Valoración daño a calidad agua y DPH,

determinar sanciones

DEHP 0,0013 mg/L

Ley 42/2007 Patrimonio natural y biodiversidad

Añade 2 anexos a Ley 22/1988 Costas

Sustancias peligrosas y Obj. calidad. No incluye ftalatos

Directiva 2005/84/CE

Juguetes

Valor límite para 6 ftalatos

0,1% masa

R.D. 866/2008 Plásticos en contacto con

alimentos

Restricciones para DEHP y DBP

R.D. 508/2007 Información emisiones del reglamento E-PRTR y AAI

Valores umbrales información pública

para emisiones atmósfera, suelo y

agua

Transferencias de DEHP Emisiones a agua y suelo: 1

kg/ año Emisiones atm: 10 kg/año

Tabla 8. Resumen normativa ftalatos (35)


20

2. OBJETIVO

El objetivo del presente trabajo ha sido la optimización de un procedimiento

cromatográfico de cribado de muestras de aguas que contienen MEHP en presencia de

los ftalatos (DEHP, DEP, DBP) con mayor presencia en el medio ambiente.

Este problema se ha abordado considerando la miniaturización como tendencia de

análisis químico. Se ha desarrollado un analizador de cromatografía liquida capilar que

incorpora la micro extracción en fase sólida en tubo y detección de fila de diodos. Para

ello se han abordado los siguientes estudios:

Optimización del sistema cromatográfico

Establecimiento de parámetros analíticos

Aplicación del método a muestras reales.


21

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1. REACTIVOS Y DISOLUCIÓN ESTÁNDAR

En esta investigación se utilizaron reactivos de calidad analítica como Acetonitrilo y

metanol, los mismos que fueron adquiridos por Scharlau (Barcelona, Spain). Se utilizó

agua ultra pura obtenida con un sistema Nanopure II (Sybron, Barnstead) preparar los

patrones.

Los reactivos utilizados fueron: di (2butilhexil ftalato) (DEHP), Dibutilftalato (DBP),

Dietilftalato (DEP), Monoetilhexilftalato (MEHP), que fueron adquiridos por Scharlau

(Barcelona, Spain).

Las soluciones madre de las patrones individuales (10.0 µg/L) fueron preparados con

acetonitrilo o agua en función de la solubilidad del compuesto. Las disoluciones de

trabajo se prepararon mediante dilución de las disoluciones madre con agua. En la

figura 5 se indica el material utilizado

Figura 5. Material utilizado para las disoluciones

3.2. EQUIPAMIENTO Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

El sistema de cromatografía líquida capilar utilizado consta de una bomba capilar

binaria (Agilent) y un detector UV-Vis de fila de diodos (Agilent, 1200 series) equipado

con una celda de flujo de 80nL. Las señales analíticas fueron registradas entre 190 –

400nm. Se utilizó una librería de espectros de los componentes puros con fines de

identificación. En la Figura 6 se muestra el equipo de medida y el procesador de

datos.


22

Para la separación de los analitos, la columna utilizada fue una columna Onyx

monolítica C18 (Phenomenex, Torrance, CA, USA) (150mm * 0.2mm i.d.)

Figura 6. Equipo de medida de cromatografía líquida capilar y procesador de datos. En la

imagen ampliada se muestra la columna monolítica

Se utilizaron como fases móviles acetonitrilo + agua en modo gradiente. El flujo de la

fase móvil 5μL/min. No se ensayaron flujos superiores para evitar sobrepresiones que

afectarían negativamente al dispositivo IT-SPME.

Todos los disolventes fueron filtrados a vacío a través de membranas de nylon de 0,45

micras (Teknokroma, Barcelona, España) antes de su uso, para eliminar todos los

sólidos en suspensión. Se desgasificaron en baño de ultrasonidos Sonitech (TerraTech,

España.

3.3. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA EN TUBO (IT – SPME)

Para la microextracción en fase sólida en tubo (IT-SPME) se utilizó una columna

capilar de cromatografía de gases TRB-5 de 40cm de longitud, 0,32mm de diámetro

interno y 3μm de espesor. Esta columna capilar se conectó a la válvula de inyección

como loop de muestra. Se utilizaron como conexiones camisas (SLEEVE) de 2,5cm

PEEK de 1/16 de pulgada, férrulas y tubería de 1/16 pulgadas.

Se procesaron manualmente en el sistema en posición LOAD de la válvula de

inyección, por medio de una jeringa de precisión 1,0 mL, alícuotas de 4,0 mL de los

blancos, patrones y muestras a analizar. Se incluyó una etapa de lavado de 50μL de

agua nanopure. A continuación, la válvula fue girada manualmente a la posición de

INJECT y los analitos fueron extraídos del capilar con la fase móvil en modo dinámico

y transferidos a la columna analítica para su separación y detección. Todos los

experimentos fueron llevados a cabo por duplicado a temperatura ambiente.


23

La Figura 7 muestra el esquema del acoplamiento de la microextracción en fase sólida

en tubo con la cromatografía capilar.

Figura 7. SPME en tubo acoplada a CL capilar utilizado en el screening de DEHP, DEP, DBP, MEHP; (a) modo carga y (b) modo inyección.

3.4. MUESTRAS REALES DE AGUA

Las muestras de aguas han sido recogidas en diferentes playas y zonas de transición

de la Comunidad Valenciana (España) en frascos de vidrio topacio y conservados a

4ºC. Tras la llegada al laboratorio, las muestras se almacenaron en la oscuridad a 4ºC

hasta su análisis. Fueron analizadas directamente, sin filtración previa. Cada una de

las muestras se analizó por duplicado a temperatura ambiente.

B

A


24

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Se han analizado los patrones por microextracción en fase sólida acoplada a

cromatografía liquida capilar para determinar el orden de elución y el tiempo de

retención de cada uno de ellos

Para la optimización de la fase móvil se han procesado disoluciones patrón de DEHP,

DEP, DBP, MEHP, se trabajó con un flujo de velocidad (5 µl/min) de forma que se

reduzcan los tiempos de análisis sin que se produzcan solapamientos de picos ni

sobrepresiones, que podrían hacer saltar alguna conexión o romper el capilar. Un

flujo excesivamente lento provocará un aumento en el tiempo de análisis y el

ensanchamiento de los picos, se ensayaron algunos gradientes que se indican en la

tabla 9, con la finalidad de obtener la fase móvil óptima.

La fase móvil optima resulta ser la numero 4 ya que permite una buena separación de

los diferentes analitos estudiados.

Fases móviles

%Acetonitrilo %Agua Tiempo (min)

1 95 5

(Sin gradiente)

2

80 90

100 100 80

20 20 20 20 20

0 10 15 35 39

3

70 70 95 95 70

30 30 5 5

30

0 5

10 15 17

4

70 70 95 95 70

30 30 5 5

30

0 8

11 18 20

Tabla 9. Determinación del tiempo de retención y gradiente de elución

A continuación se muestran los cromatográmas de cada uno de los analitos

analizados:

En la figura 8 se muestra el espectro del DEP y los cromatográmas obtenidos para

diferentes concentraciones procesadas así como, respectivo blanco (color azul), en el

color rojo tenemos una concentración de 10ug/L y en el color verde 25ug/L (ppb)


25

Figura 8. Espectro del DEP

En la figura 9 se muestra el espectro del DEHP y los cromatográmas correspondientes

a diferentes concentraciones procesadas, así como, el respectivo blanco (color azul),

en el color rojo tenemos una concentración de 0,5ug/L, en el color verde 0,25ug/L en

el color rosa una concentración de 1ug/L y 5 ug/L en color amarillo

Figura 9. Espectro del DEHP

DEH

P


26

En la figura 10 observamos al DBP y los cromatográmas a diferentes concentraciones

procesadas, así como, el respectivo blanco en color azul, en color rojo tenemos una

concentración de 5 ug/L y en color verde una concentración de 10 ug/L.

Figura 10. Espectro del DBP

En la figura 11 observamos al MEHP y los cromatográmas a diferentes

concentraciones procesadas, así como, el respectivo blanco en color azul, en color

verde tenemos una concentración de 10 ug/L y en color rojo una concentración de 25

ug/L.

DBP


27

Figura 11. Espectro del MEHP

En la figura 12, se muestran los cromatográmas correspondientes a: un blanco (color

azul) y a una mezcla de DEHP (2 μg/L), DEP (2 μg/L), DBP(2 μg/L), MEHP (2 μg/L),

(color rojo).

Los resultados obtenidos y el tiempo de análisis fueron satisfactorios. Los primeros

7,5 minutos corresponden a la etapa de preconcentración y limpieza mediante

microextracción en fase sólida en tubo (IT – SPME) y a partir de ese tiempo se

desarrolló el cromatograma.

MEHP


28

Figura 12. Cromatograma de comparación de un blanco con una mezcla de patrones.

4.2. PARÁMETROS ANALITICOS

En la siguiente tabla (Tabla 10) se detallan los principales parámetros analíticos

obtenidos en el análisis de screening de DEHP, DEP, DBP, MEHP. Entre los parámetros

analíticos se encuentran el límite de detección, datos de la linealidad como intervalo

de concentración, ordenada y pendiente de la recta de los calibrados con sus

respectivas desviaciones, el coeficiente de correlación lineal y el error típico de la

estimación. También se muestran valores acerca de la reproducibilidad, tanto de

intradía como de interdía, y valores de recuperación. Las longitudes de onda óptimas

de cada uno de los compuestos están indicadas junto con los otros parámetros.

Observando la Tabla 6 se puede comprobar que con el método utilizado, además de

presentar linealidad, se obtienen unos límites de detección (LD) muy bajos, valores

entre 0,10 – 50 ug/L. La sensibilidad depende principalmente del volumen de muestra

inyectada, espesor y dimensiones del capilar, con la microextracción en fase sólida en

tubo se disminuyen todas estas características, y por tanto la sensibilidad aumenta

permitiendo detectar concentraciones que con otras técnicas no es posible. Se

demuestra que la columna Onyx monolítica es muy eficaz para el análisis de

contaminantes orgánicos prioritarios. Igualmente, examinando los valores, se verifica

que el método analítico es reproducible, ya que los coeficientes de variación son

bastante bajos con respecto a las concentraciones de analitos utilizadas. Por lo que se


29

refiere al efecto matriz, se constata que no existe debido a que los valores de

recuperación están muy próximos al 100 %.


30

Tabla 10. Resultados de los análisis de las muestras reales de aguas.

Compuesto LD (ng/L)

Lineabilidad, y= a=b x Reproducibilidad a (n=3)

Recuperación

(%) (n=3) Longitud de

onda (nm)

Intervalos de

trabajo (µg/L) a+Sb b+Sb Sy/x R

2 Intradía

CV (%)

Interdía

CV (%)

DEHP 100 230 0,30 – 50 12 + 12 10,9+0,7 15 0,9713 20 4 96 + 9

DEP 100 230 0,30 - 25 10+40 11,42+1 5 0,972 12 6 100+5

DBP 100 230 0,30 – 50 -135+228 286+10 4 0,997 2 4 103 + 7

MEHP 250 230 0,75 – 50 90+50 27+3 5 0,974 12 9 95 + 4


31

4.3. APLICACIÓN A MUESTRAS REALES

Para identificar los picos obtenidos en el análisis de las muestras, además del tiempo

de retención, se deben comparar los espectros de los picos obtenidos en la muestra

con los de la biblioteca (espectros guardados anteriormente con patrones conocidos).

A continuación se muestran los cromatográmas de cada uno de los analitos

analizados:

Se ha realizado el análisis de muestras reales de dos tipos (de playa y de zona de

transición) recogidas en diferentes zonas de la costa del mediterráneo para el estudio

de la presencia de ftalatos.

En la Figura 13 y 14 se muestran los cromatogramas de distintas muestras de agua

(color rojo, verde y morado) junto con un blanco (color azul).

Figura 13. Cromatogramas de diferentes muestras de agua.


32

Figura 14. Cromatogramas de diferentes muestras de agua.

Los perfiles cromatograficos observados para las muestras reales son comparables

con los de las disoluciones estándar. No se encontraron diferencias entre las muestras

reales y las disoluciones estándar de los compuestos de interés. Se observó una

buena reproducibilidad entre las tres réplicas de las muestras y una buena estabilidad

del sistema cromatografico durante el estudio, en el que se procesaron más de un

centenar de muestras

Las muestras reales de agua, después de ser analizadas, fueron fortificadas para

realizar el cálculo de las recuperaciones y comprobar si existe efecto matriz en este

análisis. En la figura 13 se muestran la comparación de un cromatograma de una

muestra de agua con el cromatograma de esta misma muestra fortificada con DEHP,

DEP, DBP, MEHP todos ellos con concentración de 2ppb. (ug/l)


33

Figura 13. Comparación de cromatogramas entre muestra (azul) y muestra fortificada con

DEHP, DEP, DBP Y MEHP (rojo)

Al comparar los dos cromatogramas, se comprueba la aparición de los analitos DEHP,

DEP, DBP y MEHP con respecto a la muestra sin fortificar. Al realizar los cálculos

correspondientes, se comprueba que se han obtenido unas buenas recuperaciones.

Los valores de las recuperaciones obtenidas aparecen en la tabla correspondiente a

los resultados (Tabla 6).

Las muestras analizadas presentan una muestra de MEHP por debajo del límite de

detección. En todas ellas se detectan el DEHP.

DB

P

DEP

MEH

P

DEH

P


34

5. CONCLUSIONES

El presente trabajo describe un método en línea para realizar el screening de muestras

que contienen MEHP en presencia de DEHP, DEP, DBP, en agua usando SPME en tubo

acoplada a cromatografía liquida capilar. Se ha demostrado que la columna Onyx

monolítica es eficaz y resuelve de manera satisfactoria mezclas de compuestos con

polaridades muy diferentes. Actualmente, hay una tendencia bien reconocida hacia la

inclusión de tantos contaminantes como sean posibles en los programas de control de la

calidad del agua [12-17]

El montaje de SPME en tubo usado, permite el enriquecimiento en línea de los analitos

con las ventajas de requerir una mínima manipulación de la muestra, bajo coste, un

reducido tiempo de análisis y una excelente selectividad y sensibilidad, lo que hace

posible la caracterización de muestras de agua sin tratamiento en menos de 30 minutos y

con LD de 0,3 – 50ug/L. Por otra parte, con las condiciones propuestas no se observaron

efectos de la matriz ni interferencias debidas a otros contaminantes potencialmente

presentes en agua, como nonilfenol, pesticidas organoclorados o PBDEs.

El procedimiento planteado es muy simple y permite la identificación y la cuantificación

de los analitos en concentraciones del orden de las ppb. Por tanto, es adecuado para

controlar la calidad del agua por lo que se refiere a la presencia de ftalatos de acuerdo

con los niveles máximos de concentración establecido y regulados por la UE.


35

6. REFERENCIAS

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Parlamento Europeo y del Consejo, L-348/84, Bruselas, 2008)

(36) http://www.aesa.msc.es/aesa/web/AesaPageServer?idpage=7&idcontent=1029m

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http://www.boe.es/doue/2000/327/L00001-00073.pdf

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