universite de technologie de compiegne
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UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE (U.T.C)
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE COMPIEGNE
Discipline : Génie Biologique et Médical
Présentée et soutenue publiquement
par
Sabine Bensamoun
le 9 décembre 2003
DETERMINATION DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU
TISSU MUSCULO - SQUELETTIQUE
Directeurs de thèse :
Madame le Professeur M.C. Ho Ba Tho
&
Monsieur le Professeur F. Goubel
JURY :
Pr. Vander Sloten, Université Catholique de Leuven Rapporteur
Pr. Benhamou, Institut IPROS, INSERM-ERITM 101, Orléans Rapporteur
Dr. Stevens, Laboratoire de Plasticité Neuromusculaire, Lille Examinateur
Pr. Duchateau , Laboratoire de Biologie Appliquée, Bruxelles Examinateur
Pr. Goubel, Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, Compiègne Directeur de Thèse
Pr. Ho Ba Tho, Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, Compiègne Directeur de Thèse
REMERCIEMENTS
Comme le philosophe Gaston Bachelard l'a décrit dans "Le nouvel esprit scientifique" (1934), c'est le dialogue de l'expérimentateur et du théoricien qui constitue la base de tout travail scientifique. C'est à la croisée des chemins du concret et de l'abstrait qu'il faut comprendre et analyser la science. Quel que soit le point de départ de l'activité scientifique, cette activité doit répondre aux critères suivants : si elle expérimente, il faut raisonner; si elle raisonne, il faut expérimenter. Cette double démarche qui m'a accompagnée dans mes travaux de thèse sera toujours liée à mes futures activités scientifiques.
Il est de coutume de remercier sous forme d’une liste assez exhaustive de noms tous ceux qui ont contribué à un projet de recherche. J’ai souhaité déroger à cet usage en adressant des lettres de remerciements à ceux qui furent les plus impliqués dans ce travail de thèse. De plus, de nombreuses lettres de recommandations ont été établies pour mes dossiers post doctoraux et il m’a donc semblé normal d’écrire en retour quelques remerciements.
Je me permets d’adresser l’expression de ma profonde gratitude aux membres du jury : M. le Professeur Benhamou de l’institut IPROS « Institute of Prevention and Research on Osteoporosis » et M. le Professeur Vander Sloten de l’Université Catholique de Leuven qui ont accepté d’être rapporteurs de ce travail de thèse. Je tiens à remercier aussi Mme le docteur Stevens, en tant qu’examinateur de cette thèse, dont je n’oublie pas qu’elle m’a accueillie au sein de sa dynamique équipe du laboratoire de Plasticité Neuromusculaire pendant plusieurs semaines ; j’ai pu ainsi bénéficier de son encadrement. Et enfin M. le Professeur Duchateau de l’Institut Supérieur d’Education Physique pour avoir accepté d’être examinateur de cette thèse. Veuillez trouver tous ici l’expression de mes sincères remerciements. Toute ma reconnaissance à M. Gamet qui fut le premier à m’initier au domaine du muscle lors de mon DEA ce qui m’a ainsi permis d’entreprendre mon sujet de thèse.
A MADAME LE PROFESSEUR HO BA THO
Le travail de recherche entrepris avec Mme Ho Ba Tho depuis septembre 2000 m’a permis pendant ces trois années de thèse de m’enrichir des qualités scientifiques qu’elle a su m’enseigner. La rigueur de travail qu’elle impose s’est traduite à travers un rapport d’activité mensuel permettant d’établir et de planifier les futurs travaux de recherche, un compte rendu détaillé des réunions de travail sur un sujet précis, et la mise en place de protocoles expérimentaux pour l’apprentissage de multiples techniques. Pour un jeune thésard toute cette rigueur n’est pas facile à mettre en place mais au fil des mois on se rend vite compte que le « chef » avait raison et que la rigueur devient finalement un simple réflexe de travail. L’autonomie d’action que m’a laissée Mme Ho Ba Tho dans mon travail de thèse m’a permis de mener mon projet de recherche selon mes propres convictions et intuitions et de m’adapter personnellement à de nouvelles techniques expérimentales auxquelles j’ai été confrontée. Cette « autonomie » laissée au thésard peut être difficile à gérer lorsqu’on se retrouve, par exemple, seul face à une technique expérimentale inconnue et difficile à utiliser, mais quelle victoire lorsqu’on arrive à la maîtriser ! Je tiens personnellement à remercier Mme Ho Ba Tho pour cette confiance en moi dont elle a fait preuve pendant mon travail de thèse. D’autre part, les collaborations nationales et internationales entreprises par Mme Ho Ba Tho m’ont permis d’acquérir de nouvelles connaissances scientifiques dans les domaines de l’os et du muscle, et de voir le fonctionnement et les habitudes de travail qui se pratiquent à l’extérieur de mon laboratoire. De telles collaborations sont extrêmement enrichissantes pour un thésard, à la fois sur la façon de construire un projet commun et sur le travail d’équipe qui a pu être mené lors de ces collaborations. Enfin, la participation aux congrès est un point que ne néglige pas Mme Ho Ba Tho. En effet, elle encourage vivement ses étudiants à participer à des congrès nationaux et internationaux. Cela permet également d’établir de nombreux contacts qui ne pourront que faire avancer la recherche. Pour toutes ces qualités, je tiens à remercier Mme Ho Ba Tho qui m’a permis d’enrichir mes connaissances scientifiques, et qui a su s’adapter à ma démarche de travail pleine d’entrain et de curiosité.
A MONSIEUR LE PROFESSEUR GOUBEL
Je tiens tout particulièrement à remercier M. Goubel qui m’a permis d’avancer dans la continuité de mes études de physique à travers une orientation biomécanique dans le domaine musculo-squelettique reliant ainsi l’os et le muscle au sein de notre laboratoire. Pour cette excellente orientation je lui suis particulièrement reconnaissante. Au cours de nos différentes réunions de travail qui réunissaient des biomécaniciens du muscle, des physiologistes et des physiciens, il nous est apparu que le langage scientifique employé différait d’un domaine à l’autre. Or, parler la même langue pour mener un projet scientifique commun est vital. M. Goubel a toujours fait preuve d’une grande patience et diplomatie face à ces différentes situations, et a su guider et orienter mon projet de recherche grâce à son expérience scientifique. Il a la qualité de pousser l’étudiant au bout de sa réflexion scientifique, impliquant ainsi une parfaite maîtrise du sujet de recherche. M. Goubel, adepte de footing, a su transmettre au laboratoire un esprit sportif qui m’a vraiment aidée au cours de cette thèse : j’ai pu appliquer l’adage selon lequel l’esprit et le corps sont indissociables, « tels l’os et le muscle ». Pour toutes ces qualités je tiens à remercier M. Goubel qui a réussi également à me convaincre de tempérer mon vif entrain au profit d’une grande patience et d’une profonde réflexion sur les travaux de recherche engagés.
AUX MEMBRES DE L’UMR 6600
L’étude des propriétés mécaniques et morphologiques du muscle et de la fibre isolés a été réalisée en collaboration avec Mme Fleury qui m’a initiée aux techniques de dissection et aux différentes préparations chimiques. Pour sa très grande compétence et sa patience, je ne demande qu’à recommencer à travailler dans de si bonnes conditions avec elle. Elle n’a jamais hésité à m’accompagner lors de déplacements à Lyon, Lille, Reims afin de participer activement à mon travail de thèse. De plus, elle impose une rigueur de travail qui est un modèle à suivre. Mes nombreux déplacements au cours de cette thèse ont été administrativement gérés par Mme Lacourt qui a fait preuve d’une efficacité et d’une rapidité remarquables. Elle m’a permis d’apprendre les modalités à suivre lors de déplacements extérieurs. Elle n’est pas seulement la secrétaire de notre laboratoire mais aussi « l’assistante sociale » qui sait réconforter et redonner de la motivation aux étudiants lorsqu’il y a une « baisse de régime ». De plus, Mme Lacourt qui est la trésorière de l’association « L’Amicale de l’UTC » m’a incitée à faire partie de cette grande famille qui organise des sorties, des repas permettant aux membres de différents laboratoires de se rencontrer. Lors de mes expérimentations, Mme Vanhoutte a toujours répondu « présente » lorsque j’ai eu besoin de ses services pour des petits problèmes de manipulations. Elle n’hésite pas à personnellement s’impliquer et s’attarder sur un problème technique, et à faire partager sa grande expérience, ses « trucs et astuces ». De plus, j’ai eu l’occasion de participer depuis deux ans à la fête de la science sous sa direction ; elle a su me montrer la démarche à suivre et la technique à appliquer pour organiser et rendre attrayantes des conférences grand public. Pour toutes ces raisons, je remercie Mme Vanhoutte avec qui j’ai eu un grand plaisir à travailler. Les étudiants de, l’UMR 6600, ensemble de laboratoires qui regroupe des domaines pluridisciplinaires, ce qui enrichit les échanges scientifiques, n’ont jamais hésité à faire partager leurs multiples connaissances. Enfin, je tiens à remercier tout particulièrement Mme Marque, directrice de l’UMR 6600 que j’ai fréquemment sollicitée pour mes dossiers Postdoctoraux. Mme Marque a toujours su se rendre disponible au moment où j’avais besoin de recommandations. De plus, elle prend toujours la peine de se tenir informée auprès de chacun de l’évolution de notre avenir. Preuve d’intérêt dont je lui suis très reconnaissante.
Résumé :
La caractérisation du tissu musculo-squelettique, qui a fait l’objet de très peu d’études au cours de ces dernières années, fait appel à une connaissance pluridisciplinaire associant les tissus osseux et musculaires. Ainsi, des techniques ultrasonores et mécaniques ont été utilisées pour déterminer les propriétés mécaniques (module d’Young, coefficients élastiques), acoustiques (vitesse de propagation) et élastiques passives (forces et contraintes) d’échantillons osseux (os cortical humain) et musculaires (soleus de rat). Ces différents tests ont été réalisés aux échelles macroscopiques (ostéons, muscles isolés) et microscopiques (lamelles osseuses, fibres musculaires). Parallèlement une caractérisation des propriétés morphologiques (porosité, diamètre des pores, surface des fibres) et biochimiques (degré de minéralisation, analyse du contenu d’hydroxyproline et de titine) de ces deux tissus a été obtenue via l’utilisation de microscopes optique et environnemental, micro scanner et électrophorèses. L’analyse des propriétés mécaniques mesurées aux échelles microscopiques a permis d’expliquer certaines modifications enregistrées aux échelles macroscopiques. Cette étude a également permis de mettre en évidence de fortes corrélations entre les propriétés mécaniques et morphologiques pour ces deux tissus. Mots clés :
Os cortical - Muscle soleus - Ultrasons - Nanoindentation - Titine - Propriétés mécaniques Propriétés morphologiques
Abstract:
The characterisation of the musculo skeletal tissue associate different fields of research where bone and muscle tissue are identified. Different ultrasonic and mechanical techniques were performed in order to determine the mechanical (Young modulus, elastic coefficients), acoustic (velocity) and passive elastic (dynamic, static forces and stresses) properties of bone (human cortical bone) and muscle (soleus of rat) samples. These different tests were performed at the macroscopic (osteons, isolated muscles) and microscopic (osteon lamellae, muscle fibers) levels. Additionally, the morphological (porosity, pores diameters, fibers surfaces) and biochemical (degree of mineralization, content of hydroxyproline and titin) properties were determined with different microscopes (optical, environmental), micro QCT and electrophoresis techniques performed on bone and muscle tissues. The mechanical properties measured at the microscopic level allow to explain the modifications recorded at the macroscopic level. Furthermore, this study showed strong correlation between the mechanical and morphological properties for these two tissues.
Key words:
Cortical bone - Soleus muscle - Ultrasound - Nanoindentation - Titin - Mechanical properties Morphological properties
PUBLICATIONS :
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Luu S., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. 2003
Spatial distribution of acoustic and elastic properties of human femoral cortical bone
Journal of biomechanics. Accepté, sous presse
Bensamoun S., Gherbezza J.M., De Belleval J.F., Ho Ba Tho M.C. 2003
Transmission scanning acoustic imaging of human cortical bone and relation with the
microstructure. Clinical Biomechanics. En révision
Bensamoun S., Fan Z., Rho J-Y., Ho Ba Tho M-C. 2003.
Elastic properties and hardness of human lamellae in process of mineralisation determined
by nanoindentation. Journal of biomechanics. En révision
Bensamoun S., Stevens L., Goubel F., Mounier Y., Linke W.A., Ho Ba Tho M-C. 2003
Age effects on passive mechanical properties of rat muscle fibers.
Article soumis dans Pflügers Archive.
CONGRES INTERNATIONAUX :
• Sessions orales présentées par le premier auteur
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C. (2002).
Mechanical and acoustic properties of human femoral cortical bone. P.369
13TH Conference of the European Society of Biomechanics, Poland.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y. (2002).
Determination of elastic properties of lamellae from human femur by nanoindentation.
11th International congress on biological and medical engineering, Singapore.
Ho Ba Tho M.C., Bensamoun S., Rho J.Y. (2002)
Macro – Micro characterization of mechanical properties of human bone
11th International congress on biological and medical engineering, Singapore
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. (2003).
Variation of acoustic and elastic properties of human cortical in relation with porosity.
World Congress on Ultrasonic, France
Ho Ba Tho, M.C., Bensamoun, S., Rho, J.Y. (2003)
Macro-Micro characterization of human cortical bone using ultrasound and nanoindentation
technique. World Congress on Ultrasonic, France
Bensamoun S., Stevens L., Goubel F., Mounier Y., Ho Ba Tho M-C. 2003. Effect of age on
passive mechanical properties on isolated fibers and muscles. 14TH Conference of the
European Society of Biomechanics. Submitted
• Séances affichées présentées par le premier auteur Ho Ba Tho M.C., Luu S., Bensamoun S., Klaubunde R. (2001).
Anatomical variation of acoustic and mechanical properties of human cortical bone and
relation to microstructure. P.103
XVIIIth Congress of the International Society of Biomechanics, Zurich.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. (2002).
Mapping of ultrasonic velocities on cortical cross section of human femur. P.421
13TH Conference of the European Society of Biomechanics, Poland.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. (2002).
Spatial distribution of acoustic and elastic properties in relation with the microstructure.
11th International congress on biological and medical engineering, Singapore.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y. (2003).
Intra and inter variation of elastic properties of human osteon lamellae.
49th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, New Orleans
CONGRÈS NATIONAUX :
• Sessions orales présentées par le premier auteur Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C. (2002).
Propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical fémoral humain.
Journée Os – Ultrasons, Compiègne.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Gherbezza J.M., De Belleval J.F. (2002).
Cartographie des vitesses ultrasonores sur sections corticales fémorales humaines.
Journée Os – Ultrasons, Compiègne.
• Séances affichées présentées par le premier auteur Bensamoun S., Luu S., Fleury M.J., Vanhoutte C., Ho Ba Tho M.C. (2001).
Variation des propriétés mécaniques de l’os cortical en relation avec la microstructure.P.52-53
11ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Compiègne.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Fan Z., Rho J.Y (2003)
Determination of mechanical properties of osteon lamellae of human femoral bone by
nanoindentation . P28-29
12ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Nantes.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Stevens L., Goubel F. (2003)
Effects of age on the mechanical properties of passive rat muscles fibers. P26-27
12ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Nantes.
Bensamoun S., Gherbezza J-M., De Belleval J-F., Ho Ba Tho M.C. (2003)
Cartography of acoustic velocities of human cortical bone and relation with the
Microstructure. P30-31
12ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Nantes.
Bensamoun S., Ho Ba Tho M.C., Stevens L., Goubel F. (2003)
Effects of age on the mechanical properties of passive rat muscles fibers. P26-27
12ème Forum des Jeunes Chercheurs GBM, Nantes.
NOTATIONS Partie os
A Aire de contact
C33 Coefficient élastique longitudinal
Cij Matrice des coefficients élastiques
Cijkl Tenseur d’élasticité
D Diamètre des pores
∆l Allongement de l’échantillon
ε Déformation de l’échantillon
εi Matrice des déformations
e Epaisseur
Ei Module d’Young
Ekl Tenseur de déformation
f Flèche
F Force de compression
F1, F2, F3 Fémur 1, 2 et 3
G Module de cisaillement
H Dureté
I Moment quadratique
λ, µ Coefficient de Lamé
ν Coefficient de Poisson
N Nombre d’échantillon
Np Nombre total de pores
P Porosité
ρ Masse volumique
ρapp Masse volumique apparente
σ Contrainte
σi Matrice des contraintes
S Section de l’échantillon
SD Déviation standard
Sij Matrice de compliance
Sp Surface totale des pores
Stf Elasticité
t Temps de propagation
Tij Tenseur des contraintes
u Vecteur de déplacement
V Vitesse
Vbar Vitesse de propagation à 75KHz
Vbulk Vitesse de propagation à 2,25MHz
VL Vitesse de propagation d’une onde longitudinale
VT Vitesse de propagation d’une onde transversale
Z Impédance acoustique
Partie Muscle CC Composante contractile
CES Composante élastique série
CEP Composante élastique parallèle
D1..2 Coupe distale (1..2) sur muscle patte droite (D)
D3 Coupe ventrale (3) sur muscle patte droite (D)
G3 Coupe ventrale (3) sur muscle patte gauche (G)
D4..5 Coupe proximale (4..5) sur muscle patte droite (D)
∆L Etirement
E Module d’Young
F Force
Fs Force statique
Fd Force dynamique
L0 Longueur de référence
Ls Longueur slack
Lm Longueur de la fibre à l’intérieur du muscle
m Masse
MHC Myosine
R1, R4, R12 Rats âgés de 1, 4 et 12 mois
S Section
SD Déviation standard
σs Tension statique
σd Tension dynamique
SL0 Longueur de sarcomère au repos
SLy Longueur de sarcomère au point de rupture
SLe Longueur de sarcomère étiré
SREC « Short Range Elastic Component »
T Temps
1
INTRODUCTION
La caractérisation du tissu osseux a permis de répondre à des besoins urgents de la société en
terme de fractures osseuses, vieillissement du tissu osseux et ostéoporose. La résistance
mécanique de l’os est évaluée au moyen de techniques ultrasonores et mécaniques appliquées
in vivo et in vitro. Ces données de contraintes mécaniques sont ensuite intégrées dans des
systèmes de modélisation qui permettent de prédire les risques de fractures et de simuler, par
exemple, l’implantation de prothèses de hanches avec ses risques de descellement lors d’une
fracture du col du fémur. Le tissu osseux qui est un matériau vivant c'est-à-dire en remodelage
permanent voit ses propriétés morphologiques se modifier au cours du temps. Ainsi, des
corrélations entre la morphologie de l’os cortical et ses propriétés mécaniques pourront prédire
de la qualité osseuse. Notons que la qualité de l’os varie d’une personne à une autre suivant ses
antécédents et sa sédentarité.
La caractérisation du tissu musculaire in situ a permis d’évaluer les propriétés mécaniques
de différents groupes musculaires soumis par exemple à des entraînement physiques
(hyperactivité) ou au contraire à une réduction de l’activité physique (l’hypoactivité qui a pour
conséquence une atrophie musculaire). La fonction musculaire est alors évaluée au moyen de
techniques ergométriques qui s’intègrent dans différents domaines : rééducation fonctionnelle,
caractérisation du système musculo-tendineux... Le muscle qui est un matériau vivant subit des
changements de structures et des modifications biochimiques selon les contraintes qui lui sont
exercées (le muscle peut être soit dans un état actif lorsqu’il subit une contraction musculaire,
soit dans un état passif lorsqu’il subit un étirement). Ainsi, la détermination des propriétés
mécaniques des fibres musculaires a permis de caractériser certaines structures internes à la
fibre tel que la desmine et la titine. Ces composants jouent un rôle prépondérant dans
l’élasticité musculaire ainsi que dans certaines myopathies (desminopathie, dystrophie
musculaire de Duchenne).
La caractérisation du tissu musculo-squelettique fait appel à une connaissance
pluridisciplinaire associant les domaines de l’os et du muscle. La mécanique du système
musculo-squelettique qui a fait l’objet de très peu d’études au cours de ces dernières années
prend en considération les différents tissus environnants lors de pathologies ostéoarticulaires ou
musculaires. Ainsi lors d’une pathologie osseuse, se pose la question de savoir comment le
muscle est affecté et comment il est possible d’agir sur celui-ci afin de compenser les
problèmes osseux. De la même façon, se pose la question de savoir comment l’os réagit lors
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d’une pathologie musculaire. L’os et le muscle forment un ensemble indissociable qui
fonctionne de pair et de nombreux exemples le confirment. La pathologie du pied bot qui est
due à une déformation osseuse peut dans certains cas être traitée par une action de rééducation
au niveau des muscles des pieds qui oblige l’os à se redresser. Les scolioses qui sont dues à une
déformation de la colonne vertébrale peuvent dans les cas les plus simples être soignées par un
renforcement des muscles du dos. L’implantation d’une prothèse de hanche oblige les muscles
à jouer un rôle important dans la stabilité de la prothèse. Tous ces exemples montrent que le
muscle et l’os ne font qu’un d’un point de vue fonctionnel.
La connaissance fondamentale des propriétés mécaniques de l’os et du muscle permettra de
simuler les contraintes mécaniques à appliquer sur ces deux tissus afin de prédire l’évolution
des pathologies et leurs conséquences et afin de mettre en place de meilleurs systèmes de
rééducation.
Ainsi l’objectif de cette thèse a été d’acquérir une connaissance fondamentale des propriétés
mécaniques et morphologiques du tissu musculo-squelettique (os et muscle) humain.
Les modèles utilisés pour le tissu osseux (cortical) sont extraits de fémurs humains présentant
des modifications morphologiques. En ce qui concerne les modèles utilisés pour le tissu
musculaire, les conditions expérimentales étant plus contraignantes que pour l’os, des muscles
de soleus de rats de différents âges ont été choisis pour obtenir des modifications
morphologiques semblables à celles du muscle humain. Les modifications morphologiques
musculaires liées à l’âge sont identiques pour les modèles humain et animal (rat) alors que le
tissu osseux ne possède pas les mêmes propriétés morphologiques entre ces deux espèces.
Une première partie organisée en trois chapitres est consacrée au tissu osseux.
Le premier chapitre explique dans un premier temps l’organisation hiérarchique de l’os cortical
et dans un second temps les différentes techniques ultrasonore, mécanique et radiographique
qui permettent de caractériser l’os cortical.
Le deuxième chapitre expose les différentes techniques ultrasonore et mécanique utilisées ainsi
que les résultats des propriétés acoustiques (vitesses (m/s)) et mécaniques (module d’Young
(GPa), coefficient élastique (GPa), dureté (GPa)) obtenus au moyen de ces techniques à
l’échelle macroscopique (sections fémorales, échantillons cubiques et parallélépipédiques) et
microscopique (lamelles osseuses). Les échantillons d’os cortical choisis pour cette étude
présentent des propriétés morphologiques différentes (variation de la porosité, variation du
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diamètre des pores) et la gamme de porosité sera calculée grâce à différents logiciels d’analyse
d’images.
Le troisième chapitre compare les différents paramètres acoustiques obtenus avec les
différentes méthodes ultrasonores et corrèle ces paramètres acoustiques aux paramètres
morphologiques. Une dernière étape consistera à confronter les résultats des paramètres
mécaniques obtenus aux échelles macroscopique et microscopique.
Une deuxième partie organisée de façon parallèle au tissu osseux présente trois chapitres :
Le premier chapitre expose les différents constituants hiérarchiques du muscle squelettique et
présente les différentes techniques expérimentales permettant de mesurer les propriétés
mécaniques et morphologiques de soleus de rat.
Le deuxième chapitre présente les différentes techniques ergométriques employées pour
caractériser l’élasticité passive aussi bien à l’échelle du muscle (soleus) isolé que sur la fibre
isolée. Les paramètres contrainte dynamique (KN/m2), statique (KN/m2) et module d’Young
(KN/m2) seront calculés sur des muscles (et fibres isolées) présentant des propriétés
morphologiques différentes. Le critère de l’âge des muscles a été choisi afin d’obtenir des
modifications morphologiques. Les paramètres morphologiques (surface des muscles et des
différents types de fibres) seront analysés grâce à un logiciel spécifique d’analyse d’images. De
plus, l’évolution de l’âge entraînant des changements physiologiques une analyse biochimique
du contenu de collagène et de titine (avec isoforme) sera effectuée.
Le troisième chapitre s’attache à corréler les propriétés mécaniques aux propriétés
morphologiques et biochimiques.
Une dernière partie retrace le travail mené en parallèle sur l’os et le muscle et synthétisera les
observations trouvées sur ces deux matériaux biologiques.
La conclusion présente les perspectives de ce travail fondamental de thèse dans le domaine de
la recherche clinique.
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5
PARTIE
OSSEUSE
1
Chapitre I - Etude bibliographique
I LE TISSU OSSEUX I - 1 Classification des différents types d’os
I - 2 Organisation hiérarchique de l’os humain
I - 2 - 1 Composition de la matrice extracellulaire
a) Composante organique
b) Composante minérale
I - 2 - 2 Architecture de l’os cortical
I - 2 - 3 Remodelage osseux
II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MECANIQUES ET ACOUSTIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN
A Echelle macroscopique A - I In vitro
A - I - 1 Technique mécanique
A - I - 2 Technique acoustique en transmission
a) En contact
b) En immersion A - II In vivo
A - II - 1 Transmission axiale en contact
A - II - 2 Transmission transverse en immersion
A - II - 3 En réflexion B Echelle microscopique
B - I Echelle de l’ostéon
B - I - 1 Tests mécaniques
B - I - 2 Technique par ultrason en immersion et réflexion
B - II Echelle de la lamelle osseuse
B - II - 1 Technique de nanoindentation
2
C Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical humain
III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MORPHOLOGIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN
III - 1 Les techniques utilisées
III - 1 - 1 Micro – radiographie
III - 1 - 2 Micro-tomographie
III - 1 - 3 Les logiciels de calcul des paramètres morphologiques
III - 2 Les paramètres morphologiques
III - 2 - 1 La porosité
IV SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
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Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu cortical humain
I MATERIELS I - 1 Echantillons cubiques
I - 2 Echantillons parallélépipédiques
I - 3 Sections fémorales
II METHODES II - 1 Théorie
II - 1 - 1 Loi de Hooke
II - 1 - 2 Matériau orthotrope
II - 1 - 3 Matériau isotrope transverse
II - 1 - 4 Matériau isotrope
II - 1 - 5 Propagation d’une onde dans un milieu élastique illimité
II - 1 - 5 - 1 Application à l’os cortical
II - 1 - 6 Propagation d’une onde dans un milieu élastique limité
II - 1 - 6 - 1 Application à l’os cortical
II - 2 Mesure expérimentale
II - 2 - 1 Détermination des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical
II - 2 - 1 - 1 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en contact
II - 2 - 1 - 2 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en immersion
II - 2 - 1 - 3 Mesure de la masse volumique
II - 2 - 1 - 4 Calibration
II - 2 - 1 - 5 Analyse statistique
II - 2 - 2 Détermination des propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical II - 2 - 2 - 1 Microscope électronique à balayage
II - 2 - 2 - 2 Technique de nanoindentation
II - 2 - 2 - 3 Calibration
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II - 2 - 2 - 4 Analyse statistique
II - 2 - 3 Synthèse des échantillons II - 3 Détermination des propriétés morphologiques de l’os cortical
II - 3 - 1 Choix des échantillons
II - 3 - 2 Détermination des paramètres morphologiques
II - 3 - 3 Protocole de mesure
a) Echantillons cubiques et parallélépipédiques
b) Sections fémorales
c) Echantillons parallélépipédiques
II - 3 - 4 Validation de la méthode de mesure
III RESULTATS III - 1 Propriétés mécaniques et acoustiques des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical (F1, F2, F3)
III - 1 - 1 Mesure de la masse volumique
III - 1 - 2 Mesures des propriétés acoustiques
a) Mesures des vitesses de propagation
b) relations prédictives entre vitesse et masse volumique
III - 1 - 3 Mesures des propriétés élastiques
a) Mesures des modules d’Young (E33) et des coefficients élastiques (C33)
b) Relations prédictives entre les propriétés élastiques et la masse volumique
III - 1 - 4 Analyse statistique
III - 2 Propriétés acoustiques des sections fémorales humaines (F2) III - 2 - 1 Mesure de l’épaisseur des sections
III - 2 - 2 Capteurs plans
III - 2 - 3 Capteurs focalisés
III - 3 Calibration
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III - 4 Propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical (F1, F2, F3) III - 4 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
a) A l’échelle microscopique
b) A l’échelle macroscopique
III - 4 - 2 Etude des échantillons parallélépipédiques du fémur 2 (F2)
III - 4 - 3 Calibration
III - 4 - 4 Reproductibilité des mesures effectuées par la technique de nanoindentation
III - 5 Propriétés morphologiques
III - 5 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
a) Paramètres morphologiques
b) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques
III - 5 - 2 Sections fémorales (F2)
c) Cartographie de la microarchitecture
d) Paramètres morphologiques
e) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques
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Chapitre III - Discussion I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES ACOUSTIQUES, MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES I - 1 Technique de transmission en contact
a) Comparaison des trois fémurs (F1, F2, F3)
b) Variation spatiale
I - 2 Technique de transmission en immersion (F2)
a) Variation spatiale
I - 3 Comparaison des techniques de transmission en contact et en immersion (F2)
I - 4 Corrélation des propriétés acoustiques et morphologiques
a) Echantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
b) Sections fémorales (F2)
I - 5 Synthèse des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical
II PROPRIETES MECANIQUES DES LAMELLES OSSEUSES II - 1 Comparaison des résultats macroscopique et microscopique
II - 2 Etude du fémur 2
7
Chapitre I - Etude bibliographique
I LE TISSU OSSEUX I -1 Classification des différents types d’os
L’os est un tissu de soutien hautement spécialisé, caractérisé par sa rigidité et sa dureté. La
conformation extérieure des os est variée et irrégulière ; on peut distinguer trois types principaux :
Les os longs (fémur, tibia) qui possèdent un corps et deux extrémités : le corps ou diaphyse est en
général cylindrique, les extrémités ou épiphyses sont plus volumineuses que le corps et présentent
des surfaces lisses par lesquelles l’os s’articule avec les os voisins : les surfaces articulaires.
L’épiphyse la plus rapprochée du tronc s’appelle l’épiphyse proximale, la plus éloignée est
l’épiphyse distale.
Figure 1: Anatomie du fémur (Chevrel et coll., 2000)
Les os longs présentent la plupart du temps un cortex externe dense (périoste) composé d’os
cortical ou compact et d’une région interne formée d’os trabéculaire ou spongieux localisé aux
extrémités (épiphyse) des os longs.
L’os cortical forme une coque externe rigide qui résiste à la déformation, et le réseau trabéculaire
interne (os spongieux) renforce l’os en agissant comme un système complexe de piliers.
Les os courts qui ont presque tous une forme cubique ou proche et présentent un plus grand
nombre de facettes articulaires. Certains sont très petits (pisiforme), d’autres plus volumineux
(exemple : calcanéus).
Les os plats (exemple : omoplates, côtes) qui ont une épaisseur extrêmement réduite alors que la
longueur et la largeur sont variables.
8
I - 2 Organisation hiérarchique de l’os cortical humain
I - 2 - 1 Composition de la matrice extracellulaire
Dans la matrice extra-cellulaire de l’os, on distingue deux composantes :
- la matrice organique
- la matrice minérale
La matrice organique est composée de collagène de type I qui forme 90% de la matrice
organique osseuse. La matrice osseuse est constituée à 90% d’ostéoïde. L’ostéoïde est un tissu
de soutien constitué de collagène de type I, inclus dans un gel de glycosaminoglycane
contenant des glycoprotéines spécifiques (ostéocalcines par exemple), qui lient fortement le
calcium. En effet, la matrice organique comprend également plusieurs molécules tel que
l’ostéonectine qui joue un rôle important dans la minéralisation du fait de son affinité pour le
collagène de type I et le calcium. La matrice organique est formée d’os réticulaire et lamellaire.
L’os réticulaire (réparation d’une fracture) est caractérisé par sa distribution aléatoire des fibres
de collagène et est mécaniquement faible. L’os lamellaire est caractérisé par un alignement
parallèle régulier de lamelles de collagène et est mécaniquement très résistant.
La matrice organique est encore plus complexe puisqu’il existe des facteurs de croissance qui
jouent un rôle fondamental dans la régulation du remodelage osseux.
La matrice minérale est constituée de cristaux d’hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) (sous
forme d’une aiguille ou d’une plaquette hexagonale) et de carbonate de calcium. L’os
représente ainsi un réservoir de calcium puisqu’il contient 98% du calcium de l’organisme. De
ce fait, il joue un rôle primordial dans la régulation calcique. Le dépôt de sels minéraux dans
l’ostéoïde confère à l’os sa rigidité et sa force mécanique.
9
Os cortical
Os spongieux
Ostéon
Lamelle
Canal de Havers
Fibre de collagène
Fibrille de collagène
Molécule de collagène
Cristaux osseux
I - 2 - 2 Architecture de l’os cortical
Les propriétés mécaniques de l’os cortical dépendent des propriétés mécaniques de l’ensemble des
éléments structurels qui le composent tels : les ostéons (10-500µm), les lamelles osseuses (3-7µm),
cristaux d’apatite…
Figure 2 : Organisation hiérarchique de l’os cortical humain (Rho et coll., 1998) Le système haversien (figure 3) est l’élément représentatif de l’os cortical; il est composé d’un
ensemble de canaux nourriciers (diamètre 50-60µm) ou canaux de Havers. L’élément
représentatif du système haversien est l’ostéon (diamètre entre 10 et 500µm): orienté
parallèlement à l’axe longitudinal de l’os, il est généralement composé de 3 à 8 lamelles de
collagène minéralisées (diamètre 3 à 7µm) et organisées de façon concentrique autour du canal
de Havers. Ces lamelles sont alternées en lamelles dites épaisses et fines. La lamelle externe de
l’ostéon, la ligne cémentante, délimite l’ostéon et le système interstitiel. Le système interstitiel
est composé d’anciennes lamelles osseuses ayant appartenu à d’anciens ostéons.
Figure 3 : Représentation du système haversien (Chevrel et coll., 2000)
10
Ascenzi et Bonnucci (1967, 1968, 1990 et 1994) ont identifié trois types d’ostéons selon
l’orientation des fibres de collagène. La sélection des ostéons s’effectue via un microscope
polarisé (figure 4) ; ils sont classés en type I, II et III et représentent respectivement des
orientations transversales, alternées (alternance de fibres longitudinales et transversales) et
longitudinales de fibres de collagène.
Figure 4 : Représentation des différents types d’ostéons avec leur visualisation au microscope polarisé : a) ostéons de type I (orientation transverse), b) ostéons de type II (orientation alternée), c) ostéons de type III. (Ascenzi et Bonucci, 1968)
L’os spongieux est constitué d’un ensemble de travées (ou trabécules) osseuses qui ont une
forme de bâtonnets ou de lamelles. Les espaces situés entre les trabécules sont occupés par de
la moelle osseuse; l’os spongieux se distingue de l’os cortical par une porosité beaucoup plus
importante.
Lorsque l’os spongieux est soumis à des contraintes importantes la zone trabéculaire s’organise
de façon à offrir une résistance maximale à ces contraintes. Ainsi les zones trabéculaires
fortement sollicitées auront une structure lamellaire (forte densité) comparée aux zones moins
sollicitées qui présentent une allure bâtonnet (faible densité). L’os est un matériau vivant qui
adapte sa structure géométrique à la charge qui lui est appliquée.
Figure 5 : Image 3D de l’os trabéculaire (Peyrin et coll., 1997)
11
I - 2 - 3 Remodelage osseux
Le tissu osseux contient trois types de cellules (figure 6) qui servent à l’entretien et au
remodelage de l’ostéoïde.
Les ostéoblastes (30µm) dérivent de cellules mésenchymateuses qui forment une population
de cellules souches pouvant se différencier en cellules plus spécialisées qui forment
l’os. L’objectif des ostéoblastes est de secréter du collagène de type I qui assemblé en fibrilles
dans le milieu extra-cellulaire servira à la formation osseuse.
Les ostéocytes (10µm) sont des cellules osseuses matures issues des ostéoblastes. Par
l’intermédiaire de leurs prolongements cytoplasmiques d’interconnexion les ostéocytes
reçoivent suffisamment de nutriments pour survivre. Ils peuvent aussi résorber la matrice
osseuse qui les entoure pour libérer du calcium en quantité faible.
Les ostéoclastes (50 à 100µm) sont des cellules osseuses multinuclés dont la principale
fonction est de phagocyter les fibres de collagène, et qui jouent donc un rôle essentiel dans la
résorption du tissu osseux.
Avec la contribution de ces trois cellules qui constituent le tissu osseux on peut dire que l’os est
un tissu en remodelage permanent.
a) b)
c)
g Figure 6 : Illustration des principales cellules osseuses a) ostéoblaste b) ostéocyte c) ostéoclaste
(Maillet et coll., 1979)
Ostéocyte Ostéoplaste
Canalicules
12
II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES
MECANIQUES ET ACOUSTIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN
Ce chapitre présente les différentes méthodes expérimentales qui sont utilisées pour
caractériser les propriétés mécaniques (modules d’élasticité, coefficients élastiques) et
acoustiques (vitesse de propagation, impédance, atténuation) aux échelles macroscopique et
microscopique du tissu osseux humain.
A Echelle macroscopique
A - I In vitro
A – I – 1 Technique mécanique
Les tests mécaniques sur des échantillons osseux (cortical ou spongieux) peuvent être
appliqués en traction ou en compression. La réponse du matériau est visualisée par un
diagramme qui représente l’effort « F (N)» appliqué sur l’échantillon en fonction de sa
variation de longueur « l (mm) » (figure 7).
Figure 7 : Diagramme effort - allongement représentant un échantillon soumis à un test de compression
Ce diagramme effort - allongement est constitué de trois phases :
La phase I correspond à la déformation élastique c’est à dire que l’échantillon se déforme
proportionnellement à l’effort. Dans cette phase, l’échantillon déformé s’allonge d’une
longueur ∆l (mm), et on note la déformation (« ε ») de l’échantillon comme étant le rapport
entre l’allongement ∆l et la longueur initiale de l’échantillon l :
Dans cette zone le matériau est élastique et reprend sa forme de départ si l’effort est relâché.
Phase II : le point « Fe » correspond à la limite d’élasticité du matériau
l
F
∆l
Fe
F
∆l
13
Phase III : au-delà de la limite d’élasticité, la déformation continue à augmenter très
rapidement ; lorsque l’effort s’arrête l’échantillon ne reprend pas sa longueur initiale.
A chaque effort F correspond une contrainte σ (N/mm2) : SF
=σ S (mm2) étant la section de
l’échantillon. Le module d’élasticité longitudinale ou module d’Young E (N/mm2) correspond
au rapport entre la contrainte et la déformation (ε).
On en déduit la loi de Hooke qui relie la contrainte (σ), la déformation (ε) et le module de
Young E : eE ×=σ Equation 1
ll
SFE
∆×= Equation 2
De nombreuses études ont comparé les modules d’élasticité obtenus avec des tests en tractions
et en compressions ; certains auteurs ont conclu qu’il y avait des différences significatives des
propriétés mécaniques (Stone et coll., 1983, Kaplan et coll., 1985) alors que d’autres études
(Bensusan et coll., 1983, Rohl et coll., 1991) n’ont pas trouvé de différence entre ces deux
tests mécaniques.
La technique de la flexion en trois points (Choi et Goldstein, 1992) permet également de
mesurer mécaniquement le module d’Young (E). Cette technique consiste à imposer une force
(F) fixe sur une poutre disposée en équilibre puis à mesurer la flèche engendrée par cette force
(figure 8).
Figure 8 : Représentation de la technique trois point de flexion
Les effets de cisaillement sont négligés lorsque les dimensions longitudinales de la poutre
sont très grandes devant les dimensions transversales.
L’équation suivante permet de mesurer la flexion élastique d’une poudre :
fI
FlE 48
3
= Equation 3
E module Young (N/mm2), F la force appliquée (N), f la flèche (mm), l la longueur (mm), I le
moment quadratique (mm4).
F
14
A - I - 2 Technique acoustique en transmission
a) En contact
Plusieurs auteurs (Yoon et Katz, 1976, Van Buskirk et coll., 1981, Ashman et coll., 1984) ont
utilisé une technique acoustique de transmission en contact avec des capteurs plans à
2,25MHz et 75KHz. Cette technique ultrasonore développée par Ashman et coll., 1984 a
consisté à faire passer une onde ultrasonore à travers un échantillon disposé entre deux
capteurs jouant le rôle d’émetteur et de récepteur. Ensuite, il est visualisé sur un oscilloscope
l’impulsion émise par le générateur en entrée et la propagation de l’onde à travers le matériau
en sortie (figure 9). Le temps de propagation de l’onde peut directement être mesuré à
l’oscilloscope, et le module d’Young est déduit des mesures des propriétés acoustiques via
l’équation de propagation des ondes dans un milieu limité ; l’intervalle de valeurs pour les
vitesses obtenues à haute fréquence et dans toutes les directions est entre 3400m/s et 4000m/s
(Ashman et coll., 1984 ; Bensamoun et Ho Ba Tho, 2002 ; Ho Ba Tho et coll., 1991).
Figure 9 : Technique ultrasonore par transmission (Ho Ba Tho et coll., 1991)
Un atlas des propriétés mécaniques a été publié par Ho Ba Tho et coll., 1991 sur sept sujets
humains et sur différents types d’os en utilisant la technique de Ashman et coll., 1984 ; Les
modules d’élasticité dans la direction axiale pour le fémur, humérus et tibia sont
respectivement 19,8 GPa, 20,5 GPa et 20,8 GPa ; les résultats ont de plus démontré que les
propriétés mécaniques de l’os cortical variaient en fonction de la localisation anatomique,
reflétant l’hétérogénéité de l’os. Ces variations ont été estimées avec une résolution spatiale
de 5mm (taille des échantillons).
L
specimen
75 kHz capteurs
Générateur d’impulsionst
V =Lt
(mm)(µs)
OSCILLOSCOPE
impulsion
réponse
t : temps de parcours
15
b) En immersion
Transmission
Une technique ultrasonique en transmission a été proposée par Pithioux et coll., 2002
permettant d’estimer les propriétés élastiques d’os cortical bovin. Deux capteurs focalisés
(émetteur et récepteur) en immersion à 1MHz ont permis d’obtenir des vitesses longitudinales
comprises entre 4042 ± 19m/s et 4326 ± 20m/s ainsi que des coefficients élastiques
longitudinaux (C33) compris entre 28GPa et 39GPa. Ces résultats sont du même ordre de
grandeur que ceux publiés par Katz 1984 (C33 = 29 ± 1GPa), Yoon et Katz 1976 (C33 = 32,5
± 0,0044GPa) et Ashman 1984 (C33 = 27,6GPa).
Figure 10 : Propagation d’une onde ultrasonore en mode transmission (Pithioux et coll., 2002)
Réflexion
Cette technique utilise des capteurs piézo-électriques focalisés en immersion à basse
fréquence : 20MHz et 50MHz. L’onde acoustique émise est réfléchie à la surface du matériau
et reconvertie en signal électrique par le même capteur. Un balayage de la surface de
l’échantillon est effectué dans le but d’obtenir une cartographie 2D des impédances
acoustiques.
ρ×= CijZ Equation 4
Z étant l’impédance acoustique est relié à Cij la constante élastique et ρ la masse volumique.
Cette technique a été appliquée à des matériaux biologiques par Meunier et coll., 1988 dont le
principe est représenté figure 11.
Emetteur fixe
Récepteur mobile
Eau
16
Figure 11 : Dispositif expérimental du microscope acoustique (Bumrerraj et Katz, 2001)
Les travaux de Hasegawa et coll., 1995 ont utilisé la technique de microscopie acoustique afin
de comparer les propriétés acoustiques de trois groupes constitués de sujets pré ménopausées,
ostéoporotiques et post ménopausées. Les vitesses longitudinales obtenues pour le groupe
ostéoporotique (V = 3436 ± 209m/s) sont supérieures au groupe formé de sujets pré
ménopausées (V = 3318 ± 319m/s) et inférieures au groupe post ménopausées (V = 3663 ±
198m/s). Des différences significatives ont été trouvées entre les trois groupes mais aucune
explication n’a été avancée. Les auteurs suggèrent que les propriétés élastiques sont un bon
moyen pour prédire les fractures osseuses.
Les travaux de Meunier et coll., 1988 ont observé la résorption de certaines régions sur des
sections fémorales humaines de personnes jeunes (25 ans) et âgées (74 ans). La distribution
spatiale des impédances acoustiques (résolution 100µm) a montré que la section jeune
présentait de faibles impédances acoustiques dans la région postérieure (7,52 Kg/m2s)
comparée à une augmentation dans la région antérieure (7,78 Kg/m2s). La distribution spatiale
d’impédance chez le sujet âgé a montré différents contrastes dans des régions proches avec de
faibles impédances dans les régions postérieure (5,83 Kg/m2s) et antérieure 6,40 Kg/m2s)
ainsi qu’ un degré de porosité plus important dans la partie endoste.
Stage
Specimen
Coupling Liquid
Reflected waves
Receiver RF Signal
Transmitter
Buffer Rod (Sapphire)
Matching Layer
Acoustic wave
Piezoelectric transducer
17
Certains auteurs tel que Zimmerman et coll., 1990 utilisent la cartographie d’impédance dans
le but d’observer le remodelage osseux après des arthroplasties de hanches. En effet, le
remodelage osseux a été observé après implantation de deux types de prothèses de hanches
(Austin - Moore versus Charnley).
a) b)
Figure 12 : Cartographie fémorale d’impédance pour un sujet implanté (a) avec une prothèse
de Moore et sans prothèse (b) (Meunier et coll., 1988)
La distribution d’impédance en fonction de la localisation anatomique a été étudiée par Weiss
et coll., 1998. L’impédance acoustique du côté postérieur (7,55 Mrayls) est inférieure aux
autres côtés (7,75 – 7,8 Mrayls) (1 Mrayls = 106 Kg/m2s ) ; sur une longueur représentant
20% de la diaphyse, l’impédance acoustique diminue sur la région antérieure alors qu’elle
augmente pour le côté postérieur.
18
A - II In vivo
A - II - 1 Transmission axiale en contact
Une nouvelle technique commerciale (« Sunlight Ultrasound Technologies, Rehovot, Israel »)
in vivo a été utilisée par différents auteurs afin de détecter les personnes ostéoporotiques et
prédire le risque de fracture. Cette technique consiste à mesurer la vitesse de l’onde
ultrasonore qui se propage sur quelques centimètres suivant un mode de transmission axiale le
long de l’os cortical figure 13.
Figure 13 : Propagation de l’onde à travers les tissus mous et le long de l’os
(Barkmann et coll., 2000)
La vitesse de propagation a été mesurée sur 1521 sujets sains âgés de 20 à 90 ans sur de
multiples sites tel que le radius, le tibia, le métatarse et la phalange ; les vitesses mesurées
sont respectivement 4169m/s, 3939m/s, 3663m/s et 4047m/s. Ces mesures ont permis
d’évaluer la précision de cette technique et le recueil d’une base de données (Weiss et coll.,
2000). Les travaux de Barkmann et coll., 2000 menés avec cette même technique ont consisté
à prédire le risque de fracture en comparant des populations de sujets sains et des sujets qui
avaient auparavant eu une fracture de la hanche, cheville, avant-bras, colonne vertébrale.
Le résultat de cette étude ayant démontré des vitesses de propagation plus faibles pour les
sites fracturés permet d’envisager le potentiel de cette nouvelle technique dans la prédiction
du risque de fractures.
Transducers
Soft Tissue
Bone
19
A - II - 2 Transmission transverse en immersion
Les travaux de Laugier et coll., 1994, 1996 ont mesuré le paramètre d’atténuation en
fréquence (BUA : Broadband Ultrasonic Attenuation) afin d’estimer la qualité osseuse à
travers des images paramétriques ultrasonores reconstruites à partir de la pente d’atténuation
ou de la vitesse de propagation. La technique consiste à immerger le talon dans un bain qui est
placé entre deux capteurs piézo-électriques focalisés. L’onde se propage dans la direction
transverse à travers le calcanéum ; cette technique est équivalente à l’ostéodensitométrie par
rayons X, elle a l’avantage d’avoir une meilleure standardisation de la zone à examiner et de
permettre un bon positionnement de la région d’intérêt à observer.
Figure 14 : Représentation de l’atténuation ultrasonore obtenue in vitro sur le calcanéum
(Laugier et coll., 1994)
A - II - 3 En réflexion
Une étude similaire à celle de Hasegawa et coll., 1995 a été menée par Antich et coll., 1993
par une technique in vivo en réflexion sur trois groupes également constitués de sujets pré
ménopausées, ostéoporotiques et post ménopausées. Les résultats obtenus sont en désaccord
avec ceux trouvés par Hasegawa puisque aucune différence significative n’a été obtenue pour
les vitesses acoustiques entre les trois groupes : Vpré ménopausée = 4123 ± 174 m/s,
Vostéoporotique = 4089 ± 178m/s et Vpost ménopausée = 4045 ± 199 m/s).
20
B Echelle microscopique
B - I Echelle de l’ostéon
B - I - 1 Tests mécaniques
Les premiers travaux de recherche menés sur les propriétés mécaniques d’ ostéons isolés ont
été menés par Ascenzi et Bonucci, 1967. Plusieurs tests mécaniques en compression, torsion,
flexion ont été réalisés sur des ostéons de types I (ostéon transverse), II (ostéon alterné) et
III (ostéon longitudinal) possédant des orientations différentes de fibres de collagène.
Des tests de compression furent réalisés sur des ostéons extraits de fémurs humains (30 et 80
ans) avec deux différents niveaux de degré de calcification. Les auteurs ont trouvé que les
valeurs des propriétés élastiques augmentaient du type III au type I aussi bien pour les ostéons
pleinement minéralisés (EIII_minéralisé = 64,4 ± 18,4 Kg/cm2, EI_minéralisé = 94,9 ± 16,6 Kg/cm2)
que pour ceux en début de minéralisation (EIII_ non minéralisé = 49 ± 15,2 Kg/cm2, EI_ non minéralisé =
73,6 ± 5,6 Kg/cm2). L’intervalle de valeur trouvé pour les ostéons en début de minéralisation
est inférieur à celui obtenu pour les ostéons pleinement minéralisés (Ascenzi et Bonucci,
1968).
Les tests en tension ont été réalisés sur différents types d’ostéons secs et humides extraits de
fémurs humains (30 ans) avec deux niveaux de minéralisation. Les ostéons secs présentent
des propriétés mécaniques plus élevées (EIII_sec minéralisé = 238,6 ± 71,2 Kg/cm2,
EIII_humide minéralisé = 119,4 ± 59 Kg/cm2) et le degré de minéralisation augmente les propriétés
élastiques (EIII_sec minéralisé = 238,6 ± 71,2 Kg/cm2, EIII_sec non minéralisé = 203,9 ± 76,4 Kg/cm2
(Ascenzi et Bonucci, 1967).
Les tests en torsion (Ascenzi et coll., 1994) appliqués à des ostéons fémoraux pleinement
minéralisés montrent que le module de cisaillement pour les ostéons de type III
(G=23,15±7,74GPa) est supérieur à celui des ostéons de type II (G=17,7±3,35GPa) (Ascenzi
et coll., 1994).
Les propriétés mécaniques en flexion des ostéons de types II et III (Ascenzi et coll., 1990) ont
montré que les propriétés mécaniques des ostéons de type II (E=2,69±0,93GPa) étaient
supérieures à celles de type III (E=2,32±1,20GPa).
Selon les auteurs, les structures alternées semblent être plus résistantes aux contraintes en
flexion.
21
Pour résumer, tous ces tests réalisés à l’échelle de l’ostéon ont montré que chaque type
d’ostéons avait des propriétés mécaniques bien spécifiques dépendant de l’orientation des
fibres de collagène qui supportent différentes contraintes externes.
Notons le changement d’unité utilisé par Ascenzi et coll. entre 1967-1968 (Kg/cm2) et 1990-
1994 (GPa) pour caractériser les propriétés mécaniques d’ostéons. Il faudrait multiplier les
valeurs affichées en Kg/cm2 par un facteur 105 pour les convertir en unité Pascal (Pa).
B - 1 - 2 Technique par ultrason en immersion et réflexion
La technique du microscope acoustique à haute fréquence 400MHz et 600MHz permet
d’obtenir des images acoustiques de la microstructure (ostéons, travée) avec une résolution de
2,5µm (Bumrerraj et Katz, 2001, Eckardt et Hein, 2001, Katz et Meunier, 1993). Cette
technique permet d’observer la distribution spatiale des impédances acoustiques reflétant les
distributions spatiales des propriétés microstructurales.
Figure 15 : Représentation de la structure haversienne (600MHz) (Katz et Meunier, 1993)
22
Microscope optique
Vidéo caméra
indentateur
échantillon
B - II Lamelles osseuses
Les premiers travaux de recherche réalisés sur les propriétés mécaniques de lamelles
d’ostéons dites épaisses (largeur des lamelles supérieure à 3µm) furent réalisés par Rho et
coll., 1997 en utilisant la technique de nanoindentation figure 16. Cette technique consiste à
faire un test mécanique cyclique de compression dans la direction axiale sur une lamelle
osseuse.
Figure 16 : Technique d’indentation La réponse du matériau (la lamelle) est visualisée en temps réel et le module d’Young E
(GPa) est calculé à partir de l’élasticité S (µN/nm) (mesurée expérimentalement) et l’aire de
contact A (nm2) :
A
SE ×=2π Equation 5
Cette technique expérimentale sera plus amplement détaillée dans le chapitre suivant.
Les modules d’Young des lamelles d’ostéons et des lamelles interstitielles ont été mesurés sur
différents types d’os (fémur, tibia) et sur différents tissus osseux (cortical, spongieux) (Fan et
coll., 2002, Hengsberger et coll., 2002, Oliver et Pharr, 1992, Rho et coll., 1997, Rho et coll.,
1998, Rho et Pharr, 1999, Rho et coll., 2002). Les valeurs des lamelles interstitielles sont
significativement supérieures de (2GPa) par rapport aux lamelles des ostéons secondaires (19-
22,5GPa). L’intervalle de valeur trouvé pour la dureté des lamelles osseuses varie de 0,42GPa
à 0,65GPa (Rho et coll., 1998, Rho et coll., 1999). Selon l’étude menée par Rho et Pharr,
1999 il a été démontré que les propriétés mécaniques des échantillons testés dans un état sec
augmentaient de 9% à 16%.
Les propriétés élastiques des lamelles osseuses au sein d’un même ostéon varient de 2 ± 0,13
GPa suivant la direction radiale (du canal de Havers vers la ligne cémentante). En effet, cette
étude a montré que les propriétés élastiques des lamelles d’ostéons diminuaient du centre
(canal de Havers) vers l’extérieur (ligne cémentante) de l’ostéon (Rho et coll., 1999).
23
Précisons que ce dernier résultat qui a été obtenu sur un total de 5 ostéons nécessiterait une
augmentation du nombre d’échantillons afin de confirmer cette variation de minéralisation.
Les travaux de Martin, 1993 fondés sur un modèle à éléments finis représentant les
différences de minéralisation au sein d’un ostéon ont également montre également une
diminution de la minéralisation du centre vers l’extérieur de l’ostéon. Cependant, les travaux
de Paschalis et coll., 1996 utilisant une méthode par micro spectroscopie infra rouge a obtenu
une augmentation de la densité minérale de l’extérieur vers l’intérieur de l’ostéon avec un
plateau de minéralisation à 50-60µm du centre de l’ostéon. Le détail anatomique des lamelles
osseuses reste alors encore un sujet de débat.
Les propriétés mécaniques des lamelles d’ostéons varient également suivant la localisation
anatomique. En effet les travaux de Zysset et coll., 1999 ont montré que les paramètres
mécaniques (modules d’Young et dureté) étaient inférieurs dans la région du col fémoral
(15,8GPa) comparé à ceux mesurés au milieu de la région diaphysaire (19,1GPa). Cette
observation peut expliquer la fragilité du col fémoral à l’échelle macroscopique.
Différentes catégories de lamelles osseuses (épaisses et fines) ont été sélectionnées afin de
subir des tests de compressions dans différentes conditions expérimentales (variation de la
profondeur d’indentation) et physiologiques (sec ou humide) (Hengsberger et coll., 2002) ; les
propriétés mécaniques des lamelles d’ostéons dites épaisses sont supérieures de (2GPa) pour
de faibles profondeurs d’indentations (0,4mN) alors qu’à de grandes profondeurs
d’indentations (5mN) les lamelles dites fines sont supérieures de 2,5GPa. Le résultat reste le
même, quelles que soient les conditions physiologiques. Selon les auteurs, les lamelles
épaisses et fines qui constituent l’ostéon auraient des contenus différents en collagène et
cristaux d’apatite.
La question de l’influence de l’âge sur les propriétés élastiques des lamelles d’ostéons a été
analysée par Rho et coll., 2002 qui a conclu qu’aucune différence significative des propriétés
élastiques n’a été observée entre des populations jeunes (à 42 ans E = 21,9GPa) et âgées (à 70
ans E = 22,1GPa), vraisemblablement du fait d’un faible nombre d’échantillons testés.
C Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical humain Les techniques mécaniques et ultrasonores représentent les deux grandes catégories de tests
qui permettent de mesurer les propriétés mécaniques et acoustiques de l’os.
24
Les techniques mécaniques (Yoon et Katz, 1976, Van Buskirk et coll., 1981, Ashman et
coll., 1984, Rho et coll., 1999) sont des tests :
1) invasifs au-delà du point de rupture pour l’échelle macroscopique et également invasifs à
l’échelle de la microstructure où des empreintes d’indentations sont visibles après des
tests de compression.
2) qui nécessitent des dimensions spécifiques d’échantillons testés aux échelles
macroscopique et microscopique.
3) qui imposent des conditions expérimentales standard et souvent difficiles à mettre en
œuvre à cause de l’hétérogénéité de la structure osseuse.
4) qui ne permettent pas de mesurer l’anisotropie au sein d’un même échantillon à l’échelle
macroscopique.
Les techniques ultrasonores (Ashman et coll., 1984, Meunier et coll., 1988, Ho Ba Tho et
coll. 1991) sont des tests :
1) peu invasifs quelle que soit la technique ultrasonore utilisée
2) ne nécessitant pas de dimension spécifique des échantillons ; ils peuvent être de formes
cubiques ou cylindriques mais la longueur d’onde ultrasonore doit être supérieure ou
inférieure aux dimensions transversales de l’échantillon.
3) dont l’anisotropie peut être déterminée au sein du même échantillon.
technique Auteurs E3 (GPa)
Ultrason transmission Ashman et coll., 1984
Ho Ba Tho et coll., 1991
Bensamoun et HoBaTho, 2002
20
19,8
21
Echelle macroscopique
Mécanique compression Reilly et Burstein, 1975 17,7
Echelle microscopique
Ostéon (type II)
lamelle
Mécanique Tension
Mécanique compression
Mécanique flexion
Mécanique torsion
Nanoindentation
Ascenzi et Bonucci, 1967
Ascenzi et Bonucci, 1968
Ascenzi et coll., 1990
Ascenzi et coll., 1994
Rho et coll., 1997…2002
Zysset et coll., 1999
11,7
6, 3
2,3
22,7
[19 – 22,5]
19,1
Tableau 1 : Récapitulatif des modules d’Young axiaux trouvés dans la littérature sur os
cortical aux échelles macroscopique et microscopique.
25
III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES
MORPHOLOGIQUES DE L’OS CORTICAL HUMAIN
III - 1 Les techniques utilisées
III - 1 - 1 Micro – radiographie
Des coupes de 100µm d’épaisseur sont réalisées grâce à un microtome. Des
microradiographies de ces sections osseuses sont réalisées avec un tube à rayon X. Le film
est ensuite développé afin d’étudier les propriétés morphologiques sur ces photographies.
Figure 17 : Image microradiographique du cortex de la mi-diaphyse fémorale (Bousson, 2001)
III - 1 - 2 Micro-tomographie
La détermination des propriétés morphologiques nécessite une très haute résolution spatiale.
Pour rappel, l’os cortical a des canaux de Havers de diamètres compris entre 20µm et 70µm ;
les tomographes cliniques qui ont une résolution de l’ordre de 500µm sont donc incapables de
détecter la structure haversienne de l’os cortical.
Des microtomographes composés de tubes à rayon X ont alors été développés avec une
résolution de 14µm (Ruegsegger et coll., 1996, Muller et Ruegsegger, 1997, Hildebrand et
Ruegsegger, 1997) et 7,81µm (Lemineur et coll., 2002) afin de caractériser la micro
architecture osseuse. La microtomographie par rayonnement synchrotron (Peyrin et coll.,
1997) permet d’atteindre des résolutions spatiales qui peuvent être inférieures à 1µm avec un
haut rapport signal sur bruit. La quantification des paramètres morphologiques se fait le plus
26
souvent à partir des images 2D acquises sur l’échantillon qui est placé sur un système rotatif.
Les méthodes de reconstruction en 3D (Peyrin et coll., 1997) de l’échantillon permettent
d’accéder à des informations tridimensionnelles tel que l’analyse 3D du degré de
minéralisation.
Figure 18 : Image microtomographique 3D d’une zone d’excès de minéralisation matricielle
(Bousson, 2001)
III - 1 - 3 Les logiciels de calcul des paramètres morphologiques
De nombreux logiciels de calcul des paramètres morphologiques existent actuellement sur le
marché : OPTILAB (Graftek, France), VISIOLAB 5000 (Biocom, France), Qwin IM1000
(Leica, UK).
Chaque logiciel est adapté et modifié en fonction des paramètres morphologiques
sélectionnés.
III - 2 Les paramètres morphologiques
Les propriétés morphologiques de l’os cortical ont fait l’objet de peu d’études comparé à l’os
spongieux dont les paramètres morphologiques ont été définis dans plusieurs études
(Destresse, 1998) ; en effet l’os spongieux subit en premier des modifications morphologiques
importantes lors de pathologies et sa structure trabéculaire permet de quantifier ces
transformations.
27
III – 2 -1 La porosité La porosité est définie comme étant le pourcentage de l’aire occupée par les pores de l’os
cortical. La porosité de l’os cortical correspond aux différents canaux nourriciers de l’os tels
les canaux de Havers et de Volkman mais il n’est pas pris en compte les lacunes ostéocytaires
et les canalicules. La porosité est généralement quantifiée à l’aide d’un logiciel de comptage
sur des coupes histologiques fines.
L’étude de Currey et coll., 1988 a conclu que 80% de la variation d’élasticité de l’os cortical
était due à la porosité et à la fraction volumique égale à « 1-Porosité » (cf. p.91) ; de plus une
relation cubique a été trouvée entre le module d’Young et les paramètres porosité et contenu
minéral. Les travaux de Schaffler et Burr, 1988 ont également montré une forte corrélation
(r2 = 0,86) entre l’élasticité de l’os et la fraction volumique.
La distribution intracorticale de la porosité a également été reliée à l’âge des personnes. En
effet les travaux de Bousson et coll., 2001 ont montré que pour des personnes âgées de 60 ans
ou pour de jeunes personnes, à la fois la taille des pores et le nombre de pores augmentaient
avec l’âge, alors que pour des personnes de plus de 60 ans la taille des pores continue à
augmenter mais le nombre de pores diminue.
IV SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
L’étude bibliographique a présenté les différentes techniques mécaniques et ultrasonores qui
permettent de caractériser les propriétés mécaniques de l’os cortical. Ainsi, le chapitre suivant
détaillera les différentes techniques ultrasonores (en contact et en immersion) qui seront
utilisées pour déterminer les propriétés acoustiques et élastiques de l’os cortical à l’échelle
macroscopique. La caractérisation de l’échelle microscopique de l’os cortical (les lamelles
osseuses) se fera au moyen d’une technique mécanique (nanoindentation) qui sera analysée
dans le chapitre suivant.
L’analyse des propriétés morphologiques de l’os cortical a très peu été étudiée dans la
littérature par rapport à l’os spongieux. Le chapitre suivant met en avant les différentes
techniques d’analyse morphologique qui seront utilisées afin de caractériser les propriétés
morphologiques de l’os cortical.
La corrélation des propriétés morphologiques et mécaniques sera présentée au chapitre III.
28
29
Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques
du tissu cortical humain
I MATERIELS
Les propriétés acoustiques et mécaniques de différents matériaux vont être caractérisées dans
cette étude. Tout d’abord des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical seront
utilisés puis des sections fémorales serviront à déterminer la distribution spatiale des
propriétés acoustiques.
I - 1 Echantillons cubiques
Des échantillons d’os cortical (figure 1) ont été découpés sur un fémur (côté droit) humain
noté F1 parallèlement à l’axe de la partie supérieure de la diaphyse entre 16% et 40% (sur une
longueur de 8cm) de la longueur totale du fémur dans les zones latérale et médiale. La
technique de découpe est identique à celle utilisée par Ashman et coll., 1984. Ces échantillons
(N = 10) sont de forme cubique (5x5x5mm) et avaient déjà fait l’objet d’une étude menée par
Ho Ba Tho et coll., 2001 (Taylor et coll., 2002).
I - 2 Echantillons parallélépipédiques
Deux fémurs humains (F2 et F3) ont été prélevés sur deux cadavres humains, âgés de 70 ans,
du laboratoire d’Anatomie du Centre Hospitalier Universitaire d’Amiens.
Le deuxième fémur (côté droit) noté F2 (figure 1) a été découpé en plusieurs sections entre
40% et 70% de la longueur totale du fémur (sur une longueur de 10cm) avec une scie
diamantée (MICROCUT 2) dans la direction transverse. A partir de chaque section, des
échantillons parallélépipédiques 15x5x4mm (N = 32) sont découpés à la scie diamantée dans
les régions latérale, médiale et postérieure. Le disque de la scie est maintenu à une vitesse
faible et il est humidifié pendant toute la durée de la découpe afin de ne pas échauffer les
échantillons.
30
Le troisième fémur (côté gauche) noté F3 (fig.1) a également été découpé en plusieurs
sections dans la partie inférieure de la diaphyse entre 55% et 70% de la longueur totale du
fémur (ce qui correspond à une longueur de 5,5cm). La technique de découpe est identique à
celle pratiquée sur le fémur F2 et des échantillons parallélépipédiques (15x5x4mm N = 18)
sont découpés parallèlement à l’axe de la diaphyse dans les régions latérale, médiale et
postérieure.
Figure 1 : Localisation anatomique des échantillons
I - 3 Sections fémorales
Une section fémorale du fémur F1 a été récupérée d’une précédente étude de Ho Ba Tho et
coll., 2001.
Des sections fémorales ont été découpées (figure 2) à la scie diamantée sur le fémur F2 (N=4)
et F3 (N = 4) entre les échantillons parallélépipédiques (figure 2). L’identification des
sections fémorales du fémur F2 est reliée à la longueur totale du fémur de la partie proximale
à la partie distale : section 1 (45%), section 2 (50%), section 3 (56%) et section 4 (60%) ; de
même les sections fémorales du fémur F3 sont situées à 56%, 61%, 65% et 70% de la
longueur totale du fémur.
3. Direction axiale
1. Direction Radiale
2. Direction Tangentielle
F1
8cm
F2
10cm
F3
5.5cm
31
L’épaisseur moyenne de ces sections est de l’ordre de 2,09mm ± 0,27mm. Les mesures
d’épaisseur ont été réalisées avec un micromètre numérique (Mitutoyo) dont la précision est
de 0,01mm et le diamètre de la pointe est de 3mm. Un total de 12 mesures a été réalisé en
périphérie de la section. La distribution spatiale des vitesses permettra de vérifier le
parallélisme des faces des sections fémorales.
Les échantillons parallélépipédiques ainsi que les sections fémorales seront stockés dans une
solution de chlorure de sodium à 0,9%.
Figure 2 : Localisation anatomique des sections fémorales ainsi que les échantillons parallélépipédiques appartenant au fémur F2
3P
3M 3L
1P
1M 1L
2P
2M 2L
1
2
3
4
0P
0M 0L
3 Direction axiale
1 Direction Radiale
2 Direction Tangentielle
40%
70%
32
II METHODES
II - 1 Théorie
La caractérisation des propriétés mécaniques de l’os cortical sera réalisée au moyen de
techniques par ultrason qui sera détaillée dans la partie suivante ; la propagation des ondes
ultrasonores à travers les solides peut se faire de deux manières différentes (figure 3) :
- Les ondes peuvent se propager de manière longitudinale (aussi appelées « ondes de
compression ») : le mouvement des particules est parallèle à la direction de
propagation de l’onde.
- Les ondes peuvent se propager de manière transversale (aussi appelées « ondes de
cisaillement »), caractérisées par un mouvement des particules qui est transversal par
rapport à la direction de propagation de l’onde.
a) b)
Figure 3 : Propagation d’ondes longitudinales (a) et transversales (b) (Destresse, 1998)
II – 1 - 1 Loi de Hooke
La loi de Hooke décrit un matériau dont le comportement est élastique linéaire :
ECT klijklij ×= Equation 1
Tij : tenseur des contraintes,
Cijkl : tenseur d’élasticité
Ekl : tenseur de déformation
33
L’équation 1 peut également s’écrire de la façon suivante :
εσ jiji C ×= Equation 2
σi : matrice des contraintes
Cij : matrice des coefficients élastiques
εj : matrice des déformations
L’observation des différentes contraintes agissant sur un parallélépipède est représentée
figure 4.
Figure 4 : Représentation des différentes contraintes agissant sur six faces du parallélépipède
La loi de Hooke généralisée peut alors s’écrire :
σxx = C11εxx + C12εyy + C13εzz + C14εyz + C15εzx + C16εxy Equation 3
. . . . . . .
. . . . . . .
. . . . . . .
. . . . . . . σxy = C61εxx + C62εyy + C63εzz + C64εyz + C65εzx + C66εxy
La matrice des coefficients élastiques Cij est symétrique, le nombre de coefficients
indépendants est alors réduit à 21.
34
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
=
CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
Cij
666564636261
565554535251
464544434241
363534333231
262524232221
161514131211
Equation 4
II – 1 - 2 Matériau orthotrope
Un matériau orthotrope est un matériau élastique homogène présentant en tous points une
symétrie du comportement mécanique, chacune par rapport à un plan, les deux plans étant
orthogonaux. La matrice des coefficients élastiques est alors constituée de 9 coefficients
indépendants :
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
=
CC
CCCCCCCCCC
Cij
66
55
44
333231
232221
131211
000000000000000000000000
Equation 5
La relation contrainte–déformation est donnée sous la forme d’une matrice de compliance Sij :
σε jiji S ×= Equation 6
[ ]C
G
G
G
EEE
EEE
EEE
S ijij
1
12
31
23
32
23
1
13
3
32
21
12
3
31
2
21
1
100000
010000
001000
0001
0001
0001
−=
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
−−
−−
−−
=
νν
νν
νν
Equation 7
Ei : module d’Young dans la direction i (3 modules d’élasticité indépendants)
νij : coefficient de Poisson dans la direction i et j (3 coefficients de Poisson indépendants)
Gij : module de cisaillement dans le plan ij (3 modules de cisaillement indépendants)
35
II – 1 - 3 Matériau isotrope transverse
Un matériau isotrope transverse est un cas particulier d’un matériau orthotrope ; en effet on
dit qu’un matériau est orthotrope si tout plan passant par un axe de symétrie est un plan de
symétrie mécanique. La matrice des coefficients élastiques est alors réduite à 5 coefficients
indépendants car :
C11 = C22 C13 = C23 C44 = C55 ( )CCC 121166 21
−×=
La matrice des coefficients élastiques est alors sous la forme suivante :
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
=
CC
CCCCCCCCCC
Cij
66
44
44
331313
132212
131211
000000000000000000000000
Equation 8
La matrice de compliance Sij s’écrit :
( )
[ ]C
E
G
G
EEE
EEE
EEE
S ijij
1
31
13
3
1313
3
31
3
31
1200000
010000
001000
0001
0001
0001
−=
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
+
−−
−−
−−
=
ν
νν
νν
νν
Equation 9
II - 1 - 4 Matériau isotrope
Un matériau est isotrope si tout plan passant par un axe quelconque est un plan de symétrie
mécanique. Ainsi, les propriétés mécaniques d’un matériau isotrope sont définies uniquement
par deux constantes indépendantes appelées coefficients de Lamé et sont notées λ et µ
définies par :
λ = C12 = C13 = C21 = C23 = C31 = C32 Equation 10
µ = C44 = C55 = C66 Equation 11
λ + 2µ = C11 = C22 = C33 Equation 12
36
La matrice des coefficients élastiques s’écrit :
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
−
−
−=
200000
02
0000
002
000
000
000
000
1211
1211
1211
111212
121112
121211
CC
CC
CCCCC
CCC
CCC
Cij
Equation 13
La matrice de compliance Sij s’écrit :
( )
( )
( )
[ ]C
E
E
E
EEE
EEE
EEE
S ijij
1
13
1200000
0120000
0012000
0001
0001
0001
−=
⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
+
+
+
−−
−−
−−
=
ν
ν
ν
νν
νν
νν
Equation 14
Le comportement élastique d’un milieu isotrope est défini par les λ etν, et on en déduit :
( )µλ
µλµ++
=23E Equation 15
ν
µ22 +
==EG Equation 16
( )µλλν+
=2
Equation 17
37
II - 1 - 5 Propagation d’une onde dans un milieu élastique illimité
Le terme illimité signifie que les dimensions transversales de l’échantillon sont très grandes
devant la longueur d’onde de l’onde ultrasonore qui se propage à travers le matériau en
obéissant à la loi fondamentale de la dynamique :
tudiv i
ij ∂∂= 2
2
ρσ Equation 18
σij : Tenseur des contraintes u : Vecteur de déplacement ρ : Masse volumique du matériau La résolution de l’équation 18 permet d’obtenir les relations entre les vitesses de propagation
de l’onde ultrasonore et les coefficients élastiques. Dans le cas d’un matériau orthotrope les
relations sont les suivantes :
VC 2
1111 ρ=
VC 2
2222 ρ=
VC 2
3333 ρ=
VVC 2
32
2
2344 ρρ ==
VVC 2
31
2
1355 ρρ == Equation 19
VVC 2
21
2
1266 ρρ ==
( )( ) CVCCVCCC 66
2
12/126622
2
12/1266111222 −−+−+= ρρ
( )( ) CVCCVCCC 55
2
13/135533
2
13/1355111322 −−+−+= ρρ
( )( ) CVCCVCCC 44
2
23/234433
2
23/2344222322 −−+−+= ρρ
Vii : Vitesse de l’onde longitudinale se déplaçant dans la direction i
Vij : Vitesse de l’onde transversale se déplaçant dans la direction i avec un déplacement des particules dans la direction j
Vij/k:Vitesse de l’onde transversale se déplaçant dans la direction 2ji + avec un déplacement
des particules dans la direction 2ji −
Vij/ij : Vitesse de l’onde longitudinale se déplaçant dans la direction 2ji + avec un
déplacement des particules dans le plan ij.
38
II – 1 – 5 - 1 Application à l’os cortical
Les travaux de recherche de Van Buskirk et coll., 1981 ont développé un échantillon cubique
composé de 12 arêtes biseautées (figure 5) permettant ainsi de déterminer 18 vitesses de
propagation de l’onde ultrasonore à travers cet échantillon. Les relations ci-dessus permettront
de calculer les coefficients de la matrice d’élasticité grâce aux vitesses de propagation de
l’onde dans les différentes directions.
Figure 5 : Echantillon cubique coupé à 45° (Ho Ba Tho et coll., 2001)
Les vitesses de propagation mesurées dans cette étude ne se feront que dans la direction
longitudinale. Les vitesses qui se propagent dans un milieu illimité sont appelées des
« vitesses Bulk » et sont reliées à l’élasticité du matériau par la relation :
ρ
CV ijBulk
ij= Equation 20
Dans cette étude Vij sera égale à V33.
II - 1 - 6 Propagation d’une onde dans un milieu élastique limité
Le terme limité signifie que les dimensions transversales de l’échantillon sont inférieures
devant la longueur d’onde de l’onde ultrasonore.
La loi fondamentale de la dynamique sera modifiée selon la théorie suivante :
On considère une barre homogène de section A de module d’élasticité E et de cisaillement G.
La contrainte (σ) agissant sur un élément de la barre est représentée (figure 6) :
Figure 6 : Contrainte (σxx) agissant sur un élément (A) de la barre
A σxx
Ox
39
L’élément A subit des contraintes σxx selon l’axe (Ox) et son déplacement longitudinal est
donné par u(x,t). Dans un milieu limité les conditions aux limites et les effets de bords sont à
considérer. Dans le cas présent, on suppose que la barre est homogène impliquant alors
l’absence de force de volume et si on néglige les effets d’inerties latérales alors l’équation de
propagation de l’onde dans une barre est donnée par la relation suivante :
tuEE x
xxxx 2
2
∂∂== εσ Equation 21
L’équation fondamentale de la dynamique devient :
tu
xuE xx
2
2
2
2
∂∂
∂∂ = ρ Equation 22
La résolution de cette équation correspond à la vitesse de propagation d’une onde
longitudinale :
ρEV L
= Equation 23
Par analogie la propagation d’une onde transversale est :
ρGV T
= Equation 24
II – 1 – 6 - 1 Application à l’os cortical
Le mode de propagation de l’onde ultrasonore à travers un échantillon d’os cortical dans un
milieu limité est appelé « mode barre longue ». L’échantillon d’os cortical doit avoir une
petite section devant la dimension de la longueur d’onde et sa structure doit être considérée
comme homogène.
La relation entre les propriétés acoustiques et élastiques du matériau est obtenue en résolvant
l’équation :
VE iij
2ρ= Equation 25
40
Les vitesses de propagation de l’onde (appelées « vitesses Bar » en milieu limité) à travers des
échantillons d’os cortical présentées dans cette étude ne seront mesurées que dans la direction
longitudinale (i = j = 3) :
ρEV Bar 33
33 = Equation 26
Pour résumer,
- Dans un milieu limité, les dimensions de l’onde de propagation doivent être
supérieures à la dimension transversale de l’échantillon. L’onde a alors un
comportement homogène macroscopique qui ne sera pas influencé par les
discontinuités du milieu.
- Dans un milieu illimité, les dimensions de l’onde de propagation doivent être
inférieures à la dimension transversale de l’échantillon. L’onde n’a plus un
comportement macroscopique mais microscopique impliquant une analyse de la
microstructure (pores).
41
II - 2 Mesures expérimentales
II - 2 - 1 Détermination des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical
II - 2 - 1 - 1 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en contact
La technique ultrasonore par transmission représentée figure 7 a été développée au laboratoire
de biomécanique de l’Université de Compiègne afin de mesurer les vitesses de propagation de
l’onde à travers l’échantillon osseux et de mesurer les propriétés élastiques de l’os cortical.
Cette technique est similaire à celle développée par Ashman et coll., 1984. Un couple de
capteurs (Panametrics V106RB et V1011RB) est utilisé soit en haute fréquence (2,25MHz)
soit en basse fréquence (75KHz). Un générateur (HP 3312A) envoie une impulsion qui excite
le premier transducteur piézo-électrique dont le rôle est de transmettre une onde ultrasonore à
une fréquence qui lui est propre. L’onde est ensuite propagée à travers l’échantillon (cubique
– parallélépipédique) et est reçue par le second transducteur qui a la même fréquence de
résonance que le premier transducteur. Le récepteur convertit l’onde ultrasonore en tension
afin de pouvoir la visualiser en sortie sur un oscilloscope (Tektronics TDS 3032). Le temps de
propagation de l’onde à travers l’échantillon est directement mesuré à l’oscilloscope comme
étant la différence de temps entre le début du signal d’entrée et de sortie. La vitesse de
propagation de l’onde est ensuite déduite du rapport entre la longueur de l’échantillon (« L »)
et le temps de propagation de l’onde (« t ») :
Figure 7 : Schéma du montage expérimental du banc de test ultrasonore par transmission
(Ho Ba Tho et coll., 1991)
L
specimen
75 kHz-2,25MHz capteurs
Générateur d’impulsionst
V =Lt
(mm) (µs)
OSCILLOSCOPE
impulsion
réponse
t : temps de parcours
42
Les propriétés élastiques (modules d’Young et coefficients élastiques) peuvent être mesurées
dans les trois directions principales (axiale, tangentielle et radiale) en intervertissant les faces
de l’échantillon (figure 8) en contact avec les transducteurs. Dans cette étude il ne sera mesuré
que les directions axiales des différents échantillons.
Figure 8 : Représentation des trois directions de propagation de l’onde
a) Mesure des vitesses de propagation avec des transducteurs hautes fréquences (2,25 MHz)
Les vitesses longitudinales obtenues avec de hautes fréquences (VBulk) sont comprises entre
3600m/s et 4200m/s (Ashman et coll., 1984 ; Ho Ba Tho et coll., 1991). La longueur d’onde
(λ) est alors de 2mm. La propagation de l’onde se fera dans un milieu illimité si les
échantillons possèdent des dimensions transversales qui seront supérieures à la longueur
d’onde. On peut ainsi en déduire les valeurs des coefficients élastiques des échantillons
osseux qui seront mesurés dans la direction axiale :
VC L
2
33 ×= ρ Equation 27
ρ est la masse volumique (Kg/m3), VL (m/s) la vitesse de propagation dans la direction axiale
et C33 correspond aux coefficients élastiques (Pa) de l’os cortical dans la direction axiale.
V11
V33 Direction axiale
3
Direction tangentielle
2
1Direction radiale
V22
43
b) Mesure des vitesses de propagation avec des transducteurs basses fréquences (75 KHz)
Les vitesses longitudinales (VBar) obtenues avec des capteurs basses fréquences à 75KHz sont
comprises entre 3000m/s et 3500m/s (Ashman et coll., 1984). La longueur d’onde (λ) est de
l’ordre de 45mm, et cette longueur est largement supérieure aux dimensions transversales des
échantillons osseux :
La propagation de l’onde se fait alors dans un milieu limité (mode « barre longue ») et les
propriétés élastiques du matériau sont directement reliées aux vitesses de propagation de
l’onde par la relation :
VE 2
3333 ×= ρ Equation 28
ρ est la masse volumique (Kg/m3), V33 (m/s) la vitesse de propagation dans la direction axiale
et E33 est le module d’Young du milieu traversé dans la direction axiale.
44
II – 2 – 1 - 2 Technique ultrasonore en transmission avec des capteurs en immersion
Cette technique ultrasonore en transmission (figure 9) installée au laboratoire Roberval
(CNRS-UMR 6600) agit en mode échographique permettant de caractériser la distribution
spatiale des propriétés acoustiques sur les sections fémorales.
Un générateur (bande passante de 40MHz) (Sofranel 5052) émet des impulsions électriques
qui sont transmises au transducteur piézo-électrique. Le signal électrique est alors converti en
une onde acoustique.
Le transducteur à immersion est caractérisé premièrement par sa forme et deuxièmement par
ses paramètres intrinsèques. Deux types de transducteurs ont été utilisés : des transducteurs
plans à immersion et des transducteurs focalisés à immersion.
Le transducteur focalisé à immersion est de forme sphérique ; les fréquences utilisées sont
5MHz et 10MHz (Panametrics A308R et KB-Aerotech D14835) avec des distances focales de
75mm et des diamètres de tache focale de l’ordre de 1,24mm. La longueur d’onde à 5MHz et
10MHz est respectivement de 0,8mm et 0,4mm. Le transducteur plan émet des ondes
longitudinales aux fréquences de 5MHz et 10MHz (Panametrics V309 et Panametrics V311).
Figure 9 : Technique ultrasonique en transmission avec des capteurs en immersion
eau pilotage X-Y-Z
Table antivibration (Microcontrol MM2500)
Section fémorale
Transducteur focalisé 5MHz et 10MHz
Ordinateur
Generateur (Sofranel 5052) (S f l 5052
Oscilloscope (LeCroy 9410)
45
Une partie de l’onde acoustique est réfléchie sur le transducteur à immersion qui agit cette
fois-ci comme récepteur et retransforme l’onde acoustique en signal électrique afin de
mesurer les vitesses acoustiques dans la direction axiale sur chaque section fémorale.
Le transducteur est translaté automatiquement par un logiciel MICROXYZ (Controller Driver
MM 2500 Version 2,0) développé au sein du laboratoire Roberval afin d’obtenir plusieurs
mesures en surface des sections osseuses. Le transducteur est déplacé dans les directions X, Y
et Z par ordinateur avec une précision respective de 1µm, 0,1µm et 1µm et un pas de
déplacement de 0,5mm. La première étape a été d’utiliser le logiciel MICROXYZ pour régler
le parallélisme entre la surface du transducteur et le fond de la cuve ; ensuite le transducteur
est translaté suivant l’axe Z afin de focaliser le signal sur la surface osseuse. Un balayage
automatique est effectué suivant les directions X et Y avec un pas de 0,5mm. Chaque section
fémorale issue de F1, F2 et F3 est placée au fond d’une cuve disposée sur une table anti-
vibration et remplie d’eau déminéralisée à une température de 20°C. En chaque point
d’acquisition, deux échos sont enregistrés : le premier entre l’eau et le matériau (écho 1) et le
deuxième entre le matériau et l’eau (écho 2) figure 10.
Figure 10 : Représentation des échos à travers la section osseuse
Les acquisitions ont été moyennées (n=10) afin d’obtenir un signal de meilleure qualité. Le
nombre de points d’acquisition varie entre 1460 et 1734. Le temps (« t ») de propagation entre
les deux échos est mesuré avec un logiciel CACTUS (« CarACterisation of an ultrasonic
transducer) développé au sein du laboratoire Roberval afin de mesurer la vitesse (m/s)
écho 1 écho 2
écho 1
écho 2
t(µs)
Amplitude
mm
46
moyenne représentant toute la surface de la section. Cette vitesse est déterminée par le rapport
entre l’épaisseur (« e ») de la section et le temps de propagation (µs) entre les deux échos :
t
eV×
= 2 Equation 29
La représentation des lignes iso acoustiques est visualisée avec le logiciel Matlab qui permet
d’obtenir une cartographie de couleurs représentant la distribution spatiale des vitesses
longitudinales.
Des régions d’intérêts ont été définies par des carrés de 3mm localisés dans les régions
postérieure, latérale et médiale.
La reproductibilité de l’expérience (placement des échantillons et mesures de vitesses) a été
quantifiée en refaisant trois fois l’expérience depuis le début.
II - 2 - 1 - 3 Mesure de la masse volumique
Deux types de masse volumique existent :
- La masse volumique apparente correspond au rapport de la masse de la matrice osseuse
par le volume global de l’échantillon obtenu à partir de ses dimensions externes.
- La masse volumique réelle correspond au rapport de la masse de la matrice osseuse par
le volume occupé uniquement par la matrice osseuse. Cette masse volumique n’est
mesurée que lorsqu’on étudie l’os spongieux ; en effet dans le cas de l’os cortical, le
volume occupé par la matrice osseuse est largement supérieur à la porosité contrairement
à l’os spongieux qui a une porosité importante.
Les échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical ont été séchés sur du papier
absorbant avant que la masse volumique apparente soit calculée. La masse des échantillons a
été mesurée au moyen d’une balance digitale (Sartorius BP61S) dont la précision est de
0,1mg. Le volume des échantillons a été calculé avec les dimensions des échantillons qui sont
mesurées avec un micromètre (Mitutoyo, 293, Japan) dont la précision est de 0,01mm.
47
La masse volumique apparente est alors égale à :
VM
app=ρ Equation 30
ρapp étant la masse volumique apparente
M la masse de l’échantillon
V le volume de l’échantillon
II - 2 - 1 - 4 Calibration
La calibration des deux techniques ultrasoniques en transmission a été effectuée avec
différents matériaux isotropes tels que le cuivre, l’inox, plexi glass et le PVC.
Les vitesses théoriques de propagation des ultrasons, à travers ces matériaux, dans des milieux
illimité (transducteurs à hautes fréquences : 2,5MHz, 5MHz et 10MHz) et limité
(transducteurs à basses fréquences : 75KHz) sont connues de la littérature (Ashman et coll.,
1984). L’intervalle de vitesse théorique pour ces échantillons est compris entre 2680m/s et
5010m/s à haute fréquence et entre 2160m/s et 5000m/s à basse fréquence.
Chaque matériau a la même dimension avec un diamètre et une hauteur de 5x5mm.
II - 2 - 1 - 5 Analyse statistique
Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics (Sigma Plus) afin de déterminer
les variations des propriétés acoustiques et élastiques en fonction de la localisation
anatomique.
48
II - 2 - 2 Détermination des propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical
II - 2 - 2 - 1 Microscope électronique à balayage
Un microscope électronique environnemental à balayage (XL 30 ESEM Philips) a été utilisé
sous vide à 20KV avec un agrandissement de 45. Toutes les surfaces des échantillons
(cubiques et parallélépipédiques) ont été scannées avec un faisceau d’électrons afin d’avoir
une cartographie des électrons rétrodiffusés reflétant la minéralisation de la surface des
échantillons (figure 11a). Cette étude a été réalisée à l’Université de Memphis (Tennessee,
USA) au département : « Integrated Microscopy Center ». L’avantage de cette technique est
qu’aucun échantillon n’a dû subir de revêtement en surface.
a)
b)
Figure 11: Image filtrée (b) réalisée à partir de l’image originale en niveaux de gris (SEM) (a) sur la surface d’un échantillon osseux F2. Trois différents types d’ostéons sont sélectionnés : osteon blanc (89-107), 2: osteon gris (110-122) et 3: osteon noir (120-127).
Noir Gris Blanc
Blanc
Noir Gris
49
Toutes les images SEM ont été réalisées dans des conditions identiques (condition
physiologique, distance focale, pression). Ensuite, un filtrage des images SEM a permis
d’identifier trois types d’ostéons. Un histogramme de niveaux de gris (0-255) effectué sur les
images SEM originales a permis d’identifier qualitativement trois niveaux de gris (89-107,
110-122, 120-127) correspondant respectivement aux ostéons blancs, gris et noirs.
II - 2 - 2 - 2 Technique de nanoindentation
Les mesures du module d’Young ont été déterminées grâce à un test mécanique qui applique
des tests de compression à l’échelle de la microstructure. La technique de nanoindentation est
composée d’un indenteur de type Berkovich qui a une pointe pyramidale en diamant ainsi que
d’un microscope optique (figure 12).
Figure 12 : Représentation de l’association entre le microscope optique et l’indenteur
Toutes les régions qui seront indentées c'est-à-dire qui vont subir un test de compression sont
auparavant sélectionnées et mémorisées au moyen du microscope optique ; ensuite l’indenteur
est optiquement dirigé sur les régions qui doivent être indentées. Le test de compression est
un test cyclique qui est constitué de sept segments (figure 13) avec des chargements,
déchargements et un maintien de la force de compression pendant 10 secondes lorsque la
Indenteur Berkovich (pointe diamantée)
Echantillon d’os cortical
Microscope optique
50
charge est maximale. La viscoélasticité du matériau qui est représentée à travers un hystérésis
et pendant le fluage est alors réduite.
Figure 13 : Cycle de chargement appliqué par l’indenteur
La force maximale de compression est d’environ 2500µm et ceci implique une profondeur de
déformation du matériau qui est de l’ordre de 400nm (figure 14). Ceci provoque une
déformation radiale de l’ordre de 2,8µm (= 400nm x 7) (Hengsberger et coll. 2002).
Figure 14 : Réponse du matériau au test de compression
50% de la force maximale
95% de la force maximale
Pente = S tf
0
Déplacement (nm)
Forc
e (µ
N)
4
5
6
7
1 2
3
Premier cycle
Deuxième cycle
Troisième cycle
Temps (s)
Cha
rgem
ent (
µN)
51
L’élasticité du matériau sera mesurée expérimentalement dans la zone linéaire du dernier
déchargement (entre 50% et 95% de la force maximale appliquée) (figure 14).
Le module élastique E de l’échantillon est relié à l’élasticité (Stf) et à l’aire de contact (A) par
la méthode d’Oliver et Pharr 1992 :
122 11
2
−
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡ −+
−=×
EES
s
s
i
itf
Aννπ Equation 31
ν est le coefficient de Poisson et les indices s et i correspondent respectivement à l’échantillon
et à l’indenteur. L’indenteur est caractérisé par un module d’élasticité Ei = 1140GPa et un
coefficient de Poisson de l’ordre de νi = 0,07.
La dureté du matériau peut être mesurée comme étant le rapport entre la force maximale
(Fmax) appliquée et l’aire de contact (A).
A
FH max= Equation 32
L’équation 32 est généralement appliquée à l’échelle macroscopique pour des matériaux
homogènes isotropes mais l’os étant un matériau anisotrope le module d’Young calculé sera
considéré comme une moyenne des constantes élastiques anisotropes.
Les tests de nanoindentation ont été réalisés sur les trois types d’ostéons sélectionnés
précédemment et appartenant aux échantillons des fémurs F1, F2 et F3. Chaque indentation
est effectuée trois fois sur une même lamelle osseuse dite épaisse (Hengsberger et coll., 2002)
localisée à mi distance entre le canal de Havers et la ligne cémentante de l’ostéon (figure 15).
En effet, la lamelle localisée au centre de l’ostéon représente la valeur moyenne de toutes les
lamelles. Un total de 138 et 22 indentations a respectivement été réalisé sur les ostéons du
fémur 1 et du fémur 3 qui sont principalement constitués d’ostéons blancs. Le fémur 2 a subi
351 indentations, sur des échantillons secs, réalisés sur 61 ostéons blancs, 17 ostéons gris et
39 ostéons noirs. Une dizaine d’indentations par échantillons testés ont été produites sur les
lamelles interstitielles des échantillons appartenant à F1, F2 et F3. La reproductibilité a été
obtenue en ré exécutant le test de nanoindentation trois fois à trois moments différents.
52
Figure 15 : Localisation des indentations
II - 2 - 2 - 3 Calibration
La calibration a été réalisée avec de la silice qui est caractérisée comme un matériau élastique
isotrope. Ce matériau est utilisé pour calibrer la forme de la pointe de l’indenteur. La silice est
couramment utilisée pour ce type de calibration à cause du faible rapport entre le module
d’élasticité et la dureté.
II - 2 - 2 - 4 Analyse statistique
Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics 5,0 (Sigma Plus, Maryland,
USA) afin d’étudier la variation des propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) au sein d’une
même lamelle épaisse et entre les différents types d’ostéons.
Indentation autour d’une meme lamelle
× ×
×
53
II – 2 – 3 Synthèse des échantillons
Tableau 1 : Résumé de tous les échantillons utilisés par les techniques ultrasonore et mécanique
Matériau
Os cortical
Taille des
échantillons
(mm)
Nombre
d’échantillons
Test US - contact
75KHz - 2,25MHz
Test US – immersion
5MHz - 10MHz
Test nanoindentation
Fémur : F1
Echantillons
cubiques
5 x 5 x 5
6
x
x
x
Fémur : F2
Echantillons
parallélépipédiques
Sections fémorales
15 x 5 x 4
12
4
x
x
x
x
Fémur : F3
Echantillons
parallélépipédiques
Sections fémorales
15 x 5 x 4
6
4
x
x
x
x
54
II - 3 Détermination des propriétés morphologiques de l’os cortical
II - 3 - 1 Choix des échantillons
La détermination des propriétés morphologiques va être effectuée :
- sur les échantillons cubiques issus du fémur F1 et sur les échantillons parallélépipédiques
issus des fémurs F2 et F3 qui ont tous précédemment subi des tests par ultrason.
- Sur les sections fémorales issues du fémur F2 où trois localisations seront étudiées :
les parties latérale, médiale et postérieure.
II - 3 - 2 Détermination des paramètres morphologiques
Les paramètres morphologiques mesurés sont :
- la surface de chaque pore
- le diamètre moyen de l’ensemble des pores
- la porosité : pourcentage de l’aire occupée par les pores de l’os cortical
II - 3 - 3 Protocole de mesure
a) Echantillons cubiques et parallélépipédiques
Les échantillons cubiques issus du fémur F1 et les échantillons parallélépipédiques issus des
fémurs F2 et F3 qui ont précédemment subi des tests par ultrason sont disposés dans un
micro-scanner (Skyscan 1072). L’échantillon est ensuite fixé sur un support et un faisceau
d’électrons tourne autour de l’échantillon. L’échantillon est balayé sur une hauteur de 7mm et
une coupe sur deux est acquise : épaisseur de coupe de 15,62 µm. La résolution des images
acquises est de 7,81µm (figures 16, 17, 18) et le grossissement utilisé est de x40. Ce protocole
expérimental a été réalisé par Mme Brunet au sein de l’institut IPROS dirigé par le Pr.
Benhamou (« Institute of Prevention and Research on Osteoporosis »).
55
Figure 16 : Exemple d’acquisition au micro scanner sur un échantillon cubique (F1)
(arêtes coupées à 45°)
Figure 17 : Acquisition au micro scanner d’un échantillon parallélépipédique issu de F2
Figure 18 : Acquisition au micro scanner d’un échantillon parallélépipédique issu de F3
56
Le format des images acquises est sous forme BMP et un système d’analyse d’image LEICA
QWIN permet de mesurer automatiquement la surface des pores (figure 19). Ce logiciel ne
sera utilisé que pour détecter la porosité des échantillons cubiques et parallélépipédiques. La
porosité des régions d’intérêts des sections fémorales sera mesurée à l’aide d’un autre logiciel
dont la technique de mesure sera détaillée ci après. De plus, les échantillons issus des fémurs
F2 et F3 seront également soumis à cette même technique.
Figure 19 : Les surfaces vertes correspondent à la porosité qui sera détectée puis mesurée.
b) Sections fémorales
Suite aux mesures acoustiques effectuées sur les sections fémorales, toutes les sections ont
été poncées avec du papier à grain (800, 1200) puis polies avec de la poudre d’aluminium
(diamètre des grains = 0,3µm). La qualité du polissage a été vérifiée avec un microscope
optique en réflexion (Leica DMLS, grossissement x10). Toutes les sections ont ensuite été
scannées sous vide à 20KV au moyen d’un microscope environnemental à balayage (XL
30 ESEM-FEG) au grossissement x22. Cette technique a l’avantage de ne pas traiter en
surface les échantillons. Ce travail a été réalisé au département d’analyse physico
chimique de l’Université de Compiègne. Les sections fémorales sont alors balayées par un
faisceau d’électrons afin d’obtenir une cartographie des électrons secondaires qui
indiquent la composition de la microstructure.
Environ 40 images au format Tiff (712 x 484 pixels) sont acquises sur chaque section avec
une résolution de 5µm par pixel. Après reconstruction de chaque section fémorale, trois
régions d’intérêts sont définies par des carrés de 3mm dans les parties latérale, médiale et
postérieure. Ces régions d’intérêts sont localisées aux mêmes endroits que celles définies
sur les cartographies de vitesses.
57
Les images des régions d’intérêts vont être transférées sur un logiciel développé par
Ho Ba Tho et coll., 1993 afin de pouvoir effectuer un seuillage de la microstructure
(figure 20) contenue dans les différentes régions d’intérêts.
Figure 20 : Exemple de détection de seuil réalisée dans la région d’intérêt postérieure d’une section fémorale.
Les données géométriques détectées sont ensuite transférées vers un logiciel Patran V.9
(MSC. Software) afin de calculer individuellement l’aire des particules (figure 21) ainsi
que la surface totale de la région d’intérêt.
Figure 21 : Représentation de l’aire des particules contenues dans la région postérieure d’une section fémorale.
La porosité est définie en pourcentage comme le rapport entre l’aire totale occupée par les
pores et l’aire totale de la région d’intérêt. La taille des pores a été définie par le diamètre
« D » calculé à partir de la relation suivante :
D =
4Sp
πNp
Equation 33
D : diamètre moyen des pores en µm, Sp: surface totale des pores, Np: nombre total des pores Remarque : cette hypothèse de circularité est confirmée pour la plupart des ostéons qui sont de forme circulaire. Cependant, à partir d’un certain seuil de porosité (les canaux s’assemblant pour former des lacunes) cette hypothèse de circularité n’est plus vérifiée et il sera nécessaire de calculer la longueur caractéristique du pore.
58
II - 3 - 4 Validation de la méthode de mesure
La précision de la méthode a été réalisée en utilisant des formes géométriques connues tels
des cercles (figure 22) et des ellipsoïdes (figure 23).
Figure 22. Représentation de différents diamètres de cercles correspondant aux différentes
tailles de particules.
Les valeurs théoriques des diamètres des cercles et les valeurs obtenues par le logiciel Patran
sont résumées dans le tableau ci-dessous.
Cercles Surface théorique
(mm2)
Surface obtenue par Patran (mm2)
% d’écart
D des cercles
Diamètre moyen
D= Π×4patranS
C1 19,64 28,6 43,4% 5mm 6,03mm C2 78,74 97,81 24% 10mm 11,1mm C3 314,16 351,86 11% 20mm 21,1mm C4 1245,66 1322,9 6% 40mm 41mm
Tableau 2 : Comparaison entre les valeurs théoriques et les valeurs obtenues avec Patran
C1 C4
C2 C3
59
La même démarche a été réalisée avec des ellipses (figure 23) qui ont des longueurs d’axes
différentes.
Figure 23 : Représentation de différentes tailles d’ellipses correspondant aux différentes
tailles de particules
ellipse Surface théorique(mm2)
Surface obtenue par Patran(mm2)
% d’écart
E1 39,27 42,99 9,4% E2 157,08 168,02 6,9% E3 628,32 637,17 1,4%
Tableau 3 : Comparaison entre les valeurs théoriques et les valeurs obtenues avec Patran
La reproductibilité des mesures a été quantifiée en répétant trois fois le processus.
10*20 20*40
60
61
F1
F2
F3
1100 1400 1700 2000 2300 800 Masse volumique (kg/m3)
III RESULTATS
III - 1 Propriétés mécaniques et acoustiques des échantillons cubiques et parallélépipédiques d’os cortical (F1, F2, F3)
III – 1 - 1 Mesure de la masse volumique
La précision de la masse volumique est de 5 kg/m3. La reproductibilité est de 20 kg/m3 (1%).
La masse volumique des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques est représentée
tableau 1 et varie de 855 kg/m3 à 2127 kg/m3.
Figure 1 représente la gamme de valeurs des masses volumiques des différents échantillons.
Les valeurs sont contenues dans des cases (« box whiskers ») divisées par une ligne
horizontale qui représente la valeur médiane. Les valeurs représentées par un petit carré ne
sont pas prises en compte car elles sont trop éloignées des autres valeurs.
Masse volumique (kg/m3)
Fémur 1 (N = 10)
1855 – 1932
1892 ± 29 Fémur 2 (N=32)
855 – 2127
1608 ± 275 Fémur 3 (N=18)
979 – 1688
1221 ± 161
Tableau 1 : Valeurs maximum, minimum et moyenne avec écart type (SD) de la masse volumique des échantillons cubiques (Fémur 1) et parallélépipédiques
(Fémurs 2 et Fémur 3).
Figure 1 : Représentation des intervalles de valeurs de la masse volumique pour les trois fémurs.
62
De plus, la variation spatiale de la masse volumique (ρ) a été étudiée sur certains échantillons
du fémur 2 et est représentée tableau 2. Les valeurs varient de 1468 à 2127 kg/m3. La masse
volumique du côté postérieur est plus faible comparée aux autres côtés. Les résultats
statistiques (figure 2) montrent que la masse volumique varie en fonction de la localisation
anatomique.
Numéro des échantillons
ρMédial
(kg/m3)
ρPostérieur
(kg/m3) ρLatéral
(kg/m3)
0L-M-P
2000 ± 7
1582 ± 4
1845 ± 7
1L-M-P
2127 ± 5
1468 ± 9
1888 ± 6
2L-M-P
1870 ± 7
1708 ± 6
1744 ± 5
3L-M-P
1785 ± 7
1731 ± 6
1650 ± 7
Tableau 2 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) de la masse volumique en fonction de la
localisation anatomique
Figure 2 : Intervalle de valeurs de la densité en fonction de la localisation anatomique
(* : P<0,05)
*
Latéral
Médial
Postérieur
1400 1600 1800 2200 2000 Masse volumique (kg/m3)
63
III - 1 - 2 Mesures des propriétés acoustiques
a) Mesures des vitesses de propagation
La précision des mesures de vitesses obtenues avec la technique par transmission en contact à
2,25 MHz et 75KHz est de 60m/s (min 20 m/s – max 80 m/s), ce qui implique une précision
de 0,5 GPa et 0,3 GPa pour la mesure des coefficients élastiques et modules d’Young. La
reproductibilité est obtenue sur trois mesures et est de 125m/s (84 m/s – 172 m/s).
Les valeurs des vitesses de propagation, dans la direction axiale, à travers des échantillons
d’os cortical appartenant à F1, F2 et F3 sont représentées tableau 3.
Le mode de propagation de l’onde étant différent, les vitesses mesurées à basse fréquence
« Vbar » sont plus faibles que les vitesses mesurées à haute fréquence « Vbulk ».
Os cortical Vbar (m/s) Vbulk (m/s)
Fémur1
3194 – 3570
3338 ± 127
3938 –4238
4018 ± 103
Fémur2
1716 – 3883
3461 ± 372
3531 –4006
3839 ± 151
Fémur3
1433 – 3492
2826 ± 536
2250 – 3646
3014 ± 422
Tableau 3 : Valeurs minimum, maximum et moyenne avec écart type (SD) des propriétés acoustiques.
La gamme des valeurs obtenue pour les vitesses Vbar et Vbulk est représentée par des « box -
whiskers ».
Figure 3 : Représentation des intervalles de valeurs des Vbar pour les échantillons appartenant
à F1, F2 et F3.
F2
F3
F1
2400 2900
1400 1900 3400 3900
Vitesse « Bar » (m/s)
64
Figure 4 : Représentation des intervalles de valeurs des Vbulk pour les échantillons appartenant
à F1, F2 et F3.
La variation spatiale des vitesses « bulk » a été observée sur les échantillons du fémur F2. Le
tableau 4 résume toutes les valeurs des vitesses longitudinales obtenues à 2,25 MHz.
L’intervalle de valeurs varie de 3548 m/s à 3967 m/s. La valeur moyenne et la médiane de
toutes ces vitesses est de l’ordre de 3859 ± 109 m/s et 3909 m/s. Les vitesses du côté
postérieur sont plus faibles (3548 – 3814 m/s) comparées aux autres côtés (3858 – 3967 m/s).
La figure 5 illustre via des « box-whiskers » cette variation spatiale de vitesse en fonction de
la localisation anatomique.
Numéro des échantillons
Vbulk_Médial
Vbulk_postérieur
Vbulk_Latéral
0L-M-P
3858 ± 26
3784 ± 24
3910 ± 26
1L-M-P
3948 ± 21
3548 ± 19
3927 ± 20
2L-M-P
3926 ± 25
3775 ± 22
3967 ± 25
3L-M-P
3908 ± 28
3814 ± 26
3947 ± 28
Tableau 4 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) de la variation spatiale
des vitesses « bulk »
F1
F2
F3
2200 2600 3000 3400 3800 4200 4600
Vitesse « Bulk » (m/s)
65
Figure 5 : Distribution spatiale des vitesses « bulk » (* : P<0,05, ** : P<0,001)
b) relations prédictives entre vitesses et masse volumique
Les relations prédictives entre les différentes vitesses et la masse volumique sont représentées
figure 6.
La relation entre la vitesse de propagation (V) en mode « bar » et la masse volumique (ρ) est
la suivante : Vbar = 97 ρ0,49 R2 = 0,51 Equation 1
La relation entre la vitesse de propagation en mode « bulk » et la masse volumique est la
suivante : Vbulk = 69 ρ0,52 R2 = 0,40 Equation 2
Figure 6 : Relation entre les vitesses de propagation et la masse volumique d’échantillons
d’os cortical humain.
Latéral
Médial
Postérieur
3500 3600 3700 3800 3900 4000
Vitesse « Bulk » (m/s)
* *
*
0 500
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0 500 1000 1500 2000 2500
Masse volumique (Kg/m3)
Vbar
Vbulk
Vite
sse
(m/s
)
66
III - 1 - 3 Mesures des propriétés élastiques
a) Mesures des modules d’Young (E33) et des coefficients élastiques (C33) Les valeurs des modules d’Young obtenues dans la direction axiale à basse fréquence et les
coefficients élastiques obtenus également dans la direction axiale à haute fréquence sont
représentés dans le tableau 5 ci dessous. Le mode de propagation de l’onde influe sur les
valeurs du module d’Young qui sont plus faibles que celles des coefficients élastiques.
Os cortical
E33 (GPa)
C33 (GPa)
Fémur 1
19 – 24
21 ± 2
29 – 34
31 ± 2 Fémur 2
2 – 32
20 ± 5
11 – 33
24 ± 5 Fémur 3
2 – 18
10 ± 4
5 – 19
11 ± 4 Tableau 5 : Valeurs minimum, maximum et moyenne avec écart type (SD)
des propriétés élastiques La variation des coefficients élastiques (C33) en fonction de la localisation anatomique est
représentée tableau 6. L’intervalle de valeur varie de 18,5 GPa à 33,1 GPa. Les coefficients
élastiques du côté postérieur varient de 18,5 GPa à 25,2 GPa comparés aux autres côtés (25,7
GPa à 33,1 GPa). Les résultats statistiques (figure 7) montrent des différences significatives
entre le côté postérieur et les côtés latéral et médial.
Numéro des échantillons
C33_Médial
(GPa) C33_Postérieur
(GPa) C33_Latéral
(GPa)
0L-M-P
29,8 ± 0,24
22,7 ± 0,25
28,2 ± 0,30
1L-M-P
33,1 ± 0,2
18,5 ± 0,14
29,1 ± 0,22
2L-M-P
28,8 ± 0,23
24,3 ± 0,22
27,4 ± 0,25
3L-M-P
27,3 ± 0,28
25,2 ± 0,27
25,7 ± 0,28
Tableau 6 : Valeurs moyennes avec écarts types (SD) représentant la variation des coefficients élastiques en fonction de la localisation anatomique.
67
Figure 7 : Illustration des coefficients élastiques (C33) en fonction de la localisation anatomique (* : P<0,05, ** : P<0,001)
b) Relations prédictives entre les propriétés élastiques et la masse volumique
Les relations entre les propriétés élastiques et la masse volumique permettront de prédire des
valeurs de propriétés élastiques.
Les relations linéaires entre module d’Young, coefficient élastique et la masse volumique sont
représentées figure 8.
La relation entre le module d’Young (E) et la masse volumique (ρ) est la suivante :
E33 = 0,011ρ R2 = 0,70 Equation 3
La relation entre le coefficient élastique (C) et la masse volumique (ρ) est la suivante :
C33 = 0,014 ρ R2 = 0,72 Equation 4
Figure 8 : Relation entre le module d’Young, le coefficient élastique et la masse volumique d’échantillons d’os cortical humain.
Latéral
Médial
Postérieur
Coefficient élastique C33 (GPa)
* * *
19 22 25 28 31 34
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 500 1000 1500 2000 2500
Elas
ticité
(GPa
) E
C
Masse volumique (Kg/m3)
68
III - 1 - 4 Analyse statistique
Des tests statistiques (Anova) ont été réalisés afin d’étudier les différences de propriétés
mécaniques et acoustiques entre les trois fémurs. Le tableau 7 résume les résultats statistiques
obtenus. Des différences significatives entre les trois fémurs sont obtenues pour la densité, les
vitesses « bulk » et les coefficients élastiques. Pas de différence significative entre le fémur 1
et le fémur 2 pour les vitesses bar et les modules d’Young.
Propriétés Test Anova Vbar F1 = F2, F1 ≠ F3, F2 ≠ F3
Vbulk F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)
E33 F1=F2, F1 ≠ F3, F2 ≠ F3
C33 F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)
ρ F1 ≠ F2 ≠ F3 (p < 0,01)
Tableau 7 : Comparaison des propriétés acoustiques et mécaniques entre F1, F2 et F3
69
III - 2 Propriétés acoustiques des sections fémorales humaines (F2)
III - 2 - 1 Mesure de l’épaisseur des sections
La figure 9 représente la localisation des 12 points de mesures d’épaisseur réalisés en
périphérie de la section fémorale. Le tableau 8 résume les valeurs d’épaisseur moyennes des
différentes sections dont les distributions spatiales de vitesses seront représentées dans le
prochain paragraphe. La plus grande variation d’épaisseur trouvée est de l’ordre de 0,086mm
et correspond à la section 1 du fémur 2. Plus la variation d’épaisseur sera petite, meilleur sera
le parallélisme des faces de la section.
Figure 9 : Superposition de la cartographie de vitesse et de la cartographie d’épaisseur réalisée
sur la section 3 du F2.
Fémur N° de la section
Epaisseur (mm)
F1 1 1,289 ± 0,010
1 1,728 ± 0,054
2 1,934 ± 0,030
3 2,455 ± 0,027
F2
4 2,142 ± 0,026
Tableau 8 : Epaisseur moyenne avec écart type (SD) des sections issues de F1 et F2
2,210mm
2,129mm
2,132mm
2,131mm
2,128mm
2,153mm
2,135mm
2,144mm
2,105mm
2,131mm
2,141mm
2,170mm 0.041
0.009
0.000 0.023 0.009
70
III - 2 - 2 Capteurs plans
La précision des vitesses mesurées avec la technique par transmission en mode écho est de
137 m/s ; la reproductibilité est obtenue en refaisant l’expérience complète c'est-à-dire depuis
le début de l’expérience trois fois et est de l’ordre de 140 m/s.
La distribution spatiale des vitesses axiales obtenue avec des transducteurs plans à 5MHz et
10MHz est représentée figures 10 et 11.
Figure 10 : Cartographie de vitesse obtenue sur une section fémorale de F1 à 5 MHz
Figure 11 : Cartographie de vitesse obtenue sur une section fémorale de F1 à 10 MHz
Vitesse (m/s)
Vitesse (m/s)
71
La forme géométrique des sections fémorales n’est pas respectée avec des capteurs plans. Le
tableau 9 résume toutes les vitesses moyennes obtenues à 5 MHz et 10 MHz sur les
différentes sections appartenant à F1 et F2 ; chaque vitesse moyenne représente l’ensemble de
toutes les vitesses acquises à la surface de la section fémorale.
Fémurs Numéro de la
section
5MHz Vitesse_Plan
(m/s)
10MHz Vitesse_Plan
(m/s) F1 1 3750± 112 4002± 120
1 4401± 330 4468± 312
2 4185± 167 -
3 4295± 129 4223± 126
F2
4 4242± 144 4382± 149
Tableau 9 : Valeurs moyennes des vitesses avec écarts types (SD) obtenues pour des
transducteurs plans à 5 MHz et 10 MHz.
Les résultats des vitesses moyennes obtenues sur les sections fémorales du fémur F3 sont
inexploitables ; en effet ces sections étant très poreuses aucune représentation correcte de la
distribution spatiale de vitesses n’a pu être obtenue aussi bien avec un capteur plan que
focalisé aux fréquences de 5 MHz et 10 MHz.
72
Artéfacts
Vitesse (m/s)
III - 2 - 3 Capteurs focalisés
La distribution spatiale des vitesses moyennes obtenue à 5 MHz et 10 MHz est représentée
dans le tableau 10 ci-dessous.
Fémurs
Numéro de la
section
5MHz
Vitesse_Focalisée
(m/s)
10MHz
Vitesse_Focalisée
(m/s)
F1 1 3729± 112 3777± 113
1 4158± 291 4373± 328
2 4064± 203 4222± 211
3 4067± 122 4138± 124
F2
4 4147± 141 4320± 147
Tableau 10 : Valeurs moyennes des vitesses avec écarts types (SD) obtenues avec des
transducteurs focalisés à 5 MHz et 10 MHz. Les vitesses moyennes obtenues avec des capteurs plans (à 5MHz et 10MHz) sont supérieures
de 100m/s à 250m/s comparées à celles mesurées avec des capteurs focalisés.
L’utilisation de capteurs focalisés permet de respecter la forme géométrique des sections
fémorales et de faire une analyse plus fine en surface de la distribution des vitesses
longitudinales.
L’utilisation de capteur focalisé à 10 MHz a révélé la présence d’artéfacts en surface des
cartographies de vitesses figure 12.
Figure 12 : Distribution spatiale de vitesses de la section 3 obtenue avec
un capteur focalisé à 10 MHz
73
Vitesse (m/s)
L M
P
d)
M L
P
Vitesse (m/s)
Vitesse (m/s)
M L
P
L’emploi du capteur 5 MHz a permis de diminuer la présence de ces artéfacts ; ainsi il sera
présenté figure 13 les différentes distributions spatiales des vitesses de toutes les sections
fémorales appartenant au fémur F1 et F2.
a) b)
c)
e)
Figure 13 : Cartographies de vitesses des sections fémorales appartenant au F1 et F2 et obtenues avec un capteur focalisé à 5 MHz
a) section 1 F1 b) section 1 F2 c) section 2 F2 d) section 3 F2 e) section 4 F2
(cf. p.31)
Vitesse (m/s)
Vitesse (m/s)
M L
P
b)
74
L’analyse des propriétés acoustiques sur les sections fémorales se fera au moyen du
transducteur focalisé à 5 MHz ; en effet à cette fréquence les artéfacts ont diminué et les
valeurs moyennes des vitesses sont plus proches de la littérature (4000 m/s) que celles
obtenues à 10 MHz.
Toutes ces cartographies sont marquées par des carrés localisés dans les zones latérale (L),
médiale (M) et postérieure (P). Les propriétés acoustiques de ces zones précises seront par la
suite comparées aux propriétés morphologiques de ces mêmes zones.
Les cartographies de vitesses montrent des variations locales de vitesses qui seront
significatives uniquement si la distribution d’épaisseur est uniforme sur toute la section.
Ainsi, la variation d’épaisseur devra être considérée pour confirmer les variations
significatives de vitesses. Les variations significatives de vitesses sont représentées par un
changement de couleur. On dispose de 6 niveaux de couleurs différentes (bleu foncé, bleu
gris, vert, jaune, orange et rouge) espacées chacune d’un intervalle de 200m/s. Chaque
variation de couleur représente une variation significative de vitesses. La section 1 est une
exception car il faudra un changement de couleur équivalent à 2 franges (par exemple du bleu
au jaune) pour que la variation de vitesse soit significative, ceci étant dû à une trop grande
variation d’épaisseur (0,054mm). Une variation d’épaisseur de 0,05 mm et 0,03 mm entraîne
respectivement une variation de vitesse de 243 m/s et 175 m/s.
On observe sur ces distributions spatiales de vitesses des variations périphériques pour toutes
les sections.
Le côté postérieur présente de faibles vitesses qui varient entre 3400 m/s et 3800 m/s, soit une
variation de vitesse de 400 m/s (ou 11% de variation).
Les vitesses réparties sur le côté médial semblent être plus faibles que celles réparties sur le
côté latéral ; cette observation est uniquement significative pour la section 4. L’intervalle de
valeur des vitesses localisées sur les côtés latéral et médial est entre 4000-4200m/s, soit une
variation de 5%.
Une variation significative de vitesses est observée le long de la diaphyse, localisée entre 45%
et 60% de la longueur totale du fémur, au niveau du côté postérieur.
Une variation significative de vitesse dans la direction radiale apparaît ; en effet, les vitesses
augmentent de la partie endoste à la partie périoste (3800 m/s – 4200 m/s, soit une variation
de 11%).
75
Globalement les vitesses varient de 3400 m/s à 4200 m/s selon la localisation anatomique ;
cette différence de 800 m/s représente une variation de vitesse de l’ordre de 20%.
III - 3 Calibration
Les vitesses acoustiques des différents matériaux testés à haute et basse fréquences avec les
deux techniques par ultrason (en contact et en immersion) sont représentées tableaux 11et 12.
Les intervalles de valeurs des vitesses longitudinales qui se propagent à 5 MHz et 2,25 MHz
varient respectivement de 2327 m/s à 4710 m/s et de 2358 m/s à 4751 m/s. La vitesse
longitudinale qui se propage dans l’os cortical (4000 m/s) est incluse dans l’intervalle des
vitesses théoriques de ces matériaux. L’intervalle de valeurs des vitesses longitudinales qui se
propagent à 75 KHz est compris entre 2069 m/s et 4034 m/s.
Matériaux
(5x5x5mm)
Vitesses
longitudinales (m/s)
5MHz
Vitesses
théoriques (m/s)
Vitesses
longitudinales (m/s)
2,25MHz
Cuivre 4710 ± 28
5010 4731 ± 23
Inox 6041 ± 41
5790
5674 ± 46
Plexi Glass 2720 ± 14 2680
2879 ± 24
PVC 2327 ± 12
- 2358 ± 8
Tableau 11 : Vitesses acoustiques (« bulk ») avec écarts types des échantillons utilisés pour
calibrer les deux techniques ultrasonores.
Matériaux
(5x5x5mm)
Vitesses
longitudinales (m/s)
75KHz
Vitesses
théoriques (m/s)
Cuivre 3621
3750
Inox 4034
5000
Plexi Glass 2069
2160
PVC 2642
-
Tableau 12. Vitesses acoustiques (« bar ») des échantillons utilisés pour calibrer la technique
de transmission en contact.
76
III - 4 Propriétés mécaniques des lamelles osseuses d’os cortical (F1, F2, F3) III - 4 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
a) A l’échelle microscopique
Les valeurs des modules d’Young obtenues dans la direction longitudinale pour les lamelles
interstitielles sont pour le fémur 1(F1), fémur 2 (F2) et fémur 3 (F3) respectivement égales à
22 ± 2 GPa, 22 ± 3 GPa et 12 ± 3 GPa. Les valeurs des modules d’Young axiaux obtenues sur
des lamelles osseuses d’ostéons blancs sont de 19 ± 3 GPa (N = 138 indentations), 21 ± 3 GPa
(N = 51 indentations) et 10 ± 5 GPa (N = 22 indentations) pour les fémurs F1, F2 et F3. Les
valeurs sont significativement plus faibles pour le F3 comparées aux fémurs F1 et F2 (P <
0,001).
b) A l’échelle macroscopique
Les mêmes échantillons qui ont été testés en nanoindentation avaient précédemment été
soumis à la technique de transmission en contact avec des capteurs basses fréquences 75 KHz.
Les modules d’Young axiaux mesurés sur les échantillons de F1 (N=6), F2 (N= 6) et F3
(N=3) sont respectivement égaux à 21± 2 GPa, 20 ± 5 GPa et 10 ± 4 GPa. Si on augmente le
nombre d’échantillons avec ceux du fémur 3 précédemment testés, alors les propriétés
élastiques du fémur 3 sont significativement inférieures à celles mesurées sur F1 et F2.
La figure 14 illustre les propriétés élastiques des trois fémurs obtenues par deux différentes
techniques de mesure.
Figure 14 : Modules d’Young calculés sur des échantillons d’os cortical mesurés à l’échelle macroscopique (E_macro) et à l’échelle microscopique sur des lamelles interstitielles (E_LI (micro)) et sur des lamelles d’ostéons (E_OL (micro)) blancs pour les trois fémurs.
Elas
ticité
(GPa
)
0
5
10
15
20
25
30
E_macro E_LI (micro) E_OL (micro)
F1
F2 F3
77
III - 4 - 2 Etude des échantillons parallélépipédiques du fémur 2 (F2) Les variations intra lamellaires des modules d’Young E et dureté (H) sont calculées à partir
des écarts types obtenus lors des trois indentations exécutées sur une même lamelle osseuse.
Les valeurs sont résumées dans les tableaux 13 et 14. Aucune différence significative n’est
trouvée entre les trois types d’ostéons pour les modules d’Young (E) et dureté (H). Les
variations des propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) au sein d’une même lamelle
osseuse sont respectivement E = 2,72 ± 1,74 GPa (avec un intervalle qui varie de 0,19 GPa à
8,48 GPa) et H = 0,11 ± 0,09 GPa (avec un intervalle qui varie de 0,01 GPa à 0,43 GPa),
dépendant du type d’ostéons testés.
E (GPa)
Ostéons Blancs (N=61)
E (GPa)
Ostéons Gris (N=17)
E (GPa)
Ostéons Noirs (N=39)
0,19 – 7,76 2,81
2,93 ± 1,83
0,93 – 5,93 2,42
2,69 ± 1,57
0,24 – 8,48 2,12
2,45 ± 1,70
Tableau 13 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des
variations intra lamellaires des modules d’Young.
H (GPa)
Ostéons Blancs (N=61)
H (GPa)
Ostéons Gris (N=17)
H (GPa)
Ostéons Noirs (N=39)
0,02 – 0,43 0,11
0,15 ± 0,10
0,02 – 0,26 0,06
0,10 ± 0,08
0,01 – 0,31 0,05
0,09 ± 0,08
Tableau 14 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des
variations intra lamellaires de la dureté des lamelles osseuses.
Les variations des modules élastiques (E) et dureté (H) pour les différents ostéons sont
résumées dans les tableaux 15 et 16. Les propriétés élastiques et mécaniques des lamelles
osseuses d’ostéons blancs et gris sont dans la même gamme de valeurs mais significativement
(P < 0,001 et P < 0,05) supérieures aux lamelles d’ostéons noirs (figures 15 et 16). Les
lamelles d’ostéons blancs ont des modules d’Young et dureté qui sont significativement
supérieurs à ceux des ostéons gris (écart d’environ E = 2 GPa et H = 0,13 GPa, P<0,05) et
supérieurs à ceux des ostéons noirs (écart d’environ E = 8 GPa et H = 0,27 GPa, P<0,001). De
78
Eblc
Egris
Enoir
Box-and-Whisker Plot
7 11 15 19 23 27 31
response
Blanc
Gris
Noir
E (GPa)
* *
* *
*
plus, les propriétés élastiques (E) et mécaniques (H) des lamelles d’ostéons gris sont
supérieures à celles des ostéons noirs de E = 6 GPa et H = 0,14 GPa.
E (GPa) Osteons Blancs (N=61)
E (GPa) Osteons Gris (N=17)
E (GPa) Osteons Noirs (N=39)
13,87 – 27,06 21,59
21,30 ± 3
16,88 – 22,63 19,15
19,27 ± 1,78
7,04 – 17,59 13,33
12,95 ± 2,66
Tableau 15 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des
modules d’Young pour les différents ostéons
H (GPa) Osteons Blancs (N=61)
H (GPa) Osteons Gris (N=17)
H (GPa) Osteons Noirs (N=39)
0,26 – 0,85 0,56
0,55 ± 0,15
0,25 – 0,6 0,43
0,41 ± 0,09
0,09 – 0,52 0,29
0,30 ± 0,10
Tableau 16 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) de la
dureté pour les différents types d’ostéons .
Figure 15 : Intervalle de valeurs des modules Young pour différents types d’ostéons (**: P < 0,001 et *: P < 0,05).
79
Figure 16 : Intervalle de valeurs de la dureté pour différents types d’ostéons (**: P < 0.001 et *: P < 0.05).
III - 4 - 3 Calibration La calibration a été réalisée sur de la silice ; le module d’Young mesuré avec cette technique
de nanoindentation est de l’ordre 72,1 GPa ± 0,5 GPa. Cette valeur expérimentale est proche
de la valeur théorique de ce matériau qui est de 72 GPa. Le faible écart entre ces deux valeurs
théorique et expérimentale permet de valider les résultats mesurés par la technique de
nanoindentation
III - 4 - 4 Reproductibilité des mesures effectuées par la technique de nanoindentation La reproductibilité de la mesure du module Young ainsi que la dureté du matériau sont
effectuées sur trois ostéons en reproduisant trois fois le test de nanoindentation sur une même
lamelle épaisse située au centre de l’ostéon à trois jours d’intervalle.
Les valeurs de reproductibilité obtenues pour le module d’Young (∆E = 1,33 GPa) et la
dureté (∆H = 0,03 GPa) sont calculées à partir de l’écart type de la moyenne des propriétés
mécaniques pour les trois mesures et les trois jours.
Hblc
Hgris
Hnoir
Box-and-Whisker Plot
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
response
White
Grey
Dark
H (GPa)
* * *
* * *
* *
Blanc
Gris
Noir
80
III - 5 Propriétés morphologiques III - 5 - 1 Etude des échantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
a) Paramètres morphologiques Les porosités des fémurs F2 et F3 ont été calculées avec deux logiciels différents (Patran et
Qwin) alors que la porosité du F1 est uniquement mesurée avec le logiciel QWin. Les
résultats sont dans la même gamme de valeurs et l’écart peut varier de 1% à 17%.
Les échantillons du fémur 1 (F1) prélevés au niveau de la diaphyse supérieure ont une
porosité comprise entre 4% et 10%. Les échantillons du fémur 2 (F2) prélevés entre 40% et
70% de la longueur totale du fémur ont un intervalle de porosité qui est plus large (7% - 45%)
que celui du fémur 1. Le fémur 3 (F3) qui avait une masse volumique très inférieure aux deux
autres fémurs contient des échantillons avec une porosité élevée (35% - 69%). Les tableaux
17, 18 et 19 résument les valeurs de porosité des différents échantillons appartenant à F1, F2
et F3.
Tableau 17 : Porosité du fémur F1 mesurée avec le logiciel Qwin
Tableau 18 : Résultats et comparaison des porosités du fémur F2 mesurées avec le logiciel Qwin et Patran
Tableau 19 : Résultats et comparaison des porosités du fémur F3 mesurées avec
le logiciel Qwin et Patran
Fémur 1 Numéro de l’échantillon
Porosité Qwin
1 4% 2 9% 3 7% 4 8% 5 13% 6 10%
Fémur 2 Numéro de l’échantillon
Porosité Patran
Porosité Qwin
Ecart
1 5% 7% 2% 2 9% 11% 2% 3 38% 54% 16% 4 28% 45% 17%
Fémur 3 Numéro de l’échantillon
Porosité Patran
Porosité Qwin
Ecart
1 66% 69% 3% 2 68% 72% 4% 3 62% 61% 1% 4 50% 52% 2% 5 63% 62% 1% 6 28% 35% 7%
81
Des reconstructions en trois dimensions de certains échantillons appartenant à F1, F2 et F3
permettent d’avoir une visualisation de la largeur des canaux de Havers. La figure18 illustre
des reconstructions 3D d’échantillons appartenant à F1, F2 et F3. Il apparaît que la largeur des
canaux de Havers augmente du fémur 1 au fémur 3.
F1 F2 F3
Figure 18 : Reconstruction longitudinale 3D des échantillons appartenant aux trois fémurs
Canaux de Havers
82
b) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques
Les valeurs des propriétés acoustiques et morphologiques mesurées sur les mêmes
échantillons cubiques et parallélépipédiques sont représentées figure 17
300032003400360038004000420044004600
0 20 40 60 80
porosité (%)
Vite
sse
(m/s
)
300032003400360038004000420044004600
0 20 40 60 80
Porosité (%)
Vite
sse
(m/s
)
Figure 17: Courbe de régression entre la vitesse (m/s) et la porosité (%) mesurée avec le
logiciel QWin (a) et Patran (b)
Les vitesses varient de 2512m/s à 4150m/s pour l’ensemble des échantillons et la porosité
mesurée par le logiciel QWin et Patran est respectivement comprise entre 4% et 72% et entre
5% et 68%. Les relations prédictives entre la porosité (%) (P), mesurée par deux logiciels
d’analyse d’images, et la vitesse (m/s) (V) ainsi que le coefficient de détermination sont :
V = 4214 e -0,0047 p , R2 = 0,79 N=16 (Logiciel Qwin) Equation 5 V = 5065 P -0,11 P ≠ 0 R2 = 0,67 N=16 (Logiciel Qwin) Equation 6 V = 4202 e -0,0051 p , R2 = 0,75 N=10 (Logiciel Patran) Equation 7 V = 5099 P -0,11 P ≠ 0 R2 = 0,57 N=10 (Logiciel Patran) Equation 8
a)
b)
83
Latéral
Postérieur
Latéral
Latéral Latéral
III - 5 - 2 Sections fémorales (F2)
a) Cartographie de la microarchitecture
Les quatre sections fémorales appartenant au fémur 2 et dont la distribution spatiale de vitesse
a été quantifiée précédemment sont représentées figure 19 sous la forme de cartographies
représentant leurs microarchitectures. Chaque cartographie est un assemblage d’environ 40
images acquises au microscope électronique à transmission.
Figure 19 : Représentation de la microarchitecture des section 1 (a), section 2 (b),
section 3 (c) et section 4 (d) du F2
Médial
Postérieur
Médial
Médial
Médial
Postérieur
Postérieur
a) b)
c) d)
84
b) Paramètres morphologiques
Les propriétés microstructurales tels le diamètre des pores et la porosité seront déterminées
sur des régions d’intérêts (carrés de 3mm de côté) similaires à celles disposées sur les
cartographies de vitesses. La précision de la technique de mesure du diamètre des pores est de
10µm. La reproductibilité des mesures de surfaces des pores et de la porosité est
respectivement de 4% (0,2% – 10%) et 0,011%.
Les valeurs des diamètres moyens de pores et porosité calculées sur les régions d’intérêts sont
résumées tableau 20 et tableau 21.
Fémur 2 Diamètres moyens des pores (µm)
Médial
Diamètres moyens des pores (µm)
Postérieur
Diamètres moyens des pores (µm)
Latéral
Section 1 62 ± 41
253 ± 243
47 ± 17
Section 2 60 ± 25
191 ± 168
59 ± 30
Section 3 64 ± 38
140 ± 51 54 ± 19
Section 4 83 ± 26 122 ± 81
83 ± 41
Tableau 20 : Taille moyenne avec écart type (SD) des pores en fonction de la localisation anatomique
Tableau 21 : Valeur de porosité en fonction de la localisation anatomique
Fémur 2 Porosité (%)
Médial
Porosité (%)
Postérieur
Porosité (%)
Latéral
Section 1 3,5%
47% 3,1%
Section 2 3,4%
40% 4,6%
Section 3 5%
20% 3,7%
Section 4 5% 15% 4,6%
85
Le nombre total de pores contenu dans les différentes régions d’intérêts peut varier de 41 à
132 pores, le nombre moyen de pores par région est d’environ 70 ± 23 pores.
Le diamètre moyen des pores du côté postérieur est significativement supérieur aux diamètres
des côtés latéral et médial (supériorité d’un facteur 2 pour les sections 1 à 3) (P < 0,01). La
taille des pores pour le côté postérieur varie entre 112 ± 51 µm et 253 ± 243 µm comparée
aux autres côtés dont l’intervalle de valeurs est compris entre 47 ± 17 µm et 83 ± 41 µm.
Les résultats de la porosité montrent une tendance similaire aux résultats des diamètres de
pores. En effet, l’intervalle de valeurs de la porosité pour le côté postérieur est supérieur
(9,7% - 47%) aux autres côtés (3,1% - 5%).
D’une manière générale, le diamètre des pores et la porosité varient en fonction de la
localisation anatomique, à savoir entre 47 µm et 253 µm pour le diamètre des pores et entre
3% et 47% pour la porosité.
c) Comparaison entre propriétés acoustiques et morphologiques
Les valeurs des propriétés acoustiques et microstructurales mesurées sur les mêmes régions
d’intérêts (latérale, médiale et postérieure) appartenant aux quatre sections fémorales sont
illustrées figures 20 et 21.
3300
3500
3700
3900
4100
4300
0 10 20 30 40 50
Porosité (%)
Vite
sse
(m/s
)
Figure 20 : courbe de régression entre la vitesse (m/s) et la porosité (%)
(N = 12, R2 = 0,89, p < 0,001)
86
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50
Porosité (%)
D(µ
m)
Figure 21 : Données regroupées de la porosité (%) et du diamètre moyen des pores D (µm)
Les intervalles de valeurs de la vitesse, porosité, et diamètre des pores varient respectivement
de 3500 m/s à 4200 m/s, 3,1% à 47% et de 47 µm à 253 µm. La variation de vitesse est moins
importante (facteur 1,2) que la porosité (facteur 14) et le diamètre des pores (facteur 5).
La relation prédictive entre la vitesse (m/s) (V) et la porosité (%) (P) ainsi que le coefficient
de détermination (r2) sont exprimés par l’équation suivante :
V = 4175 e -0,0038P R2 = 0,89 Equation 9
V= 4497 P-0,06 P≠0 R2 = 0,9 Equation 10
Les relations prédictives entre la vitesse et la porosité obtenues sur les sections fémorales et
sur les échantillons cubiques et parallélépipédiques sont du même ordre de grandeur. Ce
résultat prouve la fiabilité à la fois des deux différentes techniques ultrasonores et des
techniques d’analyse d’images utilisées pour déterminer les propriétés acoustiques et
morphologiques.
87
Chapitre III - Discussion
I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES ACOUSTIQUES, MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES
I - 1 Technique de transmission en contact
a) Comparaison des trois fémurs (F1, F2, F3)
L’intervalle de valeurs des propriétés mécaniques mesurées dans cette étude est supérieur
(aussi bien pour la valeur minimale que maximale) à celui présenté par d’autres études
(Ho Ba Tho et coll., 1991). Les tests statistiques ont montré des différences significatives
entre les masses volumiques, les vitesses « bulk » et les coefficients élastiques des
échantillons appartenant aux trois fémurs. Les échantillons du fémur 3 prélevés en basse
diaphyse présentent des propriétés acoustiques (vitesses « bar » et « bulk ») et mécaniques
(coefficients élastiques et modules d’Young) qui sont significativement inférieures à celles
des fémurs 1 et 2. Cependant, aucune différence significative n’a été trouvée entre les vitesses
« bar » et les modules d’Young du fémur 1 et du fémur 2. Ce dernier résultat démontre
l’influence du mode de propagation de l’onde ainsi que l’influence du milieu biologique qui
est traversé. En effet, le tissu osseux qui est souvent considéré comme un milieu homogène et
continu doit être vérifié.
Les vitesses « bar » et modules d’Young mesurés dans cette étude sont respectivement
inférieurs aux vitesses « bulk » et coefficients élastiques. Ce dernier résultat n’est pas
surprenant puisque le mode de propagation de l’onde est différent à haute et basse fréquences.
Les différences de valeurs obtenues avec les trois fémurs peuvent s’expliquer par des
variations significatives des propriétés acoustiques et mécaniques en fonction de la
localisation anatomique (Ho Ba Tho et coll., 1991). L’intervalle de valeurs des propriétés
mécaniques et acoustiques est lié à la localisation anatomique et à la personne même.
b) Variation spatiale
La technique de transmission en contact ne montre aucune différence significative entre les
vitesses « bulk » et coefficients élastiques pour les côtés latéral et médial, alors que le côté
88
postérieur présente des vitesses acoustiques et coefficients élastiques qui sont
significativement plus faibles. Cette dernière observation est en accord avec les résultats de
propriétés élastiques trouvés lors de précédentes études (Meunier et coll., 1988, Ashman et
coll., 1984, Weiss et coll., 1998, Ho Ba Tho et coll., 1991). Le côté postérieur est plus poreux
car relié à un environnement plus vascularisé. Ces résultats sont également en accord avec
l’étude de Ho Ba Tho et coll., 1991 qui a fait un atlas des propriétés mécaniques de l’os
cortical sur sept sujets humains.
I - 2 Technique de transmission en immersion (F2)
a) Variation spatiale
La distribution spatiale de vitesses obtenue sur les sections fémorales a également révélé des
vitesses acoustiques plus faibles du côté postérieur. De plus, on observe que ces variations
significatives de propriétés acoustiques varient en fonction de la longueur du fémur. Ce
résultat permet de confirmer l’observation qualitative de Weiss et coll., 1998 qui à travers une
cartographie d’impédance a trouvé le même phénomène au niveau du côté postérieur.
Ces résultats démontrent une variation de porosité côté postérieur qui varie avec la longueur
du fémur suggérant une influence locale et significative de la vascularisation.
La technique en immersion a l’avantage de pouvoir estimer la distribution spatiale de vitesses
localisées. Les vitesses obtenues côté latéral semblent être supérieures à celles côté médial
mais sans aucune différence significative. Des variations radiales de vitesses qui sont
significatives (∼ 200 m/s) sont également présentes sur la distribution spatiale de vitesse.
Les points rouges localisés dans la partie endoste des sections fémorales sont essentiellement
dus à des artéfacts qui ont des vitesses très élevées (4400 m/s). Ces valeurs non significatives
augmentent les vitesses moyennes des sections fémorales. Ces artéfacts sont reliés à des trous
qui sont en fait des pores à très grands diamètres situés dans la partie endoste. Ces trous sont
de plus en plus présents au fur et à mesure que la section se rapproche de la métaphyse (la
section est plus grande et l’épaisseur de l’os cortical diminue) et par conséquent contient plus
d’artéfacts tel que la section 4. Les artéfacts présentent des vitesses élevées alors qu’on aurait
dû s’attendre à des vitesses plus faibles. En fait, ceci est dû à un problème de traitement du
signal et notamment à la détection du deuxième écho. L’atténuation du deuxième écho
implique une détection au hasard du temps de propagation de l’onde qui se trouve proche du
89
premier écho. Par conséquent, le temps de propagation entre les deux échos est diminué, ce
qui implique une augmentation de la vitesse. Ces artéfacts démontrent que la technique
ultrasonore en transmission est sensible à la microarchitecture (taille des pores). En fait, ces
artéfacts seront dépendants du rapport entre la longueur d’onde et le diamètre du pore. Nous
avons trouvé expérimentalement que les diamètres des pores devaient être inférieurs de trois
fois la dimension de la longueur d’onde pour que les artéfacts soient évités.
I - 3 Comparaison des techniques de transmission en contact et en immersion (F2)
La calibration des deux techniques ultrasonores a montré que les vitesses expérimentales
obtenues sur les différents matériaux à hautes fréquences (2,25MHz et 5MHz) étaient du
même ordre de grandeur et proches des vitesses théoriques (∆V ∼ 25 m/s pour la technique en
contact et ∆V ∼ 24 m/s pour la technique ultrasonore en immersion). Cet écart de vitesse est
correct étant donné que la précision des deux techniques ultrasonores est de l’ordre de 100
m/s, sauf pour l’inox qui présente une vitesse supérieure (∼ 4%) avec la technique ultrasonore
en immersion.
La différence moyenne de vitesses obtenue pour les deux techniques est équivalente comparée
aux vitesses théoriques. Le cuivre présente pour les deux techniques ultrasonores une même
vitesse mais qui est inférieure (∼ 300 m/s ou 6%) à la vitesse théorique du cuivre ; ceci peut
être dû à la qualité du matériau qui peut être un alliage et non un matériau purement constitué
de cuivre.
Comparaison des propriétés acoustiques
Les vitesses « bulk » de propagation obtenues à travers les échantillons parallélépipédiques
sont du même ordre de grandeur que celles obtenues par la technique ultrasonore en
immersion. En effet, les échantillons parallélépipédiques prélevés du côté postérieur
présentent un intervalle de vitesses équivalent au côté postérieur des sections fémorales. La
comparaison des régions latérale et médiale indique une différence de vitesse qui est au plus
de 200 m/s (valeur moyenne 100 m/s) entre ces deux techniques.
De plus, la technique ultrasonore en immersion étant sensible au choix de la fréquence il était
indispensable de comparer ces valeurs avec une autre technique ultrasonore qui permet de
mesurer des vitesses absolues et propriétés élastiques tel que cela a été réalisé dans cette
étude.
90
D’une manière générale, les vitesses acquises avec la technique de transmission en contact
sont inférieures à celles mesurées par la technique en immersion.
La précision, la calibration et les résultats de vitesses obtenus par les deux techniques
ultrasonores permettent de conclure que les vitesses acquises avec des transducteurs focalisés,
en immersion ou en contact, sont du même ordre de grandeur.
De plus, la comparaison des vitesses entre ces deux techniques indique une même variation en
périphérie et le long du fémur.
L’intervalle de vitesses « bulk » (3400 m/s – 4200 m/s) obtenu par les deux techniques
expérimentales ultrasonores sont du même ordre de grandeur que celui mesuré in vivo sur des
os longs humains (Barkman et coll., 2000, Weiss et coll., 2000, Antich et coll., 1991). Par
contre, nos résultats ne sont pas dans la même gamme que ceux trouvés par Hasegawa et coll.,
1995 (3318 m/s – 3663 m/s) qui avait utilisé des biopsies osseuses de crête corticale. Cette
différence de données peut être liée aux échantillons utilisés qui ne sont pas localisés dans la
même région.
Comparaison des propriétés mécaniques La distribution spatiale de la masse volumique et des coefficients élastiques (C33) obtenue sur
les échantillons parallélépipédiques montre de faibles valeurs pour le côté postérieur avec une
augmentation de ces valeurs le long du fémur. Précédemment, la même observation sur les
sections fémorales a été obtenue pour la distribution de vitesses au niveau du côté postérieur.
Ce dernier résultat atteste de l’habilité de la technique ultrasonore en transmission à
déterminer des vitesses absolues même si un capteur focalisé est utilisé. D’après ces derniers
résultats il sera alors possible de calculer les coefficients élastiques des sections fémorales
localisées au niveau postérieur. En effet, la masse volumique des échantillons
parallélépipédiques au niveau postérieur étant connue il sera alors possible de déterminer très
localement sur les sections fémorales la distribution postérieure des coefficients élastiques.
Précisons que cet assemblage de données est possible uniquement du fait que les vitesses
obtenues avec les transducteurs focalisés et plans sont équivalentes. En principe les vitesses
acquises avec des transducteurs focalisés sont des vitesses relatives et ne doivent pas être
utilisées comme des vitesses absolues car la propagation du rayon est différente (Bensamoun
et coll., 2002).
L’avantage de cette technique ultrasonore en immersion est de pouvoir directement estimer la
distribution spatiale des propriétés élastiques comparées à d’autres études (Zimmerman et
coll., 1990). Précisons que cette mesure ne sera possible que dans une direction alors que la
91
technique ultrasonore en contact permet de déterminer l’anisotropie de l’échantillon dans les
trois directions. Les autres directions (pour les sections fémorales) n’ont pas pu être
examinées à cause de la difficulté de la découpe due à une géométrie complexe de la diaphyse
fémorale. De plus, le plan transverse est un plan intéressant puisqu’il permet de voir la
résorption osseuse qui est reliée au remodelage osseux (dû au processus de l’âge, contact
entre os et implant, etc…).
Pour résumer, ces deux techniques sont complémentaires, l’une permet d’observer la
distribution spatiale et l’autre de mesurer l’anisotropie locale.
I - 4 Corrélation des propriétés acoustiques et morphologiques
a) Echantillons cubiques (F1) et parallélépipédiques (F2, F3)
L’étude réalisée au micro scanner sur les échantillons cubiques et parallélépipédiques a
permis de confirmer que les échantillons utilisés pour les tests ultrasonores étaient
homogènes. La porosité des échantillons du fémur 3 étant comprise entre 35% et 72% les
propriétés mécaniques et acoustiques de ces échantillons sont beaucoup plus faibles que celles
des fémurs 1 et 2 qui ont des porosités plus faibles. Une relation étroite existe donc entre les
propriétés microstructurales et les propriétés acoustiques-mécaniques.
b) Sections fémorales (F2)
L’intervalle de porosité (3% - 47%) mesuré sur la distribution spatiale de la microarchitecture
est supérieur à la gamme de valeurs généralement trouvée dans la littérature. Ceci est
certainement dû à la localisation anatomique de la région à étudier. La valeur moyenne de
porosité trouvée dans la littérature est de 10% ; l’intervalle varie entre 2% et 32% (Currey et
coll., 1988, Martin et Ishida, 1989, Watcher et coll., 2001, Watcher et coll., 2002). Selon notre
revue bibliographique aucune valeur moyenne de taille des pores n’est disponible dans la
littérature pour comparer les valeurs des paramètres morphologiques.
Les variations significatives des diamètres de pores et porosité sont corrélées aux variations
de vitesses. Ceci démontre une relation significative entre les variations de propriétés
acoustiques avec celles de la microstructure. Cependant, l’ordre de variation n’est pas le
même.
92
Une variation radiale de vitesses acoustiques (de 3800 m/s à 4200 m/s) a été observée entre
les parties endoste et périoste. Cette variation de vitesse de l’ordre de 10% est due à une zone
plus vascularisée en endoste qui se traduit par une porosité plus importante.
La variation maximale de vitesse en périphérie est de l’ordre de 800 m/s (3400 m/s à 4200
m/s) soit de 20% ; cette variation de vitesse correspond à une variation du diamètre des pores
de l’ordre d’un facteur 5 (de 47µm à 253 µm) et à une variation de porosité de l’ordre d’un
facteur 15 (de 3,1% à 47%). On constate que les variations de vitesses sont plus faibles que
les variations des paramètres caractérisant la microstructure. Par exemple, l’augmentation de
vitesse (3400 m/s à 4000 m/s) du côté postérieur avec la longueur du fémur est fortement
corrélée à la porosité et aux diamètres des pores qui diminuent suivant la longueur du fémur.
Cette augmentation de vitesse est de l’ordre de 11% alors que la porosité diminue d’un facteur
3 (47% à 15%) et d’un facteur 2 (253 µm à 122 µm) pour le diamètre des pores.
Ces résultats sont importants pour la compréhension et l’interprétation des mesures
acoustiques in vivo (Hasegawa et coll., 1995, Antich et coll., 1993).
Notre étude montre que les vitesses mesurées in vivo correspondent à une porosité de 15%.
Cette corrélation entre les propriétés acoustiques et microstructurales a montré que pour de
faibles variations de vitesses il pouvait y avoir de grands changements au niveau de la
microstructure osseuse. Ensuite, il serait important de corréler ces modifications
microstructurales avec des os pathologiques.
Les sections fémorales utilisées dans cette étude ont été prélevées sur un seul fémur (F2).
L’intervalle de valeurs des vitesses acoustiques trouvées est du même ordre de grandeur que
l’atlas des propriétés mécaniques regroupant huit sujets cadavériques humains (Ho Ba Tho et
coll., 1991).
I - 5 Synthèse des propriétés mécaniques et acoustiques de l’os cortical
La technique ultrasonore en immersion a permis de caractériser la distribution spatiale de
vitesses avec une résolution de 500 µm. Cette technique permet d’avoir une distribution
spatiale des propriétés acoustiques et mécaniques qui sera beaucoup plus précise (par exemple
dans la direction radiale et périphérique). La technique ultrasonore en immersion doit prendre
en considération certains points techniques tel qu’un excellent parallélisme des faces afin
d’avoir la meilleure interprétation possible. De plus les hétérogénéités au niveau de la
microarchitecture doivent être prises en considération. Lorsque ces différents points seront
93
sous contrôle, une estimation quantitative de la distribution spatiale des propriétés élastiques
sera déduite des cartographies de vitesses acoustiques et de masses volumiques.
Les résultats des propriétés acoustiques et mécaniques trouvés au sein d’un même fémur
suggèrent l’importance des mesures suivant la localisation anatomique. En effet, la
diminution des propriétés acoustiques est liée à la détérioration des propriétés
morphologiques (augmentation de la porosité, formation de lacunes). Cependant, de grands
changements microstructuraux reflètent de faibles variations de vitesses, démontrant ainsi que
la vitesse n’est pas si sensible aux changements de la microstructure. Ces résultats permettront
aux cliniciens et chercheurs d’avoir une meilleure compréhension (avantage et limitation) de
l’utilisation de techniques ultrasonores pour l’estimation des propriétés matérielles et
structurelles de l’os cortical.
II PROPRIETES MECANIQUES DES LAMELLES OSSEUSES II - 1 Comparaison des résultats macroscopique et microscopique
Les valeurs des propriétés élastiques des lamelles interstitielles obtenues sur les échantillons
du fémur 2 et fémur 3 sont légèrement inférieures à celles trouvées dans la littérature
(E = 25 – 27 GPa) par d’autres auteurs Rho et coll., 1997 et Zysset et coll., 1999.
Les variations des propriétés élastiques mesurées à l’échelle macroscopique, avec la technique
de transmission en contact, pour les trois fémurs sont similaires aux mesures obtenues à
l’échelle microscopique. A l’échelle macroscopique, le volume des échantillons cubiques ou
parallélépipédiques étant considéré comme homogène (hypothèse d’un milieu continu pour la
propagation de l’onde) les mesures ultrasonores reflètent alors l’ensemble des propriétés
élastiques homogénéisées (c'est-à-dire les propriétés mécaniques des lamelles interstitielles et
des différents types d’ostéons).
Dans cette étude, une variation des propriétés élastiques de l’ordre de 40% (de 13,33 GPa à
21,59 GPa) entre les différents types d’ostéons appartenant au fémur 2 a traduit un processus
dynamique de remodelage osseux. Il est intéressant de remarquer que les variations mesurées
à l’échelle microscopique, sur le même échantillon, sont plus importantes que celles
enregistrées à l’échelle macroscopique (de 11% à 20%) (Ho Ba Tho et coll., 1991).
94
Cette caractérisation des propriétés élastiques aux échelles macroscopique et microscopique
permettra de mieux interpréter les résultats mesurés sur des échantillons cubiques ou
parallélépipédiques avec la technique de transmission en contact. En effet, les faibles valeurs
des propriétés élastiques d’os cortical mesurées à l’échelle macroscopique peuvent avoir deux
interprétations possibles. La première serait due à une altération des propriétés élastiques des
ostéons minéralisés qui serait liée à une importante porosité. La seconde pourrait être due à un
tissu osseux dense constitué principalement d’ostéons en processus de minéralisation.
La connaissance du milieu microscopique permettra également de modéliser de façon plus
correcte le comportement de l’os cortical à différentes échelles.
II - 2 Etude du fémur 2 Dans cette étude trois différentes catégories d’ostéons (blancs, gris et noirs) ont été
caractérisées par une analyse qualitative de leur niveau de gris. Ces différences de niveau de
gris ont été confirmées dans cette étude par des mesures quantitatives, les ostéons blancs étant
les plus minéralisés comparés aux ostéons noirs qui sont les moins minéralisés. En effet, les
valeurs des propriétés mécaniques diminuent avec le niveau de gris des ostéons. Ces résultats
sont en accord avec l’étude de Ascenzi et Bonucci, 1968 réalisée à l’échelle de l’ostéon et sur
n’importe quel type d’ostéon (I-II-III).
Nos données sont statistiquement significatives et fournissent un intervalle de valeurs des
propriétés élastiques qui pourront être utilisées comme valeurs de références pour les lamelles
d’ostéons plus ou moins minéralisées. L’intervalle de valeurs des modules d’élasticité (E) et
de dureté (H) obtenu pour les ostéons blancs et gris est dans la même gamme de valeurs que
celles publiées dans la littérature par Rho et coll., 1997, Rho et coll., 1998, Rho et coll., 1999,
Rho et coll., 2002 et Zysset et coll., 1999. Notons que dans la littérature, le degré de
minéralisation des ostéons n’était pas spécifié, contrairement à notre étude.
Les variations du module d’Young et de dureté calculées au sein de lamelles osseuses
présentant des variations de degrés de minéralisation sont respectivement de l’ordre de E =
2,72 ± 1,74 GPa (intervalle entre 0,19 GPa et 8,48 GPa) et H = 0,11 ± 0,09 GPa (intervalle
entre 0,01 GPa et 0,43 GPa). Ce résultat a démontré une hétérogénéité de la lamelle osseuse
suggérant une variation de l’orientation des fibres de collagène et une variation du degré de
minéralisation. Ce dernier résultat n’est pas en accord avec l’étude de Ascenzi et Bonucci,
95
1968 qui considère la lamelle osseuse comme étant homogène pour tous les types d’ostéons
(I, II, III).
Cette étude a permis de caractériser les propriétés mécaniques de différents types de lamelles
osseuses en processus de minéralisation. En effet, une base de données des propriétés
élastiques à l’échelle de la microstructure a été établie, reflétant ainsi le processus de
remodelage osseux.
96
97
PARTIE MUSCULAIRE
98
99
Chapitre I – Etude bibliographique
I LE TISSU MUSCULAIRE I - 1 Classification des différents types de muscles
I - 2 Organisation hiérarchique du muscle strié squelettique
I - 2 - 1 Les différents types de tissus conjonctifs
I - 2 - 2 Architecture des fibres musculaires
I - 2 - 3 Composants responsables de la contraction musculaire
I - 2 - 4 Composants sollicités lors de l’étirement musculaire d’une fibre
II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MECANIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE (SOLEUS DE RAT) II - 1 Modèle de Hill II - 2 Relations caractéristiques du tissu musculaire
II - 2 - 1 Relation Force – Longueur
II - 2 - 1 - 1 Caractérisation de la composante élastique parallèle à l’échelle macro et microscopique
a) Caractérisation de la CEP à l’échelle macroscopique
b) Caractérisation de la CEP à l’échelle microscopique
II - 2 - 1 - 2 Etude du filament intermédiaire : la desmine
II - 2 - 1 - 3 Isoforme de titine
II - 2 - 1 - 4 Influence de la SREC sur l’élasticité passive
II - 2 - 1 - 5 Influence des ponts faiblement attachés sur l’élasticité passive II - 2 - 2 Relation Tension – Extension
II - 2 - 2 - 2 Caractérisation de la composante élastique série (CES)
à l’échelle macro et microscopique II - 2 - 3 Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisations des propriétés mécaniques passives du tissu musculaire
100
III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE
III - 1 Les techniques utilisées
III - 1 - 1 Microscope optique
III - 1 - 2 Les logiciels de calcul des paramètres morphologiques
III - 2 Les paramètres morphologiques
IV SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
101
Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu strié squelettique de soleus de rat
I MATERIELS
I - 1 Le modèle animal
II METHODES
II - 1 Analyse biochimique
II - 1 - 1 Analyse du contenu d’hydroxyproline
II - 1 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle du muscle
II - 1 - 3 Analyse des isoformes de titine à l’échelle de la fibre
II - 2 Techniques ergométriques
II - 2 - 1 A l’échelle du muscle
II - 2 - 1 - 1 Préparation des muscles isolés
II - 2 - 1- 1 Montage expérimental du muscle isolé
II - 2 - 2 A l’échelle de la fibre
II - 2 - 2 - 1 Protocole de pelage
II - 2 - 2 - 2 Montage expérimental de la fibre isolée
II - 3 Mesure de l’élasticité passive des muscles et fibres isolés
II - 3 - 1 Détermination du type de muscle et du type de fibre
II - 3 - 2 Tests mécaniques passifs
II - 3 - 2 - 1 Recherche de la longueur « slack » de la fibre et du muscle
II - 3 - 2 - 2 Le test d’étirement en rampe
II - 3 - 2 - 3 Le test de relaxation
II - 3 - 2 - 4 Le test de relaxation incrémental
II - 3 - 3 Analyse statistique
II - 4 Détermination des propriétés morphologiques du tissu strié squelettique
II - 4 - 1 Choix des échantillons
II - 4 - 2 Détermination des paramètres morphologiques
102
II - 4 - 2 - 1 Protocole de mesure
a) Etude histochimique
b) Protocole de découpe du muscle
c) Mesure des paramètres morphologiques
d) Validation de la méthode de mesure
III RESULTATS III - 1 Résultats de l’analyse biochimique
III - 1 - 1 Evolution du contenu de collagène et d’hydroxyproline en fonction de l’âge
III - 1 - 2 Isoformes et contenu de titine à l’échelle du muscle
III - 1 - 3 Electrophorèses de fibres musculaires
III - 2 Résultats des tests mécaniques
III - 2 - 1 Mesure des propriétés mécaniques passives du muscle
III - 2 - 2 - 1 Résultats de l’analyse statistique
III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives des fibres musculaires
III - 2 - 3 - 1 Résultats des tests mécaniques passifs
III - 2 - 3 - 2 Résultats de l’analyse statistique
III - 3 Résultats de l’analyse morphologique
III - 3 - 1 Diamètres des fibres en fonction de l’âge
III - 3 - 2 Evolution du type et du nombre de fibres en fonction de l’âge
a) Coupe ventrale
b) Evolution longitudinale
III - 3 - 3 Evolution des paramètres morphologiques en fonction de l’âge
a) Evolution de la surface du muscle
b) Evolution de la surface des différents types de fibres
103
Chapitre III - Discussion
I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES I - 1 l’échelle des fibres musculaires
a) comparaison des valeurs mécaniques avec la littérature
b) Comparaison des trois populations de rats
I - 2 l’échelle du muscle
I - 3 Comparaison des échelles macroscopique et microscopique
I - 4 Analyse morphologique
104
105
Chapitre I – Etude bibliographique
I LE TISSU MUSCULAIRE
Le squelette osseux est principalement recouvert par un tissu musculaire squelettique. Ces
muscles sont attachés aux os et peuvent être activés volontairement assurant ainsi la mobilité
du corps en se servant, comme de leviers, des os auxquels ils sont attachés.
I - 1 Classification des différents types de muscles Les muscles squelettiques jouent un rôle important dans le maintien de la posture et au niveau
de la stabilité des articulations.
Le muscle est un organe doué de contractilité qui permet les mouvements chez l’Homme et chez les animaux. Les muscles
représentent 43% du poids corporel total de l’adulte et contiennent 79% d’eau et 7,5% de lipides.
Les muscles du corps humain sont répartis en deux types de muscles : les muscles striés et lisses. Il existe trois types de tissu
musculaire : le tissu strié squelettique (e.g. quadriceps, soleus) et cardiaque (cœur) qui correspondent aux muscles striés et le
tissu musculaire lisse (e.g. paroi des veines, des artérioles) qui correspond au muscle lisse.
I - 2 Organisation hiérarchique du muscle strié squelettique
Figure 1 : Représentation du système muscle – os – tendon (Tortora et Grabowski, 2001)
106
I - 2 - 1 Les différents types de tissus conjonctifs
Dans un muscle intact, les fibres (ou cellules) musculaires sont entourées de différentes
couches de tissu conjonctif. Chaque fibre se trouve à l’intérieur d’une fine gaine de tissu
conjonctif appelée endomysium. Plusieurs fibres et leur endomysium sont placés côte à côte
et forment un ensemble nommé faisceau ; chaque faisceau est à son tour délimité par une
gaine plus épaisse de tissu conjonctif, le périmysium. Les faisceaux sont regroupés dans un
revêtement composé de tissu conjonctif nommé l’épimysium qui enveloppe l’ensemble du
muscle. Toutes ces gaines de tissu conjonctif organisées parallèlement au réseau contractile
vont participer à la production de force passive du muscle, soutenir chaque cellule et renforcer
l’ensemble du muscle qui procure au tissu musculaire son élasticité naturelle.
D’autres structures tels les tendons, l’aponévrose sont des structures en série avec le réseau
contractile et ont pour rôle majeur la transmission de la force contractile.
I - 2 - 2 Architecture des fibres musculaires
On distingue deux grands types de fibres : les fibres lentes (type I) et les fibres rapides (type
II). On peut ainsi définir des muscles dit lents (riches en fibres de type I) comme le soleus du
rat, des muscles rapides (riches en fibres de type II) comme l’EDL (extensor digitorum longus
du rat) et des muscles mixtes comme le quadriceps femoris ou le biceps brachii de l’Homme.
Les fibres lentes I ont une vitesse de contraction lente et une résistance à la fatigue très élevée.
Les fibres rapides II sont également composées de types IIa, IIb, IIc, etc… Les fibres IIa ont
une vitesse de contraction rapide et sont peu fatigables. Les fibres de type IIb sont à
contraction rapides et fatigables. Les fibres de type IIc sont qualifiées d’intermédiaires.
La cellule musculaire est une fibre (figure 2) dont le diamètre varie en moyenne de 10 à
100µm et dont la longueur peut atteindre 20cm. La fibre musculaire est limitée par une
membrane cellulaire appelée le sarcolemme ; elle renferme plusieurs centaines de myofibrilles
(diamètre ≈ 1µm) dont chacune se divise en compartiments de 2,5µm environ, délimités
chacun par deux disques Z et appelés sarcomères.
Selon la taille de la fibre chaque cellule peut posséder des centaines ou des milliers de
myofibrilles, qui constituent environ 80% de son volume.
107
Les myofibrilles sont entourées par le sarcoplasme (cytoplasme) qui contient plusieurs
noyaux cellulaires, des mitochondries, des lysosomes, des inclusions de glycogènes, etc.
Figure 2 : Composition d’une fibre musculaire (a) (Bodem et coll., 2002) avec la structure du
filament fin (b) (actine) et épais (c) (myosine) (Silbernagl et Despopoulos, 1999).
Au microscope, les sarcomères d’une myofibrille apparaissent comme une succession de
bandes alternativement claires et sombres (d’où le nom de muscle strié). Cette alternance de
bandes claires et sombres provient de la disposition des filaments (épais) de myosine et (fins)
d’actine.
Muscle
Fibres
Fibre isolée
Filament de myosine
Ponts d’union Filament d’actine
Bande A
Sarcomère
Bande A Ligne Z Bande
I Zone H
a)
Actine Tropomyosine
Troponine
b)
Méromyosine légère
Méromyosine lourde
c)
108
Titine Actine Myosine
I - 2 - 3 Composants responsables de la contraction musculaire
La contraction musculaire est provoquée par la formation de ponts d’union entre les têtes de
myosine et les filaments fins d’actine (figure 3); la formation de ces ponts va entraîner le
glissement des filaments fins par rapport aux filaments épais (théorie des filaments glissants)
pour finalement conduire au raccourcissement du sarcomère et à la contraction musculaire.
Figure 3 : Illustration du phénomène de contraction musculaire (Silbernagl et Despopoulos, 1999)
I - 2 - 4 Composants sollicités lors de l’étirement musculaire d’une fibre
L’étirement musculaire, à l’échelle microscopique est principalement dû à un troisième
filament appelé titine ou connectine.
Figure 4 : Représentation du filament de titine en rouge (« Protein of the year », Science)
Il sera abordé plus loin dans ce chapitre le rôle de la titine dans l’élasticité passive en
corrélation avec ses composantes structurales.
La titine est une protéine dite « géante » car sa masse moléculaire est largement supérieure
aux autres filaments myofibrillaires et varie en fonction du type de muscles : 2993 kDa pour
le muscle cardiaque et 3700 kDa pour le muscle soleus humain (Labeit et Kolmerer 1995,
Labeit et coll. 1997, Maruyama 1997). Ce filament relie les deux bandes Z et vient
longitudinalement s’attacher au filament de myosine auquel il sert de maintien structural lors
de la contraction musculaire (Horowits et Podolsky 1988).
La titine est composée de domaines extensibles localisés dans la bande I et inextensibles
localisés dans la bande A (figure 5).
Actine
Tête de myosine
109
Figure 5 : Représentation des différents domaines de la molécule de titine de soleus humain (Labeit et coll., 1997)
Le segment de titine localisé dans la bande I est tout d’abord constitué de domaines Ig
(immunoglobuline) suivis d’un inter-domaine nommé N2-A (composé de 4 domaines Ig et
une séquence de 106 résidus d’acides aminés). Ensuite présence d’un domaine PEVK (P :
Proline, E : glutamate, V : Valine, K : lysine) constitué de 2174 résidus d’acides aminés, suivi
d’un autre domaine composé de type Ig (Labeit et Kolmerer, 1995). Le segment de titine localisé dans la bande A est formé par la répétition de domaines de type fibronectine (FN3) et de
domaines de type Ig.
La titine possède des sites de fixation au niveau de la strie Z constituée de protéines
myofibrillaires tel que l’α actinine et la téléthonine et des sites de fixation dans la bande M
pour des protéines telles que myomésine et la protéine M (Gregorio et coll., 1999)
Le filament de desmine (figure 6) (poids moléculaire 52 kDa) est un filament intermédiaire
qui est organisé parallèlement aux sarcomères et qui s’attache aux extrémités des bandes Z.
La desmine possède également des propriétés élastiques pour des longueurs de sarcomères
supérieures à 4,5µm (Wang et coll., 1993). La desmine a aussi un rôle structural dans le
maintien des sarcomères s’ils subissent des détériorations (Wang et Ramirez-Mitchell, 1983).
Figure 6 : Représentation du filament de desmine (Anderson, 2000)
110
II LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES
MECANIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE (SOLEUS DE RAT)
II - 1 Modèle de Hill
Un modèle musculaire a été présenté par Hill en 1938 puis modifié par la suite et schématisé
par Shorten (1987). Ainsi le muscle a été assimilé à un modèle à trois composantes : une
composante purement contractile (CC), une composante élastique parallèle (CEP) et une
composante élastique série (CES) (figure 7).
La composante contractile CC est localisée au niveau du sarcomère et est composée :
1) d’un générateur de force qui correspond à la production de force par les ponts actine-
myosine et 2) d’un amortisseur qui traduit le comportement visqueux de la CC illustré par la
relation force-vitesse.
La composante élastique série CES est l’élément de transmission de la force contractile.
Elle est composée d’une partie passive associée aux structures tendineuses et d’une partie
active localisée au niveau des ponts actine-myosine.
La composante élastique parallèle CEP englobe tous les tissus conjonctifs qui entourent le
muscle : tissu conjonctif, sarcolemme. Elle correspond également à l’interaction résiduelle
entre les protéines d’actine et de myosine lorsque le muscle est au repos. La CEP est
également présente au niveau des protéines de connexion tel que la titine.
Ce modèle est encore le plus utilisé pour caractériser les composantes contractile et élastique
du muscle.
Une attention particulière sera attribuée à la CEP puisqu’elle caractérise les propriétés
élastiques du muscle à l’état passif. En effet, l’objectif de ce travail de thèse est de déterminer
l’élasticité passive du muscle et de la fibre isolée.
Figure 7 : Modèle musculaire à trois composantes
Composante contractile
CC
CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active PassiveEtat actif
Etat passif
tendon
Composante contractileCC
CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active PassiveEtat actif
Etat passif
tendon
Composante contractileCC
CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active PassiveEtat actif
Etat passif
tendon
Composante contractileCC
CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active PassiveEtat actif
Etat passif
tendon
CEPComposante élastique parallèleTissu conjonctif, sarcolemme
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active Passive
TendonsTissu conjonctif
Composante élastique sérieCES
Pontsmyofibrilles
Active PassiveEtat actif
Etat passif
tendon GF
111
Longueur
Force
II - 2 Relations caractéristiques du tissu musculaire
II – 2 - 1 Relation Force - Longueur
II - 2 - 1 - 1 Caractérisation de la composante élastique parallèle (CEP) à l’échelle macro et microscopique
La composante élastique parallèle est caractérisée par la relation force – longueur obtenue par
différents protocoles expérimentaux qui sont : les tests de traction à vitesse quasi-statique et
variable, les test de relaxation.
a) Caractérisation de la CEP à l’échelle macroscopique
Le muscle isolé subit des étirements en rampe avec des vitesses quasi statiques (figure 10)
à partir de sa longueur « slack » (Ls) (longueur du muscle pour lequel il développe une force
minimale). Au delà de cette longueur, les composantes structurelles qui interviennent sont les
substances collagéniques qui constituent les différentes couches du tissu conjonctif (type I :
épimysium, types I et III : périmysium et endomésium, types IV et V : sarcolemme) (Kovanen
et coll., 1984).Une relation force – longueur peut alors être enregistrée. Une augmentation
non linéaire de la force (figure 10) en fonction de l’étirement permet de caractériser le muscle
comme ayant des propriétés mécaniques non Hookéennes ; la force augmente de façon
exponentielle en fonction de la longueur. De plus, ce test d’étirement – relâchement permet de
montrer le comportement viscoélastique du muscle (figure 11) qui se traduit par un
phénomène d’hystérésis assez important lorsque la vitesse d’étirement est rapide comparée à
une faible vitesse d’étirement (figure 10).
Figure 10 : Relation force - longueur Figure 11 : Etirement du muscle à vitesse rapide (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998) (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998)
Les travaux de Kovanen et coll., 1980 et Laurent et coll., 1978 ont permis de montrer que la
compliance (mesure inverse de la pente dans la relation force – longueur) des muscles lents
était inférieure à celle des muscles rapides. Ceci est dû à la composition du muscle puisque les
Longueur
Force
112
-50 0 50 100 150 200 250 3000
200
400
600
800
1000
Temps (s)
Tens
ion
pass
ive
(mN
)
Longueur
CEP
CC
Courbe globale Fmax
L0
muscles lents ont beaucoup plus de collagène que les muscles rapides. Des études menées
(Kovanen et coll., 1984) sur des muscles lathyriques (muscles dépourvus de collagène) ont
également montré l’influence du collagène dans le développement de forces élastiques
passives.
Le muscle isolé est soumis à un test de relaxation (figure 13) à partir de sa longueur
« slack » (Ls). Le muscle subit un ou plusieurs (test cyclique) étirements maintenus pendant
un certain temps avec une vitesse variable. La force passive développée par le muscle dépend
de l’amplitude et de la vitesse d’étirement. Le comportement viscoélastique du muscle est
encore mis en évidence par une décroissance exponentielle de la force au cours du test. Ces
tests mécaniques permettent de solliciter le muscle en condition dynamique et statique afin de
mieux comprendre et interpréter les différentes composantes structurales qui entrent en jeu.
Figure 12 : Tension passive développée par des muscles soleus (sains et sans desmine) de souris soumis à un test de relaxation (Anderson et coll., 2002).
La relation force - longueur à l’échelle de l’organe est donc une association de la composante
contractile avec la composante élastique parallèle figure 14.
Figure 13 : Représentation de la relation force – longueur développée par le muscle (Goubel et Lensel-Corbeil, 1998)
113
Longueur de sarcomère (µm) 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3
0
0,4
0,8
1,2
Elas
ticité
(MN
m-2
)
b) Caractérisation de la CEP à l’échelle microscopique
Les tests mécaniques passifs utilisés à l’échelle macroscopique (muscle) sont également
applicables à l’échelle microscopique (fibre) afin de définir les éléments structuraux
responsables de l’élasticité passive.
En effet, la fibre isolée peut subir des étirements en rampe avec des vitesses variables
(figure 14) démontrant le comportement viscoélastique de la fibre musculaire.
Figure 14 : Illustration du comportement viscoélastique de fibre de spoas suite à différents tests d’étirement / relâchement (Granzier et Wang, 1993).
Ainsi des tests d’étirements cycliques effectués par Wang et coll., 1991 et 1993 sur fibres
isolées ont montré que l’élasticité résultait d’une association entre la matrice exosarcomérique
et endosarcomérique ; la matrice exosarcomérique concerne le réseau des filaments
intermédiaires qui enveloppe et interconnecte les sarcomères ; la matrice endosarcométrique
comprend à la fois des filaments extensibles tels que la titine qui relie la ligne Z et M et des
filaments inextensibles tels que la nébuline.
L’utilisation d’anticorps RT13 a permis de caractériser les zones spécifiques du filament de
titine qui étaient sollicitées pour de petits et grands étirements. L’étirement de la molécule de
titine ainsi que la relation tension passive - longueur de sarcomère est représentée figure 15.
titine actine
myosine
Longueur du sarcomère (µm)
Tens
ion
Figure 15 : Représentation des différentes phases de la relation tension passive - longueur de sarcomère en fonction de l’étirement de la molécule de titine. (Wang et coll., 1991).
114
Cette courbe est divisée en quatre parties :
Phase I : la fibre est étirée à une longueur SL0 « SL : slack length » qui correspond à sa
longueur de sarcomère au repos. A cet étirement les domaines Ig compris dans la
bande I restent repliés sur eux mêmes. La force développée est alors quasi nulle.
Phase II : A partir d’une longueur caractéristique (SLe), les domaines Ig du filament de titine
commencent à se déployer pour de faibles étirements alors que le domaine PEVK se
déplie pour des étirements plus importants. L’association de ces polypeptides va
générer une force qui augmente de façon exponentielle avec l’étirement.
Phase III : Pour de grands étirements, le point Sly « Slack length yield » (point de rupture)
correspond à l’élongation maximale que peuvent supporter les domaines
extensibles de la bande I. Le relâchement de la fibre avant ce point implique un
retour de celle-ci à son état initial.
Phase IV : Au delà du point SLy, c’est à dire pour de grands étirements il y a recrutement
d’une partie du filament inextensible de titine relié à la myosine qui est situé dans
la bande A ; ceci produit des changements structuraux irréversibles au sein de la
titine ainsi qu’une désorganisation du sarcomère.
115
II - 2 - 1 - 2 Etude du filament intermédiaire : la desmine
Les travaux de Salviati et coll., 1990, Wang et coll., 1993, Granzier et coll., 2000 ont consisté
à étudier les propriétés physiologiques et ultra structurelles de fibres pelées de lapin. La
technique a consisté à extraire par étape les filaments supposés responsables de l’élasticité
passive (figure 16). Cette étude a permis de mettre en évidence d’une part l’implication des
filaments intermédiaires (desmine) dans le développement de force passive et d’autre part la
structure viscoélastique des filaments responsables de l’élasticité passive.
Figure 16 : Relation tension passive/longueur réalisée sur fibre pelée avant (A) et après
extraction de iodure de potassium (B) (Wang et coll., 1993)
Ainsi pour de faibles longueurs de sarcomère (jusqu’à 4,5µm) c’est la matrice
endosarcométrique (filament de titine) qui est responsable de la force développée alors que
pour de grands étirements (longueur de sarcomères supérieure à 4,5µm) c’est la matrice
exosarcométrique (filament intermédiaire : la desmine) qui intervient pour générer des forces
passives.
Une récente étude (Anderson et coll., 2002) menée sur des souris dépourvues du filament de
desmine a montré d’une part que l’absence de desmine n’induisait pas une adaptation des
protéines de titine et a montré d’autre part une augmentation significative de la raideur du
muscle. Cette augmentation n’étant pas liée à une modification de la titine, il est émis comme
hypothèse qu’une adaptation d’autres structures s’est produite.
0
0
10
20
10
20
30
SLy
SLo
A
B
KI extracted
2 3 4 5 6Longueur sarcomère (µm)
116
II - 2 - 1 - 3 Isoforme de titine
Les travaux de Wang et coll., 1991 ont montré que l’élasticité passive était dépendante des
isoformes de titine. Ainsi six muscles squelettiques différents de lapin qui expriment à eux
tous trois tailles d’isoformes de titine ont été utilisés. Les fibres isolées extraites de ces mêmes
muscles ont développé des forces plus faibles pour des isoformes de titine à haut poids
moléculaire comparées à de faibles poids moléculaires. L’isoforme cardiaque qui a le plus
petit poids moléculaire développe des forces passives importantes comparées aux fibres
squelettiques qui ont des isoformes de hauts poids moléculaires.
De plus une forte corrélation a été trouvée entre deux paramètres indépendants SLe et SLy et
la taille des isoformes de titine. Pour des isoformes de titine à haut poids moléculaire, les
longueurs caractéristiques SLe et SLy des sarcomères sont plus élevées.
Toutes ces données indiquent que les caractéristiques élastiques des muscles sont liées aux
différentes isoformes de titine.
II - 2 - 1 - 4 Influence de la SREC sur l’élasticité passive
Les travaux de Haugen et Sten-Knudsen 1981 menés sur des fibres intactes d’amphibiens ont
montré que lorsque des étirements en rampe étaient effectués avec de faibles amplitudes la
réponse de la fibre était biphasique : une première phase avec une raideur importante
comparée à une deuxième phase qui contient une raideur plus faible alors que l’étirement se
poursuit. Pour de grandes amplitudes d’étirements, le recouvrement des filaments d’actine et
de myosine diminue impliquant une diminution de l’effet SREC « Short Range Elastic
Component » qui correspond à un petit nombre de ponts attachés, dans un état d’équilibre,
entre l’actine et la myosine.
La raideur passive mesurée via les différents tests mécaniques (figure 17) serait alors
constituée d’une raideur initiale due au phénomène SREC.
117
Figure 17 : Réponse d’une fibre d’amphibien suite à un étirement lent, imposé à partir de 6
longueurs de muscles différents (Haugen et Sten-Knudsen 1981).
Le même phénomène est observé à l’échelle macroscopique (muscle entier).
Cependant les travaux de Bagni et coll., 1995 n’ont constaté aucune présence du phénomène
SREC sur des fibres pelées d’amphibiens. Ces résultats restent encore inexpliqués, Bagni et
coll. ont conclu que le petit nombre de ponts entre l’actine et la myosine était négligeable
comparé au rôle de la titine dans l’élasticité passive.
II - 2 - 1 - 6 Influence des ponts faiblement attachés sur l’élasticité passive
Certains travaux ont démontré que les ponts entre actine et myosine n’étaient pas dans un état
d’équilibre stable mais en équilibre rapide entre attachement et détachement. Cependant
certaines études (Bagni et coll. 1992, Mutungi et Ranatunga 1996) ont montré une
incompatibilité temporelle entre la fréquence des cycles attachement-détachement et les temps
de relaxation. Il fut conclu que la présence de ces ponts ne pouvait pas être remise en question
mais la contribution de ces ponts à la génération de force passive devra être considérée
comme négligeable.
20µN3,56µN3,43µN3,28µN3,13µN2,68µN2,38µN
50ms
66µm
118
II - 2 - 2 Relation Tension – Extension
II - 2 - 2 - 2 Caractérisation de la composante élastique série (CES) à
l’échelle macro et microscopique
La composante élastique série est caractérisée par une courbe tension – détente obtenue
lorsque le muscle ou la fibre sont maintenus dans des conditions isométriques maximales.
La fibre subit des détentes rapides, ceci induit des variations de longueurs importantes qui ont
pour conséquence des chutes brutales de tension.
La relation tension – détente obtenue (figure 18) a été caractérisée en trois phases par Huxley
et Simmons 1971 qui ont corrélé les différentes phases de la relation tension/détente avec les
caractéristiques de la méromyosine lourde. La phase de détente rapide T1 est caractérisée par
l’élément élastique S2 qui se détend instantanément et la phase de réétirement T2 est
caractérisée par la rotation de la tête de myosine S1 qui va réétirer le segment S2.
Variation de tension Amplitude de détente Rotation de la tête de myosine
Figure 18 : Schématisation des différents phénomènes qui interviennent lorsque la fibre subit une détente rapide (Ford et coll., 1977 et Huxley et coll., 1971)
Plusieurs études (Kawai et Schachat 1984) ont montré que la CES présentait des propriétés
élastiques différentes selon le type de fibres. Les travaux de Toursel (1999) ont examiné la
relation structure - fonction des éléments contractiles appartenant aux fibres musculaires.
Cette étude a montré que les transformations des isoformes de myosine s’accompagnaient
d’une modification des caractéristiques élastiques.
Les résultats obtenus à l’échelle microscopique sont extrapolables à l’échelle macroscopique.
Le complexe muscle-tendon de soleus de rat est caractérisé comme ayant une CES plus raide
qu’un muscle rapide (Wells 1965). De plus, la CES est capable de modifier ses propriétés
élastiques selon les contraintes qui lui sont appliquées (Almeida-Silveira et coll., 2000).
a)
Temps T0 T2 T1
1
2 3
c)
b)
119
II - 2 - 3 Synthèse sur les différentes méthodes de caractérisation des propriétés
mécaniques passives du tissu musculaire
Les différents tests mécaniques exécutés à l’échelle de l’organe et de la fibre ont permis de
conclure que :
A l’échelle macroscopique les propriétés mécaniques passives du muscle ont fortement été
corrélées avec la composition intramusculaire du collagène. Les études de Kovanen et coll.,
1984 ont montré que les muscles lents (forte concentration de collagène) avaient des
contraintes à la rupture plus importantes que les muscles rapides. Des modèles lathyriques
(Kovanen et coll., 1984) qui ont une perte de collagène montrent une diminution de la
résistance du muscle lorsque des étirements sont exécutés. Tous ces résultats visent à conclure
que les propriétés mécaniques passives du muscle à l’échelle macroscopique sont dépendantes
du contenu de collagène.
A l’échelle microscopique les propriétés mécaniques passives des fibres isolées sont
dépendantes du filament de titine et de ses isoformes (Horowitz et Podolsky, 1986) pour de
petites longueurs de sarcomères et du filament de desmine pour de grandes longueurs de
sarcomères (Salviati et coll., 1990).
120
III LES DIFFERENTES TECHNIQUES DE MESURE DES PROPRIETES
MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE
III - 1 Les techniques utilisées
Les paramètres morphologiques sont mesurés sur des coupes musculaires découpées au
microtome (épaisseur de l’ordre de 10µm) et prélevées au centre du muscle. Ensuite des
colorations de la myosine ATPase permettent de mettre en évidence certaines catégories de
fibres. Ce protocole expérimental est toujours utilisé pour préparer les coupes musculaires
afin de déterminer des propriétés morphologiques et autres.
III - 1 - 1 Microscope optique
L’acquisition d’une aire représentative de la section musculaire sous microscope optique
permet de mesurer les paramètres morphologiques. Plusieurs études (Polgar et coll., 1973
Halkjaer-Kristensen et Ingemann-Hansen, 1981) prennent des régions qui contiennent en
moyenne 200 fibres pour représenter la section entière du muscle qui contient environ 3000
fibres. Dans les années 80 l’acquisition des images sous microscope optique était faite au
moyen de photographies.
III - 1 - 2 Les logiciels de calcul des paramètres morphologiques
De nombreux logiciels d’analyse morphologique (Summagraphics 10, USA ; Haff 315, Leica)
permettent de mesurer les propriétés morphologiques du muscle
III - 2 Les paramètres morphologiques
Les paramètres morphologiques les plus souvent mesurés dans la littérature sont :
- L’aire moyenne des fibres dites lentes (type I)
- L’aire moyenne des fibres dites rapides (type II)
- La surface totale de la coupe musculaire
De nombreuses études (Larson et coll., 1978 ; Tsuneko et coll., 1984) se sont intéressées à
l’évolution de l’aire des fibres lentes et rapides suivant l’âge. Ces travaux ont montré pour le
121
muscle pectoral mineur que l’aire des fibres lentes (type I) augmente après 60 ans alors que
l’aire des fibres rapides diminue après 40 ans. La répartition de l’aire des fibres en fonction de
la localisation anatomique a notamment été analysée par les travaux de Punkt et coll., 1998.
IV SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
L’étude bibliographique a principalement développé les techniques mécaniques passives
permettant de déterminer les propriétés mécaniques passives du muscle et fibre isolés. De
plus, une revue bibliographique a présenté les différents composants structurels, à l’échelle du
muscle et de la fibre, qui sont responsables de l’élasticité passive. Ainsi le deuxième chapitre
présentera les différentes techniques mécaniques utilisées sur le muscle et sur la fibre isolés
afin de mesurer le module d’Young et les contraintes dynamiques et statiques. Les éléments
structuraux tel que le collagène et la titine seront analysés afin d’expliquer certains
phénomènes mécaniques.
Les propriétés morphologiques seront déterminées sur des coupes entières de muscles soleus
comparé à la littérature qui généralement se limite à l’analyse de 200 fibres.
122
123
Chapitre II - Détermination des propriétés mécaniques et morphologiques du tissu strié squelettique de soleus de rat
I MATERIELS
I - 1 Le modèle animal
L’objectif de cette étude est d’analyser l’évolution des propriétés mécaniques passives des
muscles et fibres striés squelettiques en fonction de l’âge. Le paramètre « âge » a été choisi
dans le but d’obtenir des propriétés morphologiques différentes. Ainsi, des rats mâles Wistar
âgés de 1mois (poids : 104 ± 4g), 4 mois (poids : 395 ± 8g) et 12 mois (poids : 631 ± 46g)
seront utilisés. Ce modèle animal est basé sur l’étude de Kovanen et Suominen, 1987 qui
étudie les propriétés élastiques passives en fonction de l’âge. Les trois populations de rats
seront notées R1, R4 et R12 correspondant respectivement aux rats âgés de 1, 4 et 12 mois.
Les rats de 1 mois proviennent d’une même portée et ont été élevés dans une animalerie située
à l’Université de Compiègne. Les rats de 4 mois ont été achetés à la société Harlan. Les rats
de 12 mois ont été achetés à la société Janvier à l’âge de 6 mois puis élevés au sein de notre
animalerie. Les rats sont placés dans une animalerie qui est éclairée 12 heures sur 24 heures et
où la température est maintenue constante. Des cages (42x42x18cm) abritent environ 3 rats de
même âge ne subissant aucune activité physique et la nourriture (Teklab 18% de protéine,
Harlan) ainsi que l’eau est accessible à volonté.
II METHODES
II - 1 Analyse biochimique
II - 1 - 1 Analyse du contenu d’hydroxyproline
Les muscles congelés dans l’azote liquide et appartenant au groupe de R1, R4 et R12 vont
subir une analyse du contenu en collagène et plus particulièrement en hydroxyproline. En
effet, l’hydroxyproline correspond aux différents types de collagène qui ne peut être dissous à
cause de fortes liaisons et est donc relié aux propriétés mécaniques (Kovanen et coll., 1984).
124
Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Dr. Bellon au Laboratoire de Biochimie
Médicale et Biologie Moléculaire CNRS FRE 2260 de l’ Université de Reims qui a effectué
une partie du protocole expérimental :
Les tissus musculaires sont découpés en morceaux puis broyés à l’aide d’un potter. Il sera
utilisé 12 muscles pour R1, 13 muscles pour R4 et 7 muscles pour R12. La solution de
broyage est alors disposée dans des tubes à azote afin que la solution soit ensuite lyophilisée
pour obtenir le poids sec. Environ 20 mg de tissu lyophilisé par échantillon ont été pesés puis
disposés dans une ampoule à verre scellée auquel on a ajouté 3ml HCL 6N. Les ampoules
sont ensuite scellées au chalumeau.
La partie suivante a été réalisée par le laboratoire de l’Université de Reims :
Les ampoules sont ensuite hydrolysées pendant 24 heures à 110°C. Le lendemain les
ampoules sont ouvertes et le contenu est évaporé sous courant d’azote. Le résidu est alors
repris pour être vortexé et centrifugé. Un dosage colorimétrique par la technique PDAB
(p-diméthylaminobenzaldéhyde) permettra d’évaluer la quantité totale d’hydroxyproline
contenu dans chaque muscle.
I - 2 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle du muscle
La séparation des isoformes de titine a été réalisée en collaboration avec le Pr. Linke
(Université de Heidelberg, Allemagne). Les isoformes de titine sont déterminés par des
électrophorèses sur des gels de polyacrylamide en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS –
PAGE). Cette technique est similaire à celle employée par Linke et Granzier, 1998 et Neagoe
et coll., 2002. Environ 30 à 60 mg de tissu musculaire congelé appartenant aux populations de
1, 4 et 12 mois sont mélangés à une solution tampon qui est constituée de 100 µl d’eau glacée
à laquelle on ajoute 40 µg/ml de leupeptine. Les échantillons sont rapidement centrifugés et
un tampon de solubilisation (1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, 10% glycérol, 8 µg/ml
leupeptine, 6 µM de bleue de bromphenol, 4,3 mM Tris-HCl, pH 8,8, 4,3mM EDTA) est
ajouté aux dépôts. Ensuite, les échantillons sont incubés pendant 5 minutes dans de la glace
puis chauffés dans un bain-marie à 95°C pendant 3 minutes. Le contenu total de protéines est
alors déterminé par spectrophotométrie. Une quantité équivalente de protéines (80 µg) pour
les trois âges est disposée sur un gel SDS - PAGE. Afin de détecter les protéines géantes
(titine) il a été utilisé un gel de concentration 2,8% avec un tampon de Laemmli. Les bandes
de protéines sont visualisées avec du bleu de Coomassie puis digitalisées et analysées selon
leurs densités optiques au moyen d’un logiciel (Phoretix, Newcastle upon Tyne, UK). Des
125
courbes de calibrations sont utilisées afin de normaliser la densité optique par protéine et
l’unité de densité sur chaque gel.
I - 3 - 2 Analyse des isoformes de titine à l’échelle de la fibre
La séparation des isoformes de titine réalisée sur des fibres musculaires a été faite en
collaboration avec le Pr. Linke (Université de Heidelberg, Allemagne). Une technique
similaire à celle précédemment décrite sur le muscle sera utilisée. Des fibres musculaires
extraites de muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois seront placées dans des eppendorfs puis
stockées à -180°C avant l’analyse électrophorétique. Un gel de concentration 2% avec un
tampon de Laemmli sera utilisé pour visualiser les isoformes de titine.
II - 2 Techniques ergométriques
II - 2 - 1 A l’échelle du muscle
II - 2 - 1 - 1 Préparation des muscles isolés
L’étude des propriétés élastiques passives sera menée sur un muscle typiquement lent
(soleus). Les rats sont anesthésiés avec une injection intrapéritonéale d’uréthane (1,2g/Kg) et
le muscle soleus est alors disséqué au niveau des pattes droite et gauche. Un total de 16, 16 et
10 muscles soleus ont été respectivement disséqués sur des rats âgés de 1, 4 et 12 mois.
Pendant la dissection les extrémités distale et proximale du muscle sont attachées avec un fil
noué au début de l’extrémité tendineuse. Les muscles disséqués sont ensuite immédiatement
pesés sur une balance (BP61S, Sartorius). Les rats sont ensuite sacrifiés avec une solution
létale d’uréthane.
Ces muscles vont subir des tests mécaniques puis ils seront plongés dans de l’isopentane
(permettant la conservation des structures musculaires internes) et congelés dans de l’azote
liquide afin de déterminer ultérieurement leurs propriétés morphologiques.
II - 2 - 1 - 2 Montage expérimental du muscle isolé Le muscle soleus avec ses attaches est disposé dans une cuve remplie de solution
physiologique (Ringer). Cette cuve est alimentée en oxygène (95% d’oxygène et 5% de
dioxyde de carbone) et maintenue à une température constante de 25°C avec un pH de 7,3
126
grâce à un système de circulation. Le muscle est alors mis dans des conditions physiologiques
in vitro qui sont proches de celles in vivo. Les fils vont permettre d’attacher l’extrémité
proximale du muscle à un capteur de force (Entran, ELJ-SO56D-2,5, France, étendue de
mesure : 2,5N, fréquence de résonance supérieure à 1kHz) et l’extrémité distale à un capteur
de déplacement (EX58 n°07-S01 PRODERA, France) ; précisons qu’aucun espace libre n’est
laissé entre les capteurs et le muscle. Le muscle est alors maintenu en position horizontale
dans une cuve sous contrôle physiologique (figure 1).
Figure 1 : Position horizontale du muscle au sein de la cuve
Le protocole expérimental permettant d’imposer des étirements aux muscles est le suivant :
un logiciel (Myotest 3009) développé au sein du laboratoire de l’UTC par la société Bio2M
permet de rentrer manuellement certains paramètres tels que : la distance d’étirement, la durée
de l’étirement ainsi que la vitesse d’étirement. Les paramètres théoriques sont ensuite envoyés
à un PID (Potentiel Intégrateur Dérivateur) (UTC service électronique) qui est relié à un pot
vibrant (EX58 n°07-S01 PRODERA, France) auquel est relié le capteur de déplacement
(figure 2). On visualise ensuite sur un oscilloscope (Hewlett Packard 54645A 100MHz)
l’étirement imposé ainsi que la réponse du muscle soumis à cette contrainte. Les signaux de
forces et de déplacements sont également enregistrés sur un ordinateur.
Capteur de déplacement
Direction de l’étirement
Capteur de force
Fil
Muscle soleus
127
Avant tout test d’étirement, on impose manuellement au muscle quelques séries d’étirements /
raccourcissements afin de diminuer les effets de thixotropie (effet mémoire); ces pré
étirements auront pour but de remettre le muscle dans un état nouveau dit stable qui ne sera
plus dépendant des phénomènes qu’il aura précédemment subis.
Trois tests mécaniques passifs vont être imposés au muscle : le test d’étirement en rampe, le
test de relaxation et le test de relaxation incrémental. A la fin de chaque test le muscle est
détaché puis congelé dans de l’azote liquide afin que ses propriétés morphologiques soient
déterminées.
128
Figure 2 : Chaîne d’acquisition des signaux force et déplacement.
Tige PID
Consigne théorique
Mesure
Signal d’erreur
Amplificateur de
puissance
Pot
vibrant
Capteur Capteur de force
Conditionneur Oscilloscope
Acquisition sur PC
Alimentation
129
II - 2 - 2 A l’échelle de la fibre
II - 2 - 2 - 1 Protocole de pelage
Le muscle soleus de la patte droite, appartenant à des rats âgés de 1, 4 et 12 mois, est disséqué
puis découpé dans le sens longitudinal des fibres en 2-3 morceaux. Ces petits bouts de muscle
vont subir un pelage chimique grâce à une solution de pelage qui contient :
Propionate de potassium, Acétate de magnésium 170 mM, MOPS (acide 3 morpholino
propane sulfonique) 5 mM, ATP 2,5 mM et K2EGTA 2,5m M ; l’EGTA (éthylène glycol bis
[β aminoéthyl éther N, N’ tetra-acide acétique]) a les propriétés de fixer des cations
métalliques en formant un complexe stable ; celui-ci va alors perméabiliser l’enveloppe
externe de la fibre (le sarcolemme) sans altérer les structures sous-jacentes (Eastwood et coll.,
1979).
Le protocole de pelage est issu des travaux de Mounier et coll., 1989 :
Après isolement des morceaux de muscles, ceux-ci sont directement disposés dans la solution
de pelage pendant quatre heures à une température de 0°C ; ensuite la solution de pelage est
renouvelée par de la solution fraîche et les biopsies restent 24 heures à une température de
0°C ; le lendemain les biopsies sont rincées avec de la solution de pelage puis stockées dans
une solution de conservation composée de 50% de glycérol et 50% de solution de pelage ; les
biopsies peuvent alors être conservées à une température de -20°C pendant 2 mois. Afin
d’éviter la détérioration des protéines de titine deux stratégies sont appliquées :
- Ajouter des inhibiteurs de protéase tel que la leupeptine (20 µg/ml), l’aprotinine
(5 µg/ml) et de la pepstatine (1 µg/ml).
- Les fibres musculaires sont testées 10 jours après le pelage de façon à ce que la
dégradation n’ait pas eu le temps de commencer.
A partir de chaque biopsie, il sera alors possible d’extraire un grand nombre de fibres
musculaires (1-3mm) sous loupe binoculaire.
130
II - 2 - 2 - 2 Montage expérimental de la fibre isolée
Les fibres musculaires (1-3 mm de long) sont extraites des biopsies de R1, R4 et R12 au
moyen de pinces très fines sous loupe binoculaire. En moyenne, 4 à 5 fibres par muscle sont
isolées et un total de 19, 18 et 24 fibres ont respectivement été disséquées des biopsies âgées
de 1, 4 et 12 mois.
Un fil de soie est noué à chaque extrémité de fibre isolée puis l’ensemble est disposé dans une
cuve (2x1cm) remplie de solution relaxante (R) (même composition que la solution de
pelage). L’étape suivante sera de suspendre la fibre par ses deux extrémités dans la cuve: le fil
de soie noué à une extrémité sera glissé et ainsi fixé sous un clip qui est disposé sur le bras
d’un vibrateur électromagnétique (Cambridge Technology Inc, Watertown, USA; modèle
6350) dont le système d’asservissement est piloté par ordinateur ; la deuxième extrémité de la
fibre qui est libre sera dans un premier temps enroulée avec une pince très fine autour d’un
crochet qui est monté sur une jauge de contrainte (AE 801, AME, Horton, Norway ; fréquence
de résonance dans l’air 4,52 kHz) et dans un second temps collée sur ce même crochet grâce à
de l’acétate de cellulose qui est dissous dans une goutte d’acétone.
La tension qui sera développée par la fibre ainsi que le déplacement induit par le moteur
seront visualisés sur un oscilloscope numérique (Nicolet ; modèle 310) et imprimés sur un
enregistreur papier (Gould ; modèle 40-8474-02) (figure 3).
La longueur de la fibre ainsi que son diamètre seront mesurés sous loupe binoculaire (x 80)
qui contient un oculaire micrométrique. La fibre étant considérée comme cylindrique, sa
section est calculée par la relation π d2/ 4, d étant le diamètre de la fibre.
La longueur de sarcomère de la fibre est mesurée par un système de diffraction d’onde à
travers la fibre ; en effet un faisceau laser Hélium/Néon (Melles-Griot, Carlsbad, USA ;
longueur d’onde 632,8 nm, puissance 10 mW) est dirigé perpendiculairement à la fibre et le
réseau de diffractions apparaît sur un support gradué permettant de lire la longueur du
sarcomère de la fibre. Lorsque la fibre est étirée à 120% de sa longueur initiale, la longueur de
sarcomère est de 2,6 µm pour les fibres musculaires de rats âgés de 1, 4 et 12 mois.
131
Figure 3 : Montage expérimental d’une fibre isolée (Toursel, 1999).
Ordinateur
Oscilloscope numérique
Enregistreur
Synchronisation
Système d’asservissement
Disquette de sauvegarde
Micromanipulateur
Support Jauge de contrainte
Crochet de fixation
Fibre musculaire Cuve en verre
Clip de fixation Pompe à vide
Vibrateur électromagnétique
Micromanipulateur
132
a)
b) c) Figure 4 : Visualisation du plan de travail utilisé (a) pour fixer la fibre isolée au sein d’une cuve (b) entre le capteur de force (c) et le dispositif d’étirement motorisé
Loupe Binoculaire
Cuve
Cuve
2 cm
Etirement motorisé
Crochet fixé sur le capteur de force
133
II - 3 Mesure de l’élasticité passive des muscles et fibres isolés II - 3 - 1 Détermination du type de muscle et du type de fibre
Le muscle soleus a été choisi pour cette étude car il est majoritairement constitué de fibres
lentes et devient de plus en plus lent avec l’évolution de l’âge.
Les fibres isolées qui vont subir des tests mécaniques seront uniquement des fibres lentes.
Ainsi, un critère d’identification basé sur la différence de sensibilité des fibres lentes et
rapides au calcium (Ca2+) et au strontium (Sr2+) sera utilisé (Mounier et coll., 1989). En effet,
il est bien connu que les fibres rapides sont moins sensibles au Sr2+ qu’au Ca2+ alors que les
protéines contractiles des fibres lentes ont la même affinité pour le Sr2+ et Ca2+ (Takagi et
Endo, 1977). Les travaux de Stephenson et Williams 1981 ont montré que les tensions
relatives développées par des fibres rapides et lentes induisaient des relations tension/pCa et
tension/pSr (pCa = - log [Ca2+] et pSr = - log [Sr2+]) qui étaient d’allures différentes.
Figure 5 : Identification d’une fibre rapide (EDL : Extensor Digitorum Longus) et d’une fibre
lente (Soleus) par le test du strontium (Stephenson et Williams, 1981).
134
Le protocole de typage des fibres qui a été utilisé dans cette étude ne reprend pas l’ensemble
de toutes les concentrations en Ca2+ et Sr2+ mais uniquement certaines concentrations qui sont
particulièrement sensibles aux différences typologiques. Les concentrations utilisées sont les
suivantes :
- pCa 4,2 qui induit une tension maximale pour les deux types de fibres
- pCa 5,0 qui induit une tension à 95% pour les deux types de fibres
- pSr 3,4 qui induit une tension maximale pour les deux types de fibres
- pSr 5,0 qui induit une tension à 80% pour les fibres lentes et à 10% pour les fibres rapides
Le protocole expérimental est alors le suivant :
La fibre est étirée à 120% de sa longueur de repos (longueur de la fibre in situ et par
conséquent développement d’une force maximale) dans la cuve qui contient de la solution R.
La fibre est ensuite lavée par la solution W* qui enlève toute trace d’EGTA avant d’aborder
l’expérimentation. Les solutions pCa* 5,0 et pCa* 4,2 sont mises successivement dans la cuve
induisant une contraction maximale de la fibre en saturant tous les sites calciques libres de la
troponine C qui actionne le phénomène de contraction. La cuve est ensuite vidée puis remplie
d’une solution relaxante R qui provoque le relâchement de la fibre. La solution de lavage est
ensuite ajoutée de façon à enlever de nouveau les traces d’EGTA. Les solutions pSr 3,4 puis
pSr 5,0 sont ensuite successivement ajoutées et les fibres lentes développent une grande
tension lorsque la solution pSr 5,0 est ajoutée (figure 6). * La solution de lavage W est composée de Kprop 185mN, MgAgc2, 2,5mM, MOPS 10mM,
ATP 2,5mM.
La solution PCa est obtenue en ajoutant à la solution de lavage du Ca-EGTA et K2-EGTA.
La solution PSr est obtenue en ajoutant à la solution de lavage du Sr-EGTA et du K2-EGTA.
Figure 6 : Exemple d’enregistrement d’une contraction développée par une fibre musculaire
Solution R de relaxation
Solution PCa 5
Solution PCa 4,2
Solution R
Solution W
Solution PSr 5
Solution PSr 3,4
Solution R
Solution R
135
Ce test d’identification permet, en plus de déterminer le type de la fibre, de confirmer sa
viabilité c'est-à-dire son aptitude à développer des forces ; en effet une fibre qui aurait été
endommagée lors du pelage chimique ou lors de la dissection serait immédiatement détectée
par des tensions développées trop faibles ou dans le pire des cas par une rupture de la fibre.
Ce test permet de mettre en condition la fibre (positionnement des protéines sarcoplasmiques)
avant qu’elle ne subisse différents tests mécaniques.
II - 3 - 2 Tests mécaniques passifs
II - 3 - 2 - 1 Recherche de la longueur « slack » de la fibre et du muscle
La fibre isolée venant d’être identifiée est relâchée à sa longueur de repos pendant une dizaine
de minutes.
Avant d’effectuer les différents tests mécaniques, la longueur dite « slack length » (Ls) de la
fibre est dans un premier temps recherchée ; cette longueur Ls correspond au début de tension
développée par la fibre lorsque celle-ci est manuellement et très doucement étirée. Une fois la
longueur Ls trouvée les trois tests mécaniques (étirement en rampe, test de relaxation et test
de relaxation incrémental) (Anderson 2000) qui permettent de caractériser l’élasticité passive
du muscle seront appliqués. Ces tests mécaniques sont respectivement effectués sur 19, 18 et
24 fibres lentes issues des populations R1, R4 et R12.
Des pré-manipulations ont permis de déterminer les vitesses et les amplitudes d’étirements
qui seront appliquées.
Une démarche identique à la fibre sera appliquée au muscle ; en effet avant de tester
mécaniquement le muscle, sa longueur Ls sera recherchée par un étirement manuel permettant
ensuite d’imposer au muscle trois tests d’étirements passifs identiques sur le principe à ceux
appliqués sur la fibre.
136
∆L Fs = 50mN
Déplacement (mm)
Force (mN)
T(s)
II - 3 - 2 - 2 Le test d’étirement en rampe
Ce test est utilisé depuis plusieurs décennies afin de caractériser l’élasticité passive des fibres
et des muscles.
Protocole expérimental appliqué à la fibre :
Il consiste à étirer la fibre à partir de sa longueur Ls avec une amplitude correspondant à 50%
de sa longueur « slack » et à imposer une vitesse très lente et constante de 0,005Ls/s. La fibre
subit cet étirement pendant 100 secondes et est relâchée avec la même vitesse (figure 7). La
fibre est ensuite complètement relâchée à sa longueur Ls pendant 5 minutes afin que les
composantes élastiques de la matrice sarcomérique et endosarcomérique retrouvent leur état
initial ;
Figure 7 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R12 soumise à un test d’étirement en rampe (∆L : étirement (mm), Fs : force statique (µN), T : temps (s)).
Protocole expérimental appliqué au muscle :
De même que pour les tests menés sur la fibre, les muscles appartenant à R1, R4 et R12 sont
étirés à partir de Ls avec une vitesse très lente de 1mm/s ; les muscles seront étirés avec une
amplitude qui correspond à 20% de leur longueur de repos. Par conséquent R1, R4 et R12
seront respectivement étirés de 3mm, 5mm et 6mm. Le muscle est ensuite relâché à sa
longueur Ls (figure 8).
Figure 8 :
Représentation expérimentale de la force développée par un muscle R12 lors d’un test d’étirement en rampe
100s∆L
Fs70µN
T (s)
100s∆L
Fs70µN
T (s)
100s∆L
100s100s∆L
Fs70µN
T (s)
Fs70µN70µN
T (s)
137
Paramètres mesurés :
Ce test permet d’obtenir aussi bien pour la fibre que pour le muscle une relation tension
passive / longueur d’étirement pour les trois populations R1, R4 et R12 ; l’étirement en rampe
met en évidence le comportement non linéaire de la fibre et du muscle. Lorsque l’amplitude
d’étirement atteint 50% de la longueur « slack » pour la fibre et 20% de la longueur slack
pour le muscle, la force maximale développée pour cet étirement est analysée ; en ce point la
force est appelée « force statique » Fs (unité de Fs : µN(fibre) ou mN(muscle)) et il sera
calculé en ce point le module d’Young E (kN/m2) comme étant le rapport entre la tension
statique σs (kN/m2) et la déformation ∆l (mm).
La contrainte est égale par définition à la force développée divisée par la section. La fibre est
considérée comme ayant une section circulaire alors que la section (S) du muscle soleus est
définie par la relation de Ranatunga, 1982 :
L
mSm×
=72.0
Equation 1
m équivaut à la masse du muscle en mg et 0,72xLm correspond à la longueur des fibres en
mm.
La section est définie par le rapport entre la masse et la longueur des fibres au sein du muscle.
On suppose que la masse volumique du muscle est de l’ordre de 1 g.cm3 et que la longueur de
la fibre équivaut à 72% de la longueur totale du muscle. La longueur de la fibre est mesurée
sous une loupe binoculaire (x 80) qui contient un oculaire micrométrique.
138
650µN
8s
Fd (µN)
T (s)
60s
Fs650µN
8s
Fd (µN)
T (s)
60s
Fs650µN
8s
Fd (µN)
T (s)
60s
Fs650µN
8s
Fd (µN)
T (s)
60s
Fs
II - 3 - 2 - 3 Le test de relaxation
Protocole expérimental appliqué à la fibre:
Une fois la longueur « slack » de la fibre trouvée, celle-ci va subir un étirement d’amplitude
50%Ls avec une vitesse très rapide 10Ls/s. L’étirement est maintenu pendant 60 secondes
puis la fibre est relâchée à sa longueur Ls (figure 9). La reproductibilité sera obtenue en
laissant la fibre reposer 5 minutes, de façon à ce que toutes les structures élastiques retrouvent
leur état initial, puis en recommençant le test depuis le début.
Figure 9 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R4 soumise à un test de relaxation (Fd : force dynamique, Fs : force statique). Protocole expérimental appliqué au muscle:
A partir de la longueur « slack », les différents muscles vont subir les mêmes étirements que
le test en rampe (R1 : 3mm, R4 : 5mm et R12 : 6mm) mais avec des vitesses d’étirement qui
sont différentes. En effet des pré-manipulations ont été réalisées afin de rechercher la vitesse
maximale pour laquelle le muscle développe une force maximale. Il sera alors appliqué des
vitesses de l’ordre de 600mm/s pour les groupes R4 et R12 et une vitesse de 250mm/s pour le
groupe de R1. L’étirement sera maintenu pendant 180 secondes puis le muscle sera relâché à
sa longueur Ls. De même que pour la fibre, la reproductibilité sera calculée en refaisant le test
deux fois sans oublier de laisser reposer le muscle pendant 10 minutes afin d’éviter les
phénomènes de thixotropie.
Figure 10 : Représentation expérimentale de la force développée par un muscle isolé R4 soumis à un test de relaxation (Fd : force dynamique, Fs : force statique).
625mV
20ms
139
Paramètres mesurés :
Le comportement fibre/muscle à ce test d’étirement est tout d’abord caractérisé par un pic de
force passive nommé Fd « force dynamique » qui sera directement mesuré sur le graphe; en
effet Fd correspond à la force maximale développée par la fibre ou le muscle lorsqu’ils sont
soumis aux conditions dynamiques du test. La force dynamique est ensuite suivie d’une
décroissance exponentielle et au bout d’un certain temps t (60 secondes pour la fibre ou 180
secondes pour le muscle) un état statique prend place. La deuxième force mesurée est alors
appelée force statique « Fs » et est atteinte à la fin du plateau d’étirement lorsque la fibre ou le
muscle sont complètement relaxés d’où également son nom de force relaxée. Les tensions
statiques seront mesurées de la même façon que pour le test d’étirement en rampe. Les
tensions dynamiques seront calculées au moyen du rapport entre les forces dynamiques
développées et la surface du muscle ou de la fibre.
II - 3 - 2 - 4 Le test de relaxation incrémental
Protocole expérimental appliqué à la fibre :
Ce test est une copie du test de relaxation sauf que l’amplitude d’étirement est divisée par 5 ;
en effet la fibre à partir de sa longueur Ls va subir un enchaînement de 5 tests de relaxation.
Chaque incrément correspond à un étirement d’amplitude 10%Ls et à une vitesse d’étirement
de 10Ls/s. Chaque étirement est maintenu pendant une durée de 60 secondes et à la fin du test
complet la fibre est relâchée à sa longueur Ls (figure 11). La reproductibilité sera comme
précédemment déterminée après un temps de repos accordé à la fibre.
Figure 11 : Représentation expérimentale de la force développée par une fibre isolée R4
soumise à un test de relaxation incrémental (Fs : force statique).
60s
T (s)
Fs50µN
60s
T (s)
Fs50µN
60s
T (s)
Fs50µN
140
Protocole expérimental appliqué au muscle :
L’étirement du muscle n’est pas contrôlé par le même logiciel que les deux précédents tests ;
ce logiciel a également été développé au sein du laboratoire de l’UTC. Ce test est une copie
du test de relaxation sauf que le pas d’étirement est divisé par 4 : on notera L1, L2, L3 et L4
les quatre longueurs d’étirement imposées à R1, R4 et R12 (tableau 1).
Tableau 1 : Représentation des différentes longueurs d’étirement pour des muscles isolés âgés de 1, 4 et 12 mois et soumis à un test de relaxation incrémental.
Les vitesses d’étirement sont très rapides (imposées par le logiciel) et la durée de l’étirement
est de l’ordre de 60 secondes. A la fin du test le muscle est relâché et il revient à sa longueur
Ls. La reproductibilité est également mesurée dans les mêmes conditions que les tests
précédents.
Figure 12 : Représentation expérimentale de la force développée par un muscle isolé R4
soumis à un test de relaxation incrémental (Fd : force dynamique (mN),
Fs : force statique (mN)).
L1
(mm) (%Ls)
L2
(mm) (%Ls)
L3
(mm) (%Ls)
L4
(mm) (%Ls)
R1 0,7 4 1,5 8,6 2,2 12,7 3 17,3
R4 1,2 4,8 2,5 10,2 3,7 15,1 5 20,4
R12 1,5 4,9 3 9,83 4,5 14,7 6 19,6
L 1 L 2 L3 L4
Fd
Fs = 40mN
60S
141
Paramètres mesurés :
Comme pour le test de relaxation, la fibre ou le muscle sont soumis à la fois à des conditions
dynamiques et statiques. La force statique (Fs) ou relaxée atteinte au dernier incrément sera
mesurée pour être comparée avec les autres forces statiques enregistrées lors des précédents
tests. De plus, l’évolution des forces statiques (Fs) et dynamiques (Fd) en fonction de la
longueur d’étirement sera mesurée.
II - 3 - 3 Analyse statistique Des tests Anova ont été réalisés avec le logiciel Statgraphics (Sigma Plus) afin de déterminer
les variations des forces et tensions dynamiques et statiques développées entre les trois
populations de muscles.
Des tests Kruskall-Wallis réalisés avec le même logiciel Statgraphics ont été réalisés afin
d’étudier les variations de forces dynamiques et statiques entre les trois populations de fibres.
142
II - 4 Détermination des propriétés morphologiques du tissu strié squelettique II - 4 - 1 Choix des échantillons
Lorsque le test d’étirement mécanique effectué sur le muscle isolé est fini, celui-ci est détaché
puis retiré de la cuve pour être plongé dans de l’isopentane permettant ainsi de conserver les
structures géométriques internes du muscle avant qu’il ne soit définitivement congelé dans de
l’azote liquide.
Huit muscles par groupe d’âge (R1, R4 et R12) qui ont préalablement subi des tests
mécaniques, soit un total de 24 muscles seront analysés afin de déterminer leurs propriétés
morphologiques en fonction de l’âge.
II - 4 - 2 Détermination des paramètres morphologiques
Les paramètres morphologiques mesurés sont :
- La surface totale du muscle
- La surface moyenne des fibres lentes (type I)
- La surface moyenne des fibres intermédiaires (type IIc)
- La surface moyenne des fibres rapides (type IIa)
Les paramètres morphologiques des fibres de type IIb ont été mesurés avec un pH 4,5 sur la
coupe ventrale de chaque muscle soleus. Les résultats obtenus étaient inexploitables compte
tenu du très faible pourcentage de fibres IIb au sein du soleus. Pour cette raison, il ne sera pas
tenu compte du pourcentage de fibres IIb dans cette étude.
II - 4 - 2 - 1 Protocole de mesure
a) Etude histochimique
Les muscles congelés appartenant à R1, R4 et R12 vont être découpés en plusieurs sections
transverses au moyen d’un microtome cryostat. Les coupes sont espacées de 10µm,
l’épaisseur de coupe est de l’ordre de 7µm et les muscles sont maintenus à -20°C pendant la
découpe. Les coupes sont ensuite disposées sur des lamelles de verre puis colorées par la
méthode de Brooke et Kaiser (1970) à un pH de 4,3 qui met en évidence l’activité
143
enzymatique de la myosine. Cette technique de coloration permettra l’identification des fibres
« lentes » (type I) qui apparaissent sous une couleur noire et l’identification des fibres
« rapides » (type II) : le type II est divisé en deux sous groupes qui correspondent aux fibres
intermédiaires (type IIc) représentées par une couleur marron clair et aux fibres rapides (type
IIa) qui sont représentées par une couleur blanche.
b) Protocole de découpe du muscle
Tous les muscles vont être découpés longitudinalement de la partie distale à la partie
proximale suivant 5 régions (figure 13) identifiées par la numérotation suivante : D1….D5 ou
G1….G5, D signifiant le muscle de la patte droite et G le muscle de la patte gauche.
Figure 13 : Schéma de découpe d’un muscle de 13mm de longueur appartenant à R1.
A l’intérieur des zones 1, 2, 3, 4 et 5 il sera effectué 5 coupes successives espacées de
10µm. Toutes ces coupes seront ensuite soumises à une coloration à pH = 4,3.
Après coloration des différentes coupes, il sera choisi la coupe la plus représentative de
chaque zone à étudier.
c) Mesure des paramètres morphologiques
Les lamelles de verre qui contiennent les différentes coupes sont ensuite disposées sur une
platine motorisée sous un microscope optique à transmission. Un logiciel (QWIN Leica)
pilote automatiquement la platine, avec un pas de balayage de 2 mm suivant l’axe X et Y,
permettant d’obtenir une reconstruction totale de la coupe musculaire (figure 14). Cette
Distal Proximal
0.0 5 mm
D2/G2 D1/G1 D3/G3 D4/G4 D5/G5
3.28mm
6.65mm
9.74mm 12.97mm
144
cartographie représente un assemblage de plusieurs images qui peuvent varier de 25 à 90
images selon l’âge du muscle et la zone longitudinale à étudier.
Le comptage ainsi que la mesure de l’aire des différents types de fibres ont été réalisés sur
l’ensemble de la coupe au moyen d’un seuillage. Les paramètres morphologiques à étudier
sont directement programmés au sein du logiciel.
L’aire de chaque fibre, ici en vert (figure 16), correspond à l’aire de chaque pixel qui est
contenu dans une fibre (aire d’un pixel = 0,99 µm2). Toutes les images seuillées de la coupe
sont visualisées l’une après l’autre afin de réajuster parfois le seuillage ; en effet des
différences de contrastes peuvent exister sur un même type de fibre, ceci étant dû à la découpe
de la section qui n’est pas homogène sur toute la surface.
Les résultats sont ensuite directement obtenus sous un fichier texte.
Figure 14 : Représentation d’une coupe ventrale de muscle R1
145
Figure 15 : Représentation des différents types de fibres (I, IIc et IIa) appartenant à la région
d’intérêt définie par un carré blanc sur la précédente coupe musculaire R1
Figure 16 : Seuillage des fibres de type I
Type I
Type IIc
Type IIa
60µm
60µm
146
d) Validation de la méthode de mesure
La calibration ainsi que la précision de la méthode de mesure des paramètres morphologiques
ont été réalisées en utilisant une cellule de Thoma dont la géométrie (figure 17) et les
dimensions sont connues.
Figure 17 : Représentation d’une cellule de Thoma
Tableau 2 : Comparaison entre les surfaces théoriques et les surfaces obtenues par QWin
Surface théorique(µm2)
Surface obtenue QWIN
Pourcentage d’écart
625 615 1,6% 1250 1287 2,9% 2500 2489 0,4% 5000 4918 1,6%
1200 µm2
625 µm2
2500 µm2
147
0 50
100 150 200 250
R1 R4 R12
Col
lagè
ne (µ
g)
**
III RESULTATS III - 1 Résultats de l’analyse biochimique III - 1 - 1 Evolution du contenu de collagène et d’hydroxyproline en fonction de l’âge Le contenu d’hydroxyproline calculé pour 1mg de poids sec diminue avec l’augmentation de
l’âge. Les valeurs moyennes avec écart type (SD) d’hydroxyproline contenu par les muscles
« soleus » de rats âgés de 1 (R1), 4 (R4) et 12 (R12) mois sont respectivement de 0,49 ± 0,19
µg, 0,30 ± 0,15µg et 0,14 ± 0,08µg. La reproductibilité réalisée sur des muscles âgés de 12
mois avec un contenu équivalent de tissu lyophilisé est de l’ordre de 4%.
Le collagène contenu dans le muscle entier sec a été calculé à partir du contenu total
d’hydroxyproline dans le muscle sec et à partir du facteur de conversion 7,25 (Woessner
1961). La quantité de collagène augmente significativement jusqu’à l’âge de 4 mois puis
diminue non significativement à l’âge de 12 mois (figure 1b).
Figure 1 : Evolution du contenu d’hydroxyproline (a) et de collagène (b) en fonction de l’âge
(P.S : Poids Sec) (* : P < 0,05 ** :P < 0,001)
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70
R1 R4 R12hydr
oxyp
rolin
e (µ
d/m
g p.
s)
**
*
**
a)
b)
148
III - 1 - 2 Isoformes et contenu de titine à l’échelle du muscle
L’électrophorèse de titine (figure 2a) réalisée sur un gel SDS - polyacrylamide 2% a permis de
conclure la présence d’une seule isoforme en fonction de l’âge. Le poids moléculaire de la
molécule de titine (3700 KDa) trouvée au sein du muscle soleus de rat est équivalent à celle
du soleus de lapin. Le contenu relatif de titine montre une légère augmentation entre R1 et R4
puis une diminution entre R4 et R12 ; cette tendance n’étant pas significative aucune
différence significative du contenu de titine entre les trois groupes n’a pu être observée (figure
2b). Un gel SDS - polyacrylamide 2,8% a permis de conclure que le rapport titine / myosine
(MHC) (figure 2c) est toujours proche de 0,1 quel que soit l’âge. Le nombre d’observations
réalisées est de 4.
Figure 2 : Représentation des électrophorèses de titine sur gel SDS à 2,8% (a), ainsi que du contenu relatif de titine (%) total au sein de chaque muscle (b) et représentation du
rapport titine / myosine en fonction de l’âge (c).
Titine
Nébuline
MHC
2,8% SDS-PAGE
3700 KDa
800 KDa
205 KDa
1 4 12
a)
Contenu de titine
1 4 120
50
100
150
200
b)
Rapport titine : MHC
Mois
1 4 120
0,05
0,10
0,15
c)
149
Fibres isolées
Titine
Nébuline
Soleus de lapin
III - 1 - 3 Electrophorèses de fibres musculaires Les électrophorèses de titine (figure 3) ont été effectuées sur des fibres musculaires de R1, R4
et R12 avec un gel SDS - polyacrylamide 2%. Ces données ont permis de conclure que la
mobilité de la titine était non significativement différente entre les trois groupes. Ce résultat
confirme celui obtenu à l’échelle du muscle à savoir une seule isoforme de titine en fonction
de l’âge. Le nombre d’observations réalisées est de 4.
Figure 3 : Profils électrophorétiques réalisées sur un gel SDS 2% caractérisant des fibres
lentes soleus issues de R1, R4 et R12.
150
III - 2 Résultats des tests mécaniques III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives du muscle
a) Test d’étirement en rampe
Les différents muscles de R1, R4 et R12 ont subi un étirement de 20% de leur longueur
initiale. Ce test met en évidence le comportement non linéaire de la force passive en fonction
de l’étirement pour les trois populations.
Le tableau 1 résume les forces et tensions statiques obtenues pour un test d’étirement en rampe.
R1 n = 16
R4 n = 16
R12 n = 10
Poids du muscle (mg)
Longueur du muscle (mm)
Section (mm2)
73,7 ± 5,2
17 ± 1
6,11 ± 0,42
201,6 ± 23,9
24 ± 1
11,99 ± 1,22
271,7 ± 23,6
30 ± 1
13,2 ± 1,21
Test d’étirement en
rampe
Fs (mN)
σs (kN/m2)
13 – 67 27
30 ± 11
4,02 – 12,14 4,52
5,33 ± 2,15
39 – 75 48
52 ± 12
3,08 – 6,28 4,22
4,36 ± 0,93
20 – 34 27
27 ± 4
1,39 – 2,48 2,04
2,04 ± 0,32
E (kN/m2)
20,11 – 60,7
27,31 31,04 ± 11,09
15,39 – 31,38
21,08 21,82 ± 4,64
6,95 – 12,40
10,21 10,21 ± 1,61
Tableau 1 : Valeur moyenne avec écart type (SD) du poids, de la longueur et de la section du muscle. Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus soumis à un test d’étirement en rampe (3mm (R1), 5mm (R4) et 6mm (R12)) à une vitesse de 1 mm/s. (Fs (mN) : force statique, σs (KN/m2) : tension statique, E (KN/m2) : module d’Young).
La force statique augmente significativement d’un facteur 1,7 entre les groupes R1 et R4 puis
diminue significativement avec le même facteur entre R4 et R12. Les rats de 4 mois
développent donc une plus grande résistance à l’étirement que les deux autres populations. La
tension statique diminue non significativement entre R1 et R4 puis diminue significativement
d’un facteur 2 entre R4 et R12. Le module d’Young suit logiquement la même évolution que
151
la tension statique : il diminue non significativement d’un facteur 1,2 entre R1 et R4 puis
diminue significativement d’un facteur 2 entre R4 et R12.
Figure 4 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces statiques (Fs), modules
d’Young (E) et tension statique (σs) de muscles isolés R1, R4 et R12.
b) Test de relaxation Au cours de ce test les muscles sont dans un premier temps dans un état dynamique puis
statique. Un comportement viscoélastique des muscles pour les trois populations est observé.
Le tableau 2 résume les paramètres dynamiques (Fd et σd) et statiques (Fs et σs) obtenus pour
les muscles de 1, 4 et 12 mois.
R1 n = 16
R4 n = 16
R12 n = 10
Fd (mN)
σd (kN/m2)
77 – 128 108
104 ± 12
14,08 – 23,08 16,80
17,34 ± 2,67
215 – 456 278
296 ± 66
19,02 – 35,56 23,11
24,88 ± 4,75
162 – 229 188
191 ± 21
11,12 – 18,8014,90
14,79 ± 2,32
Test de relaxation
Fs (mN)
σs (kN/m2)
13 – 34 27
26 ± 4
4,02 – 7,45 4,92
5,51 ± 1,48
22 – 61 40
40 ± 11
2,04 – 4,47 3,21
3,25 ± 0,69
19 – 27 20
21 ± 3
1,39 – 1,93 1,63
1,63 ± 0,18
0
10 20 30 40 50 60
R1 R4 R12
Fs (mN)σs (KN/m²)E (KN/m²)
Tableau 2 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus soumis à un test de relaxation (étirement : 3mm (R1), 5mm (R4) et 6mm (R12)) à une vitesse de 250mm/s (R1) et 600mm/s (R4 et R12). (Fd (mN): force dynamique, σd (KN/m2) : tension dynamique, Fs (mN): force statique, σs (KN/m2) : tension statique).
152
La force dynamique augmente significativement (P <0,001) d’un facteur 2,5 entre les rats de 1
et 4 mois puis diminue significativement (P <0,001) d’un facteur 1,5 entre les rats de 4 et 12
mois. La force statique suit la même tendance que la force dynamique, avec toujours une
résistance à l’étirement qui est maximale pour les rats âgés de 4 mois. Les forces statiques
développées pour R1, R4 et R12 sont respectivement inférieures aux forces dynamiques d’un
facteur 4, 7 et 9. De plus les valeurs des forces statiques obtenues par ce test de relaxation sont
proches de celles mesurées par le test d’étirement en rampe.
La tension dynamique développée par R4 est significativement supérieure aux groupes R1
(P<0,001) et R12 (P<0,001) d’un facteur 1,5. Les tensions statiques développées par R1 et R4
sont significativement supérieures à celle développée par R12. On note que les tensions
statiques sont dans le même intervalle que celles obtenues par le test d’étirement en rampe.
Tous ces résultats sont illustrés figure 5.
a)
Figure 5 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces / tensions dynamiques (Fd, σd) (a) et statiques (Fs, σs) (b) obtenues avec le test de relaxation
0 50
100 150 200 250 300 350
R1 R4 R12
Fd (mN)
σd (KN/m²)
0
10
20
30
40
50
R1 R4 R12
Fs (mN)
σs (KN/m²)
b)
153
0
20
40
60
80
100 120
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Longueur (mm)
Fd_R1 (mN)Fs_R1 (mN)
a)
0
20 40 60 80
100 120 140
0 1 2 3 4 5 6
Longueur (mm)
Fd_R4 (mN)Fs_R4 (mN)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1 2 3 4 5 6 7
Longueur (mm)
Fd_R12 (mN)Fs_R12 (mN)
b)
c)
c) Test de relaxation incrémental Le muscle soumis au test de relaxation incrémental à partir de sa longueur « slack » (Ls) va
développer 4 forces dynamiques et 4 forces statiques. Les niveaux de forces statiques et
dynamiques développés par les muscles de 1, 4 et 12 mois à chaque incrément sont illustrés
sur la figure 6. Ces courbes représentent les forces statiques et dynamiques pour chaque
longueur de muscle. Pour chaque groupe il apparaît une augmentation des forces statiques et
dynamiques avec la longueur d’étirement ; en effet plus la longueur d’étirement est importante
et plus le muscle développe de hauts niveaux de résistance à l’étirement. Ce test met encore en
évidence le caractère non linéaire de l’élasticité des muscles et l’allure des courbes est
similaire à celle obtenue avec le test d’étirement en rampe.
Figure 6 : Représentation de la
force statique (Fs) (mN) et
dynamique (Fd) (mN) pour des
muscles R1 (a), R4 (b) et R12 (c)
soumis à une succession d’incréments
154
Toutes les courbes obtenues en condition statique et dynamique sont résumées sur la figure 7.
Il apparaît, comme pour les deux autres tests, que les muscles de 4 mois développent des
niveaux de résistance à l’étirement qui sont supérieurs aux muscles de 1 et 12 mois.
Figure 7 : Résumé de toutes les forces dynamiques (Fd) (a) et statiques (Fs) (b) obtenues au
cours de ce test d’étirement cyclique pour les trois populations.
Le tableau 3 et figure 7 résument les valeurs de forces statiques obtenues au cours de ce test
incrémental. On observe pareillement aux deux tests mécaniques précédents que la force
statique développée pour les rats de 4 mois est supérieure aux deux autres groupes et que la
valeur moyenne de Fs est dans le même intervalle que ceux des autres tests. De même que
pour les deux autres tests mécaniques, les tensions statiques développées par R1 et R4 sont
encore significativement supérieures à celle de R12.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7
Longueur (mm)a)
-5 0 5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7
Longueur (mm)b)
Fd_R1 (mN)
Fd_R4 (mN)Fd_R12 (mN)
Fs_R1 (mN)Fs_R4 (mN)Fs_R12 (mN)
155
R1 n = 16
R4 n = 16
R12 n = 10
Test de relaxation
incrémental
Fs (mN)
σs (kN/m2)
15 – 40 27
27 ± 7
2,72 – 9,12 4,86
5,46 ± 1,97
28 – 59 38
41 ± 12
2,65 – 4,36 3,31
3,40 ± 0,76
20 – 30 21
22 ± 4
1,44 – 2,21 1,61
1,65 ± 0,25
Tableau 3 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) du muscle soleus R1, R4 et R12 soumis à un test de relaxation incrémental (4 longueurs successives d’étirement équivalentes à 3mm/ 4 = 0,75mm (R1), 5mm / 4 = 1,25mm (R4) et 6mm / 4 = 1,5mm (R12)) à une vitesse de 1 mm/s. (Fs : force statique, σs : tension statique).
Figure 8 : Illustration des valeurs moyennes avec écart type des forces (Fs) / tensions (σs)
statiques obtenues lors du test de relaxation incrémental.
0
10
20
30
40
50
R1 R4 R12
Fs (mN)
σs(KN/m²)
156
III - 2 - 2 - 1 Résultat de l’analyse statistique Le tableau 4 résume les valeurs de forces et tensions obtenues lors des différents tests mécaniques en condition passive. Tableau 4 : Analyse statistique des différents paramètres mécaniques mesurés et calculés pour
les trois populations de muscles isolés R1, R4 et R12 (** : P < 0,001 * : P < 0,05).
Tests mécaniques
Test ANOVA – Kruskall wallis
Fd
σd
R1≠R4** R1≠R12** R4 ≠R12** R1≠R4** R1=R12 R4 ≠R12**
Test de relaxation Fs
σs
R1≠R4** R1≠R12** R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**
Fs
σs
R1≠R4** R1=R12 R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**
Étirement en rampe
E
R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**
Test de relaxation incrémental
Fs
σs
R1≠R4** R1≠R12* R4 ≠R12** R1=R4 R1≠R12** R4 ≠R12**
157
III - 2 - 3 Mesure des propriétés mécaniques passives des fibres musculaires III - 2 - 3 - 1 Résultats des tests mécaniques passifs Les fibres musculaires isolées ont subi les mêmes tests d’étirements que ceux effectués à
l’échelle du muscle : test d’étirement en rampe, test de relaxation et test de relaxation
incrémental. Les courbes caractéristiques obtenues à l’échelle de la fibre sont similaires à
celles obtenues à l’échelle du muscle. Les figures 10 à 12 représentent le comportement
mécanique de fibres isolées lorsqu’elles sont soumises aux trois différents tests passifs.
Figure 9 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test
d’étirement en rampe (étirement ∆L : 50% Ls et vitesses : 0,005Ls/s, Fs (µN): force statique, t: temps)
Figure 10 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test
de relaxation (étirement ∆L: 50% Ls et vitesses : 10Ls/s)
Figure 11 : Représentation de la résistance à l’étirement émise par une fibre isolée lors du test de relaxation incrémental (étirement ∆L: 10% Ls et vitesses : 10Ls/s)
∆L
650µN
8s
F (µN)
t(s)
Fd
Fs
60s
t(s)
Fs 50µN
100s
∆L
Fs 70µN
t(s)
158
Le tableau 5 résume les valeurs des forces et tensions obtenues lors des trois différents tests
passifs.
Tableau 5 : Valeur moyenne avec écart type (SD) des forces et tensions développées en condition statique et dynamique par des fibres lentes de soleus soumises à différents tests mécaniques.
- Le test d’étirement en rampe reflète le comportement non linéaire de la fibre (figure
10). Ce test met en évidence une augmentation significative (P<0,001) de la force
passive entre R1 et R4 puis une diminution non significative de la force statique pour
les fibres appartenant à R12 (figure 12). Les tensions statiques ainsi que le module
d’Young sont du même ordre de grandeur entre R1 et R4 puis ces paramètres
diminuent significativement (P<0,001) entre R4 et R12.
Figure 12 : Représentation des forces (Fs) (µN), tensions (σs) (KN/m2) statiques et module
Young (E) de fibres isolées R1, R4 et R12
R1 n = 19
R4 n = 18
R12 n = 24
Fd (µN)
σd (KN/m2)
80 ± 50
138 ± 66
400 ± 300
124 ± 32
300 ± 200
61± 42
Test de relaxation
Fs (µN)
σs (KN/m2)
20 ± 20
33 ± 24
80 ± 40
35 ± 15
100 ± 100
22 ± 22 Fs (µN)
σs (KN/m2)
30 ± 20
53 ± 43
200 ± 100
51 ± 27
100 ± 70
25 ± 22
Étirement en
rampe
E (KN/m2)
106 ± 86
103 ± 53
49 ± 44
Test de relaxation incrémental
E (KN/m2)
20 ± 20
41 ± 41
100 ± 70
39 ± 19
90 ± 60
18 ± 22
0 50
100 150 200 250 300
R1 R4 R12
Fs (µN)
σs (KN/m²) E (KN/m²)
159
0100 200 300 400 500 600 700
R1 R4 R12
Fd (µN) σd (KN/m²)
0
50
100
150
200
R1 R4 R12
Fs (µN)
σs (KN/m²)
- Le test de relaxation montre le comportement viscoélastique de la fibre qui se traduit
par une chute de force alors que l’étirement est maintenu (figure 11). La fibre isolée
est toute d’abord dans un état dynamique puis statique. Ce test révèle une
augmentation significative des forces statiques et dynamiques entre les fibres de R1 et
R4 puis une chute non significative des paramètres de relaxation pour les fibres isolées
de R12. Les tensions dynamiques et statiques sont dans un même intervalle pour les
fibres de R1 et R4 alors qu’une diminution significative des tensions apparaît pour le
groupe R12.
Figure 13 : Représentation des forces (Fd, Fs) (µN) et tensions (σd, σs) (KN/m2)
dynamiques (a) et statiques (b) de fibres isolées R1, R4 et R12
- Le test de relaxation incrémental qui est une succession de 5 tests de relaxation permet
également de quantifier la résistance passive des fibres ; il apparaît de même que pour
les tests précédents une augmentation significative de la force statique entre les
groupes de fibres R1 et R4 suivie par une légère diminution non significative de la
résistance à l’étirement pour le groupe de fibres R12. Les tensions statiques sont
a)
b)
160
0
50
100
150
R1 R4 R12
Fs (µN) σs (KN/m²)
équivalentes pour les fibres de R1 et R4 puis une décroissance significative apparaît
pour les fibres appartenant à R12.
Figure 14 : Représentation des forces (Fs) (µN) et tensions (σs) (KN/m2) statiques de fibres isolées R1, R4 et R12 soumises au test incrémental.
- Ces trois tests montrent des tensions passives et dynamiques ainsi qu’un module
Young qui sont du même ordre de grandeur pour R1 et R4 comparé aux tensions
développées par le groupe de fibres R12 qui sont significativement inférieures aux
groupes R1 et R4.
III - 2 - 3 - 2 Résultats de l’analyse statistique Tableau 6 : Analyse statistique des différents paramètres mécaniques mesurés et calculés pour
les trois populations de fibres isolées R1, R4 et R12 (* : P < 0,05, ** : P < 0,001)
Tests mécaniques
Test Kruskall-Wallis
Fd
σd
R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12** R4≠ R12**
Test de relaxation
Fs
σs
R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**
Fs
σs
R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**
Étirement en rampe
E R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**
Test de relaxation incrémental
Fs
σs
R1≠R4** R1≠R12** R4 =R12 R1=R4 R1≠R12* R4≠ R12**
161
Ces tests statiques ont montré des différences significatives entre les forces développées par
les fibres de R1 et R4 alors qu’aucune différence significative n’apparaît entre R4 et R12.
Les tensions développées par les fibres appartenant à R1 et R4 sont équivalentes alors qu’une
différence significative intervient entre les autres groupes.
III - 3 Résultats de l’analyse morphologique III - 3 - 1 Diamètres des fibres en fonction de l’âge Les diamètres de fibres appartenant aux rats de 1, 4 et 12 mois varient de 15 µm à 138 µm.
Les diamètres moyens de R1, R4 et R12 sont respectivement de 29 ± 11µm, 55 ± 19µm et
87 ± 29µm. La figure 9 illustre via des « box-whiskers » des différences significatives entre
les diamètres des trois groupes.
Figure 15 : Représentation des intervalles de valeurs des diamètres de fibres appartenant à R1, R4 et R12 (** : P < 0,001)
R1
R4
R12
Box-and-Whisker Plot
0 30 60 90 120 150
response
0 30 60 90 120 150
R1
R4
R12 * *
* * *
*
Diamètre (µm)
162
III - 3 - 2 Evolution du type et du nombre de fibres en fonction de l’âge Les figures 16, 17 et 18 représentent le résultat de coupes réalisées dans la partie ventrale du
muscle (zone D3/G3).
Figure 16 : section transverse d’un muscle R1
(coloration ATPase pH = 4.3)
Figure 17 : section transverse d’un muscle R4
(coloration ATPase pH = 4.3)
Figure 18 : section transverse d’un muscle R12
(coloration ATPase pH = 4.3)
Type I
Type IIa
Type IIc
50µm
50µm
50µm
163
Ces différentes coupes montrent que le muscle soleus devient de plus en plus lent avec l’âge,
ce qui se traduit par une augmentation relative du nombre de fibres de type I. On observe
également une augmentation du diamètre des fibres avec l’âge, ce que confirment les mesures
de diamètres obtenues lors des tests mécaniques effectués sur les fibres isolées.
a) coupe ventrale
Le tableau 7 résume l’évolution des différents pourcentages de fibres I, IIc et IIa en fonction
de l’âge.
Tableau 7 : Evolution des types de fibres (%) en fonction de l’âge (type I : fibre lente, type IIc : fibre intermédiaire, type IIa : fibre rapide)
Figure 19 : Illustration de l’évolution du type de fibres avec l’âge ( * : P < 0,05, ** : P < 0,001)
(type I : fibre lente, type IIc : fibre intermédiaire, type IIa : fibre rapide).
Coupe ventrale (G3/D3)
% type I % type II c % type IIa
R1
85,86 ± 6,37 3,04 ± 2,03 11,10 ± 5,99
R4
95,74 ± 5,22 1,07 ± 1,12 3,19 ± 4,81
R12
98,61 ± 1,53 0,34 ± 0,21 1,04 ± 1,46
% de fibres en fonction de l'âge
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
R1 R4 R12
I
II c
II a
** *
* **
* **
**
164
* * * *
*
R1
R4
R12
Nombre de fibres
1600 1800 2000 2200 2400
On observe une augmentation significative (13%) du pourcentage de fibres lentes avec l’âge.
Le muscle soleus est significativement constitué de fibres lentes dès l’âge de 1 mois. Les
muscles de 1 mois ont un pourcentage de fibres de type IIa qui est significativement supérieur
à celui des fibres de type IIc. Les type IIc et IIa sont prédominants pour les muscles de 1 mois
puis diminuent significativement avec l’âge.
Le nombre de fibres en fonction de l’âge a été mesuré sur la coupe ventrale de chaque muscle
(tableau 8) :
Coupe ventrale (G3/D3)
R1
R4 R12
Nombre de fibres totales
1901,5 ± 162,86 1906,5 ± 199,92 2115 ± 110,67
Tableau 8 : Représentation du nombre de fibres pour des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois
Aucune augmentation significative du nombre de fibres n’a été trouvée entre les rats âgés de 1
et 4 mois (figure 20); par contre une augmentation significative du nombre de fibres est
obtenue entre les populations R1 et R12 et entre R4 et R12.
Figure 20 : Evolution du nombre de fibres en fonction de l’âge (* : P < 0,05 ** : P < 0,001)
165
b) Evolution longitudinale
L’évolution longitudinale du pourcentage de fibres lentes (type I) ne montre aucune différence
significative en fonction de la localisation longitudinale (D1/G1...D5/G5) de la coupe (tableau
9 et figure 21) pour les groupes R4 et R12. Par contre le groupe R1 a une augmentation
significative du nombre de fibres lentes de la partie ventrale vers la partie distale et vers la
partie proximale du muscle.
Numéro de la coupe R1 % de fibres I
R4 % de fibres I
R12 % de fibres I
D1/G1
92,09 ± 5,54 97,03 ± 4,87 98,81 ± 1,73
D2/G2
86,17 ± 8,16 96,98 ± 4,37 98,57 ± 1,39
D3/G3
85,86 ± 6,37 95,74 ± 5,22 98,61 ± 1,53
D4/G4
91,05 ± 6,56 96,56 ± 4,98 98,79 ± 1,66
D5/G5
94,71 ± 5,94 98,04 ± 2,68 99,73 ± 0,68
Tableau 9 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres lentes appartenant à R1, R4 et R12
type I
020406080
100120
R1 R4 R12
D1D2D3D4D5
Figure 21 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type I (fibres lentes) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)
* *
166
L’évolution longitudinale intra musculaire des fibres rapides « intermédiaires » (type IIc) ne
montre aucune différence significative suivant la localisation de la coupe pour les groupes R4
et R12. Le groupe R1 a une diminution significative du type IIc de la partie ventrale vers la
partie distale et proximale (figure 22, tableau 10).
Tableau 10 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres rapides intermédiaires appartenant à R1, R4 et R12
Type IIc
0123456
R1 R4 R12
D1D2D3D4D5
Figure 22 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type IIc (fibres
intermédiaires) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)
On observe bien que le groupe R1 est majoritairement constitué de fibres IIc comparé aux
autres groupes.
L’évolution longitudinale intra musculaire des fibres rapides « blanches » (type IIa) ne montre
aucune différence significative suivant la localisation de la coupe pour les groupes R4 et R12
Numéro de la coupe R1 % de fibres IIc
R4 % de fibres IIc
R12 % de fibres IIc
D1/G1
1,31 ± 1,13 0,5 9 ± 0,95 0,30 ± 0,74
D2/G2
2,77 ± 1,17 0,83 ± 0,53 0,56 ± 0,41
D3/G3
3,04 ± 2,03 1,07 ± 1,12 0,34 ± 0,21
D4/G4
0,30 ± 0,18 0,66 ± 0,53 0,48 ± 0,47
D5/G5
0,24 ± 0,36 0,38 ± 0,53 0,17 ± 0,49
** *
*
167
(figure 23, tableau 11). Le groupe R1 a de la même façon que pour les fibres IIc une
diminution significative du pourcentage de fibres IIa de la partie ventrale vers la partie
proximale.
Tableau 11 : Evolution longitudinale du pourcentage de fibres rapides (type IIa) appartenant
à R1, R4 et R12
type IIa
0
5
10
15
20
R1 R4 R12
D1D2D3D4D5
Figure 23 : Illustration de la répartition longitudinale du pourcentage de type IIa (fibres
rapides) en fonction de l’âge (* : P < 0,05)
Numéro de la coupe R1 % de fibres II a
R4 % de fibres II a
R12 % de fibres II a
D1/G1
6,61 ± 5,02 1,02 ± 1,02 0,89 ± 1,54
D2/G2
10,28 ± 6,83 0,69 ± 0,74 0,87 ± 1,21
D3/G3
11,10 ± 5,99 3,19 ± 4,81 1,04 ± 1,46
D4/G4
4,08 ± 5,62 0,34 ± 0,44 0,73 ± 1,39
D5/G5
3,62 ± 5,99 1,57 ± 2,16 0,10 ± 0,20
*
*
168
La variation inter musculaire du nombre total de fibres en fonction de la localisation
longitudinale montre une diminution significative du nombre de la partie ventrale vers les
parties distale et proximale. Le tableau 12 résume le nombre total de fibres par coupe
longitudinale.
Numéro de la coupe
R1
R4 R12
D1/G1
117 ± 50 143 ± 63 138 ± 100
D2/G2
1278 ± 328 1387 ± 247 1059 ± 232
D3/G3
1903 ± 163 1907 ± 200 2115 ± 110
D4/G4
1577 ± 178 1213 ± 222 1422 ± 217
D5/G5
381 ± 306 364 ± 237 266 ± 220
Tableau 12 : Représentation longitudinale du nombre total de fibres pour des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois.
0
500
1000
1500
2000
2500
R1 R4 R12
D1D2D3D4D5
Figure 24 : Evolution longitudinale du nombre de fibres en fonction de l’âge
On observe une parfaite symétrie du nombre de fibres par rapport à la coupe ventrale. En
effet, la coupe ventrale contient le plus grand nombre de fibres comparé aux coupes distale et
proximale.
169
* * *
* * *
***
Surface musculaire (mm2)
Surface musculaire (mm2)
R1
R4
R12
0 4 8 12 16 20
III - 3 - 3 Evolution des paramètres morphologiques en fonction de l’âge
a) Evolution de la surface du muscle
La variation intramusculaire de la surface du muscle montre une augmentation significative de
la surface de la partie distale à la partie ventrale du muscle et de la partie proximale à la partie
ventrale du muscle. En effet, la partie ventrale est la région musculaire qui a la plus
importante section. La variation inter musculaire montre une augmentation significative de la
surface des muscles en fonction de l’augmentation de l’âge et quelle que soit la localisation de
la coupe. Par exemple, la coupe ventrale du muscle (G3/D3) (tableau 13) a montré une
augmentation significative d’un facteur ∼2 de la taille des sections entre R1 et R4 puis une
augmentation significative d’un facteur 1,5 entre R4 et R12.
Numéro de la coupe
R1 Surface totale (mm2)
R4 Surface totale (mm2)
R12 Surface totale (mm2)
D1/G1
0,46 ± 0,20 1,01 ± 0,41 1,43 ± 1,06
D2/G2
3,50 ± 0,72 7,89 ± 2,09 8,30 ± 1,36
D3/G3
5,28 ± 0,53 11,55 ± 0,78 16,09 ± 1,71
D4/G4
4,63 ± 1,31 7,22 ±1,57 11,30 ± 2,46
D5/G5
1,10 ± 0,77 2,19 ± 1,53 2,09 ± 1,70
Tableau 13 : Représentation longitudinale de la surface totale de coupes musculaires appartenant à des muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois
Figure 25 : Illustration de l’évolution de la surface ventrale du muscle en fonction de l’âge. (** P < 0,001)
170
Figure 26 : Evolution longitudinale de la surface du muscle en fonction de l’âge.
On observe une augmentation progressive des différentes surfaces en fonction de l’âge.
b) Evolution de la surface des différents types de fibres
L’évolution de la surface des différents types de fibres en fonction de l’âge a été réalisée sur la
coupe ventrale du muscle car cette région comporte le plus grand nombre de fibres.
Le tableau 14 résume les différentes valeurs de surfaces correspondantes aux types I, IIc et
IIa. Les valeurs minimales et maximales montrent une inhomogénéité des surfaces pour un
même type de fibres au sein d’un même muscle.
G3/D3 Surface I µm2 Surface IIc µm2 Surface IIa µm2
R1 616 – 1275 928
954 ± 246
495 – 1052 795
820 ± 186
699 – 1222 1035
993 ± 218
R4 1883 - 3165 2131
2275 ± 441
1555 – 3455 2002
2181 ± 713
1786 – 2987 2073
2253 ± 441 R12 2214 – 3703
3200 3108 ± 482
1450 – 3454 2131
2389 ± 867
1383 – 4758 3042
2989 ± 1208
Tableau 14 : Valeurs minimum, maximum, médiane et moyenne avec écart type (SD) des surfaces de muscles soleus âgés de 1, 4 et 12 mois.
0
5
10
15
20
R1 R4 R12Surf
ace
du m
uscl
e (µ
m2 )
D1D2D3D4D5
171
Figure 27 : Illustration de l’évolution des surfaces de fibres en fonction du type de fibre et de l’âge
La surface des fibres lentes (type I) augmente significativement d’un facteur 2 entre 1 et 4
mois et d’un facteur 1,5 entre 4 et 12 mois. Ce résultat suit l’évolution trouvée pour les fibres
lentes, qui augmente d’un facteur 2 entre 1 et 4 mois et encore d’un facteur 2 entre 4 et 12
mois.
La surface des fibres rapides intermédiaires (type IIc) augmente significativement d’un facteur
2,5 entre 1 et 4 mois puis une stabilisation de la surface apparaît à partir de 4 mois.
La surface des fibres rapides (type IIa) augmente significativement d’un facteur 2 entre 1 et 4
mois et d’un facteur 1,5 entre 4 et 12 mois.
Surface des fibres (µm2)
0 500
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
R1 R4 R12
III cII a
172
173
Chapitre III - Discussion
I INTERVALLE DE VALEURS DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES
I - 1 l’échelle des fibres musculaires a) comparaison des valeurs mécaniques avec la littérature
L’élasticité des fibres musculaires est principalement due à la présence des filaments de titine
dont les propriétés élastiques ont été caractérisées dans de nombreuses études (Labeit et coll.,
1997, Linke et Granzier, 1998, Wang et coll., 1993). Dans cette étude, les fibres musculaires
issues des trois populations de rats âgés de 1, 4 et 12 mois ont subi trois différents tests
mécaniques passifs (test d’étirement en rampe, test de relaxation, test de relaxation
incrémental) avec différentes vitesses d’étirement (10Ls/s et 0,005Ls/s). La réponse de ces
fibres aux tests mécaniques a montré un comportement viscoélastique qui est en accord avec
d’autres études menées sur des fibres squelettiques de lapins (Bartoo et coll., 1997, Wang et
coll., 1993) et de rats (Mutungi et coll., 1996).
L’intervalle de valeurs des propriétés mécaniques mesurées dans cette étude pour un groupe
d’âge donné est en accord avec d’autres études. L’étude de Toursel et coll., 2002, a obtenu un
module d’Young de l’ordre de 93,4 ± 2,17 KN/m2 pour son groupe contrôle composé de fibres
soleus de rats âgés de 4 mois comparé à notre module d’Young 103 ± 53 KN/m2 obtenu sur le
même modèle animal. L’étude de Anderson et coll., 2002, réalisée sur des fibres soleus
appartenant à des souris de 5 mois a obtenu des valeurs de tensions dynamiques et statiques
respectivement de l’ordre de 103 ± 10 KN/m2 et 38 ± 3 KN/m2 semblables à notre étude qui a
mesuré des tensions dynamiques équivalentes à 124 ± 32 KN/m2 et des tensions statiques de
l’ordre de 35 ± 15 KN/m2.
b) Comparaison des trois populations de rats
Les forces dynamiques et statiques développées par les fibres pelées de 4 mois sont
significativement supérieures aux forces développées par les rats de 1mois. La comparaison
des forces entre les groupes de 4 et 12 mois a révélé une légère diminution, qui est non
significative, pour les rats âgés de 12 mois. Ces variations de forces en fonction de l’âge ne
sont pas corrélées à des changements d’isoformes de titine puisqu’il a été démontré qu’aucune
isoforme de titine n’apparaissait avec l’évolution de l’âge. Une variation de la quantité de
174
titine en fonction de l’âge pourrait expliquer ces variations de résistance à l’étirement. Cette
hypothèse a été rejetée car des électrophorèses de titine sur muscle entier ont démontré que le
contenu de titine était constant quel que soit l’âge.
L’augmentation de forces entre 1 et 4 mois est reliée à la croissance du muscle (Baldwin et
coll., 1984, Goldspink et coll., 1970) ; en effet durant cette période il apparaît une
prolifération des myofibrilles qui entraîne une hypertrophie du muscle (le diamètre des fibres
a doublé). Les tensions dynamiques calculées après les tests statistiques ont révélé une
diminution significative de la résistance à l’étirement pour les fibres de 12 mois comparé à
celles de 4 mois. Cette chute de tension pourrait s’expliquer par une perte de myofibrilles en
fonction de l’âge. Cette hypothèse est en accord avec les travaux de Ansved et Edström et
coll., 1991, qui a étudié les effets de l’âge (5-6 mois et 21-25mois) sur la structure et
l’ultrastructure de fibres rapides et lentes extraites de rats. En effet, leurs observations basées
sur une analyse au microscope optique ont démontré d’une part une perte de myofilaments
dans la région centrale des fibres appartenant à des vieux rats et d’autre part une légère
augmentation de l’espace intermyofibrillaire. Selon ces auteurs, ces modifications structurales
sont similaires au processus de dénervation qui implique une perte de myofibrilles en
périphérie des fibres musculaires.
I - 2 l’échelle du muscle A l’échelle du muscle, les changements de propriétés mécaniques passives en fonction de
l’âge ont été principalement mesurés par Kovanen et coll., 1984 sur le muscle soleus de rats.
Cette étude a consisté à appliquer des tests mécaniques d’étirements passifs (équivalents au
test d’étirement en rampe) qui ont été exécutés jusqu’au point de rupture avec une vitesse de
1mm/min sur des muscles soleus âgés de 1, 2, 4, 10 et 24 mois. Ces travaux ont montré une
résistance à l’étirement qui augmentait entre les populations de 1 et 4 mois (environ
0,2N/mm2) et qui diminuait entre 4 et 12 mois. Notre étude a utilisé deux tests
supplémentaires (test de relaxation et test de relaxation incrémental) d’étirements passifs à
grande vitesse comparé à l’étude de Kovanen et coll., 1984 afin de caractériser les propriétés
mécaniques passives. Les résultats de notre étude ont démontré une augmentation
significative de forces entre 1 et 4 mois alors qu’une diminution significative de force
intervient pour les muscles rats de 12 mois. Ces variations de forces en fonction de l’âge ne
sont pas reliées aux isoformes de titine car il a été prouvé au moyen d’électrophorèses
qu’aucune isoforme de titine n’apparaissait suivant l’âge. La composante élastique parallèle à
175
l’échelle du muscle englobe les filaments de titine mais elle est majoritairement composée de
substances collagéniques qui se trouvent au niveau de l’épimysium, périmysium, endomysium
et sarcolemme. En effet, il existe différents types de collagène (type I, III, IV et V) qui se
répartissent différemment dans le muscle et qui interviennent dans l’élasticité passive.
De nombreuses études (Kovanen et coll., 1984, Kovanen et Suominen, 1989) se sont
intéressées au rôle du collagène dans les fonctions mécanique et physiologique du muscle.
Ainsi, il est fréquemment utilisé un modèle animal soumis à un entraînement physique (tapis
roulant) afin d’observer les modification collagéniques que cela peut entraîner. Les études de
Kovanen ont conclu que la structure du collagène était adaptable aux entraînements imposés
et que certains paramètres mécaniques en étaient affectés. De plus, des études suivant l’âge
(Konanen et coll., 1987, Alnaqeed et coll., 1984) ont démontré que la concentration de
collagène augmentait avec l’avancée de l’âge. Ainsi, à l’âge de 1 mois (soleus de rats), il a été
démontré une forte activité enzymatique (enzyme « PH : Prolyl-4-hydrolase » et « GGT :
Galactosylhydroxylysyl Glucosyl Transferase ») traduisant la biosynthèse du collagène à cet
âge. A l’âge de 2 mois, cette activité enzymatique chute de façon très importante indiquant
que les fibres de collagènes se sont reliées entre elles, les rendant beaucoup plus résistantes à
l’action des collagénases. Notre étude a montré une augmentation de force entre l’âge de 1
mois et 4 mois avec à cette même période une augmentation du contenu de collagène. Ces
deux phénomènes sont étroitement liés, puisque pendant la période de croissance il y a une
augmentation du degré de liaison entre les fibres de collagène. En effet, la présence
d’hydroxyproline au sein du muscle permet aux molécules de collagène d’avoir une triple
hélice stable (Kovanen et Suominen, 1989). Ce phénomène physiologique implique une
augmentation de la force passive développée à l’âge de 4 mois.
Une diminution du contenu d’hydroxyproline en fonction de l’âge a été démontrée au cours de
ce travail. Ce résultat est en accord avec l’étude de Kovanen et Suominen, 1989 qui a obtenu
une concentration d’hydroxyproline qui diminue fortement entre 2 et 10 mois (soleus de rat).
L’étude de Ducomps et coll., 2003 a également obtenu la même décroissance
d’hydroxyproline sur des lapins (muscle SMP : Semimembranosus Proprius) âgés de 50, 90 et
140 jours. La chute de force observée pour les rats de 12 mois peut alors être due à leur
sédentarité qui influe à la fois sur la quantité de collagène qui diminue à l’âge de 12 mois et
sur la qualité du collagène. Cette chute de force observée pour les rats de 12 mois peut
également provenir du même phénomène que celui observé à l’échelle de la fibre à savoir une
perte de myofibrilles qui serait amplifiée à l’échelle du muscle.
176
I - 3 Comparaison des échelles macroscopique et microscopique
La détermination des propriétés mécaniques passives sur le muscle et la fibre a permis de
conclure que l’évolution des forces entre 1 et 4 mois était similaire et se traduisait par une
augmentation significative des forces. Ce déploiement de forces est lié au phénomène de
croissance du muscle qui se traduit par une hypertrophie des fibres musculaires et une
augmentation du contenu de collagène. A partir de 4 mois, les forces dynamiques et statiques
développées par les fibres ont tendance à diminuer vers l’âge de 12 mois. Cette tendance s’est
révélée significative à l’échelle du muscle. Les structures intrinsèques à la fibre (myofibrille,
espace intermyofibrillaire) et au muscle (contenu d’hydroxyproline) vont influencer les
propriétés mécaniques passives de manière différente.
I - 4 Analyse morphologique
L’évolution du nombre de fibres suivant l’âge a été étudiée en 1990 par Timson et
Dudenhoeffer sur des soleus de rats âgés de 1, 6 et 12 mois. Ces travaux ont utilisé une
méthode de dissolution des tissus conjonctifs afin de pouvoir isoler et compter les fibres sous
microscope optique. Cette étude a conclu que le nombre de fibres ne variait pas suivant l’âge
(environ 3000 fibres) et il a été mesuré une augmentation de 34 fibres entre 1 et 6 mois ainsi
qu’une augmentation de 104 fibres entre 6 et 12 mois. L’étude de Ansved et Edström 1991qui
a effectué des analyses histochimiques sur des muscles soleus de rats âgés de 5-6 et 21-25
mois a montré une diminution significative du nombre de fibres (367 fibres) entre ces deux
populations. De plus le nombre total de fibres mesurées à 6 mois est de l’ordre de 2672 ± 263
fibres comparé à l’étude précédente qui pour un même âge contient 3069 ± 123 fibres. Cet
écart de 397 fibres peut s’expliquer selon Timson et Dudenhoeffer par une diminution de
l’angle fait entre les fibres et l’axe long du muscle pendant la croissance du muscle. Ceci
implique une présence plus ou moins importante des fibres au sein de la section. L’analyse
histologique réalisée sur des rats de 1, 4 et 12 mois au cours de cette étude a montré un
nombre total de fibres de l’ordre de 2000 fibres. Ce résultat est inférieur aux précédentes
études mais présente une augmentation significative du nombre de fibres entre 1 et 12 mois
(214 fibres) et entre 4 et 12 mois (209 fibres).
L’inhomogénéité de la taille des fibres au sein d’un muscle a été confirmée par de nombreuses
études (Polgar et coll., 1973 et Punkt et coll., 1998). Ces études n’ont trouvé aucune
corrélation entre la taille des fibres et la fonction du muscle. L’intervalle de valeurs mesuré
par Polgar et coll., concernant la répartition des diamètres de fibres lentes extraites de soleus
177
Humain varie entre 47µm et 87µm en surface du muscle et entre 56µm et 82µm dans la partie
profonde du muscle. La base de données obtenue par Polgar et coll., 1973 a permis de
conclure qu’une seule région du muscle ne pouvait pas représenter le muscle en entier. Cette
observation est en accord avec les mesures de diamètres effectuées dans cette étude qui
varient de 35µm, 60µm et 100µm pour les fibres de 1, 4 et 12 mois.
Le muscle soleus est par définition un muscle qui est principalement composé de fibres lentes
(type I). Cette étude ainsi que des précédentes (Maltin et coll., 1989) ont montré que le muscle
soleus devient de plus en plus lent avec l’âge. En effet une augmentation significative (10%)
du nombre de fibres lentes apparaît entre 1 et 4 mois. Ce résultat est en accord avec l’étude de
Maltin et coll., 1989 qui explique que le changement de type de fibres apparaît dans la période
de 0 à 76 jours pendant laquelle la surface des fibres de type I a triplé de dimension. Notre
étude montre que la surface des fibres lentes a doublé sur une période de 1 à 120 jours. Le
facteur de croissance diminue ensuite de 25% pour les fibres de 12 mois. L’étude de Punkt et
coll., 1998 a obtenu une surface du muscle soleus pour un âge de 2,5 mois de l’ordre de
1146µm² et une surface de 3220µm² pour 18 mois. Ce résultat est dans la même gamme de
valeurs que notre étude pour un jeune âge mais diffère de celle de Maltin et coll., 1989 qui
pour les mêmes âges a trouvé des surfaces de l’ordre de 2215 ± 373 µm² (2,5 mois) et 3567 ±
1073 µm² (18 mois).
Les fibres de type IIc ne représentent que 3% de l’ensemble des fibres à l’âge de 1 mois puis
diminuent significativement jusqu’à 12 mois. Ce résultat est en accord avec l’étude de Ansved
et Edström, 1991 qui trouve un pourcentage de fibres IIc de l’ordre de 1% pour des muscles
soleus âgés de 5-6 mois et 21-25 mois. L’étude de Maltin et coll., 1989 a un pourcentage de
fibre IIc qui diminue de 5% à 0,2% depuis 25 jours jusqu’à 360 jours. La surface des fibres IIc
mesurées dans cette étude a doublé jusqu'à l’âge de 4 mois puis se stabilise jusqu'à l’âge de 12
mois.
Les fibres de type IIa sont majoritaires comparées aux fibres intermédiaires (IIc) et elles
disparaissent significativement suivant l’avancée de l’âge. L’étude de Ansved et Edström,
1991 a un pourcentage de l’ordre de 6 ± 4% (IIa) pour un âge de 5-6 mois (soleus) comparé à
3.19 ± 4.81% de fibres IIa mesurées dans notre étude. Les fibres rapides ont de très grandes
surfaces comparées aux autres fibres dès l’âge de 1 mois (993 ± 218µm²) et ce résultat est en
accord avec l’étude de Maltin et coll., 1989 qui a mesuré des surfaces rapides de l’ordre de
972µm². De plus nos analyses morphologiques ont montré dans ces surfaces un grand facteur
de croissance (facteur 2) entre 1 (993 ± 218µm²) et 4 mois (2253 ± 441µm²) qui continuent de
178
croître jusqu’à 12 mois (2989 ± 1208µm²), le même phénomène est observé dans l’étude
Maltin et coll., 1989 (1mois : 972µm² à 12 mois : 3331± 1230µm²).
Notre étude histochimique a de plus démontré que la surface des différents types de fibres (I,
IIa et IIc) était à l’âge de 4 mois dans la même gamme de valeurs. Il semblerait donc que cet
âge corresponde à un palier au niveau des paramètres morphologiques.
L’évolution longitudinale des fibres de type I, IIc et IIa au sein de soleus âgés de 4 et 12 mois
n’a révélé aucune variation significative du pourcentage de fibres. Par contre, l’analyse des
muscles de 1mois a montré une augmentation significative du pourcentage de fibres lentes
(type I) de la partie ventrale vers les parties distale et proximale. Une diminution significative
du pourcentage de types IIc et IIa est observée de la partie ventrale du muscle soleus vers les
parties distale et proximale. Ce résultat indique les futurs lieux de transformation des types IIc
et IIa en type I. A notre connaissance, une seule autre étude menée par Punkt et coll., 1998 a
étudié l’évolution longitudinale des fibres sur des muscles soleus âgés de 18 mois. Il a alors
été trouvé une augmentation significative (30%) du pourcentage de type I depuis l’origine du
muscle (partie proximale) vers l’insertion (partie distale).
179
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192
193
SYNTHESE
&
CONCLUSION
194
Os spongieux
Ostéon
Lamelle Os cortical
Schémas des différentes étapes réalisées au cours de ce travail de thèse :
OS CORTICAL HUMAIN MUSCLE HUMAIN
Echelle macroscopique
(échantillons cubique, parallélépipédique,sections fémorales)
Echelle microscopique
(lamelles osseuses)
• Détermination des propriétés acoustiques et mécaniques
• Détermination des propriétés morphologiques
♦ Corrélation des propriétés mécaniques et morphologiques
♦ Influence, répercussion des propriétés mesurées à l’échelle macroscopique sur l’échelle microscopique et vice versa
Echelle macroscopique
(muscle squelettique soleus)
Echelle microscopique
(fibre soleus) • Détermination des propriétés mécaniques passives
• Détermination des propriétés morphologiques
• Analyses biochimiques
♦ Corrélation des propriétés mécaniques et morphologiques / biochimiques
♦ Influence, répercussion des propriétés mesurées à l’échelle macroscopique sur l’échelle microscopique et vice versa
RECAPITULATIF
195
SYNTHESE DES PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU MUSCULO-SQUELETTIQUE
I PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU OSSEUX Echelle macroscopique
Le principal objectif de cette étude a été de corréler la distribution spatiale et locale des
propriétés élastiques et acoustiques de l’os cortical Humain avec la répartition de la
microarchitecture.
Deux techniques ultrasonores en transmission ont été utilisées : la première est installée au
Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical (UTC). Cette technique utilise des
capteurs plans en contact à 75KHz et 2,25MHz permettant de caractériser les propriétés
élastiques (modules d’Young (E33) et coefficients élastiques (C33)) sur des échantillons
cubiques et parallélépipédiques ; la deuxième technique localisée au Laboratoire Roberval
(UTC) fonctionne en mode écho avec des capteurs focalisés à 5MHz. Elle permet d’obtenir
une cartographie des propriétés acoustiques (vitesse de propagation) sur des sections
fémorales.
Deux techniques d’analyse de la microarchitecture ont été utilisées : la première fait appel à
un microscope électronique environnemental (SEM) (SAPC, UTC) afin de visualiser la
répartition de la microarchitecture sur les sections fémorales. La deuxième technique utilisée
est un micro scanner (IPROS) qui permet de visualiser la microarchitecture des échantillons
cubiques et parallélépipédiques.
Les résultats ont démontré une forte corrélation entre les propriétés acoustiques - élastiques et
celles de la microstructure.
En effet, les propriétés élastiques mesurées sur les échantillons parallélépipédiques du fémur 3
(E33 = 10 ± 4GPa et C33 = 11 ± 4GPa) sont plus faibles que celles du fémur 1 (E33 = 21 ±
2GPa et C33 = 31 ± 2GPa) et du fémur 2 (E33 = 20 ± 5GPa et C33 = 24 ± 5GPa) car les
échantillons du fémur 3 contiennent une porosité plus importante (35% - 72%) comparé aux
autres fémurs ( fémur 1 : 4%-10%, fémur 2 : 7%-54%).
L’étude sur les sections fémorales d’un même fémur (fémur 2) confirme également cette
corrélation entre les propriétés acoustiques et morphologiques. En effet, des variations
périphériques de vitesse (20% = 800m/s) correspondent à une variation du diamètre des pores
196
de l’ordre d’un facteur 5 (de 47µm à 253µm) et à une variation de la porosité d’un facteur 15
(de 3,1% à 47%).
Echelle microscopique
L’objectif de cette partie a été de déterminer les propriétés mécaniques (module d’Young et
dureté) de lamelles osseuses appartenant à des ostéons blancs, gris et noirs sélectionnés au
moyen d’un microscope électronique environnemental.
Les résultats des propriétés mécaniques ont démontré que les ostéons blancs (E = 21,3 ±
3GPa, H = 0,55 ± 0,15) avaient des propriétés mécaniques supérieures aux ostéons gris (E =
19,27 ± 1,78GPa, H = 0,41 ± 0,09) et noirs (E = 12,95 ± 2,66GPa, H = 0,30 ± 0,10).
Cette étude a montré que l’échelle microscopique contenait des ostéons avec différents degrés
de minéralisation qui participent au remodelage osseux.
II PROPRIETES MECANIQUES ET MORPHOLOGIQUES DU TISSU STRIE SQUELETTIQUE Echelle macroscopique
L’objectif de cette étude a été de corréler les propriétés mécaniques du muscle soleus avec sa
microstructure et ses composants physiologiques.
Une technique ergométrique (Laboratoire de Biomécanique et Génie Biomédical, UTC) a
permis d’imposer différents tests mécaniques (test de relaxation, étirement en rampe, test de
relaxation incrémental) à des muscles isolés âgés de 1, 4 et 12 mois. L’utilisation de différents
âges permet d’avoir des modifications de propriétés morphologiques. Les paramètres
mécaniques enregistrés sont les forces et tensions statiques et dynamiques ainsi que le module
d’Young.
L’analyse des propriétés morphologiques a été réalisée via des coupes histologiques qui ont
permis de mesurer la surface et la répartition des différents types de fibres.
Les résultats ont montré une augmentation des forces dynamiques (facteur 2,5) et statiques
(facteur 1,7) entre 1 et 4 mois. Cette résistance à l’étirement est corrélée aux propriétés
morphologiques du muscle puisque la surface des fibres a doublé pendant cette période et aux
propriétés physiologiques car la quantité de collagène a triplé.
197
Echelle microscopique
Une technique ergométrique (Laboratoire de Plasticité Neuromusculaire) similaire à celle
utilisée pour le muscle isolé va être appliquée sur des fibres musculaires issues des précédents
muscles. Les résultats aux tests mécaniques ont montré une augmentation des forces entre 1 et
4 mois qui est liée à l’augmentation du diamètre des fibres qui a doublé pendant cette période.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Ces deux études menées sur l’os et le muscle ont montré qu’il y avait une adaptation des
propriétés mécaniques et morphologiques de l’os et du muscle à la demande fonctionnelle. En
effet, il a clairement été prouvé au cours de ce travail que les propriétés mécaniques étaient
perturbées lors de modifications morphologiques aussi bien pour l’os (variation de porosité)
que pour le muscle (variation de la surface des fibres).
Les études menées à l’échelle microscopique sur l’os (échelle de l’ostéon) et sur le muscle
(échelle de la fibre) ont permis de démontrer que les modifications mécaniques enregistrées à
l’échelle macroscopique sont le résultat plus ou moins moyenné de changements produits à
l’échelle microscopique.
Cette étude fondamentale aura permis de constater une évolution similaire au cours du temps
du comportement de l’os et du muscle. En effet, pendant qu’une diminution des propriétés
mécaniques s’installe avec une augmentation de la porosité, il apparaît en parallèle une
décroissance de la résistance musculaire à l’étirement liée aux variations des propriétés
morphologiques. Ce résultat est en accord avec d’Arcy Thompson 1961 : « l’os et le muscle
sont inséparablement associés et connectés, ils sont moulés l’un avec l’autre… »
Ce travail pluridisciplinaire a associé différents domaines de recherche. Le tendon qui est le
tissu intermédiaire entre l’os et le muscle devra être étudié (propriétés mécaniques et
morphologiques) afin de faire la jonction entre l’os et le muscle. Les perspectives seront
d’étudier les interactions entre l’os, le muscle et le tendon lors d’une pathologie osseuse ou
musculaire. Il sera nécessaire d’évaluer le comportement mécanique de chacun de ces
matériaux afin d’agir sur l’ensemble de ces tissus qui subissent les conséquences d’une
pathologie.
198
199
Résumé : La caractérisation du tissu musculo-squelettique, qui a fait l’objet de très peu d’études au
cours de ces dernières années, fait appel à une connaissance pluridisciplinaire associant les
tissus osseux et musculaires.
Ainsi, des techniques ultrasonores et mécaniques ont été utilisées pour déterminer les
propriétés mécaniques (module d’Young, coefficients élastiques), acoustiques (vitesse de
propagation) et élastiques passives (forces et contraintes) d’échantillons osseux (os cortical
humain) et musculaires (soleus de rat). Ces différents tests ont été réalisés aux échelles
macroscopiques (ostéons, muscles isolés) et microscopiques (lamelles osseuses, fibres
musculaires). Parallèlement une caractérisation des propriétés morphologiques (porosité,
diamètre des pores, surface des fibres) et biochimiques (degré de minéralisation, analyse du
contenu d’hydroxyproline et de titine) de ces deux tissus a été obtenue via l’utilisation de
microscopes optique et environnemental, micro scanner et électrophorèses.
L’analyse des propriétés mécaniques mesurées aux échelles microscopiques a permis
d’expliquer certaines modifications enregistrées aux échelles macroscopiques. Cette étude a
également permis de mettre en évidence de fortes corrélations entre les propriétés mécaniques
et morphologiques pour ces deux tissus.
Mots clés :
Os cortical - Muscle soleus - Ultrasons - Nanoindentation - Titine - Propriétés mécaniques
Propriétés morphologiques