UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA

JABOLČNI KIS*

Tanja TIČ, Tilen TRAVNIK, Matej URBANIJA

(študentje tretjega letnika študija Živilske tehnologije)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja)

Ljubljana 2003

* Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 2 POVZETEK Kis je začimba, ki jo človeštvo pozna že tisočletja. Surovine za pridelavo kisa so po svetu različne, postopek pridobivanja pa je praktično enak. Jabolčni kis je prijetnega okusa in vonja in je 4-10% raztopina ocetne kisline. V Sloveniji so jabolka najbolj zastopana in poceni sadna vrsta. Kis nastaja v dveh fazah. Prva je alkoholna fermentacija, v drugi fazi pa nastali alkohol ocetnokislinske bakterije pretvorijo v ocetno kislino in ogljikov dioksid. Poleg glavne karakteristične komponente kisa, ocetne kisline (koncentracija pogojuje jakost kisa), vsebuje kis še druge spojine. Te pridejo v kis z osnovno surovino ali jih sintetizirajo kvasovke in bakterije v določenih stopnjah fermentacije. Poznamo tri načine pridobivanja kisa: orleanski proces, Boerhaavejo metodo in submerzno ali potopno metodo, ki je v industriji najpogosteje uporabljen postopek. Ocetnokislinske bakterije so po Gram-u negativne, obligatno aerobne bakterije, ki jih delimo v dva rodova: Acetobacter in Gluconobacter. Te bakterije imajo zmožnost oksidacije alkoholov in sladkorjev. Oksidacija etanola poteka prek dveh zaporednih stopenj: oksidacije etanola v acetaldehid ter acetaldehida v acetat. Reakciji katalizirata encima alkohol dehidrogenaza in aldehid dehidrogenaza. Jabolčni kis se uporablja kot začimba in kot sredstvo za konzerviranje, ima pa še druge načine uporabe (čistilo, zdravilo). SUMMARY Vinegar is the spice known for centuries. Raw materials differ around the world but the production process is essentially the same. Apple vinegar (Cider vinegar) is a 4 to 10% solution of acetic acid and has a pleasant taste. In Slovenia apples are a common and cheap fruit variety. The production of vinegar has two phases. Alcohol fermentation which produces alcohol is the first phase. The produced alcohol is than fermented to acetic acid and carbon dioxide by acetic acid bacteria. Acetic acid is the main characteristic component of vinegar which also contains other substances originated from raw material or are synthesized by yeasts and bacteria during the fermentation process. Vinegar can be produced with three different methods: surface culture, immobilized culture and the submerged vinegar fermentation. Acetic acid bacteria are Gram negative obligatory aerobic bacteria, which belong to two groups Acetobacter and Gluconobacter. They have the capability for alcohol and sugar oxidation. Ethanol oxidation proceeds through two consucetive phases: the oxidation of ethanol to acetaldehid and the oxidation of acetaldehid to acetate. The reactions are catalyzed by the enzymes alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase. Apple vinegar is mainly used as spice and conservation agent although it has many other ways of application (cleanser, medicine).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 3 KAZALO VSEBINE 1 Uvod ...................................................................................................................... 4 2 Zgodovina bioprocesa............................................................................................ 5 3 Mikrobiološke osnove bioprocesa......................................................................... 6 3.1 Alkoholna fermentacija ......................................................................................... 6 3.1.1 Pomen temperature za alkoholno fermentacijo ..................................................... 6 3.2 Ocetnokislinske bakterije ...................................................................................... 7 3.2.1 Taksonomija .......................................................................................................... 7 3.2.2 Izolacija in identifikacija ....................................................................................... 7 4 Biokemijske osnove bioprocesa ............................................................................ 9 4.1 Pridobivanje ocetne kisline iz etanola ................................................................. 10 5 Bioinženirske osnove bioprocesa ........................................................................ 12 5.1 Pripravljalni postopki .......................................................................................... 12 5.2 Potek bioprocesa.................................................................................................. 12 5.2.1 Postopek z uporabo površinske kulture ............................................................... 12 5.2.2 Postopek z uporabo imobilizirane kulture ........................................................... 13 5.2.3 Submerzni postopek ............................................................................................ 15 5.3 Zaključni postopki ............................................................................................... 16 5.3.1 Postopki bistrenja ................................................................................................ 16 5.3.2 Postopki konzerviranja ........................................................................................ 16 6 Ekološki aspekt bioprocesa ................................................................................. 17 6.1 Vpliv na človeka.................................................................................................. 17 6.2 Vpliv na okolje .................................................................................................... 17 7 Uporaba kisa v prehrani....................................................................................... 18 7.1 Jabolčni kis kot vir kalija..................................................................................... 18 7.2 Kis za vlaganje (konzerviranje)........................................................................... 18 7.2.1 Postopek vlaganja ................................................................................................ 18 7.3 Sadje v kisu.......................................................................................................... 19 7.4 Kis s svežim sadjem in zelišči ............................................................................. 19 7.5 Kis z medom........................................................................................................ 19 7.6 Uporaba kisa v gospodinjstvu ............................................................................. 19 7.7 Kdo ne sme uživati jabolčnega kisa .................................................................... 20 7.8 Uporaba jabolčnega kisa v drugih živilih in v druge namene ............................. 20 8 Reference ............................................................................................................. 21 8.1 Citirani viri .......................................................................................................... 21 8.2 Drugi viri ............................................................................................................. 21

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 4

1 Uvod Seminarska naloga o jabolčnem kisu ima namen predstaviti zgodovino in posamezne stopnje v pridobivanju tega bioproizvoda. Proces proizvajanja kisa je zgodovinsko gledano šel skozi več razvojnih faz, v katerih se je ob spoznavanju bioinženirskih, mikrobiloloških in biokemijskih osnov izpopolnjevala tudi tehnološka oprema. Že dolgo je znano, da so mikroorganizmi ključni element proizvodnje kisa, danes pa vemo, da so nekatere vrste kvasovk in bakterij še posebno primerne. V seminarski nalogi bodo poleg mikrobioloških in biokemijskih osnov predstavljene tudi glavne bioinženirske tehnike pridobivanja kisa. Pri iskanju ustrezne literature se je pokazalo, da o jabolčnem kisu ni na razpolago veliko bibliografskih enot, zato smo si pomagali z literaturo o pridobivanju kisa ter ocetne kisline. In poudarili, da se jabolčni kis pridobiva na podoben način kot druge vrste kisa s tem, da je vhodna surovina sestavljena iz jabolk. Na končno kakovost in organoleptične lastnosti kisa vpliva tako vhodna surovina, kakor tudi proces sam, kar pa od proizvajalca zahteva veliko znanja. V slovenščini je na razpolago le malo strokovne literature o kisu, večino snovi smo povzeli po tuji literaturi. Med posameznimi postopki za proizvodnjo kisa so velike razlike, čeprav vsi temeljijo na istih mikroorganizmih, kar je svojevrsten pojav, na katerega bi radi opozorili. Tako lahko kis po orleanskem postopku proizvajamo doma, submerzni postopek pa je tehnološko izredno zapleten. Zapletenost postopka pa ne vpliva na kakovost končnega izdelka.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 5

2 Zgodovina bioprocesa Kis se uporablja že vsaj 5000 let. Odkar ljudje poznajo alkoholne pijače, tudi vedo, da te pijače na zračnem in toplem mestu preidejo v kis. Priprava vina in piva je bila dobro poznana v starodavnem Egiptu in Mezopotamiji več tisočletji pred našim štetjem. Znano je, da se je v Egiptu fermentacija vina nadaljevala naprej do kisa. Egipčanski kis je bil kasneje zelo cenjen pri Grkih in Rimljanih. Kis je bil pogosto omenjen v edini kuharski knjigi, ki se je ohranila iz časa rimske dobe Artis magiricae libri X, avtorja Apiciusa. Babilonci so izdelovali nekaj različnih tipov kisa, kot surovino pa so uporabljali tudi drevesni sok palme, dateljnove palme in žitni slad. Znanost o kisu in tehnologija priprave se je razširila v druge dežele iz Srednjega vzhoda in mogoče tudi Kitajske. Kis je Britanijo verjetno dosegel okoli 1. stoletja pred našim štetjem, ko so ga uporabljali Kelti vzdolž francoske obale Atlantika. Britanska proizvodnja kisa, ki je temeljila na sladu, se je začela že v rimskih časih, čeprav beseda »vinegar« (kis) izhaja iz francoske »vinaigre« (kislo vino). Zgodnja raba sorodnega termina »alegar« (kislo pivo) za opisovanje kisa iz slada je besedo »vingar« podprla (Adams, 1985). Prvotno so ljudje delali kis sami zase, kar doma. V 14. stoletju se je v Franciji pojavil prvi ceh proizvajalcev kisa. Vino v pokončnih sodih se je počasi kisalo, ker je bil dostop zraka le na vrhu. Pozneje so uporabljali ležeče sode z odprtinami ob straneh, tako da je zrak krožil. Pospešen način kisanja je bil dosežen s pretakanjem preko grozdnih pecljev ali koruznih strženov, tako poteka oksidacija na veliki površini. Naslednji tehnološko naprednejši korak je nastal leta 1949, ko sta Ebner in Hromatkar uporabila submerzno biotehnološko tehniko za oksidacijo etanola v ocetno kislino. Pri tej je koncentracija alkohola in ocetne kisline natančno določena. Dobro prezračevanje je obvezno, saj v največji količini določa sam potek kisanja. Ko je v tekočini dosežena zastavljena koncentracija etanola, izločijo določeno količino kisa iz bioreaktorja. Sledi polnjenje z naslednjo drozgo do začetnih koncentracij za naslednji cikel. Praznjenje je hitro, polnjenje pa počasno pri konstantni temperaturi in mešanju. S tem se prepreči poškodovanje ali odmrtje bakterij. Tudi pena škodljivo vpliva nanje, zato se uporablja mehanski odstranjevalec pene. Dolgo časa je prevladovalo mnenje, da »ocetno vrenje« ni biološki proces, ampak da je posledica razgradnje mrtvih tkiv organizmov, ki služijo kot katalizator. Šele Pasteur je l. 1868 s svojim delom »Etudes sur le vinaigre« dokazal, da v pasterizirani alkoholni tekočini ob pristopu zraka ni ocetnega vrenja. Ko pa je v tekočino cepil malo kulture Mycoderma acetati, je nastopilo »vrenje«. Od takrat so znanstveniki izolirali mnoge vrste ocetnih bakterij in jih razporedili v sistem (Adams, 1985).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 6

3 Mikrobiološke osnove bioprocesa

3.1 Alkoholna fermentacija Kvasovke so mikroorganizmi, ki izvedejo proces alkoholne fermentacije. Potek le-te je odvisen od seva kvasovk. Kvasovke, ki se nahajajo na površini jabolk, so šibko in močno vrelne in pri vretju preidejo v jabolčno kašo. Poleg teh pa lahko dodajamo selekcionirane kvasovke. Močno vrelne kvasovke: rod Saccharomyces so prisotne na površini jabolk in lahko povrejo sladkor v alkohol z volumskim deležem 9-12%. Iz rodu Saccharomyces s selekcijo pridobivajo populacijo najboljših sevov za relativno ali absolutno čisto alkoholno fermentacijo. Šibko vrelne kvasovke: so prisotne na jabolčni površini. Začnejo spontano alkoholno fermentacijo. Njihovo delovanje preneha v 3-6 dneh, ko jih začne ovirati lastno proizvedeni alkohol.

Selekcionirane kvasovke: so rezultat velikega števila izoliranih in determinativnih kvasovk rodu Saccharomyces. Glede na potek fermentacije imajo najboljše biokemijske lastnosti, saj se od njih zahteva:

• kratka faza razmnoževanja in hiter pričetek alkoholne fermentacije; tako lahko hitro prevladajo nad nežlahtnimi kvasovkami,

• alkoholna fermentacija mora potekati enakomerno brez zastojev, • pri fermentaciji naj se tvori čim manj pene, da prihranimo na fermentacijski

prostornini, • pri pretvorbi sladkorjev naj bo malo hlapnih kislin in • nastali sekundarni proizvodi fermentacije naj bodo takšni, da povečujejo kakovost

izdelka (Opara, 1980).

3.1.1 Pomen temperature za alkoholno fermentacijo Optimalna temperatura za razmnoževanje kvasovk je med 25-28°C. Večja odstopanja od te temperature imajo negativen vpliv na potek alkoholne fermentacije. Višja temperatura povzroča oblikovanje stranskih produktov fermentacije. Če pa je temperatura previsoka, lahko pride do prekinitve alkoholne fermentacije. Prav tako nizka temperatura ni primerna za alkoholno fermentacijo. Fermentacijo, ki poteka med 6 in 10°C, imenujemo hladna fermentacija. Tudi pri tej temperaturi lahko z ustreznimi kvasovkami in pri podaljšanem času alkoholne fermentacije dosežemo popolno povretje sladkorja. Brez dodatka selekcioniranih kvasovk pa se fermentacija zavleče in mošt oksidira, pojavijo se plesni, količine nepovretega sladkorja pa ni mogoče predvideti (Opara, 1980).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 7 3.2 Ocetnokislinske bakterije

3.2.1 Taksonomija Ocetnokislinske bakterije so po Gramu negativne, 0,6-0,8µm dolge, elipsoidne ali paličaste bakterije. Imajo flagele, kar jim omogoča hitro premikanje. So obligatni aerobi, ki proizvajajo pigmente ali celulozo. Zmožne so mutiranja in z lahkoto spremenijo obliko. Najpomembnejša sposobnost ocetnokislinskih bakterij je oksidacija etanola v ocetno kislino. To njihovo lastnost človek že tisočletja uporablja za izdelovanje različnih vrst kisa (vinski, jabolčni, alkoholni, rižev, sladni in drugi). Prvi, ki je ločil različne vrste ocetnokislinskih bakterij je bil Hansen leta 1879 (Bacterium aceti, Bacterium pasteurianum, Bacterium kützingianum). Kasneje so ocetnokislinske bakterije uvrstili v družino Acetobacteriaceae in znotraj družine v rodova Acetobacter in Gluconobacter (De Ley s sod., 1984). Rodova med seboj razlikujemo po sposobnosti oksidacije acetata in laktata do CO2 in H2O. To sposobnost imajo le vrste rodu Acetobacter, vrste iz rodu Gluconobacter pa ne. Med obema rodovoma ocetnokislinskih bakterij pa obstaja tudi značilna razlika v velikosti PCR-produktov medgenskih regij 16S-23S rDNK (število in velikost nukleotidov), kar nam omogoča hitro razlikovanje obeh rodov. (Trček, 1999)

G. oxydans

G. frateurii

G. cerinus

G. asaii

A. aceti

A. pasteurianus

A. methanolicus

A. diazotrophicus

A. liquefaciensR. globiformis

A. hansenii

A. intermedius

A. xylinus

A. europaeus

Slika 1: Filogenetsko drevo tipskih vrst rodov Acetobacter in Gluconobacter (Boesch s sod., 1998)

Raziskave znanstvenikov vodijo tudi v pridobitev ocetne kisline z anaerobno fermentacijo glukoze s Clostridium thermoaceticum (Trček, 1999).

3.2.2 Izolacija in identifikacija Mikrobno naravo proizvodnje kisa je prvi odkril Künitz. Izoliral je ocetnokislinske bakterije in tako dokazal, da inokulum kisa vsebuje majhne organizme razporejene v verigah.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 8 Industrijski proces pridobivanja kisa se še vedno začne z inokulumom, ki vsebuje nedefinirane mikroorganizme iz prejšnjega oksidacijskega cikla. Pri izolaciji teh mikroorganizmov pa se pojavi problem, saj kulture filtrata iz industrijskega acetatorja za rast potrebujejo gojišče z določenim pH-jem in nekaterimi drugimi začetnimi pogoji. Pri zahtevanih pogojih pa mikroorganizmi preplavijo posodo s starter kulturo, kar otežuje njihovo identifikacijo. Hitro razmnoževanje jim omogoča kratka lag faza, toleranca na etanol in dokaj visoke koncentracije ocetne kisline ter druge ugodne lastnosti za razmnoževanje. Avtorji opisujejo različne vrste ocetnokislinskih bakterij, ki naj bi bile odgovorne za proizvodnjo kisa, saj je v uporabi več različnih izolacijskih gojišč in postopkov izolacije. Te ne dajejo enakih možnosti za rast vsem vrstam iz ocetnokislinske populacije. Ravno zaradi težav pri izolaciji teh bakterij iz kisa bi bilo nujno razviti tehniko, ki bi omogočila direktno identifikacijo vrst iz ocetnokislinske populacije v bioreaktorju za proizvodnjo kisa. To bi omogočilo prepoznavanje vrst v populaciji ocetnokisllinskih bakterij iz različnih stopenj oksidacije etanola v ocetno kislino in pripomoglo k boljšemu poznavanju bioprocesa proizvodnje kisa (Trček, 1999).

3.2.2.1 Metode identifikacije Ocetnokislinske bakterije lahko identificiramo z analizo profila plazmidov (Davies s sod., 198?). Plazmidi so okrogle, ekstrakromosomske DNK molekule, katerih profil je zelo specifičen za določeni rod bakterij. Razlike plazmidnih profilov predstavljajo osnovo tehnike za identifikacijo mikroflore. Raziskave zadnjih let so pokazale, da se profili plazmidov določenega rodu tudi po petih letih mirovanja ne spremenijo. V zadnjem času je bila za identifikacijo bakterijskih vrst uspešno uporabljena regija med genoma za 16S in 23S rRNK. Za hitro razlikovanje rodov Acetobacter in Gluconobacter pa obstaja značilna razlika v velikosti PCR-produktov medgenskih regij 16S-23S rDNK. Medvrstno razlikovanje rodu Acetobacter omogoča razlika v restrikcijskih mestih medgenskih regij 16S-23S rDNK (Trček, 1999). Za identifikacijo genov ocetnokislinskih bakterij pa so uporabne manipulacijske tehnike DNK, ki temeljijo na gostiteljskemu vektorju (Beppu, 1993).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 9

4 Biokemijske osnove bioprocesa Kis je razredčena raztopina ocetne kisline, ki nastane pri dvofaznem fermentacijskem procesu. Za tvorbo ocetne kisline je potreben etanol, ki ga s svojim metabolizmom iz sladkorja proizvedejo kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Ocetna kislina je produkt delovanja ocetnokislinskih bakterij, ki so sposobne etanol v raztopini oksidirati do ocetne kisline. Prva stopnja je tako produkcija etanola iz ogljikovih hidratov, v drugi stopnji pa se etanol oksidira do ocetne kisline (Adams, 1985).

sadje žito, gomolji (škrob)

encimi(C6H10O5)n x C6H12O6 + y C12H22O11

škrob glukoza maltoza

fermentirajoči monosaharidi in disaharidi

ALKOHOLNA FERMENTACIJA kvasovke

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 ogljikov glukoza ali

fruktoza etanol anaerobni pogoji etanol dioksid

ocetnokislinske OCETNOKISLINSKA FERMENTACIJA

bakterije C2H5OH CH3COOH + H2O

ocetna kislina

etanol aerobni pogoji voda ocetna kislina

Slika 2: Shematični prikaz proizvodnje kisa (Adams, 1985)

Po teoretičnih izračunih dobimo iz 1g glukoze 0,51 g etanola, ki fermentira v 0,67g ocetne kisline (Encyclopedia of Microbiology, 2000). V praksi sta za 1% ocetne kisline v končnem izdelku potrebna vsaj 2% sladkorja v surovini (Adams, 1985). Prva faza, ki jo izvajajo mikroorganizmi, je produkcija etanola iz raztopine, ki vsebuje sladkorje. pH vrednosti v kislem območju (med 4 in 5) ter relativno velika začetna koncentracija sladkorja (okoli 10%) ustvarjajo pogoje, ki omogočajo prevlado kvasne mikroflore nad ostalimi prisotnimi mikroorganizmi. Med fermentacijo se pH vrednost niža, povečuje pa se koncentracija etanola, kar ima inhibitorni učinek na mnoge mikroorganizme. Zaradi nastajanja CO2 se postopoma vzpostavijo anaerobni pogoji, kar povzroči odmrtje morebitno prisotnih obligatno aerobnih mikroorganizmov. Trdimo lahko torej, da alkoholno fermentacijo v celoti izvedejo kvasovke. Alkoholna fermentacija je spontana, vendar ima slabe izkoristke, saj lahko sladkor namesto za nastajanje etanola za svoj razvoj izkoriščajo tudi drugi mikroorganizmi, na primer mlečnokislinske bakterije, zato v kisarnah pogosto uporabljajo različne tehnike inokulacije kvasovk. V nekaterih primerih inokulum predstavlja biomasa, ki je po fermentaciji prehodne šarže ostala na stenah posode. Sodobne kisarne pa seveda sadni sok cepijo s čistimi kulturami kvasovk, ki so jih vzgojili sami ali pa kupili v različnih oblikah (aktivne v tekočih gojiščih, posušene, stisnjene). Največkrat so uporabljeni različni sevi Saccharomyces cerevisiae (Adams, 1985). Alkoholna fermentacija oziroma pretvorba heksoz v etanol, ki jo izvaja Saccharomyces cerevisiae, kemijsko opišemo z enačbo, ki jo predstavlja enačba 1.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 10

2 CO2 C2H5OHC6H12O (1)2 +6 etanol ogljikov dioksid monosaharid

Etanol ne nastane direktno iz glukoze, temveč iz piruvata. Tega kvasovke tvorijo iz glukoze v zaporedju več reakcij, ki jim skupno pravimo Embdem-Mayerhoff-Parsova pot razgradnje glukoze. Teoretično iz 1g glukoze pri alkoholni fermentaciji nastane 0,511g etanola. Ta teoretična vrednost ni nikoli dosežena zaradi tvorbe nekaterih drugih metabolitov (Bluhm, 1983). Proces je anaeroben, poteka pri temperaturi med 30 in 32°C, med njegovim potekom pa se sproščajo tudi večje količine energije (cca. 239 kJ/mol glukoze, od česar približno 30% uskladiščijo kvasne celice v ATP, ostalo pa se sprosti v okolico kot toplota). Čas trajanja alkoholne fermentacije je odvisen od več dejavnikov, večinoma pa je zaključena v 48 do 72 urah (Adams, 1985).

4.1 Pridobivanje ocetne kisline iz etanola Med bioprocesom pridobivanja ocetne kisline se etanol skoraj kvantitativno oksidira do ocetne kisline. Običajni izkoristek je med 95 in 98%, ostanek je običajno izgubljen v izhajajočem plinu. Istočasno se primeren vir šestih ogljikovih atomov (zaželena glukoza) oksidira. Končna produkta te oksidacije sta CO2 in H2O. Celokupno reakcijo prikazuje enačba 2.

2 CH3CH2OH 2 CH3COOH ocetna kislina

H2O O (2)2 kisi+ + etanol k voda

Oksidacija etanola s strani ocetnokislinskih bakterij poteka preko dveh zaporednih stopenj. Prva stopnja je oksidacija etanola v acetaldehid, ki nato reagira z vodo in dobimo hidratiziran acetaldehid. V drugi stopnji pa se ta aldehid dehidrogenira in dobimo ocetno kislino.Reakciji katalizirata alkohol dehidrogenaza (ADH) in aldehid dehidrogenaza (ALDH). To prikazuje reakcija (3):

O2 H2O

acetaldehid ocetna kislina

Ocetna kislina se prav tako vzporedno oblikuje pri disproporcionaciji dveh molekul acetaldehida. Reakcija (4):

Etanol se nato reoksidira in ciklus se ponavlja.

ocetno fermentacijo nastajajo tudi drugi sekundarni produkti, ki dajo kisu tipično aromo. Oblikujejo se male količine hlapnih substanc (etan, actaldehid, etil formiat, etil acetat, Z

etanol2 acetaldehid + ocetna kislina (4)H2O

etanol hidratiziran acetaldehid (3)H2O - H2

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 11 izopentil acetat, butanol, metilbutanol, acetilmetilkarbinol), ki se spreminjajo od kisa do kisa, odvisno od surovin, ki dajejo kisu pestrost vonja, okusa, barve in ostalih lastnosti (Plessi, 1993).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 12

5 Bioinženirske osnove bioprocesa Kljub temu, da je kis izredno staro živilo, se je do danes razvilo malo postopkov za izdelavo. Vsi postopki so polkontinuirni, saj se del šarže vedno uporabi kot neke vrste starter kultura. V tej nalogi bodo opisani trije postopki

• postopek z uporabo površinske kulture (lesen sod); • postopek z uporabo imobilizirane kulture (generator); • submerzni postopek (acetator).

Ker se v svetu količinsko gledano, največ kisa izdela po submerznem postopku, bo ta predstavljen najbolj podrobno. Ta postopek je tudi inženirsko najzahtevnejši.

5.1 Pripravljalni postopki Naravni kis (v nadaljevanju kis) lahko proizvedemo iz praktično vsake nestrupene surovine, iz katere lahko pridobimo sok, ki vsebuje sladkorje (Adams, 1985). Sladkor je naravna sestavina vseh vrst sadja (tudi jabolk), veliko ga je tudi v raznih vrstah zelenjave in poljščin (žita, krompir...). Z mletjem, prešanjem oziroma stiskanjem in podobnimi postopki ta sladkor preide v raztopino. Takšno raztopino potrebujemo za vse postopke priprave jabolčnega kisa. V jabolčnem soku je takoj po stiskanju premalo sladkorja (5 – 6%) za dobro fermentacijo v alkohol, zato ga je potrebno koncentrirati toliko časa, da je v substratu okoli 12% sladkorja. Da se zmanjša možnost infekcije, se medij nato lahko zakisa z dodatkom žveplene kisline do pH med 4,5 in 5,0 in pasterizira. V nekaterih primerih se doda tudi amonijev sulfat kot hranilo za kvasovke. Kadar je substrat sadje, vsebuje iztisnjeni sok pogosto še delčke tega sadja. Zato se že pred stiskanjem večkrat dodajajo encimi ki pospešijo iztekanje sadnega soka (Adams, 1985). Če imamo opravka s surovinami, ki vsebujejo veliko škroba, je le-tega potrebno razgraditi do monosaharidov bodisi s kislinsko hidrolizo a1i pa z uporabo amilolitičnih encimov. Ti najpogosteje izvirajo iz slada. Danes se veliko uporabljajo tudi pripravki mikrobiološkega izvora (predvsem iz različnih plesni) (Adams, 1985). Pri jabolčnem kisu tega postopka ni potrebno uporabljati, saj jabolka vsebujejo malo škroba, ki se hitro porabi za »dihanje« jabolka, ko to doseže fiziološko zrelost. Za dober jabolčni kis potrebujemo alkoholni substrat z okoli 12% etanola.

5.2 Potek bioprocesa

5.2.1 Postopek z uporabo površinske kulture Ta postopek je najstarejši. Priprava za izdelovanje kisa po z uporabo površinske kulture je dokaj preprosta. Substrata ne polnimo do vrha, saj je fermentacija aerobna in je prisotnost kisika njuna. Po določenem času se namnoži mikroflora ocetnokislinskih bakterij, ki tvorijo film oz. mreno na površini tekočine (tudi klobuk, kisova matica). Proces je nekontinuiren, kar pomeni, da se mora film ustvariti vedno znova. To je ob slabi prezračenosti lahko zelo dolgotrajen proces, poleg tega pa pride zaradi namnoževanja tudi do izgub substrata. Izboljšave so možne z uporabo dobrega inokuluma ocetnokislinskih bakterij. Podobno kot pri alkoholni fermentaciji, lahko inokulum predstavlja sama posoda (npr. z bakterijami, vezanimi na notranji steni lesenega soda), v kateri je lahko še ostanek že narejenega kisa iz prejšnje šarže, kar postopek še pospeši. Polkontinuirni proces, kjer ocetnokislinsko mikrofloro v sloju vzdržujemo v aktivnem stanju, je znan kot orleanski postopek. V delno napolnjenih sodih se kisanje izvaja, dokler

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 13 kislost ne doseže določene vrednosti. Del kisa se nato odstrani, dotoči pa se svež alkoholni substrat. Poškodbe površinskega filma so nezaželene, zato so sodi oprem1jeni s posebnim lijakom, ki omogoča dotakanje od spodaj in ne na površino (Slika 3). Nad nivojem tekočine je izvrtanih tudi več odprtin, ki omogočajo prezračevanje. Vse so prekrite s tkanino, ki preprečuje dostop insektom (Adams, 1985). Opisani postopek je dobil ime po francoskem kraju Orleans, kjer so ga že v 14. stoletju uporabljali za industrijsko proizvodnjo kisa. Danes se ga uporablja za lastne potrebe v gospodinjstvih in za prodajo v manjših količinah po kmetijah (Adams, 1985). Postopek najbolje poteka pri temperaturi 25°C. Kis naj bi po fermentaciji še vedno vseboval od 0,2 – 0,3% etanola, da lahko med skladiščenjem pride do esterifikacije, ki pripomore k izboljšanju arome končnega izdelka. Fermentacija ne sme potekati prehitro, saj se etanol slabše izkorišča, in ne prepočasi, ker se lahko razvijejo sluzave bakterije in plesen (Mycoderma vini). Izkoristek je približno 80%. Čas kisanja se zelo podaljša, če želimo kis z več kot 7% ocetne kisline. Pri 10% ocetne kisline se kisanje ustavi.

Slika 3: Posoda za izdelavo kisa po orleanskem postopku (Adams, 1985)

Glavna slabost orleanskega postopka glede na ostale tehnologije je v tem, da je dolgotrajen. Poleg tega je pri tem postopku za kisarne večjih zmogljivosti potrebna tudi velika proizvodna površina in večje število zaposlenih ljudi. Poraba hladilne vode in energije je izjemno nizka. Tak način pridobivanja kisa je zato primeren za področja, kjer je cena zemljišč in delovne sile nizka. Kljub dejstvu, da z orleanskim postopkom (lahko) dobimo izdelek najboljše kakovosti, je na ta način pridobljen samo majhen delež svetovne proizvodnje kisa (Adams, 1985).

5.2.2 Postopek z uporabo imobilizirane kulture Ker je količina izdelanega kisa pri orleanskem postopku odvisna od površine, ki je na voljo za ocetnokislinske bakterije, se je kasneje uveljavil t.i. Buerhaavejev postopek. Njegova posebnost je v tem, da čim večjo površino za fermentacijo zagotavlja s tem, da se substrat pretaka po polnilu (oblanci, grozdni peclji,…). Sprva je bila naprava primitivna. Sestavljata jo dva lesena soda z dvojnim dnom, ki so ju napolnili z grozdnimi peclji in tanjšimi vejicami vinske trte, preko katerih so vsakodnevno pretakali kisano tekočino iz

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 14 enega soda v drugega. Napravo, ki se je razvila za uporabo tega postopka, imenujemo generator (Slika 4). Sode so nadomestili cilindrični leseni bioreaktorji, za polnilo so uporabljali različne materiale (grozdna stebla, brezove vejice, trsne palice, lesne oblance, v novejšem času tudi razne keramične nosilce), tekočina se ni več pretakala iz soda v sod, temveč je kontinuirno krožila od dna generatorja na vrh, kjer se je razškropila preko polnila z adherirano kulturo in počasi pronicala zopet do dna (Adams, 1985).

Slika 4: Shematični prikaz generatorja (Adams, 1985)

Najbolj izpopolnjeno verzijo je dolgo let ponujalo nemško podjetje Heinrichs Frings GmbH & Co. KG, katerega generatorji različnih kapacitet se v industrijski proizvodnji kisa veliko uporabljajo še danes. Lesen fermentor (kasneje tudi iz nerjaveče pločevine) je največkrat napolnjen s parjenimi bukovimi oblanci, po katerih tekočino z vrha prši rotirajoča škropilna roka. Z zunanjim toplotnim menja1nikom je med kroženjem omogočeno učinkovito reguliranje temperature (optimalno med 28 in 35 °C), zadostno količino zraka (0,8-0,9 m3/h) pa zagotavlja kvalitetno umetno prezračevanje z dna generatorja. Z vključitvijo nekaterih meri1nikov proizvodnja lahko poteka polavtomatsko. Ko količina alkohola v substratu pade z začetnih 4 - 5% na okoli 0,3%, proces zaustavimo. Del kisa se odčrpa, preostanek pa dopolni s svežim substratom, kar novi šarži skrajša lag fazo in pospeši kisanje. En cikel navadno traja približno en teden, odvisno od izpopolnjenosti generatorja in izkušenosti kisarja. Zaradi izparevanja lahko prihaja tudi do 20 % izgub kisa (Adams, 1985). Življenjska doba oblancev in generatorja je zelo odvisna od vrste surovine (daljšo omogočajo tekočine z manj hranili, saj je rast imobiliziranih bakterij v tem primeru manj intenzivna). Medtem ko so generatorji uporabni 5 do 30 let, je potrebno oblance v primeru zasluzenja menjati tudi vsako leto. Zaradi korozivnosti morajo biti vsi ventili, črpalke, cevi in armature narejeni iz plastičnih mas ali nerjavečega jekla.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 15 Vsak cikel traja 24 - 48 ur, izkoristek pretvorbe etanola v ocetno kislino je okoli 94% (Adams, 1985; Johanides s sod., 1976).

5.2.3 Submerzni postopek Ideja o postopku s potopljeno kulturo se je začela pojavljati konec 19. stoletja. Razvitih je bilo kar precej različnih postopkov, vendar je daleč najuspešnejši t.i. Fringsov Acetator®. Bistvo tega procesa je, da so mikroorganizmi potopljeni v samem substratu. Ker je ocetnokislinska fermentacija aerobna, je potrebno zagotoviti stalen dovod kisika. Za to skrbi aerator. To je ponavadi plošča diskaste ali kvadratne oblike, ki ima na robovih luknjice, skozi katere potiska zrak v substrat. Že 1 minutna prekinitve dovoda zraka lahko popolnoma zaustavi proces acetifikacije, ki se tudi po ponovni vzpostavitvi prezračevanja ne obnovi. Aerator se vrti s hitrostjo 1450-1750 min-1 in predstavlja največji del energije, potrebne za obratovanje, od 1,2 do 20,0 kWh/h. Temperatura med fermentacijo je ponavadi vzdrževana na 30°C, kar omogoča hladilna kača znotraj acetatorja, po kateri se hladilna voda pretaka s hitrostjo 500-8000 l/h (Adams, 1985). Zaradi prej omenjene občutljivosti je pri večjih kisarnah nujno potrebna uporaba električnih generatorejv, ki se vklopijo v primeru izpada električne energije. Večji problem pri submerznih fermentacijah lahko predstavlja tudi penjenje. Pena, ki nastane zaradi prisotnih površinsko aktivnih snovi, lahko vodi do izgub tekočine, blokade zračnih izpuhov, poveča se nevarnost infekcij, hitrost prenosa kisika pa je manjša. Nastajanje pene lahko uravnavamo s protipenilci, vendar se ob njihovi uporabi poveča velikost plinskih mehurčkov v tekočini, zaradi česar se zmanjša hitrost prenosa kisika in s tem učinkovitost prezračevanja.

Slika 5: Shematični prikaz acetatorja (Adams, 1985). A, črpalka; B, motor za mešalo; C, alkograf; D, ventil za hladilno vodo; E, termostat; F, rotameter; G, hladilna kača; H, cev za zrak; I, izpuh za zrak; J, razbijalec pene.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 16 Zato se raje uporablja mehanske razbijalce pene ( , I), ki se nahajajo na vrhu acetatorja. Ko pena doseže določen nivo, jo centrifugalna sila zaradi rotorja razbijalca loči na tekočino in plin. Tekočina se vrne v acetator, plin pa skozi ventil izpusti (Adams, 1985). Postopek fermentacije je polkontinuiren in traja od 24 do 48 ur, izkoristek pa je 94%. Proces je potrebno ustaviti, ko pade koncentracija etanola pod 0,3 – 0,1%, sicer lahko pride do superoksidacije. Za konstantno spremljanje razmer je Frings Acetator® opremljen še z Frings Alkograph®, ki konstantno meri količino etanola v acetatorju. Ker pa je Alkograph® meril z določenim časovnim zamikom so razvili izpopolnjeno napravo imenovano Frings Alkosens®. Le ta temelji na tehnologiji sodobnih biosenzorjev. Tako je bil časovni zamik merjenja precej skrajšan. Ker je bila ob vsaki spremembi koncentracije ocetne kisline potrebna ponovna kalibracija Frings Alkosensa® je to vodilo v razvoj še sodobnejšega Frings Alkosens II®. Ta je še bolj izpopolnjen in vsebuje večplastno membrano, novejšo tehnologijo senzorjev in posodobljeno računalniško opremo, ki omogoča popolnoma avtomatiziran proces kontrole kontinuirne, polkuntinuirne, enofazne in dvofazne fermentacije.

Slika 5

5.3 Zaključni postopki Z zgoraj omenjenimi postopki dobimo kise različnih kakovosti. Med zaključne procese uvrščamo procese bistrenja in konzerviranja.

5.3.1 Postopki bistrenja Bistrenje pri površinski kulturi ponavadi ni potrebno. Tak kis pogosto stekleniči brez kakršnekoli obdelave. Kis iz generatorja se ponavadi filtrira skozi filtrno stiskalnico z diatomejsko zemljo. Pri kisu iz submerzne proizvodnje, v katerem je suspendirana vsa biomasa, pa je pogosto nujno bistrenje z različnimi sredstvi kot npr. ribji mehur, kazein, tanini; največkrat pa se uporabi kar bentonit. V zadnjem času se vedno bolj uveljavlja bistrenje z ultrafiltracijo in mikro-crossflow filtracijo. Motnost lahko povzroča tudi kisova jeguljica (Anguilla aceti), ki je bolj pogosta pri proizvodnji s površinsko kulturo in generatorjem, kot pa v acetatorju. Ta, človeku sicer neškodljiva nematoda, se preprosto odstranj s pasterizacijo in filtracijo. V 17. stoletju so verjeli, da je kislost kisa posledica jeguljic, ki s svojimi repi prebadajo človekov jezik (Adams, 1985). Kisi, narejeni iz naravnih surovin (jabolčni, vinski), so pogosto nestabilni tudi po sterilni filtraciji. Ta fenomen lahko pripišemo encimom v kisu, a1i pa mikroorganizmom, ki so v kis prišli z vodo, uporabljeno za razredčenje. Zaradi teh se lahko pojavi motnost že ustekleničenega kisa. Da bi se temu izognili, je kis pred polnjenjem pogosto pasteriziran. Pasterizacija lahko poteka pri temperaturi od 75 do 80 °C in sicer 30 do 40 sekund, ali pa da1jši čas pri temperaturi od 50 do 55 °C. Izbira postopka je precej odvisna od sestave kisa. Pri nižjih temperaturah namreč pride samo do inaktivacije encimov, ne pa tudi mikroorganizmov, višja temperatura pa lahko negativno vpliva na barvo, vonj in okus kisa (Ebner in Follmann, 1983). Altenativo pasterizaciji predstavlja žveplanje s SO2, ki je tudi uradno dovoljeno.

5.3.2 Postopki konzerviranja Načeloma se kis lahko stekleniči takoj po končani pretvorbi etanola v ocetno kislino, vendar je bolj priporočljivo vsaj nekajtedensko odležavanje, med katerim se oblikujeta tudi končni okus in aroma. Stekleničenje poteka v steklenice iz stekla, PVC a1i polietilena, ki so tesno zaprte s plastičnimi zamaški. Pasteriziran kis se lahko polni vroč, a1i pa se pasterizacija izvede v steklenicah po polnjenju. Za ustrezno obstojnost je bistvenega pomena, da se prepreči dostop zraka (Ebner in Follmann, 1983).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 17

6 Ekološki aspekt bioprocesa

6.1 Vpliv na človeka Človeku najbolj nevarna komponenta kisa je ocetna kislina. Toksikološke lastnosti ocetne kisline ob navadnem izpostavljanju niso podrobno preučene. Velike količine ocetne kisline v zraku dražijo oči, grlo in zavirajo osrednje živčevje. Ocetna kislina v neposrednem stiku hudo vzdraži sluznico, kožo in oči. Razlita po koži izzove vnetje in kožne razjede. Veliko hujše poškodbe lahko povzroči koncentrirana ocetna kislina, kar pa pri kisu ni problem. Vseeno je dobro, da pri dolgotrajnem delu v kisarni poznamo načine, kako se zavarujemo pred škodljivimi učinki ocetne kisline kot so potemnitev kože, bronhitis, kronično vneto žrelo in zobne okvare. Kis pa izdelujejo tudi iz sintetične ocetne kisline. Ta je pridobljena kot stranski produkt frakcionirane destilacije nafte (Giumanini s sod., 2001). Tak »kis je izredno poceni zato je takšnih potvorb v zadnjem času veliko. Metode za dokazovanje vsebnosti sintetične kisline so izredno zahtevne, nekatere vključujejo tudi identifikacijo izotopov atoma ogljika (Krueger, 1985).

6.2 Vpliv na okolje Kisarne so danes lahko konstruirane tako, da v okolje ne izpuščajo nobenih škodljivih snovi. Izpušni zrak iz acetarotjev in generatorjev, ki vsebuje alkohol, ocetno kislino in etil acetat, je potrebno hladiti, da se te snovi kondenzirajo. Hlapi ocetne kisline pripomorejo k nastanku smoga, ker olajšajo sintezo ozona. Vodo za hlajenje hlapov lahko uporabimo za pripravo novega substrata. Večina tovarn uporablja cross-flow filtracijo, ki ne potrebuje filtrov, ob tem pa majhne količine trdnih snovi, ki jih proizvedejo bakterije, lahko ostanejo v kisu (100g/1000l). Tovarne, ki uporabljajo velike količine kisa imajo problem odpadnega kisa, ker bi izpust v naravo poleg tehnološke vode pomenil dvig pH, ki ga okolje ne bi zmoglo izravnati. Zato imajo nekatera podjetja t.i. egalizacijske bazene. Tak bazen ima tudi tovarna Eta Kamnik, ki svoje kisle odpadne vode združuje z bazičnimi tekočimi odpadki sosednje tovarne Svilanit. Če te možnosti ni, je potrebna nevtralizacija z apnom.

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 18

7 Uporaba kisa v prehrani

Uporaba jabolčnega kisa v prehrani je bistveno večjega pomena, kot se zaveda povprečen človek, saj kis vsebuje nekatere substance, ki so organizmu nujno potrebne. Najpomembnejša taka snov je kalij (K). Poleg najpogostejših uporab kisa, kot so vlaganje vrtnin v kis in preliv za solate, uporabljamo kis tudi kot dodatek k hrani, kot npr. kis in med, kis z zelišči, kis s svežim sadjem, sadje v kisu in drugo, poleg tega pa je uporaba jabolčnega kisa pomembna tudi za naravno odpravljanje nekaterih bolezenskih stanj in drugih nevšečnosti. Moč jabolčnega kisa se pokaže tudi pri drugih stvareh v gospodinjstvu (čiščenje). V industrijsko razvitih državah je poraba kisa na prebivalca nekaj čez 2 litra, preračunano na kis s 5% ocetne kisline (Angerer, 1997).

7.1 Jabolčni kis kot vir kalija Jabolčni kis je bogat s kalijem, ta rudnina pa je v organizmu pomembna za boj proti bakterijam. Celice, ki so dovolj preskrbljene s kalijem, zmorejo zadrževati vodo, to pa je bistveno v boju proti bakterijam. Velja namreč, da bakterije, ki prodrejo v človekovo telo, vodo, ki jo potrebujejo za svojo ohranitev, odvzemajo iz tkivnih celic. Kalij ima pomembno vlogo pri krčenju mišic, prevajanju živčnih dražljajev, delovanju encimov in celične membrane. Živila, ki vsebujejo veliko kalija, poleg jabolčnega kisa so ta še: peteršilj, špinača, suhe fige in slive, sojina moka, fižol, otrobi, pšenični kalčki ter kakav, pravi čaj in kava. Pomanjkanje kalija je vzrok za veliko število civilizacijskih bolezni kot so zaprtje, glavoboli, bolečine v grlu, obolenja kože, srca, ledvični in žolčni kamni, vnetje mehurja, težave s prostato, artritis, zasluzitve in mišični krči. Ena do dve jedilni žlici jabolčnega kisa na dan pomagajo pri lajšanju in preprečevanju omenjenih bolezni. Kalij eden izmed najpomembnejših mineralov v našem telesu. Zaradi pozitivnih učinkov na telo in kot snov, ki preprečuje prehitro staranje, ga lahko poimenujemo mineral mladosti (Angerer, 1997).

7.2 Kis za vlaganje (konzerviranje) Konzerviranje sadja in zelenjave z jabolčnim kisom je poleg sušenja na soncu, soljenja in dimljenja ena izmed najstarejših metod konzerviranja in jo uporabljamo še danes. Živila, ki so pravilno vložena v jabolčni kis, dolgo ohranimo nepokvarjena in jih lahko shranimo za dlje časa. Tako dober konzervans je jabolčni kis zato, ker vsebuje veliko kislin, to pa je medij, v katerem mikroorganizmi ne morejo preživeti, ali pa preživijo samo redki. Že 0,1% nedisociirane ocetne kisline inhibira razvoj in rast večine bakterij, ki povzročajo zastrupitve ter sporogenih bakterij. 0,3% ocetne kisline pa inhibira rast tudi mikotoksikogenih plesni. Učinek kisa se poveča ob dodatku soli ali drugih snovi, ki zmanjšujejo aktivnost vode. Prednost te metode pred modernejšimi je, da je zelo poceni. Edina slabost te metode je, da živilo izgubi nekaj prvotnega okusa in pridobi rahlo kislega. Nikakor ne smemo konzervirati slabe surovine, kajti zavedati se moramo, da iz slabe surovine ne bomo nikoli dobili dobrega izdelka. Zelenjava in sadje morata biti sveže nabrana, ali ustrezno skladiščena (Angerer, 1997).

7.2.1 Postopek vlaganja Prvi korak je čiščenje pridelka, to je odstranjevanje snovi, ki jih ponavadi ne jemo, nato živilo nekaj minut kuhamo pri 80°C ali pa ga prelijemo z vrelo vodo, da se med kuhanjem ohranita barva in značilen okus. Živilo, ki ga vlagamo, razrežemo na enako velike delce, da se pri kuhanju celotna masa enakomerno zmehča. Tekočina za vlaganje naj iz bo kisa

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 19 najboljše kakovosti. Lahko ji dodajamo razne snovi za posebno aromo. Pomembna je stopnja kislosti, kis za vlaganje mora vsebovati najmanj 7% ocetne kisline. Prekuhavanje v zaprti posodi je nujni naslednji korak konzerviranja, če hočemo doseči visoko stopnjo trajnosti živila. Ta postopek se imenuje pasteriziranje. Skoraj vse vrste vrtnin ali sadja zahtevajo temperaturo okrog 90°C. Vloženo živilo moramo kuhati na taki temperaturi najmanj eno minuto. Hlajenje segretih kozarcev je zadnji del postopka. Ohlajevati je potrebno čim hitreje, da ne uničimo preveč vitaminov, da ne zmanjšamo aromatičnega okusa in da se živila ne razkuhajo preveč. Paziti moramo, da nam zaradi prehitrega hlajenja ne poči kozarec (Angerer, 1997).

7.3 Sadje v kisu Tudi za vlaganje sadja uporabljamo kis s 7% ocetne kisline. Počasi ga segrejemo na 40°C, zlijemo na sadje v kozarcih in pustimo, da se počasi ohladi. Za dva kilograma sadja potrebujemo približno 1l kisa in pol kilograma sladkorja. V kis običajno vlagamo slive, pa tudi breskve, višnje in hruške. Slive olupimo, breskve razrežemo na četrtine. Sadje dobro operemo in ga tesno zložimo v kozarce. Nato dodamo sladkor in prelijemo z jabolčnim kisom. Kozarce zapremo in jih postavimo na sonce. Čez osem dni kis odlijemo, mu dodamo malo cimeta in klinčkov in ga zavremo. Ko se ohladi, ga spet zlijemo na sadje, kozarce znova pokrijemo in postavimo za nekaj tednov na sonce. Zdaj je sadje pripravljeno za uporabo, tekočino, zelo prijetno pijačo, pa moramo pred tem razredčiti (Angerer, 1997).

7.4 Kis s svežim sadjem in zelišči Vse vrste kisa, predvsem pa jabolčni, so vedno bolj priljubljene za solate. Industrijski kis aromatizirajo s sintetičnimi esencami. Za domačo pripravo kisa uporabljamo izključno sveže in neoporečno sadje. Čeprav naravna aroma ni tako močna kot umetna, kis diši in ima res okus po sadju, ki smo ga izbrali za odišavljenje. Kisu dodamo sadje (cca. 100-200g sadja na liter kisa) in vse skupaj postavimo za dva tedna v hladen in temen prostor. Nato kis precedimo, za okras lahko pustimo v kisu nekaj koščkov sadja. Kis največkrat odišavimo z malinami, višnjami, slivami, borovnicami, brinovimi jagodami, orehi in drugim sadjem. Na podoben način lahko kis aromatiziramo tudi z različnimi zelišči in sicer z baziliko, česnom, čebulo, peteršiljem, timijanom, drobnjakom, meliso, pehtranom, majaronom, meto, hrenom in drugimi (Angerer, 1997).

7.5 Kis z medom Pijačo, pripravljeno v kozarcu vode, s čajno žličko medu in žlico jabolčnega kisa, zagovarjajo mnogi ljudje. Med je za mnoge ljudi presladek, zato ga mešajo s kisom in tako uravnavajo sladkost. Pripravimo lahko tudi kis, kateremu dodamo 30-100g medu na liter kisa, odvisno od tega, kako sladka naj bo pijača. Kis malo segrejemo, da se med hitreje raztopi. Kis z medom uporabljamo za solate in za pripravo osvežilnih pijač, priljubljen pa je kot tudi aperitiv k jedem, ki vsebujejo belo meso (Angerer, 1997).

7.6 Uporaba kisa v gospodinjstvu Svežo barvo ohranimo, če prelijemo sadje ali vrtnine s kisom, narezani kosi na zraku sicer hitro spremenijo barvo. Tudi olupljen krompir, če smo ga pripravili preveč, obdrži svežino in naravni videz, če ga kratek čas hranimo v precej okisani vodi. Sir ohranimo v hladnem in temnem prostoru dalj časa, če ga zavijemo v prtič, ki smo ga namočili v jabolčni kis. Ribe prelijemo s kisom, da njihov močni vonj ne moti okolice. Če vodi, v kateri kuhamo ribe, dodamo malo kisa, ribja jed ne bo imela vsiljivega vonja, ribe pa ohranijo barvo. Tudi sveže meso, predvsem divjačino ali ribe, lahko vložimo v kislo marinado in shranimo v

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 20 hladnem prostoru. Tako preprečimo kvarjenje in omehčamo meso za pečenje. Ko kuhamo jajca, preprečimo pokanje lupine, če dodamo vodi žlico kisa. Ko peremo sadje in zelenjavo, dodamo vodi malo kisa in soli. Tako bolje speremo ostanke pesticidov, mrčes in drugo umazanijo (Angerer, 1997).

7.7 Kdo ne sme uživati jabolčnega kisa Čeprav ima jabolčni kis številne koristne učinke za zdravje, ga nekateri ljudje ne smejo uživati. To so predvsem tisti, ki imajo kakšno bolezen prebavil, npr. razjedo na želodcu ali dvanajstniku ali ulcerativni kolitis pa tudi druga stanja oziroma bolezni, pri katerih kislost jabolčnega kisa lahko škoduje. Podobno velja tudi za tiste, ki imajo kakšno okužbo z glivicami iz rodu Candida, kajti le tem kislo okolje najbolj ustreza za obstoj, razvoj in razmnoževanje (Angerer, 1997).

7.8 Uporaba jabolčnega kisa v drugih živilih in v druge namene Jabolčni kis je sestavni del ajvarja, različnih zelenjavnih namazov, majoneze, kečapa, nekaterih sirov. Je dobro topilo za eterična olja zelišč in dišav. Je osnovna sestavina različnih omak. Jabolčni kis je nepogrešljiv kot čistilo za vodni kamen, armaturne madeže, z njim povečamo čistilni učinek delovnih površin (Angerer, 1997).

Jabolčni kis, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, 2003. 21

8 Reference

8.1 Citirani viri Adams M. R. 1985. Vinegar. V: Microbiology of fermented foods, vol. 1. Wood B. J. (ur.). London, Elsevier Applied science Publishers: 1-47. Angerer T. 1997. Vse o kisu. Priprava, uporaba in zdravilna moč domačega jabolčnega kisa. Ljubljana, Ara: 105 str. Beppu B. 1993. Genetic organization of Acetobacter for acetic acid fermentation. Tokyo, The University of Tokyo, Department of Agricultural Chemistry, Faculty of Agroculture. Boscarol M. 2000. Sekundarni metaboliti pri proizvodnji jabolčnega kisa. Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška Fakulteta, Oddelek za živilstvo: 77 str. Bragg P. C., Bragg P. 1997. Naravni jabolčni kis zdravilni eliksir. Celje, Mavrica: 114 str. De Ley J., Kersters K. 1964. Oxidation of aliphatic glycols by acetic acid bacteria. Bacteriol. Rev, 28: 83-95. Giumanini A. G., Verardo G., Della Martina D., Toniutti N. 2001. Improved method for the analysis of organic acids and new derivatization of alcohols in complex natural aqueous matrixes: application to wine and apple vinegar. J. Agric. Food Chem, 49: 2875-2882. Krueger D. A., Krueger H. W. 1985. Isotopic composition of carbon in vinegars. Journal-Asociation of Official Analytical Chemists, 68, 3: 449-452. Opara T. 1980. Spremembe kemične sestave jabolčne kaše med alkoholnim vrenjem. Diplomska naloga Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Živilsko-tehnološki oddelek. Plessi M. 1993. Vinegar. V: Encyclopedia of Food Science, Food Technology and Nurtriton. Vol. 7. Macrae R., Robinson R. K., Sedler M. J. (ur). London, Academic Press: 4773-4779.

8.2 Drugi viri Der Weg zur modernen Essigfabrik. 2002. http://www.frings.com/deutsch/essig_d.html Bartol T., Bradač J., Hočevar I., Koler-Povh T., Siard N., Stopar K. 2001. Navodila za oblikovanje pisnih diplomskih in podiplomskih izdelkov na biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta: 23 str. Zaviršek J., Zidar K., Zubin V., Zupančič V. 2001. Proizvodnja ocetne kisline. Seminarska naloga. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Živilska tehnologija, 21 str. http://www.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/seminar/zivil/2000_01/ocetna.pdf