UNIVERZA V NOVI GORICI

VISOKA ŠOLA ZA VINOGRADNIŠTVO IN VINARSTVO

POLIFENOLNI PROFIL GROZDJA SORTE 'REFOŠK'

(Vitis vinifera ) LETNIKA 2011 NA KRASU

DIPLOMSKO DELO

Borut HROVATIN

Mentorja: doc. dr. Branka Mozetič Vodopivec, dr. Klemen Lisjak, višji

predavatelj

Nova Gorica, 2014

II

III

ZAHVALA

Iskreno bi se zahvalil mentorici doc. dr. Branki Mozetič Vodopivec za vso strokovno

pomoč pri diplomski nalogi, ter dr. Kajetan Trošt za vso pomoč pri izvedbi analiz.

Zahvalil se bi tudi Centru za raziskave vina in Kmetijskemu institutu Slovenija, ki sta

mi omogočila izvajanje analiz. Velika zahvala gre tudi vinogradnikom s Krasa, ki so mi

odstopili grozdje in seveda projektu AGROTUR, v okviru katerega sem lahko izdelal

diplomsko nalogo.

Nazadnje se bi še zahvalil družini in prijateljem, ki so me podpirali in stali ob strani v

času študija. Hvala vsem!

IV

POVZETEK

V raziskavi diplomske naloge smo preučevali vsebnost glavnih fenolov antocianinov v

grozdju (Vitis vinifera L.) sorte 'Refošk' iz vinorodnega okoliš Kras (vinorodna dežela

Primorska). V raziskavo smo zajeli 18 različnih vinogradov z različnih delov Krasa in v

vzorcih grozdja izmerili profil in količino posameznih antocianinov in njihovo vsoto

primerjali z vsebnostjo skupnih antocianinov določenih v grozdju s hitro metodo po

Glories, ki je ponavadi uporabljena za določanje fenolne zrelosti grozdja (izlužljivost

antocianinov). V grozdju sorte 'Refošk' smo določili 15 različnih antocianinov, ki so

značilnilni za rdeče sorte grozdja: delfinidin-3-glukozid, cianidin-3-glukozid, petunidin-

3-glukozid, peonidin-3-glukozid, malvidin-3-glukozid, delfinidin-3-acetilglukozid,

cianidin-3-acetilglukozid, petunidin-3-acetilglukozid, peonidin-3-acetilglukozid,

delfinidin-3-kumarilglukozid, malvidin-3-acetilglukozid, malvidin-3-kaftarilglukozid,

petunidin-3-kumarilglukozid, peonidin-3-kumarilglukozid in malvidin-3-

kumarilglukozid. V štirinajstih vzorcih grozdja smo določili vseh 15 antocianinov, v

štirih pa nismo zasledili skupine antocianinov zaestrenih z ocetno kislino, kar kaže na

razliko med vzorci grozdja 'Refošk' v obravnavi, ki je najverjeneje genetskega izvora. S

kromatografsko metodo smo v grozdju določili od 690,6 do 1853,6 mg/kg skupnih

antocianinov (izraženih kot malvidin-3-glukozdi), s spektrofotometrom (v mediju pH

1.0) pa nekoliko večje koncentracije (od 932 do 2254 mg/kg), kar kaže na razliko med

rezultati kvantifikacije antocianinov obeh metod. Med antocianini je bilo največ

malvidin-3-glukozida, ki je v povprečju predstavljal kar 50 % celotne vsebnosti

antocianinov. Prevladovali so nezaestreni (z ocetno, kavno in p-kumarno kislino)

antocianini (od 75 do 90 % glede na vse določene). Spektrofotometrične analize so

pokazale primerljivo izlužljivost antocianinov v času trgatve pri vseh vzorcih, ne glede

na različno količino antocianinov, ki je bila v grozdju prisotna.

Ključne besede: Vitis vinifera L., 'Refošk' cv., Kras, antocianini, HPLC,

spektrofotometer

V

SUMMARY

In the presented bachelor thesis we studied anthocyanins in grapes (Vitis vinifera L.) cv.

'Refošk' from wine district Karst (Primorska wine region, Slovenia). Eighteen different

vineyards from Kras were included in the study. Grapes from these vineyards were

subjected to chromatographic evaluation of individual and total anthocyanins.

Chromatographic results of total anthocyanins were compared to total anthocyanin

contents determined with spectrophotometric Glories method, comonly used for

phenolic maturity determination (anthocyanin extractability). Chromatographic analysis

revealed 15 different anthocyanins in 'Refošk' grapes: delphinidin-3-glucoside,

cyanidin-3-glucoside, petunidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside, malvidin-3-

glucoside, delphinidin-3-acetylglucoside, cyanidin-3-acetylglucoside, petunidin-3-

acetylglucoside, peonidin-3-acetylglucoside, delphinidin-3-coumarylglucoside,

malvidin-3-acetylglucoside, malvidin-3-caffeylglucoside, petunidin-3-

coumarylglucoside, peonidin-3-coumarylglucoside and malvidin-3-coumarylglucoside.

Fourteen grape (vineyard) samples contained all 15 anthocyanins but in four a group of

anthocyanins esterified with acetic acid was missing, which indicated genetic difference

between 'Refošk' grape samples. Chromatographic results of total anthocyanins varied

from 690.6 to 1853.6 mg/kg (expressed as malvidin-3-glucoside), while

spectrophotometric method according to Glories (in the medium of pH 1.0) gave

slightly higher concentrations (from 932 to 2254 mg /kg). This indicates the difference

between quantification of used methods. Malvidin-3-glucoside was the major

anthocyanin in all grape samples and nonesterified (with acetic, caffeic and p-coumaric

acid) anthocyanins represented 75 to 90 % of all determined anthocyanins.

Spectrophotometric Glories evaluation of anthocyanin extractability of 'Refošk' grapes

at harvest time showed comparable results among 18 grape samples in spite of different

amounts of anthocyanins present in the grapes.

Keywords: Vitis vinifera L., ‘Refošk’ cv., Karst, anthocyanins, HPLC,

spectrophotometer

VI

KAZALO VSEBINE

POVZETEK ....................................................................................................... IV

SUMMARY ......................................................................................................... V

KAZALO VSEBINE ........................................................................................... VI

SEZNAM TABEL ............................................................................................ VIII

SEZNAM SLIK .................................................................................................. IX

1 UVOD............................................................................................................ 1

2 TEORETIČNE OSNOVE ............................................................................... 2

2.1 Grozdje sorte 'Refošk' .......................................................................... 2

2.2 Zgodovina in zdravilnost vina Teran .................................................. 3

2.3 Fenoli v rdečem grozdju ...................................................................... 4

2.3.1 ANTOCIANINI .................................................................................. 4

2.4 Priprava vzorcev za analizo fenolov grozdja ...................................... 6

2.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ....................... 6

2.6 Spektrofotometrične metode za določanje fenolov v grozdju .......... 7

2.6.1 METODA ZA DOLOČAJE SKUPNIH ANTOCIANINOV PO

GLORIES .................................................................................................... 7

3 EKSPERIMENTALNI DEL ............................................................................ 9

3.1 Material .................................................................................................. 9

3.2 Metode ................................................................................................. 11

3.2.1 VSEBNOST SLADKORJEV, SKUPNIH KISLIN IN PH-VREDNOST

........................................................................................................ 11

3.2.2 SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE L-JABOLČNE KISLINE

........................................................................................................ 11

3.2.3 SPEKTROFOTOTOMETRIČNO DOLOČANJE SKUPNEGA

FERMENTABILNEGA DUŠIKA (FAN) ...................................................... 13

3.2.4 SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE SKUPNIH IZLUŽLJIVIH

ANTOCIANINOV PO GLORIES ................................................................ 13

VII

3.2.4.1 Priprava vzorca za analizo in izvedba analize ................................ 13

3.2.5 HPLC ANALIZA POSAMEZNIH ANTOCIANINOV ......................... 14

3.2.5.1 Priprava vzorca za analizo ............................................................... 14

3.2.5.2 Priprava vzorcev za HPLC analize ................................................... 15

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ....................................................................... 17

4.1 Osnovni kemijski parametri grozdja ................................................. 17

4.2 Vsebnost antocianinov določenih s HPLC-UV/Vis .......................... 18

4.3 Vsebnost antocianinov določenih s spektrofotometrično metodo

po Glories .................................................................................................... 25

5 ZAKLJUČKI ................................................................................................ 29

6 VIRI ............................................................................................................. 31

VIII

SEZNAM TABEL

Tabela 1: Primerjava površine in števila trsov sorte 'Refošk' v vinorodni deželi

Primorska po posameznih okoliših za leto 2006 in 2011 (Bavdaž, 2012) ............... 3

Tabela 2: Primerjava sort 'Refošk' in 'Merlot' (Vodopivec, 1999) ................................... 4

Tabela 3: Lokacija in gojitvena oblika vzorčenih vinogradov na Krasu leta 2011 .......... 9

Tabela 4: Osnovne fizikalno-kemijske analize in naprave (Uradni list Evropske

skupnosti, uredba komisije ECC, 2005) ................................................................. 11

Tabela 5: HPLC-UV/VIS analitski pogoji za analizo antocianov .................................. 15

Tabela 6: Primerjava rezultatov osnovnih kemijskih analiz kakovostnih parametrov

grozdja sorte 'Refošk' .............................................................................................. 17

Tabela 7: Vsebnost posameznih antocianinov v grozdju sorte ´Refošk´ iz različnih

vinogradov (1–18) (koncentracije vseh so podane kot mg malvidin-3-glukozida/kg

jagod, povprečje in standardne deviacije, n = 3) (tabela se nadaljuje na naslednji

strani) ...................................................................................................................... 21

IX

SEZNAM SLIK

Slika 1: Grozdje sorte 'Refošk' na kraškem latniku (Foto: Hrovatin, 2012) ..................... 2

Slika 2: Tipičen kraški (odprt) latnik (Foto: Hrovatin, 2012) .......................................... 3

Slika 3: Zemljevid Krasa z označenimi kraji vzorčnih vinogradov (Google map

aplikacija) ............................................................................................................... 10

Slika 4: Kromatogram antocianinov v grozdju sorte 'Refošk' vinograda številka 16 pri

520 nm s prisotnimi antocianini (od leve proti desni): delfinidin-3-glukozid,

cianidin-3-glukozid, petunidin-3-glukozdi, peonidin-3-glukozid, malvidin-3-

glukozid, delfinidin-3-acetilglukozid, cianidin-3-acetilglukozid, petunidin-3-

acetilglukozid, peonidin-3-acetilglukozid, delfinidin-3-kumarilglukozid, malvidin-

3-acetilglukozid, malvidin-3-kafeilglukozid, petunidin-3-kumarilglukozid,

peonidin-3-kumarilglukozd, malvidin-3-kumarilglukozid ..................................... 19

Slika 5: Kromatogram antocianinov v grozdju sorte 'Refošk' vinograda 9 pri 520 nm s

prisotnimi antocianini (od leve proti desni): delfinidin-3-glukozid, cianidin-3-

glukozid, petunidin-3-glukozdi, peonidin-3-glukozid, malvidin-3-glukozid,

delfinidin-3-kumarilglukozid, malvidin-3-kafeilglukozid, petunidin-3-

kumarilglukozid, peonidin-3-kumarilglukozdi, malvidin-3-kumarilglukozid ....... 20

Slika 6: Vsebnost skupnih antocianinov (kot mg malvidin 3-glukozid/kg jagod) vzorcih

grozdja določenih s HPLC-UV-Vis (vinogradi 1–18) (prikazane so povprečne

vrednosti in standardne devijacije, n = 3) ............................................................... 20

Slika 7: Delež nezaestrenih (z ocetno, kavno in p-kumarno kislino) monoglukozidov

antocianidinov v vzorcih grozdja sorte 'Refošk' (vinogradi 1–18) (prikazane so

povprečne vrednosti in standardne devijacije, n = 3) ............................................. 23

Slika 8: Delež malvidin-3-glukozida in delež antocianinov zaestrenih z ocetno kislino (v

% glede na vse določene antocianine) vzorcev grozdja iz vinogradov 1–18

(prikazane so povprečne vrednosti in standardne devijacije, n = 3). ...................... 24

Slika 9: Vsebnost skupnih antocianinov v mediju pH 3.2 (mg/kg), določenih z metodo

po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n = 3) ..... 26

Slika 10: Vsebnost skupnih antocianinov v mediju pH 1.0 (mg/kg), določenih z metodo

po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n = 3) ..... 26

X

Slika 11: Izlužljivost antocianinov v vzorcih vinogradov grozdja 'Refošk' določenih z

metodo po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n =

3). ............................................................................................................................ 27

1

1 UVOD

Antocianini so ena izmed najpomembnejših sestavin rdečega vina, pomembne tako s

prehranskega kot tudi senzoričnega vidika. Vplivajo na barvo in kemijsko stabilnost

vina. Od sort grozdja (Vitis vinifera L.), ki rastejo v Sloveniji, je prav sorta 'Refošk'

tista, ki jo odlikuje velika vsebnost antocianinov, še posebej, če raste na kraški rdeči

zemlji, imenovani terra rosa (Vodopivec, 1998).

Vsebnost antocianinov v sorti 'Refošk' z vinorodnega okoliša Kras (Vinorodna dežela

Primorska) še ni dobro poznana, pomembno pa je poznati potencial, ki ga grozdje lahko

nudi vinarju. V analitiki grozdja in vina je najzanesljivejša tehnika za določanje

antocianinov v grozdju in vinu prav tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

(HPLC) (Macheix in sod., 1990), ki pa navadno vinogradniku in vinarju ni dostopna. V

literaturi in praksi sicer obstaja veliko spektrofotometričnih metod, ki so hitre in

cenejše, vendar niso specifične (Macheix in sod., 1990). Povezava med sestavo

antocianinov in celokupno vsebnostjo določeno s spektrofotometrom je odvisna tudi od

same sorte grozdja, zato je pri iskanju cenejših metod za oceno vsebnosti antocianinov

dobro preveriti, kako se kvantitivni rezultati določeni s kromatografsko analizo ujemajo

z rezultati spektrofotometričnih analiz.

V diplomski nalogi smo preverili vsebnost antocianinov in sestavo grozdja sorte

'Refošk' pri čemer smo analizirali antocianine grozdja 18 različnih vinogradov v

vinorodnem okolišu Kras (Vinorodna dežela Primorska) letnika 2011. V vinogradih so

bile prisotne različne gojitvene oblike, obremenitev prav tako tudi ni bila izenačena.

Uporabili smo dve analizni tehniki, spektrofotometrično metodo po Glories in HPLC-

UV-Vis metodo. Grozdje namenjeno analizam smo vzorčili tik pred trgatvijo letnika

2011. Vinogradi, iz katerih smo pridobili vzorce za našo raziskavo, ležijo po celotnem

Krasu in s tem smo želeli pokriti celotno območje in tako dobiti podatke o antocianinih

v grozdju sorte 'Refošk' s celotnega Krasa v času trgatve. Z delom smo želeli tudi

preveriti tudi ustreznost hitre spektrofotometrične analize za oceno vsebnosti in

ekstrabilnosti antocianinov v grozdju sorte 'Refošk'.

2

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 Grozdje sorte 'Refošk'

Sorta Vitis vinifera L. 'Refošk' je najstarejša udomačena sorta pri nas. Poznanih je veliko

klonov te sorte, pa tudi sinonimov, kot so teranovka, refošk istarski, istrijanec, teran,

terano d’Istria, refosco del Carso, in refosco d’ Istria. Različne klone sorte 'Refošk'

lahko najdemo v hrvaški in slovenski Istri in tudi na slovenskem in italijanskem Krasu

(Vodopivec, 1999).

Slika 1: Grozdje sorte 'Refošk' na kraškem latniku (Foto: Hrovatin, 2012)

Sorta 'Refošk' je zelo bujna in daje velik pridelek, zato mu ustrezajo visoke gojitvene

oblike, kot je na primer kraški latnik (Hrček in Korošec Koruza, 1996). Na Krasu

poznamo dva tipa latnika; zaprti in odprti latnik, slednji poznan kot kraški latnik. V

zadnjih letih pa latnik nadomeščajo gojitvene oblike, kot so enojni in dvojni guyot, ter

kordonske oblike, ki omogoča lažje delo in bolj kakovosten pridelek (Svetina, 2010).

Fabjan (2006) navaja, da je sorta 'Refošk' v Sloveniji med rdečimi sortami na prvem

mestu (5,9 %) po zastopanosti. V Primorski vinorodni deželi je vodilna sorta 'Refošk'

(16,9 %), prav tako v koprskem (48,2 %) in kraškem (72,3 %) vinorodnem okolišu.

3

Slika 2: Tipičen kraški (odprt) latnik (Foto: Hrovatin, 2012)

Tabela 1: Primerjava površine in števila trsov sorte 'Refošk' v vinorodni deželi

Primorska po posameznih okoliših za leto 2006 in 2011 (Bavdaž, 2012)

Leto 2006 Leto 2011

Vinorodno območje

Površina

(ha)

Število

trsov Površina (ha)

Število

trsov

Goriška brda 17,7 63326 20,8 78085

Vipavska dolina 22,4 81577 40,2 155395

Kras 468,2 1441426 460 1430344

Skupaj 508,3 1586329 521 1663824

2.2 Zgodovina in zdravilnost vina Teran

Iz grozdja sorte 'Refošk' na Krasu pridelujejo vino Teran. Njegovo zdravilnosti so

opevali že v rimskih časih, ko so ga poznali in opisovali kot pucinsko vino, ki je najbolj

črno in uspeva na latnikih med Devinom in Miramarom. Teran v primerjavi z drugimi

vini rdečih sort grozdja vsebuje več aminokislin, mineralov, kislin in tudi skupnih

fenolov (Vodopivec, 1999). In prav za slednje je znano, da pozitivno vplivajo na

človekov organizem. Pospešujejo obnovo krvi, žil, srca in preprečujejo nastajanje

rakovih celic in v skladu z najnovejšimi dognanji tudi zadržujejo razvoj bolezni srca in

ožilja (Lijima in sod., 2000; Lijima in sod., 2002). Blagodejne učinke fenolov na

zdravje posameznika so Francozi že leta 1991 predstavili kot fenomen francoskega

4

paradoksa. Na podlagi dolgoletne epidemiološke raziskave so ugotovili, da imajo

Francozi v primerjavi z Američani bolj zdravo srce in ožilje (Renauld in de Lorgeril,

1992). Razloge za to so predpisali predvsem drugačni dieti, ki vključuje tudi rdeča vina,

ki so bogata s polifenoli antocianini, kar je tudi značilnost vina teran, kot pravi

Vodopivec (1999). Polifenoli vplivajo na človeški organizem kot antioksidanti, ki

varujejo človeško telo pred škodljivimi učinki prostih radikalov, pa tudi tvorbo

škodljivega holesterola (Fuhrman in sod., 1995).

Tabela 2: Primerjava sort 'Refošk' in 'Merlot' (Vodopivec, 1999)

Kazalniki Kraški latnik/'Refošk' Modificirani

casenave/'Refošk'

'Merlot'

Pridelek na trs (kg) 56,30 47,16 6,4

Titracijske kisline v

moštu g/l

17,06 14,92 6,8

Titracijske kisline v

vinu g/l

12,97 12,03 7,14

Antocianini v vinu mg/l 533,33 656,67 175

Vinska kislina v vinu g/l 1,89 3,18 2,22

Jabolčna kislina v vinu

g/l

9,44 7,66 1,01

Skupni fenili v vinu

mg/l

1465,00 1845,00 660

Aminokisline v moštu

mg/l

2640,63 2586,27 /

2.3 Fenoli v rdečem grozdju

2.3.1 ANTOCIANINI

Fenolne spojine so sekundarni metaboliti, ki so zelo razširjeni v rastlinskem svetu.

Sekundarni metaboliti niso nujni za preživetje rastlin, se pa z njimi rastline prilagajajo

različnim škodljivim vplivom iz okolja (Macheix in sod., 1990).

5

Antocianini so glavni fenoli rdečega grozdja. V grozdju se nahajajo v jagodni kožici in

so odgovorni za barvo rdečih vin, kajti med postopkom pridelave rdečih vin z

maceracijo prehajajo iz kožice v sok, ki potem fermentira v vino (Ortega - Regules in

sod., 2006). V rdečem grozdju (Vitis Vinifera L.) so do sedaj našli 15–19 različnih

antocianinov, ki se med seboj razlikujejo v strukturi (Pomar in sod., 2005). Predvsem so

za rdeče grozdje značilni glikozidi cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina in

malvidina, zaestreni s p-kumarno in kaftarno kislino pa tudi ocetno kislino (Benin in

sod., 1988; Pomar in sod., 2005). Znano je, da je profil fenolov grozdja oz. vina odvisen

od sorte grozdja, gojitvene oblike, strukture tal, podnebja, vinogradniški lege,

ampelotehnike in nazadnje od časa trgatve in nadaljnjega tehnološkega procesa v kleti

in zorenju vina (Macheiz in sod., 1990; Rodriguez-Delgado in sod., 2002).

Navkljub številnim faktorjem, ki lahko vplivajo na količino fenolov v vinu, lahko v

literaturi zasledimo podatke, ki pravijo, da se razmerje posameznih antocianinov v

rdečih sortah vina lahko uporablja kot kemotaksonomski parameter (kemijski

parameter, s katerim lahko razlikujemo sorte) za klasifikacijo različnih Vitis vinifera

sort (Mattivi in sod., 2006; Mazza, 1995; Wenzel in sod., 1987).

Koncentracija antocianinov se povečuje od obarvanja do polne zrelosti grozdja, pri

prezrelem grozdju pa se prične zmanjševati (Rio Segade in sod., 2008).

Mattivi in sod. (2006) so v svoji raziskavi opisali profil sekundarnih metabolitov v 64

sortah rdečega grozdja, gojenega v ampelografskem vrtu IASMA (Trento, Italija).

Podatki kažejo na veliko variabilnost med različnimi sortami od 25 do 6279,37 mg/kg.

V tej raziskavi so v grozdju sorte 'Refosco' določili 2865 mg/kg antocianinov, kar je

skoraj trikrat več v primerjavi s sortama 'Merlot' (1145 mg/kg) in 'Modri Pinot' (985

mg/kg).

Vrhovšek in sod. (2002) so v svoji raziskavi obravnavali fenolni potencial slovenskih

sort grozdja, kot so 'Žametovka', 'Syrah', 'Merlot', 'Barbera', 'Refošk', 'Modra Frankinja',

'Cabernet Sauvignon', 'Modri pinot' in ugotovili, da sorte 'Merlot', 'Refošk' in 'Cabernet

Sauvignon' spadajo med sorte z največ antocianini. Skupni polifenoli se gibljejo v

območju med 1105 in 2040 mg/kg kožic, antociani, določeni z ekstrakcijo v tartratni

pufer z 12 % (v/v) etanola (simulacija maceracije) pa med 448 in 1271 mg/kg, pri čemer

6

je uprabljena analizna tehnika pokazala največ antocianinov prav pri sorti 'Refošk'

(1274 mg/kg).

2.4 Priprava vzorcev za analizo fenolov grozdja

Pred samo analizo fenolnih spojin je potrebno te spojine iz rastlinskega materiala

izolirati, kar naredimo s postopkom ekstrakcije, med katerim rastlinski material (tj.

grozdne jagode, jagodne kožice, svež ali liofiliziran) homogeniziramo in ga izpostavimo

različnim topilom glede na metodo, ki jo uporabljamo. Najpogosteje se v ta namen

uporabljajo organska topila, kot so na primer metanol in aceton v določenem razmerju

zmešani z vodo, ali kot 100 % ali pa pufri, ki simulirajo pH in ostale pogoje, ki so

značilni za okolje maceracije. Po ekstrakciji se vzorci izpostavijo analizi posameznih

fenolov s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) ali skupnih s

spektrofotometrom (Robards, 2003).

2.5 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Ko ekstrahiramo fenolne spojine, antocianine iz rastlinskega materiala, so v vzorčku

prisotni v obliki mešanice in jih med seboj lahko ločimo z uporabo reverzno fazne

tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (RP-HPLC). Le ta omogoča, da se lahko

antocianini ločijo med seboj po polarnosti in tako lahko določimo v posameznih sortah

grozdja od 15 do 19 različnih antocianinov (Pomar in sod., 2005). RP-HPLC se

uporablja za ločevanje rastlinskih fenolov že od zgodnjih 70ih let prejšnjega stoletja

(Robards, 2003) in je dandanes že del vsakega dobrega vinarskega laboratorija. Princip

delovanja metode za določanje fenolov, je porazdelitev spojin med nepolarno

stacionarno fazo (C18) in polarno mobilno fazo (voda – metanojska kislina; voda –

ocetna kislina, voda – tetraflorna kislina ipd.) in tako se fenolne spojine ločijo po

polarnosti, pri čemer se polarne spojine eluirajo iz kolone prej, najkasneje pa nepolarne.

Ločba poteka tudi s pomočjo gradientnega spreminjanja sestave mobilne faze, pri čemer

se s časom analize linearno povečuje delež nepolarnih topil (metanol ali acetonitril). To

pomeni, da je pri antocianinih grozdja vrstni red naslednji: antocianidin-diglikozidi,

antocianidin-glikozidi, antocianini zaestreni z ocetno kislino in antocianini zaestreni s

hidrokisicimetnimi kislinami (Pomar in sod., 2005). Rezultat analize je kromatogram,

7

kjer posamezni vrhovi predstavljajo fenolne spojine, ki jih prepoznamo s pomočjo

ujemanja z retencijskih časov standardnih spojin, primerjavo UV-VIS spektrov, masne

spektrometrije (MS) in primerjavo kromatografskih lastnosti (vrstni red spojin, delež

posameznih antocianinov) s podatki iz literature.

2.6 Spektrofotometrične metode za določanje fenolov v

grozdju

Spektrofotometrične metode se uporabljajo za hitro analizo grozdja in vina, predvsem

barvnih pigmentov, fenolov v kožici in peškah. Prednost uporabe spektrofotometra v

metodah za določanje fenolov je hitrost in ponovljivost, ter cenovna ugodnost, kar

pridelovalcu omogoča hiter vpogled fenolnega potenciala pri nadaljnji predelavi grozdja

in vina (Vrhovsek in sod., 2002). Pridelovalci bi želeli dobiti dejansko vrednost

ekstrabilnih fenolov in antocianinov, vendar je treba upoštevati vpliv pH in stopnjo

sladkorja, da pridobimo primerljive rezultate. Različne fenolne spojine absorbirajo

svetlobo pri različni valovni dolžini v moštu in vinu, ki nam da podatek o absorbanci ali

optični gostoti (OD) (Jacobson, 2010).

Zelo znana in pogosto uporabljena metoda za določanje skupnih fenolov je metoda

Folin-Ciocalteu. S to metodo fenoli, prisotni v vzorcu, reagirajo z barvnim reagentom

Folin-Ciocalteu v alkalnem okolju in ga spremenijo iz rumene v modro barvo.

Intenzivnost barve, ki se jo določi z merjenjem absorbance pri 765 nm, je merilo za

vsebnost fenolov, ki se izražajo kot ekvivalenti galne kisline. Ta metoda ni specifična

(kot tudi ostale ne), ker so poleg fenolov v vinu tudi druge spojine, ki lahko reducirajo

reagent (proteini, kisline, sladkorji ipd.), z njo tudi ne moremo meriti, kako se lahko

fenoli ekstrahirajo iz posameznih delov jagode v pogojih maceracije, kar pa lahko

določimo z metodo, s katero se določa fenolna zrelost in jo poznamo po imenu metoda

po Glories (Ribereu-Gayon in sod., 2006).

2.6.1 METODA ZA DOLOČANJE SKUPNIH ANTOCIANINOV PO GLORIES

Metoda temelji na hitri ekstrakciji antocianinov iz kožic najprej v nežnih (pH 3.5) in

ekstremnih pogojih (pH 1.0). Metoda je s pripravo vzorcev dokaj enostavna in hitra, ker

cele grozdne jagode homogeniziramo z mletjem in nastale homogenate izpostavimo

8

ekstrakcijam pri omenjenih pH. V bistrih ekstraktih nato ovrednotimo

sprektofotometrično, kakšna je absorbanca (kolikšen del svetlobe raztopina zadrži)

svetlobe različnih valovnih dolžin, ki so karakteristične za fenolne spojine v grozdju

(280 nm za fenolne kisline in flavan-3-ole ter 510 nm za antocianine) in potem

pridobljene absorbance uporabljamo v različnih izračunih, ki nam fizikalne vrednosti

(absorbanco) pretvorijo v koncentracije, ki nam lahko pove, kakšna je ekstrabilnost

antocianinov in ostalih fenolov. Kljub temu da je metoda stara, jo uporabljajo tudi v

novejšem času, ker imajo na tak način antocianini in ostali fenoli enako okolje in je za

torej lažje primerjati kvantifikacijske rezultate, obenem pa je tudi zelo hitra (Delrot in

sod., 2010).

9

3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 Material

Vzorčenje grozdja je potekalo na območju slovenskega in italijanskega Krasa v trgatvi

leta 2011 (19. 9. 2011). Grozdje smo vzorčili v 18 različnih vinogradih, ki so našteti v

Tabeli 3. Vzorce grozdja smo shranili pri 4 °C v hladilniku preko noči in jih takoj

naslednji dan izpostavili osnovnim fizikalno-kemijskim analizam. Iz vzorčenih grozdov

smo pripravili reprezentativni vzorec 200 jagod in jih stisnili v polivinilasti vrečki. V

iztisnjenem soku smo določili vsebnost sladkorjev kot % suhe snovi, skupnih

titracijskih kislin (g vinske kisline/L), pH in skupni fermentabilni dušik (mg L-

treonina/L). Preostali vzorec stisnjenega grozdja smo shranili v polietilenskih

centrifugirkah (50 mL), cele grozde pa v vrečkah v zamrzovalniku pri –20 °C za

nadaljnjo analizo.

Tabela 3: Lokacija in gojitvena oblika vzorčenih vinogradov na Krasu leta 2011

Označba vzorca Gojitvena oblika Lokacija

1 Enoyni Guyot Škrbina

2 Dvojni Guyot Sveto

3 Enoyni Guyot Praprot

4 Enoyni Guyot Komen

5 Dvojni Guyot Hruševica

6 Latnik Sveto

7 Dvojni Guyot Repen

8 Latnik Kreplje

9 / Praprot, drevo

10 Latnik Šepulje

11 Enoyni Guyot Tublje pri Komnu

12 Enoyni Guyot Kopriva

13 Dvojni Guyot Brestovica

14 Dvojni Guyot Dutovlje, Brce

15 Kordon Komen

16 Enoyni Guyot Tublje

17 Kordon Sežana

18 Latnik Dutovlje

10

V tabeli 3 so zbrani podatki o lokacij vzorčnih vinogradih in gojitvenih oblikah, ki smo

jih zajeli v raziskavi. Z sliko 3 smo hoteli prikazati lokacije vinogradov, ki smo jih

zajeli v raziskavi; od Brestovice na Krasu, okolico Komna in Dutovelj do Sežane, na

italijanski strani pa Repen in Praprot.

Slika 3: Zemljevid Krasa z označenimi kraji vzorčnih vinogradov (Google map

aplikacija)

11

3.2 Metode

3.2.1 VSEBNOST SLADKORJEV, SKUPNIH KISLIN IN PH-VREDNOST

Osnovne fizikalno-kemijske analize, kot so reducirajoči sladkorji, skupne kisline in pH-

vrednosti so bile izmerjene na Kmetijskem institutu Slovenije v Ljubljani v

akreditiranem laboratoriju za analizo grozdja in vina. Metode so zbrane v tabeli 4. Ker

gre za akreditirane in rutinske metode, jih ne opisujemo podrobno.

Tabela 4: Osnovne fizikalno-kemijske analize in naprave (Uradni list Evropske

skupnosti, uredba komisije ECC, 2005)

Parameter Analitična metoda Naprave Reference

Reducirajoči

sladkorji Iodometrija / EGS, št. 2676/90

pH Potenciometrična Mettler Toledo DL 53 ECC, št. 2676/90

Skupne kisline Potenciometrična Mettler Toledo DL 53 ECC, št. 2676/90

3.2.2 SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE L-JABOLČNE KISLINE

V vzorcih soka smo določili vsebnost jabolčne kisline s pomočjo encimskega kita

Megaenzyme. Zamrznjene vzorce mošta smo pri sobni temperaturi odtalili, jih

centrifugirali (5 min, 4000 obratov/min), tekočino nad sedimentom v centrifugirki

prefiltrirali skozi 0,45 μm filter (Minisart RC 25 filters Sartorious (Goettingen,

Germany)) in tako pripravljene vzorčke izpostavili postopku analize po priporočilu in

navodilu proizvajalca encimskega kita (Megaenzyme, D-malic acid (D-malate) Assay

procedure, K-DMAL 02/11)).

Pri določanju smo uporabili 4 različne raztopine, pri čemer je raztopina 1 predstavljala

pufer pH 8,0 z dodanim natrijevim azidom (0.02 % m/v), v raztopini 2 je bil koencim

nikotin adenin dinukleotid (NAD+), v raztopini 3 je bila pripravljena suspenzija encima

12

D-malat hidrogenaza in raztopina 4 je bila standardna raztopina D-jabolčne kisline s

koncentracijo 0.2 mg/mL.

V 1 cm kiveto smo odpipetirali 1,0 mL deionizirane vode, 1,0 mL vzorca, dodali 0,20

mL raztopine 1 in 0,20 mL raztopine 2. Vse raztopine smo dobro premešali in nato

izmerili absorbanco vzorca pri 340 nm po treh minutah (A1). Z dodatkom suspenzije

encima (raztopina 3) v količini 0,02 mL smo pričeli reakcijo pretvorbe D-jabolčne

kisline v piruvat in počakali 6 minut, da reakcija poteče in nato izmerili absorbanco po

končani reakciji (A2). Istočasno smo naredili slepi vzorec tako, da smo namesto vzorca

dali 1,0 mL destilirane vode.

Iz dobljenih rezultatov meritev absorbance A1 in A2 smo izračunali razliko za slepi

vzorec in vzorec mošta (A2-A1). Razlika med slepim vzorcem in vzorcem mošta nam da

razliko △AD-jabolčne kisline, ki mora znašati najmanj 0,100 AU za točnost rezultatov.

Koncentracijo D-jabolčne kisline se izračuna s pomočjo formule:

c V M

d v Abs D jab. k. (g/l)

V = skupni volumen vzorca

MW = molekulska masa D-jab. kisline (g/mol)

ekstinkcijski koeficient NADH pri 340 nm

d dolžina svetlobe skozi vzorec (cm)

v volumen vzorca mošta (mL)

iz tega sledi:

c 2,34 134,09

6300 1,0 0,1 Abs D jab. k. (g/l)

Če je koncentracija jabolčne kisline presegla vrednost 0,30 g/L, smo vzorec ustrezno

razredčili in ponovno izmerili absorbanco in končni rezultat pomnožili s faktorjem

redčitve.

13

3.2.3 SPEKTROFOTOTOMETRIČNO DOLOČANJE SKUPNEGA

FERMENTABILNEGA DUŠIKA (FAN)

Zmrznjene vzorce mošta smo odtalili na sobno temperaturo in jih centrifugirali (5 min,

4000 obratov/min), prefiltirali skozi 0,45 nm filter (Minisart RC 25 filters Sartorious

(Goettingen, Germany)). Tako pripravljene filtrate smo pred analizo še redčili v

razmerju 1 : 100 z destilirano vodo in jih izpostavili postopku za določanje skupnega

fermentabilnega dušika, kot sta ga opisali Košmerl in Kač (2010). Rezultati so podani

kot mg L-treonina/L mošta.

3.2.4 SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE SKUPNIH IZLUŽLJIVIH

ANTOCIANINOV PO GLORIES

Kvantitativna metoda je sestavljena iz izluževanja antocianinov iz celotne jagode v dve

različno kisli raztopini z namenom izvedbe dveh postopkov izluževanja v bolj milih in

bolj ekstremnih pogojih. Kislo okolje razgradi fosfoproteinsko membrano rastlinske

celice, cepi protinske vezi in sprošča vsebino vakuol v kisel medij. Po Delrot in sod.

(2010) se vsi antocianini v jagodi sprostijo v topilo pri pH 1, medtem ko se le »lažje

izlužljivi« antocianini sprostijo v medij s pH 3.2. Ta je tudi blizu pH-vrednosti vina in

za torej primerljiv z dejanskim okoljem, s katerim se srečujejo antocianini v postopku

maceracije. Iz nastalih homogenatov se odstranijo rastlinski delci s filtracijo preko gaze

in μm PTFE filtra (25 cm premer) in tako pridobljene bistre filtrate se izpostavi

spektrofotometričnemu določanju absorbance pri 280 nm (za določanje skupnih

fenolov) in skupnih antocianinov (pri 510 nm). Primerjava učinkovitosti postopkov

izluževanja (popolne pri pH 1.0 s tisto, pri kateri se izlužujejo tudi v postopku

maceracije pri pH 3.2) nam lahko tudi pove delež izlužljivih antocianinov v drozgo, ki

so pomembni tudi za vinarja.

3.2.4.1 Priprava vzorca za analizo in izvedba analize

Vzorec 200 jagod smo ločili od peclja in jih v mikserju zmleli v homogeno kašo.

Homogenat smo dvakrat hitro zatehtali v 50 mL centrifugirke (10 g); v eno smo dodali

10 ml raztopine pH 1 (0.1 M raztopina HCl), drugo pa 10 mL raztopino pH 3,2 (5 g

14

vinske kisline + 22.2 mL 1 M NaOH/L deionizirane vode), dobro premešali in pustili

stati štiri ure. Postopek smo ponovili trikrat (n 3).

Po štirih urah smo raztopine filtrirali in v obeh filtratih (pH 1.0 in pH 3.2) določili tudi

vsebnost antocianinov [A](mg/L) po metodi z SO2 razbarvanjem (Riberau-Gayon in

sod., 2000). V skladu s to metodo smo 0,5 ml filtriranega vzorca pH 3,2 odpipetirali v

centrifugirko, dodali še 0,5 ml 0,1 % HCl raztopine v etanolu (v/v) in 10 ml 2 % vodne

raztopine HCl ter dobro premešali.

Tako pripravljeno 3.2 pH mešanico smo v nadaljevanju odpipetirali v dve centrifugirki

(v vsako po 2,5 mL), v eno dodali 1 mL deionizirane vode (DI H2O), v drugo pa pa 1

mL 15 % raztopine Na2S2O3 (Na-bisulfit za razbarvanje). Po 20 minutah smo obem

raztopinam (Abs Na-bisulfit in A DI H2O) določili absorbanco pri 510 nm, ki smo ju

preračunali v mg/L antocianinov po naslednji formuli:

[A](mg/L) AbsNa-bisulfit - AbsDI H2O

Postopek smo ponovili tudi za raztopino pH 1.0 in tako dobili kvantitativno dva

rezultata skupnih antocianinov, ki smo ju s s spodnjo formulo preračunali v delež

izlužljivih (ekstrabilnih) antocianinov (AE, v %).

( ) ([ ] [ ]

[ ] )

3.2.5 HPLC ANALIZA POSAMEZNIH ANTOCIANINOV

3.2.5.1 Priprava vzorca za analizo

Iz homogenata pripravljenega za analizo skupnih antocianinov po metodi Glories (glej

podpoglavje 3.2.4.1) smo odtehtali 3 g v 6 mL mešanice metanol – voda (80/20; v/v) in

izvedli postopek ekstrakcije s stresanjem v ultrazvočni kopeli (2 x po 15 minut). Bistre

ekstrakte obeh stopenj smo združili in jih shranili v zmrzovalniku (- 25 °C) do

nadaljnih analiz s HPLC tehniko. Celoten postopek ekstrakcije iz rastlinskega materiala

smo ponovili trikrat (n = 3).

15

3.2.5.2 Priprava vzorcev za HPLC analize

Pripravljene metanolne ekstrakte jagodnih kožic smo pred HPLC analizo antocianinov

razredčili z 1 % triflorocetno kislino v vodi (v razmerju 1 : 9 = v : v) (da smo bolje

ohranili simetrijo kromatografskih vrhov) ter jih pred injiciranjem prefiltrirali skozi 0,45

μm PTFE filter, kot je opisano v Sternad Lemut in sod. (2011). Tako pripravljene

vzorce smo analizirali s pomočjo HPLC-UV-Vis tehnike pri pogojih, kot jih prikazuje

Tabela 5.

Tabela 5: HPLC-UV/VIS analitski pogoji za analizo antocianov

Inštrument

aters sistem z binarno črpalko (510),

avtomatskim podajalnikom vzorcev (717+) in

UV/VIS detektorjem (2487)

Kolona

Phenomenex Luna php, C18, 4,6 250 mm, 5μm

Pretok

1 mL/min

Volumen iniciranja

20 μl

Detekcija

UV/VIS

(520 nm za antociane in 365 za flavonole)

Mobilni fazi

A = H2O + 0,2 vol. % triflorocetne kisline

B = CH3OH + 0,2 vol. % triflorocetne kisline

CH3OH = methanol

Gradientna

Ločba

0 min (30 % B), 20 min (45 % B), 30 min (55 %

B) in 50 min (70 % B)

Prepoznavanje posameznih antocianinov je temeljila na osnovi podatkov iz literature

(Sternad Lemut in sod., 2011) ter na osnovi ujemanja z retencijskimi časi komercialno

dostopnih standardov. Potrdili smo naslednje prisotne antocianine: delfinidin-3-

glukozid (Del-3-Glu), cianidin-3-glukozid (Cy-3-Glu), petunidin-3-glukozid (Pet-3-

Glu), peonidin 3-glukozid (Peo-3-Glu), malvidin-3-glukozid (Mal-3-Glu), delfinidin 3-

acetilglukozid (Del-3-AcetGlu), cianidin 3-acetilglukozid (Cy-3-AcetGlu), petunidin 3-

acetilglukozid (Pet-3-AcetGlu), peonidin 3-acetilglukozid (Peo-3-AcetGlu), delfinidin

3-kumarilglukozid (Del-3-CoGlu), malvidin-3-acetilglukozid (Mal-3-AcetGlu),

malvidin-3-kaftarglukozid (Mal-3-CafGlu), petunidin-3-kumarilglukozid (Peo-3-

CouGlu), peonidin-3-kumarilglukozid (Peo-3-CouGlu) in malvidin-3-kumarilglukozid

(Mal-3-CouGlu).

16

Vsebnost opazovanih antocianov smo določili z integracijo površin kromatografskih

vrhov ter jih izrazili kot ekvivalente malvidin-3-glukozida na maso homogenata

grozdja. Koncentracijo skupnih antocianov smo izračunali kot vsoto posameznih

identificiranih antocianinov. Vse analize smo izvajali v treh paralelkah.

17

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Osnovni kemijski parametri grozdja

Tabela 6 prikazuje osnovne fizikalno-kemijske parametre na dan trgatve oz. pobiranja

vzorcev grozdja. Analize so bile izvedene na soku vzorca 200 jagod, ki je predstavljal

cel vinograd.

Tabela 6: Primerjava rezultatov osnovnih kemijskih analiz kakovostnih parametrov

grozdja sorte 'Refošk'

Vinograd pH TA

(g/l)

Jabolčna

kislina

(g/l)

FAN

(mg/l)

Sladkor

°Brix

1 3.33 9.3 4.6 252 22.2

2 3.23 9 4.3 184 22.3

3 3.60 7.5 4.0 191 22.5

4 3.34 9.8 5.1 263 21.6

5 3.16 8.6 3.3 154 21.5

6 3.52 8 2.9 147 22.0

7 3.24 7.6 3.3 81 22.0

8 3.44 9.7 4.9 274 21.8

9 3.53 6.9 1.6 147 22.0

10 3.09 11.4 5.9 150 21.0

11 3.20 8.9 4.1 111 21.3

12 3.14 8.8 3.4 137 20.2

13 3.44 7.3 2.3 179 22.1

14 3.35 6.6 3.1 97 22.6

15 3.04 9.5 5.2 60 21.4

16 3.39 7.9 3.4 139 22.4

17 3.27 8.4 4.0 101 21.7

18 3.26 9.4 3.4 187 19.4

Vrednost pH so se gibale od od 3,04 do 3,53, vsebnosti skupnih titrabilnih kislin (TA)

pa od 6,6 do 11,4 g vinske kisline/l, vsebnost jabolčne kisline pa med 1,6 in 5,9 g/l.

Velika variabilnost vsebnosti jabolčne kisline nakazuje na neenakomerno zrelost

grozdja v posameznih vinogradih, ki so bili del raziskave. V primerjavi s podatki

18

Vodopivca (1999) so podatki o vsebnosti kislin (titrabilnih in jabolčne) v naši raziskavi

manjši.

V 18 vzorcih grozdja 'Refošk' je ocena vsebnosti prostega aminokislinskega dušika

(FAN) pokazala vsebnosti od 60 in 274 mg/l, kar je za optimalen potek alkoholne

fermentacije (AF) v polovici vzorcev premalo (razen 1–5, 8, 10, 13 in 18). Minimalna

količina za potek AF je 150 mg/l, optimalna pa od 400 do 500 mg/l dušikovih spojin

(Bavčar, 2006). Sladkorna stopnja, izražena v °Brix, se giblje med 19,4 in 22,6.

Lah (2010) je v raziskavi na grozdju sorte 'Refošk' leta 2007 primerjal kakovostne

parametre grozdja iz slovenske Istre, Krasa in Vipavske doline. V povprečju so vzorci s

Krasa dosegli 167 g/l (17,8 °Brix) sladkorja, vzorci slovenske Istre pa 206,8 g/l (21,3

°Brix) sladkorja, ter 9,6 g/l vinske in 4,5 g/l jabolčne kisline. V Vipavski dolini na

ravnini 171,6 g/l (18,2 °Brix) sladkorja, 10,9 g/l vinske kisline in 4,9 g/l jabolčne

kisline. Na gričevjem območju pa 222 g/l (22,6 °Brix) sladkorja, 7,9 g/l vinske kisline

in 4 g/l jabolčne kisline.

4.2 Vsebnost antocianinov določenih s HPLC-UV/Vis

Kromatogram na sliki 4 prikazuje profil antocianinov v vinogradu 16. Analiza je

pokazala isti profil antocianinov v 14-ih vinogradih, t.j vinogradi številka 1, 2, 4–6, 8 ter

11–18, zato grafično predstavljamo le profil antocianinov grozdja iz enega vinograda. V

teh vzorcih grozdja smo na podlagi ujemanja retencijskih časov standardov in podatkov

iz literature določili 15 antocianinov kot so delfinidin-3-glukozid (Del-3-Glu), cianidin-

3-glukozid (Cy-3-Glu), petunidin-3-glukozid (Pet-3-Glu), peonidin 3-glukozid (Peo-3-

Glu), malvidin-3-glukozid (Mal-3-Glu), delfinidin-3-acetilglukozid (Del-3-AcetGlu),

cianidin-3-acetilglukozid (Cy 3-AcetGlu), petunidin-3-acetilglukozid (Pet 3-AcetGlu),

peonidin-3-acetilglukozid (Peo 3-AcetGlu), delfinidin-3-kumarilglukozid (Del 3-

CoGlu), malvidin-3-acetilglukozid (Mal 3-AcetGlu), malvidin-3-kaftarilglukozid (Mal-

3-CafGlu), petunidin-3-kumarilglukozid (Peo-3-CouGlu), peonidin-3-kumarilglukozid

(Peo-3-CouGlu) in malvidin-3-kumarilglukozid (Mal-3-CouGlu). Kratice v oklepajih

ustrezajo označbam kromatografskih vrhov na slikah 4 in 5.

19

Slika 4: Kromatogram antocianinov v grozdju sorte 'Refošk' vinograda številka 16 pri

520 nm s prisotnimi antocianini (od leve proti desni): delfinidin-3-glukozid, cianidin-

3-glukozid, petunidin-3-glukozdi, peonidin-3-glukozid, malvidin-3-glukozid,

delfinidin-3-acetilglukozid, cianidin-3-acetilglukozid, petunidin-3-acetilglukozid,

peonidin-3-acetilglukozid, delfinidin-3-kumarilglukozid, malvidin-3-acetilglukozid,

malvidin-3-kafeilglukozid, petunidin-3-kumarilglukozid, peonidin-3-kumarilglukozd,

malvidin-3-kumarilglukozid

Slika 5 prikazuje kromatogram z vrhovi, ki odgovarjajo profilu antocianinov grozdja

vinogradov 3, 7, 9 in 10. V teh vzorcih grozdja je kromatografska analiza zaznala le 10

antocianinov. Primerjava s standardi, literaturo in kromatogramom na sliki 4 je

pokazala, da v teh vzorcih ni antocianinov kot so delfinidin-3-acetilglukozid, cianidin-3-

acetilglukozid, petunidin-3-acetilglukozid, peonidin 3-acetilglukozid in malvidin-3-

acetilglukozid. Zanimivo je, da manjka celotna skupina antocianinov zaestrenih z

ocetno kislino, ki smo jih v ostalih vzorcih opazili.

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

0,090

0,100

Minutes

8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00 50,00

Del 3-G

lu -

10,2

57

Cy 3

-Glu

- 1

1,6

79

Pet

3-G

lu -

13,0

80

Peo 3

-Glu

- 1

4,6

34

Mal 3-G

lu -

15,9

04

Del 3-A

cG

lu -

19,3

31

Cy 3

-AcG

lu -

21,5

02

Pet

3-A

cG

lu -

23,3

57

Peo 3

AcG

lu -

26,1

21

Del 3-C

oG

lu -

26,9

62

Mal 3-A

cG

lu -

28,2

79

Mal 3-C

afG

lu -

31,0

23

Pet

3-C

ouG

lu -

34,7

99

Peo 3

-CouG

lu -

40,5

36

Mal 3-C

ouG

lu -

42,8

69

20

Slika 5: Kromatogram antocianinov v grozdju sorte 'Refošk' vinograda 9 pri 520 nm s

prisotnimi antocianini (od leve proti desni): delfinidin-3-glukozid, cianidin-3-

glukozid, petunidin-3-glukozdi, peonidin-3-glukozid, malvidin-3-glukozid, delfinidin-

3-kumarilglukozid, malvidin-3-kafeilglukozid, petunidin-3-kumarilglukozid,

peonidin-3-kumarilglukozdi, malvidin-3-kumarilglukozid

Slika 6: Vsebnost skupnih antocianinov (kot mg malvidin 3-glukozid/kg jagod)

vzorcih grozdja določenih s HPLC-UV-Vis (vinogradi 1–18) (prikazane so povprečne

vrednosti in standardne devijacije, n = 3)

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

Minutes

8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00 50,00

Del 3-G

lu -

11,0

32

Cy 3

-Glu

- 1

2,5

42

Pet

3-G

lu -

14,0

73

Peo 3

-Glu

- 1

5,6

76

Mal 3-G

lu -

17,0

40

Del 3-C

oG

lu -

30,5

94

Mal 3-C

afG

lu -

35,7

69

Pet

3-C

ouG

lu -

40,3

49

Peo 3

-CouG

lu -

44,5

51

Mal 3-C

ouG

lu -

46,4

64

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Vs

eb

no

st

sk

up

nih

an

tocia

nin

ov

(mg

ma

lvid

in 3

- g

luk

ozid

a/k

g)

Številka vinograda

21

Tabela 7: Vsebnost posameznih antocianinov v grozdju sorte ´Refošk´ iz različnih vinogradov (1–18) (koncentracije vseh so podane kot

mg malvidin-3-glukozida/kg jagod, povprečje in standardne deviacije, n = 3) (tabela se nadaljuje na naslednji strani)

Št. vin

Del 3-Glu

Cy 3-Glu

Pet 3-Glu

Peo 3-Glu

Mal 3-Glu

Del 3-AcGlu

Cy 3-AcGlu

Pet 3-AcGlu

Peo 3AcGlu

Del 3-CoGlu

Mal 3-AcGlu

Cy 3-CouGlu

Pet 3-CouGlu

Peo 3-CouGlu

Mal 3-CouGlu Seštevek

1

97.9 ±

11.5

51.1 ±

5.9

126.5 ±

14.3

148.6 ±

16.7

506.3 ±

57.2

11.5 ±

0.4

3.6 ±

0.3

15.3 ±

1.3

10.9 ±

0.8

9.9 ±

0.9 53.3 ± 6

8.6 ±

1.7 13 ± 2 19 ± 2

59.2 ±

6.1

1134.8 ±

126.3

2 135.9 ±

9.8 60.8 ±

3.6 200.9 ±

12.4 204.6 ±

9.6 887.7 ±

44.1 17 ± 2.3 3.8 ± 0.3

22.1 ± 1.3

14.1 ± 1.8

16.5 ± 0.5

82.1 ± 9.7

16.8 ± 0.8

21.2 ± 0.3 29.3 ± 1

115.8 ± 4.5

1828.7 ± 100.7

3

18.2 ±

0.3

19.1 ±

0.5 47.8 ± 1

111.9 ±

3.7

431.5 ±

11.3 - - - - < LDA -

16.1 ±

1.2

2.1 ±

0.2

11.7 ±

0.3

32.4 ±

0.5

690.6 ±

18.5

4 144.9 ±

18.8 77.9 ± 10.6

179.8 ± 23.4

246.3 ± 33.4

738.3 ± 95.6

22.5 ± 3.3

6.5 ± 0.8

27.1 ± 2.9

20.8 ± 2.1

16.2 ± 1.9

96.8 ± 10.5

15.9 ± 2.8

19.9 ± 2.7

32.1 ± 4.1

94.9 ± 12.4

1739.8 ± 224.7

5

150.5 ±

3.6

50.8 ±

1.3

203.7 ±

4.4

180.5 ±

2.6

918.7 ±

15.7

12.1 ±

0.8

2.3 ±

0.5

15.9 ±

2.1

9.3 ±

0.3

19.7 ±

0.6

57.4 ±

2.3

17.2 ±

0.6

25.7 ±

0.8

34.2 ±

0.7

155.6 ±

3.3

1853.6 ±

36.3

6 69.7 ±

4.2 31.8 ± 2 97.8 ±

7.9 134.9 ±

12.5 462.7 ±

41.9 10.8 ±

0.6 2.6 ± 0.1

12.9 ± 0.6

10.8 ± 1.4

7.2 ± 0.9

57.8 ± 2.5 8 ± 0.6

7.9 ± 1.2 21.5 ± 2

60.8 ± 5.3

997.4 ± 83.5

7

59.8 ±

3.8

42.2 ±

2.3

102.4 ±

6.2

160.1 ±

8.6

514.6 ±

29.8 - - - - < LD -

17.4 ±

1.1

5.6 ±

0.7

13.3 ±

0.7

35.5 ±

2.3

950.9 ±

55

8 87.8 ± 12.4 42.8 ± 6

125.2 ± 17.3

164.9 ± 22.1

585.1 ± 79

15.9 ± 3.5

4.2 ± 0.8

22.7 ± 2.7

17.9 ± 3.6

10.2 ± 1.7

92.9 ± 17.8

13.6 ± 2.2

12.9 ± 2.3 31 ± 4.8

92.4 ± 13.5

1319.5 ± 188.9

9

80.6 ±

0.3 35 ± 1.9

119.5 ±

0.4

165.1 ±

1.3

699.4 ±

20 - - - -

7.9 ±

0.1 -

16.6 ±

0.4

13.9 ±

1.1

25.7 ±

1.2

98.5 ±

5.1

1262.4 ±

25.9

10 182.1 ±

9.3 73 ± 1.9 216.5 ±

9.5 201 ±

7.7 750.5 ±

37.8 - - - - 18.0 ±

0.1 - 12.9 ±

3.2 20.8 ±

0.9 26.4 ±

2.2 80.8 ±

9.5 1576.2 ±

91.5

11

66 ±

11.7

27.1 ±

4.2

99.8 ±

15.5

107.5 ±

14.9

501.1 ±

67.5

14.3 ±

2.3

2.8 ±

0.4 18 ± 2.5 13.8 ± 2

8.4 ±

1.7

83.8 ±

10.3

9 ±

0.9

11.9 ±

2.3

16.8 ±

3.2

72.8 ±

11.7

1053.1 ±

150.2

22

Št.

vin

Del 3-

Glu

Cy 3-

Glu

Pet 3-

Glu

Peo 3-

Glu

Mal 3-

Glu

Del 3-

AcGlu

Cy 3-

AcGlu

Pet 3-

AcGlu

Peo

3AcGlu

Del 3-

CoGlu

Mal 3-

AcGlu

Cy 3-

CouGlu

Pet 3-

CouGlu

Peo 3-

CouGlu

Mal 3-

CouGlu Seštevek

12 96.8 ±

1.7 36.4 ±

0.2 149.6 ±

1 169.5 ±

0.6 835.7 ±

1.6 14.1 ±

0.3 3 ± 0 17.2 ±

0.7 16.3 ±

1.1 13.3 ±

0.1 96.9 ±

5.1 14.2 ±

1.4 21.7 ±

0.9 36.5 ±

0.2 134.1 ±

1 1655.3 ±

8.4

13

40.8 ±

2.5 22 ± 0.6 74 ± 3

133.6 ±

4.2

458 ±

11

9.4 ±

0.6

2.1 ±

0.2

11.7 ±

0.5

16.6 ±

0.4

6.2 ±

1.8

76.3 ±

4.4 14.6 ± 0

8.6 ±

1.4

24.6 ±

0.1

73.9 ±

1.2

972.4 ±

21.1

14

97.5 ±

14.6

36.6 ±

6.3

128.1 ±

19.8

140.6 ±

22.6

550.8 ±

86.5

15.8 ±

2.8

3.6 ±

0.7

15.5 ±

2.5

10.2 ±

2.5

8.8 ±

1.9

61.5 ±

10 14 ± 2.4

13.6 ±

2.3 19.9 ± 3

78.5 ±

11.6

1194.8 ±

188.7

15

81.2 ±

9.7 29.2 ± 4

103.5 ±

14.2

93.7 ±

13

443.9 ±

56.5 18.6 ± 3

2.9 ±

0.7

18.1 ±

3.2

10.2 ±

1.8

11.9 ±

1.5

80.3 ±

15.5

8.4 ±

2.4

16.4 ±

1.8

18.2 ±

2.2

95.7 ±

14.2

1032.4 ±

142.7

16 33.7 ±

5.6 44.5 ±

4.4 60.5 ±

7.3 177.8 ±

13.9 352 ± 27.3

6.2 ± 0.5

2.1 ± 0.3

4.7 ± 0.6

8.6 ± 2.4

3.5 ± 1.6

28.8 ± 3.6

13.4 ± 0.9

5.8 ± 1.3

27.2 ± 2.3

50.9 ± 4.6

819.8 ± 75

17

54.2 ±

0.8

40.2 ±

0.2

88.5 ±

0.2

157.9 ±

1.3

487.5 ±

4.1

10.5 ±

0.5

3.3 ±

0.5

12.8 ±

1.1

11.8 ±

0.3

5.1 ±

0.5

64.4 ±

3.6

13.3 ±

0.5

8.9 ±

0.5

21.4 ±

0.4

68.3 ±

0.7

1048 ±

10.2

18

49.8 ±

0.8

29.3 ±

0.7

81.5 ±

1.6

176.8 ±

4

477.3 ±

7.8

6.9 ±

0.5

1.4 ±

0.1

4.9 ±

0.6

8.4 ±

0.4

8.5 ±

0.2

30.5 ±

0.3

16.5 ±

0.8

13.8 ±

0.4

36.4 ±

0.5

102.9 ±

1.4

1044.9 ±

17.3

ALD .... meja detekcije

23

Slika 7: Delež nezaestrenih (z ocetno, kavno in p-kumarno kislino) monoglukozidov

antocianidinov v vzorcih grozdja sorte 'Refošk' (vinogradi 1–18) (prikazane so

povprečne vrednosti in standardne devijacije, n = 3)

S podatkov v tabeli 7 in slike 7 lahko sklepamo, da med antocianini grozdja sorte

'Refošk' prevladujejo nezaestreni (z ocetno, kavno ter p- kumarno kislino) -3-glukozidi

cianidina, peonidina, petunidina, malvidina in delfinidina. Naši rezultati kažejo, da v

povprečju takšni antocianini predstavljajo kar 80 % vseh določenih antocianinov v

grozdju sorte 'Refošk'. Med vinogradi obstajajo sicer velike razlike, tako v količini kot

tudi relativnem deležu (od 75 do 90 % glede na vse antocianine), ki pa so lahko tudi

posledica različnih stopenj zrelosti, vzgojnih oblik in obremenitev.

Malvidin-3-glukozid je najbolj zastopan antocianin rdečega grozdja (Macheix in sod.,

1990; Mattivi in sod, 2006; Pomar in sod., 2006). Opažamo, da tudi grozdje sorte

'Refošk' iz vinorodnega okoliša Kras sledi temu vzorcu (oziroma vseh 18 vzorčnih

vinogradov). V naših vzorcih je vsebnost malvidin-3-glukozida variirala od 420 do 918

mg/kg jagod, kar je pomenilo od 62 do 42 % delež glede na vse določene antocianine

(Slika 8, modra barva).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

De

lež n

eza

es

tren

ih m

on

og

luko

zid

ov

an

tocia

nid

ino

v

gle

de n

a v

se

d

olo

če

ne a

nto

cia

nin

e (

v %

)

Številka vinograda

24

Slika 8: Delež malvidin-3-glukozida in delež antocianinov zaestrenih z ocetno kislino

(v % glede na vse določene antocianine) vzorcev grozdja iz vinogradov 1–18

(prikazane so povprečne vrednosti in standardne devijacije, n = 3).

V nadaljevanju je pregled profila posameznih antocianinov pokazal, da vinogradi pod

številko 3, 7, 9 in 10 ne vsebujejo antocianinov zaestrenih z ocetno kislino (acetati).

Glede na to, da so vsi ostali vzorci vsebovali to skupino antocianinov (v povprečju 10 %

glede na celokupno količino antocianinov), ki je tudi značilna za ostala rdeča grozdja

(Macheix in sod., 1990; Mattivi in sod, 2006; Pomar in sod., 2005) sklepamo, da ne gre

za enak genetski material kot v ostalih vinogradih.

Iz slike 6 in tabele 7 je razvidna velika variabilnost kromatografsko določene

koncentracije skupnih antocianinov v posameznih vinogradih. Največ antocianinov smo

določili v grozdju vinograda 5 (1853,6 mg/kg), najmanj pa v grozdju vinograda 3 (690,6

mg/kg). Le v treh vinogradih smo določili vsebnosti manjše od 1000 mg/kg (3, 13, 16),

medtem ko smo koncentracije med 1000 in 1500 mg/kg določili v 11-ih vinogradih (1,

6, 7, 8, 9, 11, 17 in 18), v štirih pa med 1500 in 1800 mg/kg (2, 4, 5 in 12). Nastale

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Dele

ž (

v %

) g

led

e n

a v

se

do

loč

en

e

an

tocia

nin

e

Številka vinograda

malvidin-3-glukozid antocianini zaestreni z ocetno kislino

25

razlike lahko pripišemo različni stopnji zrelosti, različni stopnji obremenjenosti in

različnim vzgojnim oblikam.

Vzorci grozdja so bili pobrani tik pred trgatvijo letnika 2011 in zato odražajo dejansko

stanje vsebnosti fenolov v grozdju 'Refošk' vinorodnega okoliša Kras letnika 2011, ki je

šlo v predelavo. Opažamo tudi, da odsotnost ene skupine antocianinov (antocianidin-3-

glukozidov, zaestrenih z ocetno kislino) ni vzrok za manjše vsebnosti skupnih

antocianinov, kajti vzorca 9 in 10 sta vsebovala tudi velike količine skupnih

antocianinov, primerljive z nekaterimi vzorci, ki so vsebovali vseh 15 antocianinov.

Iz tabele 7 je tudi razvidno, da malvidin-3-glikozidu v vseh vzorcih grozdja sorte

'Refošk' sledi peonidin 3-glukozid s koncentracijo od 93,6 do 246,3 mg/kg in relativnim

delžem od 9,0 do 14,1 % glede na vse določene antocianine. Sledi mu petunidin-3-

glukozid z vsebnostimi od 47,7 do 216,4 mg/kg (od 6,9 do 10,9 % glede na vse

določene antocianine), nato delfinidin-3-glukozid od 18,1 do 150,4 mg/kg (od 2,6 do

11,5 %) in cianidin-3-glukozid od 19,07 do 77,8 mg/kg (od 2,7 do 4,4 %). Ostali

antocianini so zastopani v manjših količinah, celokupna vsebnost prisotnih antocianinov

zaestrenih z ocetno kislino variira od 0 do 173,7 mg/kg, zaestrenih s p-kumarno kislino

pa od 62,2 do 252,2 mg/kg. V vzorcih grozdja smo našli samo en antocianin zaestren s

kavno kislino, t.j. delfinidin-3-kafeilglukozid (3.5–19.7 mg/kg). Naši podatki so

primerljivi z literaturo glede količine (Mattivi in sod., 2006; Vrhovšek in sod., 2002) in

tudi sestave (Mattivi in sod., 2006; Pomar in sod., 2005) grozdja sorte 'Refošk'. Mattivi

in sod. (2006) poročajo o 2865,38 mg/kg antocianinov v grozdju sorte 'Refosco'.

4.3 Vsebnost antocianinov določenih s spektrofotometrično

metodo po Glories

Za vinarja pa ni pomembna le celokupna vsebnost antocianinov, ampak tudi izlužljivost

(ekstrabilnost); to je parameter, s katerim povemo kakšen delež celotne količine

antocianinov preide iz kožic v sok, ki gre potem na fermentacijo. Z zrelostjo ta

parameter narašča. Pri takšni oceni nam lahko pomaga parameter, do katerega pridemo s

pomočjo metode za določanje fenolne zrelosti po Glories (podpoglavje 3.4.2). Po tej

26

metodi primerjamo vsebnost antocianinov, ki preide v sok med maceracijo grozdja

(izluženi v medij pH 3.2) s celotno vsebnostjo antocianinov (izluženi v medij pH 1.0).

Slika 9: Vsebnost skupnih antocianinov v mediju pH 3.2 (mg/kg), določenih z metodo

po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n = 3)

Slika 10: Vsebnost skupnih antocianinov v mediju pH 1.0 (mg/kg), določenih z

metodo po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n = 3)

960 1076

555

1000 1068

986

653

837

652

925

774 852

593

774 753

551

708

547

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Vsebnost

anto

cia

nov m

ediju

pH

3.2

(m

g/k

g)

Številka vinograda

2122 2210

1149

1973

2254

1840

1463 1591

1223

1978

1552

2038

1038

1658 1473

932

1314 1108

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Vsebnost

anto

cia

nov v

mediju

pH

1.0

(m

g/k

g)

Številka vinograda

27

Slika 11: Izlužljivost antocianinov v vzorcih vinogradov grozdja 'Refošk' določenih z

metodo po Glories (na grafikonu so podana povprečja in standardna deviacija, n = 3).

Podatki o vsebnosti antocianinov izluženih v medij pH 3.2 in pH 1.0 so nam dali

podatke o izlužljivosti antocianinov grozdja sorte 'Refošk'. Primerjava tega parametra

med posameznimi vinogradi je prikazana na Sliki 11 in kaže na to, da se pri veliki

večini vzorcev iz kožic v mošt med maceracijo lahko izluži med 40 in 50 % vseh

dostopnih antocianinov (ne glede na koncentracijo antocianinov in mesto vzorčenja).

Ujemanje kvantifikacijskih podatkov spektrofotometrijske in HPLC metode smo želeli

tudi preveriti z linearno korelacijo, podobno kot so to že opisali Vrhovšek in sod.

(2001). Tako smo analizi linearne korelacije (program Microsoft Excell) izpostavili

koncentracije skupnih antocianinov istih vzorcev; (1) določenih s HPLC in tistih (2)

določenih z metodo po Glories v mediju pH 1.0 (ki naj bi predstavljali celokupno

vsebnost antocianinov v grozdnih jagodah, Slika 10). Rezultati kažejo določen trend

ujemanja koncentracij antocianinov v istih vzorcih (R2 = 0.6375). Kot je razvidno že iz

primerjave podatkov na slike 6, tabele 7 in slike 10 je tudi ta analiza pokazala, da ne gre

za popolnoma iste vrednosti (pri vseh vzorcih so koncentracije določene z metodo po

Glories nekoliko večje v primerjavi s kromatografsko metodo, vendar to razmerje ni

povsod enako). To je najverjetneje posledica različne sestave antocianinov, ki potem

drugače doprinesejo k celokupni absorbanci svetlobe valovne dolžine 510 nm, kar se

45,2 48,8 48,6 51,4 47,3

53,6 53,4 52,7

44,5 46,8 50,1

41,8

57,2

46,7 50,7

59,2 54,0

49,5

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Izlu

žlji

vost

anto

cia

nin

ov

(%)

Številka vinograda

28

potem kaže kot drugačna koncentracija antocianinov. Razlika pa je lahko tudi posledica

dejstva, da vrsta antocianina na katerega se izraža celokupna vsebnost antocianinov ni v

obeh primerih enaka. V primeru uporabljene (empirične) spektrofotometrične analize po

Glories vrsta antocianina na katerega se izraža vsebnost skupnih antocianinov ni znana,

pri HPLC analizah pa je (malvidin-3-glukozid). Tako lahko z linearno korelacijo v

našem primeru ugotavljamo le kako rezultati koncentracije antocianinov obeh metod

korelirajo. O skladnosti uporabljenih metod pa na podlagi teh podatkov ne moremo

sklepati, ker bi v tem primeru morali poleg vzorcev primerjati tudi isto spojino.

29

5 ZAKLJUČKI

V nalogi smo prestavili vsebnost in vrsto antocianinov grozdja sorte 'Refošk' iz

vinorodnega okoliša Kras (z dvema različnima analiznima tehnikama. Antocianini so

glavna skupina polifenolov rdečega grozdja (tudi grozdja sorte 'Refošk'). V raziskavo

smo zajeli 18 vinogradov iz slovenske in italijanske strani Krasa na čim širšem

področju. Vzorčili smo v različnih vinogradih, kjer je grozdje rastlo na trtah različnih

vzgojnih oblik in tudi pod različnimi obremenitvami, da bi na tak način dobili čim širši

nabor vzorcev grozdja sorte 'Refošk'. Za določanje antocianinov smo uporabili

spektrofotometrično metodo po Glories in HPLC-UV/Vis metodo za določevanje

antocianinov.

Spektrofometrična metoda je relativno enostavna, hitra ter ponovljiva in cenovno

ugodna. S to metodo pridelovalci grozdja lahko ocenijo kakšen je delež izluženih

antocianinov iz kožic v mošt lahko pričakujejo, kar je pomemben podatek za vinarja.

Primerjava s kvantifikacijskimi rezultati bolj natančne tehnike HPLC pa je pokazala, da

se kvantifikacijski rezultati spektrofotometrične metode po Glories le v določeni meri

ujemajo z rezultati bolj natančne kromatografske analize (R2

= 0.6375). Do določenega

odstopanja prihaja zaradi razlik v sestavi antocianinov, ki lahko drugače doprinesejo k

celokupni absorbanci svetlobe pri 510 nm, pa tudi dejstva, da vrsta antocianina, na

katerega smo izražali celokupne antocianine po obeh metodah ni enaka (v metodi po

Glories namreč vrsta antocianina na katerega se rezultat izraža ni znan), kar tudi

pomeni, da z rezultati linearne korelacije kvantifikacijskih podatkov ne moremo sklepati

o skladnosti obeh metod.

Raziskava fenolnega potenciala grozdja sorte 'Refošk' s Krasa je pokazala kvantitativne

in kvalitativne razlike vsebnosti antocianinov 18 vinogradov s Krasa. S pomočjo HPLC

tehnike smo v 14 vzorcih različnih vinogradov določili enak profil s 15 različnimi

antocianini (ki so značilni tudi za druge sorte rdečega grozdja), v 4-ih vzorcih pa nismo

našli skupine antocianinov zaestrenih z ocetno kislino. Ti vzorci grozdja prihajajo iz

italijanske strani Krasa (vinogradi 3, 7, 9) in eden iz slovenskega Krasa (vinograd 10).

Ker ne poznamo izvora trstne cepljenke, lahko le ugibamo zakaj je prišlo do teh razlik.

30

Najverjetneje gre za razliko genetskega izvora, ker vemo, da je profil antocianinov

(prisotnost različnih antocianinov) v sadju in grozdju določen genetsko (Macheix in

sod., 1990).

V vseh 18 vzorcih je glavnino (slaba polovica v povprečju) antocianinov predstavljal

malvidin-3-glukozid, pokazalo se je tudi, da v času trgatve vsebnost antocianinov v

grozdju sorte 'Refošk' zelo variira, od 900 do 1900 mg (kot malvidin-3-glukozid)/kg, pri

čemer te razlike ne vplivajo veliko na izlužljivost antocianinov v drozgo, ki je bila

ocenjena med 40 in 50 %.

Opravljena raziskava je dala zanimive iztočnice za nadaljnje delo na področju sestave

antocianinov grozdja sorte 'Refošk'.

31

6 VIRI

Bavčar D. (2006) Kletarjenje danes. Ljubljana: Kmečki glas.

Bavdaž V. (2012) Revizija pridelave tipičnih sort vinske trte (Vitis viniufera L.) v

vinorodni deželi Primorska. Diplomsko delo. Nova Gorica: Univerza v Novi

Gorici.

Benin M., Gasquez A., Mahfoudi R., Bessis R. (1988) Biochemical characterisation of

Vitis vinifera L. Cultivars by electrophoresis of leaf isonezymes-an attempt to

classify grapevine varieties, Vitis, let. 27, št. 3, str. 157–172.

Delrot S., Medrano H., Or E., Bavaresco L., Grando S. (2010) Phenolic Maturity

Methods Based on the Phenol Extraction. In: Methodologies and results grapevine

research. Springer Science+Business Media B. V. str. 392–399. Pridobljeno dne

31. 7. 2012 s spletne strani:

http://books.google.si/books/about/Methodologies_and_Results_in_Grapevine_R.

html?id=oc9wLcjlbHUC&redir_esc=y

Fabjan M. (2006) Vpliv spremembe gojitvene oblike na rastni in kakovostni potencial

sorte Refošk (Vitis vinifera L.). Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani,

Oddelek za Agronomijo.

Felice F., Zambito Y., Di Colo G., D´Onofrio C., Fausto C., Balbarini A., Di Stefano R.

(2012) Red grape skin and seeds polyphenols: Evidence of their protective effects

on endothelia progenitor cells and improvement of their intestinal absorption.

European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, let. 80, str.176–184.

Fuhrman B., Lavy A., Aviram M. (1995) Consumption of red wine with meals reduces

the susceptibility of human plasma and low-density lipoprotein to lipid

peroxidation. American Journal of Clinical Nutrition, let. 61, str. 549–554.

Hrček L., Korošec - Koruza Z. (1996). Sorte in podlage vinske trte: ilustrirani prikaz

trsnega izbora za Slovenijo. Ptuj: SVA Veritas.

Iijima K., Yoshizumi M., Hashimoto M., Kim S., Eto M., Ako J., Liang Y. Q., Sudoh

N., Hosoda K., Nakahara K., Toba K., Ouchi Y. (2000) Red wine polyohenols

http://books.google.si/books/about/Methodologies_and_Results_in_Grapevine_R.html?id=oc9wLcjlbHUC&redir_esc=yhttp://books.google.si/books/about/Methodologies_and_Results_in_Grapevine_R.html?id=oc9wLcjlbHUC&redir_esc=y

32

inhibit proliferation of vascular smooth muscle cells and downregulate expression

of cyclin A gene. Circulation, let. 101: 805–811.

Iijima K., Yoshizumi M., Hashimoto M., Akishita M., Kozaki K., Ako J., Watanabe T.,

Ohike Y., Son B., Yu K., Nakahara K., Ouchi Y. (2002) Red wine polyphenols

inhibit vascular smooth muscle cell migration through two distinct signaling

pathways. Circulation, let. 105: 2404–2410.

Jacobson J. L. (2010) Introduction to wine laboratory practices and procedures. New

York : Springer, str.: 146–147.

Košmerl T., Kač M. (2010) Kemijske analize in postopki čiščenja vina. Ljubljana:

Univerza v Ljubljani, Oddelek za Živilstvo.

Lah M. (2010) Možnost gojenja žlahtne vinske trte (Vitis vinifera L.) sorte Refošk v

Vipavski dolini. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani Oddelek za

Agronomijo.

Mattivi F., Guzzon R., Vrhovšek U., Stefanini M., Velesco R. (2006). Metabolite

proffiling of grape: flavonols and anthocyanins. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, let. l54, str. 7692–7702.

Mazza G. (1995) Anthocyanins in grape products. Critical Reviews in Food Science. let.

35, str. 341–371.

Pomar F., Novo M., Masa A. (2005) Varietal different among the anthocyanin profiles

of 50 red table grape cultivars studied by performance liquid chromatography.

Journal of Chromatography A, let. 1094, str. 34–41.

Renaud S., de Lorgeril M. (1992) Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for

coronary heart disease. Lancet, let. 339: str. 1523–1526.

Ribereau – Gayon P., Maujean A. and Duboirdieu D. (2006) Methods for Measuring

Phenolic Maturing. V: Handbook of Enology volume 2. The chemistry of wine

stabilization and treatments 2nd

Edition, Chichester: J. Wiley & Sons, str. 189–

191.

Robards K. (2003) Strategies for the determination of bioactive in plants, fruit and

vegetables. Journal of chromatography A, let. 1–2, str. 657–691.

33

Sternad Lemut M., Trost K, Sivilotti P., Vrhovsek U (2011) Pinot Noir grape colour

related phenolics as affected by leaf removal treatments in the Vipava Valley.

Journal of Food Composition and Analysis., let. 24, št. 6, str. 777-784.

Svetina L. (2010) Primernost kraškega latnika za uporabo vinogradniških sodobnih

tehnologij. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Oddelek za

Agronomijo.

Vodopivec M. (1999) Kraški teran. Ljubljana: Kmečki glas.

Vrhovšek U., Mattivi F., azerhouse A. L. (2001). Analysis of red wine phenolics:

Comparison of HPLC and spectrophotometric methods. Vitis, let. 40, št. 2, str.

87–91

Vrhovšek, U., Vanzo A., Koruza B., Korošec - Koruza Z. Polifenolni potencial

slovenskega rdečega grozdja Polyphenolic potential of Slovenian red grapes. V:

Puconja M (ur.). Vinogradi in vina za tretje tisočletje? Ljubljana: Strokovno

društvo vinogradnikov in vinarjev Slovenije; Ljutomer: Zveza društev

vinogradnikov in vinarjev Slovenije; Celje: Poslovna skupnost za vinogradništvo

in vinarstvo Slovenije, 2002, str. 359–367.

Vršič S., Lešnik M. (2005) Vinogradništvo. Ljubljana: Kmečki glas.