untersuchungen zur pharmakokinetik des arzneistoffes
TRANSCRIPT
Aus dem
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes
Metamizol hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Helga Levens
aus Bremervörde
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung:
Universitätsprofessor Dr. Manfred Kietzmann
1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. hc. E. Deegen
Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juni 2005
Meiner Familie und meinen immer zu mir haltenden Freunden
Abkürzungsverzeichnis ...........................................................................1 1. Einleitung.................................................................................................1 2. Literaturübersicht ..................................................................................3
2.1. Definition des Dopingbegriffs ..................................................................3 2.1.1. Gründe zur Erstellung von Dopingreglementierungen ...................................... 4
2.2. Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände ......................................4 2.2.1. Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen
e.V. (HVT) ......................................................................................................... 4 2.2.2. Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (DVR) mit
Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht (2002) .................. 5 2.2.3. Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung
e.V. (Fédération Nationale, FN)......................................................................... 6 2.2.4. Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI - Fédération Équistre
Internationale) .................................................................................................... 9 2.3. Aspekte des Tierschutzes........................................................................10 2.4. Zusätzliche gesetzliche Aspekte für den Tierarzt im Zusammenhang mit
Doping.....................................................................................................12 2.4.1. Mögliche Strafrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt ........ 12 2.4.2. Mögliche Zivilrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt ........ 14
2.5. Formen des Dopings ...............................................................................15 2.6. Allgemeine Grundprinzipien der Pharmakokinetik................................21
2.6.1. Einkompartiment-Modell – Kinetik nach einmaliger intravenöser (i.v.) Injektion ........................................................................................................... 23
2.6.2. Zweikompartiment-Modell – Kinetik nach i.v. Injektion ................................ 24 2.6.3. Bioverfügbarkeit............................................................................................... 26 2.6.4. Verteilungsvolumen ......................................................................................... 27 2.6.5. Clearance.......................................................................................................... 29
2.7. Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) ..............................................31 2.7.1. Mediatoren der Entzündung ............................................................................. 32 2.7.2. Wirkungsmechanismus der NSAID ................................................................. 35 2.7.3. Pharmakokinetik der NSAID ........................................................................... 35 2.7.4. Nebenwirkungen der NSAID ........................................................................... 36 2.7.5. Metamizol......................................................................................................... 38
2.7.5.1. Metamizol - Pharmakodynamik ............................................................... 38 2.7.5.2. Metamizol – Pharmakokinetik ................................................................. 39 2.7.5.3. Metamizol – Arzneimitteleinsatz bei Pferden.......................................... 44 2.7.5.4. Dopingrelevanz des Einsatz von Metamizol............................................ 45
2.8. Analytik...................................................................................................45 3. Eigene Untersuchungen........................................................................50
3.1. Versuchsplanung.....................................................................................50 3.2. Material und Methode.............................................................................50
3.2.1. Pferde und Haltungsbedingungen .................................................................... 50 3.2.2. Applikation des Arzneimittels und Probengewinnung..................................... 52 3.2.3. Eingesetztes Arzneimittel................................................................................. 53 3.2.4. Aufbereitung und Aufbewahrung der Blut- und Urinproben........................... 53 3.2.5. Material, Geräte und Entwicklung analytischer Methoden für die Bestimmung
des Hauptmetaboliten 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA) von Metamizol ..... 54 3.2.5.1. Chemikalien ............................................................................................. 54 3.2.5.2. HPLC/MS/MS.......................................................................................... 55
Inhaltsverzeichnis
3.2.5.3. Eichlösungen ............................................................................................ 55 3.2.5.4. Entwicklung analytischer Methoden....................................................... 56 3.2.5.5. Proben mit 4-MAA und DMAP............................................................... 56 3.2.5.6. Chromatographie...................................................................................... 57 3.2.5.7. Extraktion von 4-MAA und DMAP aus Probenmaterial ......................... 58 3.2.5.8. Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyseschritt .......................................... 59 3.2.5.9. Aufarbeitung des Probenmaterials einschließlich der Proben für die
Validierung............................................................................................... 60 3.3. Validierung der Methode ........................................................................63
3.3.1. Grundlagen der Validierung............................................................................. 63 3.3.1.1. Selektivität, Spezifität .............................................................................. 63 3.3.1.2. Linearität .................................................................................................. 64 3.3.1.3. Richtigkeit ................................................................................................ 65 3.3.1.4. Präzision ................................................................................................... 65 3.3.1.5. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze ................................................... 66 3.3.1.6. Stabilität ................................................................................................... 67 3.3.1.7. Wiederfindung.......................................................................................... 68
3.4. Messung der Proben aus dem Hauptversuch..........................................69 3.4.1. Kalibrationsreihe im Plasma zur Quantifizierung des Ausscheidungsversuches
.......................................................................................................................... 69 3.4.2. Kalibrationsreihe im Urin zur Quantifizierung des Ausscheidungsversuches. 70
3.5. Pharmakokinetische Auswertung ...........................................................71 4. Ergebnisse..............................................................................................72
4.1. Massenspektren und Strukturformel von 4-MAA (Analyt) und DMAP (interner Standard) ..................................................................................72
4.2. Validierung der Analysenmethode .........................................................74 4.2.1. Selektivität und Spezifität ................................................................................ 74 4.2.2. Prüfung auf Linearität ...................................................................................... 76 4.2.3. Richtigkeit ........................................................................................................ 77 4.2.4. Präzision ........................................................................................................... 79 4.2.5. Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)....................... 80 4.2.6. Quantifizierungsgrenze (Bestimmungsgrenze, Limit of quantification, LOQ) 80 4.2.7. Stabilität ........................................................................................................... 80 4.2.8. Wiederfindung (Recovery)............................................................................... 81
4.3. Ergebnisse des Hauptversuchs................................................................82 4.3.1. Konzentrationen von 4-MAA im Plasma......................................................... 82 4.3.2. Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma ........................................ 84 4.3.3. Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse................................................. 86 4.3.4. Konzentrationen von 4-MAA im Urin ............................................................. 87
4.4. Berechnung der effektiven und irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen ...............................................................................90
4.5. Berechnung von Ausscheidungszeiten von 4-MAA aus Plasma und Urin.................................................................................................................92
5. Diskussion ..............................................................................................95 5.1. Eignung der erarbeiteten Analysenmethode (HPLC/MS/MS) für den
Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden .....................95 5.2. Pharmakokinetik von 4-MAA im Plasma...............................................99 5.3. 4-MAA im Urin ....................................................................................101
Inhaltsverzeichnis
5.4. Berechnungen zur effektiven und irrelevanten Plasmakonzentration und zur irrelevanten Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002); Berechnungen zur Ermittlung der Ausscheidungszeit.............103
5.5. Bewertung der Ergebnisse ....................................................................106 6. Zusammenfassung ..............................................................................109 7. Summary..............................................................................................111 8. Literaturverzeichnis ...........................................................................113 9. Anhang.................................................................................................125 Danksagung .........................................................................................131
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
� Hybridkonstante der Verteilung
Abb. Abbildung
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
AUC Area under the curve
AA 4-Aminoantipyrin
AAA N-4-Acetylaminoantipyrine
� Hybridkonstante der Elimination
BC Back Calculation
BGB Bürgerliches Gesetzbuch
C Konzentration
Cl Clearance
ClH hepatische Clearance
ClOrgan Organclearance
ClR renale Clearance
ClT totale Clearance
Cmax maximal gemessene Konzentration
C0 Plasmakonzentration zum Zeitpunkt t0 (unmittelbar nach
der i.v. Injektion)
CPlasmaø durchschnittliche Plasmakonzentration
COX Cyclooxygenase
CUrinø durchschnittliche Urinkonzentration
D Dosierung
DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen
DMAP Dihydrodimethyldimethylaminophenylpyrazolone
EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee
EPC effektive Plasmakonzentration
F Bioverfügbarkeit
FAA 4-Formylaminoantipyrin
FEI Fédération Équestre Internationale
FN Fédération Nationale – Deutsche Reiterliche Vereinigung
e.V. Warendorf
Abkürzungsverzeichnis
g Gramm
GC Gaschromatographie
h Stunde
HETE Hydroxyarachidonsäure
HPETE Hydroxyperoxyarachidonsäure
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
HQC High Quality Control Standard
HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V.
HWZ Halbwertzeit
i.a. intraarticulär
i.m. intramuskulär
IPC irrelevante Plasmakonzentration
ISTD interner Standard
IUC irrelevante Urinkonzentration
i.v. intravenös
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
l Liter
ln natürlicher Logarithmus
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantification
LPO Leistungsprüfungsordnung
LQC Low Quality Control Standard
4-MAA 4-Methylaminoantipyrin
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
max. maximal
mg Milligramm
min. Minute
ml Milliliter
mmol Millimol
MQC Midrange Quality Control Standard
MRL Maximum Residue Limit - Rückstandshöchstmenge
MRT Mean Residence Time – mittlere Verweildauer
Abkürzungsverzeichnis
MS Massenspektrometrie
m/z Quotient aus Masse und Ladung
NSAID nichtsteriodales Antiphlogistikum
p.a. post applicationem
PB Phenylbutazon
PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch
p.o. per oral, per os
QC Qualitätskontrolle
R2 Regressionskoeffizient
RE relativer Fehler, relative Abweichung
RO Rennordnung des DIR
Rss Urin/Plasmaverhältnis im steady state
S Standardabweichung
t Zeit
Tab. Tabelle
ta(IPC) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC
ta(LOD) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOD
ta(LOQ) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOQ
TBME tertiär-Butylmethylether
t50(�) HWZ der Verteilungsphase
t50(�) HWZ der Elimination
Tmax. Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration
TschG Tierschutzgesetz
Vd scheinbares Verteilungsvolumen
Vss Verteilungsvolumen im Steady State
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1. Einleitung
Bei Sportpferden kann der im Rahmen einer tierärztlichen Therapie erfolgte Einsatz von
Arzneimitteln dazu führen, dass eine Dopingkontrolle positiv ausfällt, wenn zwischen
Arzneimittelapplikation und Entnahme der Dopingprobe nicht genügend Zeit verstrichen ist.
Allein der Nachweis von Substanzen mit pharmakologischer Wirkung wird beanstandet, auch
wenn dabei keine bewusste Leistungsbeeinflussung vorliegt. Der Wissensstand über die
Nachweisdauer in Blut und Urin des Pferdes ist auch bei bereits langjährig etablierten
Arzneimitteln oft unzureichend. Tierärzte, die Sportpferde behandeln, können nicht mit
ausreichender Sicherheit abschätzen, wann welche Medikamente eingesetzt werden können,
ohne gegen Dopingreglementierungen der Pferdesportverbände zu verstoßen. Diese
Vorschriften fordern, dass zum Turnier- bzw. Rennzeitpunkt keine therapeutisch wirksamen,
leistungsbeeinflussenden - und damit dopingrelevanten - Substanzen nachgewiesen werden
können. Für einige Substanzen sind von einigen Pferdesportverbänden Grenzwerte festgelegt.
Reiter, Trainer und Pferdebesitzer stellen immer wieder die Frage, wie lange ein zu
Therapiezwecken eingesetztes Medikament vor einer Leistungsprüfung abgesetzt sein muss,
damit im Falle einer möglichen Dopingkontrolle kein positives Ergebnis resultiert. Sowohl
unter diesem Aspekt, als auch unter Berücksichtigung des deutschen Tierschutzgesetzes, nach
dem der Tierarzt verpflichtet ist, ein erkranktes Tier zu behandeln, um ihm Schmerzen zu
ersparen und es vor nachhaltigen Schäden zu bewahren, gerät der Pferdepraktiker zunehmend
in Konfliktsituationen, wenn ihm nicht ausreichend valide Daten zur Verfügung stehen,
anhand derer er seine Aussagen absichern kann.
Das European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC), eine Vereinigung von
Pferdesportverbänden aus fünf der europäischen Gemeinschaft angehörenden Staaten
(Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Italien und Spanien) ist bemüht, mit den in
Dopinglisten aufgeführten Substanzen pharmakologische Untersuchungen unter
standardisierten Bedingungen durchzuführen. Es wird beabsichtigt, gewonnene klinische und
pharmakologische Daten in ein PK/PD-Modell nach TOUTAIN und LASSOURD (2002)
einzubringen. Gemäß diesem Model durchgeführte Berechnungen zielen darauf ab, für
therapeutisch eingesetzte Substanzen Plasma- und Urinkonzentrationen zu ermitteln, in denen
die einzelne Substanz keine Wirkung auf den Organismus aufweist, so dass eine (Leistungs-)
Beeinflussung des Pferdes durch diesen Wirkstoff auszuschließen ist.
Das Ziel dieser Arbeit bestand daher einerseits darin, eine geeignete Analysenmethode zur
Quantifizierung auf einem High Pressure Liquid Chromatographen (HPLC) zu erarbeiten, und
2 Einleitung
andererseits Ausscheidungszeiten und die Eliminationskinetik für das häufig bei Pferden
eingesetzte nichtsteroidale Antiphlogistikum Metamizol aus Blut und Urin von Pferden zu
bestimmen.
Grundlage für die Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode war das derzeit
bestehende Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln.
Die erhaltenen Daten wurden pharmakokinetischen Berechnungen (TOUTAIN und
LASSOURD 2002) unterzogen, nach denen nicht mehr dopingrelevante Plasma- und
Urinkonzentrationen errechnet wurden, bei denen eine pharmakologische Wirkung von
Metamizol auf den Organismus ausgeschlossen werden kann. Die ermittelten
Ausscheidungszeiten geben an, über welchen Zeitraum das Metamizol im Pferdeorganismus
verweilt.
Die Ergebnisse der hier vorgestellten Untersuchungen sollen es dem Tierarzt erleichtern, den
Zeitpunkt zu bestimmen, ab dem ein Pferd nach erfolgreicher Therapie wieder an einer
Leistungsprüfung teilnehmen kann, ohne mit doping- und tierschutzrechtlichen
Bestimmungen zu kollidieren.
3 Literaturübersicht
2. Literaturübersicht
2.1. Definition des Dopingbegriffs
Ähnlich vielfältig wie die Definitionen des Wortes Doping sind auch seine
Übersetzungsmöglichkeiten: Erstmalige Erwähnung findet das Wort Doping in einem
englischen Lexikon 1899. Es wird dort als ein Gemisch aus Opium und Morphinderivaten,
welches an Pferde verabreicht wurde, definiert. Ursprünglich soll das Verb „doopen“ aus dem
Niederländischen kommen; es bedeutet eintauchen bzw. das Wort „doop“ soviel wie „dicke
Soße“. In den USA wurde „doping“ alsbald für eine unerlaubte Verabreichung von
Medikamenten an Rennpferde gebraucht. Laut UNGEMACH (1985) ist Doping im
Pferdesport definiert als unerlaubte Verabreichung eines jeden Mittels, außer normaler
Ernährung, das geeignet sein kann, die natürliche und aktuelle Leistungsfähigkeit eines
Pferdes zum Zeitpunkt eines Wettkampfes zu beeinflussen. Von BÜSCHER (1972) sind 42
Definitionen zusammengestellt, die alle mehr oder weniger den selben Inhalt versuchen
darzustellen, aber sehr unterschiedlich formuliert sind. Dieses zeigt die Schwierigkeit einer
juristisch brauchbaren Formulierung, die keine möglichen Hintertüten offenläßt (GRAHWIT
1995). SCHOENE (1996) nimmt die Essenzen der Dopingreglementierungen der
verschiedenen Pferdesportorganisationen und kombiniert diese zu einer Definition: „Doping
ist die Anwendung verbotener Substanzen/unerlaubter Mittel (siehe Dopinglisten) sowie der
Versuch, die Mitwirkung bei oder die Duldung einer solchen Anwendung beim Pferd zu
jedem Zeitpunkt. Ferner wird die pharmakologische, chemische und physikalische
Manipulation einer Probe als Doping bezeichnet. Auch die Anwendung jeglicher technischer
Mittel, sowohl im Training als auch im Wettkampf, gilt als Doping.“
Bis zum heutigen Tage gibt es keine allgemeingültige Definition des Dopingbegriffes für den
gesamten Bereich des pferdesportlichen Wettkampfes. Selbst in Gesetzestexten, wie
beispielsweise dem Tierschutzgesetz, fehlt eine Legaldefinition des Begriffes „Doping“. Der
Gesetzgeber setzt ihn offenbar als bekannt voraus (HIRT 1997). Statt dessen geben die
Pferdesportorganisationen für die von ihnen repräsentierten Disziplinen jeweils eigene
Definitionen des Dopingbegriffes in von ihnen erlassenen Dopingreglementierungen
(SCHOENE 1996).
4 Literaturübersicht
2.1.1. Gründe zur Erstellung von Dopingreglementierungen
Laut UNGEMACH (1985) sind Grundlagen für die Berechtigung des Dopingverbotes im
Pferdesport:
- der sportethische Gedanke eines fairen Wettkampfes,
- der Tierschutz,
- die Verhinderung einer falschen Zuchtauslese durch Vortäuschung falscher
Leistungsstandards unter dem Einfluß von Dopingmitteln,
- der Schutz des zahlenden und wettenden Publikums, das entscheidend zur Erhaltung
und Förderung des Pferdesports beiträgt,
- der Schutz der anderen Rennteilnehmer vor Gefährdungen, die von gedopten, leichter
außer Kontrolle geratenden Tieren ausgehen.
2.2. Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände
Nachfolgend soll ein kurzer Überblick über die Dopingbestimmungen der wichtigsten
deutschen Pferdesportorganisationen sowie der FEI (Fédération Équistre Internationale/
Internationale Reiterliche Vereinigung) gegeben werden. Auffallend ist, dass auch in jeder
dieser Bestimmungen eine genaue Definition des Dopingbegriffes fehlt.
2.2.1. Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –
Rennen e.V. (HVT)
Der Tatbestand des Dopings wird in § 93 der Trabrennordnung (TRO) auf die Anwendung
„ verbotener Substanzen“ , welche in einer „ Dopingliste“ in den Durchführungsbestimmungen
zur Feststellung und Verhinderung von Doping gesondert aufgeführt sind, bezogen.
„ Ein Pferd darf in seinen Geweben, seinen Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen
in der Zeit zwischen dem Beginn der Rennveranstaltung und dem Ende des Rennens, an dem
das Pferd teilgenommen hat oder für welches das Pferd als Starter angegeben worden ist,
keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen aufweisen... . Die Dopingliste in der
jeweils gültigen Fassung ist Bestandteil der Trabrennordnung... .“ (TRO §93,1)
5 Literaturübersicht
„ Ein positiver Dopingbefund liegt vor, wenn der qualitative Nachweis einer Substanz im
Sinne von Ziffer 1 der vom HVT veröffentlichten Dopingliste oder einer ihrer
Umwandlungsprodukte erbracht ist oder wenn gegen das Verbot gemäß Ziffer 2 der
Dopingliste verstoßen wurde. ...“ (TRO §93,2)
„ Unabhängig von dem generellen Verbot der Verabreichung von Substanzen oder Mitteln, die
in Absatz 1 (Auflistung der verbotenen Substanzen) genannt sind, dürfen Pferde innerhalb
von 72 Stunden vor Beginn des Rennens keine Injektionen oder Infusionen erhalten.“
(Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping gemäß §93
der TRO, Ziffer 2)
2.2.2. Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen
(DVR) mit Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht
(2002)
Im Abschnitt XIV „ Unerlaubte Mittel – Doping“ der Rennordnung (2002) sind die
entsprechenden Bestimmungen aufgeführt. Auch hier wird nur eine indirekte Definition des
Dopingbegriffes gegeben.
Unter „ 1. Allgemeines“ und den Nummern 529 und 530 sind folgende Bestimmungen zu
finden:
- 529. Kein Pferd darf zum Zeitpunkt des Rennens in seinem Gewebe, seinen
Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen ein unerlaubtes Mittel aufweisen.
- 530. Einen Verstoß begeht, wer diese Mittel anwendet, deren Anwendung versucht,
bei ihr mitwirkt oder sie pflichtwidrig ermöglicht. Einen Verstoß begeht ein Trainer,
bei dessen von ihm trainierten Pferden Substanzen solcher Mittel nachgewiesen
werden.
Der Tatbestand des Dopings wird hier nicht nur als direkter, persönlicher Verstoß gegen das
Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel verstanden, sondern weitet sich auf einen Versuch,
einer Mitwirkung und Duldung eines solchen aus. Zudem untersagt die Rennordnung des
DVR generell, unter Einbeziehung des Trainings, die Anwendung verbotener Substanzen.
6 Literaturübersicht
- 532. Das Direktorium ist befugt, durch Beauftragte von allen im Training befindlichen
Pferden jederzeit Dopingproben entnehmen zu lassen.
Mit dieser Regelung versucht das DVR einerseits Pferde vor unerlaubten Medikamenten zu
schützen, andererseits nur absolut gesunde Pferde am Training und Wettkampf teilnehmen zu
lassen. Ein im Training verabreichtes unerlaubtes Mittel ist zum Zeitpunkt des Rennens unter
Umständen nicht mehr nachzuweisen. Kranke Pferde sollen somit auch im Training vor einer
Überbelastung geschützt werden.
Unter „ 2. Erlaubte und unerlaubte Mittel“ sind diese unter den Nummern 539 bis 541
aufgelistet.
2.2.3. Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen
Vereinigung e.V. (Fédération Nationale, FN)
Im Vergleich zu den anderen Pferdesportverbänden ist durch die LPO der FN der Begriff des
Dopings insoweit direkt definiert, indem dort in §66 3.7 und 3.8 jeglicher Eingriff oder
Manipulationen bei an Wettbewerben/ Leistungsprüfungen teilnehmenden Pferden/Ponys zur
Nichtzulassung bzw. Disqualifizierung führt, der geeignet ist, die Leistung,
Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft derer zu beeinflussen. Wie dieses kontrolliert
werden soll, ist durch den §67 und entsprechenden Durchführungsbestimmungen geregelt.
Der §67a gibt eine genaue Definition der Begriffe „ Dopingsubstanzen“ und „ Verbotene
Arzneimittel“ . Durch die Grenzwertangaben in diesem Paragraphen gibt die FN Sportpferde
behandelnden Tierärzten die Möglichkeit dort aufgeführte Medikamente im Rahmen einer
notwendigen Therapie einzusetzen.
Die FN hat im Teil A §66 Allgemeine Teilnahmebeschränkungen von Pferden und Ponys
unter Punkt 3 der Leistungsprüfungsordnung (LPO), gültig ab 1. Januar 2004 Zustände
aufgelistet, die zur Nichtzulassung bzw. zur Disqualifizierung von Pferden/Ponys in
Wettbewerben/ Leistungsprüfungen führen:
§66 3.3.7 Pferde/Ponys bei denen eine vorübergehende lokale Schmerzausschaltung oder
Neurektomie vorgenommen wurde oder bei denen eine akute Veränderung der Haut bestehen
sowie Pferde/Ponys mit implantierten Tracheotubus
7 Literaturübersicht
§ 66 3.3.8 Pferde/Ponys denen gemäß §920.2.e) eine Dopingsubstanz oder ein verbotenes
Arzneimittel verabreicht oder an denen eine verbotene Methode angewendet oder zur
Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft irgendein Eingriff
oder Manipulation vorgenommen wurde.
§ 67 regelt Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferde- und Fitnesskontrollen.
Eine Liste verbotener Substanzen ist in § 67a aufgeführt:
§67a
1. Dopingsubstanzen
sind Substanzen, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu
beeinflussen. Das sind:
- Stimulantia
- Sedativa und Narkotika
- Anabolika
- Diuretika
- Peptidhormone und Analoge
Grenzwerte gelten für:
- Testosteron:
* bei Wallachen: freies und gekoppeltes Testosteron in einer Konzentration von 0,02
µg/ml Urin
* bei Stuten: freies und gekoppeltes Testosteron in einem Verhältnis zu Epitestosteron
von 12:1
- Nandrolon:
frei und gekoppelt 5�-estrane-3�, 17�-diol bis5(10)-estrene-3�, 17�-diol im Urin in
einem Verhältnis von 1
- Theobromin:
in einer Konzentration ab 2,0 µg/ml Urin
- Cortisol:
in einer Konzentration ab 1,0 µg/ml Urin
Ausserdem gilt die Verabreichung von Vollblut und/oder Zubereitungen, die rote
Blutkörperchen enthalten, sowie jede Manipulation einer Probe als Doping.
2. Verbotene Arzneimittel
8 Literaturübersicht
sind Substanzen, die als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind,
und zwar solche, die
- auf das Nervensystem
- auf das Herz-Kreislauf-System
- auf das Atmungssystem
- auf das Verdauungssystem
- auf das Harn-System
- auf die Geschlechtsorgane
- auf das Muskel- und Skelettsystem
- auf die Haut
- gegen Infektionserreger
wirken.
Grenzwerte gelten für:
- Salizylsäure:
in einer Konzentration ab 750,0 µg/ml Urin oder 6,5 µg/ml Blutplasma
- Arsen:
in einer Konzentration ab 0,3 µg/ml Urin
- Dimethylsulfoxyd (DMSO):
in einer Konzentration ab 15,0 µg/ml Urin oder
in einer Konzentration ab 1,0 µg/ml Blutplasma
- Verfügbares CO2 :
in einer Konzentration ab 37 Millimol pro Liter Blutplasma
3. Ausnahmen
Die Anwendung/ Verabreichung folgender Substanzen in zeitlichem Zusammenhang mit
Wettkampfteilnahme ist erlaubt (dies betrifft nur die Anwendung von für Pferde/Ponys in
Deutschland zugelassener Substanzen), da sie der Vorbeugung und Pflege dienen und
unterstützend bei der Gesunderhaltung des Pferdes/Ponys wirken:
- Impfstoffe gemäß Durchführungsbestimmungen zu §66.3.10 (Impfung gegen
Influenza-Viren)
- Substanzen zur Bekämpfung von Endoparasiten
- Paraimmunitäts-Inducer
- externe Desinfektionsmittel und Insektenschutzmittel
9 Literaturübersicht
Im Teil D der LPO „ Durchführungsbestimmungen“ finden sich Einzelheiten zur Neurektomie
(zur Zeit keine gesichterte Methode des Nachweises), zum Impfschutz und zu
Medikationskontrollen.
2.2.4. Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI - Fédération Équistre
Internationale)
Die Dopingreglementierungen der FEI sind aktuell in den Veterinary Regulations, 9th edition
und den General Regulations, 21th edition (mit Inkrafttreten vom 01. Januar 2005) enthalten
(www.horsesport.org). Sie entsprechen weitgehend den Dopingreglementierungen der FN;
jedoch führt die FEI bei den verbotenen Substanzen zusätzlich solche auf, die Wirkung auf
das Blutsystem und das endokrine System haben können. Zudem gelten nach der FEI
antipyretische, analgetische und antiinflammatorische Substanzen, als auch endokrine Sekrete
einschließlich ihrer synthetischen Duplikate und maskierende Substanzen als verbotene
Substanzen. Abweichend zur FN gilt nach FEI-Bestimmungen für Salicylsäure ein Grenzwert
von 625 µg/ml Urin, bzw. 5,4 µg/ml Plasma. Annex VII der Veterinary Regulations enthält
Bestimmungen (drei Medikationsformen) zur tierärztlichen Behandlung von Sportpferden und
deren Genehmigung während einer FEI-Veranstaltung. In Bestimmungen der
Medikationsform 1 ist die Notfallbehandlung einschließlich der dazu eventuell notwendigen
Verabreichung verbotener Substanzen geregelt. Die Anwendung von Altrenogest (z.B.
Regumate®) bei Stuten mit oestrusbedingetem Verhaltenproblem ist durch das Reglement der
Medikationsform 2 festgelegt. Die Genehmigung der Anwendung nicht verbotener
Substanzen ist durch Vorschriften der Medikationsform 3 geregelt.
Bei einem zusammenfassenden Vergleich der Dopingbestimmungen der oben genannten
deutschen Pferdesportorganisationen bleibt festzustellen, dass diese viele
Übereinstimmungen, aber auch deutliche Unterschiede aufweisen. Jede Organisation führt
eine eigene Liste, in der u.a. unerlaubte/ verbotene Substanzen aufgeführt sind. Die
Substanzen sind aufgrund bereits in einer Vielzahl vorhandener und ständig neu
hinzukommender Arzneimittel nicht nach Wirkstoff- oder Warenname sondern nach
Wirkstoffgruppen aufgelistet. In der Rennordnung des DVR und der LPO der FN sind für
einige Wirkstoffe Grenzwerte angegeben. Der HVT hat keine Liste über Substanzen mit
10 Literaturübersicht
Grenzwert erstellt und ist diesbezüglich der Verband mit den striktesten
Dopingreglementierungen, da er jeglichen Nachweis einer Substanz seiner Dopingliste und/
oder ihrer Metaboliten als positiven Dopingbefund ansieht (Dopingbestimmungen des HVT
2003, SCHOENE 1996, UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).
Der DVR hält in der Rennordnung fest, dass nicht allein der Einsatz eines dort aufgeführten
Wirkstoffes geahndet werden kann, sondern bereits der Versuch, die Mitwirkung und
Duldung desselben.
Laut der TRO des HVT besteht, unabhängig von dem generellen Verbot der Verabreichung
unerlaubter Mittel, ein Verbot, nach dem Pferden 72 Stunden vor Rennbeginn keine Injektion
oder Infusion gegeben werden darf. Hierdurch soll verhindert werden, dass Pferden kurz vor
dem Start leistungsfördernde Infusionen, wie z.B. Elektrolytlösungen, verabreicht werden,
deren Nachweis nicht möglich ist.
Der Begriff „ Doping“ wird in den Reglementierungen aller hier genannten
Pferdesportorganisationen benutzt, allerdings nur in der LPO der FN definiert. Hier wird
Doping als Tatsache des Vorhandenseins eines Wirkstoffes bezeichnet. Der Einsatz eines
behandelten Pferdes/ Ponys im Wettkampf stellt erst ein aktives Vergehen dar und kann
entsprechend geahndet werden.
Neben der Verabreichung von Pharmaka fallen bei dem DVR und der FN auch Maßnahmen
unter den Tatbestand des Dopings, die geeignet sind die Leistung eines Pferdes/Ponys zu
beeinflussen. Die LPO zählt dazu gestartete Pferde mit neurektomierten Gliedmaßen,
implantierten Tracheotuben und akuten Hautveränderungen. Die Rennordnung versteht
darunter den Einsatz technischer Mittel, die im Rennen mitgeführt oder angewendet werden,
wie z.B. den Einsatz von Strom oder Ohrenstopfen (LPO 2004, RO 2002, SCHOENE 1996).
2.3. Aspekte des Tierschutzes
GRAHWIT (1995) stellt den Einfluss von Doping auf die Leistungsphysiologie durch ein
Schema dar, worin gezeigt wird, dass Dopingmittel eine Aufhebung physiologischer
Leistungsblockaden auf verschiedenen Ebenen der Leistungsentfaltung bewirken können. Ein
Beispiel für einen solchen Schutzmechanismus ist die laktatbedingte Muskelermüdung und
Schmerzentfaltung. Ein in bestem Gesundheitszustand befindlicher Organismus kann allein
durch angepasste Ernährung und optimales Training die obere Grenze der natürlichen
Leistungsfähigkeit erreichen. Diese obere Grenze stellt nur ca. 60% der gesamten
11 Literaturübersicht
Leistungsfähigkeit dar. Der Übergang zum nächsthöheren Bereich innerhalb dieser 60%
erfordert bereits die Überschreitung von gewissen Barrieren, die aber mit dem Willen
steuerbar ist. Die oberen 40% der möglichen Leistungspotenz sind durch autonome
Schutzmechanismen blockiert. In diese kann nur durch bestimmte Substanzen unter
Aufhebung der Schutzbarrieren eingedrungen werden, wobei das Individuum zumindest
teilweise nicht mehr seinem bewussten Einfluss unterliegt. Das Eindringen in diesen
Risikobereich kann mit schweren Schädigungen des Organismus bis hin zum Tod
einhergehen. GRAHWIT (1995) setzt bei der Überschreitung der Barrieren in autonom
geschützte Leistungsreserven die Grenze, ab der der Tierschutzgedanke sinnvoll erscheint und
das Gesetz eintreten muss. Eine zusätzliche Gabe physiologischer Futterinhaltsstoffe, mit
Ausnahme des Thiamin, die geeignet sind, in einem Organismus das volle genetisch fixierte
Leistungspotential zu aktivieren, sollte nicht tierschutzrelevant sein, da durch diese
physiologische Leistungsgrenzen nicht aufgehoben werden können.
Für UNGEMACH (1985) stellt der Tierschutzgedanke den Hauptgrund für das Dopingverbot
im Pferdesport dar. Ein zentraler gesetzlicher Punkt dafür besteht im § 3 des
Tierschutzgesetzes (TSchG) in der Neufassung vom 1. Juni 1998. Nach Absatz 1 ist es
verboten, „ einem Tier außer in Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines
Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist oder die offensichtlich seine Kräfte
übersteigern“ . Absatz 1b besagt: „ Es ist verboten, an einem Tier im Training oder bei
sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Maßnahmen, die mit erheblichen
Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind und die Leistungsfähigkeit von Tieren
beeinflussen können, sowie an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen
Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden.“ Der Abschnitt 11 des § 3 des TSchG verbietet
das sogenannte physikalische Doping, indem es das Verbot beinhaltet, ein Gerät anzuwenden,
das durch elektrische Reize das artgerechte Verhalten des Pferde beeinflusst und die
Bewegung erheblich einschränkt oder aber außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem
Tier Schmerzen, Leiden oder Schäden zufügen können. In den Paragraphen 17 und 18 wird
aufgeführt, wie ein Verstoß gegen oben beschriebene Gesetze als Ordnungswidrigkeit oder
Straftat geahndet wird. UNGEMACH (1985) betrachtet es als Tierquälerei, sowohl ein
krankes Pferd durch Verabreichung von Medikamenten rennfähig zu machen, als auch den
Versuch, bei einem gesunden Pferd durch Dopingmaßnahmen physiologische Schutzbarrieren
auszuschalten und dadurch in unphysiologische Leistungsbereiche vorzustoßen. Beides sei
geeignet, als Folge einer Verschlimmerung bestehender Krankheitsprozesse bzw. einer
extremen Überbelastung, Pferden länger anhaltende und sich wiederholende erhebliche
12 Literaturübersicht
Schmerzen und Leiden zuzufügen. Dieses führt zudem zu einem frühzeitigen und unnötigen
Verschleiß und Verbrauch eines Pferdes (SCHOENE 1996). Gedopte Pferde können schwerer
kontrollierbar sein und dadurch, z.B. durch plötzliches Niederbrechen während eines
Rennens/des Trainings, andere Pferde und Reiter zu Sturz bringen und diese verletzen.
2.4. Zusätzliche gesetzliche Aspekte für den Tierarzt im Zusammenhang
mit Doping
Überlegungen, welche Konsequenzen das Dopingverbot nach § 3 Nr. 11 TSchG für den
(sport)pferdebehandelnden Tierarzt hat, wurden von HIRT (1997) zusammengefasst.
Verstöße gegen das o.g. Gesetz können strafrechtliche und zivilrechtliche Konsequenzen für
den pferdebehandelnden Tierarzt nach sich ziehen.
2.4.1. Mögliche Strafrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt
Nach § 18 Abs. 1 Nr. 4 TSchG begeht ein Tierarzt, der selbst einem Tier vorsätzlich ein
Dopingmittel bei einer sportlichen Veranstaltung verabreicht, eine Ordnungswidrigkeit, für
die er belangt werden kann. Gleiches gilt, wenn er das Mittel einem Dritten überlässt, der es
mit dem Wissen des Tierarztes verabreicht. In diesem Fall macht sich der Tierarzt nach § 14
Abs. 1 Ordnungswidrigkeitsgesetz (OwiG) als Beteiligter einer Ordnungswidrigkeit schuldig.
Der Vorsatz ist gegeben, wenn der Tierarzt weiß, dass es sich um ein Dopingmittel handelt
(ausreichend ist dabei das Wissen um eine leistungsbeeinflussende Wirkung) und dass das
Tier an einem Wettkampf teilnimmt. Um sich einer Ordnungswidrigkeit schuldig zu
machen, genügt der bedingte Vorsatz. Dieser ist gegeben, wenn der Tierarzt zwar nicht
definitiv weiß, dass es sich bei dem angewendeten Mittel um ein Dopingmittel handelt oder
das Tier bei einem Wettkampf starten soll, aufgrund der gesamten Umstände beides aber für
möglich hält und trotzdem das Mittel anwendet oder es Dritten zur Anwendung überlässt.
Fahrlässigkeit kann einem Tierarzt vorgeworfen werden, wenn er die
Tatbestandsverwirklichung nicht will, sie aber aufgrund einer vermeidbaren
Sorgfaltspflichtverletzung verursacht und dieses vorhersehbar war. Der Tierarzt muss hierzu
einem Irrtum unterliegen, indem er ein angewendetes oder verschriebenes Mittel nicht für ein
13 Literaturübersicht
Dopingmittel hält, er nicht von einer leistungsbeeinflussenden Wirkung zu Zeitpunkt der
Wettkampfteilnahme des Pferdes ausgeht oder er nicht davon ausgeht, dass das Pferd an
einem Wettkampf teilnimmt. In den Fällen, in denen der Tierarzt den Irrtum hätte vermeiden
können, kann er zur Rechenschaft gezogen werden. Ob dieses der Fall ist, richtet sich nach
den Umständen des Einzelfalls, wodurch unterschiedliche gerichtliche Rechtsprechungen in
ähnlichen Fällen entstehen können. Der Tierarzt kann nicht haftbar gemacht werden, wenn er
von dem Tierbesitzer über den wettkampfsportlichen Einsatz eines Pferdes falsch informiert
wurde und keine Anhaltspunkte dafür vorliegen, dass die Information unrichtig ist.
Ebensowenig wird ein Tierarzt haftbar sein, wenn er ein Pferd behandelt, das nach seinem
Wissen immer nur als Freizeitpferd spazierengeritten wird. Um den Vorwurf einer
Fahrlässigkeit zu vermeiden, stellt sich die Frage, welche Sorgfaltspflichten der Tierarzt im
Rahmen der Feststellung eines Mittels als Dopingmittel und seiner Abbauzeit hat. Der
Tierarzt muss die für seinen Berufskreis geltenden Rechtssätze und Verkehrsgeflogenheiten
beachten. Die Durchschnittsanforderungen sind an dem engen sozialen Bereich, in dem der
einzelne tätig ist zu orientieren, d.h., von einem Fachtierarzt für Pferde ist mehr zu erwarten
als von einem Allgemeinmediziner. Ein Fachtierarzt, der Sportpferde behandelt muss die
Dopingwirkstoffe und ihre Karenzzeiten kennen. Um dazu seine Leistungen dem zeitlichen
Wandel anzupassen, muss er sich fortbilden (einschlägige Fachzeitschriften, Tagungen).
Wenn bei den Abbauzeiten der Wirkstoffe Unsicherheiten bestehen, muss der Tierarzt den
Tierbesitzer über diese und auf das Risiko entsprechender Unwagbarkeiten aufklären. Der
Tierarzt, der kein Fachtierarzt ist und nur gelegentlich Sportpferde behandelt, kann sich
diesbezüglich nicht erfolgreich auf Unkenntnis berufen. Der Sorgfaltsmangel, der die
Fahrlässigkeit begründet, liegt hier in einem Übernahmeverschulden, indem er eine Aufgabe
übernimmt, der er nicht gewachsen ist. Gleiches gilt, wenn er hinsichtlich den
Dopingwirkstoffen und deren Abbauzeiten einem Irrtum unterliegt, der bei einem
Fachkollegen vermeidbar gewesen wäre. Verursacht ein Tierarzt vorsätzlich oder bedingt
vorsätzlich durch die Verabreichung eines Dopingmittels den Tod oder länger anhaltende
oder sich wiederholende erhebliche Schmerzen und Leiden eines Tieres, so begeht er nach §
17 Nr. 1 und 2b) TSchG eine Straftat. Im Falle eines vorsätzlichen Vergehens macht er sich
im Fall der Tötung oder Schädigung des Tieres nach § 303 Strafgesetzbuches (StGB) einer
Sachbeschädigung strafbar. Straffrei bleibt der Tierarzt, wenn er zuvor den Besitzer über
mögliche Konsequenzen (Tod/ Schädigung des Tieres) des Einsatzes von Dopingmitteln
aufgeklärt hat.
14 Literaturübersicht
2.4.2. Mögliche Zivilrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt
Nach § 134 Bürgerlichen Gesetzbuches (BGB) ist ein Vertrag zwischen einem Tierarzt und
einem Trainer oder Tiereigentümer nichtig, wenn er darauf zielt, einem Tier für einen
sportlichen Wettkampf gesetzeswidrig Dopingmittel zu verabreichen. Dem zu Folge hat der
Tierarzt für seine erbrachte Leistung keinen Vergütungsanspruch. Gleiches gilt, wenn der
Tierarzt das Dopingmittel einem Dritten zu o.g. Zweck überlässt. Wenn der Einsatz eines
Dopingmittels wie zuvor erwähnt, zum Tod oder zur Schädigung des Tieres führt und der
Tierarzt über diese Konsequenzen den Tiereigentümer nicht aufgeklärt hat, macht er sich nach
§ 823 BGB wegen Eigentumsverletzung schadensersatzpflichtig. Ein Tierarzt kann ebenfalls
schadensersatzpflichtig werden, wenn er zur nur auf Heilung gerichteten Behandlung Mittel
einsetzt, die auf den Dopinglisten der Verbände stehen oder die über die medizinische
Indikation hinaus leistungsbeeinflussend wirken. Gleiches gilt, wenn der Tierarzt
versehentlich ein Dopingmittel anstatt eines anderen Medikamentes anwendet. Grundsätzlich
ist ein Tierarzt verpflichtet, über Risiken und Alternativen einer Behandlung zu informieren,
wenn dieses für einen Tierbesitzer entscheidungserheblich sein kann.
Aus dem bisher Gesagten ergibt sich die Dopingproblematik, indem dem generell
legitimierten Bedürfnis nach tierärztlicher Versorgung von Sportpferden das Verbot der
Anwendung von pharmakologisch wirksamen Substanzen vor einem Wettkampf bzw. zum
Wettkampfzeitpunkt gegenübersteht. Aus diesem Grund, d.h. um die notwendige
medikamentelle Behandlung von Sportpferden zu sichern, wird es unumgänglich sein, für
jeden einsetzbaren Wirkstoff eine Karenzzeit festzulegen. Der Zeitraum zwischen der letzten
Arzneimittelgabe und dem Tag des Wettkampfes wird hier als Karenzzeit definiert (KLAUS
und HAPKE 1994). Eine Schwierigkeit ergibt sich dabei, dass über den Zusammenhang von
Nachweis und Wirkkonzentration bis heute sehr wenig oder sehr unterschiedliche Daten
vorliegen, so dass bisweilen mit sogenannten „ withdrawal times“ gearbeitet werden muss.
Diese Karenzzeiten sind definiert als der Zeitraum, in dem ein Pferd nach einmaliger Gabe
eines Wirkstoffes nicht an den Start gehen darf. Diese Daten sind durch Untersuchungen
gestützt, die die Pharmakologie, das Eliminationsverhalten und die Nachweisdauer im Blut
und Urin berücksichtigen. Ein maßgebender Faktor bei der Erstellung dieser Zeiten, ist die
Kompetenz/Kapazität der Analytik. In dem „ Handbuch Medikation“ (FN 1997), das gerade
überarbeitet wird, hat die FN Karenzzeiten für eine Auswahl von Substanzen, die häufig in
der Pferdepraxis eingesetzt werden, erstellt, die aus eigenen Untersuchungen der FN und
15 Literaturübersicht
durch Auswertung internationaler Literatur entstanden sind. Diese Liste wird fortgeschrieben
und regelmäßig überarbeitet (DÜE 1998).
2.5. Formen des Dopings
Unter Berücksichtigung der Zielsetzung kann Doping in unterschiedliche Formen unterteilt
werden:
- Doping auf Sieg
- Doping auf Niederlage
- Doping zur Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit
- Versehentliches oder unbeabsichtigtes Doping
- Doping zur Maskierung und zur Verdünnung anderer Substanzen (Maßnahmen zur
Erschwerung des Dopingnachweises)
- Doping mit körpereigenen Substanzen
- Physikalisch-technisches Doping.
Die Formen des absichtlichen Dopings lassen sich in positives und negatives Doping
unterteilen. Zu dem positiven Doping zählt das Doping auf Sieg, das Doping zur
Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit, das Doping mit körpereigenen
Substanzen und das physikalisch- technische Doping. Das Doping auf Niederlage wird als
negatives Doping angesehen (UNGEMACH 1985).
Das Doping auf Sieg soll die natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes positiv beeinflussen,
d.h., es hat zum Ziel physiologisch vorgegebene und autonom geschützte Leistungsbarrieren
zu überwinden (UNGEMACH 1985). Diese Dopingform lässt sich weiter unterteilen in
akutes, chronisches und paradoxes Doping. Bei dem akuten Doping, welches auch als „ short
term medication“ bezeichnet wird, werden verbotene leistungssteigernde Substanzen kurz vor
dem Wettkampf appliziert (SCHOENE 1996). Zur Anwendung kommen hierzu in erster Linie
Stimulantien, wie z.B. Phenylalkylamine (z.B. Amphetamin, Ephedrin), Cocain,
Methylxanthine (z.B. Coffein, Theophyllin), Opiate (z.B. Morphin, Fentanyl, Levomethadon)
und Apomorphin. Trotz unterschiedlicher Wirkungsmechanismen resultiert ein Dopingeffekt,
der durch Euphorisierung mit erhöhter Leistungsbereitschaft und Konzentration als auch
durch Steigerung der lokomotorischen Aktivität gekennzeichnet ist. Charakteristisch für
16 Literaturübersicht
Stimulantien ist eine relativ kleine therapeutische Breite, d.h. geringfügige Dosisänderungen
können nicht zu einer erwünschten stimulierenden Wirkung, sondern zu unerwünschten
Wirkungen, wie z.B. Unruhe bis hin zu nicht kontrollierbaren Erregungszuständen, führen.
Auf Grund einer kurzen Wirkungsdauer werden Stimulantien unmittelbar vor einem
Wettkampf verabreicht. Zudem kommt eine individuelle Reaktionslage auf Stimulantien, die
zusätzlich Tagesschwankungen unterliegen kann, was bedeutet, dass diese Dopingform nur
von Personen ausgeführt werden kann, die eine genaue Kenntnis der Reaktionslage des
entsprechenden Pferdes besitzen. Folglich wird diese Form des Dopings auch als „ inside job“
bezeichnet (UNGEMACH 1985, SCHOENE, 1996). Unter chronischem Doping versteht man
eine Langzeitverabreichung über Wochen und Monate z.B. von anabolen Steroiden und
bestimmten Vitaminen. In Verbindung mit optimalem Training und Fütterung, kommt es so
u.a. zu einer Zunahme der Skelettmuskulatur, woraus eine erhöhte Leistungssteigerung
resultieren kann. Die Zunahme der Skelettmuskulatur beruht nicht auf Vermehrung, sondern
auf Hypertrophie der Muskelfasern. Diese Substanzen werden meist zeitig vor dem
Wettkampf abgesetzt, dass sie zum dem Zeitpunkt nicht mehr nachweisbar sind, und nur noch
das Resultat ihrer Wirkung in Form von erstaunlicher Rennleistung und Exterieurentwicklung
erkennbar ist. Solche Machenschaften haben negativen Einfluss auf die Zuchtauswahl
beispielsweise in der Voll- und Warmblutzucht, indem Rennleistungen und Exterieur
vorgetäuscht werden, die ohne Anabolikaeinsatz nicht erreicht worden wären. Der
Anabolikaeinsatz zu Dopingzwecken kann schwerwiegende Folgen für die Pferde haben, wie
z.B. Störungen des Zyklus und der Spermatogenese bis hin zu irreversiblen
Fruchtbarkeitsstörungen, verfrühter Epiphysenfugenschluß bei Jungtieren und Gefahr von
Sehnen- und Bänderrupturen durch überproportionale Entwicklung der Muskulatur im
Vergleich zum Bandapparat. Ein langzeitiger Einsatz von Vitamin B1 und Vitamin E zur
Steigerung der Effizienz der Glykogenmobilisierung und –verwendung wird ebenfalls als
chronisches Doping angesehen. Die paradoxe Form des Dopings beinhaltet die
Verabreichung kleinster Dosen Neuroleptika und Minor-Tranquilizer über einen längeren
Zeitraum, um übermäßig erregbare und sehr nervöse Pferde wettkampffähig zu machen.
Hierzu finden heutzutage moderne Psychopharmaka aus der Humanmedizin Anwendung, die
eine Lösung von Angst- und Spannungszuständen bewirken und dabei nicht wesentlich den
Wachzustand und die Reaktions- und Leistungsfähigkeit negativ verändern (UNGEMACH
1985, SCHOENE 1996).
Doping auf Niederlage soll die Leistung eines Pferdes im Wettkampf mindern. Zu diesem
Zweck werden Neuroleptika und Minor-Tranquilizer in höheren Dosierungen als beim
17 Literaturübersicht
paradoxen Doping, als auch Sedativa eingesetzt. Mit steigender Konzentration dieser
Substanzen wird zunehmend eine psychomotorische Antriebshemmung mit ausgeprägter
lokomotorischer Hemmung und Ausfall bedingter Reflexe bewirkt. Die negative
Dopingwirkung beruht darauf, dass die Pferde den für die Rennleistung entscheidenden
Fluchtreflex verlieren sollen und schwerer anzutreiben sind. Anwendung findet diese
Dopingform, auch als „outside job“ bezeichnet, zur Ausschaltung und Beeinflussung von
Wettkampfgegnern und somit zur Manipulation von Pferdewetten (UNGEMACH 1985,
SCHOENE 1996).
Bei Doping zur Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit soll keine
Leistungssteigerung im Sinne der Überschreitung physiologischer Schutzbarrieren und
Vordringen in autonom geschützte Leistungsbereiche durch Verabreichung von
Medikamenten erzielt, sondern „ lediglich“ die uneingeschränkte, schmerzfreie
Leistungsfähigkeit eines Pferdes im gesunden Zustand garantiert werden. Im engeren Sinne
gehören zu dieser Form des Dopings alle medikamentösen therapeutischen Maßnahmen, da
zum Zeitpunkt des Wettkampfes kein Unterschied zwischen Therapie und Doping gemacht
wird. Praktische Anwendung finden hier in erster Linie nichtsteroidale Antiphlogistika
(NSAID), aber auch Lokalanästhetika und Glukokortikoide, um besonders bei
Hochleistungspferden den (weiteren) sportlichen Einsatz trotz kleinerer Verletzungen oder
Lahmheiten zu gewährleisten. Von Bedeutung sind ebenfalls NSAID, die aufgrund ihrer
spasmolytischen Wirkkomponente bei Koliken eingesetzt werden, wie z.B. Metamizol und
Flunixin. Die periphere analgetische Wirkung der NSAID bewirkt, dass die Pferde näher an
ihrer natürlichen absoluten Leistungsgrenze laufen. Der entzündungshemmende Teilaspekt
der Prostaglandinsynthesehemmung durch NSAID kann durch fehlende Ruhigstellung der
Hochleistungssportpferde nicht zum Tragen kommen, wodurch der eigentliche
antiphlogistische Effekt antagonisiert wird. Durch Ausschalten des Schmerzes als
leistungsbegrenzende Schutzbarriere, ist bei weiterem Sporteinsatz mit einer
Verschlimmerung der Krankheitsprozesse und frühzeitigen Verschleiß der Pferde zu rechnen
(UNGEMACH 1985). Für Phenylbutazon und Oxyphenbutazon bestand bis vor Kurzem ein
Grenzwert, durch den der Einsatz dieser antiphlogistischen Wirkstoffe gewissermaßen legitim
war (SCHOENE 1996). Unter Berücksichtigung der bereits bei therapeutischen Dosierungen
auftretenden Nebenwirkungen besitzen NSAID als Dopingmittel ein sehr ungünstiges
Nutzen-Risiko-Verhältnis (Ungemach 1985). Die Anwendung von Lokalanästhetika zur
peripheren Schmerzausschaltung zu Dopingzwecken, die von UNGEMACH (1985), als
„ chemische Neurektomie“ bezeichnet wurde, birgt neben der Verschlimmerung der
18 Literaturübersicht
Krankheitsprozesse zudem die Gefahr von Stürzen von Pferd und Reiter mit zusätzlicher
Gefährdung anderer Wettkampfteilnehmer.
Die Infusion von Elektrolytlösungen mit Zusatz von Natriumhydrogencarbonat, soll zumeist
eine erhöhte Pufferkapazität des Blutes bewirken, so dass durch erhöhte Muskeltätigkeit
anfallendes Laktat nicht so schnell zu einer Ermüdung und Schmerzentfaltung in der
Muskulatur führt. Dieses Verfahren stellt ebenfalls eine Form des Dopings zur
Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit dar (SCHOENE 1996).
Versehentliches oder unbeabsichtigtes Doping stellt das größte Problem für alle am
Pferdesport beteiligten Personenkreise dar (UNGEMACH 1985). Diese Form des Dopings
kommt nicht durch vorsätzliches Handeln zustande, sondern durch Unkenntnis über
Pharmakologie und –kinetik der entsprechenden Substanz (UNGEMACH 1985;
UNGEMACH et al. 1999). Viele Arzneimittel können bei einer völlig unverdächtigen
Hauptwirkung als Nebenwirkung eine klassische Dopingwirkung besitzen. Ein Beispiel
hierfür ist eine Antibiose mit Depot-Penicillin, welches das Lokalanästhetikum Procain
enthält. Dieser Zusatz wird noch für Wochen über den Urin ausgeschieden und ist im
Organismus viel länger nachweisbar als das Antibiotikum selbst und kann zudem eine zentral
stimulierende Wirkung ausüben (SCHOENE 1996, UNGEMACH 1985). Ein weiteres
Problem besteht darin, dass eine dopingrelevante Substanz sowohl Wirkstoff als auch
pharmazeutischer Hilfsstoff sein kann. Die häufigste Ursache unbeabsichtigten Dopings liegt
aber in der Unkenntnis von Ausscheidungszeiten und den daraus resultierenden Absatzfristen
vor einem Wettkampf. Solche „ Wartezeiten“ werden von vielen Faktoren beeinflusst. Ein
entscheidender Faktor ist die Sensitivität der Laboranalytik, d.h., je empfindlicher die
Nachweismethode, desto niedriger ist die Nachweisgrenze. Somit verlängert sich die
Absatzfrist für eine bestimmte Substanz. Weitere Faktoren, die Einfluss auf die
Ausscheidungszeiten einer Substanz haben sind u.a. Dosierung, Art der Verabreichung, der
Gesundheits- und Trainingszustand eines Pferdes, pH-Wert des Harnes, die
Metabolisierungsrate in der Leber und Wechselwirkungen mit anderen gleichzeitig
verabreichten Präparaten (MOSS und CLARKE 1977, UNGEMACH 1985, TOBIN und
WOOD 1989).
Unter Doping zur Maskierung anderer Substanzen versteht man die Verabreichung
zusätzlicher und gleichzeitig mit der potenten Dopingsubstanz applizierter Mittel, die den
Nachweis der eigentlich dopingrelevanten Substanz maskieren sollen oder ihre Ausscheidung
verzögern, verringern oder beschleunigen (SCHOENE 1996). Anwendung fanden dabei z.B.
Metamizol und Thiamin. Beide Substanzen sollten andere Wirkstoffe bei bestimmten
19 Literaturübersicht
laboranalytischen Nachweisverfahren überlagern. Ein weiteres Beispiel ist in diesem
Zusammenhang die Substanz Probenecid, welche durch tubuläre Sekretionshemmung zu
einem Zurückhalten eines unerwünschten Wirkstoffes im Blut führt und ein negatives
Dopingergebnis im Urin bewirken soll (FORTH et al. 1996). Zum Doping zur Verdünnung
anderer Substanzen finden in erster Linie Diuretika Einsatz, die durch erhöhte Ausscheidung
von Körperwasser einen Verdünnungseffekt anderer Substanzen im Urin zur Folge haben
sollen. Diuretika besitzen nicht die Fähigkeit die Ausscheidung von anderen Substanzen zu
beschleunigen (SCHOENE 1996). All diese Maßnahmen zur Erschwerung des analytischen
Dopingnachweises stellen für die heute routinemäßig genutzten Nachweisverfahren kein
Problem mehr dar (UNGEMACH 1985).
Unter Doping mit körpereigenen Substanzen fällt hauptsächlich das Blutdoping. Die
Vorgehensweise besteht darin, dem Pferd einige Tage vor dem sportlichen Wettkampf eine
möglichst große Menge Blut zu entnehmen, die Erythrozyten zu separieren, ihnen eventuell
noch Ozon zuzusetzen und dem Pferd kurz vor Wettkampfbeginn die eigenen Erythrozyten zu
infundieren. Dieses soll eine zusätzliche Bereitstellung an Sauerstoff und damit eine erhöhte
Leistungsfähigkeit des Pferdes bewirken. Anzuzweifeln bleibt, ob die Erythrozytenmenge
ausreicht, um tatsächlich ein erhöhtes Sauerstoffreservoir zu schaffen (SCHOENE 1996).
Die Übergänge zwischen den einzelnen Dopingformen sind teilweise fließend. All diese
Methoden beruhen auf der Anwendung von Arzneimitteln, weshalb sie auch als „ chemisches
Doping“ bezeichnet werden. Ihnen stehen die ebenfalls verbotenen physikalisch- technischen
Methoden des Dopings gegenüber. Beispiele hierfür sind Neurektomien, Einsatz eines
ständigen Tracheotubus, Einsatz von Strom (z.B. durch Konstruktionen an Sporen, Gerte),
Anbringen spitzer Gegenstände an die Reitausrüstung, Fixation der Pferdezunge und vieles
mehr. Verbote zur Anwendung entsprechender Maßnahmen finden sich in den
Dopingbestimmungen des HVT, des DRV, der FN und FEI und im Tierschutzgesetz
(SCHOENE 1996).
Unter die in den Dopinglisten der Pferdesportverbände aufgeführten Wirkstoffgruppen fällt
ein Großteil der in der täglichen Pferdepraxis zu Therapiezwecken eingesetzten Substanzen.
Für den sportpferdebehandelnden Tierarzt ergibt sich demnach die Frage nach Absatzfristen,
damit von ihnen behandelte Sportpferde bei Dopingkontrollen Grenzwerte für bestimmte
Substanzen nicht überschreiten, bzw. nicht noch Spuren einer verbotenen Substanz im Plasma
und Urin aufweisen. In dem Handbuch zur Medikation (FN 2002) sind Karenzzeiten einiger
Wirkstoffe aufgeführt. Diese Karenzzeiten stellen eine Sperrfrist dar, innerhalb der ein Pferd
20 Literaturübersicht
nach Gabe einer Substanz nicht an einem Wettkampf teilnehmen darf (DÜE 1998). Diese
Karenzzeiten haben keine Verbindlichkeit und sollen nur näherungsweise als Richtwerte
verstanden werden. Gleiches gilt für eine empfohlene Karenzzeit von 14 Tagen für alle nicht
in der Liste enthaltenen Wirkstoffe. Rechtsvorschriften zur Festlegung von Karenzzeiten im
Pferdesport bestehen derzeit nicht (UNGEMACH et al. 1999). Nach den zur Zeit geltenden
Dopingreglementierungen der deutschen Pferdesportverbände, gilt der Nachweis eines
Wirkstoffes unabhängig von der Konzentration, mit Ausnahme der Substanzen für die
Grenzwerte festgelegt wurden, als Versuch der Leistungsbeeinflussung eines Pferdes und
wird dem Doping gleichgesetzt (UNGEMACH 1988, DÜE 1998). Bei dieser sogenannten
„Nulllösung“ ist es unbedeutend, ob wirklich eine Leistungsbeeinflussung erfolgt oder nicht
(KLAUS und HAPKE 1994, UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999). DÜE (1998)
hinterfragt, wie und wodurch „ Null“ bestimmt wird. „ Null“ kann einerseits bedeuten, dass es
keine geeignete Nachweismethode gibt, oder andererseits die Konzentration einer Substanz
unterhalb der durch die Analytik vorgegebenen Nachweisgrenze liegt. Durch immer sensibler
werdende Analytik wird vermutlich irgendwann der Nachweis eines Moleküls möglich
werden (TOBIN 1981), weshalb künftig ein sinnvoller Zusammenhang zwischen Nachweis
und Wirksamkeit pharmakologisch wirksamer Substanzen Gegenstand der Forschung sein
sollte. In diesem Zusammenhang spricht DÜE (1998) von einer sogenannten Highest Non
Effect Dosis (HNED). Die „ Nulllösung“ scheint somit keine dauerhafte Alternative zu sein.
KLAUS und HAPKE (1994) diskutieren unter Berücksichtigung der oben aufgeführten
Problematik und hinsichtlich der therapeutisch notwendigen medikamentösen Behandlung
von Sportpferden, ob nicht eine „ gesplittete Dopingliste“ erstellt werden oder eine begrenzte
Anzahl von Wirkstoffen zum Wettkampfzeitpunkt zulässig sein sollte. Eine derartige Liste
könnte verbotene Dopingmittel in eigentlichen Sinn ohne therapeutische Indikation, erlaubte
Stoffe in vorschriftsmäßiger Anwendung ohne Einfluss auf die Leistung des Pferdes und
letztendlich Tierarzneimittel enthalten, für die Karenzzeiten und Grenzwerte festgelegt
werden. Karenzzeit wäre hier der Zeitraum zwischen dem Tag der letzten
Arzneimittelapplikation und dem Wettkampftag (KLAUS und HAPKE 1994).
Mit fortschreitender Steigerung der Empfindlichkeit der Analytik geraten die
Pferdesportverbände zunehmend unter Druck, ob sie geringste Konzentrationen bzw. Spuren
eines zu therapeutischen Zwecken verabreichten Pharmakons in einer Dopingkontrolle positiv
bewerten sollen oder nicht. TOBIN (1989) hob bereits hervor, dass besonders im Urin
Wirkstoffspuren noch Tage nach einer therapeutisch notwendigen Behandlung und dem
Abklingen der pharmakologischen Effekte gefunden werden können. Gerade diese Situation
21 Literaturübersicht
erschwert den Sportverbänden eine geradlinige und bei verschiedenen Fällen wiederholt
gerechte Bewertung und Ahndung. Eine Entscheidung kann nur dahingehend getroffen
werden, dass entweder jegliches Vorhandensein eines Wirkstoffes, wobei die von der
Analytik vorgegebene Nachweisgrenze limitierend wirkt, geahndet wird, oder nur
Konzentrationen oberhalb eines festgelegten Grenzwertes. Einen Lösungsansatz beschrieben
TOUTAIN und LASSOURD (2002) mit einem PK/PD-Modell, welches gerade in Bereichen
sehr niedriger Wirkstoffkonzentrationen Entscheidungen bezüglich der Dopingrelevanz
ermöglichen soll. Diesem Modell liegt eine mathematische Ermittlung sogenannter
irrelevanter Plasma (IPC)- und Urinkonzentrationen (IUC) zugrunde. Diese sind definiert als
Plasma- und Urinkonzentrationen eines bestimmten Wirkstoffes, die das Fehlen jeglicher
Auswirkungen auf den Organismus garantieren und die seitens der Pferdesportverbände nicht
geahndet werden müssten. Die Anwendung des Modells zuzüglich klinischer und
pharmakologischer Daten soll die Berechnung der IPC und IUC einer bestimmten
systemische wirkenden Substanz ermöglichen, wenn ausreichende pharmakologische Daten
zu diesem Wirkstoff vorhanden sind (TOUTAIN und LASSOURD 2002).
2.6. Allgemeine Grundprinzipien der Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik befasst sich als Teilgebiet der Pharmakologie mit
Konzentrationsveränderungen von Arzneistoffen im Organismus in Abhängigkeit von der
Zeit und deren mathematischer Beschreibung (MUTSCHLER 1991). Über den
Konzentrationsverlauf eines Pharmakons nach der Applikation bzw. seine Verweildauer im
Organismus bestimmen nach BAGGOT (1978), KOCH und RITSCHEL (1986),
MUTSCHLER (1991):
- Liberation- Freisetzung des Wirkstoffes aus der Arzneiform
- Absorption- Resorption
- Distribution- Verteilung im Organismus
- Metabolisierung- Biotransformation
- Elimination
Wichtige pharmakokinetische Parameter sind in diesem Zusammenhang die Bioverfügbarkeit,
scheinbares Verteilungsvolumen, Halbwertzeit und Clearance (FICHTL 2001). Sie werden
22 Literaturübersicht
aus Konzentrations-Zeit-Verläufen von Arzneistoffen und gegebenenfalls deren Metaboliten
in der Kreislaufflüssigkeit (Blut, Plasma, Serum) und dem Harn ermittelt (MUTSCHLER
1991).
Um den zeitlichen Konzentrationsverlauf eines Arzneistoffes im Blut, Plasma und Urin zu
veranschaulichen, werden oft pharmakokinetische Modelle benutzt. Diese sogenannten
Kompartiment-Modelle erlauben eine mathematische Beschreibung der komplexen
Verteilungs- und Eliminationsvorgänge eines Pharmakons im Organismus (DYKE und
SAMS 1994). Dabei wird der Organismus in Kompartimente (Verteilungsräume) unterteilt,
die kinetisch als einheitlich betrachtet werden und in denen von einer gleichmäßigen
Verteilung einer Substanz ausgegangen wird, z.B. Blut, Gastrointestinaltrakt oder bestimmte
Gewebe (KIETZMANN 1983). Je nach Applikationsart, Verteilungsverhalten,
Metabolisierungs- und Eliminatonsverhalten können Ein- oder Mehrkompartimentsysteme
angewendet werden (KIETZMANN 1983).
Erfolgt der Übergang einer Substanz von einem Kompartiment in ein anderes
konzentrationsabhängig, so wird pro Zeiteinheit ein konstanter prozentualer Anteil der
Substanzmenge überführt. Hierbei bleibt die Zeitspanne, in der die Konzentration jeweils um
die Hälfte abnimmt oder sich verdoppelt, gleich. Diese Zeit wird als Halbwertzeit (HWZ)
bezeichnet (KIETZMANN 1983). Wird die exponentielle Abnahme der Stoffkonzentration im
Verhältnis zur Zeit halblogarithmisch dargestellt, so ergibt sich ein linearer Kurvenverlauf.
Die Steigung der erhaltenen Gerade entspricht der Geschwindigkeitskonstanten der
Elimination, aus der die Plasma-HWZ berechnet werden kann. Der Verlauf einer solchen
Konzentrationskurve wird als Kinetik 1. Ordnung bezeichnet (KIETZMANN 1983).
In Fällen von Sättigungserscheinungen gehorcht die Pharmakokinetik einer Kinetik 0.
Ordnung, bei der pro Zeiteinheit ein konstanter Anteil der Substanzmenge von einem zum
anderen Kompartiment transportiert wird. Die Abnahme der Stoffkonzentration stellt sich
bereits bei linearer Darstellung als Gerade dar (KIETZMANN 1983, FORTH et al. 1996).
23 Literaturübersicht
2.6.1. Einkompartiment-Modell – Kinetik nach einmaliger intravenöser (i.v.)
Injektion
Hierbei wird angenommen, dass sich eine Substanz nach intravenöser Applikation im Körper
als in einem einzigen Kompartiment gleichmäßig verteilt. Folgt die Elimination dabei einer
Kinetik 1. Ordnung, so gehorcht die Konzentration folgender Funktion:
C = C0 � e-ke � t [1] ln C = ln C0 – ke � t [2]
C0 = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt 0, unmittelbar nach der Injektion
ke = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante
t = Zeit
Die graphische Darstellung von Gleichung [1], in der die Konzentration gegen die Zeit
aufgetragen wird, ergibt eine Exponentialkurve (s. Abb. 1.1). Diese Exponentialkurve kann
durch Logarithmieren in die Form einer Geradengleichung [2] transponiert werden (s. Abb.
1.2), wobei die Eliminationskonstante der Steigung der Geraden der logarithmischen Funktion
entspricht (MUTSCHLER 1991).
Abb. 1.1: exponentielle Darstellung des Abb. 1.2: halblogarithmische Darstellung des
Konzentrations-Zeit-Verhältnisses Konzentrations-Zeit-Verhältnisses
Die Eliminationshalbwertzeit (Plasma-HWZ, t1/2) ist die Zeit, in der die Plasmakonzentration
um die Hälfte des ursprünglichen Wertes abfällt. Sie ist nach folgender Gleichung zu
errechnen:
24 Literaturübersicht
t1/2 = ek2ln
[3]
Die HWZ ist ein wichtiger pharmakokinetischer Parameter. Sie liefert die Grundlage für die
Dosierungsberechnung und Dosierungsintervallen bei wiederholten Arzneimittelgaben
(MUTSCHLER 1991). Mit Kenntnis der HWZ kann ungefähr die Zeitspanne abgeschätzt
werden, innerhalb der eine Substanz ausgeschieden ist und bei einer Wettkampfteilnahme
nicht zu einem positiven Dopingergebnis führen sollte. Nach TOBIN und WOODS (1989)
soll theoretisch nach der ersten HWZ 50% einer Dosis und innerhalb der zweiten HWZ 75%
einer Dosis ausgeschieden sein. Zur völligen Clearance benötigt das Pferd ca. 70
Eliminationshalbwertzeiten (KLAUS und HAPKE 1994).
2.6.2. Zweikompartiment-Modell – Kinetik nach i.v. Injektion
Bei einem Zweikompartiment-Modell wird angenommen, dass sich das Pharmakon nach der
Applikation zunächst gleichmäßig in einem zentralen Kompartiment (Plasma oder gut
durchblutete Organe) verteilt, und von dort in das periphere Kompartiment (schlechter
durchblutete Gewebe, wie z.B. Muskulatur, Fettgewebe) übergeht. Die Elimination findet
nach Rücktransfer der Substanz in das zentrale Kompartiment ausschließlich aus diesem statt.
Charakteristisch für die Kinetik nach einer i.v. Injektion, die mit dem Zweikompartiment-
Modell beschrieben werden soll, ist, dass bei halblogarithmischer Darstellung die
Plasmakonzentrationswerte zunächst rasch abfallen und anschließend auf einer weniger steil
verlaufenden Geraden liegen (MUTSCHLER 1991).
Abbildung 2 und die Gleichung [4] beschreiben die Blutspiegelkonzentration (C) im
Zweikompartiment-Modell:
C = C1 � e- �1� t + C2 � e- �z� t [4]
25 Literaturübersicht
Abb. 2: lineare (linke Abb.) und halblogarithmische (rechte Abb.) Darstellung der
Plasmakonzentration (C) nach einmaliger intravenöser Applikation eines Pharmakons als Funktion der
Zeit (t) im Zweikompartiment-Modell
Nach Abbildung 2 sind �1 und �z sogenannte Hybridkonstanten, d.h., sie gehen sowohl –
daher die Bezeichnung – auf Verteilungs- als auch auf Eliminationsprozesse ein; �1
charakterisiert vorwiegend die Geschwindigkeit der Verteilung und Elimination und �z
vorwiegend die Geschwindigkeit der Elimination nach Erreichen sogenannter Steady-State-
Bedingungen. Durch Einsetzen der Eliminationskonstanten �z in Gleichung [4] kann die
terminale HWZ errechnet werden. Extrapoliert man die durch �z beschriebene Gerade auf die
Ordinate, so stellt der Schnittpunkt die Konzentration C2 nach Erreichen des
Verteilungsgleichgewichtes dar. Die initiale Phase der Verteilung und die beginnende
Ausscheidung werden durch den Schnittpunkt der Geraden mit der Steigung �1 und der
Ordinate durch die Konzentration C1 in Abb. 2 dargestellt. Addiert man die Konzentrationen
C1 und C2 erhält man die fiktive Anfangskonzentration C0 im Plasma (Konzentration im
zentralen Kompartiment) unmittelbar nach intravenöser Applikation.
Von DERENDORF et al. (2002) wird ein Dreikompartiment-Model beschrieben. Hierbei wird
zusätzlich ein „ tiefes“ Kompartiment angenommen, wenn der Substanzaustausch zwischen
einem peripheren und zentralen Kompartiment sehr lange dauert. Bei einem „ flachen“
Kompartiment stellt sich hingegen schnell ein Verteilungsgleichgewicht mit dem zentralen
Kompartiment ein.
Die pharmakokinetischen Kompartimente entsprechen in den meisten Fällen nicht einem
anatomisch definierten Verteilungsraum im Organismus, sondern stellen zumeist fiktive
Größen dar. Demzufolge wurde versucht, physiologisch realistischere kinetische Modelle,
sogenannte physiologische pharmakokinetische Modelle, zu entwickeln. Bei diesen wurden
26 Literaturübersicht
anatomische, physiologische und physikochemische Parameter deutlicher berücksichtigt. Ein
solches Modell besteht aus einer Reihe hinter- oder nebeneinander geschalteter
Kompartimente (Organe, Körperregionen), die reine Verteilungsräume darstellen oder
zusätzlich eleminierende Funktion aufweisen können. Hierbei wird der Konzentrations-Zeit-
Verlauf in den einzelnen Organen in erster Linie durch den sie versorgenden Blutfluss und die
jeweilige Exkretionsrate bestimmt (MUTSCHLER 1991).
2.6.3. Bioverfügbarkeit
Geschwindigkeit und Ausmaß, womit ein Wirkstoff aus einer Arzneiform freigesetzt,
resorbiert und am Wirkort verfügbar wird, wird als Bioverfügbarkeit (F) bezeichnet. Da die
Bioverfügbarkeit in den meisten Fällen am Wirkort nicht bestimmt werden kann, wird sie aus
im Plasma oder Urin gemessenen Konzentrationen ermittelt. Bei intravenöser Applikation ist
die Bioverfügbarkeit mit 100% anzunehmen. Wird ein Arzneimittel extravasal (z.B. peroral
(p.o.), intramuskulär (i.m.), subkutan (s.c.)) verabreicht, müssen Faktoren, die die
Bioverfügbarkeit beeinflussen berücksichtigt werden. Dazu zählen beispielsweise
Geschwindigkeit der Wirkstofffreisetzung aus der galenischen Zubereitung, die
Resorptionsgeschwindigkeit und die Resorptionsquote des freigesetzten Wirkstoffs sowie das
Ausmaß des sogenannten First-pass-Effekts. In welchem Ausmaß ein Wirkstoff aus dem
Gastrointestinaltrakt resorbiert wird, ist von seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften,
der intestinalen Durchblutung, der Größe der Resorptionsoberfläche des Darmes, der
Darmenzymaktivität oder der Interaktion mit anderen die Resorption beeinflussenden
Substanzen abhängig (BENET et al. 1996). Bevor ein durch die Magen- und
Dünndarmschleimhaut resorbierter Wirkstoff das Herz und somit Lungen- und
Körperkreislauf erreicht, gelangt er über die Pfortader in die Leber. Der First-pass-Effekt
bestimmt den Wirkstoffanteil, der bei dieser ersten Passage metabolisiert oder von der Leber
zurückgehalten wird. Folglich ist die Bioverfügbarkeit nach extravasaler Applikation geringer
als 100% (MUTSCHLER 1991). Praktisch bestimmt man die Bioverfügbarkeit, indem ein
Wirkstoff zunächst i.v. appliziert wird, um die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Die gleiche
Dosis dieses Wirkstoffes wird dann extravasal, z.B. oral appliziert. Nach Berechnung der
Flächen unter beiden Plasma-Konzentrations-Zeit-Kurven (Area under the curve – AUC), die
ein Maß für die Konzentration im Organismus darstellen, kann die Bioverfügbarkeit nach
folgender Gleichung berechnet werden:
27 Literaturübersicht
F = [%]100..⋅
vAUCiAUCx
[5]
AUCx = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve bei extravasaler, z.B. oraler
Applikationsweise
AUCi.v. = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve nach i.v. Injektion
Die AUC kann nach Gleichung [6] wie folgt berechnet werden, indem die in die Blutbahn
gelangte Substanzmenge (M) durch die totale Clearance (Cl) (siehe 2.6.5) dividiert wird:
AUC = ClM
[µg/ml*h] [6]
2.6.4. Verteilungsvolumen
Das Verteilungsvolumen ( Vd ) gibt an, in welchem Volumen sich eine Substanz bei einer
gemessenen Konzentration verteilen würde (scheinbares Verteilungsvolumen) (GLADTKE
und VON HATTINGBERG 1977). Unter Annahme eines Einkompartiment-Modells (bei
Kinetik 1. Ordnung), bei dem sich der gesamte Organismus wie ein Verteilungsraum verhält,
entspricht es bei rascher intravenöser Injektion dem Quotienten aus der applizierten
Wirkstoffmenge (D) [g] und der initialen Anfangskonzentration (C0) [g/l] (MUTSCHLER
1991).
Vd = ][0
lCD
[7]
Allgemein ist es aufgrund der Speziesvielfalt günstiger, ein relatives Verteilungsvolumen
(V`d) zu erheben. Dieses berechnet sich entsprechend der Gleichung [7] mit dem Unterschied,
dass die Dosierung in mg/kg KGW und demzufolge V`d in l/kg angegeben wird (FREY
2002).
Das Verteilungsvolumen kann identisch sein mit dem Plasmavolumen, der extrazellulären
Flüssigkeit oder dem Gasamtkörperwasser. Es kann aber auch vielfach größer sein als das
Gesamtvolumen des Körpers, wenn eine Substanz sich in einem bestimmten Gewebe
anreichert (KIETZMANN 1983). Somit ist das Verteilungsvolumen initial nach intravenöser
28 Literaturübersicht
Applikation gering, da sich die gesamte Substanzmenge in der Blutbahn befindet. Es
vergrößert sich mit zunehmender Verteilung in die verschiedenen Gewebe (MUTSCHLER
1991). Demzufolge stellt es einen Proportionalitätsfaktor zwischen der applizierten
Wirkstoffmenge (D) und der Plasmakonzentration (C) dar (FICHTL 2001). Desweiteren
verteilt sich eine intravenös verabreichte Substanz aus der Blutbahn in die Gewebe. Nach
Abschluss der Verteilungsphase stellt sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen Plasma
und Gewebe ein, das als Verteilungsvolumen im Steady State (Vss) bezeichnet wird. Das
Verteilungsvolumen im Steady Stae ist höher als das Verteilungsvolumen der Initialphase, da
sich nur noch ein geringer Teil der Substanz im Plasma (zentrales Kompartiment) und ein
größerer Teil in den Geweben (peripheres Kompartiment) befindet. Das Verteilungsvolumen
im Steady State (Vss) wird entsprechend Gleichung [8] berechnet. kcp und kpc stellen dabei
sogenannte Transferkonstanten zwischen dem zentralen und dem peripheren Kompartiment
dar.
Vss = ��
�
�
��
�
�+
pc
cp
k
k1 * Vc [l/kg] [8]
Durch Verteilung der Substanz in ein peripheres Kompartiment, kommt es im zentralen
Kompartiment zur Abnahme der Konzentration, wodurch sich ein Konzentrationsgradient
zwischen beiden Verteilungsräumen bildet. Folglich diffundiert die Substanz aus dem
peripheren in den zentralen Verteilungsraum, wobei es zu einem linearen
Konzentrationsabfall im peripheren Kompartiment kommt, der wiederum durch die
Hybridkonstante der Elimination (�) dargestellt wird. Dieser Zustand wird als sogenannter
Pseudo-Steady-State bezeichnet. Das entsprechende Verteilungsvolumen in der
Eliminationsphase (Vd�) wird nach Gleichung [9], in der CL der Clearance entspricht, wie
folgt berechnet (DERENDORF et al. 2002):
Vd� = β
CL[l/kg] [9]
29 Literaturübersicht
2.6.5. Clearance
Die Ausscheidung eines Pharmakons und/oder seiner Metaboliten führt zu einer
Konzentrationsabnahme des Wirkstoffes im Organismus. Vorgegeben durch die physikalisch-
chemischen Eigenschaften (Molekulargewicht, pKa-Wert, Löslichkeit, Dampfdruck) der zu
eliminierenden Substanz, erfolgt die Ausscheidung renal (mit dem Urin), biliär und intestinal
(mit den Fäzes) oder pulmonal (mit der Atemluft). Bei laktierenden Tieren kann die Substanz
zudem mit der Milch ausgeschieden werden (MUTSCHLER 1991). Weitere
Ausscheidungswege, wie z.B. über die Haut, Einbau in Haaren, Schweiß oder Speichel sind
quantitativ meist zu vernachlässigen (BENET et al. 1996).
Die Clearance (CL) bezeichnet das Plasmavolumen, das pro Zeiteinheit von einem
Pharmakon befreit wird. Sie wird entsprechend der Gleichung [10] bestimmt durch den
Quotienten der Dosis und der Fläche unter der Kurve (MUTSCHLER 1991):
CL = AUC
D [10]
Da zumeist mehrere Organe an der Elimination eines Pharmakons aus dem Organismus
beteiligt sind, setzt sich die totale Körperclearance (CLT) aus mehreren Clearances
zusammen. Die wichtigsten sind die hepatische (CLH) und die renale Clearance (CLR).
CLT = CLR + CLH + CLX [11]
CLX = weitere Clearances
Die Organclearance stellt das Produkt der Organdurchblutung (Q) und dem
Extraktionsquotienten (E) dar:
CLOrgan = Q � E [12]
Der Extraktionsquotient (E) kann wie folgt bestimmt werden:
E = (Carteriell – Cvenös)/Carteriell [13]
30 Literaturübersicht
Demnach ergibt sich für die hepatische Clearance:
CLH = QH � EH [14]
Da vor allem lipophile Substanzen nur sehr langsam oder kaum renal ausgeschieden werden,
werden sie im Organismus durch verschiedene Enzymsysteme in hydrophilere, leichter
ausscheidbare Stoffe metabolisiert. Diese Umwandlungsprozesse von Fremdstoffen werden
als Biotransformation bezeichnet; sie laufen hauptsächlich in der Leber ab. In sogenannten
Phase-I-Reaktionen werden Wirkstoffmoleküle enzymatisch (oxidativ, reduktiv oder
hydrolytisch) verändert. Bei den Phase-II-Reaktionen erfolgt eine Konjugation (Kopplung)
des Wirkstoffmoleküls bzw. eines durch Phase-I-Reaktion entstandenen Metaboliten an eine
körpereigene Substanz (z.B. Glucuron-, Essig- oder Schwefelsäure, Aminosäuren)
(MUTSCHLER 1991). Die Konjugationsprodukte können aufgrund ihrer Hydrophilie
schneller ausgeschieden werden (FREY 2002). Die hepatische Clearance wird durch das Maß
der Metabolisierung und der biliären Sekretion bestimmt (SAMS 1996).
Die renale Clearance (CLR) ist der Anteil des renalen Plasmaflusses, der pro Zeiteinheit von
einem Wirkstoff befreit wird (MUTSCHLER 1991). Sie ist abhängig von der Konzentration
des Pharmakons im Plasma (CP) und im Urin (CU) sowie vom Umfang der Harnbildung (urine
flow rate) und wird nach folgender Gleichung bestimmt (SCHOENE 1996):
CLR = (CU � urine flow rate)/CP [ml/min] [15]
Theoretisch besteht nach dieser Gleichung eine Proportionalität zwischen der
Wirkstoffkonzentration im Plasma und Urin bei konstanter renaler Clearance und konstanter
Flussrate des Urins. Praktisch werden bei Blasenentleerungen nicht immer konstant gleiche
Mengen Urin abgesetzt, so dass unterschiedliche Urinkonzentrationen in der Blase
„ gespeichert“ werden (SAMS 1996, TOBIN et al. 1999). Daher ist ein Rückschluß von der
Urinkonzentration auf die Plasmakonzentration oft ungenau. Zudem ist das Ausmaß der
renalen Elimination oft Schwankungen, beispielsweise bedingt durch Veränderung der
Nierendurchblutung, des pH-Wertes und gegebenenfalls nach Diuretikaverabreichung,
unterlegen. Der physiologische pH-Wert liegt beim Pferd im Stand der Ruhe im leicht
alkalischen Bereich von pH 7 bis 8 (SCHOENE 1996). Der Urin-pH-Wert ist von
verschiedenen Faktoren, wie z.B. der Ernährung oder intensiver körperlicher Anstrengung
31 Literaturübersicht
abhängig (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999). Nach MOOS und HAYWOOD (1973)
produzieren im Training stehende Vollblutpferde eher einen sauren Harn, der durch vermehrte
Bildung und Ausscheidung saurer Stoffwechselendprodukte bedingt ist. Über einen Zeitraum
von 1 bis 1,5 Stunden nach intensivem Training soll es nach GERKEN et al. (1991) zu einem
pH-Wertabfall um ein bis drei Einheiten kommen. Zahlreiche Arzneimittel sind schwache
Säuren oder Basen, deren Ionisierungsgrad pH-abhängig ist (FREY 2002). Je niedriger der
Urin-pH-Wert ist, um so langsamer werden „ saure“ Arzneimittel ausgeschieden, während
„ basische“ Arzneimittel dann vermehrt ionisiert vorliegen, nicht rückresorbiert und somit
schneller ausgeschieden werden (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999, FREY 2002,
MUTSCHLER 1991, SCHOENE 1996). Nach körperlicher Anstrengung kommt es
physiologisch zu einer kurzzeitig gesteigerten Diurese. Die Ausscheidung von normalerweise
stark rückresorbierter Pharmaka steigt, was aber bei gleichzeitig vermehrter
Flüssigkeitsausscheidung keine Konzentrationsänderung dieser Substanzen im Urin bewirkt.
Normalerweise nicht tubulär rückresorbierten Pharmaka sind aufgrund einer
leistungsinduzierten Diurese vorübergehend verringert im Urin vorhanden. Damit ergibt sich
für „ saure“ Arzneimittel eine eventuelle Verdeckung eines positiven Dopingbefundes, da
Dopingproben gewöhnlich unmittelbar nach dem Wettkampf gewonnen werden (SCHOENE
1996).
2.7. Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID)
Pharmaka zur Beeinflussung von Entzündungen werden unter dem Begriff Antiphlogistika
zusammengefasst. In Abgrenzung zu den Kortikosteroiden gehören aromatische organische
Säuren ohne Steroidgerüst zu den nicht-steroidalen Antiphlogistika. Entzündungshemmende
Wirkstoffe greifen auf unterschiedlichen Ebenen in die „ Pathophysiologie“ der Entzündung
ein, indem sie beispielsweise die Freisetzung von Entzündungsmediatoren beeinflussen,
überschießende Immunreaktionen unterdrücken oder degenerative Prozesse abschwächen.
Entzündungen sind primär eine physiologische Antwort des Organismus auf bestimmte Reize.
Sie zeigen zumeist ohne Einsatz von Antiphlogistika eine hohe Spontanheilungsrate, wenn
die auslösende Noxe beseitigt wird. Da die Anwendung entzündungshemmender Wirkstoffe
eine rein symptomatische Therapie darstellt, ist sie indiziert, wenn die eigentliche Ursache
nicht zu beheben ist und/oder überschießende Entzündungsreaktionen eine Verschlimmerung
32 Literaturübersicht
des Krankheitszustandes herbeiführen würden (UNGEMACH 2002). Aufgrund einzelner
Wirkkomponenten können die NSAID in zwei Gruppen eingeteilt werden:
- Wirkstoffe mit deutlicher zentraler analgetischer und antipyretischer, aber nur geringer
entzündungshemmender Wirkung, und
- Wirkstoffe mit vorwiegend peripher entzündungshemmenden Eigenschaften, aber nur
geringer antipyretischer Wirkung
Anwendungsgebiete für NSAID sind in der Veterinärmedizin akute schmerzhafte
Entzündungsprozesse besonders des Bewegungsapparates und auch durch Endotoxine
bedingte Krankheitszustände. Hier werden sie in erster Linie bei Pferden und Hunden zur
Behandung entzündlich muskuloskelettaler Erkrankungen, wie Arthritiden, Myalgien,
Erkrankungen des Bänderapparates, als auch zur Fiebersenkung und Kolikbehandlung
eingesetzt (UNGEMACH 2002). Seit Beginn der Anwendung der NSAID besteht eine
fortwährende Diskussion um Vor- und Nachteile ihres Gebrauchs (KLAUS und HAPKE
1994). Zu den NSAID gehören vorwiegend folgende Substanzgruppen: Pyrazolidine und
Pyrazolone (Phenylbutazon, Oxyphenbutazon, Suxibuzon, Metamizol),
Indolessigsäurederivate (Indometacin, Diclofenac), Arylpropionsäurederivate (Naproxen,
Ibuprofen, Ketoprofen, Carprofen, Vedaprofen), Fenamate (Meclofenaminsäure, Flunixin-
Meglumin, Tolfenaminsäure), Oxicame (Meloxicam, Piroxicam), Salicylsäure-Derivate
(Acetylsalicylsäure), Anilin-Derivate (Paracetamol) (KLAUS und HAPKE 1994,
KIETZMANN et al. 2002, UNGEMACH 2002).
2.7.1. Mediatoren der Entzündung
Die Entzündung (Inflammatio) ist eine Reaktion des Organismus auf vorrangig von außen
einwirkende Noxen. Nach Reizung kommt es zu Störungen des Gewebestoffwechsels, in
dessen Gefolge die Kardinalsymptome einer Entzündung zu beobachten sind:
• Rubor - Rötung durch Hyperämie
• Calor - Temperaturanstieg
• Tumor – Schwellung durch Exsudation
• Dolor - Schmerz
• Functio laesa - Funktionsbeeinträchtigung
33 Literaturübersicht
Bei der Entstehung dieser Symptome spielen Mediatoren der Entzündung eine große Rolle
(GOLBS und SCHERKL 1996). Als Reaktion auf eine Zellschädigung wird das Enzym
Phosholipase A2 aktiviert, welches Arachidonsäure aus Phospholipiden der Zellmembran
freisetzt (KLAUS und HAPKE 1994). Arachidonsäure kann auf zwei enzymatischen
Hauptwegen, dem Cyclooxygenase- und dem Lipoxygenase-Weg, zu zahlreichen
Mediatorsubstanzen umgewandelt werden (MUTSCHLER 1991).
Von dem Enzym Cyclooxgenase existieren Isoformen, von denen die COX-1
physiologischerweise (konstitutiv) in hohen Konzentrationen, beispielsweise in der
Magenschleimhaut und in der Niere gebildet wird. Die COX-2 entspricht einem durch
entzündliche Faktoren induzierbaren Enzym, welches sich durch fortschreitende entzündliche
Prozesse fortlaufend im peripheren Entzündungsgebiet anreichert. Dieses Phänomen hat die
Forschung auf Entwicklung selektiver COX-2-Hemmstoffe ausgerichtet, die die durch
NSAID hervorgerufenen Nebenwirkungen möglichst gering halten sollen (KIETZMANN et
al. 2002).
Nach Katalyse durch die Cyclooxygenase entsteht zunächst das Prostaglandinendoperoxid
PGG2, welches wiederum durch eine Peroxidase zu einem weiteren
Prostaglandinendoperoxid, dem PGH2 , umgewandelt wird. Aus PGH2 entstehen
verschiedene Prostaglandine, Thromboxan A2 und Prostacyclin. Die Wirkungen der in fast
allen Geweben vorkommenden Prostaglandine sind außerordentlich komplex, wobei die
verschiedenen Substanzen teilweise synergistisches, teilweise antagonistisches Verhalten
zeigen. Beispiele für ihre Wirkungen sind: Dilatation/Kontraktion glatter Muskulatur (z.B.
Gefäße, Bronchien, Gastrointestinal-Trakt, Uterus), Hemmung/Förderung der
Thrombozytenaggregation, Hemmung der Magensaftsekretion, Verstärkung der Effekte
anderer Mediatoren bezüglich der Gefäßpermeabilität und Schmerzempfindung,
Fieberentstehung durch Wirkung auf den Hypothalamus, Förderung der Nierendurchblutung,
Luteolyse, Steigerung der Spermienaktivität (MUTSCHLER 1991). Thromboxan A2 wird von
Thrombozyten produziert und fördert ihre Aggregation. Zudem werden ihm vaso- und
bronchokonstriktorische Wirksamkeit zugeschrieben, wodurch es einen Antagonisten des
Prostacyclins darstellt. Das im Gefäßendothel vorkommende Prostacyclin besitzt zudem
broncho- und vasodilatatorische und thrombozytenaggregationshemmende Wirkung
(MUTSCHLER 1991).
Wird die Arachidonsäure durch das Enzym Lipoxygenase katalysiert, entsteht zunächst
Hydroxyperoxyarachidonsäure, die wiederum enzymatisch zu Hydroxyperoxy- (HPETE) und
34 Literaturübersicht
weiter zu Hydroxyarachidonsäure (HETE) sowie zu Leukotrienen umgesetzt wird (KLAUS
und HAPKE 1994). Das Leukotrien B4 wirkt leukotaktisch, die Leukotriene C4, D4 und E4
hingegen bronchokonstriktorisch. Letztere besitzen diesbezüglich im Vergleich zu Histamin
eine 1000-fach stärkere Wirksamkeit. Allerdings tritt ihre Wirkung langsamer ein als die
anderer Mediatoren. Desweiteren werden ihnen vasokonstriktorische Effekte zugeschrieben.
Beim enzymatischen Abbau der Hydroperoxide entstehen Sauerstoffradikale, die zu
Denaturierung von Enzymen, Schädigung von Zellmembranen, Depolimerisation von
Bindegewebssubstanzen (Kollagen, Hyaluronsäure) sowie zu erhöhter Gefäßpermeabilität
führen können (MUTSCHLER 1991). Abbildung (3) stellt die Arachidonsäurekaskade dar.
Abb. 3: Biosynthese von Produkten der Arachidonsäure (Arachidonsäurekaskade) nach GOLBS und
SCHERKL (1996)
35 Literaturübersicht
2.7.2. Wirkungsmechanismus der NSAID
Die NSAID besitzen antiphlogistische, analgetische und antipyretische Wirkqualitäten, wobei
die einzelnen Wirkkomponenten bei den verschiedenen NSAID sehr unterschiedlich
ausgeprägt sind. Die wichtigste pharmakodynamische Wirkung besteht in der Hemmung der
Cyclooxygenase (COX) und damit der Synthese von Prostaglandinen, Thromboxan A2 und
Prostacyclin (KIETZMANN et al. 2002). Folglich werden die Kardinalsymptome der
Entzündung durch Reduktion der Vasodilatation, Kapilarpermeabilität, der Chemotaxis und
der Sensibilisierung der Schmerzrezeptoren gegenüber Kininen und Histamin abgeschwächt
oder beseitigt (UNGEMACH 2002). Durch Blockade der Thromboxan A2 –Bildung werden
hämostatische Prozesse verhindert und eine antithrombotische Wirksamkeit erzielt (KLAUS
und HAPKE 1994).
Ein weiterer antiinflammatorischer Mechanismus, der nicht auf Hemmung der
Prostaglandinsynthese beruht, sondern der eine Einlagerung der NSAID in zelluläre
Membranen und das Abfangen von Sauerstoffradikalen darstellt, wird diskutiert. Dieses soll
u.a. eine Aggregationshemmung von Granulozyten und Stabilisierung von
Lysosomenmembranen bewirken. Zusätzlich soll einer übermäßigen Bildung von
Mucopolysacchariden und damit einer Bindegewebsproliferation entgegengewirkt werden
(KIETZMANN et al. 2002, UNGEMACH 2002).
2.7.3. Pharmakokinetik der NSAID
Nach oraler Verabreichung werden NSAID im Gastrointestinaltrakt im allgemeinen gut
resorbiert und besitzen eine hohe Bioverfügbarkeit. Bei zeitgleicher Fütterung kann die
Resorption verzögert sein (KLAUS und HAPKE 1994, KIETZMANN et al. 2002). NSAID
zeigen aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften eine hohe Bindung an
Plasmaproteine (über 90%) und damit ein geringes scheinbares Verteilungsvolumen.
Chemisch stellen die meisten NSAID schwache Säuren dar, deren pKa-Wert zwischen 3 bis 5
liegt und eine gute Penetration in entzündliches Gewebe ermöglicht (KLAUS und HAPKE
1994, UNGEMACH 2002). NSAID sind in diesen Geweben noch vorhanden, wenn sie im
Plasma nicht mehr nachgewiesen werden können (KLAUS und HAPKE 1994). Die
Elimination aus entzündlichem Gewebe, welches kinetisch ein tiefes Kompartiment darstellt,
36 Literaturübersicht
erfolgt entsprechend langsam, so dass direkt am Ort der Wirkung über längere Zeit wirksame
Konzentrationen aufrechterhalten werden, während die Konzentration im Plasma (besonders
beim Pferd) relativ schnell absinkt. Im Entzündungsexsudat und in der Synovia von
Gelenken konnten beim Pferd für Phenylbutazon und Flunixin Konzentrationen festgestellt
werden, die über denen im Plasma lagen und zudem länger als 24 Stunden wirksam waren
(KLAUS und HAPKE 1994, UNGEMACH 2002). NSAID-Plasmaspiegel sind somit kein
eindeutiger Hinweis auf das Maß ihrer therapeutischen Aktivität (KLAUS und HAPKE
1994). Die Diskrepanz zwischen kurzer Halbwertzeit im Plasma und längerer Wirksamkeit
der NSAID lässt sich auch durch teilweise irreversible Hemmung der Cyclooxygenase und
der besonderen Affinität dieser Substanzen zu bestimmten (entzündeten) Geweben erklären
(UNGEMACH 2002). Zudem kommt es zu einer Akkumulation in entzündetem Geweben.
Nach KLAUS und HAPKE (1994) ist die Wirkdauer der NSAID kürzer als die Zeit für die
Neubildung der Cyclooxygenase. Dosierungen der NSAID dürfen nicht allein aufgrund der
Plasmahalbwertzeit berechnet werden, sondern vorwiegend nach der Gewebekinetik bzw.
Wirkung (KIETZMANN et al. 2002).
Flunixin ist in therapeutischer Dosierung beim Pferd das NSAID mit der größten relativen
Wirksamkeit, die dann weiter über Meclofenaminsäure, Phenylbutazon, Naproxen bis hin zu
den Salicylaten abnimmt (LEES und HIGGENS 1985).
Die Elimination der NSAID erfolgt größtenteils renal, wobei Speziesunterschiede bestehen.
Allgemein ist die renale Elimination aller NSAID bei Absinken des Harn-pH-Wertes in den
sauren Bereich verzögert.
2.7.4. Nebenwirkungen der NSAID
Wichtige unerwünschte Wirkungen begründen sich auf die Hemmung der COX-1 und damit
auf Hemmung der systemischen Prostaglandinsynthese, die von der erwünschten Hemmung
der COX-2 lokal im Entzündungsgebiet nicht komplett zu trennen ist. Alle Cyclooxygenase-
Hemmstoffe besitzen demnach ein gleiches qualitatives Spektrum an Nebenwirkungen
(KIETZMANN et al. 2002). Als Nebenwirkungen können auftreten:
• Reizungen bis hin zu Ulzerationen der Schleimhaut des Gastrointestinal-Traktes: Das
Vorhandensein vasodilatatorisch wirksamer Prostaglandine ist deutlich herabgesetzt,
37 Literaturübersicht
so dass es zu lokaler Ischämie in diesem Bereich kommt, die hier eine
Gewebeschädigung begünstigt. Geringere Konzentration des Prostaglandin E2 und
des zytoprotektiv wirkenden Prostacyclins bewirken eine vermehrte Sekretion von
Magensäure und eine verminderte Schleimsekretion. Beides verstärkt die
Schleimhautreizung. Zudem führt die Anreicherung der NSAID aufgrund ihres pKa-
Wertes in den Mukosazellen (pH-Falle) zu einer weiteren Reizung der Schleimhaut.
Mit dieser Nebenwirkung ist sowohl nach oraler als auch nach parenteraler
Applikation der NSAID bereits im therapeutischen Dosierungsbereich (besonders bei
Endoparasitenbefall) zu rechnen (UNGEMACH 2002). Diese Art der Nebenwirkung
äußert sich in Erbrechen, abdominalen Schmerzerscheinungen, Durchfällen,
Verstopfung, punktförmige Blutungen der Schleimhaut bis hin zu Ulzeration und
Perforation.
• Gefahr von Blutungen: Durch Hemmung der Thromboxansynthese ist durch
Hemmung der Thrombozytenaggregation die Blutgerinnung verzögert/ herabgesetzt.
Dieses betrifft besonders die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes. Ein weiteres
Risiko stellen Notfalloperationen, wie z.B. eine Kolikoperation dar, wenn zuvor ein
NSAID in hoher Dosierung über einen längeren Zeitraum verabreicht wurde kann es
bis hin zum Verbluten des Patienten führen (SCHOENE 1996).
• Blutbildveränderungen: Besonders bei Mensch und Pferd kann es nach längerer
Anwendung (hoher Dosierungen) zu Blutbildveränderungen in Form von
Thrombozytopenie und Leukozytopenie kommen, so dass bei längerer
Behandlungsdauer eine Kontrolle des Blutbildes erforderlich ist (UNGEMACH 2002).
• Beeinträchtigung der Nierenfunktion: Vermutlich kommt es durch eine verminderte
Prostacyclin- und Prostaglandin E2-Konzentration zu einer verminderten
Durchblutung der Nieren. Wasser- und Salzretention können gelegentlich zu
Nierenschäden (Papillarnekrose) und sekundär zu Ödembildung oder zur
Dekompensation einer bestehenden Herzinsuffizienz führen (KIETZMANN et al.
2002, UNGEMACH 2002).
• Bronchospasmus: Durch Hemmung der Prostaglandinsynthese aus der Arachidonsäure
läuft kompensatorisch der Lipoxygenaseweg verstärkt, wodurch vermehrt
bronchokonstriktorisch wirksame Leukotriene gebildet werden. Dieses Phänomen
wird in der Humanmedizin als „ Aspirin-Asthma“ bezeichnet (UNGEMACH 1997).
• Wirkungsbeeinträchtigung anderer Arzneimittel: NSAID gehen eine hohe
Plasmaproteinbindung ein, wodurch sie andere Arzneimittel aus der Proteinbindung
38 Literaturübersicht
verdrängen und dadurch deren Wirksamheit letztlich verstärken können
(KIETZMANN et al. 2002).
Mit Entwicklung von selektiven COX-2-Hemmstoffen, wie sie in der Humanmedizin,
vertreten durch die Wirkstoffe Celeccoxib und Rofecoxib, bei aktivierter Arthrose und
Polyarthritis angewendet werden, erhofft sich die Tiermedizin eine Reduzierung der durch die
COX-1 bedingten gastrointestinalen Nebenwirkungen (KIETZMANN et al. 2002). Beispiel
einer Neuzulassung im Veterinärbereich ist der Wirkstoff Firocoxib, der sich jedoch noch
nicht im Handel befindet (persönliche Mitteilung Prof. Dr. KIETZMANN).
2.7.5. Metamizol
2.7.5.1. Metamizol - Pharmakodynamik
Synonyme für Metamizol sind Noraminopyrinmethansulfonat und Novaminsulfon. Im
Englischen wird es als Dipyron bezeichnet (EBERT et al. 2002). Metamizol ist ein
wasserlösliches Pyrazolon-Derivat, welches seit 1922 für seine gute analgetische,
antipyretische und spasmolytische Wirksamkeit bekannt ist (LEVY et al. 1995). Die
klinische Relevanz einer antiinflammatorischen Wirksamkeit, die auf die Hemmung der
COX-2 zurückgeführt wird, ist nach CAMPOS et al. (1999) und LEVY et al. (1995) fraglich.
Aufgrund seiner analgetischen und spasmolytischen Wirkkomponente wird Metamizol zur
Behandlung von Spasmen der glatten Muskulatur des Magen- und Darm-Traktes (besonders
bei Kolik) und anderer Bauchhöhlenorgane (Gallengänge, Gallenblase, Harnapparat) als auch
zur Behebung eines Spasmus bei Schlundverstopfung angewendet (LEVY et al. 1995,
LÖSCHER 2002). Weitere Indikationen sind Fieber, geringgradige Schmerzzustände bei
Muskel- und Gelenkerkrankungen, postoperative Wundschmerzen als auch Schmerzkontrolle
bei Tumorpatienten (LEVY et al. 1995, EBERT et al. 2002). Im humanmedizinischen Bereich
steht Metamizol in Form von Tabletten, Sirup, Tropfen, Zäpfchen und Injektionslösung zur
Verfügung (LEVY et al. 1995). In der Veterinärmedizin ist es als Monopräparat in Form einer
50%igen Injektionslösung für Pferd, Rind, Schwein, Hund und Katze, als auch in
Tablettenform für Hunde zugelassen. Bei Rindern, Schweinen und Equiden darf Metamizol
laut EU-Höchstmengenverordnung angewendet werden. Die Dosierung beträgt bei allen
Tierarten 20 – 50 mg/kg KGW und wird i.m. oder langsam i.v. verabreicht. Bei Bedarf kann
die Applikation ein- oder zweimal täglich im Intervall von 8 Stunden wiederholt werden
39 Literaturübersicht
(EBERT et al. 2002). Metamizol besitzt im Vergleich zu anderen NSAID eine relativ große
therapeutische Breite. Bei Überdosierung kann es zu im Folgenden aufgezählten
Erscheinungen kommen, die symptomatisch zu behandeln sind: starker Speichelfluß,
Erbrechen, Kreislaufkollaps, zunächst erhöhte Atemfrequenz und Krämpfe, später Koma und
Atemlähmung (EBERT et al. 2002). Neben den für NSAID typischen Nebenwirkungen sind
beim Mensch Blutbildschäden bis hin zur Agranolozytose und anaphylaktischen Reaktionen
während/ unmittelbar nach intravenöser Injektion aufgetreten (LEVY et al. 1995, EBERT et
al. 2002). Aufgrund möglicher Nebenwirkungen ist der Wirkstoff Metamizol beispielsweise
in Schweden und den USA nicht zugelassen (LEVY et al. 1995). Laut EBERT et al. (2002)
sind nach mehrmaliger täglicher Applikation hoher Dosen Metamizol über mehrere Tage
beim Pferd Leukozytopenien aufgetreten. In einer Studie von BENTUR und COHNEN
(2004) ist beim Mensch auch nach längerer Verabreichung von Metamizol kein Fall von
Agranulozytose aufgetreten; das Auftreten einer Agranulozytose bringen die Autoren mit
geographischen Unterschieden in Zusammenhang. IBANEZ et al. (2004) erlangten ähnliche
Ergebnisse bezüglich der Ausbildung einer Agranulozytose nach Verbreichung von
Metamizol und machten sie zudem abhängig von Dosierungsmustern, Dauer der Anwendung
und Wechselwirkungen mit gleichzeitig verabreichten Wirkstoffen. TANYILDIZI und
BOZKURT (2003) untersuchten nach Verabreichung von 50 mg/kg Metamizol die
Hyaluronidase-Aktivität und Auswirkungen auf Spermien beim Widder mit dem Ergebnis,
das die Hyaluronidase-Aktivität und die Spermatozoenmobitlität zunahmen wobei die
Spermakonzentration und das Ejakulatvolumen über 6 Tage geringer waren. Folglich
erscheint der Einsatz von Metamizol bei Zuchttieren dieser Spezies während der Decksaison
ungeeignet.
SANZ et al. (2004) entwickelten ein flußzytometrisches Nachweisverfahren zur Bestimmung
der Basophilenaktivität und Sulfidoleukotriene im Blut für eine Invitro-Diagnose der
Hypersensitivität gegenüber Acetylsalicylsäure und anderen NSAID (u.a. Metamizol). Sollte
dieses Testverfahren mit einer Spezifität von über 90% klinisch zum Einsatz kommen, könnte
es hilfreich sein, allergische Reaktionen auf diese Substanzen im Vorfeld zu vermeiden.
2.7.5.2. Metamizol – Pharmakokinetik
Mit oral verabreichtem 14C-markierten Metamizol konnte gezeigt werden, dass es im Magen
sofort zu 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA) hydrolysiert und in dieser Form im Dünndarm
40 Literaturübersicht
resorbiert wird (LEVY et al. 1995). Sowohl nach oraler als auch nach i.v. Applikation wurden
ca. 90% der verabreichten Dosis mit dem Harn und ca. 10% mit den Faeces ausgeschieden.
Insgesamt waren mehr als 20 Metaboliten nachweisbar, von denen die 4 Hauptmetaboliten 4-
MAA, 4-Aminoantipyrin (AA), 4-Acetylaminoantipyrin (AAA) und 4-Formylaminoantipyrin
(FAA) ca. 60% der verabreichten Dosis darstellten.
Mit Einführung der HPLC konnten die 4 Hauptmetaboliten des Metamizols gleichzeitig im
Plasma bzw. Urin nachgewiesen werden (ASMARDI und JAMALIE 1983, DAMM 1989).
Nachfolgend wurden Studien bezüglich ihrer Pharmakokinetik durchgeführt (ROHDEWALD
et al. 1983, DAMM 1989). Im Humanbereich wurden die vier Hauptmetaboliten des
Metamizol vorwiegend mittels HPLC und UV-Detektion im Plasma, Urin und Speichel
nachgewiesen (LEVY et al.1995), während in Studien am Tier (insbesondere
Dopingnachweis) die Gaschromatographie mit Massenspektroskopie zur Untersuchung von
Pferde-Plasmaproben (SCHLINGLOFF 1997), bzw. Pferde-Urinproben (POPOT et al. 2000)
Anwendung fand.
Beim Mensch konnte nach oraler Applikation vom Metamizol dieses nicht in unveränderter
Form im Plasma und Urin nachgewiesen werden, während nach i.v. Injektion sehr geringe
Mengen unverändertes Metamizol zu finden waren (VOLZ und KELLNER 1980, ASMARDI
und JAMALIE 1985). Metamizol wird unmittelbar nach oraler Aufnahme im Magen
komplett, bzw. nach i.v. Injektion „ nur“ nahezu vollständig nichtenzymatisch zu 4-MAA
hydrolysiert. Somit beruhen pharmakokinetische Untersuchungen auf dem quantitativen
Nachweis des 4-MAA und weiterer Metaboliten (ASMARDI und JAMALI 1985, LEVY et
al. 1995, SCHLINGLOFF 1997). Abbildung 4 zeigt die chemische Struktur von Metamizol
und seiner vier Hauptmetaboliten.
41 Literaturübersicht
Abb. 4: Strukturformel von Metamizol (Dipyrone), 4-MAA, AA, FAA und AAA
Metamizol unterliegt zu einem hohen Prozentsatz einem First-pass-Effekt, in den ein bislang
nicht genau identifiziertes Cytochrome-P450-Isoenzym involviert ist (LEVY et al. 1995). 4-
MAA wird einerseits durch Desalkylierung zu AA, welches nach AGUNDEZ et al. (1994)
und LEVY et al. (1995) analgetische, antipyretische und antiphlogistische Wirksamkeit
besitzt, metabolisiert und weiter zu AAA alkyliert. Andererseits kann 4-MAA zu FAA
oxydiert werden (DAMM 1989, VLAHOV et al. 1990). Nach LEVY et al. (1995) sind für die
Bioverfügbarkeit von 4-MAA je nach Darreichungsform und Applikationsweise folgende
Werte ermittelt worden: 85% bei Tabletten, 89% bei Tropfen, 54% bei Zäpfchen, 87% nach
intramuskulärer Injektion. Die Absorption von 4-MAA erfolgt bei oraler Verabreichung und
gleichzeitiger Nahrungsaufnahme im Vergleich zur Nüchterneinnahme geringgradig
langsamer (FLUSSER et al. 1988). Die Plasmaproteinbindung, die mittels Ultrafiltration
ermittelt wurde, beträgt für 4-MAA 58%, 48% für AA, 18% für FAA und 14% für AAA
(ZYLBER-KATZ et al. 1985). Die höhere Proteinbindung von 4-MAA und AA im Vergleich
zu FAA und AAA ist durch ihre chemische Struktur erklärbar. Das geringe
Verteilungsvolumen ist von LEVY et al. (1995) nach intravenöser Injektion von Metamizol
mit 33,5 l bzw. nach oraler Applikation mit 1,19 l/kg angeben. ASMARDI und JAMALI
42 Literaturübersicht
(1985), SCHLINGLOFF (1997) und KLAUS et al. (1997) beschreiben nach i.v. Injektion
von Metamizol die Konzentrations-Zeit-Verhältisse von 4-MAA im Plasma mit einem
offenem Zweikompartiment-Modell. Nach unveröffentlichten Studien von LEVY et al.
(1995) passieren die Metaboliten des Metamizol die Blut-Hirn-Schranke und sind in der
Cerebrospinalflüssigkeit nachweisbar. Die vier Hauptmetaboliten konnten nach einmaliger
oraler Verabreichung einer therapeutischen Dosis bis 48 Stunden nach der Applikation (post
applicationem – p.a.) in der Muttermilch quantifiziert werden. Dabei wurde gezeigt, dass die
Konzentrationen der Metaboliten im Plasma und der Muttermilch korrelieren.
Untersuchungen von NEDDERMANN und ROHDEWALD (1988) zeigen, dass 4-MAA nach
oraler Gabe niedriger Metamizol-Dosierung als einziger der vier Hauptmetaboliten im
Speichel erscheint, wohingegen die übrigen erst nach höheren Dosierungen nachgewiesen
werden konnten. Die Metamizol-Konzentrationen des Speichels korrelieren mit dem Anteil
nichtproteingebundener Metaboliten im Plasma. Die HWZ der Elimination von 4-MAA aus
Plasma und Speichel ist nahezu identisch. Metamizol bzw. seine Metaboliten werden zu 90%
in nicht glucuronidierter Form mit dem Urin ausgeschieden. 4-MAA erscheint als erster der
Metaboliten im Urin und ist nicht mehr nachweisbar, während die anderen Hauptmetaboliten
noch detektierbar sind (ZYLBER-KATZ et al.1992). AAA und FAA sind beim Menschen
noch 48 Stunden nach der Applikation im Plasma und entsprechend länger im Urin messbar.
Die Prozentanteile der Gesamt-Metamizol-Dosis, die nach oraler Applikation im Urin
nachgewiesen wurden sind 2 – 4% für 4-MAA, 5 – 9% für AA, 21 – 27% für AAA und 11 –
23% für FAA (LEVY et al. 1995). Die HWZ von 4-MAA im Urin ist im Vergleich zu der im
Plasma länger (ZYLBER-KATZ et al. 1992). Es wird angenommen, dass nach i.v.
Applikation von Metamizol dieses zu einem geringen Teil im Plasma unverändert vorhanden
ist und erst in den Nieren zu 4-MAA verstoffwechselt wird. Beides erklärt eine „ kumulative“
renale Elimination von 4-MAA (LEVY et al. 1995). Kinder im Alter von 1 bis 11 Jahren
scheiden Metamizol-Metabliten schneller aus als Erwachsene, wobei ältere Menschen 4-
MAA zu 33% langsamer ausscheiden als jüngere. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der
Kinetik nach einmaliger Gabe von Metamizol sind nicht bekannt, obwohl LEVY et al. (1995)
eine unveröffentlichte Studie erwähnen, nach der Frauen 4-MAA und AA langsamer
eliminieren als Männer. Einfluss auf das Ausscheidungsverhalten wurden zudem bei Leber-
und Nierenerkrankungen diskutiert. Bei Patienten mit Leberzirrhose verläuft die
Metabolisierung von 4-MAA zu den weiteren Metaboliten in geringerem Maße, bedingt durch
die Reduktion der Demethylierungs-, Oxidierungs- und Acetylierungsreaktionen, ab.
Signifikante Unterschiede im Vergleich zu Gesunden sind durch folgende Veränderungen
43 Literaturübersicht
dargestellt: die Plasma-HWZ ist nahezu um einen Faktor 2 – 3 länger, die maximale
Plasmakonzentration ist geringer, die Zeit bis zum Erreichen maximaler Plasmaspiegel ist
annähernd verdoppelt, die nichtrenale Clearance ist deutlich herabgesetzt ( ca. um die Hälfte),
die renale Clearance ist ebenfalls geringer. Bei Lebererkrankungen korreliert (linear) die
verlängerte Plasma-HWZ mit leberspezifischen Parametern im Blut, wie z.B. dem
Serumalbumin, der Aspartat-Aminotransfersae (AST), der Alanin-Aminotransferase (ALT),
der Lactat-Dehydrogenase (LDH), der Alkalischen Phosphatase (ALKP), dem Total-Bilirubin
(TBil), dem Prothrombinwert (ZYLBER-KATZ et al. 1995). Bei Patienten mit chronischer
Niereninsuffizienz konnte nach i.v. Applikation von Metamizol eine geringgradig verlängerte
renale Clearance beobachtet werden. Dieses soll auf den unverstoffwechselt vorliegenden 4-
MAA Anteil nach i.v. Verabreichung, der erst in den Nieren metabolisiert wird,
zurückzuführen sein. Kardiovaskuläre Erkrankungen und Schocksymptomatik können eine
verminderte renale Eliminierung bedingen. Ansonsten ist eine verzögerte Gesamtclearance
zumeist in einer Beeinträchtigungen des Leberstoffwechsels begründet (HEINEMEYER et al.
1993, LEVY et al. 1995). Werden gleichzeitig mit Metamizol Neuroleptika, insbesondere
Phenothiazinderivate verabreicht, kann es zu schwerer Hypothermie kommen. Metamizol
reduziert beim Menschen die Furosemid-Clearance signifikant (ROSENKRANZ et al. 1992).
In Untersuchungen von BACRACHEVA et al. (1997) wurde der Einfluss einer
Verabreichung von Cimetidin auf die Pharmakokinetik der Metamizol-Metaboliten betrachtet.
Die Ergebnisse zeigten, dass Cimetidin mit Metamizol interagiert, indem es die systemische
Verfügbarkeit von Metamizol steigert, die Eliminations-HWZ verlängert und die systemische
Clearance verzögert, wobei die renale Elimination von 4-MAA unverändert erscheint.
Nach SCHLINGLOFF (1997) variierte das Verteilungsvolumen beim Pferd zwischen 0,64
und 1,44 l/kg und lag im Mittel bei 1,0 ± 0,23 l/kg; nach KLAUS et al. (1997) lag das
Verteilungsvolumen bei 1,85 l/kg. Die Plasmahalbwertzeit ist von EBERT et al. (2002) für
Hund und Pferd mit 4 – 5 Stunden festgelegt. SCHLINGLOFF (1997) gibt eine Plasma-HWZ
von 5,4 ± 1,3 Stunden für das Pferd an, wobei individuelle Schwankungen zwischen 4,1 und
7,8 Stunden lagen. Eine Kombination von Metamizol mit Induktoren der
Lebermikrosomenenzyme (Barbiturate, Phenylbutazon) führt zu einer verkürzten HWZ von
Metamizol und damit zu einer verkürzten Wirkungsdauer (EBERT et al. 2002). Nach
SCHLINGLOFF (1997) beträgt die totale Clearance im statistischen Mittel 2,14 ± 0,35
ml/min/kg beim Pferd.
44 Literaturübersicht
2.7.5.3. Metamizol – Arzneimitteleinsatz bei Pferden
Metamizol wird beim Pferd als Monopräparat (Vetalgin®) und in Kombination mit dem
Spasmolytikum Butylscopolamin (Buscupan compositum®) besonders zur
Schmerzbehandlung bei Koliken unterschiedlicher Genese und anderen spastischen
Zuständen der Bauchhöhlenorgane als auch bei Schlundverstopfung angewendet. Als
Monopräparat dient es zudem zur Fierbersenkung, seltener bei rheumatischen Zuständen der
Muskulatur und Gelenken, Lumbago, Neuritiden, Neuralgien und Tendovaginitiden. In
beiden Präparateformen ist es in einer Konzentration von 500 mg/ml hoch konzentriert
enthalten. Beim Pferd empfiehlt sich eine intravenöse Applikation in einer Dosierung von 20
– 50 mg/kg KGW (EBERT et al. 2002). Dieses entspricht zumeist einer ein- bis zweimaligen
Gabe von 10 ml Vetalgin® pro 100 kg Pferd bzw. 3 – 6 ml Buscupan compositum® pro 100
kg Pferd ausreichend, um eine spastische Kolik erfolgreich zu therapieren (HUSKAMP et al.
1999). Die spastische Kolik gehört mit einem Anteil von etwa 40% aller Kolikerkrankungen
mit Abstand zur häufigsten Kolikform des Pferdes. Erfolgt zügig nach Einsetzen der
Symptome eine gezielte Behandlung, ist die Prognose günstig. Anderenfalls können heftige
klonische Darmkrämpfe zu Invaginationen und Darmverschlingungen führen, als auch die
Entstehung von Gekröseläsionen als spätere Strangulationsursache begünstigen. Bei nicht
genau diagnostizierten Koliken können Spasmoanalgetika sowohl therapeutischen als auch
diagnostischen Zweck erfüllen. Verbergen sich hinter einer Koliksymptomatik Kolikformen,
die eventuell einer chirurgischen Behandlung bedürfen, wirken Spasmoanalgetika nicht oder
nur für kurze Zeit. Im Falle einer spastischen Kolik setzt die spasmoanalgetische Wirkung
des Metamizol nach kurzer Zeit ein (Minuten) und hält über Stunden an. Oft ist eine
einmalige Behandlung ausreichend nach der die Pferde kurzfristig wieder zu Sportzwecken
einsetzbar erscheinen (HUSKAMP et al. 1999).
Die Firma Intervet ermittelte Rückstandshöchstmengen (MRL- Maximum Residue Limits)
des Wirkstoffes Metamizol für die Anwendung bei lebensmitteliefernden Tieren, so dass
dieser Wirkstoff wieder uneingeschränkt der Tiermedizin zur Verfügung steht. Die
Wartezeiten für essbare Gewebe des Pferdes betragen nach i.v. Applikation des Präparates
Vetalgin® 12 Tage.
45 Literaturübersicht
2.7.5.4. Dopingrelevanz des Einsatz von Metamizol
Ein absichtlicher Einsatz von Metamizol zu Dopingzwecken könnte auf einer
Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit eines Pferdes beruhen. Bei Pferden, die
national oder international im Leistungssport eingesetzt werden, geht die körperliche
Belastung meistens mit einer gewissen natürlichen „ Abnutzung“ einher, so dass gerade
Hochleistungssportpferde nach langjährigen, hochfrequenten Einsätzen während der
Turniersaison oft mehr oder weniger geringgradige Lahmheiten oder Unreinheiten im
Bewegungsablauf zeigen. Allen am sportlichen Einsatz eines Hochleistungspferdes
Beteiligten ist daran gelegen, ein erfolgreiches Sportpferd möglichst lange einsetzten zu
können. Zur Erfüllung dieses Zweckes kommen oft Lokalanästhetika, Glukokortikoide und
NSAID zum Einsatz, damit betroffene Pferde wieder oder überhaupt erst an ihre
Leistungsgrenze laufen können. Diese genannten Substanzen stehen bereits seit Jahren an der
Spitze der aufgedeckten Dopingmittel (UNGEMACH 1985). Zum Teil fallen darunter auch
Substanzen wie Metamizol (und Flunixin), die aufgrund ihrer spasmolytisch-analgetischen
Wirkung bei Kolikern zum Einsatz kommen. Bei der Anwendung dieser Wirkstoffgruppen
bedingt die analgetische Wirksamkeit eine Besserung der Symptome, wobei der eigentlich
sinnvolle antiphlogistische und antiexsudative Effekt aufgrund fehlender Ruhigstellung der
Pferde nicht zum Tragen kommt. Somit ergibt sich langfristig gesehen eher eine
Verschlimmerung bestehender Krankheitsprozesse (UNGEMACH 1985).
2.8. Analytik
Analysenmethoden, die in der modernen Dopinganalytik zum Einsatz kommen, sind neben
immunologischen Methoden (wie z.B. Radioimmunassay (RIA), Enzyme-linked
Immunosorbant Assay (ELISA)) in erster Linie chromatographische Trennverfahren. Unter
dem Begriff der Chromatographie sind verschiedene physikalische Trennmethoden
zusammengefasst, die alle nach einem einheitlichen Prinzip funktionieren. Es beruht darauf,
dass das zu trennende Stoffgemischgemisch mit einer beweglichen (mobilen) Phase über eine
ruhende (stationäre) Phase transportiert wird, wobei eine Wechsel der Komponenten
zwischen den beiden Phasen stattfindet, der zu einer Trennung des Gemisches aufgrund
unterschiedlicher Polarität führt. Die mobile Phase kann flüssig oder gasförmig sein, die
46 Literaturübersicht
stationäre Phase fest oder flüssig (SCHWEDT 1986). Nach dem Trennprinzip bzw. der
Ausführungstechnik werden folgende chromatographische Trennmethoden unterschieden:
• Papierchromatographie (PC)
• Dünnschichtchromatographie (DC, engl.: TLC – thin layer chromatography)
• Gas-Chromatographie (GC)
• Säulen- oder auch Flüssigchromatographie (LC)
Da in dieser Studie ein Verfahren der Flüssigchromatographie angewendet wurde, soll
nachfolgend nur diese chromatographische Methode beschrieben werden.
Die LC wird zum Auftrennen verschiedener in Lösung befindlicher Substanzen genutzt.
Vorteile gegenüber einer GC-Methode liegen u.a. darin, dass auch Substanzen mit hohem
Siedepunkt als auch sehr polarer Substanzen nachgewiesen werden können (SCHOENE
1996). In der LC ist die stationäre Phase in einem langgestreckten Trennbett in einem Rohr
als Säule angeordnet. Das zu trennende Gemisch wird auf das eine Ende der Säule gegeben,
die mobile Phase fließt mit Hilfe einer Pumpe unter Überdruck durch die Säule. Je nach
Säulendurchmesser und mittlerem Durchmesser der Teilchen der stationären Phase
unterscheidet man zwei apparativ unterschiedlich ausgestattete Techniken (SCHWEDT
1986):
• Klassische Säulenchromatographie: innerer Säulendurchmesser ca. 1 cm und größer,
Teilchendurchmesser zwischen 100 und 200 µm, Durchfluss der mobilen Phase unter
Atmosphärendruck oder maximal bis 5 bar
• Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC- High Pressure Liquid
Chromatography): Teilchendurchmesser kleiner als 50 µm, Säulendurchmesser ca. 2
– 6 mm, Gefäßmaterial meist Stahl
Nach UNGER et al. (1995) eignet sich die HPLC-Methode zur Analyse von
schwerflüchtigen, stark polaren und ionische (z.B. Säuren, Basen), thermisch instabilen und
leicht zersetzlichen Substanzen, als auch von solchen mit hoher Molmasse innerhalb kurzer
Zeit (Dauer der Analyse zwischen einer Minute bis zu ca. einer Stunde). Ein Hochdruck-
Flüssigkeits-Chromatograph besteht aus 4 Haupt-Elementen (SCHWEDT 1986):
1. Pumpe: dient der konstanten pulsationsfreien Strömung des Lösungsmittels;
befördert das Lösungsmittel aus einem Vorratsgefäß in die Säule; hält einen
bestimmten Druck aufrecht
47 Literaturübersicht
2. Einspritzsystem: gibt die Probe (1 bis 2000 µl) in den Strom der mobilen
Phase
3. Trennsäule mit Füllung
4. Detektor
Die Ummantelung der Säulen besteht zumeist aus Edelstahl aber auch aus Tantal oder Kupfer.
Das Innere der Trennsäule, welches die stationäre Phase darstellt, besteht aus einem stabilen
dichten Verband kleiner poröser Teilchen (Durchmesser kleiner als 20 µm), wodurch ein
hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen hergestellt und hohe Druckstabilität
gewährleistet wird (UNGER et al. 1995). Als stationäre Phase werden Substanzen,
ausgerichtet nach physikalischen Eigenschaften (Polarität, Löslichkeit) der zu extrahierenden
Substanz, wie Kieselgel, Aluminium, Nitrite, Oktadecylsilane und Sulfonate verwendet. Als
mobile Phase stehen verschiedene Lösungsmittel, auch in Konzentrationen und
Kombinationen, wie z.B. Petrolether, Hexan, Diethylether, Chloroform, Acetonitril, Ethanol,
Methanol und Wasser zur Auswahl (SCHOENE 1996). Die HPLC bietet die Möglichkeit der
einfachen Adsorbtionschromatographie, geeignet für Moleküle mit geringer Polarität, als auch
die der Ionenaustauscher-Chromatographie für positiv oder negativ geladene Teilchen
(SCHOENE 1996).
Die mobile Phase wird nach Verlassen der Trennsäule durch einen Detektor geführt, der die
Aufgabe besitzt, ein chromatographisches Konzentrationsprofil sichtbar zu machen. Aus den
Chromatogrammen soll die Retentionszeit, das Retentionsvolumen und die Konzentration der
zu analysierenden Substanz zu entnehmen sein. Ultraviolett- (UV-), Fluoreszenz- oder
Ionenstrom-Detektoren finden zumeist Anwendung. Eine sensiblere und spezifischer
Identifizierung einer Substanz ist jedoch über die Detektion eines Massenspektrometers
gegeben. Anforderungen an einen Detektor sind ein geringer Rauschpegel, um Substanzen
auch im niedrigen Konzentrationsbereich noch sicher darzustellen und hohe Empfindlichkeit
für nachzuweisende Substanzen. Zudem muss er geringe Drift aufzeigen, was bedeutet, dass
die Nulllinie über längere Zeit stabil zu halten ist, damit Änderungen des Messwertes in
einem Zeitintervall möglichst gering sind (SCHWEDT 1986).
In dieser Studie wird ein MS/MS-Tandem-System verwendet. Dieses erzeugt aus einer
Substanzprobe einen gasförmigen Ionenstrahl, trennt die Ionen nach Masse und Ladungen
und erzeugt so ein Massenspektrum. Dabei werden die pro Zeiteinheit gebildeten
Ionenmengen als Ionenströme bezeichnet, die in der Summe den Gesamt- oder
48 Literaturübersicht
Totalionenstrom ergeben (BUDZIKIEWICZ 1998). Es werden verschieden Methoden der
Ionisation, die unter atmosphärischem Druck ablaufen unterschieden:
- Chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (Atomsperic Pressure Chemical
Ionisation, APCI)
- Photoionisation unter atmosphärischem Druck (Atomspheric Pressure Photoionisation,
APPI)
- Elektrospray-Ionisation (ESI)
Bei diesen Methoden werden Substanzmoleküle im Lösungsmittel zunächst unter
atmosphärischem Druck in substanzspezifische Ionen (Fragment-Ionen) zerlegt und
anschließend von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. In dieser Studie wird die
Methode der APCI verwendet. Der aus der LC-Säule austretende Eluent wird unter
atmosphärischem Druck über eine geheizte Kapillare geleitet und in eine geheizte evakuierte
Kammer versprüht. Eine in der Verdampfungskammer befindliche Glühkathode ionisiert die
in der Gasphase befindlichen Moleküle, dass entstehende geladene Teilchen über eine kleine
Öffnung der Gaskammer in das Massenspektrum geleitet werden. Dem Massenspektrum sind
ein System zur Trennung der geladenen Teilchen und ein Detektor angeschlossen
(LEHMANN 1996).
In dem verwendeten Tandem-Massenspektrometer werden durch vier hintereinander
geschaltete Quadrupole die Ionen zunächst getrennt, dann zum Zerfall gebracht und letztlich
die entstehenden Tochterionen erneut getrennt. Der erste Quadrupol, der zu einer
Aufreinigung und Selektion der Ionen des Analyten führt, besteht aus vier parallel im Quadrat
angeordneten Metallstäben, von denen kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend
verbunden sind. Es wird an zwei einander gegenüberliegenden Stäben eine Wechselspannung
angebracht, dass abwechselnd positive und negative Felder relativ zur Mittelachse erzeugt
werden, die eine Ionentrennung bewirken. Die angelegte Spannung kann so eingestellt
werden, dass nur die Ionen der zu analysierenden Substanz gerade durch das elektrische Feld
geleitet werden und andere Ionen aus dem Feld in die Umgebung abgeleitet und neutralisiert
werden. Im zweiten, auch als Stoßkammer bezeichneten Quadrupol, kommt es zur
Fragmentierung der Ionen des Analyten durch Kollisionsaktivierung mittels
Stickstoffmolekülen. Entstandene Tochterionen gelangen in ein weiteres Stabquadrat, dem
ebenfalls eine bestimmte Spannung angelegt ist, um bestimmte Ionen zu selektieren und
andere zu neutralisieren und zu eliminieren. Die selektierten Tochterionen werden in den
49 Literaturübersicht
Detektor weitergeleitet. In diesem Fall wird der Detektor als Reaktionsdetektor bezeichnet, da
die in der Trennsäule eluierten Substanzen in chemischen Reaktionen verändert und danach
erst detektiert werden. Für die bei diesen chemischen Reaktionen entstanden Ionen besitzt der
Detektor im Vergleich zum ursprünglichen Molekül eine bessere Selektivität und
Empfindlichkeit (BUDZIKIEWICZ 1998).
50 Eigene Untersuchungen
3. Eigene Untersuchungen
3.1. Versuchsplanung
Um die Eliminationskinetik von Metamizol im Plasma und Urin des Pferdes zu ermitteln und
bezugnehmend auf das Dopingverbot zu prüfen, ob eine Karenzzeit für Sportpferde zu
bestimmen ist, wurde die Substanz einmalig in mittlerer therapeutischer Dosierung in Form
einer handelsüblichen Injektionslösung intravenös appliziert.
In einem Vorversuch wurden die Blut- und Urinproben eines Pferdes nach einem zuvor
festgelegten Zeitschema durch Venenpunktion entnommen bzw. durch Auffangen von
Spontanurin gewonnen. In diesem Vorversuch sollte überprüft werden, ob die Durchführung
zeitlich und labortechnisch praktikabel ist. Da sich der Vorversuchablauf als gut durchführbar
erwies, konnte der Hauptversuch in gleicher Weise stattfinden. Im Labor des Institutes für
Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln wurde eine Methode zur Extraktion der
Substanz aus dem Probenmaterial und Nachweis mittels HPLC/MS/MS geprüft, nach der alle
Plasma- und Urinproben aufgearbeitet und gemessen wurden. In dem sich anschließenden
Hauptversuch wurden insgesamt 10 Pferde beprobt. Die Ergebnisse der
Laboruntersuchungen wurden pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.
Der Tierversuch ist unter dem Aktenzeichen 509a-42502-02A149 bei der Bezirksregierung
Hannover angezeigt.
Der Versuchsablauf der Studie und die Zeitpläne der Probenentnahme sind in Anlehnung an
die Vorgaben des European Horserace Scientific Liasion Committee (EHSLC) als
Standardprotokoll für intravenöse pharmakokinetische Studien vom Mai 2002 erstellt worden.
3.2. Material und Methode
3.2.1. Pferde und Haltungsbedingungen
Für den Versuch stand eine Gruppe von 10 Wallachen - 6 Warmblüter und 4 Vollblüter -
unterschiedlichen Alters, Gewichts und Trainingzustandes zur Verfügung. Die Pferde waren
für diesen Versuch im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
in 31535 Neustadt/Mariensee untergebracht. An dieser Pferdegruppe sollen nacheinander
Untersuchungen zur Pharmakokinetik weiterer Substanzen hinsichtlich der Dopingrelevanz
51 Eigene Untersuchungen
durchgeführt werden. Zwischen diesen Versuchsdurchgängen liegt jeweils eine Wash-Out-
Phase.
Während der Zeit der Versuchsdurchführung wurden acht Pferde auf der Weide gehalten. Sie
wurden mit Heu oder Grassilage zugefüttert und hatten Zugang zu einem mit Stroh
eingestreuten Laufstall, in dem sich Selbsttränken und Einzelständerfutterplätze befanden.
Zwei Vollblutpferde wurden in Boxen von ca. 16 m² Größe auf Stroh gehalten und zweimal
täglich mit Heu und Hafer gefüttert; die Wasseraufnahme erfolgte ad libitum. Ein besonderes
Training fand während des Versuchs nicht statt. Vor Versuchsbeginn wurde bei allen Pferden
eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt, die bei allen Pferden ohne besonderen
Befund blieb. Mit einer Viehwaage wurde das Gewicht jedes Pferdes am ersten Versuchstag
festgestellt, um die individuelle Metamizol-Dosis zu errechnen. Für alle Pferde sind in
Tabelle 1 Angaben zu Alter, Haltungsbedingungen, Rasse, Gewicht und Dosis
zusammengefasst.
Tabelle 1: Angaben zu Alter, Haltungsbedingungen, Rasse, Gewicht und Dosis
Pferd
A
Pferd
B
Pferd
C
Pferd
D
Pferd
E
Pferd
F
Pferd
G
Pferd
H
Pferd
I
Pferd
J
Alter
(Jahre)
7
9 7 7 9 9 8 4 7 3
Haltung Weide/Laufstall Boxen-
haltung
Weide/
Laufstall
Boxen-
haltung
Rasse Hannoversches Warmblut Vollblut
Gewicht
[kg]
668 666 680 776 684 754 438 475 524 518
Metamizol-
Dosis [mg]
20040 19980 20400 23280 20520 22620 13140 14250 15720 15540
Vetalgin®-
Menge [ml]
40,1 40,0 40,8 46,6 41,0 45,2 26,3 28,5 31,4 31,1
52 Eigene Untersuchungen
3.2.2. Applikation des Arzneimittels und Probengewinnung
Jeweils 45 Minuten vor Versuchsbeginn (t0 = Zeitpunkt der Injektion) wurde bei jedem Pferd
ein Venenverweilkatheter (Braunüle MT®; Größe: 3/G14, Stichlänge 8 cm) in die linke und
rechte Vena jugularis gelegt und an der Haut fixiert. Die Haut in dem Punktionsbereich wurde
zuvor rasiert und mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Über den Katheter in der Vena jugularis
sinister wurde den Pferden Blutproben von je 54 ml entnommen, wofür sechs Sarstedt-
Monovetten® (Lithium-Heparin beschichtet; 15 I.E Heparin/ml Blut; 9 ml Fassungsvermögen)
verwendet wurden. Von jedem Pferd wurde 15 Minuten vor der Medikamentenapplikation
eine Blank-Blutprobe entnommen, in der die zu untersuchende Substanz nicht enthalten ist.
Vor Versuchsbeginn wurde die errechnete Medikamentendosis in Einwegspritzen
aufgezogen. Die Injektionsflaschen wurden jeweils an dem Tag des Versuchsbeginns frisch
angestochen. Die Injektion erfolgte langsam und streng i.v. in den Katheter in der Vena
jugularis dexter. Hierbei wurden Einmalhandschuhe getragen, um einer Verschleppung des
Wirkstoffes der Injektionslösung vorzubeugen.
Blutproben wurden nach der Injektion nach 2, 5, 10, 15, 30, 60 Minuten und 2, 4, 6, 8, 12, 24,
36, 48, 72 und 96 Stunden entnommen. Zwischen den Blutentnahmen wurden die Braunülen
mit einem Mandrin (Vasofix®) verschlossen. Zwölf Stunden nach Versuchsbeginn wurden die
Venenverweilkatheter entfernt. Die weiteren Blutproben wurden durch Venenpunktion mit
einer 1,2x40mm (18Gx1,5") Einmalkanüle gewonnen.
Urinproben wurden durch Auffangen von Spontanurin 2, 4, 6, 10, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144
und 168 Stunden nach der Injektion gewonnen. Einwegplastikbecher, die in einer
Aufhängevorrichtung an einem ca. 50 cm langen Stab befestigt waren, dienten zum
Auffangen des Urins. Alle Pferde der Versuchsgruppe wurden vor dem Versuch auf den
spontanen Urinabsatz konditioniert. Am Morgen des jeweils ersten Versuchstages wurde vor
Versuchsbeginn von jedem Pferd eine Urinprobe gewonnen, in der die zu untersuchende
Substanz nicht enthalten ist.
53 Eigene Untersuchungen
3.2.3. Eingesetztes Arzneimittel
Testsubstanz:
Vetalgin® (Wirkstoff: Metamizol- Natrium)
Hersteller: Intervet Deutschland GmbH, Postfach 1130, D-85701 Unterschleißheim
Handelsform: 50%ige Injektionslösung in 100 ml Flaschen
Chargen Nr.: 03W030; Zulassungsnummer: N127; verwendbar bis: 11.2006
Metamizol wurde den Tieren als Monopräparat (Vetalgin® ad us. vet.) in einer Dosierung von
30 mg/kg KGW intravenös injiziert. Das Präparat enthält 500 mg Metamizol-Natrium pro
Milliliter Injektionslösung. Metamizol kann beim Pferd in einer Dosierung von 20-50 mg/kg
KGW bei intravenöser Injektion appliziert werden.
3.2.4. Aufbereitung und Aufbewahrung der Blut- und Urinproben
Die mit Lithium-Heparin beschichteten Monovetten® gesammelten Blutproben wurden
innerhalb einer Stunde nach Entnahme bei 1000 g 10 Minuten zentrifugiert (Zentrifuge
Rotana IS, Hettich). Das gewonnene Blutplasma wurde in einer Einwegspritze aufgezogen,
gemischt und in vier 6 ml Glasgefäße mit Plastikschraubdeckel umgefüllt. Diese wurden
unmittelbar im Kühlschrank stehend bei 4 °C bis zum Abend des jeweiligen Versuchstages
aufbewahrt und dann bei –20 °C eingefroren. Der Transport in das Analysenlabor erfolgte in
mit Trockeneis befüllten Styroporbehältern.
Die in Plastikbechern aufgefangenen Urinproben wurden unmittelbar in zwei
Kunststoffbehälter mit Schraubdeckel (100 ml) aliqoutiert. Die Dichte des Urin wurde mit
einer Harnspindel (Firma Heiland, Hamburg), der pH-Wert mit Indikatorpapier (Merck®
Universalindikator pH 0-14) bestimmt. Anschließend wurden die Urinproben bis zum Abend
des jeweiligen Versuchstages im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt und dann bei –20 °C
eingefroren. Der Transport in das Labor erfolgte wie bei den Plasmaproben.
54 Eigene Untersuchungen
3.2.5. Material, Geräte und Entwicklung analytischer Methoden für die
Bestimmung des Hauptmetaboliten 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA)
von Metamizol
Die Plasma- und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule in Köln auf den Gehalt von 4-MAA untersucht. Metamizol konnte als
solches nicht in den Proben nachgewiesen werden, da es unmittelbar nach Applikation im
Pferd metabolisiert wird. Zur Ermittlung der Eliminationskinetik von Metamizol wurde der
Hauptmetabolit 4-MAA bestimmt. Für die Bestimmung der Konzentration von 4-MAA im
Pferdeplasma und –urin wurde je eine Methode zur Aufarbeitung der Proben mit basischer
Extraktion und Trennung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) mit
anschließender Detektion mit einem Massenspektrometer (MS) erarbeitet.
3.2.5.1. Chemikalien
Acetonitril, Supragradient HPLC grade J.T. Baker, Deventer, Holland
Ammoniumacetatpuffer
• Ammoniumacetat Merck, Darmstadt
• Bidestilliertes Wasser (Milli-Q-Wasser) Institut für Biochemie, Köln
• Eisessig Merck, Darmstadt
Aqua destillata Institut für Biochemie, Köln
Dimethylaminoantipyrin Aventis Pharma, Frankfurt/ Main
Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt
Mercaptoethanol Fluka-Chemikalien,
CH-9470 Buchs
Methanol, destilliert Institut für Biochemie, Köln
4-Methylaminoantipyrin Aventis Pharma, Frankfurt/ Main
Salzsäure 0,06 N Merck, Darmstadt
Tertiär-Butylmethylether (TBME), vor Gebrauch destilliert KMF, Laborchemie Handels
GmbH, Sankt Augustin
55 Eigene Untersuchungen
3.2.5.2. HPLC/MS/MS
Die 4-MAA Analyse wurde mit einer HPLC API 2000, gekoppelt an einen Agilent Series
1100 Liquid Chromatographen, durchgeführt. Folgende Geräteeinstellungen wurden benutzt:
HPLC:
• Säule: Merck Li Chro CART® 55x4 Purospher® Star, 3 µm
• Eluenten: A = 5 mmol/l Ammoniumacetat in H20, 0,1% Eisessig
B = Acetonitril
• Gradienten: 5 % B � 50 % B in 5 Minuten, 50% B � 100 % B in 6.
Minute, 1 Minute 100 % B zur Reinigung der Säule,
Reequilibrierung mit 5% B für 2 Minuten
• Flussrate: 1 ml/Minute
• Injektionsvolumen: 10 µl
Massenspektrometer (APCI 2000 Triple-Quadrupol Massenspektometer, Perkin-Elmer Sciex
Instruments):
• Ionenquelle: APCI bei 400 °C
• Ionisationseinstellung: positiv
• Aquisitionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring, MRM
• Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr
• Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt
3.2.5.3. Eichlösungen
Zur Durchführung einer quantitativen Bestimmung wurden Lösungen der zu untersuchenden
Substanz Metamizol bzw. 4-MAA, und dem internen Standard Dimethylaminophenazon,
DMAP, hergestellt. Die 4-MAA-Stammlösung wurde durch Einwaage von 10 mg
Reinsubstanz in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben und Auffüllung mit 1 %iger
Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl hergestellt. Diese Lösung hatte eine Konzentration von
1mg/ml. Von dieser Stammlösung wurde 1 ml abgenommen, in den zuvor mehrfach mit
Methanol gespülten und getrockneten Erlenmeyerkolben gegeben und wieder auf 10 ml mit 1
%iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl aufgefüllt, so dass eine Arbeitslösung der
Konzentration 100 µg/ml entstand. In weiteren Verdünnungsschritten von 1:10 entstanden
56 Eigene Untersuchungen
Arbeitslösungen mit Konzentrationen von 10 µg/ml und 1 µg/ml. Zur Herstellung der 10
mg/ml Stammlösung wurden 10 mg der 4-MAA-Reinsubstanz direkt in ein spitzes
Zentrifugenschliffglas eingewogen, in einem Milliliter der 1 %igen Mercaptoethanollösung
angelöst und auf dem Schüttler (Vortex®) bis zur vollständigen Auflösung der Reinsubstanz
geschüttelt.
Analog zur Herstellung der 4-MAA-Stammlösung (1 µg/ml) wurde eine DMAP-
Stammlösung in gleicher Konzentration erstellt. Aus dieser DMAP-Stammlösung wurden
durch 1:10- Verdünnung mit 1 %iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl Arbeitslösungen
der Konzentrationen 100 µg/ml, 10 µg/ml und 1 µg/ml erstellt. Zusätzlich wurde eine
Arbeitslösung der Konzentration 20 µg/ml hergestellt. Hierfür wurden 200 µl der 1 mg/ml in
einen Erlenmeyerkolben gegeben und mit der oben genannten Mercaptoethanollösung auf 10
ml aufgefüllt.
Anfänglich wurde als Lösungsmittel Methanol verwendet. Die Standardlösungen waren
allerdings in dem wässrigen Milieu nur über wenige Tage stabil, so dass ein Oxidationsschutz
verwendet werden musste. Als Oxidationsschutz eignete sich 1%ige Mercaptoethanollösung
in 0,06 N HCl.
3.2.5.4. Entwicklung analytischer Methoden
Mit den erstellten Stamm- und Arbeitslösungen wurden wie unter 3.2.5.5 beschrieben Proben
erstellt, die zunächst mit einer HPLC mit UV-Detektion (Hewlett Packard HP 1090 Liquid
Chromatograph) gemessen wurden. Anfänglich galt es, eine geeignete Säule zur
chromatographischen Darstellung des 4-MAA und DMAP zu finden. Weiterhin musste für
jede der beiden Substanzen ein Wellenlängenbereich gefunden werden, bei dem eine
deutliche Peakformen entstanden und von deren Flächen ein sauberes Integral gebildet
werden konnte. Zudem mussten geeignete Eluenten und Gradienten gefunden werden.
3.2.5.5. Proben mit 4-MAA und DMAP
Den Stamm- und Arbeitslösungen wurden Mengen von 10, 25, 50, und 100 µl entnommen,
diese in je ein spitzes Zentrifugenschliffglas gegeben und am Rotationsverdampfer unter
Vakuum über einem auf 50 °C erhitzten Wasserbad eingedampft. Die eingeengte Substanz
57 Eigene Untersuchungen
wurde in 100 µl Milli-Q-Wasser angelöst, mit einer Glasspritze in gläserne Probeneinsätze
der Autosamplervials überführt und mittels HPLC/UV gemessen.
3.2.5.6. Chromatographie
Bei der HPLC/UV-Messung wurden unter Bezug auf Literaturangaben (ASMARDI und
JAMALI 1983, ZYLBER-KATZ et al. 1984, DAMM 1989, AGUNDEZ et al. 1994,
AGUNDEZ u. BENITEZ 1996) anfangs verschiedene Säulen eingesetzt: LC-Säule CC 125/3
Nucleosil 120-3 C18 (Machery und Nagel), 5 µm LiChrCART® 250-4 RP-18 encapped Säule
(Merck®), Supercosil TM LC-18-DB Säule 7,5 x 4,6 x 3.
Als Lösungsmittel wurden zu Beginn der Methodenentwicklung zunächst Acetonitril und
Milli-Q-Wasser benutzt. Die Gradienteneinstellung war wie folgt: 30% Acetonitril und 70%
Milli-Q-Wasser bis zur 15. Minute, dann für 3 Minuten 100% Acetonitril, Wiederherstellung
der Ausgangsgradienten innerhalb von 2 Minuten und Equilibrierung über 4 Minuten. Das
Injektionsvolumen der Probenlösung betrug 25 µl. Für 4-MAA wurden bei der Wellenlänge
von 245 nm und für DMAP bei 255 nm die besten Messergebnisse an der eingesetzten HPLC-
UV erzielt.
Die Messergebnisse waren hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und somit der eindeutigen
Identifizierung beider Substanzen nicht zufriedenstellend. Statt eines scharfen vom
Untergrund gut abgesetzten Peaks wurden die Substanzen zwar nach einer ihnen
zuzuordnenden Retentionszeit detektiert, jedoch als nicht auswertbarer Peak. Deutliche, aber
noch nicht zufriedenstellende Verbesserung zeigte der Wechsel der Eluenten: das Milli-Q-
Wasser wurde gegen einen Ammoniumacetat-Puffer getauscht. Zusätzlich wurde die
Gradienteneinstellung verändert: innerhalb von fünf Minuten wurde von 95 %
Ammoniumacetat-Puffer (Eluent A) und 5 % Acetonitril (Eluent B) auf 10 %
Ammoniumacetat-Puffer und 90 % Acetonitril gewechselt und der Anfangsgradient von 95 %
A und 5 % B nach sieben Minuten wieder erreicht und bis zur achten Minute gehalten. Die
Flussrate der Lösungsmittel betrug 1 ml/Minute. Auswertbare Messergebnisse, dass heißt
reproduzierbare Messungen mit scharf von dem Untergrund und gegeneinander abgesetzten
Peaks beider Substanzen erbrachte der Wechsel der HPLC-Säule. Verwendung fand
schließlich eine LiChroCART® HPLC-Cartridge Purosper® STAR RP-18 endcapped (3 µm)
(Merck, Darmstadt), die laut Herstellerangaben zur Messung amphoterer Moleküle besonders
geeignet ist.
58 Eigene Untersuchungen
3.2.5.7. Extraktion von 4-MAA und DMAP aus Probenmaterial
Nachdem sowohl das 4-MAA als auch der interne Standard der Stamm- und Arbeitslösungen
durch oben beschriebene Analysenmethode qualitativ und quantitativ nachzuweisen war,
musste eine geeignete Methode zur Extraktion des 4-MAA aus Wasser sowie aus Plasma und
Urin erarbeitet werden. Mit dem Ziel, eine möglichst große Extraktionsausbeute zu erhalten,
wurden Ergebnisse der Festphasen-Extraktion und der Flüssig-Flüssig-Extraktion bei
unterschiedlichen pH-Werten verglichen.
Bei der Festphasen-Extraktion wurden Wasserproben mit verschiedenen Konzentrationen der
4-MAA- und DMAP- Lösungen versehen (gespikt) und jeweils auf eine Säule (Chromabond®
C18, Macherey und Nagel) aufgetragen. Die Substanzen wurden mit Methanol von den
Säulen gewaschen und am Rotationsverdampfer über einem 50 °C warmen Wasserbad
eingeengt. Die eingeengten Substanzen wurden in je 100 µl des Ammoniumacetat-Puffers
angelöst, in HPLC-Messröhrchen (Vials) überführt und mittels HPLC/UV-Detektion
gemessen. Im Vergleich zu vorherigen Messungen war die Extraktionsausbeute jedoch zu
gering.
Für die Flüssig-Flüssig-Extraktion wurden vier Reagensgläser mit je 5 ml bidestilliertem
Wasser und gleicher Menge des internen Standards angesetzt. Zu drei dieser Ansätze wurde
4-MAA in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Um ein pH-Optimum
herauszufinden, bei dem die Extraktionsausbeute der Substanzen am größten ist, wurde die
eben beschriebene Versuchsreihe drei Mal angesetzt: bei pH 7, 9,6 und 14. Der pH-Wert 7
wurde durch Zugabe von 250 µl einer 0,8 molaren Natrium-Phosphatpuffer-Stammlösung, pH
9,6 durch Zusatz von 5 g geglühtem Natriumsulfat als Festpuffer und pH 14 durch
Hinzufügen von 10 bis 12 Tropfen einer 1 molaren Kaliumhydroxidlösung bzw. alternativ
durch 4 Tropfen einer 5 molaren Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Durch
Universalindikatorpapier wurde die Einstellung des pH-Wertes jeder einzelnen Probe
überprüft. Anschließend wurden zu jeder Probe 5 ml tertiär-Butylmethylether (TBME)
gegeben. Die mit Glasstopfen verschlossenen Reagensgläser wurden in horizontaler Ebene 20
Minuten auf einen Schüttler verbracht, dass die zu untersuchenden Substanzen durch den
Ether aus der wässrigen Phase extrahiert wurden. Die geschüttelten Proben wurden bei 1000
g 5 Minuten zentrifugiert, die die Testsubstanzen enthaltende Etherphase mit Pasteurpipetten
in spitze Zentrifugenschliffgläser überführt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Die
eingedampften Substanzen wurden in 100 µl Ammoniumacetatpuffer angelöst und zur
59 Eigene Untersuchungen
Messung an der HPLC-UV in Autosamplervials überführt. Gute Extraktionsausbeuten wurden
bei pH 9,6 und 14 erzielt.
Zur Ermittlung des Extraktionsverhaltens von 4-MAA und DMAP aus biologischer Matrix
wurden nach oben beschriebenem Aufarbeitungsschema anstelle der Wasserproben Urin und
Plasma bei den drei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet und gemessen. Auch hier wurden
bei 9,6 und 14 gute Ausbeuten der Extraktion erhalten. Die bei pH 9,6 extrahierten Proben
zeigten deutliches Untergrundrauschen in ihren Chromatogrammen. Diese entsteht dadurch,
dass im sauren und neutralen Milieu Störfaktoren der biologischen Matrix in die Etherphase
übergehen und in den Chromatogrammen die genaue Identifizierung der zu untersuchenden
Substanz stören, indem sie deren Peakformen basal durch An- und Überlagerung verändern.
Bei pH 14 stellen sich diese Störfaktoren nicht dar, dass die Aufarbeitung der im Folgenden
zu messenden Proben bei pH 14 durchgeführt wurde.
3.2.5.8. Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyseschritt
Zur Prüfung, ob 4-MAA in konjugierter (glucuronidierter oder sulfatierter) Form mit dem
Urin ausgeschieden wird, wurden Hydrolyseschritte in die Flüssig-Flüssig-Aufarbeitung
einbezogen.
Hierzu wurden jeweils 5 ml einer 4-MAA enthaltenden Urinprobe aus dem Vorversuch mit
dem internen Standard versetzt und einer Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia
coli, Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia und Cystein bei derem jeweiligen pH-
Optimum unterzogen. Nach den enzymspezifischen Inkubationszeiten und –bedingungen
wurden die Urinproben auf pH 14 eingestellt und wie oben beschrieben mittels Flüssig-
Flüssig-Extraktion weiter aufgearbeitet. Zum Vergleich wurden 5 ml der ersten Urinprobe des
Vorversuchs ohne Hydrolyse entsprechend aufgearbeitet und alle Proben mittels HPLC-UV
gemessen. Aufgrund des Ergebnisses, dass eine Aufarbeitung mit Hydrolyse keine größeren
Extraktionsausbeuten ergab, war davon auszugehen, dass 4-MAA in freier Form mit dem
Urin ausgeschieden wird. Somit wurden alle weiteren Aufarbeitungen ohne Hydrolyseschritt
durchgeführt.
60 Eigene Untersuchungen
3.2.5.9. Aufarbeitung des Probenmaterials einschließlich der Proben für die
Validierung
Die Aufarbeitung der Proben erfolgte für Plasmaproben nach dem Schema der Abbildung 5
und für Urinproben nach dem Schema der Abbildung 6 ohne Hydrolyse. Für Urinproben im
Konzentrationsbereich von Null bis 100 µg/ml 4-MAA wurde die Aufarbeitung modifiziert:
es wurden 5 ml Urin mit 2 µg DMAP (20 µl der 100 µg/ml Arbeitslösung) versetzt, die
gesamte Etherphase eingeengt und in 200 µl Anfangspuffer aufgenommen. Nach der
Aufarbeitung waren einige Plasmaproben stark getrübt. Vermutlich führten ausgefallene
Proteine und Lipide zu dieser Trübung. Um einer im Vorversuch mehrfach beobachteten
Verstopfung der zur Säule des Chromatographen zuführenden Kapillare vorzubeugen, wurden
diese aufgearbeiteten Plasmaproben nochmals bei 3000 g für 15 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand konnte vorsichtig, ohne den Bodensatz aufzuwirbeln, mit einer Glasspritze in
Autosamplervials überführt werden. Die Messung aller Proben des Hauptversuches
einschließlich derer für die Validierung, wurde mit HPLC/MS/MS wie unter 3.2.5.2 und
3.2.5.6 beschrieben durchgeführt.
Nach Aufarbeitung aller Plasma- und Urinproben des Vorversuches wurde die Dauer der
Probenentnahme für den Hauptversuch festgelegt. Im Vorversuch zeigte sich, dass Metamizol
bzw. 4-MAA im Plasma nach 24 Stunden und im Urin nach 96 Stunden nicht mehr
nachgewiesen werden konnte. Unter Berücksichtigung einer Sicherheitszeitspanne wurden die
Entnahmezeiten für Plasma bis zu 96 Stunden und für Urin bis zu 168 Stunden nach der
Arzneimittelinjektion festgelegt. Im Vorversuch wurde Metamizol in einer Dosierung von 40
mg/kg Körpergewicht verabreicht. Sowohl die erste Plasma- als auch die erste Urinprobe war
bei einer aufgearbeiteten Probenmenge von 5 ml nicht messbar. Es schien, als wäre die
Chromatographiesäule bei der hohen 4-MAA-Konzentration überladen. Folglich ergaben sich
undeutliche Chromatogramme. Somit wurde die Dosierung des Metamizol für den
Hauptversuch auf 30 mg/kg Körpergewicht und das aufzuarbeitende Probenaliquot auf einen
Milliliter reduziert.
Bei dem ersten Versuch der Validierung der Methode konnten keine annehmbaren
Kalibrationsreihen mit methanolischen 4-MAA- und DMAP-Standard- und Arbeitslösungen
erzielt werden. Das 4-MAA erschien instabil zu sein. Die Standard- und Arbeitslösungen
verfärbten sich mit zunehmender Lagerzeit gelblich. Laut MERCK-INDEX (1989) soll das
4-MAA unter Lichteinfluss und im wässrigen Milieu oxidieren. Um dem entgegenzukommen
61 Eigene Untersuchungen
wurden die Standard- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanol- Lösung in 0,06 N
Salzsäure als Oxidationsschutz hergestellt und dadurch akzeptable Eichkurven erhalten.
Die Abbildungen (5) und (6) stellen das Schema der Aufarbeitung von Plasma- bzw. von Urin
proben dar, nach denen auch die Proben des Hauptversuchs bearbeitet wurden.
Probenvorbereitung:
����
1 ml Plasma im Zentrifugenschliffglas
����
+ 1,0µg Dimethylaminophenazon als interner Standard
(50µl einer 1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06N HCL),
die 20µg/ml Dimethylaminophenazon enthält)
+ 50µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),
mit pH-Papier überprüfen,
gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14
+ 5 ml tert.-Butylmethylether,
mit Stopfen versehen
����
�
Etherphase mit Pasteurpipette in Spitzglas überführen,
am Rotationsverdampfer einengen
�
Etherphase trocknen,
in 200µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex),
evtl. bei 3000rpm für 15 Minuten zentrifugieren,
mit Pasteurpipette aufnehmen (Vorsicht Bodensatz)
und in Autosamplervials überführen und
10µl pro Messung in das LC/MS injizieren
Abb. 5: Nachweis von Metamizol im Pferdeplasma mittels LC/MS
20 Minuten schütteln und
anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren
62 Eigene Untersuchungen
Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich 100-8000µg/ml):
����
1 ml Urin im Zentrifugenschliffglas
����
+ 50µg Dimethylaminophenazon als interner Standard
(50µl einer 0,1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06 N
HCL), die
1 mg/ml Dimethylaminophenazom enthält)
+ 75µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),
mit pH-Papier überprüfen,
gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14
+ 5 ml tert.-Butylmethylether,
mit Stopfen versehen
����
20 Minuten schütteln und
anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren
�
1ml der Etherphase mit Eppendorfpipette in Spitzglas
überführen,
am Rotationsverdampfer einengen
�
in 1ml Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), mit
Pasteurpipette in Autosamplervials überführen,
10µl pro Messung in das LC/MS injizieren
Abb. 6: Nachweis von Metamizol im Pferdeurin mittels LC/MS
63 Eigene Untersuchungen
3.3. Validierung der Methode
3.3.1. Grundlagen der Validierung
Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der Zuverlässigkeit
einer analytischen Methode zur Erzeugung reproduzierbarer Daten. Als ein Instrument der
Qualitätssicherung ist sie Voraussetzung für die quantitative Bestimmung unterschiedlicher
Substanzen. Sie umfasst alle Teilschritte der Bestimmungsmethode, d. h. sie zeigt, dass die
Methode der Probenaufarbeitung und Messung für den beabsichtigten Zweck, der Erzeugung
ergebnissicherer pharmakokinetischer Daten für den Wirkstoff Metamizol, geeignet ist. In
dieser Studie sind folgende Elemente in die Validierung einbezogen:
• Selektivität, Spezifität
• Linearität
• Richtigkeit
• Präzision
• Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
• Stabilität
• Wiederfindungsrate
3.3.1.1. Selektivität, Spezifität
Die Selektivität bzw. Spezifität gibt an, inwieweit ein Verfahren hier die HPLC/MS/MS-
Methode für eine bestimmte Substanz in Gegenwart anderer Substanzen präzise Ergebnisse
liefert, d. h. inwieweit es zwei Substanzen unterscheiden und trennen kann. Jede Substanz
muss zu einer für sie charakteristischen Retentionszeit von der Säule getragen werden und im
Chromatogramm einen deutlichen von Störpeaks zu trennenden Peak darstellen.
Wie in Kapitel 3.2.5.7 beschrieben, wurden Leerplasma und –urinproben mit Proben, denen
4-MAA zugesetzt wurde, verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die Analyten (4-
MAA und DMAP) ohne Verfälschung durch Serum- bzw. Urininhaltsstoffe (Spezifität) und
ohne gegenseitige Störung bei ausreichender Trennung (Selektivität) darzustellen sind.
64 Eigene Untersuchungen
3.3.1.2. Linearität
Die Linearität beschreibt die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und den
theoretischen Konzentrationen. Sie gilt nur für einen bestimmten Konzentrationsbereich.
Nach DIN 38402 A51 (1986) erfolgt die Überprüfung der Linearität der Methode an
mindestens 5 Leerproben, denen unterschiedliche Konzentrationen der zu untersuchenden
Substanz zugesetzt werden. Diese fünf Konzentrationen müssen äquidistant fortlaufend den
gesamten Kalibrationsbereich abdecken. Jede Konzentrationsstufe wurde doppelt
aufgearbeitet und gemessen. Laut DIN 32645 (1994) werden Blankproben und
Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze hierfür nicht berücksichtigt. Die Messreihe
muss mindestens drei Mal an unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Tagen
aufgearbeitet und gemessen werden. Da sich der Kalibierbereich sowohl im Plasma als auch
im Urin über zwei bzw. drei Zehnerpotenzen erstreckte, wurde für beide Matrices die
Linearität im niedrigen und hohen Konzentrationsbereich überprüft. Die gewählten
Konzentrationen sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.
Tabelle 2: Konzentrationen 4-MAA im Leerplasma zur Bestimmung der Kalibrationskurve
Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml
Niedrig
0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10
Hoch
10, 50, 100, 150, 200, 250
Tabelle 3: Konzentrationen 4-MAA im Leerurin zur Bestimmung der Kalibrationskurve
Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml
Niedrig
0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100
Hoch
100, 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000
Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen des Analyten (4-MAA) und des internen
Standards (DMAP) wurde der Quotient errechnet und gegen die Konzentration der
Kalibratoren aufgetragen. Die entstehende Kalibriergerade wurde visuell auf Ausreißer und
Linearität untersucht. Unter Einbezug der Steigung dieser Geraden wurde auf die
65 Eigene Untersuchungen
„ gemessene“ Konzentration zurückgerechnet (back calculation, BC). Die BC durfte dabei um
maximal 15% und die Konzentration an der unteren Bestimmungsgrenze (lower limit of
quantification, LLQC) um maximal 20% von der theoretischen Konzentration abweichen
(EHSLC 2002).
3.3.1.3. Richtigkeit
Die Richtigkeit gibt die Abweichung des Mittelwertes von einem erwarteten Referenzwert
(wahren Wert) an. Sie hängt von der Größe systematischer Fehler, wie z.B. unkorrektes
Einwiegen des Analyten zur Herstellung einer Stammlösung oder Pipettierfehlern bei der
Erstellung der Kalibierreihe, ab.
Um die Richtigkeit zu überprüfen, wurden an drei unterschiedlichen Tagen jeweils fünf
Blankproben beider Matrices innerhalb des Messbereiches mit einer niedrigen (low quality
control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality control standard, MQC) und einer
hohen (high quality control standard, HQC) Konzentration der nachzuweisenden Substanz
gespikt, aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC 2002). Im niedrigen Konzentrationsbereich
sind Abweichungen von den erwarteten Ergebnissen von bis zu 20% und im mittleren und
hohen Konzentrationsbereich von bis zu 15% zulässig. Zur Ermittlung der relativen
Abweichung (relativer Fehler, RE) des gemessenen Wertes von dem theoretisch zu
erwartenden Wert wird der Mittelwert aller fünf Konzentrationen eines
Konzentrationsbereiches (A) und die theoretische Konzentration (B) zueinander in
Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet (EHSLC 2002):
RE (%) = (A-B)/B x 100 [16]
3.3.1.4. Präzision
Die Präzision ist das Maß für die Streuung eines Analysenergebnisses bei wiederholter
Durchführung der Messung gleicher Proben . Die Standardabweichung (S) bzw. die relative
Standardabweichung (Variationskoeffizient) wiederspiegeln die Präzision des Verfahrens
66 Eigene Untersuchungen
zahlenmäßig. Bei der Präzision unterscheidet man Wiederholpräzision sw (intraday
repeatability oder Tagespräzision) und Zwischenpräzision sb (interday repeatability).
Zur praktischen Ermittlung der Präzision werden jeweils fünf LQC-, MQC- und HQC-
Proben des Kalibrationsbereiches beider Matrices an drei unterschiedlichen Tagen
aufgearbeit und mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. In Relation zum gemessenen Mittelwert
dürfen die Präzisionen im niedrigen Kalibrationsbereich nicht mehr als 20% bzw. im
mittleren und hohen Kalibrationsbereich nicht mehr als 15% abweichen (EHSLC 2002). Die
Präzisionen können wie folgt berechnet werden (EHSLC 2002):
Sw = )(
�� ⋅
Tagesrate
TagesrateTagesrate
f
Sf 2
[17]
Sb = ( )
Tage
gesamtTagesrate
f
XX� −2
[18]
In den Gleichungen entspricht „ f“ der Anzahl der Messungen –1 (bzw. den Freiheitsgraden),
„ X“ dem Mittelwert gleicher Konzentrationen und „ s“ der Standardabweichung.
3.3.1.5. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
Unter Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) versteht man die niedrigste
Konzentration, bei der sich eine Substanz unter den angegebenen Messbedingungen noch
qualitativ bestimmen lässt, indem ein vom Untergrundrauschen der Blankproben deutlich zu
unterscheidendes Instrumentensignal detektiert wird.
Für diese Studie wurde die Nachweisgrenze durch Ermittlung des Signal-Rausch-
Verhältnisses empirisch bestimmt. Hierzu wurde zunächst 4-MAA in drei verschiedenen
Konzentrationen des unteren Konzentrationsbereiches in Plasma- und Urin-Leerproben
gegeben. Für Plasma wurden die 4-MAA Konzentrationen 25, 100 und 250 ng/ml und für
Urin 100, 250 und 500 ng/ml gewählt. Jede Probe wurde dreifach aufgearbeitet und
67 Eigene Untersuchungen
gemessen. An zwei Ionenübergängen (218/97 und 187/57) wurde von den Peakhöhen der
niedrigsten, sich vom Untergrundrauschen abhebenden Konzentrationsstufe der Mittelwert
und die Standardabweichung gebildet. Dann wurde die Peakhöhe des Untergrundrauschens
von 10 Blankproben in Plasma und Urin ermittelt und daraus jeweils ein Mittelwert gebildet.
Nach Addition des 4-MAA-Signal-Mittelwertes zu dem dreifachen der Standardabweichung
muss sich ein Verhältnis zum Mittelwert der Peakhöhen des Untergrundrauschens von
mindestens 3:1 ergeben.
Die Bestimmungsgrenze (Quantifizierungsgrenze, limit of quantification, LOQ) legt die
niedrigste mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantitativ bestimmbare Konzentration
einer zu analysierenden Substanz fest.
Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze sind mindestens fünf Proben im gewählten
Konzentrationsbereich aufzuarbeiten und mittels HPLC/MS/MS zu quantifizieren. Die
Abweichung zwischen einem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert darf
nicht mehr als 20% betragen. Die Bestimmungsgrenze (BG) kann annähernd errechnet
werden: BG � 3 · NG [19]
3.3.1.6. Stabilität
Es ist für die gesamte Dauer des Ausscheidungsversuches, von der Probenentnahme bis zum
Abschluss der Analytik, zu gewährleisten, dass die zu quantifizierende Substanz bei der
Lagerung stabil ist. Zur Ermittlung der Stabilität im Plasma wurden 24 Blankplasmaproben
mit 4-MAA versetzt, so dass jeweils 12 Ansätze mit Konzentrationen 10 µg/ml bzw. 100
µg/ml erstellt wurden. Zur Ermittlung der Lagerstabilität von 4-MAA im Urin wurden
ebenfalls 24 Blankurinproben mit 4-MAA versetzt (12 Proben einer 100 µg/ml und 12 Proben
einer 1000 µg/ml Konzentration). Proben gleicher Konzentrationen wurden gepoolt und auf
12 Reagensgläser zu gleichen Mengen verteilt. Sechs Proben jeder Konzentration wurden
sofort mit internem Standard versetzt, aufgearbeitet und zusammen mit einer
Kalibrationsreihe mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. Die restlichen Proben wurden unter
gleichen Bedingungen wie die Proben des Ausscheidungsversuches der Pferde über acht
Wochen bei minus 20 ºC tiefgefroren. Nach diesem Zeitraum, der der maximalen
Lagerungsdauer der Versuchsproben entspricht, werden diese Proben mit einer frisch
erstellten Kalibrationsreihe gemessen.
68 Eigene Untersuchungen
Für Plasma und Urin getrennt werden die Mittelwerte der zwei Messreihen mit dem T-Test
bei einseitiger Fragestellung verglichen. Von den Messreihen werden die Mittelwerte (X1 und
X2), die Standardabweichungen (s1 und s2), die Anzahl der Messungen (n1 und n2) sowie die
Freiheitsgerade (f1 und f2) bestimmt. Die Prüfgröße PGT wird wie folgt berechnet:
PGT = 21
21
21
22
212
1
21
nnnn
fffsfs
XX
+⋅
⋅
+⋅+⋅
− [20]
Der kritische Wert KWt kann aus statistischen Tabellen entnommen oder wie folgt berechnet
werden:
KWt = TINV (� · 2/f1+f2) [21]
Ist die Prüfgröße PGT kleiner als der kritische Wert KWt liegen zwischen den Mittelwerten
der Messreihen mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,01 keine Unterschiede vor.
3.3.1.7. Wiederfindung
Die Bestimmung der Wiederfindungsrate von 4-MAA wurde mit einer Konzentration von 50
µg/ml im Plasma und 100 µg/ml im Urin durchgeführt. Für beide Matrices wurden jeweils 12
Proben aufgearbeitet. Den Blank-Proben 1 bis 6 wurde nur die 4-MAA Standardlösung in
entsprechender Konzentration zu Beginn der Aufarbeitung zugegeben. Abweichend von dem
gewohnten Aufarbeitungsschema wurde den Proben der interne Standard, das DMAP, in
entsprechender Konzentration erst nach dem Einengen am Rotationsverdampfer zugegeben
und die Proben anschließend bis zu vollständigen Trockne für zwei Stunden in einen
Exsikator verbracht wurden. Anschließend wurden die Proben mit Anfangspuffer gelöst und
in Autosamplervials überführt und quantifiziert. Den Proben 7 bis 12 wurde sowohl das 4-
MAA als auch der interne Standard erst nach dem Einengen am Rotationsverdampfer
zugegeben. Die weitere Behandlung erfolgte entsprechend den Proben 1 bis 6. Nach der
Messung wurde die Wiederfindungsrate des 4-MAA aus Plasma und Urin wie folgt
berechnet:
69 Eigene Untersuchungen
Wiederfindung [%] = 100127Pr)/(61Pr)/(
•−−
obenAreaAreaMWobenAreaAreaMW
ISTDS
ISTDS [22]
3.4. Messung der Proben aus dem Hauptversuch
3.4.1. Kalibrationsreihe im Plasma zur Quantifizierung des
Ausscheidungsversuches
Mit jeder Aufarbeitung von Plasmaproben des Ausscheidungsversuches wurde zu deren
Quantifizierung eine Kalibrationsreihe mit mindestens fünf verschiedenen 4-MAA-
Konzentrationen durch spiken von Blankplasma angefertigt. Eine Leerplasmaprobe, der nur
der interne Standard zugesetzt wurde, gehört zu jeder Kalibrationsreihe und ist nicht in den
fünf Konzentrationen enthalten. Diese fünf Konzentrationen decken den erwarteten
Substanzmengenbereich der Proben des Ausscheidungsversuches. Für niedrige und hohe
Konzentrationsbereiche wurde je eine eigene Kalibrierreihe erstellt. Jede Konzentration der
Kalibrierung wurde doppelt aufgearbeitet und gemessen. Die 4-MAA-Konzentrationen der
Kalibrierkurven, die Konzentration der verwendeten Standard- und Arbeitslösungen sowie die
jeweils zugegebene Menge sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt.
Tabelle 4: Eichwerte für die Kalibrierung im Plasma -niedrige Konzentrationen-
zur Quantifizierung der Plasmaproben p09 bis p16 und p00
Konzentration in µg/ml
Verwendete
Standard-/ Arbeitslösung
in µg/ml
zugegebene Menge in µl
0,5 10 50
1,0 100 10
2,5 100 25
5,0 100 50
7,5 100 75
10,0 1000 10
25,0 1000 25
70 Eigene Untersuchungen
Tabelle 5: Eichwerte für die Kalibrierung im Plasma -hohe Konzentrationen-
zur Quantifizierung der Plasmaproben p01 bis p08
Konzentration in µg/ml
Verwendete
Standard-/ Arbeitslösung
in µg/ml
zugegebene Menge in µl
10 1000 10
25 1000 25
50 1000 50
75 1000 75
100 1000 100
125 10000 12,5
150 10000 15
3.4.2. Kalibrationsreihe im Urin zur Quantifizierung des
Ausscheidungsversuches
Die Prinzipien zur Erstellung von Eichkurven im Plasma wie unter 3.4 beschrieben gelten
gleichfalls für die Erstellung von Eichkurven im Urin. Die 4-MAA-Konzentrationen der
Eichkurven, die Konzentration der verwendeten Standard- und Arbeitslösungen sowie die
jeweils zugegebene Menge sind in den Tabellen 6 und 7 dargestellt.
Tabelle 6: Eichwerte für die Kalibrierung im Urin -niedrige Konzentrationen-
zur Quantifizierung der Urinroben u08 bis u11 und u00
Konzentration in µg/ml
Verwendete
Standard-/ Arbeitslösung
in µg/ml
zugegebene Menge in µl
0,25 10 25
0.5 10 50
1,0 100 10
2,0 100 20
71 Eigene Untersuchungen
4,0 100 40
5,0 100 50
6,0 100 60
7,5 100 75
8,0 100 80
10,0 1000 10
Tabelle 7: Eichwerte für die Kalibrierung im Urin -hohe Konzentrationen- zur Quantifizierung der
Urinproben u01 bis u07
Konzentration in µg/ml
Verwendete
Standard-/ Arbeitslösung
in µg/ml
zugegebene Menge in µl
50 1000 50
250 10000 25
500 10000 50
750 10000 75
1000 10000 100
2500 10000 250
3750 10000 350
5000 10000 500
3.5. Pharmakokinetische Auswertung
Pharmakokinetische Berechnungen erfolgten mit dem Programm Pharsight WinNonLin 4.1
der Firma Pharsight Corporation unter Verwendung eines offenen Zwei-Kompartiment-
Modells.
72 Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Massenspektren und Strukturformel von 4-MAA (Analyt) und
DMAP (interner Standard)
Die Massenspektren von 4-MAA und DMAP, die nach Ionisation und Aufreinigung im
Tandem-Massenspektrum durch den Detektor aufgezeichnet wurden, sind in den Abbildungen
7 und 8 dargestellt. Unter den in 3.2.5.2 und 3.2.5.6 beschriebenen HPLC-Bedingungen hat 4-
MAA eine Retentionszeit von 3,1 ± 0,1 Minuten und wird im Massenspektrum mit den
Massen m/z = 218 und m/z = 187 detektiert. DMAP gelangt nach einer Retentionszeit von 3,4
± 0,1 Minuten von der Chromatographiesäule und wird im Massenspektrum mit den Massen
m/z = 232 und m/z = 97 aufgezeichnet. Unter den Messbedingungen waren die
Retentionszeiten bei Berücksichtigung tagesabhängiger Schwankungen (± 0,1 Minuten) über
den gesamten Verlauf der Studie konstant. In die Massenspektren ist die Strukturformeln der
jeweiligen Substanz integriert. Gleichzeitig ist beispielhaft dargestellt, an welcher Stelle des
4-MAA-Moleküls ein für die Substanz charakteristisches Fragment mit einer bestimmten
Molmasse abgespalten wird. Nach Abspaltung entsteht aus dem 4-MAA ein Fragment mit der
Masse 97 bzw. 56 mol. Neben diesen Hauptfragmenten entstehen noch eine Vielzahl
zusätzlicher Fragmente, die ebenfalls molekülspezifisch sind, auf die hier aber nicht
eingegangen werden soll.
73 Ergebnisse
Die Abbildung 9 zeigt ein in dieser Studie erhaltenes Chromatogramm, auf dem links 4-MAA
und rechts DMAP detektiert wurde.
74 Ergebnisse
Abb. 9: Chromatogramm einer 4-MAA und DMAP enthaltenen Plasmaprobe
4.2. Validierung der Analysenmethode
4.2.1. Selektivität und Spezifität
Wie unter 3.2.5.7 beschrieben wurden Leerplasma und –urinproben, denen 4-MAA und
DMAP zugesetzt wurde, untersucht, um die Spezifität der Methode für die zu untersuchende
Substanz (4-MAA) und den internen Standard (DMAP) zu prüfen. Es konnte festgestellt
werden, dass diese Substanzen ohne Verfälschung durch Serum- bzw. Urininhaltsstoffe
(Spezifität) und ohne gegenseitige Störung bei ausreichender Trennung (Selektivität) mit der
verwendeten Messmethode erfasst werden.
Die Abbildungen 10 und 11 zeigen vergleichend Ausschnitte aus Gesamtchromatogrammen
von Plasma- und Urinproben zum Zeitpunkt der Retention von 4-MAA, die kein 4-MAA
(Leermatrixprobe) und 4-MAA in verschiedenen Konzentrationen enthalten.
75 Ergebnisse
4-MAA 217,8/97,0 4-MAA 217, 8/97,0 4-MAA 217,8/97,0
(Area=217,0) (Intensity=91,1) (Area=200857,8) (Intensity=60339,7) (Area=8926730,1) (Intensity=2426494,4)
a) b) c)
Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm von Plasmaproben, denen (a) kein 4-MAA, (b) 1µg
4-MAA/ml und (c) 100 µg 4-MAA/ml zugesetzt wurde
4-MAA 217,8/97,0 4-MAA 217, 8/97,0 4-MAA 217,8/97,0
(Area=255) (Intensity=98,1) (Area=50232) (Intensity=9488) (Area=3020032) (Intensity=865890)
a) b) c)
Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm von Urinproben, denen (a) kein 4-MAA, (b) 0,5
µg 4-MAA/ml und (c) 1000 µg 4-MAA/ml zugesetzt wurde
76 Ergebnisse
4.2.2. Prüfung auf Linearität
Die Kalibrationskurven für 4-MAA wurden im Plasma im Bereich von 0,25 bis 10 µg/ml
bzw. von 10 bis 250 µg/ml und im Urin im Bereich von 0,5 bis 100 µg/ml bzw. von 100 bis
8000 µg/ml an verschiedenen Tagen überprüft. In einem Graphen wurde die theoretisch zu
erwartende Konzentration des 4-MAA gegen den Quotienten des gemessenen
Peakflächenverhältnisses von 4-MAA zu DMAP aufgetragen (siehe Abbildungen 12 und 13).
Die Kalibrationsgleichungen aller Messungen folgen einer quadratischen Regression der
Form y = ax2 + cx + b, die neben dem Korrelationskoeffizienten (Bestimmtheitsmaß = R2)
immer im jeweiligen Graphen angezeigt werden. Die Abweichungen der gemessenen von der
theoretisch zu erwartenden Konzentration betrugen an allen Messtagen im Durchschnitt
weniger als 15% bzw. im Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20%. Das
Bestimmtheitsmaß der quadratischen Regression erreicht bei allen Kalibrationskurven einen
Wert von R2 > 0,994 im Plasma bzw. von R2 > 0,995 im Urin.
y = -0,0001201441x2 + 0,1173098011x - 0,0632107525R2 = 0,9980957133
-5
0
5
10
15
20
25
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Konzentration 4-MAA [µg/ml]
Quo
tien
t (2
18/2
32)
Abb. 12: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient für 4-MAA im
Plasma (ermittelt nach Messung der unter 3.3.1.2 beschriebenen Proben)
77 Ergebnisse
y = -0,0000000216x2 + 0,0010349686x - 0,0395396089R2 = 0,9993694945
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
Konzentration 4-MAA in µg/ml
Quo
tien
t (2
18/2
32
Abb. 13: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient für 4-MAA im
Urin (ermittelt nach Messung der unter 3.3.1.2 beschriebenen Proben)
4.2.3. Richtigkeit
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit der verwendeten Methode
im Plasma dargestellt. Dabei wurde an drei verschiedenen Messtagen die Richtigkeit als
relative Abweichung [RE (%)] der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages
von den erwarteten Konzentrationen bestimmt. Die Ergebnisse liegen alle unterhalb der
maximal zulässigen Abweichung von 15% im oberen und 20% im mittleren und niedrigen
(nahe dem LLOQ) Kalibrationsbereich.
Tabelle 8: relative Abweichung (RE) als Beweis der Richtigkeit der Methode für
4-MAA im Plasma
Tag Anzahl
der
Proben
Erwartete
Konzentration
4-MAA [µg/ml]
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen 4-MAA [µg/ml]
Relative
Abweichung
RE [%]
1 6 1 0,99 0,51
78 Ergebnisse
6
6
10
100
10,49
102,32
4,87
2,32
2 6
6
6
1
10
100
0,98
9,96
100,35
1,78
0,44
0,35
3 6
6
6
1
10
100
0,99
9,78
92,13
0,84
2,24
7,87
In Tabelle 9 sind die Abweichungen der Mittelwerte der gemessenen von der theoretisch
erwarteten Konzentration als relative Abweichung [RE (%)] der Messungen für Urin
dargestellt. Die Ergebnisse liegen ebenfalls alle unterhalb der maximal zulässigen
Abweichung von 15% im oberen bzw. 20% im unteren (nahe dem LLOQ)
Konzentrationsbereich.
Tabelle 9: relative Abweichung (RE) als Beweis der Richtigkeit der Methode für 4-MAA im Urin
Tag Anzahl
der
Proben
Erwartete
Konzentration
4-MAA [µg/ml]
Mittelwert der gemessenen
Konzentrationen 4-MAA
[µg/ml]
Relative
Abweichung
RE [%]
1 6
6
6
10
100
1000
10,03
108,07
930,00
0,28
8,07
7,00
2 6
6
6
10
100
1000
9,95
91,40
929,01
0,47
8,6
7,10
3 6
6
6
10
100
1000
9,41
91,80
917,99
5,88
8,20
8,20
79 Ergebnisse
4.2.4. Präzision
Die Wiederholpräzision (Tagespräzision, intraday repeatability) und die Zwischenpräzision
(interday repeatability) wurden wie unter 3.3.1.4 beschrieben errechnet. Die Ergebnisse zur
Bestimmung der Präzision der Analysenmethode der Studie sind den Tabellen 10 (für Plasma)
und 11 (für Urin) aufgeführt. Alle Ergebnisse liegen innerhalb der maximal zulässigen
Abweichung von 15% im oberen Kalibrationsbereich bzw. 20% im Bereich der
Quantifizierungsgrenze.
Tabelle 10: Intraday und Interday Präzision der Methode für Plasma
Erwartete Konzentration
4-MAA [µg/ml]
Wiederholpräzision
(intraday repeatability) [%]
Zwischenpräzision
(interday repeatability) [%]
1 5,22 0,67
10 3,15 3,67
100 5,77 5,50
Tabelle 11: Intraday und Interday Präzision der Methode für Urin
Erwartete Konzentration
4-MAA [µg/ml]
Wiederholpräzision
(intraday repeatability) [%]
Zwischenpräzision
(interday repeatability) [%]
10 4,09 3,43
100 7,96 9,50
1000 1,77 0,72
80 Ergebnisse
4.2.5. Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)
Die Nachweisgrenze von 4-MAA im liegt bei der in dieser Studie verwendeten Methode bei
0,25 µg/ml Plasma und bei 0,5 µg/ml Urin. Diese Werte wurden gemäß der Angaben unter
3.3.1.5 ermittelt.
4.2.6. Quantifizierungsgrenze (Bestimmungsgrenze, Limit of quantification,
LOQ)
Die Quantifizierungsgrenze für 4-MAA beträgt für die in der Studie angewendete Methode
aufgrund der Ergebnisse für Präzision und Richtigkeit 1 µg/ml Plasma und 10 µg/ml Urin.
Diese Werte wurden wie unter 3.3.1.5 beschrieben festgelegt.
4.2.7. Stabilität
Zur Überprüfung der Lagerstabilität von 4-MAA im Plasma und Urin wurden für jede Matrix
zwei Messreihen mit 2 Konzentrationen zu je 12 Proben erstellt. Sechs Proben jeder
Konzentration wurden in der ersten Messreihe am Tag Null zusammen mit einer
tagesaktuellen Kalibrationsreihe aufgearbeitet und gemessen, die restlichen Proben in einer
zweiten Messreihe acht Wochen später nach Lagerung bei –20° C. In den Tabellen 12 und 13
sind die Ergebnisse dargestellt.
81 Ergebnisse
Tabelle 12: Stabilität von 4-MAA im Plasma;
Vergleich der Daten am Tag Null mit denen nach Lagerung bei –20° C nach 8 Wochen
Messreihe
erwartete
Konzentration
4-MAA[µg/ml]
Anzahl der
Messungen
Mittelwert
[µg/ml]
Standard-
abweichung
[µg/ml]
Variations-
koeffizient
[%]
1 10 6 10,02 0,22 2,22
2 10 6 10,49 0,33 3,13
1 100 6 109,82 1,70 1,56
2 100 6 118,10 2,12 1,80
Tabelle 13: Stabilität von 4-MAA im Urin;
Vergleich der Daten am Tag Null mit denen nach Lagerung bei –20° C nach 8 Wochen
Messreihe
erwartete
Konzentration
4-MAA[µg/ml]
Anzahl der
Messungen
Mittelwert
Standard-
abweichung
[µg/ml]
Variations-
koeffizient
[%]
1 100 6 113,13 2,14 1,89
2 100 6 106,56 3,72 3,49
1 1000 6 907,22 35,48 3,91
2 1000 6 1044,51 59,44 5,69
Aufgrund der Ergebnisse konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den
Messreihen gezeigt werden. 4-MAA gilt in beiden Matrices als lagerstabil.
4.2.8. Wiederfindung (Recovery)
Die Wiederfindung gibt den Prozentsatz der nach der Probenaufarbeitung und Extraktion
tatsächlich „ wiedergefunden“ Substanzmenge im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen
Menge an. Die Bestimmung der Wiederfindung des 4-MAA im Plasma und Urin wurde wie
unter 3.3.1.7 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse der Prüfung auf Wiederfindung sind
82 Ergebnisse
in der Tabellen 14 aufgeführt. Im Plasma wird 4-MAA zu 29,84% und im Urin zu 9,5%
wiedergefunden.
Tabelle 14:
Wiederfindung von 4-MAA im Plasma und Urin
Matrix
Anzahl der
Proben
Mittlere
Wiederfindungsrate
[%]
Plasma 12 29,84
Urin 12 9,5
4.3. Ergebnisse des Hauptversuchs
4.3.1. Konzentrationen von 4-MAA im Plasma
In Abbildung 14 ist der Konzentrationsverlauf von 4-MAA im Plasma nach einmaliger
intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei allen 10 Pferden dargestellt. Die
Abbildung zeigt nur Konzentrationen, die oberhalb der Quantifizierungsgrenze liegen. Der
Konzentrationsverlauf während der ersten 30 Minuten p.a. ist in der Ausschnittsgraphik
verdeutlicht. Zum ersten Entnahmezeitpunkt, zwei Minuten nach der intravenösen
Applikation, wird bei allen Pferden die höchste Konzentration gemessen. Diese lag bei den
Pferden zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml Plasma. Bei allen Pferden sind die
Plasmakonzentrationen nach 24 Stunden unter die Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml
gesunken. Das Unterschreiten der Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml Plasma ist bei neun
Pferden ebenfalls nach 24 Stunden post applicationem (p.a.) erfolgt. Bei einem Pferd ist der
Plasmaspiegel erst 36 Stunden p.a. unter die Nachweisgrenze abgesunken.
83 Ergebnisse
0
50
100
150
200
250
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Zeit nach i.v. Applikation [h]
Kon
zent
ratio
n 4-
MA
A [µ
g/m
l Pla
sma]
Pferd APferd BPferd C
Pferd DPferd EPferd F
Pferd GPferd HPferd IPferd J
0
50
100
150
200
250
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Abb. 14: Plasmakonzentrationsverlauf von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von
30 mg/kg Metamizol bei 10 Pferden
Abbildung 15 zeigt die halblogarithmische Darstellung des Plasmakonzentrationsverlaufs
innerhalb der ersten 12 Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW bei den
Pferden der Studie.
84 Ergebnisse
Abb. 15: halblogarithmische Darstellung des Plasmakonzentrationsverlaufs innerhalb der ersten 12
Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei 10 Pferden
4.3.2. Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma
Die pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten unter Annahme eines offenen Zwei-
Kompartiment-Modells. Der Konzentrationsbereich von der maximal erreichten
Konzentration (Cmax) bis zur Quantifizierungsgrenze wurde in die Berechnungen einbezogen.
Tabelle 15 zeigt eine Zusammenfassung der errechneten Daten.
1
10
100
1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Zeit nach i.v. Applikation [h]
Kon
zent
ratio
n 4-
MA
A [µ
g/m
l Pla
sma]
Pferd APferd BPferd CPferd DPferd EPferd FPferd GPferd HPferd IPferd J
85 Ergebnisse
Tabelle 15: Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma nach einmaliger intravenöser
Applikation von 30 mg/kg KGW bei 10 Pferden (der niedrigste und der höchste
Wert sind hervorgehoben)
Parameter Einheit Pferd
A
Pferd
B
Pferd
C
Pferd
D
Pferd
E
Pferd
F
Pferd
G
Pferd
H
Pferd
I
Pferd
J
� [1/h] 8,8 5,5 9,2 15,7 22,1 10,5 17,5 22,5 8,6 9,4
t50 (�) [h] 0,08 0,12 0,08 0,04 0,03 0,07 0,04 0,03 0,08 0,07
ß [1/h] 0,3 0,2 0,4 0,6 0,8 0,3 0,8 1,3 0,3 0,3
t50 (�) [h] 2,6 2,9 1,7 1,2 0,8 2,1 0,9 0,6 2,1 2,2
MRT [h] 3,2 3,5 2,1 1,4 1,1 2,6 1,0 0,7 2,4 2,6
Vss [ml/kg] 997,0 802,3 564,3 422,4 464,9 684,5 481,0 336,2 762,6 807,2
Clearance [ml/h/kg] 312,3 232,2 267,1 297,3 427,4 263,8 463,7 495,3 314,6 310,3
AUC [µg/ml*h] 96,1 129,2 112,3 100,9 70,2 113,7 64,7 60,6 95,4 96,7
Cmax [µg/ml] 164,2 146,0 209,1 300,5 220,4 212,2 255,9 277,4 190,8 192,7
Erläuterung der in den Tabellen 15 und 16 verwendeten Abkürzungen:
� , � = Hybridkonstante der Verteilungs- bzw. Eliminationsphase
t50 (�) = Halbwertzeit der Verteilungsphase
t50 (�) = Halbwertzeit der Eliminationsphase
MRT = Mean Residue Time - mittlere Verweildauer eines Substanzmoleküls im Organismus
Vss = Verteilungsvolumen im Steady State
AUC = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
Cmax = maximal gemessene Konzentration im Plasma
86 Ergebnisse
In der folgenden Tabelle 16 sind Mittelwerte, Standardabweichungen und
Variationskoeffizienten für die in Tabelle 15 aufgeführten Parameter als Ergebnisse der
pharmakokinetischen Berechnungen für 4-MAA im Plasma angegeben.
Tabelle 16: Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient pharmakokinetischer Daten
von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (die
Erläuterungen der Abkürzungen entsprechen denen der Tabelle 15)
Parameter Einheit Mittelwert bei
n = 10
Standard-
abweichung
Variations-
koeffizient
� [1/h] 12,98 6,03 46,47
T50 (�) [h] 0,064 0,028 44,92
� [1/h] 0,53 0,35 65,39
T50 (�) [h] 1,71 0,80 46,66
MRT [h] 2,06 0,97 46,91
Vss [ml/kg] 632,24 210,68 33,32
Clearance [ml/min] 338,4 90,61 26,78
AUC [µg/ml*h] 93,98 22,52 23,96
Cmax [µg/ml] 216,92 48,69 22,45
4.3.3. Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse
Bei der Analyse der Urinproben aus dem Vorversuch wurde geprüft, ob 4-MAA in
glucuronidierter und/oder sulfatierter Form mit dem Pferdeurin ausgeschieden wird. Dazu
wurde die erste Urinprobe (ca. 2 Stunden nach Versuchsbeginn gewonnen) eines Pferdes
dreifach unterschiedlich mit Hydrolyseschritt aufgearbeitet und zwar mit
• ß-Glucuronidase von Escherichia coli,
• ß-Glucuronidase/ Arylsulfatase von Helix pomatia, sowie
• Cystein.
Zusätzlich wurde die gleiche Urinprobe dreifach ohne Hydrolyse aufgearbeitet. Die
Extraktionsausbeuten, die durch die Quotienten der integrierten Flächen von 4-MAA zu
87 Ergebnisse
DMAP dargestellt werden, waren ohne Hydrolyseschritt größer. Dementsprechend wurden
alle Urinproben des Hauptversuches ohne Hydrolyse aufgearbeitet.
4.3.4. Konzentrationen von 4-MAA im Urin
Abbildung 16 zeigt den Konzentrationsverlauf von 4-MAA im Urin bis 180 Stunden nach
einmaliger intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol von allen 10 Pferden.
Die Ausschnittsgraphik ergibt eine deutlichere Darstellung des Konzentrationsverlaufs
innerhalb der ersten 24 Stunden. Für die erste Urinprobe, zwei Stunden nach der Applikation,
konnten bei den Pferden A, D und I keine Daten ermittelt werden. Gleiches gilt für die Daten
der fünften Urinprobe nach 36 Stunden des Pferdes D. Bei allen Pferden, für die eine
Konzentration der ersten Urinprobe ermittelt werden konnte, ist diese die höchste gemessene
Konzentration im Urin. Sie lag bei den Pferden zwischen 1209,7 und 5021,7 µg/ml Urin. Bei
vier Pferden sind die Urinkonzentrationen nach 24 Stunden unter die Quantifizierungsgrenze
von 10 µg/ml gesunken, wohingegen bei fünf Pferden diese erst nach 36 Stunden
unterschritten wurde. Bei Pferd D kann diesbezüglich auf Grund des Fehlens der Probe (nach
36 h) keine Aussage getroffen werden; in der Urinprobe 49,1 Stunden p.a. liegt die 4-MAA-
Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml. Bei einem Pferd ist die
Nachweisgrenze des 4-MAA im Urin bereits nach 30,3 Stunden unterschritten. Die 4-MAA-
Urinkonzentration von vier Pferden liegen 36 Stunden p.a. unterhalb der Nachweisgrenze.
Demgegenüber benötigt ein Pferd 50,1 und ein weiteres Pferd 94,2 Stunden bis zum
Unterschreiten der Nachweisgrenze.
88 Ergebnisse
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Zeit nach i.v. Applikation [h]
Kon
zent
ratio
n 4-
MA
A [µ
g/m
l Urin
]
Pferd APferd B
Pferd CPferd DPferd EPferd FPferd GPferd HPferd IPferd J
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Abb. 16: Urinkonzentrationsverlauf von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von
30 mg/kg Metamizol bei 10 Pferden
In Abbildung 17 ist der Urinkonzentrationsverlauf nach intravenöser Applikation von 30
mg/kg KGW Metamizol bei allen 10 Pferden der Ausscheidungsstudie bis zum Erreichen der
Nachweisgrenze in halblogarithmischer Form dargestellt. Abbildung 18 zeigt in kumulativer
Darstellung die 4-MAA-Ausscheidung mit dem Urin bei Annahme einer produzierten
Urinmenge von 1 ml/kg KGW pro Stunde.
89 Ergebnisse
1
10
100
1000
10000
5,33 9,50 25,00
Zeit nach i.v. Applikation [h]
Kon
zent
ratio
n 4-
MA
A [
µg/m
l Uri
n]
Pferd A
Pferd BPferd C
Pferd D
Pferd EPferd F
Pferd G
Pferd HPferd I
Pferd J
Abb. 17: halblogarithmische Darstellung des Urinkonzentrationsverlaufs innerhalb der ersten 10
Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei 10 Pferden
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Zeit nach i.v. Applikation [h]
Men
ge 4
-MA
A im
Uri
n [m
g]
Pferd BPferd CPferd EPferd F
Pferd GPferd HPferd J
Abb. 18: Kumulative Darstellung der 4-MAA-Ausscheidung mit dem Urin bei Annahme einer
produzierten Urinmenge von 1 ml/kg KGW pro Stunde
90 Ergebnisse
4.4. Berechnung der effektiven und irrelevanten Plasma- und
Urinkonzentrationen
TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickelten ein PK/PD-Modell, mit dessen Hilfe aus
erhobenen pharmakokinetischen Daten effektive bzw. irrelevante Plasma- und
Urinkonzentrationen berechnet werden können. Die effektive Plasmakonzentration (EPC) pro
Dosierungsintervall wird unter Berücksichtigung der Dosierung (D) und der Clearance (Cl)
nach folgender Gleichung ermittelt.
EPC = ClearanceDosierung
[µg/ml] [23]
Bei parenteraler Applikationsweise müßte in o.g. Gleichung die Dosis mit der
Bioverfügbarkeit multipliziert werden. Da bei intravenöser Verabreichung die
Bioverfügbarkeit einen Wert von 1 annimmt, wird sie in der Formel nicht aufgeführt.
Die irrelevante Plasmakonzentration (IPC) läst sich aus der EPC unter Annahme eines
Sicherheitsfaktors (SF) nach Gleichung [24] berechnen. Der von TOUTAIN und
LASSOURD (2002) eingesetzte Sicherheitsfaktor soll dem Ausgleich interindividueller
Schwankungen und der Gewährleistung der Validität der Daten dienen und wurde auf den
Zahlenwert 500 festgelegt.
IPC = SF
EPC [µg/ml] [24]
Nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) wird die irrelevante Urinkonzentration (IUC) wie
folgt berechnet:
IUC = IPC � Rss [µg/ml] [25]
Rss stellt dabei das Konzentrationsverhältnis von Urin zu Plasma im Steady-State dar. Die
Berechnung erfolgt nach Gleichung [26].
Rss = rationsmakonzentttlichePladurchschnitionnkonzentrattlicheUridurchschni
[26]
91 Ergebnisse
Die durchschnittliche Urinkonzentration (CUrinø) wird in dieser Studie wie folgt errechnet:
Addition der Urinkonzentrationen, die in dem Zeitraum eines angenommenen
Dosierungsintervalls von 8 Stunden liegen und anschließende Division durch die Anzahl der
addierten Konzentrationen.
Die durchschnittliche Plasmakonzentration (CPlasmaø) errechnet sich nach Gleichung [27] unter
Einbeziehung der maximalen Plasmakonzentration (Cmax) und der Eliminationskonstanten (�)
(KIETZMANN, 1983).
CPlasmaø = tervallDosierung
Csin
max
•β [µg/ml] [27]
Die EPC, IPC und IUC wurden entsprechend der oben aufgeführten Gleichungen nach
Einsetzen der in Tabelle 15 aufgeführten für Plasma ermittelten pharmakokinetischen Daten
für alle 10 Pferde berechnet und sind in Tabelle 17 dargestellt. Dabei wurde ein
Dosierungsintervall von 8 Stunden angenommen (EBERT et al. 2002). Tabelle 17 zeigt die
Ergebnisse der EPC, IPC und IUC entsprechend oben beschriebener Vorgehensweise der
Berechnung nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) von 10 Pferden nach einer intravenösen
Dosierung von 30 mg/kg KGW bei einem Dosierungsintervall von 8 Stunden. Bei den Pferden
A, D und I konnten keine Werte für die IUC ermittelt werden, da bei diesen Pferden die mit in
die Berechnung einfließende Konzentration der ersten Urinprobe nicht auszuwerten war.
Tabelle 17: nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) berechnete EPC, IPC und IUC von 10 Pferden
einschließlich Mittelwert und Standardabweichung nach einer Dosierung von 30 mg/kg KGW bei
einem Dosierungsintervall von 8 Stunden (der niedrigste und der höchste Wert sind unterlegt)
Para-
meter
Ein-
heit
Pferd
A
Pferd
B
Pferd
C
Pferd
D
Pferd
E
Pferd
F
Pferd
G
Pferd
H
Pferd
I
Pferd
J MW S
EPC
(8h) µg/ml 64,17 86,05 76,38 78,30 48,01 85,75 28,34 31,74 45,30 50,08 59,41 21,65
IPC
(8h) µg/ml 0,13 0,17 0,15 0,16 0,10 0,17 0.06 0,06 0,09 0,10 0,12 0,04
IUC
(8h)
µg/ml
n.e. 2,21 2,83 n.e. 4,94 1,77 1,49 1,30 n.e 0,79 2,19 1,38
92 Ergebnisse
Erläuterung der in Tabelle 17 verwendeten Abkürzungen:
EPC = effektive Plasmakonzentration
IPC = irrelevante Plasmakonzentration
IUC = irrelevante Urinkonzentration
MW = Mittelwert
n.e. = Daten nicht ermittelt
S = Standardabweichung
Nach diesen Berechnungen ist ersichtlich, dass die EPC immer deutlich oberhalb der
Quantifizierungsgrenze (1 µg/ml Plasma) liegt. Die IPC liegt jedoch bei allen Pferden dieser
Ausscheidungsstudie unterhalb der Nachweisgrenze von 0,25 mg 4-MAA/ml Plasma.
Die IUC liegt bei allen Tieren deutlich unterhalb der Quantifizierungsgrenze von 10 µg/ml
Urin als auch deutlich oberhalb der Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml.
4.5. Berechnung von Ausscheidungszeiten von 4-MAA aus Plasma und Urin
Die Zeit für die Ausscheidung von 4-MAA aus dem Plasma bis zum Erreichen der
irrelavanten Plasmakonzentration (ta(IPC)) kann nach Gleichung [28] berechnet werden
(KIETZMANN, 1983):
ta(IPC) = β
IPCC lnln max −[h] [28]
Um die Ausscheidungszeit von 4-MAA aus dem Plasma bis a) zum Erreichen der
Quantifizierungsgrenze (ta(LOQ)) bzw. b) der Nachweisgrenze (ta(LOD)) zu errechnen, kann die
Gleichung [28] modifiziert werden:
a): ta(LOQ) = β
LOQCC lnln max −[h] [ 29]
b): ta(LOD) = β
LODCC lnln max −[h] [30]
93 Ergebnisse
Erläuterungen zu den Gleichungen 28, 29 und 30:
C(LOQ) = Konzentration der Quantifizierungsgrenze
C(LOD) = Konzentration der Nachweisgrenze
Cmax = maximale Konzentration
ta(IPC) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration
ta(LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der
Quantifizierungsgrenze
ta(LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der Nachweisgrenze
� = Eliminationskonstante
Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse der Berechnungen der Ausscheidungszeiten von 4-MAA bis
zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (ta(IPC)) als auch bis zum Erreichen der
Quantifizierungs (ta(LOQ))- und Nachweisgrenze(ta(LOD)). Die Zeit bis zum Erreichen der
irrelevanten Plasmakonzentration betrug bei den Pferden zwischen 6,5 und 33,7 Stunden und
lag im Mittel bei 18,9 Stunden. Die Ausscheidung von 4-MAA aus dem Plasma bis zum
Erreichen der Quantifizierungsgrenze dauerte zwischen 4,3 und 24,9 Stunden bzw.
durchschnittlich 13,6 Stunden. Bis zum Erreichen der Nachweisgrenze betrug die
Ausscheidungszeit aus dem Plasma zwischen 4,8 und 27,9 Stunden. Die mittlere
Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze liegt bei 15,1 Stunden.
94 Ergebnisse
Tabelle 18 : nach KIETZMANN (1983) berechnete Ausscheidungszeiten (ta(IPC) , ta(LOQ) , ta(LOD)) von
4-MAA bei 10 Pferden nach einer intravenösen Verabreichung von 30 mg/kg KGW Metamizol und
einem Dosierungsintervall von 8 Stunden (der niedrigste und der höchste Wert sind unterlegt)
Para-
meter
Einheit Pferd
A
Pferd
B
Pferd
C
Pferd
D
Pferd
E
Pferd
F
Pferd
G
Pferd
H
Pferd
I
Pferd
J
MW S
ta(IPC)
[h]
23,85
33,72
18,05
12,60
9,67
23,74
10,52
6,45
25,51
25,21
18,93
8,83
ta(LOQ)
[h]
17,00
24,92
13,36
9,51
6,74
17,86
6,93
4,33
17,50
17,54
13,57
6,52
ta(LOD)
[h]
19,01
27,93
14,86
10,51
7,50
19,87
7,68
4,79
19,51
19,54
15,12
7,32
Erläuterungen zu den Abkürzungen der Tabelle 18:
ta(IPC) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration
ta(LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der
Quantifizierungsgrenze
ta(LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der Nachweisgrenze
95 Diskussion
5. Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es einerseits, eine geeignete Analysenmethode zum quantitativen
Nachweis von 4-MAA, dem Hauptmetaboliten des Arzneistoffes Metamizol, im Plasma und
Urin von Pferden bei Einsatz eines Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographen und
anschließender Detektion durch ein Tandem-Massenspektrometer zu erarbeiten und zu
validieren. Andererseits sollten mit den im Pferdeplasma und –urin gemessenen 4-MAA-
Konzentrationen pharmakokinetische Berechnungen durchgeführt werden. Für 4-MAA
wurden nach Einbringen errechneter pharmakokinetischen Parameter in das PK/PD-Modell
von TOUTAIN und LASSOURD (2002) Plasma- und Urinkonzentrationen ermittelt, die
keine relevante pharmakologische Wirkung der Substanz auf den Organismus erwarten lassen
sollen. Auf Grundlage der Ergebnisse soll geprüft werden, ob eine allgemeine Aussage
getroffen werden kann, wie lange 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden nachweisbar ist
und welche möglichen Konsequenzen sich daraus für den Einsatz von Sportpferden im
Wettkampf ergeben.
5.1. Eignung der erarbeiteten Analysenmethode (HPLC/MS/MS) für den
Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden
Metamizol beziehungsweise 4-MAA wurde im Institut für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln in Plasma und Urin bislang gaschromatographisch mit nachfolgender
Massenspektrometrie qualitativ analysiert (SCHÄNZER, persönliche Mitteilung). Die dafür
zuvor verwendete Aufarbeitungsmethode, einschließlich einer basischen Extraktion der
Substanz, wurde für das HPLC/MS/MS-Verfahren modifiziert. Die aufzuarbeitende Plasma-
und Urin-Menge wurde verringert; die Aufnahme der eingeengten Etherphase erfolgte anstatt
in Methanol in einem Ammonium-Acetat-Puffergemisch, welches dem HPLC-
Anfangsfließmittel entspricht. Die bisher verwendete Analysenmethode erwies sich als
unzureichend empfindlich und lieferte zudem unbefriedigende Peakformen im
Chromatogramm, die eine ungenaue Integration bedingten. Entsprechend erfolgte keine
Quantifizierung des 4-MAA. Die Einführung einer HPLC-Methode zur Analyse von 4-MAA
war darin begründet, die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens zu verbessern. Zudem sollte
eine schärfere Darstellung der Peakform und eine bessere Detektion die Quantifizierung
96 Diskussion
ermöglichen. In dem bestehenden Routineverfahren des Institutes für Biochemie der
Sporthochschule Köln wurde Ether als organisches Extraktionsmittel für 4-MAA aus
Pferdeplasma und –urin verwendet. Ether eignet sich besonders gut zur Extraktion basischer
Verbindungen, wie sie das Metamizol bzw. 4-MAA darstellt. Mit dem Ether werden aber
auch Substanzen aus den biologischen Matrices gelöst, die die Analytik stören. Um dem
entgegenzuwirken, wird der pH-Wert vor der Extraktion stark basisch (pH 14) eingestellt,
dass saure und neutrale Verbindungen in der entsprechenden Matrix zurückbleiben und nicht
in die Etherphase übergehen.
Im Vorversuch wurde zusätzlich überprüft, ob 4-MAA im Pferdeurin in konjugierter
(glucuronidierter, sulfatierter) Form vorliegt. Dazu wurden auf Routineverfahren des
Institutes für Biochemie der Sporthochschule Köln basierende Methoden zur Hydrolyse
verwendet. Die Hydrolyse von 4-MAA enthaltenden Pferdeurin mit ß-Glucuronidase von
Escherichia coli, ß-Glucuronidase/Arylsulfatase und Cystein vor der eigentlichen
Aufarbeitung erbrachte keine Verbesserung der Extraktionsausbeute im Vergleich zur
Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse. Auch sind der Literatur (POPOT et al. 2000)
bezüglich der Ausscheidungsform des 4-MAA mit dem Pferdeurin keinerlei Angaben zu
entnehmen. Es ist somit anzunehmen, dass 4-MAA beim Pferd in freier Form mit dem Urin
ausgeschieden wird.
In Anlehnung an die Vorgaben der EHSLC (2002) wurde die Analysenmethode durch
Validierung auf Eignung zum Nachweis von 4-MAA in Plasma und Urin des Pferdes geprüft.
Dabei wird durch die Spezifität der Methode sichergestellt, dass sowohl das 4-MAA als auch
der interne Standard (DMAP) ohne Verfälschung von Serum- bzw. Urininhaltsstoffen
(Störpeaks) darzustellen sind. Die Selektivität bestätigt, dass bei der Methode eine
ausreichende Trennung ohne gegenseitige Störung beider Substanzen auch aufgrund
unterschiedlicher Retentionszeiten gewährleistet ist. Die Proportionalität zwischen den
Messergebnissen und den theoretisch zu erwartenden Konzentrationen wurde im Plasma im
Bereich von 0,25 bis 10 µg/ml und von 10 bis 250 µg/ml bzw. im Urin im Bereich von 0,5 bis
100 µg/ml und 100 bis 8000 µg/ml geprüft und bestätigt. Dabei folgen die
Kalibrationsgleichungen aller Messungen einer quadratischen Gleichung. Das
Bestimmtheitsmaß (R2) der quadratischen Regression erreicht bei allen Messungen im Plasma
einen Wert von R2 > 0,994, bzw. im Urin einen Wert von R2 > 0,995, so dass die Methode als
geeignet einzustufen ist. Die Richtigkeit (relativer Fehler) der Methode, repräsentiert durch
die relative Abweichung [RE (%)] der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines
Tages von den theoretisch zu erwartenden, wurde an drei Messtagen überprüft und bewiesen.
97 Diskussion
Die Kriterien für die Präzision (intraday repeatability und interday repeatability) wurden
ebenfalls erfüllt. Bei allen bisher genannten Validierungsparametern blieben die
höchstzulässigen Abweichungen bei beiden Matrices innerhalb von 15% im oberen und 20%
im mittleren und unteren Kalibrationsbereich. Die Nachweisgrenze für 4-MAA im Plasma
beträgt 0,25 µg/ml und ist vergleichend zu anderen Studien, die allerdings auf andere
Analyseverfahren beruhen, relativ hoch. Dennoch ist die erarbeitete Methode empfindlich
genug, den 4-MAA-Nachweis in dopingrelevanten Proben zu gewährleisten. Bei
gaschromatischem Nachweis und Detektion durch ein Massenspektrometer erreichte
SCHLINGLOFF (1997) eine Nachweisgrenze von 3,9 ng/ml Pferdeplasma. DAMM (1989)
erzielte mittels HPLC-Trennung und UV-Detektion bei 265 nm eine Nachweisgrenze von 0,1
µg/ml Humanplasma und 2 µg/ml Humanurin. In dieser Studie konnte im Pferdeurin eine
Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml ermittelt werden. Weitere Vergleiche zu Studien aus dem
humanmedizinischen Bereich (AGUNDEZ et al. 1994, ASMARDI und JAMALI 1983,
ZYLBER-KATZ et al. 1984) sind nicht möglich, da diese auf andere Nachweisverfahren
(HPLC-UV) basieren und zudem keine Nachweisgrenzen genannt werden. POPOT et al.
(2000) weisen Metaboliten des Metamizols (FAA, AA, AAA, Dehydronoraminophenazon)
im Pferdeurin mittels GS/MS nach, geben jedoch keine Nachweis- und
Quantifizierungsgrenzen an.
4-MAA stellt den Hauptmetaboliten des Metamizols dar. Weitere bekannte bedeutende
Metaboliten wie z.B. 4-Formylaminoantipyrin (FAA), 4-Aminoantipyrin (AA) und 4-
Acetylaminoantipyrin (AAA) und deren Nachweis aus Plasma, Urin und anderen
Körperflüssigkeiten sind in der Literatur besonders im Humanbereich mehrfach beschrieben
(DAMM 1989, VLAHOV 1990, LEVY et al. 1995, ZYLBER-KATZ et al., 1992,
NEDDERMANN und ROHDEWALD 1988, POPOT et al. 2000), bleiben aber in
Untersuchungen dieser Studie unberücksichtigt. Die Metaboliten FAA, AA und AAA
besitzen teilweise noch pharmakologische Wirksamkeit. Allgemein wird aber 4-MAA als
Leitsubstanz in der Doping-Analytik verwendet, so dass in die Berechnungen des PK/PD-
Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) weitere Metaboliten nicht einbezogen
werden und zudem für dieses Modell nur pharmakokinetische Daten der hauptsächlich
wirksamen Substanz, dem 4-MAA, benötigt werden (siehe 5.4). Da die Proben des
Ausscheidungsversuchs nach der Gewinnung z.T. bis zu 8 Wochen bei –20 °C eingefroren
waren, bevor sie aufgearbeitet und gemessen wurden, erfolgte eine Überprüfung der
Lagerstabilität von 4-MAA im Plasma und Urin unter gleichen Bedingungen. 4-MAA ist in
beiden Matrices bei –20 °C über acht Wochen stabil. Trotz der geringen Wiederfindungsrate
98 Diskussion
weisen Richtigkeit und Präzision aus, dass die Methode geeignet ist, dopingpositive Fälle zu
erkennen. Die in dieser Studie für die Analytik von 4-MAA in Plasma und Urin von Pferden
entwickelte Methode beinhaltet ein einfaches und schnelles Aufarbeitungs- und
Extraktionsverfahren. Da aufwendige Prozeduren für eine Übersichtsanalyse, wie in der
Routine der Dopinguntersuchung, unvorteilhaft sind, stellt die hier entwickelte Methode einen
Ansatz zur Entwicklung eines Routineverfahrens dar. Es bleibt jedoch zu berücksichtigen,
dass in dieser Studie ein sehr großer Konzentrationsbereich (im Urin: von Null bis 8000
µg/ml) erfasst und validiert werden musste, wodurch vergleichend zu GC/MS- und HPLC-
UV-Verfahren einerseits nicht die Empfindlichkeit mit dieser Methode erreicht wurde,
andererseits aber die Messgeräte auch bei sehr hohen Konzentrationen noch auswertbare
Chromatogramme lieferten. In dieser Studie konnten die höchsten Extraktionsausbeuten
(siehe 3.2.5.7, Abbildungen 5 und 6) mittels basischer Extraktion bei pH 14 und Verwendung
von tertiärem Butylmethylether in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion erzielt werden.
Demgegenüber erscheinen andere in der Literatur beschriebene Aufarbeitungen eher
aufwendig. SCHLINGLOFF (1997) extrahierte ebenfalls im Basischen, führte die
Plasmaproben jedoch über eine Festphasen-Extraktionssäule und musste zur Messung an
einem Gaschromatographen derivatisieren. POPOT et al. (2000) extrahierten
Pferdeurinproben bei pH 9,5 und nutzten ebenfalls eine Festphasen-Extraktion. DAMM
(1989) führte zur Analyse von 4-MAA in Humanplasma und –urin eine Flüssig-Flüssig-
Extraktion im basischen pH-Bereich vor Messung mittels HPLC-UV-Verfahren durch.
Vergleichend stellt Aufarbeitungsprozedur der erarbeiteten Methode ein einfaches, schnelles
und praktikables Verfahren dar.
Besondere Schwierigkeiten lagen in dieser Studie während der Validierung der Methode in
der starken Oxidationsneigung des 4-MAA unter Lichteinfluss und bei Verbringung in
wässriges Milieu begründet. Dieses wurde nach Messungen von Kalibrierreihen deutlich, die
mit 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen erstellt wurden, in denen das 4-MAA in Methanol
oder in 0,06 N Salzsäure gelöst war. Waren die methanolischen oder salzsäurehaltigen
wässrigen Stamm- und Arbeitslösungen älter als 24 Stunden, verfärbten sie sich zunehmend
gelblich. Zudem zeigte sich in Abhängigkeit von der Lagerzeit eine erhebliche Streuung der
Ergebnisse der Messreihen mehrerer Tage. Akzeptable Kalibrierreihen wurden erst erhalten,
nachdem die 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanollösung (in
0,06 N Salzsäure) erstellt wurden. 4-MAA erschien darin für ca. 4 Wochen stabil. Unter
Berücksichtigung der erheblichen Oxidationsneigung von 4-MAA war es von Interesse, wie
lange 4-MAA nach der Aufarbeitung, gelöst in dem Ammoniumacetat-HPLC-Anfangspuffer
99 Diskussion
und in HPLC-Autosamplervials verbracht, reproduzierbare Messergebnisse liefert. Dazu
wurden Proben der Kalibrierreihen der Validierung nach 24, 48 und 72 Stunden Lagerung
bei Zimmertemperatur wiederholt gemessen und die gemessenen Konzentrationen mit denen
von Messreihen verglichen, die sofort nach der Aufarbeitung gemessen wurden. Dabei wurde
festgestellt, dass bis zu 24 Stunden reproduzierbare Messergebnisse gewährleistet sind.
Wurde die Proben wie oben beschrieben zwischenzeitlich nicht bei Zimmertemperatur,
sondern bei +4° C aufbewahrt, ist bis zu 48 Stunden die Reproduzierbarkeit der
Messergebnisse gewährleistet.
Abschließend ist zu erwähnen, dass die Wiederfindungsraten, die mit dieser Methode erzielt
wurden, durch Veränderung der Aufarbeitungsprozedur verbesserbar erscheinen. Die
Methode zeichnet sich durch das einfache Aufarbeitungsverfahren, valider Präzision und
Reproduzierbarkeit aus. Zudem kann die entwickelte Methode über einen großen
Konzentrationsbereich gleichermaßen für Plasma und Urin angewendet werden.
5.2. Pharmakokinetik von 4-MAA im Plasma
Zwei Minuten nach der intravenösen Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol wird die
höchste Plasmakonzentration von 4-MAA bei allen 10 Pferden gemessen. Diese liegt im
Konzentrationsbereich zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml Plasma und beträgt im Mittel 159,4
µg/ml. Bei allen Pferden erfolgt innerhalb der ersten 15 Minuten nach der Verabreichung ein
rascher Abfall der 4-MAA-Plasmakonzentration auf weniger als die Hälfte der in der ersten,
zwei Minuten nach Versuchsbeginn gemessenen Plasmaprobe. Zwölf Stunden nach der
Metamizolapplikation war bei allen Pferden die Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml Plasma
unterschritten. Die Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml war im Plasma bei 9 Pferden nach 12
Stunden erreicht. Bei einem Pferd war die Nachweisgrenze von 4-MAA im Plasma jedoch
erst nach 36 Stunden p.a. unterschritten.
In Anbetracht des Verlaufs der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve von 4-MAA konnten
pharmakokinetische Berechnungen auf Grundlage eines offenen Zwei-Kompartiment-Modells
durchgeführt werden (HEINZEL et al. 1993). Zur Ermittlung der pharmakokinetischen
Parameter wurden nur Konzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze verwendet.
Nach pharmakokinetischen Berechnungen ergibt sich eine mittlere Clearance für 4-MAA im
Plasma von 338,4 ± 90,6 ml/min. Die Halbwertzeit der Eliminationsphase beträgt im Mittel
100 Diskussion
1,7 ± 0,8 Stunden. Das Verteilungsvolumen im Steady-State lag im Mittel bei 632,2 ± 210,7
ml/kg.
Trotz Ermittlung des Körpergewichtes jedes einzelnen Pferdes und genauer Berechnung der
individuellen Dosis, wonach jedes Pferd präzise eine Dosierung von 30 mg/kg KGW erhält,
schwanken die gemessenen Maximalkonzentrationen zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml
Plasma. Diese Schwankungen belegen letztlich die biologische Variabilität, da aufgrund der
Verwendung eines Venenkatheters, durch den die intravenöse Applikation erfolgte, die
Möglichkeit einer paravenösen Applikation ausgeschlossen sein sollte. Ein mutmaßlicher
Erklärungsversuch wäre eine sehr rasche Umverteilung aus dem Plasma ins Gewebe. Um
Bezug auf die Fragestellung dieser Studie zu nehmen, eine allgemein gültige Aussage zur
Ausscheidungsdauer und Dopingrelevanz von Metamizol zu treffen, dürfen interindividuelle
Schwankungen nicht unerwähnt bleiben. So variieren die errechneten maximalen
Plasmakonzentrationen (Cmax) um einen Faktor 2. Die Zeiten für die HWZ der Verteilung als
auch die HWZ der Elimination zeigen interindividuelle Schwankungen um einen Faktor 4.
Die HWZ der Verteilungsphase nimmt Werte zwischen 0,03 und 0,12 Stunden und die HWZ
der �-Phase Werte zwischen 0,6 und 2,9 Stunden an. Betrachtet man die Clearance, so liegen
die berechneten Werte, variierend um einen Faktor 2, im Bereich zwischen 232,2 und 495, 3
ml/h/kg. Die Werte der Clearance sind geringeren Schwankungen unterlegen als die Werte
der HWZ. Bei relativ konstanter Clearance führt ein vergrößertes Verteilungsvolumen zur
Verlängerung der HWZ.
101 Diskussion
5.3. 4-MAA im Urin
Bei Betrachtung des Verlaufs der 4-MAA-Konzentrations-Zeit-Kurve im Urin (Abb. 16) sind
sehr deutliche interindividuelle Schwankungen ersichtlich. Die maximal gemessene 4-MAA-
Urin-Konzentration lag zwischen 1210 und 5022 µg/ml und differierte somit um den Faktor 4.
Im Mittel betrug die maximal erreichte 4-MAA-Konzentration 2740,4 µg/ml Urin. Dabei ist
zu berücksichtigen, dass von drei Pferden die erste Urinprobe ca. 2 Stunden nach
Arzneimittelapplikation nicht gewonnen werden konnte und diese entsprechend nicht zur
Berechnung des Mittelwertes der maximal erreichten 4-MAA-Urinkonzentration
herangezogen wurde. Bei den sieben Pferden, bei denen die erste Urinprobe ausgewertet
werden konnte, enthält diese die höchste im Urin gemessene 4-MAA-Konzentration. Bei
Pferd D konnte die erste Urinprobe nicht gewonnen werden; in der zweiten ca. sechs Stunden
nach Metamizolapplikation gewonnenen Urinprobe wurde eine 4-MAA-Konzentration von
4620,1 µg/ml gemessen. Dieses entspricht vergleichend zu den anderen Pferden der höchsten
4-MAA-Konzentration, die in der bis zur sechsten Stunde p.a. gewonnenen Urinprobe
gemessen wurde. Es läst sich vermuten, dass die erste Urinprobe bei Pferd D die maximal im
Urin gemessene 4-MAA-Konzentration aufgewiesen hätte.
Die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer Konzentration im
Urin ist mit erheblichen Unsicherheiten verbunden. Die oben beschriebenen interindividuellen
Schwankungen in der Ausscheidungszeit verdeutlichen dieses. Differenzen in der
Ausscheidungszeit sind teilweise durch die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen
Pferde bedingt. Die Harnproduktion unterliegt dem Einfluss verschiedener endogener und
exogener Faktoren. Beispiele hierfür sind Flüssigkeitsaufnahme, Fütterung, diurale Kapazität
der Nieren, Haltungsbedingungen, das Maß der körperlichen Anstrengung, der
Gesundheitszustand, eventuell Wechselwirkungen mit gleichzeitig verabreichten Wirkstoffen
und vieles mehr (SCHOENE 1996). Um präzisere Aussagen bezüglich der Ausscheidungsrate
(Menge an ausgeschiedenem 4-MAA im Urin pro Zeiteinheit) zu machen, wäre es notwendig
gewesen, den gesamten Urin von jedem Pferd über die Dauer des Ausscheidungsversuches
aufzufangen und mengenmäßig zu erfassen (DYKE und SAMS 1994). Dazu hätten die Pferde
während des gesamten Ausscheidungsversuches Urinauffangschürzen tragen müssen, was
aber im Vorfeld des Versuchsvorhabens aufgrund der Paddock- und Laufstallhaltung und
eventueller Verletzungsgefahr der Pferde als praktisch nicht durchführbar abgelehnt wurde.
Mittels kumulativen Darstellung (Abb.18) der mit dem Urin ausgeschiedenen 4-MAA-
Menge, kann die Auswirkung der Harnproduktion auf die Menge der ausgeschiedenen
102 Diskussion
Substanz unter Berücksichtigung der verabreichten Dosis für jedes Pferd errechnet werden. In
der Literatur wird die vom Pferd produzierte Urinmenge hypothetisch mit 1-2 ml/kg KGW/h
angegeben (SCHÄFER 1999). Zur Ermittlung der Daten der Abbildung 18 wurde für jedes
Pferd eine Harnproduktion von 1 ml/kg KGW/h angenommen und mit zu entsprechenden
Entnahmezeitpunkten gemessenen 4-MAA-Urinkonzentrationen rechnerisch verknüpft. Ein
Pferd hat demnach bis zum Erreichen der Quantifizierungsgrenze im Zeitraum von 10 bis 24
Stunden nach der Metamizolapplikation (20520 mg Metamizol intravenös) 8378 mg 4-MAA
ausgeschieden. Dieses entspricht 40,83% der absolut verabreichten Metamizol-Menge.
Nimmt man eine produzierte Urinmenge von 2 ml/kg KGW/h an, so hat dieses Pferd in der
gleichen Zeit 16756 mg 4-MAA (81,66% der absolut verabreichten Dosis) mit dem Urin
ausgeschieden. In Anbetracht dieses Beispieles erscheinen derartige Berechnungen unter
Einbeziehung der auf eine Hypothese basierenden produzierten Urinmenge nicht sinnvoll.
Zudem ist zu berücksichtigen, dass selbst wenn der gesamte Urin gesammelt worden wäre,
die Rückberechnung der ausgeschiedenen Substanzmenge nicht absolut exakt sein kann, da
weitere rechnerisch schwer erfassbare physiologische Faktoren die Ausscheidung eines
Pharmakons mit dem Urin beeinflussen. Hierzu zählen beispielsweise die Metabolisierung
einer Substanz in verschiedenen Organen und eine Anreicherung der Substanz aufgrund ihrer
biochemischen Eigenschaften in bestimmten Geweben für längere Zeit als die der
Ausscheidungsversuch andauert. 4-MAA wird zudem zu weiteren Metaboliten
verstoffwechselt, die ebenfalls mit dem Urin ausgeschieden werden, aber in dieser Studie
nicht mitbestimmt wurden. Das Ausmaß der tubulären Rückresorption wird maßgeblich vom
pH des Urins bestimmt, da nur der unionisiert Anteil des Arzneistoffes rückresorbiert werden
kann (LÖSCHER und KROKER 1997). Änderungen des Harn-pH-Wertes können nach
TOBIN et al. (1989) entscheidenden Einfluss auf die Ausscheidung einer Substanz mit dem
Urin haben. Bei Rennpferden stellte er in Abhängigkeit von extremer körperlicher
Beanspruchung Schwankungen des Urin-pH-Wertes im Bereich von 9,0 bis 4,5 fest. Die
Urin–pH-Werte lagen bei den Pferden dieser Studie im Bereich zwischen 7,5 und 9,5, wobei
jedes einzelne Pferd einen relativ konstanten Urin-pH zeigte (siehe Anhang). GERKEN et al.
(1991) stellten über einen Zeitraum von 1 - 1,5 nach kurzem intensiven Training ein
markantes Absinken des Urin-pH-Wertes um ein bis drei Einheiten fest. Bei Substanzen wie
beispielsweise dem Metamizol chemisch ähnlichen Phenylbutazon führte dieses zu einer 20-
bis 50fachen Abnahme der ausgeschieden Menge und zur Verlängerung der
Ausscheidungszeit. Auch UNGEMACH (1988) berücksichtigt, dass besonders bei
Substanzen, die pH-abhängig mit dem Urin ausgeschieden werden, die Urinkonzentrationen
103 Diskussion
und Ausscheidungszeiten dieser Substanzen bei Harn-pH-Änderungen erheblichen
Schwankungen unterliegen können. Nach TOBIN et al. (1989) können demzufolge die
Urinkonzentrationen um das 200-fache variieren, woraufhin er festhält, dass es nahezu
unmöglich ist, von einer im Urin gemessenen Konzentration einer Substanz auf den Zeitpunkt
der Applikation zu schließen. Die bei den Pferden dieser Studie ermittelten Urin-pH-Werte
sind im Anhang aufgeführt. Nach theoretischen Betrachtungen von TOBIN und WOODS
(1989) benötigt das Pferd 70 HWZ bis zur völligen Clearance. Übertragen auf diese Studie,
wäre 4-MAA bei den Pferden des Ausscheidungsversuches frühestens nach 42 Stunden und
längstens nach 203 Stunden ausgeschieden. Entsprechend ist die HWZ separat wenig
aussagekräftig. Bei konstanter Clearance unterliegt sie dem Einfluss der Verteilung.
Beispielsweise verlängert sich die HWZ bei steigendem Verteilungsvolumen.
5.4. Berechnungen zur effektiven und irrelevanten Plasmakonzentration
und zur irrelevanten Urinkonzentration nach TOUTAIN und
LASSOURD (2002); Berechnungen zur Ermittlung der
Ausscheidungszeit
Einbringen pharmakokinetischer Daten (Cmax, Geschwindigkeitskonstante der Elimination �,
Clearance) von 4-MAA in das pharmakokinetische/pharmakodynamische Modell von
TOUTAIN und LASSOURD (2002) (siehe 4.4), sollten letztlich zur Ermittlung von 4-MAA-
Konzentrationen im Plasma und Urin führen, bei denen dieser Wirkstoff (bzw. Metamizol)
keine relevante pharmakologische Wirksamkeit mehr besitzt.
Grundlage für die Entwicklung des PK/PD-Modells stellten für TOUTAIN und LASSOURD
(2002) aktuelle Doping-Reglementierungen dar, nach denen jeglicher Nachweis eines
Wirkstoffes bzw. bei wenigen Substanzen, für die ein Grenzwert festgelegt wurde, dessen
Überschreitung als doping-positiv gilt. Dabei wird nicht berücksichtigt, ob von der
festgestellten Konzentration einer Substanz noch eine pharmakologische Wirksamkeit ausgeht
oder nicht. TOBIN (1981) berücksichtigt, dass die Methoden der Dopinganalytik immer
sensibler und entsprechend die Nachweisgrenzen dopingrelevanter Substanzen immer weiter
gesenkt werden. Demzufolge versucht er mit experimenteller Festlegung einer sogenannten
Highest Non Effect Dosis (HNED) einen sinnvollen Zusammenhang zwischen Konzentration
und Wirksamkeit herzustellen. Grenzen dieser Methode bestehen durch Veränderung der
Applikationsweise und der Dosierung, als auch bei wiederholter Verabreichung in der
104 Diskussion
Änderung des Dosierungsintervalls, im Erhalt veränderter pharmakologischer Daten (TOBIN
et al. 1999). Das Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) basiert auf
Literaturauswertung klinischer und pharmakokinetischer Studien. Es ist nur für systemisch
wirksame Substanzen anwendbar, die zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Im Gegensatz
zur allgemeinen Dopinganalytik, in der Urin als Untersuchungs-Matrix der Wahl gilt,
basieren Berechnungen von TOUTAIN und LASSOURD (2002) auf im Plasma und Urin
gemessenen Wirkstoffkonzentrationen. Um irrelevante Plasmakonzentrationen festzulegen
wird in diesem Modell ein Sicherheitsfaktor (SF) integriert, dem ein Zahlenwert von 500
zugeordnet ist.
Die für 4-MAA berechneten pharmakokinetischen Parameter wurden in das Modell von
TOUTAIN und LASSOURD (2002) eingebracht und die EPC, IPC und IUC von 4-MAA bei
den Pferden dieser Aussscheidungsstudie ermittelt. Zur Berechnung der effektiven
Plasmakonzentration (EPC) wird ein Dosierungsintervall von 8 Stunden (EBERT et al. 2002)
angenommen. Somit beträgt die für 4-MAA berechnete EPC im Mittel 59 ± 21 µg/ml, wobei
der höchste Wert mit 86 und der niedrigste Wert mit 28 µg/ml errechnet wurde. Die EPC liegt
bei allen Pferden (siehe Tabelle 17) deutlich oberhalb der Quantifizierungsgrenze. In der
vorliegenden Studie wird bei Betrachtung der gemessenen Plasmakonzentrationen (Übersicht
im Anhang dieser Arbeit) die EPC bei allen Pferden durchschnittlich bereits 10 bis 15
Minuten p.a. unterschritten. Die Zeit bis zum Erreichen der EPC wäre der Wirkungsdauer
gleichzusetzen.
TOUTAIN und LASSOURD (2002) verwenden die EPC zur Berechnung der irrelevanten
Plasmakonzentration (IPC). Sie dividieren die EPC durch einen Sicherheitsfaktor. Diesem
wird ein Zahlenwert von 500 zugeordnet, der sich aus den Faktoren 10 (Berücksichtigung
interindividueller Schwankungen) und 50 (Gewährleistung der Validität der Daten) ergibt.
Entsprechend dieses Modells ergab sich in dieser Studie für 4-MAA eine durchschnittliche
IPC von 0,12 ± 0,04 µg/ml (siehe Tabelle 17). Die errechnete IPC schwankte bei den Pferden
zwischen 0,17 und 0,06 µg/ml. Alle für die IPC ermittelten Zahlenwerte liegen unterhalb der
4-MAA-Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml Plasma.
Zur Berechnung der irrelevanten Urinkonzentration (IUC) nach TOUTAIN und LASSOURD
(2002) mussten zunächst die durchschnittliche Plasma- und die durchschnittliche
Urinkonzentration für die Pferde dieser Studie im Dosierungsintervall von 8 Stunden
errechnet werden. Pferde, bei denen eine Urinprobe nicht gewonnen wurde, wurden hier nicht
berücksichtigt. Die IPC wurde anschließend mit dem Urin-/Plasma-Konzentrationsverhältnis
im Steady-State (Rss) multipliziert, wonach sich eine durchschnittliche IUC von 2,2 ± 1,4
105 Diskussion
µg/ml ergibt. Die Werte für die IUC (siehe Tabelle 17) lagen bei allen Pferden deutlich
unterhalb der Quantifizierungsgrenze von 10 µg/ml, jedoch oberhalb der Nachweisgrenze des
4-MAA im Urin (0,5 µg/ml). Aufgrund dessen, dass die IUC-Werte unterhalb der
Quantifizierungsgrenze liegen, ist eine Bewertung vorsichtig vorzunehmen. Zudem muss
berücksichtigt werden, dass der Rss –Wert erheblichen Schwankungen unterlegen sein kann.
Der Rss –Wert errechnet sich unter Berücksichtigung der Konzentration der Substanz im Urin.
Beispielsweise können ein veränderter Urin-pH-Wert als auch Veränderungen der Diurese
(durch wechselhafte Durchblutung der Nieren-Blutdruckschwankungen, Medikamente)
diesen erheblich beeinflussen (TOUTAIN und LASSOURD, 2002). Unter Annahme einer
gesteigerten Diurese könnte die Wirkstoffkonzentration im Urin um den Faktor 10 ansteigen,
so dass die IUC-Werte anstatt im Bereich der Nachweisgrenze dann im Bereich der
Quantifizierungsgrenze lägen. Dieses Phänomen liefert die Begründung für TOUTAIN und
LASSOURD (2002), dass Urin zur Bestimmung irrelevanter Wirkstoffkonzentrationen im
Vergleich zum Plasma die weniger geeignete Matrix darstellt.
Ausscheidungszeiten für 4-MAA bis zum Erreichen der IPC (ta(IPC)), der
Quantifizierungsgrenze (ta(LOQ)) und der Nachweisgrenze (ta(LOD)) im Plasma wurden wie in
Kapitel 4 4.5 beschrieben berechnet (siehe Tabelle 18). Bei den Pferden des
Ausscheidungsversuches vergingen bis zum Erreichen der IPC im Mittel 18,9 ± 8,8 Stunden.
Die Zeiten schwankten im Bereich zwischen 6,5 und 33,7 Stunden. Bei Berücksichtigung der
IPC-Werte, die bei allen Pferden unterhalb der Nachweisgrenze liegen, und der
interindividuellen Schwankungen von über 27 Stunden, ist bezüglich der ta(IPC) das Treffen
einer allgemeingültigen Aussage nicht zulässig. Die Zeit bis zum Erreichen der
Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml Plasma beträgt durchschnittlich 13,6 ± 6,5 Stunden.
Auch hier sind starke interindividuelle Schwankungen zwischen 24,9 und 4,33 Stunden
auffällig. Betrachtet man die Konzentrations-Zeit-Kurve von 4-MAA im Plasma (siehe
Abbildung 14), so ist bei allen Pferden die Quantifizierungsgrenze 24 Stunden nach der
Metamizolapplikation unterschritten. 12 Stunden p.a. liegen die 4-MAA-
Plasmakonzentrationen nur knapp oberhalb der Quantifizierungsgrenze. Bei neun Pferden ist
die Nachweisgrenze ebenfalls nach 24 Stunden unterschritten Im Mittel beträgt die Zeit bis
zum Erreichen der Nachweisgrenze 15,2 ± 7,3 Stunden, wobei Schwankungen von über 23
Stunden zwischen Pferd B (27,93 Stunden) und Pferd H (4,79 Stunden) errechnet wurden. Die
errechneten Zeiten bis zum Erreichen der Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze decken
sich mit den aus der 4-MAA-Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (Abbildung 14) ersichtlichen
106 Diskussion
Werten. Allerdings sind die errechneten Schwankungen der Abbildung 14 nicht zu
entnehmen.
5.5. Bewertung der Ergebnisse
Ein Ziel dieser Arbeit, eine geeignete HPLC/MS/MS-Methode zum Nachweis von 4-MAA,
dem Hauptmetaboliten von Metamizol, im Plasma und Urin von Pferden zu entwickeln und
zu validieren, wurde erreicht. Bei Betrachtung der Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen
der entwickelten Analysenmethode konnte vergleichend zu Studien, die auf anderen
Nachweisverfahren beruhen (beispielsweise DAMM, 1989: HPLC/UV-Methode;
SCHLINGLOFF, 1997: GC/MS-Methode; POPOT, 2000: GC/MS-Methode) die dort jeweils
angegebene Empfindlichkeit nicht erreicht werden. Gleiches gilt für die Wiederfindungsraten
von 4-MAA in den untersuchten Matrices. Unter dem Aspekt einer möglichen Etablierung
dieser Methode in die Routinediagnostik bleibt jedoch zu berücksichtigen, dass die hier
entwickelte Methode den 4-MAA-Nachweis in einem sehr großen Konzentrationsbereich (bis
8000 µg/ml Urin) abdeckt. Die Validierung der Methode belegt zudem die Eignung zum
Nachweis von 4-MAA aus Pferdeplasma und –urin. Der Einsatz der Methode zur
Routinediagnostik könnte als Lösungsansatz zur Einführung eines einheitlichten
Nachweisverfahrens verschiedener Laboratorien dienen.
Aufgrund der dem Metamizol zugesprochenen zentralanalgetischen, spasmolytischen,
antipyretischen, antirheumatischen und/oder antiphlogistischen Wirkung wird es
pharmakologisch den NSAID oder den schwachen Analgetika zugeordnet. Entsprechend sind
die Anwendungsgebiete von Metamizol beim Pferd die Schmerzbehandlung bei Kolikformen
unterschiedlicher Genese oder sonstige krampfartige Zuständen der Bauchhöhlenorgane,
Lumbago, akute und chronischen Arthritiden, rheumatische Zuständen der Muskulatur und
Gelenke, Neuritiden, Neuralgien und Tendovaginitiden. Zur Behandlung eben genannter
Krankheitszustände ist mittlerweile eine Reihe von Wirkstoffen im Handel, deren
Wirkungspotenz die des Metamizols um ein Vielfaches übertrifft. Dennoch wird Metamizol
nach wie vor in der Pferdepraxis eingesetzt und könnte sowohl als Ursache unbeabsichtigten
Dopings als auch absichtlichen Dopings zum Zwecke der Wiederherstellung der natürlichen
Leistungsfähigkeit fungieren. Letztgenanntes könnte zur Maskierung von Koliksymptomen,
die kurz vor einem sportlichen Einsatz auftreten als auch von klinisch sich geringgradig
darstellenden orthopädischen Krankheitzuständen dienen.
107 Diskussion
Für den Dopingnachweis pharmakologisch wirksame Substanzen gilt bis auf wenige
Ausnahmen, für die Grenzwerte festgelegt wurden, aufgrund national anwendbarer
Dopingbestimmungen, die sogenannte „ Null-Lösung“ . Folglich wird jeglicher Nachweis einer
verbotenen Substanz als dopingpositiv bewertet. Ein Beweggrund, die Null-Lösung nicht
dauerhaft gelten zu lassen, ist, dass „ Null“ durch die ständig in der Entwicklung
fortschreitende Analytik und damit einhergehender Senkung von Nachweisgrenzen bestimmt
wird. Ein weiterer Grund für die Abschaffung der in kontroverse Diskussionen geratenen
Null-Lösung ist, dass hierbei die eventuell nicht mehr vorhandene Wirksamkeit einer
geringen nachgewiesenen Substanzmenge unberücksichtigt bleibt. TOUTAIN und
LASSOURD (2002) verfolgen einen Lösungsansatz mit der Berechnung von irrelevanten
Plasma- und Urinkonzentrationen zwecks Ermittlung von Grenzwerten, die in Dopinglisten
der Pferdesportverbände aufgenommen werden könnten. Das damit von ihnen verfolgte Ziel
ist die notwendige Behandlung erkrankter Sportpferde zu sichern und einer Verschärfung der
Bewertung von Dopingproben aufgrund laufend empfindlicher werdender Nachweismethoden
entgegenzuwirken.
Die in der vorliegenden Studie nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) berechnete EPC von
4-MAA liegt bei allen Pferden deutlich oberhalb der Quantifizierungsgrenze; die EPC wird
jedoch im Mittel 10 bis 15 Minuten nach der intravenösen Applikation von Metamizol
unterschritten. Entsprechend dieser Berechnungen wäre die generelle Wirksamkeit dieser
Substanz in Frage zu stellen. Da bei dieser Studie keine Berücksichtigung
pharmakodynamischer Parameter erfolgte, kann kein praktischer Bezug zu den theoretisch
ermittelten EPC-Werten hergestellt werden. Die Werte der errechneten IPC befinden sich bei
allen Pferden dieser Studie unterhalb der Nachweisgrenze. Dieses bedeutet, dass alle bei einer
Dopingkontrolle gemessenen Werte unterhalb der Nachweisgrenze (0,25 µg/ml Plasma) als
dopingnegativ gelten würden. Anders ist es bei der Bewertung der Werte der IUC, die bei
allen Pferden zwar unterhalb der Quantifizierungsgrenze (10 µg/ml Urin), jedoch oberhalb der
Nachweisgrenze (0,5 µg/ml) liegen. Hier könnten die bei einer Dopingkontrolle gemessenen
Werte als dopingpositiv bewertet werden, solange die Substanz eindeutig identifizierbar ist
(oberhalb der Nachweisgrenze). Die Ermittlung von Grenzwerten nach Berechnung der IPC
und IUC von 4-MAA im Plasma und Urin ist aufgrund unterhalb der Quantifizierungsgrenzen
liegender Werte nicht empfehlenswert.
Die Berechnungen der Ausscheidungszeit nach KIETZMANN (1983) bis zum Erreichen der
IPC als auch der Quantifizierungs- und Nachweisgrenze im Plasma sind nahezu
deckungsgleich mit den Ergebnissen des Ausscheidungsversuches (siehe Tabelle 18 und
108 Diskussion
Anhang) vergleichend. Somit stellen diese Berechnungen ein in der Praxis geeignetes
Verfahren zur Ermittlung von Ausscheidungszeiten dar.
Interindividuelle Schwankungen pharmakokinetischer Daten bei den Pferden dieser Studie,
verdeutlichen, dass aufgrund der vorliegenden Ergebnisse und der geringen Probandenzahl
keine auf die Gesamtpopulation übertragbare allgemeingültige Aussage bezüglich der
Ausscheidungszeit und Festlegung einer Karenzzeit getroffen werden kann. Ebenso wenig
sinnvoll erscheint die Festsetzung von Grenzwerten für 4-MAA im Plasma und Urin von
Pferden aufgrund der in der eigenen Studie gefundenen Streuung der Ergebnisse.
Abschließend ist zu bemerken, dass die Schwierigkeit, die mit dem Nachweis
dopingrelevanter Substanzen verknüpft ist und die Festlegung daraus für den Pferdesport
resultierender Grundsätze, durch die Ergebnisse dieser Studie einmal mehr belegt ist.
109 Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Helga Levens (2005):
Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Metamizol hinsichtlich der
Dopingrelevanz beim Pferd
Das Ziel dieser Arbeit bestand einerseits darin eine geeignete Analysenmethode zum
Nachweis von 4-MAA, dem Hauptmetaboliten des Metamizol, im Pferdeplasma und -urin
mittels HPLC/MS/MS-Verfahren zu erarbeiten und zu validieren. Grundlage für die
Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode war ein im Institut für Biochemie der
Deutschen Sporthochschule Köln bestehendes GC/MS-Verfahren. Mit der Erarbeitung der
Messmethode ging die Entwicklung eines basischen Flüssig-Flüssig Extraktionsverfahrens
von 4-MAA aus Plasma und Urin von Pferden einher. Als Extraktionsmittel wurde tertiär-
Butylmethylether (TBME) genutzt. Nach Einengung der Etherphase wurden die Proben in
Ammoniumacetat-Puffer, dem anfänglichen HPLC-Fließmittel, wieder angelöst und der
Messung zugeführt. Als interner Standard wurde Dihydrodimethyl-
dimethylaminophenylpyrazolon (DMAP) verwendet. Nach vergleichender Aufarbeitung von
Urinproben mit und ohne Hydrolyseschritt konnte gezeigt werden, dass 4-MAA im Urin von
Pferden in freier Form ausgeschieden wird. Die Quantifizierungsgrenze für 4-MAA beträgt
bei der entwickelten Methode 1 µg/ml Plasma und 10 µg/ml Urin. Die Nachweisgrenze ist im
Plasma mit 0,25 µg/ml und im Urin mit 0,5 µg/ml ermittelt.
Ein weiteres Ziel dieser Studie bestand darin, Ausscheidungszeiten und die
Eliminationskinetik für das häufig bei Pferden eingesetzte nichtsteroidale Antiphlogistikum
Metamizol, bzw. dessen Hauptmetaboliten 4-MAA aus Plasma und Urin zu bestimmen. Einer
Gruppe von 10 Pferden wurde Metamizol in einer Dosierung von 30 mg/kg KGW intravenös
verabreicht. Die 4-MAA-Konzentrationen der zu bestimmten Zeiten p.a. gewonnenen Plasma-
und Urinproben wurden mittels HPLC/MS/MS ermittelt und anschließend
pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen. Die mittlere Clearance beträgt im Plasma
338 ± 91 ml/min. Die HWZ der Eliminationsphase beträgt durchschnittlich 1,7 ± 0,8 Stunden.
Das Verteilungsvolumen unter Steady-State Bedingungen ist durchschnittlich mit 632 ± 210
ml/kg KGW angegeben. Mit Hilfe des multifaktoriellen Einflüssen unterlegenen und damit
nicht unumstrittenen pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Modells von TOUTAIN
und LASSOURD (2002) wurden sogenannte irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen
110 Zusammenfassung
(IPC und IUC) ermittelt, bei denen eine Wirkung von 4-MAA auf den Organismus
ausgeschlossen sein soll. Zudem wurde eine sogenannte effektive Plasmakonzentration (EPC)
ermittelt, die bei den Pferden dieser Ausscheidungsstudie bereits 10 bis 15 Minuten p.a.
unterschritten wurde. Die IPC und IUC lagen unter Annahme eines Dosierungsintervalls von
8 Stunden im Durchschnitt jeweils unterhalb der Quantifizierungsgrenze dieser Methode, so
dass anhand der vorliegenden Ergebnisse die Festlegung eines Grenzwertes nicht sinnvoll
erscheint. Somit ist derzeit jeglicher Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden
dopingrelevant.
Die Ausscheidungszeit wurde bis zum Erreichen der IPC als auch bis zum Erreichen der
Quantifizierungs- und Nachweisgrenze im Plasma berechnet. Die ermittelten
Ausscheidungszeiten sind mit den Ausscheidungszeiten, die bei Betrachtung der
Konzentrations-Zeit-Kurve erhoben werden können vergleichbar. Die Quantifizierungsgrenze
wurde im Plasma bei allen Pferden 12 Stunden p.a. unterschritten. Die Nachweisgrenze wurde
von neun Pferden ebenfalls 12 Stunden p.a. erreicht; bei einem Pferd wurde sich jedoch erst
nach 36 Stunden unterschritten. Im Urin wurde die Quantifizierungsgrenze frühestens
zwischen der 10. und 24. Stunde und spätestens zwischen der 36. und 48. Stunde p.a.
unterschritten. Das Unterschreiten der Nachweisgrenze erfolgte frühestens 33,3 Stunden p.a.
und spätestens im Zeitraum zwischen der 69. und 94. Stunde. Aufgrund der geringen Anzahl
an Probanden und der beachtenswerten Streuung der Ergebnisse sollte keine auf die
Gesamtpopulation übertragbare Aussage bezüglich der Ausscheidungszeit getroffen werden.
111 Summary
7. Summary
Helga Levens (2005):
Pharmakokinetic study of the drug dipyrone concerning its relevance of doping in
horses
The aim of the present study was to develop and validate the proof of a suitable analytical
method of 4-MAA, the main metabolite of dipyrone, in plasma- and urine samples from
horses by HPLC/S/MS-method. The basics for the development of a new practical analytical
method was an established GC/MS-routine-procedure at the Institute of Biochemistry at the
Deutsche Sporthochschule Köln. The establishment of the new analytical method by
HPLC/MS/MS went along with the development of an alcaline liquid-liquid-extraction for 4-
MAA from plasma- and urine samples of horses. Tertiär-Butylmethylether (TBME) was used
as extract solvent. After evaporation of the etherphase the residues were dissolved again in an
ammoniumacetat-buffer before they were injected to the HPLC system. The mobile phase
consists of Ammoniumacetate that is conform with the initial phase in this method.
Dihydrodimethyl-dimethylaminophenylpyrazolone (DMAP) was chosen as internal standard.
When the urine samples were analysed with or without hydrolysis it could be observed that 4-
MAA in urine of horses is excreted unbound. The limit of quantification for 4-MAA is 1
µg/ml in plasma and 10 µg/ml in urine. The limit of detection is fixed at 0,25 µg/ml in plasma
and 0,5 µg/ml in urine.
Further we investigated the kinetic of the elimination rate of dipyrone by using its main
metabolite 4-MAA in plasma and serum samples. Dipyrone is a nonsteroidal
antiinflammatory drug used as therapeutic agent in horses. This study contained a sample size
of 10 horses and dipyrone was administrated intravenously in a dose of 30 mg/ kg. Before
phamakokinetically investigated, the concentration of 4-MAA were determined via
HPLC/MS/MS and fractioned in certain time intervals. The clearance of 4-MAA from the
plasma is 338 ± 91 ml/min. The half-life of elimination is 1,7 ± 0,8 hours. During steady-state
the volume of distribution is 632 ± 210 ml/kg bodyweight. Non relevant plasma- and urine
samples (IPC and IUC) were defined by using the phamakokinetic/ phamakodynamic model
of TOUTAIN and LASSOURD (2002). Latter model is used in research to exclude 4-MAA in
organism.
112 Summary
Furthermore we analysed the EPC (effective plasmaconcentration). In this present study the
EPC is below the value earlier than 10-15 minutes p.a.
During a dosage interval of 8 hours IPC and IUC were below the quantification limit in this
used model. As a consequence of latter results it isn t̀ possible to determinate a marginal limit
for IPC and IUC and deductive any positive findings of 4-MAA in urine or plasma samples
are definitely doping relevant.
KEITZMANN (1983) calculated the elimination rate in plasma focussing the limits of IPC,
quantification and detection. In the present study it could be observed that the detected
excretion times are similar with those that are in relation to the concentration-time-curve. 12
hours after administration all detected values of all horses were under the limit of
quantification. The values of 9 horses reached the limit of detection after 12 hours. The value
of one horse was at the limit of detection after 36 hours. In urine the limit of quantification
was reached earliest 10-24 and latest 36-48 hours after administration. The limitof detection
was reached earliest 33,3 and latest 69-94 hours after administration. Because of the limited
number of hourse and wide standard deviation no conclusions can be drawn for the overall
clearance-time of 4-MAA.
113 Literaturverzeichnis
8. Literaturverzeichnis
AGÚNDEZ, J. A.G. u. J. BENÍTEZ (1996):
Determination of aminopyrine and dipyrone metabolites in urine.
Therap. Drug Monitoring 18, 104-106
AGÚNDEZ, J. A.G., C. MARTÍNEZ, R. MARTÍN, J. BENÍTEZ (1994):
Determination of aminopyrine, dipyrone and its metabolites in urine by high-performance
liquid chromatography.
Ther. Drug Metab. Disp. 16, 316-322
ASMARDI, G. u. F. JAMALI (1983):
High-performance liquid chromatography of dipyrone and its active metabolites in biological
fluids.
J. Chromatogr. 277, 183-189
ASMARDI, G. u. F. JAMALI (1985):
Pharmacokinetics of dipyrone in man; role of the administration route.
Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet. 10, 121-125
BACRACHEVA, N., N. TYUTYULKOVA, A. DRENSKA, J. GORANTCHEVA, S.
SCHINZEL, T. SCHOLL, A. STOINOV, I. TCHAKARSKI, J. TENTCHEVA u. V.
VLAHOV (1997):
Effect of cimetidine on the pharmakokinetics of metabolites of metamizol.
Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 35, No. 7, 275-281
BAGGOT, J. D. (1978):
Some aspects of clinical pharmacocinetics in veterinary medicine.
J. Vet. Pharmacol. Therap. 1, 5-18
114 Literaturverzeichnis
BENET, L. Z., D. L. KROETZ u. B. D. CAMERON (1986):
Pharmacocinetics.
In: HARDMAN, J. G., L. E. LIMBRID, P. B. MOLINOFF, R. W. RUDDON, A.
GOODMAN (Hrsg.): Goodman and Gilman s̀ the pharmacological basis of therapeutics.
9. Aufl., The Mc Graw-Hill Companies, USA, New York, S. 3-27
BENTUR, Y. u. O. COHEN (2004):
Dipyrone overdose.
J. Toxicol. Clin. Toxicol. 42, 261-265
BUDZIKIEWICZ, H (1998):
Massenspektrometrie – eine Einführung.
4. Auflage, Verlag Wiley-VCH, Weinheim
BÜSCHER, D. W. (1972):
Das Doping.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ, ERNÄHRUNG UND
LANDWIRTSCHAFT (Hrsg.) (2001):
Das neue Tierschutzgesetz. Verlag Koelblin Druck, Baden-Baden
CAMPOS, C., R. de GREGORIO, R. GARCIA-NIETO, F. GAGO, P. ORTIZ u. S.
ALEMANY (1999):
Regulation of cyclooxygenase activity by metamizol.
Eur. J. Pharmacol., 378, 339-47
COHEN, O., E. ZYLBER-KATZ, Y. CARACO, L. GRANIT u. M. LEVY (1998):
Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of dipyrone metabolites after a single dose of
dipyrone.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 54, 549-553
115 Literaturverzeichnis
DAMM, D. (1989):
Simultaneous determination of the main metabolites of dipyrone by highpressure liquid
chromatography.
Arzneimittel-Forschung 39 , 1415-1417
DERENDORF, H., T. GRAMATTE u. H.G. SCHÄFER (Hrsg.) (2002):
Pharmakokinetik: Einführung in die Theorie und Relevanz für die Arzneimitteltherapie.
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart
DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG e.V. (FN) (Hrsg.) (2004):
Leistungsprüfungsordnung (LPO)
Verlag FN, Warendorf, 57-62, 240-242
DIREKTORIUM FÜR VOLLBLUTZUCHT UND RENNEN e.V. (DRV) (Hrsg.) (2002):
Rennordnung (RO) vom 1.März 1960, in der Neufassung vom 1.Januar 1991 mit Änderungen
bis Januar 2002
XIV. Unerlaubte Mittel – Doping
DVR, Köln, 127-136, 226-227
DÜE, M. (1998):
Doping bei Pferden
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 105, 114-117
DYKE, T. M., u. R. A. SAMS (1994):
Statistical tests used in publications of equine pharmacokinetic data – Which are used? Which
should be used?
in: Proceedings of the 10th International Conference of Racing Analysts and Veterinarians,
Stockholm, Sweden
EBERT, U., H.-H. FREY u. R. SCHULZ (2002):
Pharmakologie des zentralen Nervensystems (ZNS).
in: FREY, H. H. u. W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für
die Veterinärmedizin.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, 87-138
116 Literaturverzeichnis
EUROPEAN HORSERACE SCIENTIFIC LIAISON COMMITTEE – EHSLC (2002):
Guidelines for analysis of samples from pharmacocinetic studies – method validation.
in: Guidelines of EHSLC, 03. September 2002, The Jockey Club, Portman Square, London
FICHTL, B. (2001):
Arzneistoffkonzentratione im Organismus in Abhängigkeit von der Zeit: Pharmakokinetik im
engeren Sinn.
in: Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, FORTH, W., D.
HENSCHLER, W. RUMMEL, U. FÖRSTERMANN u. K. STARKE (Hrsg.)
8. Aufl., Urban und Fischer Verlag, Münschen
FLUSSER, D., E. ZYLBER-KATZ, L. GRANIT u. M. LEVY (1988):
Influence of food on the pharmacokinetics of dipyrone.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 34, 105-107
FREY, H.-H. (2002):
Allgemeine Pharmakologie.
in: FREY, H.-H. u. W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für
die Veterinärmedizin.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, 1-33
GERKEN, D. F., R. A. SAMS, K. Mc KEEVER et al. (1991):
Urinary pH effects on the renal clearance of lidocain and phenylbutazon in exercising horses.
The Toxicologist 11, 97
GLADTKE, E. und H.M. VON HATTINGBERG (1977):
Pharmakokinetik.
2.Auflage, Verlag Springer, Berlin, Heidelberg, New York
GOLBS, S. u. R. SCHERKL (1996):
Pharmakologie der Entzündung und der Allergie.
in: FREY, H.-H. u. W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für
die Veterinärmedizin.
Verlag Enke, Stuttgart
117 Literaturverzeichnis
GRAHWIT, G. (1988):
Das Dopingproblem aus tierschützerischer Sicht.
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 95, 46-47
HAUPTVERBAND FÜR TRABER-ZUCHT UND –RENNEN e.V. - HVT (Hrsg.) (2003):
Satzungen und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und -Rennen e.V.
HVT, Kaarst, 45, 71-73
HEINEMEYER, G., H. J. GRAMM, I. ROOTS, R. DENNHARDT u. W. SIMGEN (1993):
Kinetics of metamizol and its metabolites in critical-care patients with acute renal
dysfunction.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 45, 445-450
HEINZEL, G. R. u. P. TRANSWELL (1993):
Compartmental analysis method manual.
in: HEINZEL, G., R. WOLOSZCAK u. P. THOMANN (Hrsg.): Pharmacocinetic and
pharmacodynamic data analysis system for the PC.
Verlag Fischer, Stuttgart, Jena, New York
HIRT, A. (1997):
Doping im Tierschutzrecht: die Verantwortlichkeit des Tierarztes.
Tierärzt. Praxis 25, 244-248
HUSKAMP, B., N. KOPF u. W. SCHEIDEMANN (1999):
Magen-Darm-Trakt.
in: DIETZ, O. u. B. HUSKAMP (Hrsg.): Handbuch Pferdepraxis.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, S. 411-502
IBANEZ, L., X. VIDAL, E. BALLARIN u. J. R. LAPORTE (2004):
Agranulocytosis associated with dipyrone (metamizol).
Eur. J. Clin. Pharmacol. 60, 821-829
118 Literaturverzeichnis
INTERNATIONALE REITERLICHE VEREINIGUNG (FEI) (Hrsg.) (2001):
General Regulations 21th edition (2005) u. Veterinary Regulations 9th edition (2001)
(www.horsesport.org)
Fédération Équistre Internationale, 1005 Lausanne, Schweiz
KIETZMANN, M. (1983):
Einführung in die Kinetik für die Praxis.
Prakt. Tierarzt 7, 577-584
KIETZMANN, M., R. SCHERKL u. R. SCHULZ (2002):
Pharmakologie der Entzündung und der Allergie.
in: FREY, H.-H. u. W. LÖSCHER (Hrsg.): Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für
die Veterinärmedizin.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, 318-344
KLAUS, A.-M. u. H. J. HAPKE (1994):
Die Dopingproblematik im Pferdesport – Pharmakokinetik ausgewählter dopingrelevanter
Antiphlogistika/Analgetika.
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 101, 331-338
KLAUS, A.-M., Y. SCHLINGLOFF, U. KLEINITZ, M. BÖTTCHER u. H.-J. HAPKE
(1997):
Pharmakocinetic study of dipyrone metabolite 4-MAA in the horse and possible implications
for doping control.
Journal vet. Pharmacol. Therap. 20, 204-208
KOCH, K. u. W. A. RITSCHEL (1986):
Synopsis der Biopharmazie u. Pharmakokinetik.
ecomed Verlagsgesellschaft mbH, Landsberg, München
LEES, P. u. A. J. HIGGINS (1985) :
Clinical pharmakology and therapeutic uses of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the
horse.
Eq. Vet. J. 17, 83-96
119 Literaturverzeichnis
LEHMANN, W. D. (1996):
Massenspektrometrie in der Biochemie.
Verlag Spektrum Akademischer, Heidelberg, Berlin, Oxford
LEVY, M., E. ZYLBER-KATZ u. B. ROSENKRANZ (1995):
Clinical pharmakokinetics of dipyrone and ist metabolites.
Clin. Pharmakokinet. 28, Nr. 3, 216-234
LÖSCHER, W. u. R. KROKER (1997):
Allgemeine Pharmakologie.
in: LÖSCHER, W., F. R. UNGEMACH u. R. KROKER (Hrsg):
Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren.
3. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Hamburg, S. 19-22
MERCK INDEX (1989):
An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals.
BUDAVARI, S. (Hrsg.), 11th edition
Verlag Merck, Rahway, New Jersey, USA
MOOS, M. S. u. E. G. C. CLARKE (1977):
A review of drug “ clearance times” in race horses.
Equ. Vet. J. 9, 98-103
MOOS, M. S., u. P. E. HAYWOOD (1973):
Persistence of phenylbutazon in horses producing acid urines.
Vet. Rec. 93, 124
MUTSCHLER, E. (Hrsg.) (1991):
Pharmakokinetik.
in: Arzneimittelwirkungen: Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie.
6. Aufl., Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart
120 Literaturverzeichnis
NEDDERMANN, E. u. P. ROHDEWALD (1988):
Dose-dependent pharmacokinetics of metabolites of dipyrone in salvia.
Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 13, No 2, 105-111
POPOT, M.A., M. JAUBERT, F. BALSSA u. Y. BONNAIRE (2000):
Detection of dipyrone administration in the horse by gas chromatography/mass spectrometry.
Proceedings of the 13th International Conferenceof Racing Analyts and Veterinarians,
Cambridge, UK, 386-390
ROHDEWALD, P., G. DREHSEN, E. MILSMANN u. H. DERENDORF (1983):
Relationship between salvia levels of metamizol metabolites, bioavailability and analgesic
efficacy.
Arzneimittel-Forschung 33, 985-988
ROSENKRANZ, B., K. H. LEHR, G. MACKERT u. H. W. SEYBERT (1992):
Metamizol-furosemid interaction study in healthy volunteers.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 42, 593-598
SAMS, R. (1996):
Pharmacocinetic studies of drugs in racehorses.
in: Proceedings of 11th International Conference of Racing Analysts and Veterinarians,
Queensland, Australia
SANZ, M. L., P. GAMBOA u. A. L. DE WECK (2004):
New combined test with flowcytometric basophil activation and determination of
sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other
nonssteroidal anti-inflammatory drugs.
Int. Arch. Allergy Immunol. 136, Nr. 1, 58-72
SCHÄFER, M. (1999):
Krankheiten der Harnorgane.
in: DIETZ, O. u. B. HUSKAMP (Hrsg.): Handbuch Pferdepraxis.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, 511
121 Literaturverzeichnis
SCHLINGLOFF, Y.-C. (1997):
Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Metamizol und Dexamethason unter
Berücksichtigung dopingrelevanter Aspekte beim Pferd.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
SCHOENE, C. (1996):
Doping beim Pferd.
Verlag Enke, Stuttgart
SCHWEDT, G. (1986):
Chromatiographische Trennmethoden.
Verlag Thieme, Stuttgart, New York, 52-94
TANYILDIZI, S. u. T. BOZKURT (2003):
Effects of acetylsalicylic acid and metamizol on hyaluronidas activity and sperm
characteristics in rams.
Anim. Reprod. Sci. 76, 195-204
TOBIN, T. (1979):
Pharmacological review: The nonsteroidal anti-inflammatory drugs II: Equiproxen,
meclofenamic acid, flunixin and others.
J. Equine Med. Surg. 7, 298-302
TOBIN, T. (1981):
Drugs and the performance horse.
Verlag Thomas, Springfield, Illinois
TOBIN, T. (1983):
Pre and post-race testing for drugs in racing horses.
in: Proceedings of a course in drug usage in horses 122, 181-198
Veterinary Continuing Education Massey University, Palmerston North
122 Literaturverzeichnis
TOBIN, T. und T. WOOD (1989):
The effects of drugs on race horses performance.
in: Proceedings of the Annual Convent of the America Association of Equine Practioneers 34,
639-650
TOBIN, T., J. D. HARKINS u. R. A. SAMS (1999):
Testing for therapeutic medications: analytical/pharmacological relationships and
“ limitations” on the sensitivity of testing for certain agents.
J. Vet. Pharmacol. Therap. 22, 220-233
TOUTAIN, P. L. u. V. LASSOURD (2002):
Pharmacocinetic/pharmacodynamic approch to assess irrelevant plasma or urine drug
concentrations in postcompetition samples for drug control in the horse.
Equine Vet. J. 34, 242-249
UNGEMACH, F. R. (1985):
Dopingkontrolle bei Rennpferden.
Tierärztl. Praxis 13, 35-53
UNGEMACH, F. R. (1988):
Doping im Pferdesport.
in: Handbuch Pferd, Fachredaktion P. THEIN
Verlag BLV, München, Wien, Zürich, S. 869-884
UNGEMACH, F. R. (1997):
Pharmaka zur Beeinflussung von Entzündungen.
in: LÖSCHER, W., F. R. UNGEMACH u. R. KROKER (Hrsg):
Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren.
3. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Hamburg
123 Literaturverzeichnis
UNGEMACH, F. R. (2002):
Pharmaka zur Beeinflussung von Entzündungen.
in: LÖSCHER, W., F. R. UNGEMACH u. R. KROKER (Hrsg):
Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren.
5. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Hamburg
UNGEMACH, F. R. u. M. CH. NÜRNBERGER (1999):
Doping im Pferdesport.
in: DIETZ, O. u. B. HUSKAMP (Hrsg.): Handbuch Pferdepraxis.
2. Aufl., Verlag Enke, Stuttgart, S. 65-80
UNGER, K. K. u. E. WEBER (1995):
Handbuch der HPLC Teil 1: Leitfaden für Anfänger und Praktiker.
Verlag GIT, Darmstadt
VLAHOV, V., M. BADIAN, M. VERHO u. N. BACRACHEVA(1990):
Pharmacocinetics of metamizol metabolites in healthy subjects after a single oral dose of
metamizol sodium.
Eur. J. Clin. Pharmacology 38, 61-65
VOLZ, M. u. H. M. KELLNER (1980):
Kinetics and metabolism of pyrazolones (propyphenazone, aminopyrine and dipyrone).
British J. Clin. Pharmacol. 2, 299-308
ZYLBER-KATZ, E., Y. CARACO, L. GRANIT u. M. LEVY (1995):
Dipyrone metabolism in liver disease.
Clin. Pharmacol. Therap. 58, Nr. 2, 198-209
ZYLBER-KATZ, E., L. GRANIT u. M. LEVY (1985):
Plasma protein binding of dipyrone metabolites in man.
Eur. J. Pharmacol. 29, 67-71
124 Literaturverzeichnis
ZYLBER-KATZ, E., L. GRANIT u. M. LEVY (1984):
Simultaneous determination of dipyrone metabolites in plasma by high-performance liquid
chromatography.
J. Chromatogr. 305, 477-484
ZYLBER-KATZ, E., L. GRANIT u. M. LEVY (1992):
Formation and excretion of dipyrone metabolites in man.
Eur. J. Clin. Pharmacol. 42, 187-191
125 Anhang
9. Anhang
Im Anhang sind folgende Tabellen aufgeführt:
Tabelle 19 - Teil 1 und 2: 4-MAA-Plasmakonzentrationen von 10 Pferden nach
Applikation (i.v.) von 30
mg/kg KGW Metamizol einschließlich der
Probenentnahmezeitpunkte Tabelle 20 - Teil 1 und 2: 4-MAA-Urinkonzentrationen von 10 Pferden nach Applikation
(i.v.) von 30
mg/kg KGW Metamizol einschließlich der
Probengewinnungszeitpunkte
Tabelle 21: pH-Werte der gewonnenen Urinproben
126 Anhang
Tab. 19 – Teil 1: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Plasma [µg/ml] nach
intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-E) einschließlich
der Probenentnahmezeitpunkte
Probe Zeit p.a. [h] Pferd A Pferd B Pferd C Pferd D Pferd E
p00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p 01 0,03 134,42 128,79 169,09 208,81 138,27
p02 0,08 82,87 100,76 114,14 110,45 72,50
p03 0,16 57,38 74,41 73,25 77,32 59,40
p04 0,25 39,98 54,79 56,83 52,84 44,64
p05 0,50 21,30 32,82 30,96 30,81 24,52
p06 1,00 13,68 20,60 23,12 22,62 19,42
p07 2,00 8,30 13,94 16,02 16,40 14,59
p08 4,00 8,08 9,88 7,23 9,15 8,95
p09 6,00 5,78 6,88 5,69 6,94 5,02
p10 8,00 3,81 4,29 3,24 4,79 4,25
p11 12,00 1,96 1,92 2,25 1,73 1,81
p12 24,00 0,18 0,16 0,16 0,00 0,00
p13 36,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p14 48,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p15 72,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p16 96,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
127 Anhang
Tab. 19 – Teil 2: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Plasma [µg/ml] nach intravenöser
Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-E) einschließlich der
Probenentnahmezeitpunkte
Probe Zeit p.a. [h] Pferd F Pferd G Pferd H Pferd I
p00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p 01 0,03 165,72 168,01 170,73 156,30
p02 0,08 103,04 89,26 91,47 100,49
p03 0,16 66,79 52,13 61,73 68,48
p04 0,25 46,05 40,17 49,75 46,25
p05 0,50 28,76 24,57 28,13 24,06
p06 1,00 19,71 14,53 16,83 16,03
p07 2,00 13,25 10,71 11,87 10,52
p08 4,00 8,88 7,25 7,50 7,58
p09 6,00 6,65 4,09 4,96 4,35
p10 8,00 4,50 3,00 3,41 3,52
p11 12,00 2,42 1,39 1,62 1,39
p12 24,00 0,66 0,09 0,14 0,00
p13 36,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p14 48,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p15 72,00 0,00 0,00 0,00 0,00
p16 96,00 0,00 0,00 0,00 0,00
128 Anhang
Tab. 20 – Teil 1: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Urin [µg/ml] nach intravenöser
Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-D) einschließlich der
Probengewinnungszeitpunkte
n.n. = nicht nachgewiesen
Probe Zeit p.a. [h] Pferd A Probe Zeit p.a. [h] Pferd B
u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00
u 01 0,00 n.n u 01 2,00 3029,48
u 02 5,33 657,29 u 02 5,58 485,71
u 03 9,50 189,89 u 03 14,00 244,74
u 04 25,00 1,79 u 04 24,00 15,63
u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 1,41
u 06 48,00 0,00 u 06 48,00 0,00
u 07 72,00 0,00 u 07 72,00 0,00
u 08 96,00 0,00 u 08 97,05 0,00
u 09 120,00 0,00 u 09 121,25 0,31
u 10 141,42 0,54 u 10 144,00 0,00
u 11 163,66 0,49 u 11 169,08 0,00
Probe Zeit p.a. [h] Pferd C Probe Zeit p.a. [h] Pferd D
u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00
u 01 2,00 3346,93 u 01 0,00 n.n.
u 02 5,33 290,15 u 02 6,00 4620,13
u 03 10,00 236,51 u 03 10,00 191,50
u 04 24,00 19,78 u 04 24,00 13,42
u 05 36,00 1,20 u 05 36,00 n.n.
u 06 48,00 0,00 u 06 49,08 0,00
u 07 72,00 0,00 u 07 72,00 0,00
u 08 96,00 0,00 u 08 96,00 0,00
u 09 120,00 1,49 u 09 118,92 0,55
u 10 142,04 0,88 u 10 144,00 0,24
u 11 168,00 0,05 u 11 168,00 0,00
129 Anhang
Tab. 20 – Teil 2 : gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Urin [µg/ml] nach intravenöser
Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd E-J) einschließlich der
Probengewinnungszeitpunkte
n.n.= nicht nachgewiesen
Probe Zeit p.a. [h] Pferd E Probe Zeit p.a. [h] Pferd F
u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00
u 01 2,00 5021,71 u 01 2,00 2299,81
u 02 6,00 297,39 u 02 6,00 441,25
u 03 10,00 253,89 u 03 10,00 374,68
u 04 24,00 2,30 u 04 24,00 18,74
u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 0,00
u 06 49,05 0,00 u 06 49,03 0,00
u 07 73,01 0,40 u 07 72,00 0,44
u 08 96,00 0,01 u 08 94,38 0,16
u 09 120,93 0,00 u 09 119,53 0,00
u 10 152,36 0,00 u 10 142,07 0,00
u 11 174,36 0,28 u 11 174,95 0,20
Probe Zeit p.a. [h] Pferd G Probe Zeit p.a. [h] Pferd H
u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00
u 01 2,00 2957,97 u 01 2,00 1209,65
u 02 7,50 202,37 u 02 7,00 434,13
u 03 10,00 111,39 u 03 12,07 157,41
u 04 24,00 2,03 u 04 30,33 0,00
u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 0,00
u 06 48,00 0,00 u 06 49,00 0,00
u 07 70,75 0,00 u 07 72,00 0,00
u 08 93,25 0,00 u 08 97,00 0,00
u 09 118,12 0,00 u 09 120,00 0,28
u 10 141,33 0,05 u 10 152,28 0,06
u 11 173,25 0,20 u 11 170,02 0,00
130 Anhang
Probe Zeit p.a. [h] Pferd I Probe Zeit p.a. [h] Pferd J
u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00
u 01 0,00 n.n. u 01 2,00 1317,34
u 02 6,00 1031,51 u 02 6,00 583,53
u 03 10,00 301,02 u 03 10,00 190,63
u 04 24,00 44,53 u 04 24,00 57,30
u 05 35,00 13,63 u 05 36,00 17,67
u 06 50,05 0,14 u 06 47,08 2,49
u 07 70,83 0,00 u 07 69,42 2,27
u 08 95,55 0,00 u 08 94,18 0,00
u 09 118,92 0,00 u 09 117,50 0,00
u 10 151,12 0,11 u 10 149,73 0,00
u 11 170,92 0,00 u 11 169,72 0,00
Tab. 21 : pH-Werte der gewonnenen Urinproben
Urin-
Probe
Pferd
A
Pferd
B
Pferd
C
Pferd
D
Pferd
E
Pferd
F
Pferd
G
Pferd
H
Pferd
I
Pferd
J
u01 9 8,75 9 9 9 8,5 8,5 9 8,75 9
u02 8,5 8,75 9 9 9 9 8,75 9 8,75 9
u03 8,5 8,75 9 9 9 9 8,75 9 9 8,5
u04 9 8,25 9 9 9 9 8,75 9 8,5 8,5
u05 8,75 8,5 9 9 8,5 9 8,75 9 8,5 9
u06 8,75 8,75 8,5 9 9 9 8,75 9 8,75 8,75
u07 9 8,75 8,5 9 8,5 9 9 9 8,5 8
u08 9 9 8,75 9 8,5 9 9 9 8,75 7,5
u09 9,25 8,5 8,5 8,75 8,5 9 8,75 8,25 9 7,5
U10 8,25 8,25 8,5 8,75 8,5 8,5 8,75 8,25 9 7,5
U11 8,25 8,25 8,5 8 9 9 8,5 8,25 8,75 8,5
u00 9 9 8 9,25 9 9 8,5 9 8,5 8,75
131 Danksagung
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen des
Themas und die außerordentlich gute Betreuung. Seine stete Unterstützung war allzeit
motivationsfördernd.
Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V. in Warendorf, im
Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und die
Übernahme der finanziellen Kosten, die die Durchführung dieser Arbeit ermöglichten.
Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Institutes für Biochemie der Deutschen
Sporthochschule Köln für die freundliche Aufnahme und ausdauernde Unterstützung im
Labor. Herrn Prof. Dr. W. Schänzer und Herrn Dr. Marc Machnik danke ich für den
fachlichen Beistand bei der Entwicklung der Analysenmethode und für die hervorragende
Betreuung während des gesamten Laboraufenthaltes. Herrn Opfermann, Dr. Mario Thevis
und Sven Guddert gilt mein besonderer Dank für die geduldige rund-um-die-Uhr-Betreuung
hinsichtlich jeglicher Fragestellung zur sensiblen Technik der HPLC.
Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die
freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und der Einrichtungen und
Gerätschaften der FAL. Herrn Jonny Meier und Herrn Wassmann danke ich herzlichst für die
freundliche und tatkräftige Unterstützung im Pferdestall.
Weiterhin gilt mein Dank Herrn Dr. Frank Niedorf, der durch Beseitigung aller Fragen zur
Methodenvalidierung zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Ebenso danke ich Herrn
Hans-Herbert Bohr für die Hilfe bei der Beschaffung aller zur Durchführung der
Ausscheidungsstudie notwendigen Utensilien.
Mein Dank gilt außerdem Severine Tobias und Irene Hammer, die hochmotiviert die
anfängliche praktische Organisation dieser Arbeit vorantrieben.
Ein besonderer Dank gilt meiner Familie, Helmut, Astrid, Alina, Andre, Freni, Ute, Wiebke,
Ines, Sandra, Swantje und allen, die ich hier noch vergessen habe, auf die ich mich immer
132 Danksagung
verlassen konnte und die durch tatkräftige und moralische Unterstützung zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.