uČinak oksidacijskog stresa u mehanizmu toksiČnosti · životinjskog porijekla ~meso, mlijeko,...

FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET

Dubravka Rašić

UČINAK OKSIDACIJSKOG STRESA U

MEHANIZMU TOKSIČNOSTI

OKRATOKSINA A I CITRININA

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2013

FACULTY OF PHARMACY AND BIOCHEMISTRY

Dubravka Rašić

THE SIGNIFICANCE OF OXIDATIVE

STRESS IN THE MECHANISM OF TOXICITY

OF OCHRATOXIN A AND CITRININ

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2013

FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET

Dubravka Rašić

UČINAK OKSIDACIJSKOG STRESA U

MEHANIZMU TOKSIČNOSTI

OKRATOKSINA A I CITRININA

DOKTORSKI RAD

Mentor:

Dr. sc. Maja Peraica, dr. med., znanstvena savjetnica

Zagreb, 2013

FACULTY OF PHARMACY AND BIOCHEMISTRY

Dubravka Rašić

THE SIGNIFICANCE OF OXIDATIVE

STRESS IN THE MECHANISM OF TOXICITY

OF OCHRATOXIN A AND CITRININ

DOCTORAL THESIS

Supervisor:

Maja Peraica, PhD, MD, Scientific advisor

Zagreb, 2013

Ovaj rad izrađen je u Jedinici za toksikologiju, Jedinici za mutagenezu i Jedinici za analitičku

kemiju i mineralni metabolizam Instituta za medicinska istraživanja i medicinu rada, a u

okviru projekta Ministarstva znanosti, obrazovanja i sporta Republike Hrvatske br. 022-

0222148-2142 pod vodstvom znanstvene savjetnice dr. sc. Maje Peraica, dr. med.

Rad je predan na ocjenu Fakultetskom vijeću Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja znanstvenog stupnja doktora znanosti iz područja

biomedicine i zdravstva.

Izradu ovog doktorskog rada omogućili su dragi ljudi svojim znanjem i stručnošću.

Hvala…

Voditeljici projekta i mojoj dragoj mentorici dr. sc. Maji Peraica, voditeljici Jedinice za toksikologiju na svakodnevnim

dobronamjernim savjetima, usmjeravanju i kreativnim znanstvenim i neznanstvenim raspravama.

Svim bivšim i sadašnjim suradnicima Jedinice za toksikologiju na ugodnoj radnoj atmosferi i pomoći, a posebno gospođi

Jasni Mileković, višoj tehničkoj suradnici, koja je svoje slobodne vikende odvajala kako bi pokusi na životinjama bili

besprijekorno obavljeni.

Dr. sc. Alici Pizent, dr. sc. Marinu Mladiniću i dr. sc. Davoru Želježiću koji su svojim znanjem i vještinama pridonijeli

eksperimentalnom izvođenju dijela ovog doktorskog rada te na sugestijama tijekom pisanja rada.

Srdjanu Stefanoviću, dr. vet. med. s Instituta za higijenu i tehnologiju mesa u Beogradu na otkrivanju tajni UPLC-MS/MS-a

i ekspresnoj analizi uzoraka.

Mojim dragim bivšim i sadašnjim kolegama s Instituta za medicinska istraživanja i medicinu rada koji oko sebe šire

pozitivnu energiju i više nego dobrodošlu u pojedinim trenucima.

Svima koji su na bilo koji način doprinijeli izradi ovog doktorskog rada.

Mojoj obitelji na podršci.

Posebno hvala mojem dragom suprugu Nikoli koji je svojim računalnim vještinama i pedantnošću pridonio da ovaj

doktorski rad poprimi konačan oblik te na beskrajnoj ljubavi i toleranciji.

1

Sadržaj

1 UVOD ............................................................................................................................................... 3

1.1 Okratoksin A ............................................................................................................................ 5

1.1.1 Kemijska svojstva ............................................................................................................. 5

1.1.2 Biosinteza ........................................................................................................................ 6

1.1.3 Metabolizam i mehanizam djelovanja OTA ..................................................................... 7

1.1.4 Toksični učinci .................................................................................................................. 9

1.1.5 Izloženost ljudi ............................................................................................................... 11

1.2 Citrinin ................................................................................................................................... 14

1.2.1 Kemijska svojstva ........................................................................................................... 14

1.2.2 Povijest .......................................................................................................................... 14

1.2.3 Pigmenti roda Monascus ............................................................................................... 15

1.2.4 Toksikokinetika .............................................................................................................. 15

1.2.5 Toksični učinci ................................................................................................................ 16

1.2.6 Izloženost ljudi ............................................................................................................... 18

1.3 Zajedničko djelovanje OTA i CTN i vrste koje proizvode oba mikotoksina............................ 20

1.3.1 Zajedničko pojavljivanje okratoksina A i citrinina u hrani ............................................. 20

1.4 Oksidacijski stres ................................................................................................................... 24

1.4.1 Malondialdehid.............................................................................................................. 24

1.4.2 Glutation ........................................................................................................................ 25

1.4.3 Superoksid dismutaza .................................................................................................... 26

1.4.4 Katalaza ......................................................................................................................... 26

1.4.5 Glutation peroksidaza.................................................................................................... 27

1.5 Antioksidansi ......................................................................................................................... 27

1.5.1 Resveratrol .................................................................................................................... 28

2 OBRAZLOŽENJE TEME .................................................................................................................... 33

3 MATERIJALI I METODE ................................................................................................................... 34

3.1 Kemikalije .............................................................................................................................. 34

3.2 Instrumenti ............................................................................................................................ 35

3.3 Puferi i otopine ...................................................................................................................... 36

3.3.1 Otopine mikotoksina i resveratrola za tretman pokusnih životinja .............................. 37

3.4 Životinje ................................................................................................................................. 38

3.4.1 Tretman životinja ........................................................................................................... 38

2

3.4.2 Metode .......................................................................................................................... 40

4 STATISTIČKA OBRADA .................................................................................................................... 50

5 REZULTATI...................................................................................................................................... 51

5.1 Opće stanje životinja ............................................................................................................. 51

5.2 Mjerenje koncentracije mikotoksina ..................................................................................... 57

5.2.1 OTA u urinu, bubregu i jetri u preliminarnom pokusu .................................................. 57

5.2.2 Mjerenje koncentracije OTA i CTN-a u buregu, jetri i mozgu ........................................ 58

5.3 Oksidacijsko oštećenje .......................................................................................................... 62

5.3.1 Malondialdehid.............................................................................................................. 62

5.3.2 Glutation ........................................................................................................................ 67

5.3.3 Superoksid dismutaza .................................................................................................... 71

5.3.4 Katalaza ......................................................................................................................... 74

5.3.5 Glutation peroksidaza.................................................................................................... 76

5.3.6 hOGG1 ........................................................................................................................... 77

6 RASPRAVA...................................................................................................................................... 83

7 ZAKLJUČCI ...................................................................................................................................... 93

8 POPIS KORIŠTENIH KRATICA .......................................................................................................... 95

9 LITERATURA ................................................................................................................................... 96

10 SAŽETAK ................................................................................................................................... 114

11 SUMMARY ............................................................................................................................... 116

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA ............................................................................................ 118

BASIC DOCUMENTARY CARD ............................................................................................................... 119

ŽIVOTOPIS ............................................................................................................................................ 120

3

1 UVOD

Mikotoksini su sekundarni metaboliti plijesni koje nalazimo u hrani biljnog i životinjskog

porijekla. Hrana i krmivo obično je istovremeno kontaminirana s različitim plijesnima koje

proizvode različite mikotoksine. Mikotoksini i njihovi metaboliti mogu se naći u hrani

životinjskog porijekla (meso, mlijeko, jaja, sir) ako su životinje izložene kontaminiranom

krmivu (Peraica i sur., 2002).

Bolesti uzrokovane mikotoksinima nazivaju se mikotoksikoze. U povijesti su mikotoksini

uzrokovali velike epidemije ljudi i životinja zbog kojih je uginulo više desetaka tisuća životinja

i umrlo više stotina tisuća ljudi (Peraica i Rašić, 2012).

Mikotoksini su molekule različitih struktura – od jednostrukih heterocikličkih prstenova

molekulske mase od jedva 50 Da do nepravilno uređenih struktura koje se sastoje od šest ili

osam povezanih prstenova molekulske mase veće od 500 Da. Budući da takve malene

molekule ne potiču odgovor imunološkog sustava jer ih on ne raspoznaje kao strane

molekule, one se distribuiraju u organima sisavaca uzrokujući toksične učinke (Pitt, 2000).

Simptomi mikotoksikoza su različiti – od preosjetljivosti kože, oštećenja bubrega, jetre i

drugih organa do imunodeficijencije ili indukcije tumora.

Najveći broj vrsta plijesni koji proizvode mikotoksine, a povezani su s proizvodnjom hrane

dolaze iz tri roda: Aspergillus, Fusarium i Penicillium. Neke vrste plijesni iz rodova Aspergillus

i Penicillium su patogeni ili komensali na biljkama, no češće su te vrste povezane s

onečišćenjem hrane tijekom sušenja i skladištenja. Proizvodnja mikotoksina ovisi o genskom

potencijalu plijesni, temperaturi i vlažnosti okoliša. Ne zna se koja je uloga mikotoksina u

rastu i razvoju plijesni (Pitt, 2000).

Okratoksini su skupina strukturno sličnih mikotoksina koji su metaboliti plijesni rodova

Aspergillus i Penicillium. U tropskim i suptropskim područjima okratoksin A (OTA) uglavnom

proizvode plijesni roda Aspergillus, a u umjerenim područjima to su uglavnom plijesni roda

Penicillium (Krogh, 1987). OTA je glavni i najčešći predstavnik okratoksina koji jedini ima

4

značajno karcinogeno djelovanje (Wang i Groopman, 1999). Otkriven je 1965. godine kao

toksični metabolit plijesni Aspergillus ochraceus (Van der Merwe i sur., 1965).

U Danskoj je 1928. godine otkrivena povezanost između nefropatije svinja i njihove prehrane

pljesnivom hranom (Krogh, 1972). Slična bolest pojavljuje se endemski i kod ljudi na

području nekih država na Balkanskom poluotoku te je zbog toga nazvana endemskom

nefropatijom (EN). To je kronična obostrana bolest bubrega otkrivena pedesetih godina

dvadesetog stoljeća u seoskim dijelovima Bosne i Hercegovine, Bugarske, Hrvatske, Kosova,

Rumunjske i Srbije. Obilježja EN-a su da je to neupalna intersticijska bolest s neprimjetnim

početkom koja polako napreduje do zatajenja bubrega. Nekad se javljala u mlađoj životnoj

dobi, a danas kod starijih osoba koje zbog napretka medicine obično dožive normalni životni

vijek (Miletić Medved i sur., 2005). U području EN-a javljaju se češće tumori urotela pa se

smatra da je uzrok tih tumora isti kao i EN-a.

S obzirom na sličnosti endemske nefropatije i mikotoksinske nefropatije koja zahvaća svinje i

perad te na prisutnost OTA u hrani životinja koje su oboljele od nefropatije i u hrani ljudi u

endemskom kraju, Krogh je pretpostavio da je uzročnik tih bolesti isti (Krogh, 1974). Tijekom

proljeća 1980. godine Hult i suradnici su u krvi stanovnika endemskih sela na području

zapadne brodske Posavine prvi puta izmjerili OTA (Hult i sur., 1982). U brojnim istraživanjima

prije i nakon toga OTA je utvrđen u mnogobrojnim uzorcima hrane i krvi iz toga područja i to

u značajno višim koncentracijama nego u hrani i krvi stanovnika područja u kojima nema

endemske nefropatije, no nikada nije dokazano da je bolest uzrokovana tim mikotoksinom

(Pavlović i sur., 1979). Na pokusnim je životinjama dokazano da OTA ima nefrotoksično,

hepatotoksično, hematotoksično, imunosupresivno i teratogeno djelovanje (Marquardt i

Frolich, 1992; Castegnaro i sur., 1998; Obrecht-Pflumio i Dirheimer, 2000; Obrecht-Pflumio i

Dirheimer, 2001), a Međunarodna agencija za istraživanje raka (International Agency for

Research on Cancer - IARC) ga je svrstala u skupinu 2B - mogući karcinogen za ljude (IARC,

1983).

Citrinin (CTN) je mikotoksin kojeg proizvode plijesni iz rodova Aspergillus, Penicillium i

Monascus. Izolirali su ga Hetherington i Raistrick 1931. godine kao sekundarni metabolit

vrste Penicilium citrininum (Hetherington i Raistrick, 1931). Iako je davno otkriven, nije mu

pridavana velika pažnja do nedavno kada je postao zanimljiv zbog pretpostavke da bi

5

zajedno s OTA mogao uzrokovati EN (Stoev i sur., 1998a, Stoev i sur., 1998b, Stoev, 2008).

Neke vrste plijesni koje proizvode CTN mogu proizvoditi OTA i patulin. CTN najčešće

kontaminira žitarice nakon žetve i tijekom skladištenja, no nalazi se i na drugim proizvodima

biljnog porijekla kao što su grah, voće, voćni i povrtni sokovi, aromatično bilje i začini te na

pokvarenim mliječnim proizvodima (Fink-Gremmels, 1991). CTN kontaminira i crvenu rižu

koja se boji pigmentom monascidinom koji nastaje iz plijesni Monascus (Blanc i sur., 1995a;

Blanc i sur., 1995b).

Ciljni organ djelovanja CTN-a je bubreg, a u manjoj mjeri oštećuje jetru i koštanu srž (Gupta i

sur., 1983). CTN ima antibiotski učinak za Gram-pozitivne bakterije, no zbog nefrotoksičnosti

nikada nije korišten kao antibiotik (Raistrick i Smith, 1941). Međunarodna agencija za

istraživanje raka svrstala je citrinin u skupinu 3 – nije dokazano karcinogen za ljude (IARC,

1983).

Hesseltine je 1986. godine poredao mikotoksine po važnosti te je okratoksin A smjestio na

sam vrh, a citrinin na dno ljestvice (Hesseltine, 1986).

1.1 Okratoksin A

1.1.1 Kemijska svojstva

Prema IUPAC-u naziv OTA je L-fenilalanin-N-((5-kloro-3,4-dihidro-8hidroksi-3-metil-1-okso-

1H-2-benzopiran-7-il)karbonil)-(R)-izokumarin (slika 1-1). 7-karboksi-5-klor 3,4-dihidro-3R-

metil izokumarin amidno je vezan s L-fenilalaninom preko karboksilne skupine na položaju 7

kumarinske jezgre. Empirijska formula mu je C20H18O6NCl, a molekulska masa 403,82.

Bezbojna je kristalinična tvar dobro topljiva u polarnim organskim otapalima, slabo topiva u

vodi, a topiva u vodenoj otopini natrijevog hidrogenkarbonata. OTA ima maksimum

apsorpcije kod 333 nm, a emisije kod 467 nm (u 96%-tnom etanolu), a pod UV svjetlom (366

nm) flourescira plavo (Kuiper-Goodman i Scott., 1989; Ringot i sur., 2005).

6

Slika 1-1 Kemijska struktura okratoksina A

OTA je slaba kiselina kojoj je pKa vrijednost u rasponu od 4,2 do 4,4 za karboksilnu skupinu

fenilalaninskog dijela molekule i od 7,0 do 7,3 za fenolnu hidroksilnu skupinu izokumarinskog

dijela. Kiseli dijelovi molekule imaju ključnu ulogu u apsorpciji OTA. U uvjetima fiziološke pH

vrijednosti u tankom crijevu OTA je prisutan u obliku monoaniona (OTA-) i diaoniona (OTA2-),

a u potpuno protoniranom obliku nalazi se uglavnom u gornjim dijelovima

gastrointestinalnog trakta gdje je pH nizak (Pfohl-Leszkowicz i Manderville, 2007; Ringot i

sur., 2005). OTA ima atom klora na mjestu C5 dihidro-metil-izokumarinskog prstena te on

zajedno s fenolnom –OH skupinom povećava toksičnost. Amidna je veza između

fenilalaninskog i dihidroizokumarinskog dijela vrlo stabilna te se ova molekula ne raspada na

visokoj temperaturi niti hidrolizira (Petzinger i Ziegler, 2000). Razgrađuje ga UV zračenje.

1.1.2 Biosinteza

Proizvodnja OTA ovisi o genskim svojstvima i fiziologiji plijesni na koju utječu različiti

čimbenici kao što su temperatura, aktivnost vode i sastav hranidbene podloge. U hladnim i

umjerenim područjima Penicillium verrucosum obično kontaminira žitarice, a P. nordicum

obično kontaminira meso tijekom sušenja i sir (Dwivedi i Burns, 1986; Fink-Gremmels i sur.,

1995; Föllmann i sur., 1995; Gareis i sur., 1988). U tropskim i suptropskim predjelima OTA

obično proizvodi vrsta Aspergillus ochraceus i to na orasima, kikirikiju, grahu, začinima,

zelenoj kavi, sušenom voću, ali i na mesu i dimljenoj i usoljenoj ribi (Kozakiewicz, 1989;

Pardo i sur., 2005; WHO/FAO, 2001). Osim ove vrste roda Aspergillus, OTA proizvode i vrste

A. niger var niger (žitarice i uljarice) i A. carbonarius (grožđe, grožđice i kava) (Abarca i sur.,

člaxmkl

7

1994; Belli i sur., 2004). Neke druge vrste iz roda Aspergillus (A. lacticoffeatus, A.

sclerotioniger i A. alliaceus) te vrsta Petromyces alliaceus mogu proizvoditi OTA u

laboratorijskim uvjetima (Samson i sur., 2004; Lillehoj i sur., 1978; Moss, 1996; Bayman i

sur., 2002; Varga i sur., 2003).

1.1.3 Metabolizam i mehanizam djelovanja OTA

Kod većine životinja OTA se pasivno apsorbira u neioniziranom obliku (OTA0) ili obliku

monoaniona (OTA-) u želucu i u proksimalnom jejunumu (Ringot i sur., 2000). Metabolizam

OTA do sada nije detaljno razjašnjen, no budući da se akumulira u bubrezima, pretpostavlja

se da je njegov mehanizam složeniji nego što je trenutno poznato (EFSA, 2006).

Toksikokinetički čimbenici znatno utječu na toksičnost OTA. Nakon apsorpcije u probavnom

sustavu OTA se veže za proteine plazme, a stupanj vezanja različit je u različitim životinjskim

vrstama. Jačina vezanja OTA za proteine plazme određuje vrijeme njegovog zadržavanja u

organizmu. Toksikokinetika OTA proučavana je u pokusima na šaranima, prepelicama,

miševima, štakorima, svinjama i majmunima. Životinje su tretirane peroralno (po) ili

intravenozno (iv) s OTA (50 ng kg-1 tm) te im je uzimana krv u različitim vremenskim

razmacima (Hagelberg i sur., 1989). Vrijeme polovične eliminacije (t ½) OTA iz plazme bilo je

dulje kod svih životinja u pokusu nakon iv aplikacije nego nakon po aplikacije jer se nakon po

aplikacije OTA djelomično eliminira putem jetre prije dolaska u krvotok. Najduži t ½

eliminacije OTA bilo je kod majmuna (840 sati nakon iv aplikacije, odnosno 510 sati nakon

po), a najkraći kod šarana (8,3 sata nakon iv aplikacije, odnosno 0,68 sati nakon po). Kod

ostalih životinja u pokusu t ½ eliminacije nakon iv aplikacije iznosilo je od 12 sati (prepelica)

do 170 sati (štakor), a nakon po aplikacije od 6,7 sati (prepelica) do 120 sati (štakor)

(Hagelberg i sur., 1989). U ljudi t ½ eliminacije OTA iz plazme nakon po aplikacije iznosi 35,55

dana (853,2 sata) te je veća negoli u majmuna (510 sati) (Studer-Rohr i sur., 2000).

Vrijeme polovične eliminacije OTA iz krvi veće je od t ½ eliminacije iz pojedinih organa

vjerojatno zbog vezanja OTA na proteine plazme (Ringot i sur., 2005). OTA se iz crijeva

reapsorbira u cirkulaciju i zatim krvotokom ponovo dolazi u jetru iz koje se sa žuči izlučuje u

crijevo (enterohepatička cirkulacija) što pogoduje dugom zadržavanju OTA u organizmu

8

(Fuchs i sur., 1988a; Roth i sur., 1988). Osim toga, OTA se u glomerulu izlučuje urinom, a

zatim se reapsorbira u proksimalnim i distalnim kanalićima bubrega. Raspodjela OTA u

organizmu ovisi o vrsti životinje, načinu primjene, dozi OTA, prehrani i zdravstvenom statusu

životinje. Uglavnom se nakuplja u bubrezima, jetri i mišićima (Fuchs i sur., 1986; Fuchs i sur.,

1988a; Fuchs i sur., 1988b; Ringot i sur., 2000; Corcuera i sur., 2012), no pronađen je i u

ostalim organima. Nakupljanje OTA u organizmu istraživano je na nekoliko životnjskih vrsta

(štakor, miš, pastrva i prepelica). OTA je u različitim koncentracijama pronađen najviše u krvi,

a zatim u srcu, mozgu, žlijezdama slinovnicama, škrgama, plućima, timusu, tankom i

debelom crijevu, jetri, žuči, bubregu (u kori i srži; pronefros i opistonefros kod riba), slezeni,

gušterači, jajnicima, maternici, testisima, urinu, koštanoj srži, mišićima, koži i smeđem

masnom tkivu (Breitholtz Emanuelsson i sur., 1991; Fuchs i sur., 1986; Fuchs i sur., 1988a;

Fuchs i sur., 1988b).

OTA je toksičan djelomično zbog strukturne homologije okratoksina A i fenilalanina zbog koje

OTA inhibira sintezu proteina zbog kompeticije s fenilalaninom za fenilalanin tRNA sintetazu

(Creppy i sur., 1983). Uzrokuje i lomove DNA, inhibiciju glukoneogeneze, inhibiciju

zgrušavanja krvi i apoptozu (Petzinger i Ziegler, 2000). Mehanizam toksičnosti OTA uključuje i

oksidacijsko oštećenje povećanjem produkcije slobodnih radikala što uzrokuje povećanje

lipidne peroksidacije (Domijan i sur., 2004a). Osim toga OTA inhibira stanično disanje u

mitohondriju jer je kompetitivni inhibitor nosača na unutarnjoj strani mitohondrijske

membrane pa utječe na mehanizam kojim se stvara energija (Stoev i sur., 2002; Petzinger i

Ziegler, 2000).

Način eliminacije iz organizma ovisi o putu unosa OTA, dozi, stupnju vezanja OTA s

proteinima plazme i njegovoj enterohepatičkoj cirkulaciji. Kod svih životinjskih vrsta važnu

ulogu u eliminaciji toksina iz organizma imaju i urinarna i fekalna ekskrecija. Razina ekskrecije

nekim od tih putova ovisi o putu unošenja toksina u organizam, dozi, stupnju vezanja za

proteine i enterohepatičkoj citkulaciji (Ringot i sur., 2006). Eliminaciju urinom otežava

reapsorpcija OTA u svim dijelovima nefrona uz pomoć organskih anionskih transportera

(OAT) (Žlender i sur., 2009). Bubrežna reapsorpcija OTA pridonosi njegovoj akumulaciji u

bubregu i nefrotoksičnosti. Uz izlučivanje urinom i fecesom, kod sisavaca je važno izlučivanje

majčinim mlijekom (Ringot i sur., 2006). Taj je način izlučivanja važan jer je majčino mlijeko

hrana za dojenčad na čije zdravlje OTA može posebno štetno utjecati.

9

1.1.4 Toksični učinci

Ciljni organ toksičnog djelovanja OTA je bubreg. Nađeno je da je nefrotoksičan za sve

pokusne i domaće životinje osim za goveda. OTA je mikotoksin s kancerogenim,

genotoksičnim, teratogenim, imunotoksičnim i nefrotoksičnim svojstvima (Domijan i Peraica,

2010 ). OTA oštećuje proksimalne kanaliće bubrega pri čemu se u urinu može naći povećana

katalitička aktivnost ezima četkaste prevlake (Domijan i sur., 2004b). Sam OTA je organski

anion (OA) i supstrat je za različite bubrežne OAT-e koji su većim dijelom smješteni na

bazolateralnoj i luminalnoj membrani proksimalnog kanalića bubrega (Žlender i sur., 2009).

Povećano nakupljanje OTA u proksimalnim kanalićima bubrega primijećeno je u različitim

životinjskim modelima (štakor, svinje, kokoši) te se smatra da je djelomično odgovoran za

dokazanu nefrotoksičnost OTA. Uz ostale simptome nefrotoksičnosti (smanjenje

funkcionalnosti proskimalnih kanalića, glukozurija, proteinurija, oštećenje strukture kanalića,

apoptoza, nekroza i adenomi i karcinomi stanica kanalića), OTA utječe na aktivnost i

ekspresiju bubrežnih OAT-a. U bubrezima sisavaca OTA se prenosi putem OAT1, OAT2, OAT3,

OAT4 (nije pristutan u glodavaca) i OAT5 (nije prisutan u ljudi). U našem istraživanju u kojem

su muški štakori 10 dana tretirani s OTA (250 i 500 µg kg-1 tm) vidljivo je oštećenje

proksimalnih kanalića bubrega i upregulacija OAT-a u cijelom proksimalnom kanaliću.

Najveće oštećenje primijećeno je u S3 segmentu proksimalnog kanalića te je pretpostavljeno

da stanice u ovom dijelu kanalića imaju najučinkovitiji mehanizam nakupljanja OTA ili

najneučinkovitiji mehanizam njegove eliminacije. Budući da je oksidacijski stres jedan od

predloženih mehanizama nefrotoksičnosti OTA, pretpostavljamo da ovaj dio kanalića ima

nisku koncentraciju „hvatača“ staničnih ROS-ova koji bi mogli zaštititi stanicu od

oksidacijskog stresa uzrokovanog s OTA.

Genotoksični, mutageni i kancerogeni učinci OTA su istraživani u pokusima in vivo i in vitro,

no dobiveni rezultati nisu jednoznačni (WHO/IPCS, 2001).

10

1.1.4.1 Citotoksičnost, mutagenost, genotoksičnost, kancerogenost i teratogenost

Citotoksičnost, genotoksičnost i mutagenost OTA istraživana je na stanicama fibroblasta

miša. Na tri vrste ovih staničnih linija koje su bile izložene okratoksinu A osam sati (10-200

µM) nije nađen citotoksični učinak. Iako je nastanak reaktivnih kisikovih spojeva (Reactive

oxygen species - ROS) u odnosu na kontrolnu skupinu bio značajno veći (Simarro Doorten i

sur., 2005). Ta je razlika bila još izraženija nakon 24 sata izloženosti. U homogenatu stanica

izloženih OTA došlo je do oštećenja DNA što je dokazano kometskim testom (povećanjem

duljine i smanjenjem repa kometa). Mehanizam citotoksičnosti OTA je i dalje nerazjašnjen,

no smatra se da je jedan od mehanizama povećanje proizvodnje ROS-ova.

Dokazano je da je OTA karcinogen za miševe i štakore te da su mužjaci štakora osjetljiviji od

ženki na djelovanje OTA. Nastanak tumora kod štakora induciran je malom dozom OTA (70

µg kg-1 tm) kojoj su životinje bile izložene dvije godine (Boorman, 1989; IARC, 1993). Postoje

nekoliko pretpostavki o mehanizmu nastanka karcinoma. OTA bi mogao biti kancerogen zbog

izravnog oštećenja DNA (genotoksičnost) ili neizravno poticanjem citotoksičnosti,

oksidacijskog oštećenja ili zbog poticanja diobe stanica kao posljedica oštećenja tkiva (Kamp i

sur., 2005). U prilog citotoksičnog mehanizma nastanka karcinoma su rezultati pokusa na

stanicama i laboratorijskim životinjama u kojima je dokazano da OTA uzrokuje povećanu

apoptozu stanica bubrega i tubulo-intersticijalnu nefropatiju (Krogh i sur., 1988; Kamp i sur.,

2005, Petrik et al., 2003, Domijan i sur., 2004b). Nakon tretmana s OTA pronađeni su adukti

OTA na DNA u bubregu, jetri i slezeni koji su bili ovisni o dozi i duljini tretiranja (Pfohl-

leszkowicz i sur., 1993).

Iako se dugo mislilo da nije genotoksičan, u novije je vrijeme genotoksičnost OTA dokazana

istraživanjima na kulturi ljudskih stanica. Utvrđeno je da OTA utječe na ekspresiju citokroma

P450s, popravak DNA, povećava izmjenu sestrinskih kromatida i jednolančanih lomova.

Utvrđena je i neplanirana sinteza DNA koja je znak aktivacije protoonkogena (Wang i

Groopman, 1999). U pokusu u kojem su PK15 stanice tretirane s OTA utvrđeno je povećanje

broja mikronukleusa (Šegvić Klarić i sur., 2008). Creppy i sur. (1985) su genotoksičnost OTA

istraživali in vitro na stanicama slezene i in vivo na miševima kojima su nakon pokusa

istraživali oštećenje DNA u slezeni, bubregu i jetri. U oba su pokusa utvrđeni jednolančani

lomovi DNA.

11

OTA iz organizma majke može prijeći placentalnu barijeru, nakupljati se u fetalnom tkivu i

uzrokovati oštećenja središnjeg živčanog sustava. Dokazano je teratogen kod miševa,

štakora, hrčaka, pilića i zečeva (Pfohl-Leszkowicz i Manderville, 2007).

1.1.5 Izloženost ljudi

Srednji je dnevni unos OTA u ljudi u Europi 1-2 ng kg-1 tm dok je dozvoljeni dnevni unos koju

je predložila Svjetska zdravstvena organizacija 16 ng kg-1 tm dnevno (WHO/FAO, 2001). Ljudi

su najviše izloženi ovom mikotoksinu konzumiranjem žitarica i proizvoda od žitarica, no OTA

se može unijeti u organizam i konzumiranjem kave, vina, piva, svinjetine i proizvoda od

svinjskog mesa i krvi te začinima.

Budući da je dokazano da je uzročnik svinjske nefropatije u Danskoj OTA, Krogh je

pretpostavio da bi isti mikotoksin mogao biti uzročnik EN-a (Krogh, 1972). Zbog toga su

provedena mnogobrojna istraživanja o izloženosti ljudi tom mikotoksinu.

1971. godine osnovan je tim stručnjaka iz Danske i Hrvatske koji su u okolici Slavonskog

Broda trebali proučiti etiologiju endemske nefropatije zbog pretpostavke da je ta bolest

uzrokovana mikotoksinima. Sakupljani su uzorci hrane iz tog područja tijekom pet godina te

je istraživana prisutnost OTA u hrani i to uglavnom žitaricama (kukuruz, pšenica, ječam i

pšenični kruh). Analizirano je ukupno 768 uzoraka, a okratoksin A je jedini dokazani

okratoksin. Udio kontaminiranih uzoraka bio je 0-42,9%, a zanimljivo je da je OTA izmjeren i

u 18,8% analiziranih uzoraka pšeničnog kruha (Pavlović i sur., 1979).

Okratoksin A je u ljudskoj krvi prvi dokazao Hult i sur. analizirajući spektrofluorimetrijskom

metodom uzorke krvi sakupljene u endemskim selima Brodske Posavine (Hult i sur., 1982.).

U tim su selima istom metodom Radić i sur. istraživali OTA u serumima ljudi sakupljanim

tijekom 10 godina (ukupno 6.909 uzoraka) (Radić i sur., 1997). Broj pozitivnih uzoraka (0,2-

4%) i koncentracija OTA (2-50 ng mL-1) razlikovala se ovisno o godini sakupljanja uzoraka i

odgovarala je klimataskim prilikama pojedine godine. Kasnije su provedena istraživanja

visokoućinskom tekućinskom kromatografijom (HPLC) širom svijeta i niske koncentracije OTA

nađene su u mnogim zemljama u kojima nema nefropatije. U Hrvatskoj je HPLC-om mjerena

koncentracija OTA u plazmi dobrovoljaca iz pet gradova (Osijek, Zagreb, Varaždin, Rijeka,

12

Split) tijekom sva četiri godišnja doba (Peraica i sur., 2001). Sakupljeno je približno 50

uzoraka u svakom gradu tijekom svakog godišnjeg doba, ukupno 983 uzorka. Najveća

koncentracija OTA u svim je regijama izmjerena u lipnju, a najmanja u prosincu dok je po

regijama najveća koncentracija OTA i najveći broj pozitivnih uzoraka nađen u Osijeku, a

najmanje u Rijeci. U Rijeci je također učestalost pozitivnih uzoraka bila najmanja.

Okratoksin A je izmjeren u majčinom mlijeku u Norveškoj, Italiji, Švedskoj, Slovačkoj i Brazilu

(Skaug i sur., 2001; Micco i sur., 1995; Thuvander i sur. 2001; Dostal i sur., 2008; Navas i sur.,

2005). Iako su koncentracije OTA niske, njegova bi prisutnost mogla negativno utjecati na

novorođenčad koja je posebno osjetljiva na toksine.

Dugotrajnim istraživanjima nije dokazano da OTA uzrokuje EN, no učestali nalaz tog

mikotoksina u krvi ljudi i u namirnicama iz endemskog kraja upućuju da bi taj nefrotoksični

mikotoksin mogao zajedno s drugim nefrotoksičnim mikotoksinima biti uzročnik EN-a. Drugi

nefrotoksični mikotoksini su citrinin, fumonizin B1 i penicilična kiselina.

1.1.5.1 OTA u hrani biljnog i životinjskog porijekla

1.1.5.1.1 Vino

Prvi su OTA u vinu našli Zimmerli i Dick 1995. godine analizirajući 18 uzoraka vina (dva bijela,

10 crnih i 6 rosè) (Zimmerli i Dick, 1995). Godinu dana kasnije analizirali su 24 bijela, 15 rosè,

79 crnih i 15 desertnih vina i sok od grožđa. Najviše koncentracije OTA nađene su u crnom, a

najniže u bijelom vinu. Visconti i sur. su istraživali OTA u komercijalnim i vinima

proizvedenim u obiteljskim vinarijama (38 crnih, 8 rosè, 9 bijelih i jedno desertno) te pronašli

da su sva vina proizvedena u obiteljskim vinarijama sadržavala OTA (Visconti i sur., 1999).

Najveći postotak pozitivnih uzoraka bio je u crnom vinu te su zaključili da crno i rosè vino više

pridonosi ukupnom unosu OTA u organizam, nego bijelo vino.

I u drugom je istraživanjima nađeno da bijelo vino obično sadrži manje OTA nego rosè i crno,

da koncentracija OTA ovisi o geografskom porijeklu grožđa i da su vina iz južnih regija više

kontaminirana OTA nego ona iz sjevernih (Ottender i Majerus, 2000; Pascale i Visconti,

2001).

13

Istraživanjem OTA u vinima u Hrvatskoj dobiveni su slični rezultati. U istraživanju koje je

provedeno 2004. godine sva istraživana crna vina sadržava su OTA za razliku od bijelih vina

(Domijan i Peraica, 2005b). U svim vinima proizvedenim u južnom dijelu Hrvatske pronađen

je OTA za razliku od vina proizvedenih u sjevernim regijama. U drugom istraživanju

određivana je koncentracija OTA u (crnom) moštu i vinu dobivenom iz toga mošta (Flajs i

sur., 2009). Nađeno je da je koncentracija OTA u moštu viša nego u vinu. U oba istraživanja je

nađeno da je koncentracija OTA u vinima iz Hrvatske niža od vina proizvedenih u svijetu.

1.1.5.1.2 Grah

Prvi su podaci o OTA u grahu u Hrvatskoj objavljeni 1989. godine kada su analizirana četiri

uzorka graha iz endemskog područja. U tom je istraživanju kontaminacija OTA bila označena

kao intenzitet kontaminacije koji je u sva četiri uzorka bio slab (Cvetnić i Pepeljnjak, 1989).

OTA u grahu pronađen je i u području zahvaćenom EN-om u ukupno pet uzoraka (Radić i

sur., 1997). Domijan i sur. su istraživali OTA u uzorcima graha sakupljenim u 13 županija u

Hrvatskoj koje su raspodijelili u četiri regije: sjevernu, istočnu, središnju i južnu (Domijan i

sur., 2005a). Od sakupljenih 45 uzoraka, u 17 je pronađen OTA i to najviše u sjevernoj regiji

dok u uzorcima iz južne regije OTA nije nađen. Koncentracija OTA u svim je uzorcima bila

niska.

Istražuju se, za sada na pokusnim životinjama, metode zaštite od djelovanja mikotoksina koje

se temelje na poznavanju mehanizma djelovanja mikotoksina. Tako su životinje koje su

dobivale OTA kao zaštitu od njegovog djelovanja dobivale fenilalanin, vitamin E, selen i

ekstrakt artičoke (Stoev i sur., 2000; Galvano i sur., 2001; Creppy i sur., 1995).

14

1.2 Citrinin

1.2.1 Kemijska svojstva

CTN je prema IUPAC-u (3R, 4S)-4,6-dihidro-8-hidroksi-3,4,5-trimetil-6-okso-3H-2-benzopiran-

7-karboksilna kiselina (slika 1-2 ). To je kristalinična tvar žute boje molekulske mase 250,25 s

maksimumom apsorpcije na 250 i 333 nm (UV). Netopljiv je u hladnoj vodi, a otapa se u

vodenoj otopini natrijevog hidroksida, natrijevog karbonata ili natrijevog acetata te u

metanolu, acetonitrilu, etanolu i većini ostalih polarnih organskih otapala (Xu i sur., 2006).

Slika 1-2 Kemijska struktura citrinina

1.2.2 Povijest

CTN je izoliran 1931. godine iz plijesni Penicillium citrininum, a 1941. godine otkrivena su

njegova antibiotska svojstva, no zbog nefrotoksičnog djelovanja nije korišten kao antibiotik

(Hetherington i Raistrick, 1931, Raistrick i Smith, 1941). Osim vrste P. citrininum, CTN

proizvode mnogobrojne vrste plijesni iz rodova Penicillium, Aspergillus i Monascus. CTN je

metabolit mnogih vrsta plijesni pa se pojavljuje zajedno s patulinom, oksalnom kiselinom i

OTA.

15

1.2.3 Pigmenti roda Monascus

U orijentalnoj kuhinji tradicionalno se kao bojila za hranu upotrebljavaju sekundarni

metaboliti plijesni iz roda Monascus. Riječ je o sekundarnim metabolitima vrsta M. pilosus,

M. purpureus, M. ruber i M. froridanus koji su stoljećima (Sabater-Vilar i sur., 1999)

upotrebljavani pri fermentiranju crnog vina, proizvodnji crvenog sira od soje, bojenju hrane,

konzerviranju mesa te kao poboljšivači okusa (EFSA, 2012). Proizvodnja pigmenata ovih

plijesni detaljno je proučena i patentirana u Tajvanu, Japanu, SAD-u i Francuskoj, a njihova je

primjena široko rasprostanjena po državama Azije i Europe iako je njihova primjena

dopuštena samo u Japanu te služe kao zamjena za uobičajene aditive (E-249, E-252, E-120)

koji se koriste za bojenje mesa (Sabaret Vilar i sur., 1999).

Donedavno su se ovi pigmenti koristili i kao dodaci prehrani zato što imaju sposobnost

snižavanja razine kolesterola u krvi i snižavanja krvnog tlaka kao i antioksidacijska svojstva

(EFSA, 2012). Važno otkriće dogodilo se 1995. godine kada su Blanc i sur. iz različitih vrsta

roda Monascus izolirali pigment monascidin A i otkrili da ima identičnu strukturu kao

mikotoksin citrinin otkriven davne 1931. godine kao metabolit različitih vrsta rodova

Aspergillus i Penicillium (Blanc i sur., 1995).

Iako se bojila za hranu dobivena iz plijesni roda Monascus koriste stoljećima, do sada nisu

zabilježeni štetni učinci. No, ipak bi trebalo izbjegavati kontaminaciju hrane CTN-om jer je

nefrotoksičan i mutagen nakon metaboličke aktivacije (Sabater-Vilar i sur., 1999).

1.2.4 Toksikokinetika

Istraživanja toksikokinetike CTN-a do sada nisu provedena (EFSA, 2012). Nekoliko sati nakon

intravenozne i oralne aplikacije (3-6 sati), CTN je pronađen u jetri i bubrezima (Reddy i sur.,

1982a). Apsorbirani se CTN eliminira iz organizma uglavnom putem bubrega jer je nađeno da

je 74% CTN-a izlučeno u urinu tijekom 24 sata. Manji se dio izlučuje fecesom. Nakon oralne

aplikacije, maksimalna koncentracija CTN-a u serumu je nađena nakon tri sata, a oko 20%

CTN-a je bilo vezano za albumin u serumu. Citrinin brzo nestaje iz plazme s maksimumom

eliminacije nakon 12 sati. 72 sata kasnije u serumu je bilo samo 0.9% od unesene doze.

16

Proces eliminacije CTN-a može se opisati modelom s dvije faze (brza faza i sporija faza ).

Vrijeme polovične eliminacije CTN-a u bržoj fazi je 1,95 sati, dok je to u sporijoj fazi 39,7 sati.

CTN vjerojatno prolazi proces enterohepatičke cirkulacije budući da je u ranoj fazi eliminacije

tek mala količina CTN-a pronađena u fecesu.

Nakon tretmana radioaktivno obilježenim CTN-om izmjerena je količina CTN-a u pojedinim

organima: jetra (9,5%), probavni sustav-želudac, tanko i debelo crijevo (6,8%, od kojih je

najveći udio pronađen u tankom crijevu), bubreg (3,5%), maternica (0,4%), fetusi (0,26%). U

svim je organima maksimalna koncentracija bila 30-60 minuta nakon tretmana. Nakon 72

sata tretmana koncentracije CTN-a u organima bile su skoro nemjerljive (Reddy, 1982b). CTN

prolazi kroz placentu i u malim se koncentracijama može naći u fetusima što je u skladu s

njegovim fetotoksičnim učinkom.

Miševi soja CD-1 tretirani su ip CTN-om (0,12, 0,6 i 3 mg kg-1 tm) svakodnevno tijekom dva

do četiri tjedna. Nakon dvotjednog tretmana CTN-om dozom od 3 mg kg-1 tm primijećeno je

povećanje bubrega (Reddy i sur., 1988b).

Metaboliti CTN-a (osim dihidrocitrinona) nisu opisani. Od ukupne primijenjene doze CTN-a

na gravidnim štakoricama, oko 15% se metabolizira u dihidrocitrinon, dok se oko 43%

citrinina izluči u nepromijenjenom obliku. Nisu nađeni drugi metaboliti CTN-a (Sabater-Vilar i

sur., 1999; Frank, 1992).

1.2.5 Toksični učinci

1.2.5.1 Nefrotoksičnost

Kod odraslih štakora za nefrotoksičnost je vjerojatno odgovorna osnovna nemetabolizirana

molekula CTN-a (Berndt i Hayes, 1982). Nađeno je, naime, da se u pokusu u kojem su

životinje tretirane probenicidom koji blokira organski anionski transport CTN-a u kori

bubrega smanjuje mortalitet pokusnih životinja i poboljšava bubrežna funkcija (mjerena kao

bubrežni transport).

17

1.2.5.2 Imunološka reakcija

Nakon dvotjednog tretmana miševa CTN-om (3 mg kg-1 tm) ip primijećeno je smanjenje broja

perifernih leukocita i povećanje broja limfocitnih blasta u slezeni što ukazuje da CTN ne

smanjuje sintezu DNA (Reddy i sur., 1988b). Pri tim dozama CTN stimulira humoralnu

imunost miševa.

1.2.5.3 Genotoksičnost, citotoksičnost i mutagenost

Rezultati istraživanja genotoksičnosti i mutagenosti CTN-a nisu jednoznačni. Genotoksičnost

CTN-a istraživana je na bakterijama i stanicama sisavaca in vitro i na miševima in vivo. CTN

nije bio genotoksičan za sojeve vrste Salmonella typhimurium (Wehner i sur., 1978; Sabater-

Vilar i sur., 1999; Knasmüller i sur., 2004). Kod vrste Escherichia coli CTN je uzrokovao

jednolančane lomove kromosomske DNA (Martin i sur., 1986). Oštećenje DNA otkriveno je

korištenjem kometskog testa u pokusu na Vero stanicama koje su bile izložene CTN-u 24

sata, dok istim testom nije otkrivena genotoksičnost na jetrenim stanicama (HEPG2) i

bubrežnim stanicama ljudskog embrija (HEK232) (Bouslimi i sur., 2008; Knasmüller i sur.,

2004; Liu i sur., 2003).

Genotoksičnost CTN-a potvrđena je na PK15 stanicama u kojima se nakon izloženosti CTN-u

povećao broj mikronukleusa (Šegvić Klarić i sur., 2012). Isti učinak nakon tretmana CTN-om

primijećen je i na HEPG2 stanicama, humanim limfocitima i V79 stanicama hrčka (Knasmüller

i sur., 2004; Dömnez-Altuntas i sur., 2007; Pfeiffer i sur., 1998).

Pfohl-Leszkowicz i sur. našli su DNA adukte u stanicama ljudskog bubrega (HK2) koje su bile

izložene CTN-u, a isti su adukti primijećeni i u tumorskom tkivu bubrega (Pfohl-Leszkowicz i

sur., 2007).

Genotoksičnost CTN-a istraživana je in vivo na vrlo mladim miševima na čijim su stanicama

koštane srži primijećene kromosomske abnormalnosti (hipoploidija, sljepljivanje i stvaranje

nakupina kromosoma) nakon što su miševi osam tjedana tretirani CTN-om dozama 5-20 mg

kg-1 (Jeswal 1996).

18

1.2.5.4 Teratogenost

Teratogenost CTN-a ispitivana je na gravidnim štakoricama tretiranim subkutano

jednokratnom dozom (35 mg kg-1 tm) i žrtvovanim dvadesetog dana skotnosti (Reddy i sur.,

1982b). Taj je treman uzrokovao 50% smrtnosti u štakorica koje su CTN dobile u pojedine

dane gravidnosti iako je subkutani LD50 za odrasle štakorice daleko viši (67 mg kg-1 tm).

Tretman CTN-om nije utjecao na broj fetusa, no fetusi štakorice tretiranih CTN-om bili su

manji nego u kontrolnoj skupini. Nisu zabilježene značajne malformacije kostura, no

primjećeni su povećani bubrezi, hidrocefalus i rascjep nepca. Tretman CTN-om tijekom

razdoblja nastanka organa uzrokovao je smanjenje broja živih i povećanje broja resorbiranih

fetusa, a vrste malformacije ovisile su o danu gestacije kada su životinje tretirane. U tkivima

fetusa nisu nađeni metaboliti CTN-a što upućuje na izravan učinak CTN-a (a ne metabolita)

na fetus, poglavito na bubrege (Reddy i sur., 1982a).

1.2.5.5 Kancerogenost

Kancerogena svojstva CTN-a ispitivana su u malobrojnim istraživanjima. Istraživanje na

štakorima koji su tijekom 80 tjedana dobivali CTN u hrani ukazala su na njegovu

tumorogenost zbog pojave adenoma bubrega (Arai i Hibino, 1983). U tom razdoblju nije

zabilježena pojava karcinoma.

Kancerogenost nije primijećena niti nakon pokusa na vrsti Oryzias latipes (medaka - japanska

ukrasna ribica) koja je tretirana CTN-om 24 tjedna (Hatanaka i sur., 1982).

Na temelju provedenih ustraživanja IARC je svrstao CTN u skupinu 3 – nema karcinogeni

učinak na ljude (IARC , 1986).

1.2.6 Izloženost ljudi

Radna skupina EFSA-e donijela je 2012. znanstveno mišljenje o prisutnosti CTN-a u hrani i

procjenu rizika izloženosti CTN-u na ljudsko zdravlje (EFSA, 2012). Jedno od malobrojnih

19

istraživanja u kojima se spominje izloženost ljudi CTN-u putem hrane provedeno je u

područjima u kojima se javlja EN. Istraživana je prehrana 15 obitelji, a CTN je pronađen u tri

obitelji što nije dovoljno da se zaključi kolika je izloženost ljudi CTN-u (Pfohl-Leszkowicz i sur.,

2007). Iako je CTN pronađen u žitaricama, voću i aromatičnim travama, nema podrobnijih

istraživanja o njegovom utjecaju na ljudsko zdravlje.

1.2.6.1 CTN u hrani

U usporedbi s OTA postoji jako malo istraživanja o pojavi CTN-a u hrani. Među prvima je

istraživanje provedeno u Kanadi. U tom je istraživanju određena koncentracija CTN-a u

pšenici, zobi, ječmu i raži. CTN je otkriven u 13 od 29 uzoraka, a u svim uzorcima koji su bili

kontaminirani s CTN-om, nađen je i OTA (Scott i sur., 1972).

Veći dio istraživanja kontaminiranosti žitarica CTN-om u Europi proveden je u jugoistočnoj

Europi, u područjima u kojima se pojavljuje EN. Petkova-Bocharova i sur. našli su da je

učestalost nalaza i koncentracija CTN-a u kukuruzu i grahu veća u endemskom kraju od

uzoraka iz krajeva u kojem nema te bolesti (Petkova-Bocharova i sur., 1991).

U Aziji je CTN istraživan u riži, kukuruzu i šećernoj trski, no pronađen je samo u uzorcima riže

i to onima koji su sakupljani tijekom kišnih razdoblja (Reddy i sur., 1983; Nguyen i sur., 2007).

U riži je CTN otkriven i u Africi, ali i u i ječmu i kukuruzu, dok u uzorcima pšenice nije nađen

(El-Sayed, 1996; Abd-Allah i Ezzat, 2005).

Osim u žitaricama, CTN je nađen i u jabukama. Pepeljnjak i sur. su otkrili CTN u 19% uzoraka

jabuka skupljenih u Hrvatskoj (Pepeljnjak i sur., 2002). Osim ovog nalaza, CTN je u jabukama

nađen i u jabukama iz Portugala i Njemačke (Martinis i sur., 2002; Dietrich i sur., 2001).

CTN je nađen i u začinima iz Indije i ljekovitom bilju u Španjolskoj u kojem je zajedno s CTN-

om nađen i OTA, aflatoksin B1, zearalenon, T-2 toksin i deoksinivalenol (Kumari i Nusrath,

1987; Saxena i Mehrotra, 1989; Santos i sur, 2009). Iako su koncentracije CTN-a male, one

mogu pridonijeti ukupnom unosu CTN-a u organizam.

20

1.2.6.2 Razgradnja CTN-a tijekom prerade hrane

Jako je malo dostupnih podataka o sudbini CTN-a tijekom pripreme hrane (EFSA, 2012). Kao i

u svim ostalim istraživanjima o CTN-u, rezultati o razgradnji CTN-a nisu jednoznačni.

Većina se istraživača slaže da se CTN razgrađuje na temperaturi višoj od 175 ᵒC bez prisustva

vlage, dok Lee (2007) nije primijetio razgradnju CTN-a na toj temperaturi (Kitabatake i sur.,

1991; Betina 1989; Lee, 2007). Iako se koncentracija CTN-a nije smanjila fermentacijom

kukuruza, kuhanje fermentiranog kukuruza ipak razgrađuje CTN (Kpodo i sur., 1996). Krogh

je još 1974. godine primijetio da se CTN koji je dodan u slad brže razgrađuje od OTA tijekom

prerade piva i ne nalazi se u značajnim količinama u sladnoj kaši. Očito je da razgradnja CTN-

a u hrani ovisi o temperaturi i sadržaju vlage (Krogh, 1974).

1.3 Zajedničko djelovanje OTA i CTN i vrste koje proizvode oba mikotoksina

Jedna od vrsta plijesni koje proizvode CTN je i Penicillium verrucosum koju možemo naći na

žitaricama poput pšenice i ječma. Kako je ta vrsta poznata kao značajan proizvođač OTA, nije

neobično da se ova dva mikotoskina često mogu naći zajedno iako je učestalost nalaza CTN-a

mnogo manja (Bragulat i sur. 2008). Dokazano je da OTA ima nefrotoksično, karcinogeno,

genotoksično, teratogeno i imunotoksično djelovanje, dok je CTN dokazano nefrotoksičan, a

rezultati istraživanja njegove genotoksičnosti i mutagenosti su oprečna. Budući da se ta dva

mikotoksina često pojavljuju zajedno, važno je istražiti kakav je zajednički toksični učinak ta

dva mikotoksina.

1.3.1 Zajedničko pojavljivanje okratoksina A i citrinina u hrani

Istovremena kontaminacija žita s OTA i CTN zabilježena je još 1972. godine u pokrajinama

Alberta i Ontario u Kanadi. Većina tada analiziranih uzoraka sadržavala je OTA (18 od 32

pregledana uzorka), a CTN je pronađen u 13 od tih 18 uzoraka u kojima je nađen OTA.

21

Pronađene su i plijesni koje proizvode oba mikotoksina i to u ukupno 22 uzorka, a to znači da

u nekim uzorcima plijesni nisu proizvele mikotoksine (Scott i sur., 1972). Bragulat i sur. su

istraživali učestalost zajedničkog pojavljivanja ovih mikotoksina, njihovu prisutnost u

žitaricama i životinjskoj hrani te vrste plijesni iz roda Penicillium koje ih proizvode (Bragulat i

sur., 2008). Analizirali su 178 uzoraka žitarica i komercijalne hrane za životinje iz kojih su

izolirane plijesni roda Penicillium koje su uključene u daljnju studiju. U izolatima je otkriveno

da se u 11 uzoraka nalazi plijesan P. verrucosum koja je proizvodila OTA, dok je CTN

pronađen u 14 uzoraka (proizvodile su ga plijesni P. verrucosum i P. citrininum). Iako je broj

uzoraka u kojima su pronađena oba mikotoksina bio mali, potvrđena je mogućnost

kontaminacije žita s OTA i CTN-om u slučaju neprimjerenog skladištenja žita.

Istovremena kontaminacija žitarica s OTA i CTN-om istraživana je i na riži u Vijetnamu. Od

ukupno 100 uzoraka riže, OTA je pronađen u 35, a CTN u 13 uzoraka. Osim ova dva

mikotoksina, u ovim je uzorcima pronađen i aflatoksin B1 (u 51 uzorku). Uzorci su uzimani

tijekom dvije sezone (sušne i kišne) i primijećeno je da je tijekom kišne sezone kontaminacija

mikotoksinima češća. Budući da je u Aziji riža važna namirnica (a i izvozi se u ostale dijelove

svijeta), a koncentracija mikotoksina u nekim je uzorcima bila iznad dozvoljene granice,

konzumacija takve riže znantno pridonosi ukupnom unosu tih mikotoksina (Nguyen i sur.,

2007). Zajednički nalaz OTA i CTN-a u žitaricama (kukuruz, ječam i riža) pronađen je i u Egiptu

(Abd Alla, 1996).

Zajedničko pojavljivanje OTA i CTN-a zabilježeno je i u Bugarskoj u uzorcima pšenice, zobi i

pšeničnim mekinjama u području zahvaćenom EN-om (22% analiziranih uzoraka) i

kontrolnom području u 14% analiziranih uzoraka (Vrabceva i sur., 2000).

Zbog čestog istovremenog nalaza OTA i CTN-a u žitaricama i pretpostavke da su ljudi i

životinje istovremeno izloženi tim toksinima, provedeni su mnogi pokusi o zajedničkom

utjecaju tih mikotoksina in vitro i in vivo. OTA i CTN su nefrotoksični mikotoksini te

istraživanja o njihovom zajedničkom djelovanju uglavnom pokazuju sinergistički učinak

povezan s nefrotoksičnošću (Speijers i Speijers, 2004).

22

1.3.1.1 Zajedničko djelovanje OTA i CTN-a in vitro

Citotoksični i genotoksični učinak OTA, CTN-a i zajedničkog djelovanja ova dva mikotoksina

istraživan je na nekoliko vrsta stanica. Creppy i sur. su još 1980. godine istraživali zajednički

učinak OTA i CTN-a na kulturi stanica hepatoma (Creppy i sur., 1980). Nakon pojedinačnog i

zajedničkog tretmana s OTA i CTN-om, zaključili su da je inhibicija sinteze RNA i proteina

učinkovitija nakon tretmana s oba mikotoksina nego nakon zasebnog tretmana. Na kulturi

stanica ljudskih bubrega koje su bile istovremeno izložene različitim koncentracijama OTA i

CTN-a mjerena je aktivnost kaspaze-3, ključnog proteina u nastanku apoptoze (Schwerdt i

sur., 1999). Taj je protein odgovoran za kaskadnu aktivaciju drugih proteina koji uzrokuju

nastanak fragmentacije DNA i kondenziranje kromatina. Poznato je da niska koncentracija

OTA aktivira kaspazu-3 u ovim stanicama, no istovremeni tretman kulture stanica ljudskih

bubrega s OTA i CTN-om dalo je nekoliko različitih učinaka. Najmanje upotrijebljene

koncentracije CTN-a (0,25 i 1 µmol L-1) u kombinaciji s OTA (25 i 50 nmol L-1) nisu utjecale na

aktivnost kaspaze-3, više koncentracije (2,5 i 5 µmol L-1) su u kombinaciji s OTA djelovale

antagonistički, dok su najviše koncentracije (7,5 i 15 µmol L-1) imale aditivni učinak na

aktivnost kaspaze-3 (Knecht i sur., 2005).

U pokusu na Vero stanicama (epitelne stanice bubrega afričkog zelenog majmuna) istraživan

je zajednički citotoksični učinak OTA i CTN-a i uspoređen s citotoksičnošću pojedinog

mikotoksina (Bouslimi i sur., 2008). Nakon tretmana pojedinim mikotoksinima primijećeno je

da je citotoksični učinak (MTT test) CTN-a mnogo manji nego učinak OTA, dok je nakon

tretmana s oba mikotoksina citotoksični učinak bio sinergistički. Fragmentacija DNA nađena

je nakon tretmana vrlo niskom koncentracijom oba mikotoksina za razliku od tretmana

pojedinačnim mikotoksinom gdje je primijećena samo kod visoke koncentracije CTN-a.

Citotoksični, genotoksični i apoptotski zajednički učinak OTA i CTN-a primijećen je i u pokusu

na PK15 stanicama koje su tretirane ovim mikotoksinima pojedinačno i s oba mikotoksina

istovremeno (Šegvić Klarić i sur., 2012). Primijećen je aditivan citotoksični učinak kao rezultat

zajedničkog djelovanja mikotoksina (MTT test). Iako nije povećan broj mikronukleusa, učinak

na povećanje stanica u apoptozi bio je sinergističan, broj nukleoplazmatskih mostova kao i

broj nuklearnih pupoljaka bio je značajno veći dok je preživljavanje stanica bilo sinergistički

smanjeno. Zajednički učinak više mikotoksina istraživan je i na bubrežnim stanicama svinje

23

(LLC-PK1) MTT testom (Heussner i sur., 2006). U pokusu u kojem su korišteni mikotoksini

OTA, okratoksin B, patulin i CTN primijećeno je da su najčešće interakcije CTN-a s drugim

mikotoksinima. Nakon zajedničkog tretmana stanica s OTA i CTN-om nađeno je da je toksični

učinak OTA i CTN-a veći od pretpostavljenog pa je zaključeno da ta dva mikotoksina imaju

sinergistično djelovanje. Istraživanje zajedničke toksičnosti proveli su i Pfohl-Leskowicz i sur.

na nekoliko vrsta plućnih i bubrežnih kultura ljudskih stanica te in vivo na štakorima (Pfohl-

Leskowicz i sur., 2008). Preživljavanje stanica nakon zajedničkog tretmana s OTA i CTN-om

ovisilo je o omjeru ova dva mikotoksina. Ako je koncentracija CTN-a bila niža od

koncentracije OTA, učinak na preživljavanje stanica bio je antagonistički, dok je singergistički

učinak primijećen ako je koncentracija CTN-a bila ista ili viša od koncentracije OTA. Osim

toga, primjećena je češća pojava OTA-DNA adukata nakon tretmana s oba mikotoksina u

odnosu na tretman samo sa OTA.

Embriotoksičnost je istraživana na pilećim embrijima koji su istovremeno tretirani s OTA i

CTN-om. Primijećen je aditivni učinak s obzirom na smrtnost i oštećenje organa (Vesela i sur.,

1983).

Za razliku od većine rezultata istraživanja mutagenosti OTA i CTN-a te njihovog zajedničkog

djelovanja, Würgler i sur. nisu utvrdili mutageno djelovanje tih mikotoksina korištenjem

bakterija Salmonella typhimurium TA102 (Würgler i sur., 1991). Razlog negativnom rezultatu

ovog testa je vjerojatno antibiotsko djelovanje CTN-a. U tom je pokusu pozitivna kontrola bio

H2O2 koji je imao mutageno djelovanje. Pojačani citotoksični učinak ovih mikotoksina nakon

zajedničkog tretmana nije primijećen niti na epitelnim stanicama mokraćnog mjehura svinje

(Föllmann i sur., 2000).

1.3.1.2 Zajedničko djelovanje okratoksina A i citrinina in vivo

Genotoksično djelovanje OTA i CTN-a istraživano je na stanicama koštane srži (BALB/C)

miševa koji su tretirani intraperitonealno (Bouslimi i sur., 2008). Iz rezultata ovih istraživanja

vidljivo je da OTA i CTN uzrokuju kromosomske aberacije ovisno o dozi, no isto tako da je

njihov zajednički učinak aditivan ili čak sinergistički u odnosu na tretman pojedinačnim

mikotoksinom.

24

Kako bi se istražilo moguće prenatalno djelovanje OTA i CTN-a, skotne su štakorice

subkutano tretirane tim mikotoksinima, pojedinačno i zajedno. Štakorice su žrtvovane

dvadesetog dana gravidnosti, a fetusi su pregledani kako bi se otkrila moguća oštećenja.

Fetusi štakorica koje su tretirane s oba mikotoksina imali su značajno više malformacija u

odnosu na kontrolnu skupinu, dok su tek neznatne malformacije primijećene kod fetusa koji

su bili izloženi pojedinačnom mikotoksinu. Promjene su bile najizraženije na unutrašnjim

organima, kosturu i glavi, a ovisile su o danu tretmana tijekom gravidnosti (Mayura i sur.,

1984).

Kancerogeno djelovanje OTA i CTN-a istraživano je u pokusu na miševima koji su tijekom 70

tjedana bili izloženi tim mikotoksinima (Kanisawa, 1984). Tumori bubrežnih stanica pojavili

su se nakon tretmana s OTA (25 mg kg-1 hrane) te nakon tretmana s OTA i CTN-om (25 i 200

mg kg-1 hrane). U pokusima u kojima su miševi bili tretirani samo s CTN-om ili naizmjence s

OTA i CTN-om, pojava tumora je izostala. Isto tako nije bilo pojave tumora na jetri što

upućuje na izraženu nefrotoksičnost oba mikotoksina.

Glahn i sur. su istraživali bubrežne funkcije pilića starih 12 tjedana te pokušali odrediti

mijenja li se diuretski učinak CTN-a u akutnoj okratoksikozi (Glahn i sur., 1987). Pilići su dva

dana intramuskularno tretirani s OTA, a treći su dan životinje anestezirane te su

intravenozno tretirane s CTN-om. Nije otkriven aditivan diuretički učinak tijekom prvih 48

sati.

Speijers i Speijers su u preglednom članku (2004) saželi istraživanja toksičnog zajedničkog

učinka OTA i CTN-a. U najvećem broju istraživanja in vitro i in vivo primijećen je sinergistički

učinak tih mikotoksina.

1.4 Oksidacijski stres

1.4.1 Malondialdehid

Peroksidacija lipida je složen proces koji se odvija u životinjama i biljkama. Uključuje

stvaranje i poticanje daljnjeg nastanka lipidnih radikala, preraspodjelu dvostrukih veza u

nezasićenim mastima i moguće razaranje membranskih lipida pri čemu nastaju različiti

25

produkti kao što su alkoholi, ketoni, aldehidi i eteri. Membrane su bogate nezasićenim

masnim kiselinama i okružene staničnom tekućinom bogatom kisikom i metalima pa su zato

podložne peroksidaciji.

Peroksidacija lipida obično započinje otpuštanjem vodika nezasićene masne kiseline zbog

čega nastaje lipidni radikal. Preraspodjela dvostrukih veza rezultira stvaranjem konjugiranih

diena. Napad molekulskog kisika stvara lipid peroksi radikal koji će ili izdvojiti atom vodika iz

susjedne molekule lipida stvarajući lipidni hidroperoksid ili će nastati lipidni endoperoksid.

Stvaranje lipidnog endoperoksida koji sadrži barem tri isprekidane metilenske dvostruke

veze može dovesti do stvaranja malondialdehida (MDA) kao produkta oštećenja (Buege i

Aust, 1977).

1.4.2 Glutation

Glutation (L--glutamil-L-cisteinil-glicine) je tiol male molekulske mase kojeg nalazimo u

biljakama i životinjama (Meister i Anderson, 1984). Jedna od njegovih najvažnijih funkcija

unutar stanica je detoksikacija slobodnih radikala i peroksida (Kleinman i Richie, 2000).

Unutar stanice sudjeluje u sustavu signaliziranja (reverzibilno se veže na –SH skupinu unutar

proteina što može aktivirati i inaktivirati sam protein), modulira staničnu diobu (povećana

koncentracija GSH u stanici je povezana s pojačanom diobom stanica) i apoptozu (njegova

koncentracija u stanici je snižena tijekom apoptoze) (Lu, 2012).

Sintetizira se iz aminokiselina L-glutamata, L-cisteina i glicina, a reakcije kataliziraju enzimi -

glutamilcistein sintetaza i GSH sintetaza (Griffith, 1999).

L-glutamat + L-cistein + MgATP L--glutamil-L-cistein + MgADP + Pi

L--glutamil-L-cistein + glicin + MgATP glutation + MgADP + Pi

U stanicama je glutation u reduciranom obliku kao tiol (GSH) i kao reducirani disulfid (GSSG),

no GSH je dominantan oblik te ga ima >98% od ukupnog glutationa. U eukariotskim

stanicama GSH se nalazi u citoplazmi (80-85%), mitohondrijima (10-15%) i endoplazmatskom

retikulumu (Sies, 1999).

26

GSH može biti transportiran kroz biološke membrane pa zato može sudjelovati u vrlo

složenom sustavu transporta među organima. Sintetizira se većinom u jetri iz koje se

transportira u krvotok kako bi se opskrbila druga tkiva. Isto vrijedi i za GSSG koji prolazi

membrane jetrenih kanalića i izlučuje se jetrom.

1.4.3 Superoksid dismutaza

Superoksid dismutaza (SOD; E.C. 1.15.1.1.) je enzim koji katalizira reakciju razgradnje

superoksida (O2-) u kisik i vodikov peroksid te tako štiti stanicu od toksičnih produkata

aerobnog disanja. Superkosid se proizvodi tijekom mnogih procesa u organizmu kao što su

aerobni metabolizam, oksidativna fosforilacija i fotosinteza, a njegova reakcija s SOD-om

prikazana je rekacijama na slici. Budući da SOD ima ključnu funkciju kontrole razine ROS-ova

u organizmu, SOD bi mogao koristitit u terapiji bolesti povezanih s oksidacijskim stresom

(Perry i sur., 2010; Liochev i Fridovich, 2010).

(n+1)+ •- n+

2 2M -SOD+O M -SOD+O

n+ •- (n+1)+

2 2 2M -SOD + O M -SOD + H O

Slika 1-3 Reakcija enzima superoksid dismutaze i superoksida

1.4.4 Katalaza

Katalaze (CAT; 1.11.1.6) su skupina citoplazmatskih enzima koji kataliziraju raspad vodikovog

peroksida na kisik i vodu. U toj skupini nalaze se enzimi koji sadrže Fe vezano uz hem i Mn

enzimi (zvani katalaze-peroksidaze). Sastoje se od četiri polipeptidna lanca od kojih svaki ima

od više od 500 aminokiselina (Nicholls, 2012). Svaki je lanac vezan uz hem koji omogućuje da

enzim reagira s vodikovim peroksidom.

27

1.4.5 Glutation peroksidaza

Glutation peroksidaze (GPx; 1.11.1.9) su skupina filogenetski srodnih enzima. Evolucijski su

glutation peroksidaze svrstane u tri skupine: GPx1/GPx2, GPx3/GPx5/GPx6 i

GPx4/GPx7/GPx8. Glutation peroksidaze 1-4 javljaju se u svih sisavaca i po kemijskom su

sastavu selenoproteini sa selenocisteinom u katalitičkom središtu. Poznato je da kataliziraju

redukciju vodikovog peroksida ili organskih peroksida do vode ili pripadajućih alkohola

koristeći glutation kao reducens. Ovi enzimi imaju antioksidacijsku funkciju u različitim

dijelovima stanice (Brigelius-Flohe i Maiorino, 2012).

1.5 Antioksidansi

Antioksidansi su skupina spojeva koji organizam štite od štetnog djelovanja slobodnih

radikala. Osim što ih organizam sam proizvodi, unosimo ih i hranom kao proizvode

sekundarnog metabolizma biljaka (Robards i sur., 1999). Po kemijskom su sastavu polifenoli,

odnosno organske molekule koje se sastoje od jednog ili više aromatskih prstenova na koje

je vezana jedna ili više hidroksilnih skupina. Oni čine jednu od najbrojnijih i široko

rasprostranjenih skupina spojeva u biljkama, kojoj pripada više od 8.000 različitih spojeva.

Ovisno o kemijskoj strukturi polifenoli se dijele na: jednostavne fenole i benzokinone (C5),

fenolne kiseline (C6-C1), acetofenone i feniloctene kiseline (C6-C2), hidroksicimetne kiseline,

kumarine, izokumarine i kromone (C6-C3), naftokineone (C6-C4), ksantone (C6-C1-C6),

stilbene (u koje spada resveratrol) i antrakinone (C6-C2-C6), flavonoide (C6-C3-C6), lignane i

neolignane (C6-C3)2, biflavonoide (C6-C3-C6)2, lignine (C6-C3)n, kateholne melanine (C6)n i

kondenzirane tanine (C6-C3-C6)n. Flavonoidi čine najveću skupinu polifenola (broj novo

otkrivenih polifenola stalno se povećava), a u prirodi se često nalaze u obliku glikozida, tj.

povezani su s molekulama šećera što pridonosi velikoj raznolikosti i velikom broju tih

spojeva. Vezanje šećera na flavonoide povećava polarnost molekule što je potrebno za

pohranjivanje tih spojeva u vakuolama biljnih stanica. Najpoznatiji antioksidansi su

askorbinska kiselina (vitamin C), tokoferoli (vitamin E), beta-karoten i resveratrol.

28

1.5.1 Resveratrol

Iako je resveratrol (RSV) dugo poznat, interes za njegovo djelovanje na organizam se

povećao devedesetih godina prošloga stoljeća kada je pronađen u crnom vinu te je

pretpostavljeno da ima ulogu u „francuskom paradoksu“ (Siemann i Creasy, 1992). Naime,

Francuzi su poznati po konzumaciji hrane bogate zasićenim masnim kiselinama, ali i po

konzumaciji vina. Usprkost konzumiranju hrane bogate zasićenim masnim kiselinama,

postotak smrtnosti od kardiovaskularnih bolesti je među najnižima u svijetu. Pretpostavljeno

je da bi RSV, odnosno umjerena konzumacija crnog vina mogla biti odgovorna za taj

fenomen (Constant, 1997).

RSV (3,4',5-trihidroksistilben) je pripadnik porodice stilbena među fenolnim spojevima.

Pronađen je u mnogim biljkama, a uglavnom u vinovoj lozi. Sintetizira se iz fenilalanina u

tkivu lišća vinove loze kao odgovor na gljivičnu infekciju (fitoaleksin). Osim u grožđu,

možemo ga naći i u kikirikiju, pistacijama, bobičastom voću i tamnoj čokoladi. U grožđu se

nalazi u sjemenkama i koži te ga zbog procesa proizvodnje vina ima više u crnom nego u rozè

i bijelom vinu. Njegova biosinteza ovisi o mnogobrojnim čimbenicima kao što su vrsta

grožđa, geografsko područje, klima, uvjeti biljnog stresa (biotički ili abiotički), agronomski

čimbenici i enološka praksa (Fernandez-Mar i sur., 2012; Olas i Holmsen, 2012).

Biosinteza RSV-a odvija se putem šikiminske kiseline iz fenilalanina. Najvažniji enzimi u ovom

procesu su fenilalanin amonij-ligaza, koenzim A ligaza i stilben sintetaza. Stres može

potaknuti sintezu tih enzima (Fernandez-Mar i sur., 2012). Stilben sintetaza je enzim koji nije

eksprimiran u uvjetima kada nema stresa, no u uvjetima stresa ovaj enzim je otkriven šest

sati nakon pojave stresa, a svoj maksimun doseže nakon 30 sati (Soleas i sur., 1997).

U plazmi je najviše RSV-a izmjereno jedan sat nakon oralnog tretmana te ponovo nakon šest

sati vjerojatno zbog enterohepatičke cirkulacije konjugiranih metabolita. RSV se izlučuje

urinom, ali i fecesom što upućuje na enterohepatičku cirkulaciju ako je aplikacija bila iv

(Cottart i sur., 2010). Glavni metabolit je resveratrol-3-O-sulfat.

29

1.5.1.1 Kemijska svojstva resveratrola

Na sobnoj temperaturi RSV je krutina prljavo bijele boje molekulske mase 228,25 g mol-1 i

temperature tališta pri 253 ᵒC. Slabo je topljiv u vodi, no topljiv je u mastima i etanolu. U

prirodi je uglavnom prisutan u stabilnijem trans- obliku dok pod utjecajem UV zračenja

prelazi u cis- oblik.

Slika 1-4 Kemijska struktura resveratrola

Antioksidacijska svojstva RSV-a povezana su s hidroksiklnom skupinom (OH-) koja “hvata”

slobodne radikale proizvedene u živom organizmu (Queiroz i sur., 2009).

1.5.1.2 Mehanizam djelovanja

Budući da se RSV veže za albumine, pretpostavlja se da bi albumini mogli biti prirodno

spremište polifenola in vivo. U organizmu se brzo metabolizira te do tkiva dolaze njegovi

metaboliti, no ljudski enzimi te metabolite mogu lako ponovo pretvoriti u RSV (Rotches-

Ribalta i sur., 2012). Najviša koncentracija metabolita RSV-a u plazmi izmjerena je nakon 2-

2,5 sati nakon konzumiranja crnog vina. Nakon osam sati primijećeno je drugo povećanje

koncentracije zbog čega se pretpostavlja da RSV prolazi enterohepatičku cirkulaciju. Većina

metabolita RSV-a u urinu je pronađena 4-8 sati nakon konzumiranja crnog vina (Rotches-

Ribalta i sur., 2012).

30

Mnogobrojna istraživanja potvrdila su korisno djelovanje RSV-a na organizam. Ima

protuupalno i antitumorsko djelovanje, štiti od bolesti srca i krvnih žila, djeluje kao regulator

za sve tri faze malignih promjena – nastanak, promociju i širenje. Poznato je i njegovo

povoljno djelovanje na zdravlje u kombinaciji s nekim drugim antioksidansima. U kombinaciji

s kvercetinom i elagičnom kiselinom sinergistički potiče apoptozu leukemijskih stanica

(Mertens-Talcott i Percival, 2005), dok u kombinaciji s vitaminom E sprječava lipidnu

peroksidaciju (Fang i sur., 2002). Muški štakori tretirani su oralno tijekom 28 dana 1000 puta

većom dozom (20 mg kg-1) od one koju čovjek unosi u organizam, no nisu primijećeni nikakvi

štetni učinci (Juan i sur., 2002).

Gehm i sur. pretpostavili su da RSV štiti srce i krvne žile zbog svoje estrogenske aktivnosti

(Gehm i sur., 1997). Ovu hipotezu su provjerili Slater i sur. pokusom na ovariektomiziranim

štakoricama koje su dobivale RSV (Slater i sur., 1999). Njima su mjerili težinu uterusa, HDL

kolesterol u plazmi i mineralnu gustoću kostiju. Budući da se niti jedan od mjerenih

parametara nije promijenio u odnosu na pozitivnu kontrolu, zaključili su da za zaštitini učinak

RSV-a na srce i krvne žile nije odgovorna estrogenska aktivnost.

1.5.1.3 Antioksidacijsko djelovanje

RSV povećava antioksidacijski kapacitet plazme i smanjuje lipidnu peroksidaciju. Istraživanja

su provedena na štakorima, svinjama i ljudima, no je li mehanizam njegovog djelovanja

izravan ili neizravan, još nije poznato (Wenzel i sur., 2005; Baur i sur., 2006).

1.5.1.4 Kardioprotektivno djelovanje

Postoji nekoliko mehanizama kojima RSV štiti srce i krvne žile od aterosklerotskih promjena.

Najvažniji je inhibicija apoptoze, a na taj način i zaštita od različitih bolesti (oštećenje

miokarda, aterokskleroza i ventrikularne aritmije). RSV modulira metaboliozam lipida i

lipoproteina te na taj način može smanjiti lipidnu peroksidaciju (Das i Das, 2007). RSV

31

smanjuje agregaciju trombocita in vitro i in vivo koja ima veliki značaj u nastanku

ateroskleroze te olakšava širenje krvnih žila (vazodilataciju) stimuliranjem Ca2+-aktiviranih K

kanala povećanjem signalizacije dušikovom oksidom u endotelu krvnih žila (Bertelli i sur.,

2007; Wang i sur, 2005). Čini se da je povećanje koncentracije dušikovog (II) oksida

(povećanjem ekspresije NO-sintaze i smanjenje inaktivacije NO slobodnim radikalima) glavni

mehanizam njegovog kardioprotektivnog djelovanja (Li i sur., 2006; Orallo i sur., 2002).

1.5.1.5 Antitumorsko djelovanje

Antitumorsko djelovanje RSV-a temelji se na inhibiciji enzimske aktivnosti ciklooksigenaze

čija je aktivnost rizik za nastanak mnogih vrsta tumora. Osim toga, RSV može suzbiti nastanak

tumora zaustavljenjem staničnog ciklusa i poticanjem apoptoze (Aggarwal i sur., 2004). Iako

povezanost umjerene konzumacije crnog vina i sprječavanja nastanka karcinoma nije

dokazana, studije in vivo jasno pokazuju antitumorski potencijal ove molekule. RSV je

smanjio rast CaCo-2 stanica i usporio rast tumora dojke te smanjio širenje metastaza (Athar i

sur., 2007; La Vecchia i Bosetti, 2006).

1.5.1.6 Ostali korisni učinci resveratrola

Budući da RSV može prijeći krvno-moždanu barijeru, ima i jak neuroprotektivni učinak te

može suzbiti disfunkciju neurona kod Huntingtonove bolesti, Alzheimerove bolesti i usporiti

napredovanje Parkinsonove bolesti (Parker i sur., 2005; Karlsson i sur., 2000). Dokazano je da

RSV produljuje životni vijek vrsta Saccharomyces cerevisiae i Drosophila melanogatser te da

je značajno produžio život miševa koji su hranjeni hranom visoke kalorične vrijednosti

(Howitz i sur., 2003; Valenzano i sur., 2006; Baur i sur., 2006). Pretpostavlja se da ima ulogu i

u prevenciji dijabetesa i komplikacija dijabetesa (Harikumar i Aggarwal, 2008).

1.5.1.7 Pokusi na životinjskim modelima

32

Nakon što su štakori tretirani s 4 mL crnog vina koje je sadržavalo 6,5 µg mL-1 RSV-a, RSV je

pronađen u plazmi i urinu, ali i u srcu, jetri i bubregu (Bertelli i sur., 1996; Fernandez-Mar i

sur., 2012). Isto istraživanje napravljeno i na ljudima, a RSV je pronađen u organizmu nakon

15 dana. Zaključeno je da je dovoljno 450 mL crnog vina kako bi koncentracija RSV-a u plazmi

ljudi bila između 0,1 i 1 µM (Bertelli i Das, 2009). RSV ima antikancerogeno djelovanje kod

koncentracija od 5 do 100 mM, dok je koncentracija koja je dovoljna za zaštitu od

kardiovaskularnih bolesti između 0,1 i 1 µM (Bertelli, 2007). Znači da svaka osoba koja

umjereno konzumira crno vino u organizam unosi dovoljno RSV-a za zaštitu od

kardiovaskularnih bolesti.

Bez obzira na opisana istraživanja, teško je donijeti konačni zaključak o koristi RSV-a. Postoje

velike razlike u načinu provođenja pokusa, istraživanja na ljudima provedena su na malom

broju ispitanika koji su RSV dobivali kratkotrajno, a razlikuju se i pripravci RSV-a, no RSV bi

mogao imati veliko značenje u prevenciji različitih bolesti.

33

2 OBRAZLOŽENJE TEME

Dosadašnja istraživanja OTA bila su potaknuta njegovom mogućom ulogom u nastanku EN-a

pa je to jedan od najčešće istraživanih mikotoksina. Podrobno je istraživana izloženost ljudi iz

endemskog kraja tom mikotoksinu, provedena su mnogobrojna istraživanja mehanizma

toksičnosti, mutagenosti i kancerogenosti no mehanizam toksičnosti nije u potpunosti

razjašnjen. CTN je jedan od najranije otkrivenih mikotoksina, no budući da u razmjerno

malobrojnim istraživanjima u odnosu na druge mikotoksine nije otkriveno značajno toksično

i kancerogeno djelovanje, novija su istraživanja toksičnog djelovanja CTN-a rijetka.

Dosadašnja su istraživanja mogućih učinaka CTN-a usmjerena ispitivanju mutagenih i

genotoksičnih svojstava na kulturama stanica, a na pokusnim je životinjama ispitivana

njegova teratogenost. Mehanizam toksičnosti CTN-a do sada je istraživan isključivo na

kulturama stanica. Iako je hrana rijetko kontaminirana pojedinačnim mikotoksinom,

istraživanja provedena na pokusnim životinjama s više mikotoksina su rijetka. Zbog čestog

istovremenog pojavljivanja OTA i CTN-a u hrani, ta se je kombinacija mikotoksina više

proučavala, no rezultati istraživanja nisu jednoznačni.

Cilj istraživanja bio je utvrditi na pokusnim životinjama sudjeluje li oksidacijski stres u

mehanizmu toksičnosti CTN-a, povećava li se oksidacijski stres pri istovremenoj izloženosti

životinja tim mikotoksinima te može li se učinak ovih mikotoksina spriječiti primjenom RSV-a.

Budući da genotoksičnost CTN-a, za razliku od OTA, nije jednoznačno dokazana, cilj

istraživanja bio je i istražiti povećava li se oksidacijsko oštećenje DNA ako su životinje

istovremeno izložene djelovanju oba mikotoksina.

Učinak OTA i CTN-a istraživan je u tkivima odraslih muških Wistar štakora koji su tretirani

oralno. Oksidacijski stres procijenjen je praćenjem:

1. oštećenja lipida mjerenjem koncentracije MDA,

2. promjene koncentracije GSH, staničnog tiola s antioksidacijskim djelovanjem,

3. promjene katalitičke aktivnosti antioksidacijskih enzima (SOD, CAT i GPx),

4. specifičnog oksidacijskog oštećenja DNA pomoću hOGG1 komet testa.

34

3 MATERIJALI I METODE

3.1 Kemikalije

• 1, 1, 3, 3 – tetrametoksi propan, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• 5, 5’-ditiobis-2-nitrobenzoat (DTNB), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Agaroza, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Boja za proteine 'Serva-Blue G', Serva, Heidelberg, Njemačka

• Butilirani hidroksitoluen (BHT), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Citrinin, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Etanol, CH3CH2OH, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Etidijev bromid, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Etil acetat, C4H8O2, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Fosforna kiselina, H3PO4, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Glutation (GSH), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Goveđi serumski albumin (BSA), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Gvanidin hidroklorid, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Haemiglobincyanide standard, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Nizozemska

• 8-oksogvanin-DNA-glikozilaza 1 (hOGG1) enzim, Trevigen, Maryland, USA

• Kalijev dihidrogenfosfat, KH2PO4, Merck, Darmstadt, Njemačka

• Kalijev hidroksid, KOH, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Klorovodična kiselina, HCl, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Ksantin oksidaza (E.C. 1.17.3.2), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Metafosforna kiselina (MPA), Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Metanol HPLC čistoće, CH3OH, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Na2EDTA, C10H14N2Na2O8 x 2H2O, Merck, Darmstadt, Njemačka

• Natrijev dihidrogenfosfat dodekahidrat, Na2HPO4 x 12 H2O, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Natrijev hidrogenkarbonat, NaHCO3, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Natrijev hidroksid, NaOH, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Natrijev karbonat, Na2CO3, Kemika, Zagreb, Hrvatska

35

• Natrijev klorid, NaCl, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• Okratoksin A, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Pufer fosfatni 0,01 M, pH 7,0 (Ransod Sample Diluent), Randox, Crumlin, UK

• Pufer 50 mM, pH 10.2 CAPS/ 0,94 mM EDTA, Randox, Crumlin, UK

• Ransod reagensi, Randox, Crumlin, UK

• Resveratrol, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Tiobarbituratna kiselina, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Trikloroctena kiselina, CCl3COOH, Kemika, Zagreb, Hrvatska

• TRIS, tris(hidroksimetil)aminoetan, C4H11NO3, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri,

SAD

• Triton X-100, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, SAD

• Voda HPLC čistoće, Merck, Darmstadt, Njemačka

3.2 Instrumenti

• Analitička vaga, Mettler Toledo, XN105DR

• Analitička vaga, Mettler Toledo, AE 200

• Spektrofotometar Cecil 9000

• Spektrofotometar Varian Cary 50

• Termostatirani spektrofotometar Varian-CARY 50 Scan

• HPLC sistem, Shimadzu, Kyoto, Japan

o Degaser (uređaj za uklanjanje otopljenih plinova) DGU 20A3

o Gradijentna pumpa LC 20AD SP

o UV-VIS detektor SPD 20AV

o Fluorescentni detektor RF 20A

o Termostat za kolonu CTO 20A

o Autosampler – automatski uzorkivač SIl 20 AC HT

o Komunikator s računalom CBM 20A

UPLC-MS/MS sistem, Waters Acquity TQD, Waters, SAD

• pH metar, SevenEasy, Mettler Toledo

• Uređaj za elektroforezu, Life technologies – Applied biosystems, Carlsbad, CA, SAD

36

• Epifluorescencijski mikroskop, Olympus, Tokio, Japan

3.3 Puferi i otopine

• Fiziološka otopina (0,9% otopina natrijevog klorida)

• Otopina za lizu

o 2,5 M natrijev klorid

o 100 mM Na2EDTA

o 10 mM TRIS baza

o 1% natrij lauril sarkozinat

o 1% Triton X-100

o pH 10 – podešeno s 10 M NaOH

• Alkalna otopina za denaturaciju i elektroforezu

o 5 mL 200 mM Na2EDTA

o 980 mL H2O

o 87,66 g NaCl

o pH 12,10 – podešeno s 10 M NaOH

• Homogenizacijski pufer

o 75 mM NaCl

o 24 mM Na2EDTA

o pH 7,4 podešeno s 10 M NaOH

• Neutralizacijski pufer (TRIS HCl)

o 48,5 g TRIS baza otopljeno u 1L vode

o pH 7,5 – podešeno s 1M HCl

• 0,3 M fosfatni pufer (PBS)

o 800 g NaCl

o 20 g KCl

37

o 57,72 g Na2HPO4 otopljeno u 500 mL vode

o 24,40 g NaH2PO4 otopljeno u 500 mL vode

o pH 7,4, po potrebi se podešava s 1M HCl ili 10 M NaO

• Pufer FLARE (Trevigen) 25x

o 20 mM HEPES

o 2 M KCl

o 150 mM Na2EDTA

o pH 7,4 (ne podešava se jer se pufer kupuje gotov)

• Pufer FLARE™ (Trevigen) 1x

o 4 ml stock otopine pufera FLARE™ (Trevigen) 25x

o 96 ml redestilirane vode

• hOGG1 reakcijska otopina

o otopina 1: 32 µL pufer FLARE™ (Trevigen) 25x + 768 µL redestilirane vode

o otopina 2: 32 µL pufer FLARE™ (Trevigen) 25x + 767,2 µL redestilirane vode +

0,8 µL hOGG1 enzima

3.3.1 Otopine mikotoksina i resveratrola za tretman pokusnih životinja

Mikotoksini okratoksin A i citrinin te antioksidans resveratrol nabavljeni su od proizvođača

Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim.

Okratoksin A: Mr=403,81, čistoće >=98% iz Petromyces albertensis. Prije tretmana otopljen je

u 51 mM NaHCO3 i napravljene su koncentracije 125 i 250 µg mL-1. Životinje su tretirane

dozama od 125 i 250 µg OTA kg-1 tjelesne mase (tm).

Citrinin: Mr=250,25, čistoće >=98% iz Penicillium citrinum. Prije tretmana otopljen je u 50

mM Na2CO3 razrijeđen u finalnoj koncentraciji od 20 mg mL-1. Životinje su tretirane dozom

od 20 mg CTN kg-1 tm.

38

Resveratrol: Mr=228,24, čistoće >99%. Prije tretmana je otopljen u 5% etanolu do

koncentracije 10 mg mL-1. Životinje su tretirane dozom od 10 mg RSV-a kg-1 tm.

3.4 Životinje

U pokusima su korišteni mužjaci štakora soja Wistar stari deset tjedana i mase 230-270

grama na početku pokusa. Štakori su nasumce raspoređeni u skupine. Životinje su tijekom

pokusa držane u makrolonskim kavezima sa sterilnom steljom te su imale neograničeni

pristup hrani (Mucedola, Settimo, Italija) i vodi. Svaki treći dan su boravile u metaboličkom

kavezu 24 sata bez pristupa hrani, a pristup vodi bio je neograničen. Kavezi su bili u prostoriji

s kontrolirananom temperaturom (22 ˚C) uz ciklus izmjene svjetla i tame od 12 sati. Pokuse

je odobrilo Etičko povjerenstvo Instituta za medicinska istraživanja i medicinu rada. Postupak

sa životinjama u potpunosti je bio u skladu sa svim propisima Zakona o dobrobiti životinja.

3.4.1 Tretman životinja

Pokusi su provedeni u četiri zasebna dijela, a životinje su toksine i RSV dobivale gastričnom

sondom.

1. Pokus okratoksin A

Štakori su raspodijeljeni u tri skupine (n=4) koje su dobivale:

A) otapalo (51 mM NaHCO3),

B) OTA (125 µg kg-1 tm) i

C) OTA (250 µg kg-1 tm).

Životinje su tretirane dnevno 21 dan u isto doba dana.

39

2. Pokus citrinin

Štakori su podijeljeni u dvije skupine (n=4) koje su dobivale:

A) otapalo (50 mM Na2CO3) i

B) CTN (20 µg kg-1 tm).

Životinje su tretirane dnevno dva dana u isto doba dana. Oralna LD50 vrijednost za štakora je

50 mg kg-1 (Sakai, 1955 u Dunn i sur., 1983). U većini dostupnih istraživanja, životinje su

jednokratno tretirane visokim dozama CTN-a (Berndt i Hayes, 1977). Odlučeno je da će

životinje biti tretirane ukupnom nižom dozom CTN-a od one koja je korištena u literaturi

zbog istovremenog tretmana s OTA. Doza je primijenjena u dva dana kako životinje ne bi

uginule tijekom pokusa. Budući da se CTN vrlo brzo eliminira iz organizma, a za djelovanje

OTA je potrebna njegova akumulacija u organizmu, odabrana su posljednja dva dana pokusa

za tretman CTN-om kako bi bio vidljiviji zajednički učinak OTA i CTN-a te kako bi bilo moguće

izmjeriti koncentraciju CTN-a u pojedinim tkivima.

3. Pokus okratoksin A + citrinin

Štakori su podijeljeni u tri skupine (n=6) koje su dobivale:


B) OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN (20 mg kg-1 tm)

C) OTA (250 µg kg-1 tm) i CTN (20 mg kg-1 tm).

Životinje su tretirane dnevno s OTA 21 dan u isto doba dana, a zadnja dva dana pokusa i s

CTN-om.

4. Pokus okratoksin A + citrinin + resveratrol

Štakori su podijeljeni u četiri skupine (n=6) koje su dobivale:


40

B) RSV (10 mg kg-1 tm),

C) OTA (125 µg kg-1 tm), CTN (20 mg kg-1 tm) i RSV (10 mg kg-1 tm).

D) OTA (250 µg kg-1 tm), CTN (20 mg kg-1 tm) i RSV (10 mg kg-1 tm).

Životinje su tretirane s OTA i RSV-om dnevno tijekom 21 dana u isto doba dana. Štakori iz

obje tretirane skupine tretirani su i s CTN-om tijekom zadnja dva dana pokusa.

Svaki treći dan štakori su bili u metaboličkom kavezu tijekom 24 sata te je sakupljan urin.

Nakon završetka pokusa životinje su žrtvovane te su sakupljeni uzorci krvi (iz srca), bubrezi,

jetra i mozak. Krv je zaleđena do analize kao puna krv, plazma i eritrociti. Dio jetre i bubrega

potreban za određivanje oksidacijskog oštećenja DNA (komet test) sakupljen je odmah te je

isti dan napravljen pokus. Mozak i ostatak jetre i bubrega zaleđeni su do analize.

3.4.2 Metode

3.4.2.1 Homogeniziranje tkiva

Neposredno prije analize odvagana je potrebna masa jetre i bubrega te je napravljen 10%-tni

homogenat u fiziološkoj otopini. 10%-tni homogenati mozga su napravljeni od polovice

mozga prerezanog po uzdužnoj osi.

3.4.2.2 Mjerenje koncentracije OTA u urinu i tkivima

Esktrakcija OTA

Urin

Estrakcija OTA iz urina napravljena je po metodi koju su opisali Breitholtz-Emanuelsson i sur.

(1993).

1 mL urina

5 mL metanola

41

500 µL 1M HCl

5 mL kloroforma

Smjesa je miješana na rotacijskoj mješalici, a nakon toga dva puta ekstrahirana kloroformom

i isprana vodom.

Tkiva

Estrakcija OTA iz tkiva napravljena je po modificiranoj metodi koju su opisali von Bauer i sur.

(1984).

10% homogenat tkiva

10 mL kloroforma

35 mL smjese 0,05M HCl i 0,5M MgCl2

Smjesa je miješana na rotacijskoj mješalici, a nakon toga dva puta ekstrahirana kloroformom

i isprana s NaHCO3.

Kloroform u kojem se nalazio ekstrahirani OTA uparen je do suha u struji dušika i injektiran u

HPLC.

3.4.2.3 Mjerenje koncentracije OTA metodom visokoučinske tekućinske kromatografije

Koncentracija OTA u urinu i tkivima izmjerena je metodom visokoučinske tekućinske

kromatografije kao što je opisano u radu Flajs i sur. (2009). Upareni uzorak OTA otopljen je u

200 µL mobilne faze koja se sastojala od metanola, vode i octene kiseline (70:30:2). Protok

mobilne faze bio je 0,5 mL min-1, a valna duljina emisije i ekscitacije na fluorecentnom

detektoru namješrena je na 336, odnosno 464 nm. Upotrijebljavana je pretkolona (4,0x4,0

mm) i kolona (125,x4,0 mm, Merck, Darmstadt, Njemačka), a analiza je izvršena na HPLC-u

koji se sastojao od uređaja za uklanjanje zraka, izokratne pumpe, uređaja za održavanje

stalne temperature kolone i fluorescentnog detektora (Shimadzu, Kyoto, Japan). Limit

detekcije za ovu metodu bio je 5 ng L-1.

42

3.4.2.4 Mjerenje koncentracije OTA i CTN-a u tkivima pomoću UPLC-MS/MS-a

Priprema uzoraka

Odvagano je dva grama tkiva bubrega, jetre ili mozga i pomiješano sa smjesom koja je

sadržavala metanol i vodu u omjeru 80:20 (v/v), 1% octene kiseline, 4 g Na2SO4 i 1 g

CH3COONa. Smjesa je miješana na rotacijskoj mješalici 30 minuta te nakon toga

centrifugirana. 5 µL supernatanta injektirano je u UPLC-MS/MS.

Analiza je napravljena na koloni reverzne faze Hibar Purospher STAR HR 50x2.1mm, veličine

čestica 2 µm, a mobilna faza sastojala se od vodene otopine 0,1% octene kiseline i metanola.

Protok je bio 0,53 mL min-1, a analiza se odvijala po sljedećem pogramu:

0.1% CH3COOH = A

CH3OH = B

0. min - 95%A - 5%B

0.61 min - 95%A - 5% B

4.5 min - 5% A - 95% B

5. min - 95% A - 5%B

3.4.2.5 Mjerenje koncentracije MDA u tkivima i plazmi

Zbog oštećenja polinezasićenih masnih kiselina nastaje MDA koji je pouzdan pokazatelj

peroksidacije lipida. Koncentracija MDA određivana je izvornom metodom koju su opisali

Drury i sur. (1997) za određivanje MDA u plazmi te prilagođena za određivanje MDA u

homogenatima tkiva. Metoda se temelji na vezanju MDA s tiobarbituratnom kiselinom (TBA)

pri čemu nastaje ružičasti spoj koji apsorbira svjetlost valne duljne od 538 nm. Kao standard

za baždarnu krivulju korišten je 1,1,3,3-tetraetoksi propan. Daljnja oksidacija spriječena je

dodavanjem butiliranog hidroksitoluena (BHT).

43

Postupak:

50 μL uzorka (plazme ili homogenata tkiva)

5 μL BHT (0,2%, w/v)

750 μL fosforne kiseline (1%, v/v)

250 μL TBA (0,6%, w/v)

445 μL vode

Uzorci s reagensima su promiješani i inkubirani u kipućoj vodenoj kupelji 30 minuta. Reakcija

je zaustavljena hlađenjem u vodi i 20 µL uzorka injektirano je u HPLC.

HPLC

Visokoučinski tekućinski kromatograf sastoji se od uređaja koji uklanja otopljene plinove,

izokratne i gradijentne pumpe, termostatiranog prostora za kolonu, UV i fluorescentnog

detektora (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Pretkolona i analitička kolona su C-18

obrnute faze (LiChrospher, Merck, Darmstadt, Njemačka) s česticama veličine 5 μm.

Dimenzije pretkolone su 4,0 x 4,0, a kolone 4,0 x 125,0 mm.

Iz mobilne faze koja se sastojala od 50 mM KH2PO4 i metanola (60:40, v/v, pH 6,8) uklonjen

je otopljeni zrak u ultrazvučnoj kupelji (15 minuta). Protok mobilne faze bio je 1 mL min-1.

MDA je mjeren UV detektorom pri valnoj duljini od 532 nm. Injektirano je 20 μm uzorka, a

temperature kolone je bila 32 ᵒC. Pri tim uvjetima vrijeme zadržavanja MDA na koloni bilo je

2,5 minute.

3.4.2.6 Određivanje koncentracije glutationa (GSH)

Koncentracija glutationa mjerena je izvornom spektrofotometrijskom metodom po Ellmanu

(1958) u plazmi, bubrezima, jetri i mozgu.

44

Metoda se temelji na vezanju glutationa (tiola) s 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoičnom kiselinom

(DTNB). U ovoj brzoj reakciji cijepa se disulfidna veza te nastaje 2-nitro-5-tiobenzoat (NTB-),

koji se ionizira do NTB2- koji je žute boje i apsorbira svjetlost valne duljine od 412 nm.

Postupak

Homogenati tkiva (10%) centrifugirani su 10 minuta pri 10.000 G. U 300 µL supernatanta

dodano je 100 µL TCA (5%-tne otopine). Smjesa je promiješana na tresilici i centrifugirana 10

minuta na 10.000 G. Pripremljene su otopine slijepe probe, standarda GSH i uzoraka za

mjerenje apsorbancije na 412 nm:

100 µL H2O/100 µL standarda/100 µL homogenata tkiva ili plazme

850 µL fosfatnog pufera

50 µL DTNB

Apsorbancija GSH mjerena je u triplikatu. DTNB je dodan neposredno prije mjerenja

apsorbancije svakog uzorka jer je razmjerno nestabilan pri sobnoj temperaturi. Svaki uzorak

promiješan je na vortex mješalici. Mjerenje je provedeno tako da se paralelno mjerila

apsorbancija slijepe probe i standarda ili pojedinih uzoraka. Koncentracija GSH iz uzoraka

izračunata je iz formule Lamber-Beerovog zakona, prema kojem je apsorbancija jednaka

umnošku ekstinkcijskog koeficijenta (ɛ) (mjera sposobnosti neke tvari da apsorbira i rasprši

zračenje), širine kivete (b) i koncentracije tvari (c): A = ɛ b c ili iz baždarnog dijagrama.

3.4.2.7 Određivanje koncentracije hemoglobina

Hemoglobin (Hb) u punoj krvi i eritrocitima mjeren je spektrofotometrijski pri valnoj duljini

apsorbancije od 540 nm standardiziranom cijanomethemoglobin metodom koristeći

Haemiglobincyanide standard.

45

3.4.2.8 Određivanje katalitičke aktivnosti enzima

3.4.2.8.1 Određivanje katalitičke aktivnosti SOD-a

3.4.2.8.1.1 Određivanje katalitičke aktivnosti SOD-a u eritrocitima

Katalitička aktivnost SOD-a u eritrocitima mjerena je prema Europskoj standardiziranoj

metodi (EC-FLAIR) (Belsten i Wright, 1995b) korištenjem komercijalnog Ransod reagensa

prema uputama proizvođača. Ksantin oksidaza odgovorna je za pretvorbu ksantina u

mokraćnu kiselinu pri čemu se kao nusprodukt stvara superoksidni anion. Superoksidni anion

raspoloživ je za redukciju 2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolij klorida (INT) u

obojeni formazon (A505), dok se dio superoksidnog aniona, usporedno, katalitički razgrađuje

djelovanjem enzima SOD-a. Što je u uzorku veća aktivnost SOD-a to je inhibicija redukcije

INT-a veća.

Postupak:

• Isprani eritrociti hemolizirani su i načinjeno je radno razrjeđenje (100 puta).

• U predinkubiranu reakcijsku smjesu dodan je razrijeđeni uzorak. Reakcija otpočinje

dodavanjem otopine ksantin oksidaze pri čemu nastaju superoksidni radikali koji u reakciji s

INT-om stvaraju obojeni formazon.

• Aktivnost SOD-a mjerena je spektrofotometrom (Cary 50, Varian) pri valnoj duljini od

505 nm i temperaturi od 37 ᵒC. Što je aktivnost SOD-a veća, to je manja koncentracija

nastalog produkta.

• Početna apsorbancija A30 mjerena je nakon 30 s, a konačna apsorbancija A210 nakon

210 s, iz čega je izračunata A, a potom i postotak inhibicije.

• Rezultati mjerenja apsorbancije poznatih koncentracija korišteni su za baždarni

pravac u lin-log mjerilu.

• Dobivena vrijednost aktivnosti enzima u hemolizatu izražena se jedinicom U mL-1 krvi.

Aktivnost SOD-a podijeljena je s koncentracijom hemoglobina i izražena kao aktivnost u

gramu hemoglobina (U g-1 Hb).

46

3.4.2.8.1.2 Određivanje katalitičke aktivnosti SOD-a u plazmi

Postupak

680 µL supstrata (predinkubiran u termobloku pri 37 ᵒC, 15 min)

20 µL uzorka/standarda

100 µL ksantin oksidaze (predinkubirana u termobloku pri 37 ᵒC, 15 min)

Nakon dodavanja ksantin oksidaze uzorak je odmah promiješan uz istovremeno započeto

mjerenje.

3.4.2.8.2 Određivanje katalitičke aktivnosti glutation peroksidaze

Za određivanje aktivnosti GPx-a u krvi korištena je Europska standardizirana metoda (Belsten

i Wright, 1995a). T-butil hidroperoksid oksidira glutation što se mjeri spektrofotometrijskim

praćenjem smanjenja koncentracije β-NADP pri apsorbanciji od 340 nm. Jedna jedinica

aktivnosti GPX-a je broj mikromolova β-NADPH oksidiranih u minuti. Rezultati su izraženi kao

količnik jedinice aktivnosti i masene koncentracije hemoglobina.

3.4.2.8.3 Određivanje katalitičke aktivnosti CAT-a

Katalitička aktivnost CAT mjerena je izvornom spektrofotometrijskom metodom (Aebi,

1984). Metoda se temelji na spekrofotometrijskom mjerenju razgradnje H2O2 zbog čega

dolazi do pada apsorbancije na valnoj duljini od 240 nm (UV područje). Razlika u apsorbanciji

u jedinici vremena jest mjera katalitičke aktivnosti katalaze. Što je više katalaze u uzorku, to

će razlika u apsorbanciji unutar nekog vremenskog razdoblja biti veća jer se razgrađuje više

H2O2.

47

Postupak:

• Uzorak homogenata jetre ili bubrega, odnosno hemolizata krvi razrijeđen je fosfatnim

puferom (50 mM, pH 7,0) 2.000 ili 1.000 puta.

• Razrijeđeni uzorak (2 mL) pomiješan je s 1,0 mL H2O2 (30 mM).

• Apsorbancija svakog uzorka mjerena je prema svojoj slijepoj probi koja sadrži 2,0

razrijeđenog uzorka i 1,0 mL fosfatnog pufera (50 mM, pH 7,0).

• Pad apsorbancije praćen je tijekom 30 sekundi pri valnoj duljini od 240 nm i

temperaturi od 25 ᵒC.

• Katalitička aktivnost katalaze izračunata je pomoću molarnog ekstinkcijskog

koeficijenta 40 mM-1cm-1.

3.4.2.9 Komet test

hOGG1 komet test napravljen je prema metodi koju su opisali Mladinić i sur. 2009. Ovaj test

temelji se na izoliranju pojedinih stanica iz tkiva homogenizacijom te denaturacije tijekom

koje dolazi do pucanja vodikovih veza i razmatanja komplementarnih lanaca DNA. Uslijed

narušene strukture na mjestu oštećenja DNA i napetosti koja se javlja uslijed rotacije

(tijekom denaturacije) na tom istom mjestu lanac DNA puca. Tijekom elektroforeze, a zbog

oštećenja koja su nastala u kemijskoj strukturi DNA, gubi se visoka organizacija kvarterne

strukture DNA i ona se opušta (engl. relax/relaxed loops). U takvoj DNA, s opuštenim

regijama unutar DNA i oslobođenim slobodnim krajevima fragmenata lanaca DNA koji su

nastali uslijed loma, izloženoj električnom polju tijekom elektroforeze, relaksirane regije i

oslobođeni krajevi putuju prema anodi i polako izlaze iz nukleoida. Nukleoid s neoštećenom

DNA izgleda pravilno okruglo, poput sfere, a nukleoid s oštećenom DNA iz sfere ima izduženu

tvorbu koju tvore izvučene relaksirane regije i krajevi fragmenata lanaca DNA koji su nastali

zbog loma. Sferični dio koji predstavlja nukleoid naziva se glava kometa, a tvorba iza glave

rep kometa.

48

Preparati komet testa analizirani su pomoću programskog paketa za analizu. Preparat je

stavljen pod epifluorescencijski mikroskop, obasjan UV svjetlošću točno određene valne

duljine (koje), sliku hvata kamera spojena na računalo s programskim paketom. Program

mjeri dužinu repa počevši od središta glave do najudaljenijeg dijela genomske DNA koji je

migrirao u električnom polju iz nukleoida. Dužina repa označava maksimalnu udaljenost na

koju su dijelovi DNA zahvaćeni oštećenjem migrirali u gelu. Što je više oštećenja, rep je duži.

Intenzitet repa određuje se usporedbom intenziteta fluorescencije područja repa kometa s

intenzitetom fluorescencije glave kometa i korigira se s obzirom na pozadinsku

fluorescenciju. U kometu je DNA raspoređena tako da je dio u glavi, a dio u repu i zajedno

čine 100% genoma. Zbroj intenziteta fluorescencije glave i fluorescencije repa vrednuje se

vrijednošću 100. Stoga udio intenziteta fluorescencije koji otpada na područje repa odgovara

postotku genomske DNA koja je iz nukleoida migrirala u rep. Time intenzitet fluorescencije

izravno predstvalja% genomske DNA koja tvori rep i koja je zahvaćena oštećenjima.

Nakon žrtvovanja životinja uzorkovan je 0,1 g tkiva jetre i bubrega. Tkivo je isprano u

homogenizacijskom puferu i u 1 ml istog pufera mehanički homogenizirano. Od svakog

uzorka organa (homogenata) izrađena su dva preparata. 10 µl homogenata resuspendirano

je u 100 µl 1% otopine agaroze niske temperature tališta u PBS-u (Trevigen). Agaroza je bila

na temperaturi od 37 ᵒC. Suspenzija je nanešena na predmetna stakalca prethodno uronjena

u 1% otopinu agaroze normalne temperature tališta i osušena. Suspenzija je pokrivena

predmetnim stakalcem i ostavljena na ledu 10 minuta.

Predmetno stakalce je uklonjeno, a preparat uronjen u pufer za lizu stanica koji je ohlađen

na 4 ᵒC te ostavljeno 24 sata.

Postupak:

• Od svakog uzorka izrađena su 2 preparata. Jedan je tretiran s 50 µL pufera, a drugi

istovremeno s 50 µL otopine enzima hOGG1.

• Preparati su isprani tri puta FLARE™ puferom.

• Inkubirani su na 37 ᵒC 10 minuta te nakon toga uronjeni u alkalnu otopinu za

denaturaciju i elektroforezu tijekom 15 minuta uz jednu izmjenu otopine svježom.

49

• Preparati su premješteni u kadicu za elektroforezu s alkalnom otopinom za

denaturaciju i elektroforezu. Elektroforeza je trajala 20 minuta, pri stalnom naponu

21 V i jakosti struje od 300 mA.

• Preparati su ispirani:

o tri puta s TRIS HCl puferom u trajanju od pet minuta.

o 70%-tnim etanolom i ostavljeni 10 minuta.

o 96%-tnim etanolom i ostavljeni 10 minuta.

• Preparati su osušeni i obojeni otopinom etidijevog bromida (20 g mL-1)

• Svako stakalce je pregledano pod povećanjem od 250 puta na epifluorescencijskom

mikroskopu (Olympus, Tokio, Japan)

Na svakom je stakalcu analizirano 100 nukleoida te su izmjereni duljina i intenzitet repa (%

DNA u repu) koristeći Comet Assay IV analysis system (Perceptive Instruments, Suffolk,

Velika Britanija). Oksidacijsko oštećenje DNA prikazano je kao razlika srednje vrijednosti

mjerenih parametara između preparata tretiranih hOGG1 enzimom i onih tretiranih FLARE

puferom.

50

4 STATISTIČKA OBRADA

Rezultati dobiveni mjerenjem volumena urina izraženi su kao srednje vrijednosti sa

standardnim devijacijama aritmetičke sredine (n=4 i n=6). Rezultati mjerenja koncentracija

MDA i GSH i katalitičke aktivnosti SOD-a, CAT-a i GPx-a prikazani su kao postotna vrijednost u

odnosu na pripadajuću kontrolnu skupinu (n=4 i n=6). Rezultati mjerenja duljine i intenziteta

repa kometa izraženi su kao srednje vrijednosti sa standardnim devijacijama aritmetičke

sredine (n=4 i n=6) te kao postotna vrijednost u odnosu na skupinu tretiranu puferom.

Testiranje značajnosti promjena u tretiranim skupinama životinja u odnosu na kontrolne te

promjena izazvanih djelovanjem pojedinačnih mikotoksina u odnosu na njihove kombinacije

provedeno je analizom varijance (ANOVA on Ranks) i Tukey post testom multiple

komparacije na razini značajnosti p<0,05. Za statističku obradu podataka korišten je program

STATISTICA 10.0.

51

5 REZULTATI

5.1 Opće stanje životinja

Tijekom trajanja pokusa kontrolne i tretirane životinje bile su dobrog općeg stanja bez

znakova trovanja. U promatranom razdoblju nije došlo do ugibanja životinja. Životinje su

držane po skupinama u makrolonskim kavezima, a prije prvog tretmana i svaki treći dan

stavljane su zasebno u metaboličke kaveze radi sakupljanja urina tijekom 24 sata. Životinje

su vagane svaki dan neposredno prije tretmana i na dan žrtvovanja. Mase životinja prikazane

su na slikama od 5-1 do 5-6.

Slika 5-1 Mase kontrolnih životinja (0; n=4) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm;

n=4) tijekom 21 dan. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost mase skupine.

200

220

240

260

280

300

320

340

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

125

250

OTA µg kg-1

52

Slika 5-2 Mase kontrolnih životinja (0; n=4) i životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm; n=4)

tijekom dva dana. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost mase skupine.

Slika 5-3 Mase kontrolnih životinja (0; n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 µg kg-1 tm; n=6)

tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm; n=6) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani

kao srednja vrijednost mase skupine.

250

260

270

280

290

300

310

0 1 2

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

20

200

220

240

260

280

300

320

340

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

125 + 20

OTA µg kg-1

CTN mg kg-1

CTN mg kg

-1

53

Slika 5-4 Mase kontrolnih životinja (0; n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (250 µg kg-1 tm; n=6)

tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm; n=6) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani

kao srednja vrijednost mase skupine.

Slika 5-5 Mase kontrolnih životinja (0; n=4), životinja tretiranih resveratrolom (RSV; n=4) i životinja

tretiranih okratoksinom A (125 µg kg-1 tm; n=4) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm; n=4) tijekom 21 dan i

citrininom (20 mg kg-1 tm; n=4) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao srednja

vrijednost mase skupine.

200

220

240

260

280

300

320

340

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

250 + 20

150

170

190

210

230

250

270

290

310

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 N

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

RSV

125 + 20 + 20

OTA µg kg-1

CTN mg kg-1

OTA µg kg-1

CTN mg kg

-1

RSV mg kg-1

54

Slika 5-6 Mase životinja u kontrolnoj skupini (0; n=4), životinja tretiranih resveratrolom (RSV; n=4) i

životinja tretiranih okratoksinom A (250 µg kg-1 tm; n=4) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm; n=4) tijekom

21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm; n=4) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao

srednja vrijednost mase skupine.

Rezultati mjerenja mase životinja ukazuju da promjena mase životinja nije ovisila o spoju s

kojim su životinje tretirane. Masa životinja se smanjivala (20-30 g) tijekom boravka u

metaboličkom kavezu kada nisu imale pristup hrani. Nakon povratka u makrolonske kaveze

njihova se masa povećala. Nakon dva dana boravka u zajedničkim kavezima sa slobodnim

pristupom hrani i vodi, masa im se povećala za nekoliko grama (2-10). Tijekom tretmana od

21 dan masa svih životinja je jednoliko rasla (10-30 grama).

150

170

190

210

230

250

270

290

310

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 N

Mas

a (g

)

Dan tretmana

0

RSV

250 + 20 + 20

OTA µg kg-1

CTN mg kg

-1

RSV mg kg-1

55

Urin svih životinja sakupljan je tijekom 24 sata prije početka pokusa, a zatim svaki treći dan.

Izmjereni volumeni urina prikazani su u tablicama 5-1 – 5-4.

Tablica 5-1 Volumen urina kontrolnih životinja (0; n=4) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250

µg kg-1 tm; n=4) tijekom 21 dan. Rezultati volumena urina prikazani su kao srednja vrijednost ±

standardna devijacija.

Tretman Dan tretmana

OTA (µgkg-1) 0 3 6 9 12 15 18 21

Volumen urina (mL)

0 25±13 22±9 26±21 16±7 17±6 16±7 16±6 18±7

125 30±11 22±12 23±8 22±7 21±9 17±6 23±6 21±5

250 30±7 20±8 20±3 18±2 16±2 15±2 16±2 15±2

Tablica 5-2 Volumen urina kontrolnih životinja (0; n=4) i životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm;

n=4) tijekom dva dana. Rezultati volumena urina prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna

devijacija.


CTN (mgkg-1) 1 2

Volumen urina (mL)

0 18±8 12±2

20 15±4 13±2

Tablica 5-3 Volumen urina kontrolnih životinja (0; n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250

µg kg-1 tm; n=6) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm; n=6) posljednja dva dana pokusa.

Rezultati volumena urina prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.


OTA (µgkg-1) + CTN (mgkg-1)

0 3 6 9 12 15 18 21

Volumen urina (mL)

0 32±17 24±12 17±7 15±5 17±6 17±6 24±12 19±6

125 + 20 27±13 23±7 18±3 19±5 16±5 19±4 22±7 19±3

0 24±5 26±11 23±10 23±8 20±6 20±6 20±6 22±6

250 + 20 19±8 26±4 25±5 23±7 20±6 20±6 20±5 21±7

56

Tablica 5-4 Volumen urina kontrolnih životinja (0; n=4), životinja tretiranih resveratrolom (20 mg kg-1

tm; n=4) tijekom 21 dan i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) i resveratrolom

(20 mg kg-1 tm; n=4) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm; n=4) posljednja dva dana pokusa.

Rezultati volumena urina prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.


OTA (µgkg-1) + CTN (mgkg-1) + RSV (mgkg-1)

0 3 6 9 12 15 18 21

Volumen urina (mL)

0 32±2 15±4 16±4 11±2 15±3 13±3 16±8 21±6

RSV 20 11±16 20±3 22±2 19±2 22±6 18±4 21±5 16±4

125 + 20 + 20 31±14 16±5 21±10 18±6 19±5 13±4 19±3 22±11

0 21±8 22±14 32±7 23±2 27±6 21±4 19±6 19±3

RSV 20 16±6 21±10 21±12 18±11 24±7 20±8 19±5 17±3

250 + 20 +20 13±6 28±16 22±10 19±9 20±7 19±10 17±9 22±12

Iz prikazanih rezultata mjerenja volumena urina vidljivo je da količina izlučenog urina nije

povezana s tretmanom.

57

5.2 Mjerenje koncentracije mikotoksina

5.2.1 OTA u urinu, bubregu i jetri u preliminarnom pokusu

Koncentracija OTA mjerena je u urinu, bubrezima i jetri pokusnih životinja tretiranih s OTA

(250 i 500 µg kg-1 tm) i uspoređena s vrijednostima u kontrolnim životinjama.

*različito od kontrole, p<0,05

Slika 5-7 Koncentracija okratoksina A u urinu, bubregu i jetri kontrolnih životinja (0; n=4) i životinja

tretiranih okratoksinom A (250 i 500 µg kg-1 tm; n=4) tijekom 10 dana. Rezultati su prikazani kao

srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Nakon tretmana s OTA (250 i 500 µg kg-1 tm tijekom 10 dana) izmjerena je koncentracija OTA

u urinu, bubrezima i jetri (Slika 5-7). Promjena koncentracije OTA u bila je značajna u urinu i

oba mjerena organa (5,10±0,80, 92,10±6,64 i 112,21±35,36 ng g-1 tkiva) životinja koje su

tretirane višom dozom OTA u odnosu na kontrolu (0). U preliminarnom pokusu životinje su

bile tretirane s OTA 10 dana svaki drugi dan dozom od 250 i 500 µg kg-1 tm. Budući da se

koncentracija MDA povećala samo nakon tretmana od 500 µg kg-1 tm, zaključeno je da bi

trebalo istražiti utjecaj svakodnevnog tretmana s OTA na oksidacijski stres te zbog toga sniziti

doze OTA.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

250 500

ng

g-1 t

kiva

OTA

URIN

BUBREZI

JETRA

*

*

* *

*

*

58

5.2.2 Mjerenje koncentracije OTA i CTN-a u buregu, jetri i mozgu

Koncentracija OTA i CTN-a mjerena je u bubregu, jetri i mozgu pokusnih životinja tretiranih s

OTA (125 i 250 µg kg-1 tm), CTN-om (20 mg kg-1), zajedničnim tretmanom s oba mikotoksina

te zajedničkim tretmanom s oba mikotoksina i RSV-om (20 mg kg-1) i uspoređena s

vrijednostima u kontrolnim životinjama. Životinje su s OTA i RSV-om tretirane tijekom 21

dan, a s CTN-om posljedna dva dana pokusa.


Slika 5-8 Koncentracija okratoksina A u bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja i životinja tretiranih

okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ±

standardna devijacija.

U bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan izmjerena je

koncentracija OTA. U kontrolnih životinja nije utvrđen OTA u pojedinim organima. U bubregu

životinja koncentracija OTA iznosila je 1,55±0,53 i 3,03±0,06 µg g-1 tkiva, u jetri 1,05±0,42 i 3,96±0,27

µg g-1 tkiva, a u mozgu 0,07±0,04 i 0,15±0,06 µg g-1 tkiva.

0

2

4

6

8

µg

g-1 t

kiva

125 µg kg-1 250µg kg-1

OTA

BUBREG

JETRA

MOZAK

*

*

* * *

*

59

Slika 5-9 Koncentracija citrinina u bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja i životinja tretiranih

citrininom (20 mg kg-1) tijekom dva dana. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna

devijacija.

U bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s CTN-om (20 mg kg-1 tm) tijekom dva dana izmjerena je

koncentracija CTN-a. U kontrolnih životinja nije utvrđen CTN u pojedinim organima. U bubregu

životinja koncentracija CTN-a iznosila je 2,23±1,50 µg g-1 tkiva, u jetri 1,76±0,59 µg g-1 tkiva, a u

mozgu 0,03±0,006 µg g-1 tkiva.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

µg

g-1 t

kiva

20 mg kg-1

CTN

BUBREG

JETRA

MOZAK

60

Slika 5-10 Koncentracije citrinina i okratoksina A u bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja i

životinja tretiranih s okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1)

posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Koncentracije OTA i CTN-a izmjerene su u bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s OTA

(125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i CTN-om (20 mg kg-1) posljednja dva dana pokusa. U

kontrolnim životinjama nije uvrđena prisutnosti OTA i CTN-a. Najveća koncentracija CTN-a

izmjerena je u bubregu (9,71±0,79 i 13,67±0,87 µg g-1 tkiva), u jetri je koncentracija CTN-a

iznosila 7,02±1,13 i 8,33±1,28 µg g-1 tkiva, a u mozgu 0,25±0,09 i 0,30±0,09 µg g-1 tkiva.

Koncentracija OTA izmjerena u bubregu iznosila je 1,00±0,26 i 0,80±0,12 µg g-1 tkiva, u jetri

0,94±0,40 i 1,56±0,74 µg g-1 tkiva, a u mozgu 0,04±0,001 i 0,08±0,03 µg g-1 tkiva.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

125 + 20 250 + 20 125 + 20 250 + 20

CTN OTA

µg

g-1 t

kiva

OTA+CTN

BUBREG

JETRA

MOZAK

61

Slika 5-11 Koncentracije citrinina i okratoksina A u bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja i

životinja tretiranim s okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) i resveratrolom (20 mg kg-1) tijekom 21

dan i citrininom (20 mg kg-1) tijekom posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao srednja

vrijednost ± standardna devijacija.

Koncentracije OTA i CTN-a izmjerene su u bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s OTA

(125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1) tijekom 21 dan i CTN-om (20 mg kg-1) posljednja

dva dana pokusa. U kontrolnim životinjama nije uvrđena prisutnosti OTA i CTN-a.

Koncentracija CTN-a izmjerena je u bubregu iznosila je 10,26±0,75 i 7,33±0,64 µg g-1 tkiva, u

jetri 5,79±1,01 i 8,22±0,69 µg g-1 tkiva, a u mozgu 0,24±0,05 i 0,20±0,004 µg g-1 tkiva.

Koncentracija OTA izmjerena u bubregu iznosila je 0,70 ±0,13 i 1,57±0,25 µg g-1 tkiva, u jetri

1,84±0,18 i 0,95±0,06 µg g-1 tkiva, a u mozgu 0,03±0,02 i 0,07±0,005 µg g-1 tkiva.

0

2

4

6

8

10

12

125 + 20 + 20 250 + 20 + 20 125 + 20 + 20 250 + 20 + 20

CTN OTA

µg

g-1 t

kiva

OTA+CTN+RSV

BUBREG

JETRA

MOZAK

62

5.3 Oksidacijsko oštećenje

5.3.1 Malondialdehid

Koncentracija malondialdehida (MDA) u preliminarnom pokusu mjerena je u urinu, bubregu i

jetri pokusnih životinja tretiranih s OTA (250 i 500 µg kg-1 tm) i uspoređena s vrijednostima u

kontrolnim životinjama.


Slika 5-12 Koncentracija malondialdehida u preliminarnom pokusu u urinu, bubregu i jetri kontrolnih

životinja (0; n=4) i životinja tretiranih okratoksinom A (250 i 500 µg kg-1 tm; n=4). Rezultati su

prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Nakon tretmana s OTA (250 i 500 µg kg-1 tm tijekom 10 dana) izmjerena je koncentracija

MDA u urinu, bubregu i jetri (Slika 5-12). Koncentracija MDA bila je značajno promijenjena u

urinu (0,60±0,15 µmol g-1 kreatinina) te jetri (261,23±10,30 nmol g-1 tkiva) nakon tretmana s

višom koncentracijom OTA u odnosu na kontrolu (1,59±0,43 µmol g-1 kreatinina i

127,57±19,61 nmol g-1 tkiva).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 250 500

µm

ol g

-1 k

reat

inin

a

MDA

URIN

0

50

100

150

200

250

300

0 250 500

nm

ol g

-1 t

kiva

MDA

BUBREZI

JETRA

*

*

63

Koncentracija MDA mjerena je u plazmi, bubregu, jetri i mozgu pokusnih životinja tretiranih s

OTA, CTN-om i RSV-om i uspoređena s vrijednostima u kontrolnim životinjama.

1 različito od koncentracije MDA u kontroli (p<0,05)

Slika 5-13 Koncentracija malondialdehida u plazmi, bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja (0,

n=4) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm; n=4) tijekom 21 dan. Rezultati su

prikazani kao postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

Nakon tretmana s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm tijekom 21 dan) izmjerena je koncentracija MDA

u plazmi, bubregu, jetri i mozgu (Slika 5-13). Značajna promjena koncentracije MDA (p<0,05)

nađena je u bubregu životinja koje su tretirane s obje doze OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) (145

odnosno 170%) u odnosu na kontrolne životinje u kojima je koncentracija MDA iznosila

24,95±2,46 nmol g-1 tkiva.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

KONTROLA PLAZMA BUBREG JETRA MOZAK

% k

on

tro

le (

nm

ol g

-1 t

kiva

)

OTA

125

250

1 1

64

1 različito od koncentracije MDA u plazmi, p<0,05


n=4) i životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm; n=4) tijekom dva dana. Rezultati su prikazani kao

postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

Rezultati pokusa u kojem su životinje tretirane CTN-om (20 mg kg-1 tm) tijekom dva dana

prikazani su na slici 5-14 Značajno viša koncentracija MDA izmjerena je u mozgu životinja

koje su tretirane s CTN-om (20 mg kg-1) u odnosu na plazmu (113, odnosno 91% u usporedbi s

kontrolnim životinjama).

0

20

40

60

80

100

120

140


% k

on

tro

le (

nm

ol g

-1 t

kiva

) CTN

1

65

1 različito od koncentracije MDA u kontroli, p<0,05

2 različito od koncentracije MDA u mozgu životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA, p<0,05


n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-

1 tm, n=6) tijekom posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao postotna vrijednost u

odnosu na kontrolu.

Nakon zajedničkog tretmana životinja s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i CTN-om

(20 mg kg-1 tm) posljednja dva dana pokusa primijećen je porast koncentracije MDA u plazmi

(128%), bubregu (194%) i jetri (160%) životinja tretiranih sa 125 µg OTA kg-1 i CTN-om (20 mg

kg-1 tm ) te u plazmi (132%) i jetri (170%) životinja tretiranih s 250 µg kg-1 tm OTA.

Koncentracija MDA u kontralama iznose 15,8±18, 14,1±2,7 i 10,72±2,65 nmol g-1 tkiva (plazma,

bubreg i jetra).

Povećana je i koncentracija MDA u bubregu životinja (tretiranih sa 125 µg OTA kg-1) u odnosu

na koncentraciju MDA u mozgu životinja tretiranih s 250 µg OTA kg-1.

0

50

100

150

200

250


% k

on

tro

le (

nm

ol g

-1 t

kiva

) OTA+CTN

125

250

1, 2 1

1

1

1

1

66

1 različito od koncentracije MDA u kontroli, p<0,

2 različito od koncentracije MDA u plazmi životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA, RSV-om i CTN-om 250, p<0,05

3 različito od koncentracije MDA u plazmi životinja tretiranih s 125 µg kg

-1 OTA, RSV-om i CTN-om, p<0,05


n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm, n=6)

tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm, n=6) tijekom posljednja dva dana pokusa. Rezultati su


U pokusu u kojem su životinje tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm)

tijekom 21 dan te CTN-om (20 mg kg-1 tm) posljednja dva dana pokusa, mjerena je

koncentracija MDA u plazmi, jetri, bubregu i mozgu. Koncentracija MDA značajno se

razlikovala samo u plazmi životinja koje su tretirane s OTA (250 µg kg-1 tm), CTN-om (20 mg

kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm) u odnosu na kontrolne životinje (151%). Koncentracija

MDA u plazmi kontrolnih životinja iznosila je 2,21±0,53 nmol g-1 tkiva. Značajno niža

koncentracija MDA primijećena je i u jetri u odnosu na koncentraciju MDA u plazmi.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


% k

on

tole

(n

mo

l g-1

tki

va)

OTA+CTN+RSV

125

250

2, 3 2

1

67

5.3.2 Glutation

Koncentracija reduciranog glutationa (GSH) mjerena je u plazmi, bubregu, jetri i mozgu

pokusnih životinja tretiranih s OTA, CTN-om i RSV-om i uspoređena s vrijednostima u


1 različito od koncentracije GSH u kontroli, p<0,05

Slika 5-17 Koncentracija glutationa u plazmi, bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja (0, n=4) i

životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan. Rezultati su prikazani

kao postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

Koncentracija GSH izmjerena je u plazmi, bubregu, jetri i mozgu kontrolnih životinja i

životinja tretiranih s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm). U bubregu i mozgu životinja tretiranih s OTA

(250 µg kg-1 tm) izmjereno je značajno sniženje koncentracije GSH U odnosu na kontolne

životinje (69, odnosno 77%). Koncentracija GSH u bubregu i mozgu kontrolnih životinja

iznosila je 0,22±0,02 i 0,46±0,10 µmol g-1 tkiva.

0

20

40

60

80

100

120


% k

on

tole

(µ

mo

l g-1

tki

va)

OTA

125

250

1

1

68

1 različito odkoncentracije GSH u kontroli, p<0,05

2 različito od koncentracije GSH u plazmi, p<0,05


životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 2 dana. Rezultati su prikazani kao postotna

vrijednost u odnosu na kontrolu.

Koncentracije GSH mjerena je u plazmi, bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s CTN-om

(20 mg kg-1 tm) tijekom dva dana. Taj tretman uzrokovao je značajno sniženje koncentracije

GSH u plazmi tretiranih životinja (70%) u odnosu na kontrole. Koncentracija GSH u plazmi

kontrolnih životinja iznosila je 0,20±0,03 μmol g-1 tkiva.

0

20

40

60

80

100

120

140


% k

on

tro

le (

µm

ol g

-1 t

kiva

) CTN

2

1

69

1 različito od koncentracije GSH u kontroli, p<0,05

2 različito od koncentracije GSH u bubregu životinja tretiranih s 125 µg kg

-1 OTA i CTN-om, p<0,05

Slika 5-19 Pokus okratoksin A + citrinin. Koncentracija glutationa u plazmi, bubregu, jetri i mozgu

kontrolnih životinja (0, n=6) i životinja tretiranih okratoksinom A (125 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i

citrininom (20 mg kg-1 tm, n=6) tijekom posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao

postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

Koncentracije GSH mjerena je u plazmi, bubregu, jetri i mozgu životinja tretiranih s OTA (125

i 250 µg kg-1 tm) tijekom 21 dan i CTN-om (20 mg kg-1 tm) tijekom posljednja dva dana

pokusa. Taj tretman uzrokovao je značajno povećanje koncentracije GSH u bubregu životinja

tretiranih s OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN-om u odnosu na kontrole (120%) i sniženje

koncentracije GSH u bubregu (66%) i mozgu (85%) životinja tretiranih s OTA (250 µg kg-1 tm) i

CTN-om (20 mg kg-1 tm) te jetri (70%) životinja tretiranih s OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN-om (20

mg kg-1 tm) u odnosu na kontrolu. Koncentracija GSH u bubregu, jetri i mozgu kontrolnih

životinja iznosila je 0,25±0,04, 0,80±0,04 i 0,73±0,08 μmol g-1 tkiva.

0

20

40

60

80

100

120

140


% k

on

tro

le (

µm

ol g

-1 t

kiva

) OTA+CTN

125

250

1

1, 2 1, 2

1

70

1različito od koncentracije GSH u kontroli, p<0,05

2različito od koncentracije GSH u plazmi, p<0,05

3 različito od koncentracije GSH u bubregu životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA, RSV-om i CTN-om, p<0,05


životinja tretiranih OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm, n=6) tijekom 21 dan i

citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su prikazani kao postotna

vrijednost u odnosu na kontrolu.

U životinja koje su tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm) tijekom 21

dan i CTN-om (20 mg kg-1 tm) tijekom zadnja dva dana pokusa izmjerena je koncentracija

GSH u plazmi, bubregu, jetri i mozgu. Značajno povećanje koncentracije GSH izmjereno je u

bubregu i mozgu životinja tretiranih s OTA (125 µg kg-1 tm), RSV-om (20 mg kg-1 tm) i CTN-

om (20 mg kg-1 tm) u odnosu na kontrolu. Koncentracija GSH bila je snižena (71%) u bubregu

životinja tretiranih s (250 µg kg-1 tm), RSV-om (20 mg kg-1 tm) i CTN-om (20 mg kg-1 tm) u

odnosu na kontrolu. Koncentracija GSH u bubregu i mozgu kontrolnih životinja iznosila je

0,30±0,05 i 0,09±0,02 µmol g-1 tkiva.

0

20

40

60

80

100

120

140


% k

on

tro

le (

µm

ol g

-1 t

kiva

) OTA+CTN+RSV

125

250

2,3 2

1

71

5.3.3 Superoksid dismutaza

1 različito od katalitičke aktivnosti SOD-a u kontroli; p<0,05

2različito od katalitičke aktivnosti SOD-a u plazmi životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA i CTN-om; p<0,05

Slika 5-21 Katalitička aktivnost superoksid dismutaze u plazmi u kontrolnih životinja (KONTROLA,

n=4) životinja tretiranih okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm, n=4) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm,

n=4) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) posljednja dva dana pokusa. Rezultati su


Katalitička aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) izmjerena je u plazmi životinja koje su 21

dan tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm), 21 dan tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i

posljednja dva dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm) te 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-

om (20 mg kg-1 tm) i posljednja dva dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm) te je uspoređena s


Katalitička aktivnost SOD-a smanjila se u plazmi životinja koje su tijekom 21 dan tretirane s

OTA (250 µg kg-1 tm) (61%), u onih koje su zajednički tretirane s OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN-

om (20 mg kg-1 tm) (52%) te plazmi onih životinja (43%) koje su zajednički tretirane s OTA

(250 µg kg-1 tm), CTN-om (20 mg kg-1 tm) i RSV–om (20 mg kg-1 tm) u odnosu na kontrolu. U

životinja koje su tretirane s OTA (250 µg kg-1 tm) i CTN-om (20 mg kg-1 tm) katalitička

0

20

40

60

80

100

120

140

0 125 250 125 + 20 250 + 20 20 250 + 20 + 20

KONTROLA OTA OTA + CTN RSV OTA+CTN+RSV

% k

on

tro

le (

U L

-1)

SOD

1, 2 1, 2

1, 2

1

2

72

aktivnost SOD-a bila je povećana u odnosu na životinje koje su tretirane samo s OTA (250 µg

kg-1 tm), istovremeno s OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN-om (20 mg kg-1 tm) te istovremeno s OTA

(250 µg kg-1 tm), CTN-om (20 mg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm). Katalitička aktivnost SOD-

a u plazmi kontrolnih životinja iznosila je 2.88892 U L-1.

1 različito od katalitičke aktivnosti SOD-a u kontroli, p<0,05

2 različito od katalitičke aktivnosti SOD-a u eritrocitima životinja tretiranih s CTN-om; p<0,05

3 različito od katalitičke aktivnosti SOD-a u eritrocitima životinja tretiranih sa 125 µ kg

-1 OTA, RSV-om i CTN-om;

p<0,05

Slika 5-22 Katalitička aktivnost superoksid dismutaze u eritrocitima kontrolnih životinja (KONTROLA,

n=4), životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 2 dana, životinja istovremeno

tretiranih s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm, n=6) tijekom 21 dan i CTN-om (20 mg kg-1 tm, n=6) posljednja

dva dana pokusa te životinja istovremeno tretiranih s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm, n=4) i RSV-om (20

mg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan te CTN-om (20 mg kg-1 tm, n=4) posljednja dva dana pokusa.

Rezultati su prikazani kao postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 125+20 250+20 20 125+20+20 250+20+20

KONTROLA CTN OTA+CTN RSV OTA+CTN+RSV

% k

on

tro

le (

U g

-1 H

b)

SODe

2,3 1, 2, 3

73

Katalitička aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) izmjerena je u eritrocitima životinja koje su

dva dana tretirane CTN-om (20 mg kg-1 tm), 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) te dva dana

CTN-om i 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm) te zadnja dva

dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm) i uspoređena s kontrolnim životinjama.

Povećana katalitička aktivnost SOD-a u izmjerena je u eritrocitima životinja koje su

istovremeno tretirane s OTA (250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm) (107%) tijekom 21

dan i CTN-om (20 mg kg-1 tm) (129%) posljednja dva dana pokusa u odnosu na kontrolne

životinje. Katalitička aktivnost SOD-a u eritrocitima kontrolnih životinja iznosila je 4.382±171

U g-1.

74

5.3.4 Katalaza

Slika 5-23 Katalitička aktivnost katalaze u plazmi kontrolnih životinja (KONTROLA, n=4), životinja

tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 2 dana, životinja istovremeno tretiranih s

okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm, n=6) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm, n=6) posljednja

dva dana pokusa te životinja istovremeno tretiranih s okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm, n=4) i

resveratrolom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) posljednja dva

dana pokusa. Rezultati su prikazani kao postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

Katalitička aktivnosti katalaze (CAT) izmjerena je u plazmi životinja koje su 21 dan tretirane s

OTA (125 i 250 µg kg-1 tm), 21 dan tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i posljednja dva

dana s CTN-om te 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm) i zadnja dva

dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm) te uspoređena s kontrolnim životinjama. Nije primijećena

statistička značajnost katalitičke aktivnosti katalaze između pojedinih tretiranih skupina.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 125 250 125+20 250+20 20 250+20+20

KONTROLA OTA OTA+CTN RSV OTA+CTN+RSV

% k

on

tro

le (

U m

L-1)

CAT

75

1različito od katalitičke aktivnosti katalaze u eritrocitima kontrola, p<0,05

2 različito od katalitičke aktivnosti katalaze u eritrocitima životinja tretiranih s CTN-om, p<0,05

Slika 5-24 Katalitička aktivnost katalaze u eritrocitima kontrolnih životinja (KONTROLE), životinja dva

dana tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm), životinja istovremeno 21 dan tretiranih okratoksinom A

(125 µg kg-1 tm) i posljednja dva dana citrininom (20 mg kg-1 tm) te životinja istovremeno tretiranih

21 dan okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm) i posljednja dva dana

citrininom (20 mg kg-1 tm). Rezultati su prikazani kao postotna vrijednost u odnosu na kontrolu.

U eritrocitima pokusnih životinja koje su dva dana tretirane CTN-om (20 mg kg-1 tm),

istovremeno 21 dan tretirane s OTA (125 µg kg-1 tm) i posljednja dva dana s CTN-om (20 mg

kg-1 tm) te životinja istovremeno tretiranih 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm), RSV-om (20

mg kg-1 tm) i CTN-om (20 mg kg-1) tm izmjerena je katalitička aktivnost CAT-a te je

uspoređena s kontrolnim životinjama. Smanjena katalitička aktivnost katalaze (61%)

primijećena je u eritrocitima životinja tretiranih s CTN-om (20 mg kg-1 tm) u odnosu na

kontrole. Katalitička aktivnost katalaze u eritrocitima kontrola iznosila je 33,30 U g-1 Hb.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 125+20 250+20 20 125+20+20 250+20+20

KONTROLA CTN OTA+CTN RSV OTA+CTN+RSV

% k

on

tro

le (

U g

-1 H

b)

CATe

1

2

2

76

5.3.5 Glutation peroksidaza

Slika 5-25 Katalitička aktivnost glutation peroksidaze u krvi kontrolnih životinja (KONTROLA, n=4) i

životinja tretiranih citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4), istovremeno tretiranih okratoksinom A (125 i 250

µ kg-1 tm, n=6) i citrininom (20 mg kg-1 tm, n=6) te istovremeno tretiranih okratoksinom A (125 i 250

µ kg-1 tm, n=4), citrininom (20 mg kg-1 tm, n=4) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm, n=4).

Katalitička aktivnost glutation peroksidaze (GPx) izmjerena je u plazmi životinja koje su

tretirane dva dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm), 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i dva dana s

CTN-om (20 mg kg-1 tm) i 21 dan s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1 tm) i dva

dana s CTN-om (20 mg kg-1 tm) te je uspoređena s kontrolnim životinjama. Katalitička

aktivnost GPx-a nije se promijenila niti u jednoj od tretiranih skupina.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 125+20 250 + 20 125+20+20 250+20+20

KONTROLA CTN OTA+CTN OTA+CTN+RSV

% k

on

tro

le (

U g

-1 H

b)

GPx krv

77

5.3.6 hOGG1

Oštećenje DNA mjereno je hOGG1 komet testom koji je specifičan za mjerenje oksidacijskog

oštećenja baza u DNA. Kao paramatri razine oštećenja mjereni su duljina i intenzitet repa

kometa na nukleoidima stanica bubrega i jetre.

Tablica 5-5 Duljina i intenzitet repa kometa u stanicama bubrega i jetre životinja koje su tretirane

okratoksinom A (125 i 250 µg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan dobiveni primjenom komet testa uz

primjenu hOGG1.

Duljina repa (µm) ± S.D. % DNA u repu (intenzitet) ± S. D.

Tkivo Skupina Pufer hOGG1

enzim Razlika Pufer hOGG1 enzim Razlika

Bubreg

Kontrola 11.1±5.4 11.6±2.9 0.5±2.6 1.3±3.2 1.9±6.9 0.5±3.7

125 12.6±3,0 12.79±5.99 0.2±3.0 1.8±5.2 2.37±4.36 0.5±0.86

250 13.0±2.6 13.3±6.18 0.3±3.6 2.05±2.3 2.6±5.96 0.55±3.6

Jetra

Kontrola 12,0±3.5 13.0±1.9 1.06±1.56 0.79±6.2 1.3±1.69 0.5±4.49

125 12.1±3,0 15.05±2.08 2.9±0.9 1.9±4.78 1.5±1.1 0.57±3.67

250 12.5±4.5 14.75±4.99 2.3±0.5 2.1±2.0 2.55±1.89 0.4±0.1

U pokusu u kojem su životinje tretirane samo s OTA nije primijećena značajna razlika u

vrijednosti duljine i intenziteta repa kometa u stanicama bubrega i jetre između kontrolnih

životinja i životinja tretiranih s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm).

Tablica 5-6 Duljina i intenzitet repa kometa u stanicama bubrega i jetre životinja tretiranih CTN-om

(20 mg kg-1 tm, n=4) dva dana dobiveni primjenom komet testa uz primjenu hOGG1.

Duljina repa ± S.D. % DNA u repu (intenzitet) ± S. D.

Tkivo Skupina Pufer hOGG1 Razlika Pufer hOGG1 Razlika

Bubreg Kontrola 11,31±0,36 13,48±0,81 2,17±1,17 1,09±1,33 1,81±2,35 0,72±1,02

20 11,51±2,11 15,25±4,63 3,74±2,52 1,14±0,51 2,79±0,83 1,65±0,32*

Jetra Kontrola 10,48±1,46 12,82±3,05 2,34±1,59 1,03±0,29 2,09±0,69 1,06±0,40

20 12,35±1,52 15,24±3,49 2,89±1,90 1,15±0,35 2,17±0,57 1,02±0,22

*Različito od kontrole (p<0,05).

78

U pokusu u kojem su životinje tretirane samo s CTN-om (20 mg kg-1 tm) uočeno je značajno

povećanje intenziteta repa kometa u bubrezima tretiranih životinja u odnosu na kontrolne

(1,650,32% i 0,721,02%; p<0,05). Duljina repa kometa nije bila različita u tretiranih

životinja u odnosu na kontrole. U stanicama jetre nisu nađene razlike u vrijednosti

intenziteta i duljine repa kometa u tretiranih životinja u usporedbi s kontrolama.

Tablica 5-7 Duljina i intenzitet repa kometa u stanicama bubrega i jetre kontrolnih životinja (0) i

životinja tretiranih okratoksinom A (125 µg kg-1 tm, n=6) tijekom 21 dan i citrininom (20 mg kg-1 tm,

n=6) tijekom posljednja dva dana pokusa dobiveni primjenom komet testa uz primjenu hOGG1.

Duljina repa (µm) ± S.D. % DNA u repu (intenzitet) ± S. D.

Tkivo Skupina Pufer hOGG1 enzim

Razlika Pufer hOGG1 enzim

Razlika

Bubreg

Kontrola 12,3±0,2 12,6±0,5 0,34±0,3 1,51±0,67 1,99±0,65 0,48±0,02

125 11,9±1,4 14,3±1,5* 2,37±0,1* 1,4±1,04 5,3±1,6** 3,9±0,5**

Kontrola 18,3±6,3 18,7±5,8 0,40±0,5 1,4±5,1 1,90±5,80 0,50±0,70

250 24,0±10,2 25,8±11,1 1,8±0,9 9,0±9,5 14,6±10,1** 5,6±0,6**

Jetra

Kontrola 12,5±1,03 12,5±1,04 0,00±0,01 0,72±0,10 1,04±0,11 0,32±0,01

125 12,9±0,8 13,3±0,8 0,44±0,01 0,98±0,68 4,10±0,82** 3,1±0,14**

Kontrola 20,4±6,6 21,2±4,2 0,80±2,40 1,40±6,20 1,80±3,40 0,40±2,80

250 24,8±10,6 37,4±9,3** 12,6±1,3** 5,9±10,0 35,0±9,9** 29,1±0,1**


**Različito od kontrole (p<0,001).

U pokusu u kojem su životinje su istovremeno tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i CTN-

om (20 mg kg-1 tm) uočen je značajan porast vrijednosti parametara hOGG1 komet testa u

odnosu na kontrolnu skupinu. Duljina repa kometa izmjerena u stanicama bubrega životinja

koje su tretirane s OTA (125 µg kg-1 tm) i CTN-om (20 g kg-1 tm) bila je značajno viša

(14,31,5 µm), nego u kontrolnim životinjama (12,60,5 µm; p<0,05). Duljina repa kometa

bila je značajno viša (37,49,3 µm) u stanicama jetre životinja koje su tretirane višom dozom

OTA (250 µg kg-1 tm) i CTN-om (20 mg kg-1 tm) od duljine repa kometa u kontrolnim

životinjama (21,204,2 nm; p<0,001). Duljina repa kometa nije se značajno povećala u

stanicama bubrega životinja koje su tretirane s 250 µg OTA kg-1 tm i CTN-om (20 mg kg-1 tm)

kao niti u stanicama jetre životinja koje su tretirane sa 125 µg OTA kg-1 tm i CTN-om (20 mg

kg-1 tm).

79

U stanicama bubrega životinja koje su tretirane s 125 i 250 µg kg-1 tm i CTN-om (20 mg kg-1

tm) intenzitet repa kometa bio je značajno viši (5,31,5% i 14,610,1%, p<0,001), negoli u

kontrola (2,00,6% i 1,95,8%, p<0,001). Intenzitet repa kometa u stanicama jetre životinja

tretiranih s navedenim dozama OTA i CTN-a (4,10,8% i 35,09,9%) bio je također značajno

veći (p<0,001) u odnosu na kontrolne životinje (1,00,1% i 1,83,4%).

Tablica 5-8 Duljina i intenzitet repa kometa u stanicama bubrega i jetre kontrolnih životinja (0),

životinja tretiranih resveratrolom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan, životinja tretiranih

okratoksinom A (250 µg kg-1 tm, n=4) i resveratrolom (20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom 21 dan i citrininom

(20 mg kg-1 tm, n=4) tijekom dva dana dobiveni primjenom komet testa uz primjenu hOGG1.

Duljina repa (µm) ± S.D. % DNA u repu (intenzitet)

± S. D.

Tkivo Skupina Pufer hOGG1

enzim Razlika Pufer

hOGG1

enzim Razlika

Bubreg

Kontrola 15,7±3,3 19,3±3,8 3,6±0,5 0,7±1,8 2,2±2,8 1,5±1,0

RSV 14,6±1,6 17,4±2,2 2,8±0,6 0,3±0,5 1,3±1,0 1,0±0,5

125 15,0±1,4 16,0±5,4 1,0±4,0 0,3±0,5 1,5±4,4* 1,2±3,9*

Kontrola 15,9±2,2 18,0±2,8 2,1±0,6 0,9±1,9 1,7±2,4 0,8±0,5

RSV 16,7±2,6 17,1±2,1 0,4±0,5 0,8±1,3 1,4±1,4 0,6±0,1

250 16,9±2,7 25,1±3,1* 8,2±0,4* 3,5±2,7 14,9±5,8** 11,4±3,1**

Jetra

Kontrola 16,2±2,2 17,0±2,7 0,8±0,5 0,4±0,6 0,9±1,4 0,5±0,8

RSV 16,0±2,5 18,5±2,3 2,5±0,2 0,2±0,6 1,2±0,8 1,0±0,2

125 16,0±2,4 16,4±3,1 0,4±0,7 0,3±0,6 0,7±1,1 0,4±0,5

Kontrola 18,0±3,3 21,6±3,2 3,6±0,1 0,7±1,3 1,3±1,4 0,6±0,1

RSV 17,1±2,4 18,4±2,5 1,3±0,1 0,6±1,1 1,5±1,3 0,9±0,2

250 14,8±3,2 21,0±2,8** 6,2±0,4** 0,6±1,7 3,9±3,0* 3,3±1,3*


**Različito od kontrole (p<0,001).

U pokusu u kojem su životinje tretirane s OTA, CTN-om (20 mg kg-1 tm) i RSV-om (20 mg kg-1

tm) duljina repa kometa u stanicama bubrega bila je značajno veća (p<0,05) u životinja koje

80

su tretirane višom dozom OTA (25,13,1 µm), negoli u kontrolnih životinja (18,02,8 µm). U

jetri je značajna razlika (p<0,001) nađena također u životinja koje su bile tretirane većom

dozom OTA, CTN-om i RSV-om (21,02,8 µm), nego u kontrolnim životinjama (21,63,2 µm).

Srednja vrijednost intenzitet repa kometa u stanicama bubrega životinja koje su tretirane sa

125 µg OTA kg-1 tm, CTN-om i RSV-om bila je (1,54,4%) značajno viša u odnosu na kontrole

(p<0,05). Značajnost razlike bila je veća (p<0,001) u stanicama bubrega životinja koje su

tretirane uz CTN i RSV većom dozom OTA (14,95,8%) u usporedbi s kontrolom (1,72,4%).

U jetri je srednja vrijednost intenziteta repa kometa bila značajno viša (p<0,05) kod životinja

koje su tretirane višom dozom OTA, CTN-om i RSV-om (3,93,0%) od kontrola (1,31,4%).

1 različito od pufera, p<0,05 2 različito od duljine repa kometa u stanicama bubrega životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA, p<0,05

Slika 5-26 Usporedba duljine repa kometa u stanicama bubrega između pojedinih skupina tretiranih mikotoksinima i resveratrolom u odnosu na tretman puferom.

020406080

100120140160180

% p

ufe

ra

hOGG1

1,2

1 1,2

81

1

različito od pufera, p<0,05 2 različito od duljine repa kometa u stanicama bubrega životinja tretiranih sa 125 µg kg

-1 OTA, CTN-om i RSV-

om, p<0,05

Slika 5-27 Usporedba duljine repa kometa u stanicama jetre između pojedinih skupina tretiranih mikotoksinima i resveratrolom u odnosu na tretman puferom.

1 različito od pufera, p<0,05

2 različito od duljine repa kometa u stanicama bubrega životinja tretiranih s 250 µg kg

-1 OTA, p<0,05

Slika 5-28 Usporedba intenziteta repa kometa u stanicama bubrega između pojedinih skupina tretiranih mikotoksinima i resveratrolom u odnosu na tretman puferom.

020406080

100120140160180

% p

ufe

ra

hOGG1

0

100

200

300

400

500

600

700

% p

ufe

ra

hOGG1

1 1, 2

1

1

1

1,2

1

82

1 različito od pufera


-1 OTA, p<0,05


-1 OTA, p<0,05

4 različito od duljine repa kometa u stanicama bubrega životinja tretiranih s CTN-om, p<0,05

Slika 5-29 Usporedba intenziteta repa kometa u stanicama jetre između pojedinih skupina tretiranih mikotoksinima i resveratrolom u odnosu na tretman puferom.

0

100200

300400

500600

700800

% p

uh

era

hOGG1

1, 2, 3, 4

1, 2, 3, 4

1, 2, 3 1, 2, 3

1, 2, 3

1, 2, 3

83

6 RASPRAVA

OTA pripada najviše proučavanim i najtoksičnijim mikotoksinima za razliku od CTN-a koji je

među najmanje proučavanim mikotoksinima, a po toksičnosti je na samom dnu ljestvice

(Hesseltine, 1986). Za OTA je utvrđeno da uzrokuje svinjsku nefropatiju (Krogh, 1972), a zbog

sličnosti patohistoloških nalaza bubrega svinja oboljelih od svinjske nefropatije i ljudi

oboljelih od BEN-a pretpostavljeno je da bi OTA mogao biti uzročnik BEN-a kao i tumora

gornjeg dijela mokraćnog sustava koji se daleko češće pojavljuju u području s BEN-om, negoli

u drugim krajevima Hrvatske. Ta je pretpostavka potaknula istraživanja mehanizma

djelovanja i izloženosti ljudi tom mikotoksinu, a u Hrvatskoj je, osim u žitaricama, pronađen u

grahu (Cvetnić i Pepeljnjak, 1989; Domijan i sur., 2005a) i vinu (Domijan i Peraica, 2005b;

Flajs i sur., 2009). Dokazano je da je nefrotoksičan i da uzrokuje maligne tumore bubrega u

štakora (NTP, 1989). Na temelju tog i drugih istraživanja IARC je procijenio da je OTA sigurni

kancerogen za pokusne životinje (IARC, 1993). Zbog nedostatka epidemioloških istraživanja

svrstan je kao mogući kancerogen za ljude u skupinu 2B.

CTN je ponovo dobio na važnosti kada je primijećeno da OTA i CTN sintetiziraju isti rodovi

plijesni (Aspergillus i Penicillium) te da se pojavljuju zajedno u žitaricama za ljudsku i

životinjsku prehranu (Scott i sur., 1972; Abd Alla, 1996; Nguyen i sur., 2007; Bragulat i sur.,

2008; Šegvić Klarić, 2012). Dokazano je da je CTN nefrotoksičan u svim ispitnim vrstama

(Hanika i Carlton, 1994; Carlton i Tuite, 1977). Zbog nefrotoksičnosti i zajedničkog

pojavljivanja s OTA pretpostavljeno je da je jedan od uzročnika BEN-a (Krogh 1974, Stoev,

2008). Zbog zajedničkog nalaza u uzorcima hrane, kao i zbog pretpostavke da bi ta dva

mikotoksina mogla imati sinergistički i nefrotoksični učinak i uzrokovati BEN, istraživan je

zajednički učinak OTA i CTN u uvjetima in vitro i in vivo.

U većini istraživanja in vitro na stanicama sisavaca primijećeno je da je citotoksično

djelovanje OTA i CTN-a sinergistično (Creppy i sur., 1980, Heussner i sur., 2006, Bouslimi i

sur., 2008, Šegvić Klarić i sur., 2012). Pojačani citotoksični učinak ovih mikotoksina nakon

zajedničkog tretmana nije primijećen na epitelnim stanicama mokraćnog mjehura svinje

(Föllmann i sur., 2000).

84

U preglednom članku Speijers i Speijers (2004) navode mnoštvo radova u kojima su istraženi

učinci OTA i CTN-a uglavnom na kulturama stanica i pilećem embriju, a rjeđe na pokusnim

životinjama (Speijers i Speijers, 2004). Rezultati tih istraživanja nisu jednoznačni jer su neki

istraživači našli da OTA i CTN imaju aditivno, drugi sinergističko, a neki čak i antagonističko

djelovanje. U navedenim pokusima istraživana je citotoksičnost, genotoksičnost,

kancerogenost i teratogenost navedenih mikotoksina. Autori su istraživali njihov učinak na

proteinsku sintezu, ionski transport, histološku strukturu bubrega i smrtnost pokusnih

životinja, no ne i oksidacijski stres kao mogući mehanizam toksičnosti.

U dosadašnjim je istraživanjima primijećeno morfološko oštećenje bubrega koje je ovisilo o

dozi OTA s kojom su tretirane životinje (Žlender i sur., 2009, Kumar i sur., 2007, Gekle i sur.,

1993). U istraživanju kojeg smo proveli na odraslim muškim štakorima primijetili smo

dominantno oštećenje S3 segmenta proksimalnog kanalića bubrega, no oštećenje je bilo

vidljivo u cijelom nefronu (Žlender i sur., 2009). U ovom smo pokusu mjerili i koncentraciju

OTA u urinu, bubrezima i jetri koja je ovisila o dozi s kojom su životinje tretirane. Najveću

koncentraciju OTA primijetili smo u jetri što je u skladu s enterohepatičkom cirkulacijom

(Fuchs i sur., 1988a). Budući da je oksidacijski stres jedan od predloženih mehanizama

toksičnosti OTA, mjerili smo i koncentraciju MDA (urin, jetra i bubrezi) kao parametra

peroksidacije lipida. Značajno povećana koncentracija MDA izmjerena je samo u jetri

životinja tretiranih višom dozom OTA (500 µg kg-1 tm). Ovaj rezultat može se objasniti

duljinom tretmana (10 dana) i time da je jetra zbog enterohepatičke cirkulacije u tako

kratkom vremenu vjerojatno bila najizloženija djelovanju OTA.

U istraživanjima in vitro na stanicama sisavaca za oba mikotoksina je utvrđeno da uzrokuju

oksidacijski stres (Schaaf i sur. 2002; Ribeiro i sur. 1997; Johannessen i sur. 2007).

Mehanizam djelovanja CTN-a je nepoznat, podaci o zajedničkom djelovanju OTA i CTN-a su

proturječni, a istraživanja provedenih na životinjama je malo. Zbog toga je jedan od ciljeva

ovog rada bio utvrditi važnost oksidacijskog stresa u mehanizmu toksičnosti CTN-a u

pokusnim životinjama. Budući da je poznato da je jedan od mehanizama djelovanja OTA

povećanje nastanka ROS-ova i oksidacijski stres, a neki autori smatraju da bi to mogao biti i

mehanizam djelovanja CTN-a drugi je cilj istraživanja bio istražiti uzrokuje li istovremena

izloženost ovim mikotoksinima potencirajuće toksično djelovanje. Učinak pojedinačnog i

zajedničkog djelovanja OTA i CTN-a na oksidativni stres u tkivima životinja određen je na tri

načina: mjerenjem koncentracije GSH i katalitičke aktivnosti antioksidacijskih enzima (SOD,

85

CAT i GPx) kao izravnog pokazatelja obrane stanice protiv oksidacijskog stresa, mjerenjem

koncentracije MDA kao pokazatelja peroksidacije lipida i mjerenjem razine oksidacijskog

oštećenja baza DNA (komet test uz korištenje enzima popravka hOGG1).

RSV je poznati antioksidans čija je učinkovitost dokazana in vitro i in vivo (Bertelli, 2007). Da

bi se istražilo njegovo moguće djelovanje u sprečavanju nastanka oksidacijskog oštećenja

uzrokovanog s OTA i CTN-om, skupine životinja koje su tretirane tim mikotoksinima tretirane

su i RSV-om.

Bubrezi i jetra su primarni organi citotoksičnog djelovanja OTA i CTN-a i kancerogenog

djelovanja OTA. Citotoksični učinak OTA primijećen je i u mozgu pokusnih životinja

(Belmadani i sur. 1999). Stoga su parametri oksidacijskog stresa – MDA i GSH praćeni u

plazmi, bubrezima, jetri i mozgu. Aktivnost antioksidacijskih enzima mjerena je u punoj krvi,

plazmi i eritrocitima, a oksidacijsko oštećenje DNA u stanicama bubrega i jetre.

Dva najvažnija enzima koji sudjeluju u detoksikaciji superoksid radikala su superoksid

dismutaza i glutation peroksidaza. SOD katalizira reakciju dismutacije superoksid radikala

(O2·-) u vodikov peroksid (H2O2) dok GPx katalizira redukciju (u ovom slučaju detoksikaciju)

vodikovog peroksida u vodu i istovremenu oksidaciju reduciranog oblika glutationa (GSH) u

oksidirani oblik (GSSG). Većina katalitičke aktivnosti SOD-a u krvi odvija se u eritrocitima dok

je u serumu i plazmi aktivnost ovog enzima znatno manja (Sun i sur., 1988). Katalitičku

aktivnost enzima SOD-a inhibira povećana koncentracija superoksidnih radikala u stanici.

Glutation peroksidaze su skupina filogenetski srodnih enzima koji kataliziraju redukciju H2O2

ili organske vodikove perokside u vodu ili pripadajući alkohol koristeći GSH kao reducens

(Brigelius-Flohé i Maiorino, 2012). Katalitička se aktivnost GPx-a u prisutnosti povećane

koncentracije vodikovog peroksida smanjuje, a tijekom te reakcije GSH se oksidira u GSSG.

Katalaza je enzim koji se u životinja nalazi najvećim dijelom u peroksisomima, a malo je ima u

mitohondrijima i endoplazmatskom retikulumu. Najveći dio redukcije H2O2 odvija se u

peroksisomima pri čemu se aktivnost katalaze smanjuje.

U našim prijašnjim istraživanjima upotrebnom standardnog i Fpg-mogificiranog

(formamidopirimidin-DNA-glikozilaza) komet testa nađeno je da čak i male doze OTA (5, 50 i

500 ng kg-1 tm) uzrokuju oksidacijsko oštećenje DNA, no oksidacijski stres nije jedini

mehanizam uključen u genotoksičnost i kancerogenost DNA (Domijan, i sur., 2006). hOGG1

je, za razliku od Fpg modificiranog komet testa, specifičan za 8-oksoGua

(hidroksideoksogvanin) i metil FapiGua (formamidogvanin). hOGG1 popravlja ove oksidirane

86

baze samo kada su u paru s citozinom zbog čega je hOGG1 specifičniji nego Fpg koji

prepoznaje 8-oksoGua sparene s citozinom, gvaninom ili timidinom (Smith i sur., 2006). U

pokusima prikazanima u ovom doktorskom radu za dokazivanje specifičnog oksidacijskog

oštećenja DNA korišten je hOGG1 komet test u životinja koje su bile izložene pojedinačnom i

zajedničkom djelovanju OTA i CTN-a.

U dvogodišnjem istraživanju na miševima svakodnevno izlaganima 40 µg OTA kg-1 tm, svih 50

tretiranih mužjaka razvilo je simptome nefropatije, a 31 karcinome ili adenome. Kada je isti

broj ženki tretiran s OTA, samo je kod malog broja nađena nefropatija, a kod nijedne

karcinom ili adenom (Bendele i sur. 1985). U dvogodišnjem istraživanju na štakorima, pri

svakodnevnim dozama OTA od 210 µg kg-1 tm ili 70 µg kg-1 tm, 72% mužjaka i 16% ženki,

odnosno 39% mužjaka i 4% ženki razvilo je renalne adenome ili karcinome (Boorman 1989).

Budući da su mužjaci štakora znatno osjetljiviji na nefrotoksično djelovanje OTA nego ženke,

naše istraživanje provedeno je na odraslim mužjacima.

Primijenjene doze oba mikotoksina daleko su veće od dnevnog unosa tih mikotoksina

europskog stanovništva što je primjereno za istraživanje mehanizma njihovog toksičnog

djelovanja. U našem su istraživanju životinje dobivale 125 i 250 µg OTA kg-1 tm jer je u našim

prijašnjim istraživanjima nađeno da pri toj dozi primijenjenoj 21 dan dolazi do promjena

nekih parametara oksidacijskog stresa. Dnevna doza RSV-a (20 mg kg-1 tm) odabrana je

prema literaturnim podacima.

Mikotoksini su u organizam unošeni oralno jer su ljudi i životinje ovim mikotoksinima

najčešće izloženi kontaminiranom hranom.

Različito trajanje tretmana s OTA i CTN-om odabrano je zbog razlike u toksikokinetici. Naime,

OTA se dobro apsorbira i dugotrajno zadržava u organizmu zbog vezanja na albumine plazme

i druge proteine kao i zbog enterohepatičke cirkulacije, a toskični se učinci razvijaju sporo

(Chu i sur. 1971; Fuchs i sur. 1988b). Za razliku od OTA, samo se manji dio CTN-a apsorbira u

probavnom sustavu i brzo se izlučuje iz organizma (Hesseltine, 1986).

U našim smo pokusima tijekom tretmana od 21 dan svakodnevno mjerili masu životinja, a

budući da su oba korištena mikotoksina nefrotoksični spojevi, svaki smo treći dan mjerili i

volumen izlučenog urina. Tijekom pokusa nije bilo ugibanja životinja, a masa životinja

postepeno je rasla što je u skladu s našim prijašnjim istraživanjima (Domijan i sur., 2004a).

Porast tjelesne mase životinja ovisio je o njihovoj masi na početku pokusa. U životinja kojima

je masa na početku pokusa bila oko 300 grama porasla je tijekom tri tjedna pokusa za 10-20

87

grama pa su dosegli uobičajenu tjelesnu masu štakora u odrasloj dobi. Štakori koji su na

početku pokusa imali manju tjelesnu masu (270-290 grama), imali su veći porast tjelesne

mase do kraja pokusa te su tada dostigli masu od 310-320 grama. Najveći porast tjelesne

mase zabilježen je u životinja koje su na početku pokusa imale 230-250 grama, dok su krajem

pokusa dostigle masu od oko 300 grama.

Arai i Hibino (1983) pratili su promjenu tjelesne mase muških štakora tretiranih CTN-om

tijekom 80 tjedana te primijetili da je povećanje tjelesne mase životinja tretiranih CTN-om

manje od povećanja tjelesne mase kontrolnih životinja. U našem istraživanju nije nađena

razlika u masi tretiranih i kontrolnih životinja jer je pokus prekratko trajao da bi se tretman

mogao odraziti na njihovu masu.

Domijan i sur. (2004a) su u istraživanju provedenom na štakorima tretiranim ip s 500 µg OTA

kg-1 tm tijekom četiri tjedna primijetili povećanje volumena urina dvanaesti dana tretmana,

nakon čega se vratio na početne vrijednosti do kraja tretmana. U ovom je doktorskom radu,

24-satni urin sakupljan svaki treći dan pokusa, počevši s danom prije prvog tretmana

toksinima, a zadnji je uzorak urina sakupljan tijekom 24 sata prije žrtvovanja životinja. Nije

primijećena pravilnost u izlučivanju urina tijekom tretmana, a niti razlika u kontrolnim i

tretiranim skupinama. Razlika u izlučivanju urina u ovom radu i prije opisanom radu Domijan

i sur. (2004a) vjerojatno je nastala zato što su u ovom istraživanju korištene manje doze OTA

(125 i 250 µg kg-1 tm) a pokus je trajao kraće pa nisu mogla nastati oštećenja bubrega koja bi

se očitovala promjenom izlučivanja urina.

U ovom istraživanju izmjerena je koncentracija OTA i CTN-a u bubregu, jetri i mozgu životinja

nakon različitih tretmana. Nakon tretmana pokusnih životinja s OTA i CTN-om (Slika 5-10)

koncentracija OTA u bubregu i jetri bila je niža nego u životinja koje su tretirane samo s OTA

(Slika 5-8) dok je koncentracija CTN-a bila viša nego u životinja koje su dobile sam CTN.

Budući da se nakon zajedničkog tretmana koncentracija CTN-a znatno povećava ovisno o

dozi primijenjenog OTA, može se pretpostaviti da OTA omogućava ulazak CTN-a u stanice.

Meki i Hussein su nakon tretmana štakora 250 OTA µg kg-1 tm gastričnom sondom dnevno

tijekom četiri tjedna našli povećanu koncentraciju MDA u serumu, jetri i bubrezima u odnosu

na kontrolnu skupinu (Meki i Hussein, 2001).

Petrik i sur. (2003) tretirali su štakore s OTA (120 µg kg-1 tm) tijekom 10, 30 i 60 dana te je

proučavan učinak OTA na lipidnu peroksidaciju. Povćana koncentracija MDA pronađena je u

tkivu bubrega životinja koje su tretirane 60 dana.

88

Hoehler i sur. (1996) hranili su tri tjedna štakore hranom kontaminiranom s OTA od 5 mg kg-

1, što prema procjeni odgovara unosu od 500 µg kg-1 tm OTA. Nije pronađen porast MDA u

plazmi, bubrezima ili jetri štakora. Iako su doze OTA bile veće od primijenjenih u prethodnom

pokusu, u tom istraživanju nije nađen učinak na lipidnu peroksidaciju što se može objasniti

mogućom smanjenom apsorpcijom OTA iz kontaminirane hrane.

U dostupnoj literaturi nema podataka o učinku CTN-a kao i učinka OTA i CTN-a na

koncentraciju MDA u tkivima pokusnih životinja.

U ovom istraživanju nađena je povećana koncentracija MDA u bubregu nakon svakodnevnog

izlaganja štakora OTA dozi od 250 µg kg-1 tm tijekom tri tjedna čime je potvrđeno da je

povećanje lipidne peroksidacije mogući mehanizam nefrotoksičnosti OTA. Sam CTN nije

uzrokovao povećanje koncentracije MDA u niti jednom organu tretiranih životinja. Međutim,

kada su životinje tretirane nižom dozom OTA (125 µg kg-1) i CTN-om koncentracija MDA bila

je značajno veća ne samo u bubregu nego i u plazmi i mozgu. Nakon tretmana višom dozom

OTA (250 µg kg-1) i CTN-om značajno viša koncentracija MDA u odnosu na kontrole nađena je

u plazmi, bubregu i jetri.

Kada su životinje istovremeno tretirane s OTA i RSV-om tijekom 21 dan i CTN-om posljednja

dva dana pokusa značajno viša koncentracija MDA nađena je samo u jetri životinja tretiranih

nižom dozom OTA. U životinja tretiranih višom dozom OTA, CTN-om i RSV-om nije nađena

razlika u koncentraciji MDA u ijednom tkivu tretiranih životinja u odnosu na kontrolu.

Smanjenje koncentracije MDA nakon tretmana RSV-om potvrđuje da je mehanizam

toksičnog djelovanja OTA i CTN-a oksidacijski stres koji se smanjuje zbog poznatih

antioksidacijskih svojstava RSV-a.

U ovom je radu istraživan učinak OTA i CTN-a na koncentraciju GSH u plazmi, bubregu, jetri i

mozgu životinja. GSH se sintetizira u jetri i plazmom dolazi u druge stanice gdje štiti stanicu

od slobodnih radikala. Povećana koncentracija slobodnih radikala uzrokuje smanjenje

koncentracije GSH.

U literaturi je opisan učinak OTA na koncentraciju GSH ispitivan na kulturama stanica i na

pokusnim životinjama.

Na primarnim stanicama bubrežnih tubula štakora nađeno je da OTA povećava koncentraciju

reaktivnih kisikovih spojeva i smanjuje koncentraciju GSH (Schaaf i sur., 2002). Primjenom

antioksidacijskih spojeva alfa-tokoferola i n-acetil-L-cisteina povećala se koncentracija GSH u

89

stanicama. Smanjenje koncentracije GSH nađeno je u bubregu i jetri štakora koji su tretirani

četiri tjedna s OTA svakodnevno gastričnom sondom (250 µg kg-1) (Meki i Hussein, 2001).

Na kulturama ljudskih alveolarnih epitelnih stanica A549 nađeno je da subtoksične

koncentracije CTN-a uzrokuju smanjenje razine unutarstaničnog GSH (Johannessen i sur.

(2007.). Učinak CTN-a na koncentraciju GSH u organima pokusnih životinja nije opisan u

dostupnoj literaturi.

U dostupnoj literaturi nema podataka ni o zajedničkom učinku OTA i CTN-a na koncentraciju

GSH.

U ovom istraživanju kada su životinje izložene samo OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) smanjenje

koncentracije GSH primijećeno je u plazmi i svim analiziranim organima (plazma, bubrezi,

jetra, mozak) ovisno o dozi. To je smanjenje bilo značajno samo u bubrezima i mozgu

životinja koje su tretirane višom dozom OTA. U skladu s prethodnim istraživanjima, ovi

rezultati ukazuju na vjerojatnu ulogu oksidacijskog stresa u mehanizmu nefrotoksičnog

učinka OTA.

Tretman životinja CTN-om (20 mg kg-1 tm) u dva uzastopna dana uzrokovao je značajno

sniženje koncentracije GSH u plazmi tretiranih životinja u odnosu na kontrolu. Budući da je

GSH pokazatelj koji u pravilu brzo odražava oksidacijski stres, moguće je da bi duže izlaganje

CTN-u rezultiralo promjenama MDA.

Učinak obje doze OTA bio je povećanje oksidacijskog stresa kada su životinje bile tretirane i s

CTN-om. Pri manjoj dozi OTA nađeno je značajno sniženje koncentracije GSH u jetri, a pri

višoj u bubregu, jetri i mozgu. Rezultati mjerenja koncentracije GSH u ovom pokusu ukazuju

da CTN pojačava učinak OTA na oksidacijski stres u različitim organima.

Kada su životinje tretirane RSV-om zajedno s mikotoksinima značajno niža koncentracija GSH

nađena je samo u bubregu životinja tretiranih višom dozom OTA (250 µg kg-1 tm) i CTN-om.

Rezultat upućuje na znatno antioksidacijsko djelovanje RSV-a.

Nakon izlaganja životinja OTA i CTN-u, bez obzira jesu li mikotoksini dani pojedinačno ili

zajedno, mjereni parametri oksidacijskog stresa u mozgu su bili nedosljedni. Takav je rezultat

vjerojatno posljedica slabog ulaska mikotoksina u mozak, što je u suglasnosti s rezultatima

dobivenim autoradiografijom (Fuchs i sur. 1988b).

Katalitička aktivnost enzima SOD-a, CAT i GPx-a dobri su pokazatelji oksidacijskog stresa u

stanicama. U dosadašnjim je istraživanjima nađeno da tretman malim koncentrcijama OTA (5

ng i 50 μg kg -1) tijekom dva tjedna ne uzrokuje smanjenje katalitičke aktivnosti SOD-a i CAT-a

90

(Domijan et al., 2007). Drugi su autori mjerili aktivnosti SOD-a, CAT-a, GPx-a, glutation

reduktaze (GR) i glutation-S-transferaze (GST) u bubrezima i jetri štakora koji su oralno

dnevno četiri tjedna tretirani s višom dozom OTA (250 µg kg-1 tm) (Meki i Hussein, 2001).

Nakon tog tretmana u jetri i bubrezima štakora došlo je do smanjenja koncentracije GSH u

odnosu na kontrolnu skupinu kao i značajnog smanjenja aktivnosti enzima SOD-a, CAT-a,

GPx-a, GR-a i GST-a. Autori smatraju da je oksidacijski stres glavni mehanizam toksičnog

učinka OTA.

Učinak OTA (120 µg kg-1 tm) na promjenu katalitičke aktivnosti SOD-a proučavan je na

štakorima koji su tretirani ovim mikotoksinom tijekom 10, 30 i 60 dana (Petrik i sur., 2003).

Povećana katalitička aktivnost SOD-a izmjerena je u tkivu bubrega životinja koje su tretirane

60 dana.

Učinak CTN-a na nastanak ROS-ova i katalitičku aktivnost enzima SOD-a, CAT-a i GPx-a

istraživan je na kulturi stanica jetre (Ribeiro i sur., 1997). Iako je nađeno povećanje

proizdvodnje ROS-ova, nije bilo promjene aktivnosti SOD-a, CAT-a i GPx-a. U tom je

istraživanju nađeno znatno povećanje stvaranje ROS-ova, smanjenje aktivnosti GSSG-

reduktaze i transhidrogenaze pa autori smatraju da je uz oksidacijski stres važni mehanizam

nastanka toksičnog učinka CTN-a poremećaj permeabilnosti membrana mitohondrija.

U ovom su istraživanju SOD i CAT mjereni u plazmi i eritrocitima životinja dok je GPx mjerena

u punoj krvi. Aktivnost SOD-a bila je smanjena u plazmi životinja tretiranih višom dozom

OTA, nižom dozom OTA i CTN-om te višom dozom OTA, CTN-om i RSV-om. Zanimljivo je da je

aktivnost eritrocitnih enzima SOD-a i CAT-a bila smanjena samo u životinja tretiranih CTN-

om. Katalitička aktivnost CAT-a u plazmi nije se promijenila nakon ijednog tretmana.

Katalitička aktivnost GPx-a u plazmi smanjila se nakon tretmana nižom dozom OTA i CTN-om,

dok se aktivnost GPX-a u punoj krvi nije smanjila nakon ijednog tretmana. Iako ovi rezultati

nisu u potpunosti konzistentni, ipak upućuju na to da je oksidacijski stres jedan od

mehanizama njihove toksičnosti.

Nađeno je da OTA i CTN djeluju sinergistički na inhibiciju sinteze DNA, RNA i proteina u

kulturi stanica hepatoma (Creppy i sur. 1980). Sinergističko djelovanje OTA i CTN nađeno je

MTT testom na bubrežnim stanicama LLC-PK1 (Heusner i sur. 2006) i na Vero stanicama

(Bouslimi i sur. 2008). Na kulturi Vero stanica, uz smanjenje vijabilnosti, dokazano je da OTA i

CIT uzrokuju značajno povećanje fragmentacije DNA (Bouslimi i sur. 2008). Isti su autori našli

91

da izloženost miševa ovim mikotoksinima značajno povećava broj kromosomskih aberacija u

koštanoj srži.

Dok su neki autori našli na psima kao pokusnim životinjama da OTA i CTN imaju sinergističko

djelovanje na oštećenje funkcije bubrega (Kitchen i sur. 1977), drugi autori su na kokošima

našli da su OTA i CTN antagonisti, jer predtretman s OTA smanjuje učinak CTN-a (Glahn i sur.

1988).

U našem istraživanju u kojem su životinje istovremeno izlagane OTA i CTN-u, u životinja koje

su tretirane nižom dozom došlo je do značajnog smanjenja koncentracije GSH u i jetri, dok je

u životinja koje su tretirane višom dozom to smanjenje bilo značajno u bubrezima, jetri i

mozgu. Nakon takvog izlaganja došlo je i do značajnog povećanja koncentracije MDA u tim

organima. Budući da je sniženje koncentracije GSH i povišenje koncentracije MDA znak

oksidacijskog stresa koji nije nađen kada su OTA i CTN davani životinjama odvojeno, može se

zaključiti da CTN pojačava djelovanje OTA nastankom oksidacijskog stresa u ciljnim

organima.

Razina oksidacijskog štećenje DNA mjerena je u stanicama bubrega i jetre štakora hOGG1

komet testom. Mjereni su duljina i intenzitet repa kometa u životinja tretiranim s OTA, CTN-

om i RSV-om pojedinačno i zajedno. Nakon tretmana s OTA nije zabilježena promjena duljine

i intenziteta repa kometa u stanicama bubrega i jetre, dok je nakon tretmana CTN-om

zabilježena samo promjena intenziteta repa kometa na stanicama bubrega. Intenzitet repa

kometa bolji je pokazatelj oksidacijskog oštećenja DNA, nego duljina repa kometa.

Nakon tretmana s oba mikotoksina zajedno značajno povećanje vrijednosti duljini repa

kometa primijećeno je u stanicama bubrega životinja koje su tretirane nižom dozom OTA i

CTN-om te u stanicama jetre životinja koje su tretirane višom dozom OTA i CTN-om.

Značajno povećanje intenziteta repa kometa primijećeno je u stanicama oba organa životinja

tretiranih i s nižom i s višom dozom OTA i CTN-om. U svim navedenim pokusima promjena

intenziteta repa kometa nađena je pri nižim dozama negoli duljina repa kometa što je

posljedica veće osjetljivosti intenziteta repa kao pokazatelja oštećenja DNA uslijed

oksidacijskog stresa.

U životinja tretiranih s OTA, CTN-om i RSV-om značajno povećanje duljine repa kometa

zabilježeno je u stanicama bubrega i jetre životinja tretiranim višom dozom OTA, CTN-om i

RSV-om dok pri nižoj dozi OTA nije nađena razlika u odnosu na kontrole. Intenzitet repa

kometa bilo je značajno viši u brubrezima životinja koje su dobile višu i nižu dozu

92

OTA+CTN+RSV, dok je u jetri bio viši samo pri višoj dozi OTA+CTN+RSV. U ovom je pokusu

uočen manji zaštitni učinak RSV-a na oksidacijsko oštećenje DNA negoli je bio učinak na GSH

i lipidnu peroksidaciju što ukazuje da bi osim oksidacijskog oštećenja mikotoksini mogli

dovoditi do oštećenja genetičkog materijala i drugim mehanizmima poput stvaranja adukata

ili epigenetičkim djelovanjem.

93

7 ZAKLJUČCI

Na temelju rezultata mjerenja koncentracije antioksidacijskog spoja GSH, parametra lipidne

peroksidacije (MDA) i antioksidacijskih enzima (SOD, CAT i GPx) u pokusima u kojima su

štakori bili tretirani s OTA (125 i 250 μg kg-1 tm), CTN-om (20 mg kg-1 tm), kombinacijom tih

dvaju mikotoksina te mikotoksinima i RSV-om (20 mg kg-1 tm) može se zaključiti sljedeće:

1. Budući da tretman s OTA i CTN-om nije utjecao na tjelesnu masu životinja niti

uzrokovao njihovo ugibanje, primjenjene doze nisu imale opći toksični učinak.

2. Primjenjene doze mikotoksina bilo da su primjenjivane pojedinačno ili zajedno ne

uzrokuju oštećenja bubrega koja bi dovela do promjene volumena urina.

3. Iako primijenjena doza CTN-a ne uzrokuje promjenu koncentracije MDA u plazmi,

bubregu i jetri, a doza od 125 µg kg-1 OTA povećava njegovu koncentraciju samo u

bubregu, zajednička primjena OTA i CTN-a uzrokuje povećanu lipidnu peroksidaciju u

plazmi, bubregu i jetri pa se može zaključiti da CTN potencira toksični učinak OTA.

4. Budući da nakon tretmana životinja RSV-om dolazi do smanjenja lipidne peroksidacije

u svim organima osim u plazmi pri dozi od 250 µg kg-1 OTA i CTN-u (20 mg kg-1 tm)

može se zaključiti da RSV ima protektivno antioksidacijsko djelovanje pri ovim

dozama OTA i CTN-a.

5. U životinja tretiranih CTN-om (20 mg kg-1 tm) snižena je koncentracija GSH, katalitička

aktivnost katalaze u eritrocitima te je povećan intenzitet repa kometa u stanicama

jetre. Na temelju promjene ovih parametara može se zaključiti da je oksidacijski stres

jedan od mehanizama toksičnosti CTN-a.

6. Pojedinačni tretman pokusnih životinja mikotoksinima smanjuje koncentraciju GSH u

pojedinim organima (doza od 250 µg kg-1 OTA smanjuje koncentraciju GSH u bubregu

i mozgu, a CTN u plazmi) dok je koncentracija GSH u životinja tretiranih s OTA (250 µg

kg-1) i CTN-om smanjena u bubregu, jetri i mozgu. Ti rezultati ukazuju na potencirajući

učinak CTN-a na toksičnost OTA.

7. Nakon tretmana životinja s OTA, CTN-om i RSV-om snižena koncentracija GSH

izmjerena je samo u bubrezima životinja tretiranih s OTA (250 µg kg-1), CTN-om i RSV-

om. Može se zaključiti da RSV ima značajan antioksidacijski zaštitni učinak.

94

8. Iako se katalitička aktivnost enzima SOD, CAT i GPx smanjuje u plazmi i eritrocitima

tretiranih mikotoksinima, rezultati nisu jednoznačni.

9. Primijenjene doze OTA nisu uzrokovale oksidacijsko oštećenje DNA, a primijenjena

doza CTN-a uzokovala je povećanje oksidacijskog oštećenja DNA u stanicama

bubrega. Zajednička primjena OTA (125 i 250 µg kg-1) i CTN-a uzrokovala je

oksidacijsko oštećenje u stanicama bubrega i jetre tretiranih životinja što ukazuje na

značajni potencirajući učinak CTN-a.

10. Potencirajuće djelovanje CTN-a na OTA najbolje je izraženo kod oksidacijskog

oštećenja DNA u stanicama jetre i bubrega.

11. Učinak primjenjene doze RSV-a bio je značajno smanjenje oksidacijskog oštećenja

DNA samo u jetri životinja tretiranih s OTA (125 µg kg-1) i CTN-om što ukazuje na

primjetan, ali nedovoljan zaštitni učinak RSV-a na oksidacijsko oštećenja DNA.

12. Ovim istraživanjem dokazano je da oksidacijski stres sudjeluje u mehanizmu

toksičnosti CTN-a koji potencira toksičnost OTA. CTN naročito potencira

genotoksičnost OTA izmjerenu kao oksidacijsko oštećenje DNA. Oksidacijski stres

uzrokovan zajedničkom primjenom OTA i CTN-a može se znatno umanjiti

primijenjenom dozom RSV-a.

95

8 POPIS KORIŠTENIH KRATICA

CAT - katalaza

CTN – citrinin

GPx – glutation peroksidaza

GSH – glutation

hOGG1 - 8-oksogvanin-DNA-glikozilaza 1 (hOGG1) enzim

MDA – malondialdehid

OTA – okratoksin A

ROS – reaktivni kisikovi spojevi (reactive oxigen species)

RSV – resveratrol

SOD – superoksid dismutaza

96

9 LITERATURA

1. Abarca ML, Bragualt MR, Castella G, Cabanes FJ. (1994) Ochratoxin A production by

strains of Aspergillus niger var niger. Appl Environ Microbiol 60:2650-2652.

2. Abd Alla ESAM. (1996) Natural occurrence of ochratoxin A and citrinin in food stuffs

in Egypt. Mycotoxin Research 12:41-44.

3. Abd-Allah EF, Ezzat SM. (2005) Natural occurrence of citrinin in rice grains and its

biocontrol by Trichoderma hamatum. Phytoparasitica 33:73-84.

4. Aebi H. (1984) Catalase in Vitro. Method Enzym 105:121-126. 5. Aggarwal B, Bhardwaj A, Aggarwal RS, Seeram NP, Shishodia S, Takada Y. (2004) Role

of resveratrol in prevention and therapy of cancer:preclinical and clinical studies.

Anticancer Research 24:2783-2840.

6. Arai M, Hibino T. (1983) Tumorigenicity of citrinin in male F344 rats. Cancer Lett

17:281-287.

7. Athar M, Back JH, Tang X, Kim KH, Kopelovich L, Bickers DR. (2007) Resveratrol: a

review of preclinical studies for human cancer prevention. Toxicol Appl Pharmacol

224:274–83.

8. Bauer von J, Gareis M, Gedek B. (1984) Zum Nachweis und Vorkommen von

Ochratoxin A bei Schlachtschweinen. Berl Münch Tierärztl Wschr 97:279-283.

9. Baur JA, Oearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A. (2006) Resveratrol

improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature 444:337-342.

10. Bayman P, Baker JL, Doster MA, Michailidis TJ, Mahoney NE. (2002) Ochratoxin

production by the Aspergillus ochraceus group and Aspergillus alliaceus. Appl Environ

Microbiol 68:2326-2329.

11. Belli N, Marin S, Sanchis V, Ramos AJ. (2004) Influence of water activity and

temperature on growth of isolates of Aspergillus section nigri obtained from grapes.

Int J Food Microbiol 96:19-27.

12. Belmadani A, Steyn PS, Tramu G, Betbeder AM, Baudrimont I, Creppy EE. (1999)

Selective toxicity of ochratoxin A in primary cultures from different brain regions.

Arch Toxicol 73:108-114.

97

13. Belsten JL, Wright AJ. (1995b) European community - FLAIR common assay for

erythrocyte superoxide dismutase (SOD); results of an inter-laboratory trial. Eur J Clin

Nutr 49:928-931.

14. Belsten JL, Wright AJ. (1995a) European Community – FLAIR common assay for

whole-blood glutathione peroxidase (GSH-Px); results of an inter-laboratory trial. Eur

J Clin Nutr 49:921-927.

15. Bendele AM, Carlton WW, Krogh P, Lillehoj EB. (1985) Ochratoxin A carcinogenesis in

the (C57B1/6J x C3H) F1 mouse. J Nat Cancer Int 75:733-742.

16. Berndt WO, Hayes AW. (1982) The effect of probenicid on Citrinin-induced

nephrotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol 64:118-124.

17. Bertelli AAE, Das DK. (2009) Grapes, wines, resveratrol and heart health. J Cardiovasc

Pharm 54:468-476.

18. Bertelli AAE, Giovannini L, Stradi R, Bertelli A, Tillement JP. (1996) Plasma, urine and

tissue levels of trans-and cis-resveratrol (3,4',5-trihydroxystilbene) after short-term

or prolonged administration of red wine to rats. Internat J Tissue Reaction 18:67-71.

19. Bertelli AAE. (2007) Wine, research and cardiovascular disease: instructions for use.

Aterosclerosis 195:242-247.

20. Betina V. (1989) Citrinin. In: Mycotoxins: Chemical, Biological and Environmental

Aspects. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 174-191.

21. Blanc PJ, Laussac JP, Le Bars J, Le Bars P, Loret MO, Pareilleux A, Prome D, Prome JC,

Santerre AL, Goma G. (1995a) Characterisation of monascidin A from Monascus as a

citrinin. Int J Food Microbiol 27:201-213.

22. Blanc PJ, Laussac JP, Le Bars J, Le Bars P, Loret MO, Pareilleux A, Prome D, Prome JC,

Santerre AL, Goma G. (1995) Characterization of monascidin A from Monascus as

citrinin. Int J Food Microbiol 27:201-213.

23. Blanc PJ, Loret MO, Goma G. (1995b) Production of Citrinin by various species of

Monascus. Biotechnology Lett 17:291-294.

24. Boorman GA. (1989) Toxicology and carcinogenesisi studies of ochratoxin A in F344/N

rats. NTP Tehnical Report 358, NIH Publication No. 89-2813.

25. Bouslimi A, Bouaziz C, Ayed-Boussema I, Hassen W, Bacha H. (2008) Individual and

combined effect of ochratoxin A and citrinin on viability and DNA fragmentation in

98

cultured Vero cells and on chromosome aberration in mice bone marrow cells.

Toxicology 251:1-7.

26. Bragulat MR, Martinez E, Castella G, Cabanes FJ. (2008) Ochratoxin A and citrinin

producing species of the genus Penicillium from feedstuffs. Internat J Food Microbiol

126:43-48.

27. Breitholtz Emanuelsson A, Fuchs R, Hult K, Appelgren LE. (1991) Distribution of 14C-

ochratoxin A and 14C-ochratoxin B in rats: a comparison based on whole-body

autoradiography. In Mycotoxins, Endemic Nephropathy and Urinary tract tumors (ed.

Castegnaro M, Pleština R, Dirheimer G, Cgernozemsky IN i Bartsch H), Lyon,

International Agency for Research on Cancer, pp 201-203. IARC, 1991.

28. Breitholtz-Emanuelsson A, Olsen M, Oskarsson A, Palminger I, Hult K. (1993)

Ochratoxin A in cow’s milk and in human milk with corresponding human blood

samples. J AOAC Int 76:842-846.

29. Brigelius-Flohe R i Maiorino M. (2012) Glutathione peroxidases. Biochim Biophys Acta

(article in press).

30. Buege JA, Aust SD. (1977) Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 52:302-

310.

31. Carlton WW, Tuite J. (1977) Metabolites of P. viridicatum toxicology. U: Rodricks J. V.,

Hesseltine D. W., Mehlman M. A. (Ur.) Mycotoxins in human and animal health.

Illinois, Pathotox Publications Inc., str. 525-555.

32. Castegnaro M, Mohr U, Pfohl-Leszkowicz A, Estève J, Steinmann J, Tillmann T,

Michelon J, Azemar B, Bartsch H. (1998) Strain- and sex-specific induction of renal

tumors by ochratoxin A in rats correlates with DNA adduction. Int J Cancer 77:70–5.

33. Chu FS. (1971) Interaction of ochratoxin A with bovine serum albumine. Arch

Biochem Biophys 147:359-366.

34. Constant J. (1997) Alcohol, ischemic heart disease, and the French paradox. Clin

Cardiol 20:420-424.

35. Corcuera LA, Vettorazzi A, Arvillaga L, González-Peñas E, López de Cerain A. (2012) An

approach to the toxicity and toxicokinetics of aflatoxin B1 and ochratoxin A after

simultaneous oral administration to fasted F344 rats. Food Chem Toxicol 50:3440-

3446.

99

36. Cottart CH, Nivet-Antoine V, Laguiller-Morizot C, Beaudeux, JL. (2010) Resveratrol

bioavailability and toxicity in humans. Mol Nutr Food Res 54:7-16.

37. Council for Agricultural Science and Technology (CAST). Mycotoxins, economic and

health riskc. Report No. 116. Ames, Iowa: CAST; 1980.

38. Creepy EE, Kane A, Dirheimer G, Lafarge-Frayssinet C, Mousset S, Frayssinet C. (1985)

Genotoxicity of ochratoxin A in mice: DNA single-strand break evaluation in spleen,

liver and kidney. Toxicol Lett 28:29-35.

39. Creppy EE, Baudrimont I, Betbeder AM. (1995) Prevention of nephrotoxicity of

ochratoxin A, a food contaminant. Toxicol Lett 83:869-877.

40. Creppy EE, Lorkowski G, Berck G, Röschenthaler, Dirheimer G. (1980) Combined

action of citrinin and ochratoxin A on hepatoma tissue culture cells. Toxicol Lett

5:375-380.

41. Creppy EE, Stormer FC, Kern D, Roschenthaler R, Dorheimer G. (1983) Effects of

ochratoxin Ametabolites on yeast phenylalanyl-tRNA synthetase and on the growth

and in vivo protein synthesis of hepatoma cells. Chem-Biolog Interacti 47:239-247.

42. Cvetnić Z, Pepeljnjak S. (1989) Toksikogenost sojeva Aspergillus ochraceus

nefropatičnog i anefropatičnog područja SR Hrvatske (Poseban otisak), Sarajevo

1989, Posebna izdanja, Knjiga LXXXIX, odjeljenje medicinskih nauka, Knjiga 14.

43. Cvjetković B, Jurjević Ž. Zaštita pšenice od Fusariuma primjenom fungicida i utjecaj na

mikotoksine (The control of Fusarium on wheat by fungicides and its influence on

mycotoxins, in Croatian). In: Plijestić S, editor. Zbornik radova 13. Međunarodnog

savjetovanja tehnologa sušenja i skladištenja (Proceedings of the 13th International

symposium of tehnologiss for drying and storing) 22-24 Jan 1997; Stubičke Toplice,

Croatia. Zagreb: Faculty of Agriculture, University of Zagreb; 1997. P.1-23.

44. Das S, Das DK. (2007) Anty-inflammatory responses of resveratrol. Inflammation and

Allergy: Drug Targets 6:168-173.

45. Dietrich R, Schmid A, Märtlbauer E. (2001) Citrinin in fruit juices. Mycotoxin Res

17:156-159.

46. Domijan AM, Peraica M, Ferenčić Ž, Čužić S, Fuchs R, Lucić A, Radić B. (2004b)

Ochratoxin A-induced apoptosis in rat kidney tissue. Arh Hig Rada Toksikol 55:243-

248.

100

47. Domijan AM, Peraica M, Fuchs R, Lucić A, Radić B. (2004a) Effect of ochratoxin A on

enzymr activity and malondialdehyde in rat urine. Period Biolog 106:373-376.

48. Domijan AM, Peraica M, Lucić Vrdoljak A, Radić B, Žlender V, Fuchs R. (2007) The

involvement of oxidative stress in ochratoxin A and fumonisin B1 toxicity in rats. Mol

Nutr Food Res 51:1147-1151.

49. Domijan AM, Peraica M, Žlender V, Cvjetković B, Jurjević Ž, Topolovec Puntarić S, Ivić

D. (2005a) Seed-borne fungi and ochratoxin A contamination of dry beans (Phaseolus

vulgaris L.) in the Republic of Croatia. Food Chem Toxicol 43:427-432.

50. Domijan AM, Peraica M. (2005b) Ochratoxin A in wine. Arh Hig Rada Toksikol 56:17-

20.

51. Domijan AM, Peraica M. (2010) Carcinogenic Mycotoxins. In: Chalene A. McWuenn,

Comprehensive Toxicology, volume 14, pp. 125-137. Oxford: Academic Press.

52. Domijan AM, Želježić D, Kopjar N, Peraica M. (2006) Standard snd Fpg-modified

comet assay in kidney cells of ochratoxin A- and fumonisin B1-treated rats. Toxicology

222:53-59.

53. Dömnez-Altuntas H, Dumlupinar G, Imamoglu N, Hamurcu Z, Liman BC. (2007) Effects

of the mycotoxin citrinin on micronucleus formation in a cytokinesis-block

genotoxicity assay in cultured human lymphocytes. J Appl Toxicol 27:337-341.

54. Dostal A, Jakusova L, Cajdova J, Hudeckova H. (2008) Results of the first studies of

occurence of ochratoxin A in human milk in Slovakia. Bratisl Lek Listy 106:276-278.

55. Drury J A, Nycyk J A, Cooke R W I. (1997) Comparison of urinary and plasma

malondialdehyde in preterm infants. Clin Chim Acta 263:177-185.

56. Dunn BB, Stack ME, Park DL, Joshi A, Friedman L, King RL. (1983) Isolation and

identification of dihydrocitrinone, a urinary metabolite of citrinin in rats. J Toxicol

Environ Health 12:183-289.

57. Dwiwedi P, Burns RB. (1986) The natural occurrence of ochratoxin A and its effects in

poultry. A review. World Poultry Sci J 42:32-47.

58. EFSA (2012) Scientific opinion on the risk for public and animal health related to the

presence of citrinin in food and feed. EFSA Panel on Contaminants int he Food Chain

(CONTAM); European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italija.

59. Ellman GL. (1958) A colorimetric method for determining low concentrations of

mercaptans. Arch Biochem Biophys 74:443-450.

101

60. El-Sayed AMAA. (1996) Natural occurrence of ochratoxin A and citrinin in food stuffs

in Egypt. Mycotoxin Research 12:41-44.

61. Fang JG, Lu M, Chen ZH, Zhu HH, Li Y, Yang L. (2002). Antioxidant effects of

resveratrol and its analogues against the free-radical-induced peroxidation of linoleic

acid in micelles. Chemistry – A Europ J 8:4191-4198.

62. Fernandez-Mar MI, Mateos R, Garcia-Parrilla MC, Puertas B, Cantos-Villar E. (2012)

Bioactive compounds in wine: resveratrol, hydroxytyrosol and melatonin: a review.

Food Chem 130:797-813.

63. Fink-Gremmels J, Dresel J, Leistner L. (1991) Use of Monascus extracts as an

alternative to nitrate in meat products. Fleischwirtschapt 71:1184-1186.

64. Fink-Gremmels J, Jahm A, Blom MJ. (1995) Toxicity and metabolism of ochratoxin A.

Natural Toxins 3:214-220.

65. Flajs D, Domijan AM, Ivić D, Cvjetković B, Peraica M. (2009) ELISA and HPLC analysis

of ochratoxin A in red wines of Croatia. Food Control 20:590-592.

66. Föllmann W, Hillebrand IE, Creppy EE, Bolt HM. (1995) Sister chromatid exchange

frequency in culture isolated porcine urinary bladder epithelial cells (PUBEC) treated

with ochratoxin A and alpha. Arch Toxicol 69:280-286.

67. Föllmann W, Lebrun S, Kullik B, Kock M, Römer HC, Golka K. (2000) Citotoxicity of

ochratoxin A and citrinin in different cell types in vitro. Mycotoxin Res 16:123-126.

68. Frank HK. (1992) Citrinin. Z Ernährungswiss 31:164-177.

69. Fuchs R, Appelgren LE, Hagelberg S, Hult K. (1988a) Carbon-14-ochratoxin A

distribution in the japanese quail (Coturnix coturnix japonica) monitored by whole

body autoradiography. Poultry Sci 67:707-714.

70. Fuchs R, Appelgren LE, Hult K. (1986) Distribution of 14C-ochratoxin A in the rainbow

trout (Salmo gairdneri). Acta Pharmacol Toxicol 59:220-227.

71. Fuchs R, Appelgren LE, Hult K. (1988b) Distribution of 14C-ochratoxin A in the mouse

monitored by whole-body autoradiography. Pharmacol Toxicol 63:355-360.

72. Galvano F, Piva A; Ritieni A, Galvano D. (2001) Dietary strategies to counteract the

effects on milk production and components. J Anim Sci 64:120-131.

73. Gareis M, Märtlbauer E, Bauer J, Gedek B. (1988) Bestimmung von Ochratoxin A in

Muttermilch. Z Lebensm Unters Forsch 186:114-117.

102

74. Gehm BD, McAndrews JM, Chein PY, Jameson JL. (1997) Resveratrol, a polyphenolic

compound found in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor. Proc

Nat Acad Sci 94:14138-14143.

75. Gekle M, Oberleithner H, Silbernagel S. (1993) Ochratoxin A impairs „postproximal“

nephron function in vivo and blocks plasma membrane anion conductance in Madin-

Darby caninekidney cells in vitro. Pflugers Arch 425:401-408.

76. Glahn RP, Wiedeman RF, Enangelisti JW. (1988) Effects of ochratoxin A alone and in

combination with citrinin on kidney function of single comb white leghorn pullets.

Poultry Sci 67:1034-1042.

77. Glahn RP, Wiedman RF, Evangelisti JW. (1987) Effects of ochratoxin A alone and in

combination with citrinin on kifney function of single comb white leghorn pullets.

Poultry Sci 67:1034-1042.

78. Grazioli B, Fumi MD, Silva A. (2006). The role of processing on ochratoxin A content in

Italian must and wine: A study on naturally contaminated grapes. Internat J Food

Microbiol 111:S93-S96

79. Griffith OW. (1999) Biologic and pharmacologic regulation of mammalian glutathione

synthesis. Free Rad Biol Med 27:922-935.

80. Gupta M, Sasmal D, Bandyopadhyay S, Bagchi G, Chatterjee T, Dey S. (1983) Hematological

changes produced in mice by ochratoxin A and citrinin. Toxicology 26:55-62.

81. Hagelberg S, Hult K, Fuchs R. (1989) Toxicokinetics of ochratoxin A in several species

and its plasma-binding properties. J App Toxicol 9:91-96.

82. Hanika C, Carlton WW. (1994) Toxicology and pathology of citrinin. U: Llewellyn G. C.,

Dashek W. V., O’Rear C. E. (ur.) Biodeterioration research 4. Mycotoxins, wood decay,

plant stress, biocorrosion and general biodeterioration. New York, Plenum Press, str.

41-63.

83. Harikumar KB, Aggarwal BB. (2008) Resveratrol: A multitargeted agent for age-

associated chronic diseases. Cell Cycle 7:1020-1035.

84. Hatanaka J, Doke N, Harada T, Aikawa T and Enomoto M. (1982) Usefulness and

rapidity of screening for the toxicity and carcinogenicity of chemicals in medaka,

Oryzias latipes. Japan J Experimen Med 52:243-253.

85. Hesseltine CW. (1986) Global significance of mycotoxins. In: Mycotoxins and

Phycotoxins. Steyn PS, Vleggar R (eds) Elsevier, Amsterdam.

103

86. Hetherington AC, Raistrick H. (1931) Studies on biochemistry of microorganisms. Part

XIV. On the production and chemical constitution of a new yellow coloring matter,

citrinin produced from glucose by Penicilium citrininum Thom. Phil Trans Roy Soc

London, Ser B 220:269-296.

87. Heussner AH, Dietrich DR, O'Brien E. (2006) In vitro investigation of individual and

combined cytotoxic effects of ochratoxin A and other selected mycotoxins on renal

cells. Toxicol Vitro 20:332-341.

88. Hoehler D, Marquardt RR, Frohlich A. (1996) Lipid peroxidation as one mode of action

of ochratoxin A toxicity in rats and chicks. Can J Anim Sci 77:287-292.

89. Höhler D. (1998) Ochratoxin A in food and feed: occurence, legislation and mode of

action. Z Ernährungswiss 37:2-12.

90. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG. (2003) Small

molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature

425:191-196.

91. Hult K, Pleština R, Habazin Novak V, Radić B, Čeović S. (1982) Ochratoxin A in human

blood and balkan endemic nephropathy. Arch Toxicol 51:313-321.

92. IARC (1983) Approaches to Classifying Chemical Carcinogens According to Mechanism

of Action (IARC intern. tech. Rep. No. 83/001)

93. IARC (1986) Citrinin. Some naturally occuring and synthetic food components,

surocoumarins and ultraviolet radiation. IARC monographs on the evaluation of

carcinogenic risks to humans, volume 40.67.

94. IARC (1993) Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to

humans, Vol. 56. Some natirally occuring substances: food items and constituents,

heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. International agency for research on

cancer, Lyon. Pp. 489-521

95. Jeswal P. (1996) Citrinin-induced chromosomal abnormalities in the bone-marrow

cells of Mus musculus. Cytobios 86:29-33.

96. Johannessen LN, Nilsen AM, Lovik M. (2007) Mycotoxin-induced depletion of

intracellular glutathione and altered cytokine production in the human alveolar

epithelial cell line A549. Toxicol Lett 168:103-112.

97. Juan ME, Vinardell MP, Planas JM (2002) The daily oral administration of high doses

of trans-resveratrol to rats for 28 days is not harmful. J Nutr 132:257-260.

104

98. Kamp HG, Eisenbrand G, Schlatter J, Würth K, Janzowski C. (2005) Ochratoxin A:

induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell

lines and primary cells. Toxicology 206:413-425.

99. Kanisawa M. (1984) Synergistic effects of citrinin on hepatorenal carcinogenesis of

ochratoxin A in mice. Toxigenic fungi – their toxins and health hazard 4:245-254.

100. Karlsson J, Emgard M, Brundin P, Burkitt MJ. (2000) Trans-resveratrol protects

embryonic mesencephalic cells from tert-butyl hydroperoxide:Electron paramagnetic

resonance spin trapping evidence for a radical scavenging mechanism. J Neurochem

75:141-150.

101. Kitabatake N, Trivedi AB, Doi E. (1991) Thermal decomposition and detoxification of

citrinin under various moisture conditions. J Agricult Food Chem 39:2240-2244.

102. Kitchen D, Carlton WW, Tuite J. (1977) Ochratoxin A and Citrinin induced nephrosis in

beagle dogs. I. Clinical and clinicopathological Features. Vet Pathol 4:154-172.

103. Kleinman WA, Richie JP. (2000) Status of glutathione ond other thiols and disulfides

in human plasma. Biochem Pharmacol 60:19-29.

104. Knasmüller S, Cavin C, Chakraborty A, Darroudi F, Majer BJ, Huber WW, Erlich VA.

(2004) Structurally related mycotoxins ochratoxin A, ochratoxin B and citrinin differ in

their genotoxic activities and in their mode of action in human-derived liver (HepG2)

cells: implications for risk assessment. Nutrit Cancer 50:190-197.

105. Knecht A, Schwerdt G, Gekle M, Humpf HU. (2005) Combinatory effect of citrinin and

ochratoxin A in immortalized human proximal tubule cells. Mycotoxin Research

21:176-181.

106. Kozakiewicz Z. (1989) Aspergillus species on stored products. Mycological paper no.

161, CAB International Mycological Institute, Kew, UK, p. 1.

107. Kpodo K, Sorensen AK, Jakobsen M. (1996) The occurrence of mycotoxins in

fermented maize products. Food Chem 56:147-153.

108. Krogh P, Axelsen NH, Elling F, Gyrd-Hansen N, Hald B, Hyldaard-Jensen J, Larsen AE,

Madsen A, Mortensen HP, Moller T, Peterson OK, Ravnskov U, Rostgaard M, Aalund

O. (1974) Experimental porcine nephopathy. Acta Pathol Microbiol Scand Supp

246:1-21.

109. Krogh P, Gyrd-Hansen N, Hald B, Larsen S, Nielsen JP, Smith M, Ivanoff C, Meisner H.

(1988) Renal enzyme activities in experimental ochratoxin A-induced porcine

105

nephropathy: diagnostic potential of phosphoenolpyruvate carboxykinase and

gammaglutamyl transpeptidase activity. J Toxicol Environ Health 23:1-14.

110. Krogh P, Hald B, Gjersten P, Myken F. (1974) Fate of ochratoxin A and citrinin during

malting and brewing experiments. Appl microbiol 1:31-34.

111. Krogh P. (1972) Mycotoxic porcine nephropathy: a possible model for balkan

Endemic Nephropathy. Bulgarian cademy of Sciences. Endemic nephropathy.

Proceedings oft he second International Symposium on Endemic Nephropathy, Sofia,

November 9-11.

112. Krogh P. (1976) Epidemiology of mycotoxic porcine nephropathy. Nord

Veterinaermed 28:452-458.

113. Krogh P. (1987) Ochratoxin in food. Page 97 in P. Krogh, ed. Mycotoxins in food.

Academic Press, Inc., London, UK.

114. Kuiper-Goodman T, Scott PM. (1989) Risk assessment of the mycotoxin ochratoxin

A. Biomed Environ Sci 2:179-248.

115. Kumari CK, Nusrath M. (1987) Natural occurrence of citrinin and ochratoxin A in

coconut products. Nat Acad Sci Lett-India 10:303-305.

116. La vecchia C. Bosetti C. (2006) Diet and cancer risk in mediterranean countries: open

issues. Pub Health Nutrit 9:1077-1082.

117. Larsen TO, Svendsen A, Smedsgaard J. (2001) Biochemical characterization of

ochratoxin A-producing strains of the genus Penicillium. Appl Environ Microbiol

67:3630-3635.

118. Lee CL, Chen WP, Wang JJ, Pan TM (2007) A simple and rapid approach for removing

citrinin while retaining monacolin K in red mold rice. J Agricult Food Chem 55:11101-

11108.

119. Li Y, Cao Z, Zhu H (2006). Up-regulation of endogenous antioxidants and phase 2

enzymes by the red wine polyohenol, resveratrol in cultured aortic smooth muscle

cells leads to cytoprotection against oxidative and elektrophilic stress.

Pharmacological Research 53:6-15.

120. Lillehoj EB, Aalund O, Hald B. (1978) Bioproduction of 14C ochratoxin A in submerged

culture. Appl Eniviron Microbiol 36:720-723.

121. Liochev SI, Fridovich I. (2010) Mechanism of the peroxidase activity of Cu, Zn

superoxide dismutase. Free Rad Biol Med 48:1565-1569.

106

122. Liu BH, Yu FY, Wu TS, Li SY, Su MC, Wang MC, Shih SM. (2003) Evaluation of genotoxic

risk on oxidative DNA damage in mammalian cells exposed to mycotoxins, patulin i

citrinin. Toxicol Appl Pharmacol 191:255-263.

123. Lu SC. (2012) Glutathione synthesis. Biochim Bioph Acta (article in press).

124. Marquardt RR, Frohlich AA. (1992) A review of recent advances in understanding

ochratoxicosis. J Anim Sci 70:3968-3988.

125. Martin W, Lorkowski G, Creppy EE, Dirheimer G, Roschenthaler R. (1986) Action of

citrinin on bacteria chromosomal and plasmid DNA in vivo and in vitro. Appl

Environment Microbiol 52:1273-1279.

126. Martins ML, Gimeno A, Martins HM, Bernardo F. (2002) Co-occurrence of patulin and

citrinin in Portuguese apples with rotten spots. Food Add Contam 19:568-574.

127. Mayura K, Parker R, Berndt WO, Phillips TD. (1984) Effect of simultaneous prenatal

exposure to ochratoxin A and citrinin in the rat. J Toxicol Environment Health 13:553-

561.

128. Meister A, Anderson ME. (1984) Glutathione. Ann Rev Bichem 52:711-760.

129. Meki A, Hussein A. (2001) Melatonine reduces oxidative stress induced by ochratoxin

A in rat liver and kidney. Toxicol Pharmacol 103:305-313.

130. Mertens-Talcott SU, Percival SS (2005). Ellagic acid and quercetin interact

synergistically with resveratrol in the industion of apoptosis and cause transient cell

arrest in human leukemia cells. Cancer Lett 218:141-151.

131. Micco C, Miraglia M, Brera C, Corneli S, Ambruzzi A. (1995) Evaluation of ochratoxin A

level in human milk in Italy. Food Addit Contam 12:351-354.

132. Miletić-Medved M, Domijan AM, Peraica M. (2005) Recent data on endemic

nephropathy and related urothelial tumor in Croatia. Wien Klin Wochenschr 117:604-

609.

133. Miller JD. (2001) Factors that affect the occurence of Fumonisin. Environ Health

Perpect 109(Suppl 2):321-324.

134. Mladinic M, Berend S, Lucic Vrdoljak A, Kopjar N, Radic B, Zeljezic D. (2009)

Evaluation of genome damage and its relation to oxidative stress induced by

glyphosate in human lymphocytes in vitro. Environ Molec Mutag 50:800-807.

135. Moss MO. (1996) Mode od formation of ochratoxin A. Food Addit Contam 13:5-9.

107

136. Navas SA, Sabino M, Rodriguez-Amaya DB. (2005) Aflatoxin M1 and ochratoxin A in

human milk bank in the city of Sao Paulo, Brazil. Food Addit Contam 22:457-462.

137. Nguyen MT, Tozlovanu M, Tran TL, Pfohl-Leszkowicz A. (2007) Occurence of

aflatoksin B1, citrinin and ochratoxin A in rice in five provinces of the central region

of Vietnam. Food Chem 105:42-47.

138. Nicholls P. (2012) Classical catalase: Ancient and modern. Arch Bioch Biophys 525:95-

101.

139. Obrecht-Pflumio S, and Dirheimer G. (2000) In vitro DNA and dGMP adducts

formation caused by ochratoxin A. Chem-Biol Interact 127:29-44.

140. Obrecht-Pflumio S, and Dirheimer G. (2001) Horseradish peroxidase mediates DNA,

and deoxyguanosine 30-monophosphate adduct formation in the presence of

ochratoxin A. Arch Toxicol 75:583–590.

141. Olas B, Holmsen H. (2012) Interaction of resveratrol with membrane

glycerophospholipids in model system in vitro. Food Chem Toxicol 50:4028-4034.

142. Orallo F, Alvarez E, Camina M, Leiro JM, Gomez E, Fernandez P. (2002) The possible

implication of trans-resveratrol in the cardioprotective effects of long-term moderate

wine consumption. Molec Pharmacol 61:294-302.

143. Otteneder H, Majerus P. (2000) occurence of ochratoxin A (OTA) in wines: influence

of the type of wine and its geographical origin. Food Addit Contam 9:793-798.

144. Pardo E, Marín S, Ramos AJ, Sanchis V. (2005) Effect of water activity and

temperature on mycelial growth and ochratoxin A production by isolates of

Aspergillus ochraceus on irradiated green coffe beans. J Food Protect 68:133-138.

145. Parker JA, Arango M, Abderrahmane S, lambert E, Tourette C, Catoire H. (2005)

Resveratrol rescues mutant polyglutamine cytotoxicity in nematode and mammalian

neurons. Nature Genetics 37:349-350.

146. Pascale M, Visconti A. (2001) Ocratoxin A in wine and beer: analytical method and

natural occurrence. Congress Proceedings, 11th Congress of the Mediteranean

Phytopathology Union and 3rd Congress if the Sociedade Portugesa de Fitopatologia,

Evora, Portugal, 17-20 September. 426-428

147. Pavlović M, Pleština R, Krogh P. (1979) Ochratoxin A contamination of foodstuffs ina

n area with balkan (endemic) nephropathy. Acta Path Microbiol Scand Sect B 87:243-

246.

108

148. Pepeljnjak S, Šegvić M, Ožegović L. (2002) Citrininotoxinogenicity of Penicillium spp.

isolated from decaying apples. Brazilian J Microbiol 33:134-137.

149. Peraica M, Domijan AM, Jurjević Ž, Cvjetković B. (2002) Prevention of exposure to

mycotoxins from food and feed. Arh Hig Rada Toksikol 53:229-237.

150. Peraica M, Domijan AM, Matašin M, Lucić A, Radić B, Delaš F, Horvat M, Bosanac I,

Balija M, Grgičević D. (2001) Variations of ochratoksin A concentration int he blood of

healthy populations in some Croatian cities. Arch Toxicol 75:410-414.

151. Peraica M, Rašić D. (2012) The impact of mycotoxicoses on human history. Arh Hig

Rada Toksikol 63:513-518.

152. Perry JJP, Shin DS, Getzoff ED, Tainer JA. (2010) The structural biochemistry of the

superoxide dismutases. Biochim Biophys Acta 1804:246-262.

153. Petkova-Bocharova T, Castegnaro M, Michelon J and Maru V. (1991) Ochratoxin A

and other mycotoxins in cereals from an area of Balkan endemic nephropathy and

urinary tract tumours in Bulgaria. In: Mycotoxins, Endemic Nephropathy and Urinary

Tract Tumours. Eds Castegnaro M, Plestina R, Dirheimer G, Chernozemsky IN and

Bartsch H. IARC Scientific Publications, 83-87.

154. Petrik J, Žanić-Grubišić T, Barišić K, Pepeljnjak S, Radić B, Ferenčić Ž, Čepelak I. (2003)

Apoptosis and oxidative stress induced by ochratoxin A in rat kidney. Arch Toxicol

77:685-693.

155. Petzinger E, Ziegler K. (2000) Ochratoxin A from a toxicological perspective. J Vet

Pharmacol Ther 23:91-98.

156. Pfeiffer E, Gross K, Metzler M. (1998) Aneuploidogenic and clastogenic potential of

the mycotoxins citrinin and patulin. Carcenogenesis 19:1313-1318.

157. Pfohl-Leszkowich A, Manderville RA. (2007) Ochratoxin A: An overview on toxicity

and carcinogenicity in animals and humans. Mol Nutr Food Res 51:61-99.

158. Pfohl-Leszkowich A, Molinie A, Tozlovanu M, Manderville RA. (2008) Combined toxic

effects of ochratoxin A and citrinin, in vivo and in vitro Experimental procedures

(American Chemical Society), chapter 3:56-79.

159. Pfohl-Leszkowich A, Tozlovanu M, Manderville RA, Peraica M, Castegnaro M,

Stefanovic V. (2007) New molecular and field evidences for the implication of

mycotoxins but not aristolochic acid in human nephropathy and urinary tract tumor.

Molec Nutrit Food Res 51:1131-1146.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petzinger%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10849253

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ziegler%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10849253

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10849253

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10849253

109

160. Pfohl-Leszkowicz A, Grosse Y, Kane A, Creppy E, Dirheimer G. (1993) Differential DNA

adduct formation and disappearance in three mice tissues after treatment by the

mycotoxin ochratoxin A. Mutation Res 289:265-273.

161. Pitt JI. (2000) Toxigenic fungi and mycotoxins. Food Science Australia 56:184-192.

162. Queiroz AN, Gomes BAQ, Moraes WM, Borges RS. (2009) A theoretical antioxidant

phamacophore for resveratrol. Eur J Med Chem 44:1644-1649.

163. Radić B, Fuchs R, Peraica M, Lucić A. (1997) Ochratoxin A in human sera in the area

with endemic nephropathy in Croatia. Tox Lett 91:105-109.

164. Raistrick H, Smith G. (1941) Anti-bacterial substances from moulds. Chem Ind London

6:828-830

165. Reddy BN, Nusrath M, Kumari CK, Nahdi S. (1983) Mycotoxin contamination in some

food commodities from tribal areas of Medak District, Andhra Pradesh. Indian

Phytopathology 36:683-686.

166. Reddy RV, Mayura K, Wallace Hayes A, Berndt WO. (1982a) Embryocidal teratogenic

and fetotoxic effects of citrinin in rats. Toxicology 25:151-160.

167. Reddy RV, Taylor MJ, Sharma RP. (1988b) Evaluation on citrinin toxicity on the

immune functions of mice. J Food Protect 51:32-36.

168. Reddy RV, Wallace Hayes A, Berndt WO. (1982) Disposition and metabolism of

14Ccitrinin in pregnant rats. Toxicology 25:161-174.

169. Reid LM, Zhu X, Ma BL. (2001) Crop rotation and nitrogen effects on maize

susceptibility to gibberella (Fusarium graminearum) ear rot. Plant Soil 237:1-14.

170. Ribeiro SMR, Chagas GM, Campello AP, Kluppel LW. (1997) Mechanism of citrinin-

induced dysfunction of mitochondria. V. Effect on the homeostasis of the reactive

oxygen species. Cell Biochem Funct 15:203-209.

171. Ringot D, Chango A, Schneider YJ, Larondelle Y. (2006) Toxicokinetics and

toxicodynamics of ochratoxin A, an update. Chem-Biolog Interact 159:18-46.

172. Robards K, Prenzler PD, Tucker G, Swatsitang P, Glover W. (1999) Phenolic

compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chem 66:401-436.

173. Rotches-Ribalta M, Andres-Lacueva C, Estruch R, Escribano E, Urpi-Sarda M. (2012)

Pharmacokinetics of resveratrol metabolic profile in healthy humans after moderate

consumption of red wine and grape extract tablets. Pharmacol Res 66:375-382.

110

174. Roth A, Chakor K, Creppy EE, Kane A, Roschenthaler R, Dirheimer G. (1988) Evidence

for an enterohepatic circulation of ochratoxin A in mice. Toxicology 48:293-308.

175. Sabater-Vilar M, Maas RFM, Fink-Gremmels J. (1999) Mutagenicity of commercial

Monascus fermentation products and the role of citrinin contamination. Mutat Res

444:7-16.

176. Samson RA Houbraken JAMP, Kujipers AFA, Frank JM, Frisvard JC. (2004) New

ochratoxin A or sclerotium producing species in Aspergillus section Nigri. Stud Mycol

50:45-61.

177. Santos L, Marin S, Sanchis V, Ramos AJ. (2009) Screening of mycotoxin

multicontamination in medicinal and aromatic herbs sampled in Spain. J Sci Food

Agricult 89:1802-1807.

178. Saxena J, Mehrotra BS. (1989) Screening of spices commonly marketed in India for

natural occurrence of mycrotoxins. J Food Composit Analysis 2:286-292.

179. Schaaf GJ, Nijmeijer SM, Maas RFM, Roestenberg P, Groene EM, Fink-Gremmels J.

(2002) The role of oxidative stress in the ochratoxin A-mediated toxicity in proximal

tubular cells. Biochim Biophys Acta 1588:149-158.

180. Schwerdt G, Freudinger R, Mildenberger S, Silbernagel S, Gekle M. (1999) The

nephrotoxin ochratoxin A induces apoptosis in cultured human proximal tubule cells.

Cell Biol Toxicol 15:405-415.

181. Scott PM, van Walbeek W, Kennedy B, Anyeti D. (1972) Mycotoxins (ochratoxin A,

citrinin and sterigmatocystin) and toxigenic fungi in grains and other agricultural

products. J Agr Food Chem 20:1103-1109.

182. Shinohara Y, Arai M, Hirao K, Sugihara S, Nakanishi K, Tsunoda H, Ito N. (1976)

Combination effect of citrinin and other chemicals on rat kidney tumorigenesis. Gann

67:147-155.

183. Siemann EH, Creasy LL. (1992) Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine.

Amer J Enology Viticult 43:49-52

184. Sies H. (1999) Glutathione and its role in cellular fumctions. Free Rad Biol Med

27:916-921.

185. Simarro Doorten Y, Nijmeijer S, de Nijs-Tjon L, Fink-Gremmels J. (2005) Metabolism-

mediated Ochratoxin A genotoxicity in the single-cell gel electrophoresis (Comet)

assay. Food Chem Toxicol 44:261-270.

111

186. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad OD. (2001) Presence of ocratoxin A in human

milki n relation to dietary intake. Food Addit Contam 4:321-327.

187. Slater I, Odum J, Ashby J. (1999) Resveratrol and red wine consumption. Hum

Experiment Toxicol 18:625-626.

188. Smith CA, O’Donovan MR, Martin EA. (2006) hOGG! Recognizes oxidative damage

using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis

21:185-190.

189. Soleas GJ, Diamandis EP, Goldberg DM. (1997) Resveratrol: a molecule whose time

has come? And gone? Clin Biochem 30:91-113.

190. Speijers GJA, Speijers MHM. (2004) Combined toxic effect of mycotoxins. Toxicol Lett

153:91-98.

191. Stoev SD, Anguelov G, Ivanov I, Pavlov D. (2000) Influence of ochratoxin A anda n

extract of artichoke on the vaccinal immunita and health in broiler Chicks. Exp Toxicol

Pathol 52:43-55.

192. Stoev SD, Daskalov H, Radic B, Domijan A, Peraica M. (2002) Spontaneous mycotoxic

nephropathy in Bulgarian chickens with unclarified mycotoxin aetiology. Vet Res

33:83–94.

193. Stoev SD, Hald B, Mantle P. (1998a) Porcine nephropathy in Bulgaria: a progressive

syndrome of complex of uncertain (mycotoxin) etiology. Vet Rec 142:190-194.

194. Stoev SD, Stoeva J, Anguelov G, Hald B, Creppy EE, Radic B. (1998b) Haematological,

biochemical and toxicological investigations in spontaneous cases with different

frequency of porcine nephropathy in Bulgaria. J Vet Med A 45:229-236.

195. Stoev SD. (2008) Complex Etiology, Prophylaxis and Hygiene Control in Mycotoxic

Nephropathies in Farm Animals and Humans. Int J Mol Sci 9:578–605. 196. Studer-Rohr I, Schlatter J, Dietrich DR. (2000) Kinetic parameters and intraindividual

fluctuations of ochratoxin A plasma levels in humans. Arch Toxicol 74:499-510.

197. Sun Y, Larry WO, Ying Li. (1988) Simple method for clinical assay of superoxide

dismutase. Clinical Chem 34:497-500. 198. Sun Y, Oberley LW, Li Y. (1988) A simple method for clinical assay of superoxide

dismutase. Clin Chem 34:497-500.

199. Šegvić Klarić M. (2012) Adverse effects od combined mycotoxins. Arh Hig Rada

Toksikol 63:519-530.

112

200. Šegvić Klarić M, Pepeljnjak S, Rozgaj R. (2008) Genotoxicity of Fumonisin B1,

Beauvericin and ochratoxin A in porcine kidney PK15 cells: effects of individual and

combined treatment. Croat Chem Acta 81:139-146.

201. Šegvić Klarić M, Želježić D, Rumora L, Peraica M, Pepeljnjak S, Domijan AM. (2012) A

potential role of calcium in apoptosis and aberrant chromatin citrinin. Arch Toxicol

86:97-107.

202. Thuvander A, Paulsen JE, Axberg K, Johansson N, Vidnes A, Enghardt-Barbieri H, Trygg

K, Lund-Larsen K, Jahrl S, Widenfalk A, Bosnes V, Alexander J, Hult K, Olsen M. (2001)

Levels of ochratoxin A in blood from Norvegian and Swedish blood donors and their

possible correlation with food consumption. Food Chem Toxicol 39:1145-1151.

203. Ueno Y. (1998) Residue and risk of ochratoxin A ih numan plasma and beverages in

Japan. Mycotoxins, No. 47:25-32.

204. Valenzano DR, terzibasi E, Genade T, Cattaneo A, Domenici L, Cellerino A. (2006)

Resveratrol prolongs lifespan and retards the onset of age-related markers in a short-

lived vertebrate. Current Biol 16:296-300.

205. Van der Merwe KJ, Steyn PS, Fourie L, Scoot DB, Theron JJ (1965) Ochratoxin A, a

toxic metabolite produced by Aspergillus ochraceus Wilh. Nature 205:1112-1113.

206. Varga J, Rigo K, Toth B, Teren J, Kozakiewicz Z. (2003) Evolutionary relationships

among Aspergillus species producing economically important mycotoxins. Food

Technol Biotechnol 41:29-36.

207. Vesela D, Vesely D, Jelinek R. (1983) Toxic effect of ochratoxin A and citrinin, alone

and in combination, on chicken embryos. Appl Environm Microbiol 45:91-93.

208. Visconti A, Pascale M, Centonze G. (1999) Determination of ochratoxin A in wine by

means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid

chromatography. J Chromatogr 846:89-101.

209. Vrabceva T, Usleber E, Dietrich R, Märtlbauer E. (2000) Co-occurrence of ochratoxin A

and citrinin in cereals from Bulgarian villages with a history of Balkan Endemic

Nephropathy. J Agric Food Chem 48:2483-2488.

210. Wang JS, Groopman JD. (1999) DNA damage by mycotoxins. Mutat Res 424:167-181.

211. Wang Z, Zou J, Cao K, Hseih T, Huang Y, Wu JM. (2005) Dealkoholized red wine

containing known amounts of resveratrol suppresses atherosclerosis in

113

hypercholesterolemic rabbits without affecting plasma lipid levels. Internat J Molec

Med 16:533-540.

212. Wehner FG, Thiel PG, van Resnburg SJ, Demasius IP. (1978) Mutagenicity to

Salmonella typhimurium of some Aspergillus and Penicillium mycotoxins. Mutat Res

58:193-203.

213. Wenzel E, Soldo T, Erbersdobler H, Somoza V. (2005) Bioactivity and metabolism of

trans-resveratrol orally administrated to Wistar rats. Molec Nutr Food Res 49:482-

494.

214. WHO/FAO (2001) Ochratoxin A in: Safety evaluation of certain mycotoxins in food.

Vol. 47. WHO Food Addit Series, pp. 281-415.

215. WHO/IPCS (2001) Safety evaluation of certain mycotoxins in food. WHO Food Addit

Series 47:281-416.

216. Würgler FE, Friedrich U, Schlatter J. (1991) Lack of mutagenicity of ochratoxin A and

B, citrinin, patulin and cnestine in Salmonella typhimurium TA102. Mutat Res

261:209-216.

217. Xu BJ, Jia XQ, Gu LJ, Sung CK. (2006) Review on the qualitative and quantitative

analysis of the mycotoxins citrinin. Food Control 17:271-285.

218. Zimmerli B, Dick R. (1995). Determination of ochratoxin A at the ppt level in human

blood, serum, milk and some foodstuffs by high-performance liquid chromatography

with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup:

methodology and Swiss data. J Chromatogr 666:85-99.

219. Žlender V, Breljak D, Ljubojević M, Flajs D, Balen D, Brzica H, Domijan A-M, Peraica M,

Fuchs R, Anzai N, Sabolić I. (2009) Low doses of ochratoxin A upregulate the protein

expression of organic anion transporters Oat1, Oat2 and Oat5 in rat kidney cortex.

Toxicol Appl Pharmacol 239:284-296.

114

10 SAŽETAK

Okratoksin A (OTA) i citrinin (CTN) su mikotoksini koji se često nalaze zajedno u žitaricama i

oba imaju nefrotoksična svojstva u svim do sada ispitivanim vrstama osim u preživača.

Sekundarni su metaboliti plijesni iz rodova Aspergillus i Penicillium. Mehanizam djelovanja

OTA nije do kraja istražen, a mehanizam djelovanja CTN-a gotovo je u potpunosti nepoznat.

Pretpostavlja se da je oksidacijski stres jedan od mehanizama djelovanja OTA i CTN-a. O

zajedničkom djelovanju ova dva mikotoksina na sisavce proveden je mali broj istraživanja, a

rezultati tih istraživanja nisu jednoznačni. U nekim je istraživanjima nađeno da je njihovo

djelovanje sinergistično, u drugima da je aditivno, a u nekim pak da je antagonistično.

Cilj istraživanja bio je na muškim odraslim Wistar štakorima ispitati mehanizam toksičnog

djelovanja OTA i CTN-a kao i zaštitni učinak poznatog antioksidansa RSV-a.

U preliminarnom su pokusu štakori tretirani s OTA (250 i 500 µg kg-1 tm) tijekom 10 dana te

su mjerene koncentracije OTA i malondialdehida (MDA) kao parametar lipidne peroksidacije

u urinu, bubregu i jetri. Koncentracija OTA bila je povećana u skladu s dozom, a najveća

koncentracija izmjerena je u jetri nakon tretmana višom dozom (112,21±35,36 ng g-1 tkiva).

Značajno povećanje MDA izmjereno je u jetri nakon tretmana višom dozom (261,23±10,30

nmol g-1 tkiva). Životinje su oralno gastričnom sondom tretirane s OTA (125 i 250 µg kg-1 tm) i

RSV-om (20 mg kg-1 tm) tijekom 21 dan i CTN-om (20 mg kg-1 tm) zadnja dva dana pokusa.

Nakon završetka pokusa životinje su žrtvovane te su uzorkovani krv, bubrezi, jetra i mozak. U

tim su organima izmjereni parametri oksidacijskog stresa: koncentracija MDA, glutationa

(GSH) kao i katalitička aktivnost superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation

peroksidaze (GPx) te koncentracija OTA i CTN-a. U stanicama bubrega i jetre hOGG1 komet

testom izmjereno je oksidacijsko oštećenje DNA.

U organima životinja najviše koncentracije OTA i CTN-a izmjerene su u bubrezima, a

najmanje u mozgu. Izmjerena koncentracija CTN-a bila je oko pet puta viša u organima

životinja koje su uz CTN tretirane i s OTA, negoli u životinja koje su tretirane samo CTN-om.

Tretman s OTA (125 i 250 µg kg-1) značajno je povisio koncentraciju MDA bubregu u odnosu

na kontrolu za 145% odnosno 170%. Sam CTN (20 mg kg-1) nije utjecao na promjenu

koncentracije MDA niti u jednom ispitivanom organu. Međutim, kada su životinje uz nižu

115

dozu OTA tretirane i CTN-om koncentracija MDA bila je viša u plazmi, bubregu i jetri za

128%, 194% odnosno 160% u odnosu na kontrole. Veća koncentracija MDA nađena je i u

plazmi i jetri životinja tretiranih višom dozom OTA i CTN-om za 132% odnosno 170% u

odnosu na kontrole. U životinja koje su osim mikotoksinima tretirane i RSV-om (20 mg kg-1)

nije nađena značajno veća koncentracija MDA osim u plazmi životinja koje su dobile višu

dozu OTA i CTN. Koncentracija GSH bila je značajno niža u bubregu i mozgu (69%, odnosno

77%) životinja koje su tretirane s višom dozom OTA. Tretman CTN-om uzrokovao je

smanjenje koncentracije GSH u plazmi (70% u odnosu na kontrole). Niža doza OTA zajedno s

CTN-om uzrokovala je smanjenje koncentracije GSH u jetri od 70% u odnosu na kontrolu, a

viša doza OTA zajedno s CTN-om smanjenje koncentracije GSH u bubregu i mozgu (66%

odnosno 85%). Nakon tretmana RSV-om snižena koncentracija GSH nađena je samo u

bubregu životinja koje su dobivale višu dozu OTA i CTN (71%). Katalitička aktivnost SOD-a bila

je smanjena u plazmi životinja koje su dobile višu dozu OTA, nižu dozu OTA i CTN kao i višu

dozu OTA, CTN i RSV. Tretman s obje doze OTA nije uzrokovao promjenu parametara komet

testa, dok je tretman CTN-om uzrokovao povećanje intenziteta repa kometa u bubrezima

tretiranih životinja (1,65±0,32%) u uspredbi s kontrolom (0,72±1,02). U životinja koje su osim

s OTA tretirane CTN-om intenzitet repa kometa bio je značajno veći pri obje doze OTA u

stanicama bubrega (5,33±1,55, 14,6±10,1%, p<0,001) nego u kontrolnih životinja (1,99±0,65,

1,90±5,80%). Isti je učinak na intenzitet repa kometa nađen i u stanicama jetre životinja

tretiranih s obje doze OTA i CTN-om (4,10±0,82, 35,0±9,9% p<0,001) u odnosu na kontrole

(1,04±0,11, 1,80±3,40%). Duljina repa kometa bila je viša u bubregu životinja tretiranih

nižom dozom OTA i CTN-om kao i u jetri životinja tretiranih višom dozom OTA i CTN-om. U

životinja koje su osim s OTA i CTN-om tretirane i RSV-om razlika u intenzitetu repa u

bubrezima bila je i nadalje značajna pri obje doze OTA kao i u jetri pri višoj dozi OTA, dok je

duljina repa bila značajno veća u bubregu i jetri samo nakon više doze OTA i CTN.

Iz rezultata ovih istraživanja vidljivo je da je koncentracija CTN-a u organima životinja koje su

tretirane s oba mikotoksina višestruko veća u odnosu na koncentraciju CTN-a u organima

životinja koje su tretirane samo CTN-om. Isto tako zajednički tretman životinja s oba

mikotoskina povećava oksidacijski stres u životinja u odnosu kada su tretirane mikotoksinima

pojedinačno. Iako je imao učinak na smanjenje MDA i povećanje GSH, tretman RSV-om nije

spriječio oksidacijsko oštećenje DNA.

116

11 SUMMARY

Ochratoxin A (OTA) and Citrinin (CTN) are mycotoxins commonly found together in grain.

Both were found to have nephrotoxic properties in all species experimented upon so far

except for ruminants. These secondary metabolites of mold are commonly produced by the

same species (Aspergillus and Penicillium). The toxicity mechanism of OTA has not been fully

explained, while the toxicity mechanism of CTN is all but unknown. It is hypothesized that

oxidative stress is one of the toxicity mechanisms of OTA and CTN. There has been little

research on the combined effects of both mycotoxins and the results are ambiguous at best.

Some papers state that the combined effect is synergistic, others say it is additive while

others still say it is antagonistic.

This thesis explores the combined effect of OTA and CTN applied to adult male Wistar rats,

as well as the protective effect of the well-known antioxidant resveratrol (RSV).

In a preliminary experiment, the animals have been treated with OTA (125 and 250 µg kg-1

bw) for 10 days. Concentrations of OTA and malondialdehyde (MDA) as a parameter of lipide

peroxidation in urine, kidney and liver tissue were measured. The OTA concentration was

increased in accordance with applied dosage, with the biggest levels measured in the liver

after treatment with the higher dosage (112,21±35,36 ng g-1 tissue). A significant increase in

MDA concentration levels was measured in liver tissue after treatment with the higher

dosage (261,23±10,30 nmol g-1 tissue). The animals have been treated via gastric probe with

OTA (125 and 250 µg kg-1 bw) for 21 days and RSV and CTN (20 mg kg-1 bw) for the last two

days of the experiment. After the experiment, they were sacrificed and blood, kidney, liver

and brain tissue were sampled. Parameters of oxidative stress were measured in the

samples taken: concentration of MDA and glutathione (GSH), catalytic activity of superoxide

dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). In the kidney and liver

tissue, the hOGG1 comet test was performed for oxidative DNA damage.

The highest concentration levels of OTA and CTN were measured in kidney tissue and the

lowest in brain tissue. The measured levels of CTN were five times higher in animals treated

with OTA also. The higher OTA dosage (250 µg kg-1) significantly increased the MDA levels in

kidney samples compared to the controls, by 145% and 170% respectively. CTN by itself did

117

not increase MDA levels in any of the sampled organs. However, when treated with the

lower dosage of OTA and CTN simultaneously, the MDA levels in plasma, kidney and brain

samples were 128%, 194% and 160% higher than in the controls. MDA levels were also

increased in plasma and liver samples from animals treated separately with higher OTA and

CTN dosages by 132% and 170%, respectively. In animals that were also treated with RSV (20

mg kg-1), the MDA levels were not significantly increased, except for the plasma in animals

treated with higher OTA and CTN dosages. GSH levels were significantly lower in kidney and

brain tissue samples (69% and 77%) from animals treated with the higher OTA dosage.

Treatment with CTN alone decreased GSH levels in plasma by 70%. The lower OTA dosage

with CTN decreased GSH levels in liver tissue by 70%. The higher OTA dosage with CTN

decreased GSH levels in kidney and brain tissue by 66% and 85%, respectively. After treating

with RSV, decreased GSH levels were found only in kidney tissue of animals receiving the

higher OTA dosage and CTN, 71% lower compared to controls. SOD catalytic activity was

reduced in plasma of animals receiving the higher OTA dosage, lower OTA dosage with CTN

and higher OTA dosage with CTN and RSV. Neither dosage of OTA caused a change in the

comet assay parameters. Tail intensity was increased in kidney tissue from animals treated

with CTN only (1.65±0.32%) compared to controls (0.72±1.02). When treated in combination

with CTN, tail intensity in the kidney tissue was significantly higher with both dosages of OTA

(5.33±1.55, 14.6±10.1%, p<0.001) compared to control values (1.99±0.65, 1.90±5.80%). The

same effect was also observed in liver samples from animals receiving both dosages of OTA

combined with CTN (4.10±0.82, 35.0±9.9% p<0.001) compared to controls (1.04±0.11,

1.80±3.40%). Comet tail length was higher in kidney tissue of animals receiving the lower

OTA dosage and CTN as well as in the liver tissue of animals receiving the higher OTA dosage

and CTN. In animals treated with RSV in addition to OTA and CTN, tail intensity for kidney

tissue was still displaying significant change for both OTA dosages. Tail intensity for liver

tissue was affected only by the higher OTA dosage. Tail length was significantly higher in

both kidney and liver tissue only after applying the higher OTA dosage combined with CTN.

These results clearly show that CTN concentration levels in organs of animals treated with

both mycotoxins are several times higher than in organs of animals treated only with CTN.

Also, the oxidative stress is significantly higher when both mycotoxins are applied together

as opposed to one by one. Although reducing MDA and increasing GSH levels, treatment

with RSV did not prevent DNA oxidative damage.

118

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Farmaceutsko-biokemijski fakultet Doktorski rad

UČINAK OKSIDACIJSKOG STRESA NA MEHANIZAM DJELOVANJA OKRATOKSINA A I CITRININA

Dubravka Rašić

Jedinica za toksikologiju, Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada, Zagreb, Hrvatska

Okratoksin A (OTA) i citrinin (CTN) su nefrotoksični mikotoksini koji se često zajedno nalaze u žitaricama.

Mehanizam djelovanja OTA nije do kraja istražen, a CTN-a je gotovo u potpunosti nepoznat. Zbog zajedničkog

pojavljivanja i pretpostavke da je u mehanizam njihove toksičnosti uključen oksidacijski stres provedena su

istraživanja na muškim odraslim Wistar štakorima koji su danomice oralno tretirani s OTA (125 i 250 μg kg-1

tm

x21), CTN-om (20 mg kg-1

tmx2) i resveratrolom (20 mg kg-1

tmx21). Ciljevi istraživanja bili su utvrditi: izaziva li

tretman CTN-om oksidacijski stres, utječe li tretman s OTA i CTN-om na povećanje oksidacijskog stresa u

pokusnim životinjima te može li tretman antioksidacijskim spojem resveratrolom smanjiti nastanak

oksidacijskog stresa izazvanog djelovanjem OTA i CTN. CTN je uzrokovao smanjenje koncentracije glutationa

(GSH) u plazmi i povećanje intenziteta repa kometa u bubregu. Nađeno je da CTN pojačava učinak OTA

povećanjem koncentracije MDA u plazmi i jetri, a posebice u bubregu gdje se taj učinak smanjuje tretmanom

resveratrolom. Zajedničkim tretmanom s OTA i CTN-om snižava se koncentracija GSH u jetri nakon niže

koncentracije OTA, a u bubregu i mozgu nakon više. Učinak dodatnog tretmana s resveratrolom jest značajno

niža koncentracija GSH nađena samo u bubregu. Budući da je snižena koncentracija GSH primijećena u bubregu

i mozgu pri većoj koncentraciji OTA, učinak na sniženje koncentracije GSH može se pripisati tom mikotoksinu.

Učinak tretmana s OTA i CTN-om nije bio jednoznačan na djelovanje antioksidacijskih enzima. Katalaza je bila

najmanje osjetljiva na djelovanje mikotoksina, a superoksid dismutaza najosjetljivija. Oštećenje DNA mjereno

kometskim testom bilo je izraženo kada su životinje tretirane s oba mikotoksina a intenzitet repa bio je

osjetljiviji parametar oštećenja. Primjena resveratrola nije spriječila oksidacijsko oštećenje DNA.

(124 stranice, 32 slike, 8 tablica, 219 literaturnih podataka, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u biblioteci Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta, A. Kovačića 1, Zagreb

Ključne riječi: okratoksin A, citrinin, resveratrol, pokusne životinje, malondialdehid, glutation, hOGG1, superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza

Mentor: Dr. sc. Maja Peraica, dr. med., znanstvena savjetnica

Ocjenjivači: Dr. sc. Maja Šegvić Klarić, izv. prof.

Dr. sc. Tihana Žanić Grubišić, red. prof

Dr. sc. Božica Radić, znanstvena savjetnica

Rad prihvaćen dana: 19. lipnja 2013.

119

BASIC DOCUMENTARY CARD

University of Zagreb Faculty of Pharmacy and Biochemistry Disertation

THE SIGNIFICANCE OF OXIDATIVE STRESS IN THE MECHANISM OF TOXICITY OF OCHRATOXIN A AND CITRININ

Dubravka Rašić

Unit of Toxicology, Institute for Medical Research and Occupational Health,Zagreb, Croatia

Ochratoxin A (OTA) and Citrinin (CTN) are nephrotoxic mycotoxins commonly found together in grain. The

toxicity mechanism of OTA has not been fully explained, while the toxicity mechanism of CTN is all but

unknown. Because they commonly appear together in nature and because it is hypothesized that oxidative

stress is somehow included in their toxicity mechanisms, a research was performed on adult male Wistar rats

which were treated daily with OTA (125 i 250 μg kg-1 bm x21), CTN (20 mg kg-1 bmx2) and resveratrol (20 mg

kg-1 bmx21). The goals of the research were to establish whether CTN treatment induces oxidative stress,

whether combined OTA and CTN treatment increases oxidative stress in tested animals and whether treatment

with the antioxidant compound resveratrol can reduce the levels of oxidative stress induced by OTA and CTN.

CTN treatment caused a reduction in glutathione (GSH) concentration levels in plasma samples and an increase

of comet tail length in kidney samples. It has been established that CTN augments the effects of OTA by

increasing malondialdehyde (MDA) concentration levels in plasma and liver tissue and especially in the kidneys

where this effect is reduced by resveratrol treatment. GSH concentration levels are decreased in liver samples

after treatment with both dosages of OTA, while kidney and brain samples display this reduction only after

treatment with the higher dosage. The effect of resveratrol treatment is that a significant reduction in GSH

concentration levels is found only in kidney samples. Since GSH concentration reduction was observed in all

experiments with higher OTA dosages, the effect can be attributed to that mycotoxin. The effect of the

combined OTA and CTN treatment on oxidative enzyme levels is ambiguous. Catalase activity was least

sensitive to the effect of mycotoxins, while superoxide dismutase activity was most sensitive. DNA damage

measured with the comet assay was prominent in animals treated with both mycotoxins with tail intensity

being the better damage indicator. Treatment with resveratrol did not prevent DNA oxidative damage.

(124 Pages, 32 figures, 8 tables, 219 references; original in Croatian)

Thesis deposited in the library of Faculty of Pharmacy and Biochemistry, A. Kovačića 1, Zagreb, Croatia

Key words: ochratoxin A, citrinin, resveratrol, experimental animals, malondialdehyde, glutathione, hOGG1, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase

Supervisor: Maja Peraica, MD, PhD

Reviewers: Prof. Maja Šegvić Klarić, PhD, Assoc. Prof.

Prof. Tihana Žanić Grubišić, PhD, Full Prof.

Božica Radić, PhD, Scientific Advisor

Thesis accepted: June 19th 2013

120

ŽIVOTOPIS

Rođena sam 10. studenog 1980. godine u Koprivnici. Osnovu školu i prirodoslovno-

matematičku gimnaziju završila sam u Križevcima. 1999. godine upisala sam studij biologije i

kemije na Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

gdje sam diplomirala 2005. godine i bila svrstana među 10% najboljih studenata ovog smjera

i stekla zvanje profesora biologije i kemije. Tijekom 2005. i 2006. godine bila sam vanjski

suradnik na Biološkom odsjeku PMF-a u Zagrebu na kolegijima Biologija stanica i Stanična i

molekularna biologija, a tijekom 2006. i 2007. godine radila sam kao učitelj prirode, biologije

i kemije u Osnovnoj školi Trnsko i Osnovnoj školi Frana Krste Frankopana u Zagrebu. Od

2007. godine zaposlena sam u Jedinici za toksikologiju Instituta za medicinska istraživanja i

medicinu rada na projektu „Utjecaj mikotoskina na ljude i životinje“ kojem je voditeljica dr.

sc. Maja Peraica. Iste godine upisala sam poslijediplomski doktorski studij Medicinsko-

biokemijske znanosti na Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu. Bila

sam član Organizacijskog odbora i tajnica IV. Hrvatskog toksikolškog kongresa, a tajnica sam i

Hrvatskog toksikološkog društva. Članica sam i Hrvatskog društva za biokemiju i molekularnu

biologiju i Hrvatskog mikološkog društva. Sudjelovala sam na nekoliko radionica, simpozija i

kongresa u Hrvatskoj i inozemstvu, a koautor sam na nekoliko znanstvenih i stručnih radova.

Popis radova

1. Znanstvene publikacije u časopisima koje citira baza Current Contents (CC)

1. Flajs D, Domijan A-M, Ivić D, Cvjetković B, Peraica M. (2009) ELISA and HPLC analysis

of ochratoxin A in red wine collected in Croatia. Food Control 20: 590-592.

2. Žlender V, Breljak D, Ljubojević M, Flajs D, Balen D, Brzica H, Domijan A-M, Peraica

M, Fuchs R, Anzai N, Sabolić I. (2009) Low doses of ochratoxin A upregulate the

protein expression of organic anion transporters Oat1, Oat2 and Oat5 in rat kidney

cortex. Toxicol Appl Pharmacol 239: 284-296.

121

3. Garaj-Vrhovac V, Gajski G, Pažanin S, Šarolić A, Domijan A-M, Flajs D, Peraica M.

(2011) Assessment of cytogenetic damage and oxidative stress in personnel

occupationally exposed to the pulsed microwave radiation of marine radar

equipment. Internat J Hyg Environ Health 214: 59-65.

4. Šuran J, Flajs D, Peraica M, Prevendar-Crnić A, Šperanda M, Božić F. (2013)

Pharmacokinetics of an immunomodulating dose of levamisole in weaned pigs. Acta

veterianaria Hungarica DOI: 10.1556/Avet.2013.020.

5. Šuran J, Prišć M, Rašić D, Srebočan E, Prevendar Crnić A. (2013) Malondialdehyde

and heavy metal concentrations in tissues of wild boar (Sus scrofa L.) from central

Croatia. J Environ Sci Health, Part B. 48:147-152.

6. Petlevski R, Flajs D, Kalođera Z, Zovko Končić M. (2013) Composition and antioxidant

activity of aqueous and ethanolic Pelargonium radula extracts. S Af J Botany; 85:

17–22.

2. Znanstvene publikacije u časopisima koje citira baza SCI Expanded i druge znanstvene

baze

1. Flajs D, Peraica M. Toxicological features of citrinin. (2009) Arh Hig Rada Toksikol 60:

457-464.

2. Peraica M, Flajs D. (2012) The impact of mycotoxicoses on human history. Arh Hig

Rada Toksikol 63: 513-517.

3. Znanstvena publikacija objavljena u elektronskom časopisu s recenzijom koji se ne

referira u sekundarnim i tercijarnim publikacijama

http://bib.irb.hr/prikazi-rad?&rad=503008



http://bib.irb.hr/prikazi-rad?&lang=EN%20Croatian%20Scientific%20Bib..&rad=505141




122

1. Peraica M, Flajs D, Domijan A-M, Ivić D, Cvjetković B. (2010) Ochratoxin A

contamination of food from Croatia. Toxins 2: 2098-2105. (doi:

10.3390/toxins2082098) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/journals

4. Znanstvena publikacija objavljena u zborniku radova s nacionalnog znanstvenog skupa

1. Peraica M, Flajs D. Opasnosti od izloženosti mikotoksinima u dječjoj dobi. (2012)

Zbornik radova Proljetnog pedijatrijskog simpozija, 4.-5. ožujka 2012., Osijek (Ereš

Hrvaćanin Z, Aberle N, ur.) (u tisku)

5. Sažetak objavljen u časopisu s međunarodnom recenzijom koji se referira u CC

1. Peraica M, Marjanović A, Flajs D, Domijan A-M, Gajski G, Garaj-Vrhovac V. (2008) Oxidative

stress in workers occupationally exposed to microwave radiation. Abstracts of the 44th

European Congress of Toxicology, Rodos, Grčka, 2008: S156. Toxicol Lett 2008; 180S:S38. 2. Flajs D, Domijan A-M, Ivić D, Cvjetković B, Peraica M. ELISA and HPLC analysis of ochratoxin

A in red wine collected in Croatia. Abstracts of the 44th European Congress of Toxicology,

Rodos, Grčka, 2008: S156. Toxicol Lett 2008; 180S:S182. 3. Peraica M, Domijan A-M, Flajs D, Pavlović M. MDA and 8-OHdG in urine of elderly persons

from two regions in Croatia with different diet habits. Abstracts of the 45th European

Congress of Toxicology, Dresden, Njemačka, Toxicol Lett 2009: S189:S119. 4. Flajs D, Pizent A, Domijan A-M, Peraica M. Concentration of malodnialdehyde in plasma of

lead-workers. Abstracts of the 45th European Congress of Toxicology, Dresden, Njemačka,

Toxicol Lett 2009: S189:S119. 5. Peraica M, Flajs D. HE time course of kidney lesions in ochratoxin a treatment.

Abstracts of the 46th European Congress of Toxicology, Barcelona, Španjolska,

ToxicolLett2010:S196:S239 6. Flajs D, Želježić D, Mladinić M, Peraica M. Effects of citrinin treatment on oxidative stress in

rat kidney. Abstracts of the 46th European Congress of Toxicology, Barcelona, Španjolska,

Toxicol Lett 2010: S196:S239 7. Peraica M, Flajs D, Mladinić M, Želježić D, Balen Eror D, Koepsell H, Sabolić I. Oxidative

stress and Na+-glucose cotransporters Sglt1 and Sglt2 in kidneys of ochratoxin A-treated

rats. Abstracts of the 47th European Congress of Toxicology, Pariz, Francuska, Toxicol Lett

2011: S205:S275 8. Flajs D, Mladinić M, Želježić D, Peraica M. Citrinin potentiates ochratoxin A toxicity.

Abstracts of the 47th European Congress of Toxicology, Pariz, Francuska, Toxicol Lett

2011:S205:S220-221.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/journals

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037842741000929X?_alid=1800964886&_rdoc=4&_fmt=high&_origin=search&_docanchor=&_ct=8&_zone=rslt_list_item&md5=c2131a42e1f9df0c7074b320228d4e1f

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378427410009288?_alid=1800964886&_rdoc=3&_fmt=high&_origin=search&_docanchor=&_ct=8&_zone=rslt_list_item&md5=ffe43c033e711a5a046323e6f89575f7

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378427410009288?_alid=1800964886&_rdoc=3&_fmt=high&_origin=search&_docanchor=&_ct=8&_zone=rslt_list_item&md5=ffe43c033e711a5a046323e6f89575f7

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378427411011337?_alid=1800964886&_rdoc=1&_fmt=high&_origin=search&_docanchor=&_ct=8&_zone=rslt_list_item&md5=9e50da34fb0964551b46e5e6592ca56f



http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378427411009568?_alid=1800964886&_rdoc=2&_fmt=high&_origin=search&_docanchor=&_ct=8&_zone=rslt_list_item&md5=797a4bd95d7da174fd604d435e7858ca

123

6. Stručni radovi u časopisu s recenzijom koji se referira u neselektivnim sekundarnim i

tercijarnim publikacijama (Index Medicus, Excerpta Medica, Chemical Abstracts i sl).

1. Peraica M, Domijan A-M, Flajs D, Ivić D, Cvjetković B. The exposure of general

population in Croatia to ochratoxin A. Krmiva 2008; 50: 27-33. 2. Peraica M, Flajs D, Domijan A-M, Ivić D, Cvjetković B. Vina mogu biti kontaminirana

mikotoksinima. Glasilo biljne zaštite 2010; 10: 241-245.

7. Sažetak objavljen u zborniku sažetaka sa nacionalnog znanstvenog skupa

1. Peraica M, Domijan A-M, Flajs D, Ivić D, Cvjetković B. Izloženost opće populacije u Hrvatskoj

okratoksinu A. XV. međunarodno savjetovanje Krmiva 2008. Opatija 2.-5. lipnja 2008.

Program i sažeci radova str. 31. 2. Flajs D, Domijan A-M, Ivić D, Cvjetković B, Peraica M. Okratoksin A u vinima u

Republici Hrvatskoj. 2. hrvatski znanstveni simpozij s međunarodnim sudjelovanjem

Gljivice i mikotoksini – zdravstveni aspekti i prevencija. Zagreb 5. prosinca 2008.

str.78. 3. Marjanović AM, Domijan A-M, Flajs D, Pavičić I. Pokazatelji oksidacijskog oštećenja

makromolekula i antioksidacijske obrane u ispitanika izloženih radarskom zračenju

frekvencija od 1, 5 GHz - 10, 9 GHz. Zbornik radova osmog simpozija hrvatskog

društva za zaštitu od zračenja. Krajcar Bronić, I ; Kopjar, N ; Milić, M ; Branica, G

(ur.). Zagreb, 2011. 513-519. 4. Flajs D, Peraica M. Oxidative of brain tissue damage in rats treated with ochratoxin

A and citrinin. Programme and Abstracts „Power of Funghi and Mycotoxins in

Health and Disease“, Primošten, 19.-22. listopada 2011. Antolović R, Miličević T (ur.)

2011. str. 58. 5. Novak I, Flajs D, Peraica M. Glutathione and MDA in tissues of rats treated with

ochratoxin A. Programme and Abstracts „Power of Funghi and Mycotoxins in Health

and Disease“, Primošten, 19.-22. listopada 2011. Antolović R, Miličević T (ur.) 2011.

str. 86-86. 6. Rašić D, Peraica M. Resveratrol reduces oxidative damage in the rat liver caused by

ochratoxin A and citrinin. Abstracts of the 4th Croatian Congress of Toxicology

(CROTOX 2012). Arg Hig Rada Toksikol 2012:63(Suppl. 2):P27,str.41. 7. Milić M, Rašić D, Angelini S, Peraica M. Influence of hOGG1 ang XRCC1

polymorphism on MDA concentrations in occupationally exposed radiation workers

after irradiation. Abstracts of the 4th Croatian Congress of Toxicology (CROTOX

2012). Arg Hig Rada Toksikol 2012:63(Suppl. 2):P52,str.54.




124

8. Sažetak objavljen u zborniku sažetaka sa međunarodnog znanstvenog skupa

1. Flajs D, Domijan A-M, Miletić-Medved M, Peraica M. Concentration of

malondialdehyde in human urine samples from area of endemic nephropathy.

Federation of European Biochemical Societies Workshop on lipids as regulators of

cell function, Spetses, Grčka 16.-21. lipnja 2008. Programme and Abstracts str. 2. Flajs D, Domijan A-M, Žlender V, Sabolić I, Peraica M. The effect of treatment with

ochratoxin A on oxidative stress in rat liver and kidney. Federation of European

Biochemical Societies Advanced Course on Mechanisms, Consequences and

Detection of Free Radical-Mediated Oxidative Protein Modifications, Kemer Antalya,

Turska 15.-20. travnja 2009. Programe and Abstract Book, str. 78. 3. Peraica M, Domijan A-M, Flajs D, Pavlović M. The impact of Mediterranean diet on

MDA and on 8-OhdG concentrations in urine of elderly persons: comparison in

Croatian regions with different diet habits. Research symposium on clinical trials

with frail elderly persons. Rim, Italija 18-19. XI. 2009.

ELISA and HPLC analysis of ochratoxin A in red wines of Croatia

D. Flajs a,*, A.-M. Domijan a, D. Ivic b, B. Cvjetkovic b, M. Peraica a

a Unit of Toxicology, Institute for Medical Research and Occupational Health, Ksaverska c. 2, 10000 Zagreb, Croatiab Department of Plant Pathology, Faculty of Agronomy, University of Zagreb, Svetošimunska 25, 10000 Zagreb, Croatia

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 28 March 2008Received in revised form 21 August 2008Accepted 26 August 2008

Keywords:Ochratoxin AELISAHPLCAspergillus carbonarius

a b s t r a c t

Ochratoxin A (OTA) contaminates wine all round the world, and its consumption may significantly increasehuman exposure to this toxin. In this study, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and high-perfor-mance liquid chromatography (HPLC) for OTA analysis were tested on must and wine samples collected inCroatia. The results of ELISA and HPLC analysis of OTA in naturally contaminated red wines correlated well(r = 0.821), and the correlation was better at higher OTA concentrations. In contrast to HPLC, ELISA couldnot detect very low OTA concentrations. OTA concentrations in must (range 19–50 ng/l) were higher thanin the wines (range 0–21 ng/l). No must samples showed the presence of Aspergillus carbonarius, which is acommon OTA-producing mould affecting grapes.

� 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Humans are continuously exposed to a nephrotoxic mycotoxinochratoxin A (OTA) that naturally occurs in various commodities.OTA contaminates cereals and cereal products, coffee, beans, porkmeat and meat products, milk and milk products, eggs, wine, andbeer all over the world (Speijers & van Egmond, 1993). The impor-tance of OTA control in various commodities is emphasised by thefact that every commodity may contribute to OTA exposure. Theoverall exposure to OTA in European countries is not such that itcould present a serious healthcare problem (Peraica, Domijan,Fuchs, Lucic, & Radic, 1999). However, Zimmerli and Dick, the firstscientists that found OTA in wine, claimed that OTA exposuremight be doubled by moderate red wine consumption (Zimmerli& Dick, 1996).

It is well known that the main producers of OTA in wine arestrains of Aspergillus carbonarius and Aspergillus niger that contam-inate grapes. Based on a literature research and results of owninvestigation Ottender and Majerus claim that OTA is detectedmore commonly in red wines than in rosés and white wines, whichis the consequence of differences in winemaking procedures(Ottender & Majerus, 2000). These results were confirmed by otherauthors, including our earlier study on wines collected in Croatia(Belli, Marin, Sanchis, & Ramos, 2002; Domijan & Peraica, 2005).Similar to Ottender and Majerus in the mentioned study, we alsonoticed a geographical pattern of OTA appearance; the wines fromthe south had more OTA than wines from the north of Croatia.

Overall mean concentration of OTA in the European countries isnot high, and except for the Italian red wines, it does not exceed100 ng/l (Varga & Kozakiewicz, 2006). The European Food SafetyAuthority (EFSA) has set a maximum level for OTA of 2.0 ng/g forall types of wines. Low levels such as this require very sensitiveanalytical methods. Nowadays, the most commonly used methodfor determination of OTA in wine is high-performance liquid chro-matography (HPLC) with fluorescent detection after the immuno-affinity cleanup procedure. This method, originally published byVisconti, Pascale, and Centonze (1999) is recommended by theEuropean Standard prEn 14133. The HPLC method, as well as pre-viously used thin-layer chromatography (TLC) method requires atime-consuming sample cleanup. In contrast, immunochemical en-zyme-linked immunosorbent assay (ELISA) requires low volumesamples and quicker sample cleanup. ELISA is rapid, simple, spe-cific, and sensitive, but may sometimes result in systematic overes-timate if compared to the chromatographic methods (Belli et al.,2002).

In this study we performed a mycological test for A. carbonariusof red must and determined OTA concentrations using HPLC andELISA in must and wine samples. The rationale for red wine testingwas that red wine is usually contaminated with higher OTA con-centrations than white wine.

2. Materials and methods

2.1. Samples

We collected six red must samples, six wine samples producedfrom the same musts, and four samples of bottled wines from 2007

0956-7135/$ - see front matter � 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.foodcont.2008.08.021

* Corresponding author.E-mail address: [email protected] (D. Flajs).

Food Control 20 (2009) 590–592

Contents lists available at ScienceDirect

Food Control

journal homepage: www.elsevier .com/locate / foodcont

mailto:[email protected]

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09567135

http://www.elsevier.com/locate/foodcont

crop. All samples originated from the coastal Croatia. Must sampleswere kept at �20 �C, and wine at room temperature until analysis.

2.2. Mycological analysis

1, 10 and 100 ll of must were diluted in 10 ml of sterile water.1 ml of dilutions were poured over three Petri dishes with semi-selective MEA-B medium developed by Pollastro, De Miccolis,and Faretra (2006), containing agar (20 g/l), malt extract (20 g/l),chloramphenicol (50 mg/l), dichloran (0.2% w/v), chlortetracycline(50 mg/l), and boscalid (10 mg/l). The dilutions were 1:10000, 1:1000 and 1:100, respectively. The dishes were incubated at 25 �Cand checked for the presence of A. carbonarius colony-formingunits after 3, 6, 10, and 14 days. All samples were tested twice, 1day after collection and 9 days after collection.

2.3. Reagents

OTA standard was obtained from Sigma Chemicals (St. Louis,MO, USA). All chemicals were of the analytical grade and solventsfor mobile phase were of the HPLC grade.

The ELISA test kit (I’screen Ochratoxin A) was supplied by Tec-na, Trieste, Italy.

A stock solution of OTA was prepared in methanol (1.0 mg OTA/ml methanol). The concentration of the stock solution was checkedspectrophotometrically at 333 nm using 6640 M�1 cm�1 as theextinction coefficient. The working standards for HPLC analysiswere prepared by adding known amounts of the diluted stock solu-tion to the HPLC mobile phase to give final concentrations from 0.5to 10.0 ng OTA/ml. The working standards were freshly preparedevery week.

2.4. Extraction and cleanup

2.4.1. HPLC analysisHPLC analysis was performed as described earlier (Domijan &

Peraica, 2005). For HPLC analysis, an aliquot of 10.0 ml of wine ormust sample was diluted with 10.0 ml of a PBS-buffer. After adjust-ing pH to 7.0–7.5 with 10 M NaOH, the sample was filtered througha microfibre filter paper. Ten milliliter of filtrate was applied ontoan immunoaffinity column (IAC; OchraTest, Vicam, Watertown,MA, USA). The column was washed with 10.0 ml PBS-buffer andthen with 10.0 ml water. OTA was eluted from the IAC using4.0 ml methanol acidified with acetic acid (98:2) (v/v). The eluatewas collected and evaporated to dryness under a stream of nitro-gen. Before HPLC analysis, the evaporated samples were dissolvedin 200 ll of the mobile phase. OTA was identified by constantretention time and quantified by comparison with peak areas ofstandards in the mobile phase. The standard curve was linear(r2 = 0.9987) and the detection limit was 5 ng/l.

2.4.2. ELISA analysisFive milliliter of 1 M HCl and 5.0 ml of chloroform were added

to 5.0 ml of must or wine sample and shaken in a low-speed shakerfor 20 min. The mixture was centrifuged at 2000g for 20 min. Thelower (organic) layer was collected and washed twice with2.0 ml of bicarbonate (0.1 M). Pooled bicarbonate phases wereacidified with formic acid and extracted twice with chloroform(2.0 ml). The chloroform phases were combined and evaporatedin a stream of nitrogen. The residue was dissolved in 200 ll of0.1 M bicarbonate (pH 8.1) and applied immediately after dissolv-ing to the ELISA plate. Each sample was applied in triplicate. Theintensity of the resulting yellow colour was measured at 450 nmon the microplate reader (Victor 3, Perkin Elmer, Shelton, CT,USA). The OTA concentration was calculated by comparing withthe standards provided by the manufacturer. The ELISA calibration

curve of OTA standards (0.05–5.0 ng/ml) diluted in bicarbonate0.1 M (pH 8.1) supplied by the manufacturer was highly reproduc-ible, as indicated by the low mean standard deviation (CV 1.85%).

2.5. Chromatographic condition

The HPLC apparatus consisted of a gradient pump and fluores-cent detector (Varian, Walnut-Creek, CA, USA). The separationwas performed on the analytical column (125.0 � 4.0 mm) coupledwith guard column (4.0 � 4.0 mm) LiChrospher RP-18 (Merck,Darmstadt, Germany) with 5 lm particles. Chromatography resultswere collected and processed using the Star ChromatographyWorkstation software (Ver. 5.0, Varian, Walnut-Creek, CA, USA).

For OTA detection, the mobile phase consisted of methanol,water, and acetic acid (70:30:2) with the flow rate of 0.5 ml/min.Detector wavelengths were set at kex 336 and kem 464.

2.6. Statistics

OTA concentration in must and wine samples detected by HPLCand ELISA were compared using the correlation test to obtain lin-ear regression equation and correlation coefficient (DescriptiveStatistics, Statistic software 5.0, StatSoft Inc., USA).

3. Results and discussion

No colony of A. carbonarius, the most common OTA produceraffecting grape berries, was detected on the MEA-B plates 14 daysafter inoculation with diluted must samples. On selective mediathere were no viable A. carbonarius propagule (spores or myceliumfragments). It is possible that OTA-contamination of must wascaused by some other OTA-producing fungal species such as A.tubingensis (Perrone et al., 2006), A. ochraceus (Rosa et al., 2002)or A. niger (Perrone et al., 2006; Tjamos et al., 2004).

In addition to HPLC, common analytical methods for OTA deter-mination are the TLC and ELISA. HPLC and TLC require extensivesample preparation. ELISA is considered a reliable and fast methodfor determination of OTA in different commodities (Fujii et al.,2007; Matrella, Monaci, Milillo, Palmisano, & Tantillo, 2006; Zhenget al., 2005). ELISA test kits are favoured because they require lowsample volume and quicker sample cleanup than the conventionalmethods such as TLC and HPLC. The ELISA is based on the reactionof antigen–antibody, but antibodies often show cross-reactivity tocompounds similar to mycotoxins (Zheng et al., 2005).

Our ELISA analysis of wine samples according to the kit manu-facturer instructions resulted in surprisingly high OTA concentra-tion (140 ng/l). Visconti et al. (1999) have mentioned theproblems in OTA analysis in red wine which may be attributed tothe presence of several anthocyanins and other pigments thatinterfere with OTA-binding to the antibody, giving false positiveresults. When we introduced IAC extraction of OTA in the cleanupprocedure before ELISA, following the advice from the literature(Varga & Kozakiewicz, 2006), the OTA concentration in the samesample was much lower (8 ng/l). IAC seem to eliminate the inter-fering substances, but their use significantly increases the cost ofthe analysis.

The other modification of the original manufacturer’s methodwas the introduction of an additional step in sample purificationused for other matrices (Peraica et al., 1999). More specifically,we additional extracted OTA from the bicarbonate phase into theorganic solvent. The organic solvent was evaporated to drynesswhich made possible the detection of very low OTA concentrations.The results of the analysis of the same wine sample were similar tothose obtained with the IAC used for sample preparation (9 ng/l).From the economical point of view the other tested modification

D. Flajs et al. / Food Control 20 (2009) 590–592 591

of additional OTA-extraction from the bicarbonate phase into theorganic solvent is more advisable, but it takes away the otherimportant advantage of ELISA, that is, rapid and simple cleanup.

With this modification some must and wine samples were ana-lysed by ELISA method. The results were compared with HPLC re-sults for the same samples (Table 1). We found a better correlationof the results at higher than at lower OTA concentrations. Linearregression analysis gave a slope y = 0.006 + 0.636x, and the Pear-son’s correlation coefficient was high (r = 0.821).

Wine OTA concentrations obtained by HPLC were comparablewith our previous study (Domijan & Peraica, 2005). Two (out of10) wine samples did not contain detectable OTA concentrations;in two samples OTA was at the detection limit (5 ng/l), and in oth-ers samples it was in the range between 14 and 21 ng/l (Table 2). Incontrast to wine, all must samples contained detectable OTA con-centrations (range 19–50 ng/l). OTA in must is released fromOTA-contaminated grapes during crushing and maceration, butits concentration decreases during fermentation, with further de-crease during sedimentation (Grazioli, Fumi, & Silva, 2006).Although the OTA concentration decreases during winemaking,its elimination is not complete.

4. Conclusions

Not even after 14 days of inoculation did we find a colony of A.carbonarius, the most common producer of OTA, in our must andwine samples. This points to the presence of other OTA producers.The method of OTA-extraction recommended by the ELISA manu-

facturer is not appropriate for red wines because of the interfer-ence of chromogenes. The introduction of IAC or additionalcleanup with bicarbonate eliminate this interference, and the lattermethod gives results that correlate well with the results obtainedby HPLC.

The concentration of OTA in wine samples was lower than inthe must samples, and the overall OTA concentration was similarto that of red wines in our earlier study.

Acknowledgements

We wish to thank Mrs. Mirjana Matašin for technical assistance.We thank Dr. sc. Ivancica Trošic and Mr. sc. Ivan Pavicic for per-forming microplate reader measurements. The financial supportof the Ministry of Science, Education and Sports of the Republicof Croatia is greatly acknowledged (Grant Nos. 0022-0222148-2142 and 178-1781844-2692).

References

Belli, N., Marin, S., Sanchis, V., & Ramos, A. J. (2002). Review: Ochratoxin A (OTA) inwines, musts and grape juices: Occurrence, regulations and methods ofanalysis. Food Science and Technology International, 8, 325–335.

Da Rocha Rosa, C. A., Palacios, V., Combinas, M., Fraga, M. E., De Oliveira Rekson, A.,Magnoli, et al. (2002). Potential ochratoxin A producers from wine grapes inArgentina and Brazil. Food Additives and Contaminants, 19, 408–414.

Domijan, A. M., & Peraica, M. (2005). Ochratoxin A in wine. Arhiv za higijenu rada itoksikologiju, 56, 17–20.

Fujii, S., Sataque Ono, E. Y., Reche Ribeiro, R. M., Algarte Assuncao, F. G., Takabayashi,C. R., de Oliveira, Rocha Moreira, et al. (2007). A comparison between enzymeimmunoassay and HPLC for ochratoxin A detection in green, roasted and instantcoffee. Brazilian Archives of Biology and Technology, 50, 349–359.

Grazioli, B., Fumi, M. D., & Silva, A. (2006). The role of processing on ochratoxin Acontent in Italian must and wine: A study on naturally contaminated grapes.International Journal of Food Microbiology, 11, 93–96.

Matrella, R., Monaci, L., Milillo, M. A., Palmisano, F., & Tantillo, M. G. (2006).Ochratoxin A determination in paired kidneys and muscle samples from swinesslaughtered in southern Italy. Food Control, 17, 114–117.

Ottender, H., & Majerus, P. (2000). Occurrence of ochratoxin A (OTA) in wines:Influence of the type of wine and its geographical origin. Food Additives andContaminants, 17, 793–798.

Peraica, M., Domijan, A. M., Fuchs, R., Lucic, A., & Radic, B. (1999). The occurrence ofochratoxin A in blood in general population of Croatia. Toxicology Letters, 110,105–112.

Perrone, G., Mulè, G., Susca, A., Battilani, P., Pietri, A., & Logrieco, A. (2006).Ochratoxin A production and amplified fragment length polymorphism analysisof Aspergillus carbonarius, Aspergillus tubingensis, and Aspergillus niger strainsisolated from grapes in Italy. Applied and Environmental Microbiology, 72,680–685.

Pollastro, S., De Miccolis, R. M., & Faretra, F. (2006). A new semi-selective mediumfor the ochratoxigenic fungus Aspergillus carbonarius. Journal of Plant Pathology,88, 107–112.

Speijers, G. J. A., & van Egmond, H. P. (1993). Worldwide ochratoxin A levels in foodand feeds. In E. E. Creppy, M. Dirheimer, & G. Castegnaro (Eds.), Humanochratoxicosis and its pathologies (pp. 85–100). Montrouge: John Libbey EurotoxLtd..

Tjamos, S. E., Antoniou, P. P., Kazantzidou, A., Antonopoulos, D. F., Papageorgiou, I., &Tjamos, E. C. (2004). Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius in Corinthraisin and wine-producing vineyards in Greece: Population composition,ochratoxin A production and chemical control. Journal of Phytopathology, 152,250–255.

Varga, J., & Kozakiewicz, Z. (2006). Ochratoxin A in grapes and grape-derivedproducts. Trends in Food Science & Technology, 17, 72–81.

Visconti, A., Pascale, M., & Centonze, G. (1999). Determination of ochratoxin A inwine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performanceliquid chromatography. Journal of Chromatography A, 864, 89–101.

Zheng, Z., Hanneken, J., Houchins, D., King, R. S., Lee, P., & Richard, J. L. (2005).Validation of an ELISA test kit for the detection of ochratoxin A in several foodcommodities by comparison with HPLC. Mycopathologia, 159, 265–272.

Zimmerli, B., & Dick, R. (1996). Ochratoxin A in table wine and grape-juice:Occurrence and risk assessment. Food Additives and Contaminants, 13, 655–668.

Table 1Determination of ochratoxin A using HPLC and modified ELISA method in naturallycontaminated must and wine samples (y = 0.006 + 0.636x; r = 0.82)

Sample HPLC (ng/l�1) ELISA (ng/l�1)

Must Crljenak 44 40Zinfandel 21 13Plavac mali 19 12Regent 19 9

Wine Crljenak 20 20Zinfandel 14 20Plavac mali 5 13Plavac malia 0 9

a Bottled wine.

Table 2OTA concentrations in red musts and wines measured using the HPLC method

Cultivar OTA (ng/l)

Musts Wines Must Wine

Crljenak Crljenak 44 20Dobrincic Dobrincic 50 19Glavinuša Glavinuša 30 18Nincuša Nincuša 25 0Plavac mali Plavac mali 19 5Zinfandel Zinfandel 21 14– Babic 16– Frankovka 5– Portugizac 21– Plavac malia 0

a Bottled wine.

592 D. Flajs et al. / Food Control 20 (2009) 590–592

Low doses of ochratoxin A upregulate the protein expression of organic aniontransporters Oat1, Oat2, Oat3 and Oat5 in rat kidney cortex

Vilim Žlender a, Davorka Breljak b, Marija Ljubojević b, Dubravka Flajs a, Daniela Balen b, Hrvoje Brzica b,Ana-Marija Domijan a, Maja Peraica a, Radovan Fuchs a, Naohiko Anzai c, Ivan Sabolić b,⁎a Unit of Toxicology, Institute for Medical Research and Occupational Health, Zagreb, Croatiab Molecular Toxicology, Institute for Medical Research and Occupational Health, Ksaverska cesta 2, HR-10001, Zagreb, Croatiac Department of Pharmacology and Toxicology, Kyorin University School of Medicine, Tokyo, Japan

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:Received 5 February 2009Revised 22 May 2009Accepted 8 June 2009Available online 16 June 2009

Keywords:KidneyMembrane transportersMycotoxinsNephrotoxicityOrganic anionsPAHProximal tubule

Mycotoxin ochratoxin A (OTA) is nephrotoxic in various animal species. In rodents, OTA intoxication impairsvarious proximal tubule (PT) functions, including secretion of p-aminohippurate (PAH), possibly viaaffecting the renal organic anion (OA) transporters (Oat). However, an effect of OTA on the activity/expression of specific Oats in the mammalian kidney has not been reported. In this work, male rats weregavaged various doses of OTA every 2nd day for 10 days, and in their kidneys we studied: tubule integrity bymicroscopy, abundance of basolateral (rOat1, rOat3) and brush-border (rOat2, rOat5) rOat proteins byimmunochemical methods, and expression of rOats mRNA by RT-PCR. The OTA treatment caused: a) dose-dependent damage of the cells in S3 segments of medullary rays, b) dual effect upon rOats in PT: low doses(50–250 μg OTA/kg b.m.) upregulated the abundance of all rOats, while a high dose (500 μg OTA/kg b.m.)downregulated the abundance of rOat1, and c) unchanged mRNA expression for all rOats at low OTA doses,and its downregulation at high OTA dose. Changes in the expression of renal Oats were associated withenhanced OTA accumulation in tissue and excretion in urine, whereas the indicators of oxidative stress eitherremained unchanged (malondialdehyde, glutathione, 8-hydroxydeoxyguanosine) or became deranged(microtubules). While OTA accumulation and downregulation of rOats in the kidney are consistent withthe previously reported impaired renal PAH secretion in rodents intoxicated with high OTA doses, the post-transcriptional upregulation of Oats at low OTA doses may contribute to OTA accumulation and developmentof nephrotoxicity.

© 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Ochratoxin A (OTA) is ubiquitous fungal metabolite and foodcontaminant with nephrotoxic and carcinogenic potential inanimals and humans (EFSA, 2006; Kuiper-Goodman and Scott,1989; Pfohl-Leszkowicz and Manderville, 2007). It has been shownin various animal models (rat, pig, chicken) that OTA: a) accumulateslargely in the proximal tubule (PT) cells, b) induces dose- and time-dependent impairment of PT function, resulting in limited polyuria,glucosuria, proteinuria and enzymuria, and diminished secretion oforganic anions (OA), c) damages the renal structure, manifested bytubule degeneration, apoptosis, necrosis, and exfoliation of PT cells,predominantly involving the pars recta segment (S3), and d) causesfocal tubular proliferative effects, including cell hyperplasia andtubular cell adenoma and carcinoma (Boorman et al., 1992;Castegnaro et al., 1998; Kuiper-Goodman and Scott, 1989; Kumaret al., 2007; Lee et al., 1984; Rached et al., 2007; Sauvant et al., 2005).

In some studies, usually after treating experimental animals withOTA for a few months or years, cellular mechanisms of OTA toxicitywere associated with increased lipid peroxidation and formation ofmalondialdehyde (MDA), DNA damage, and apoptosis, and werecounteracted by the scavengers of reactive oxygen species (ROS),thus indicating oxidative stress as a possible mediator of toxicity(Cavin et al., 2007; Grosse et al., 1997; Kamp et al., 2005; Petrik et al.,2003; Ringot et al., 2006; Schaaf et al., 2002).

OTA has a long plasma half life in the body, mainly due to bindingto serum proteins, slow biotransformation, entero-hepatic circulation,and reabsorption in kidney (Fuchs and Hult,1992). The renal excretionof OTA via glomerular filtration is limited, and largely proceeds viatransepithelial secretion in PT (Bahnemann et al., 1997; Jung et al.,2001; Welborn et al., 1998). The filtered and/or secreted OTA ispartially reabsorbed along the nephron, mostly in the PT S3 segments(Dahlmann et al., 1998; Zingerle et al., 1997). Filtration andtransepithelial secretion, followed by reabsorption, represent aneffective way of OTA accumulation in kidneys and may be a base fordevelopment of nephrotoxicity. OTA itself is an OA and a substrate ofvarious renal OA transporters (Oat) located in the basolateral (BLM) or

Toxicology and Applied Pharmacology 239 (2009) 284–296

⁎ Corresponding author. Fax: +385 1 4673 303.E-mail address: [email protected] (I. Sabolić).

0041-008X/$ – see front matter © 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.taap.2009.06.008

Contents lists available at ScienceDirect

Toxicology and Applied Pharmacology

j ourna l homepage: www.e lsev ie r.com/ locate /ytaap

mailto:[email protected]

http://dx.doi.org/10.1016/j.taap.2009.06.008

http://www.sciencedirect.com/science/journal/0041008X

luminal membrane domain of (mainly) PT cells. In the mammaliankidney, OTA can be transported by Oat1 (Slc22a6), Oat2 (Slc22a7),Oat3 (Slc22a8), OAT4 (SLC22A11; absent in rodents), Oat5 (Slc22a19;absent in humans), Oat-K1 (Oatp1a3/Slco1a3), H+-dipeptide cotran-sporter (PEPT/family Slc15), and ATP-driven multidrug resistance-associated protein Mrp2 (Abcc2) (Anzai et al., 2005; Babu et al., 2002;Cha et al., 2001; Enomoto et al., 2002; Kobayashi et al., 2002; Kusuharaet al., 1999; Kwak et al., 2005; Leier et al., 2000; Takeuchi et al., 2001;Tsuda et al., 1999; Youngblood and Sweet, 2004). In the rodent PT,Oat1 and Oat3 are localized in the BLM and thus may mediateinternalization of OTA at the basolateral side. Oat2, Oat5, Oat-K1, andPEPT are localized in the brush-border membrane (BBM) and thusmay mediate reabsorption of OTA, whereas Mrp2 in the BBM mayserve as an active extruder of OTA.

Earlier studies in various experimental models indicated that OTA,being itself a substrate for various Oats, can interact with the transportof other OA. In these studies: a) OTA directly and competitivelyinhibited the basolateral transport of a prototypical OA p-aminohip-purate (PAH) in isolated PT segments and renal cortical membranes,b) in the presence of OTA, the accumulation of PAH in the renalcortical slices, isolated PT cells, and PT-derived established cell lines,was impaired, and c) the OTA-treated experimental animals exhibiteda diminished accumulation of PAH in the renal cortical slices in vitroand a lower PAH clearance in vivo (Friis et al., 1988; Gekle andSilbernagl, 1994; Groves et al., 1998, 1999; Jung et al., 2001; Sauvant etal., 1998; Sokol et al., 1988; Welborn et al., 1998). These data thusindicated that OTA may affect the activity and/or expression of renalOats, but such possibilities have not been experimentally verified. Inorder to test if OTA affects the cellular expression and distribution ofrenal Oats, here we used an in vivo model of OTA intoxication in adultmale rats, and characterized the protein and mRNA expression levelsof the two basolateral (Oat1, Oat3) and two brush-border (Oat2, Oat5)OA/OTA transporters in PT. The Oat data were correlated with thetissue morphology, OTA accumulation in the renal tissue and itsexcretion in urine, and with the tissue and/or urine indicators ofoxidative stress.

Materials and methods

Animals and treatment. Adult (12–14 weeks old) male Wistar ratswere from the breeding colony at the Institute in Zagreb. Animalswere bred and maintained according to the Guide for Care and Use ofLaboratory Animals (National Institute of Health, Bethesda, USA,1996). The studies were approved by the Institutional EthicsCommittee.

OTA was dissolved in 51 mM NaHCO3, pH 7.4, and given by gastricgavage. Animals (4 rats/experimental group) were gavaged withvarious OTA doses (50,125, 250 and 500 μg/kg b.m.) every 2nd day for10 days (in total, 5 doses; the last gavagewas given on the 9th day, e.g.,the day before termination). Control rats were gavaged an equivalentvolume of solvent (10 ml/kg b.m.), using the same time pattern. Thegavage was executed between 8 and 9 am.

Antibodies. The use of affinity purified, rabbit-raised anti-peptidepolyclonal antibodies against the rat OA transporter (rOat) proteinsrOat1 (rOat1-ab), rOat2 (rOat2-ab), rOat3 (rOat3-ab), and rOat5 (rOat5-ab) in immunoblotting and immunocytochemical studieswasdescribedin details elsewhere (Anzai et al., 2005; Ljubojevic et al., 2004, 2007).Monoclonal antibodies against α-actin (actin-ab) and α-tubulin(tubulin-ab) were purchased from Chemicon Int. (Temecula, CA, USA)and Sigma (St. Louis, MO, USA), respectively. Secondary antibodies, e.g.,the CY3- (GARCY3) or alkaline phosphatase-labeled (GARAP) goat anti-rabbit IgG, CY3-labeled donkey anti-mouse IgG (DAMCY3), and alkalinephosphatase-labeled goat anti-mouse IgG (GAMP), were purchasedfrom Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA)or Kirkegaard and Perry (Geithersburg, MD, USA).

Chemicals. Anesthetics (Narketan and Xylapan) were purchasedfrom Chassot AG (Bern, Switzerland). OTA (free acid; 99% purity; Cat.No. O1877), protease inhibitors (phenyl–methyl–sulfonyl–fluoride(PMSF), antipain, benzamidine), 1,1,3,3-tetramethoxy propane,butylated hydroxytoluene, and 2-thiobarbituric acid (TBA) werepurchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). Water and silica gel Si-60 (15–40 μm) for HPLC studies were obtained from Merck(Darmstadt, Germany). Other chemicals and reagents were theanalytical or molecular biology grade, and their commercial sourcewas either Kemika (Zagreb, Croatia) or is indicated under descriptionof specific methods.

Determination of urine biochemical parameters. On the 9th day oftreatment, rats were gavaged with the last (5th) dose of OTA orvehicle (controls), placed individually in the metabolic cages,deprived of food but with free access to water, and urine was collectedfor 24 h. The final urine volume was measured, an aliquot wascentrifuged at 2500 ×g for 15 min to remove the particulate debris,and analysis of various parameters (glucose, creatinine, inorganicphosphate, potassium, chloride, sodium) was performed in thesupernatant using the biochemical analyzer Olympus AU 600(Tokyo, Japan) and HPLC apparatus (Shimadzu Corporation, Kyoto,Japan) and commercial substrates. Protein was measured by the dye-binding method (Bradford, 1976).

OTA analysis. Before determination, OTA was extracted from urineand the kidney and liver tissues. OTA in urine was extracted by themethod of Breitholtz-Emanuelsson et al. (1993). Kidneys and liverswere collected from the animals terminated by cervical dislocation,washed in physiological saline (0.9% NaCl), the respective renal(pooled cortex plus outer stripe) and liver (the largest lobe) tissueswere manually separated, weighed, and kept frozen at −20°C untilfurther analysis. A 10% homogenate of the thawed tissues wasprepared in saline, and OTA was extracted exactly as described byBauer von et al., 1984.

The extracted OTA was determined by HPLC. The HPLC apparatusconsisted of degasser, isocratic pump, the column oven (ShimadzuCorporation, Kyoto, Japan), and the fluorescent detector (ThermoSeparation Products – Spectra System FL 2000, Fremont, CA, USA). Theguard column (4.0 × 4.0 mm) and the analytical column(4.0×125.0 mm) were C-18 reverse-phase (LiChrospher, Merck,Darmstadt, Germany) with 5 μm particles. The mobile phase,consisting of methanol, water and acetic acid (700:300:20, v/v),was degassed before use in an ultrasonic bath for 15 min. The flow-ratewas 0.5 mLmin−1. The excitation and emissionwavelengths were336 nm and 464 nm, respectively. The injection volume was 20 μL andthe temperature in the column oven was set at 32°C. Under theseconditions, the retention time of OTA was about 8 min.

OAT concentration in tissue homogenates and urine samples wascalculated from the integrated peak area and linear regression curveobtained with OTA standards. In preliminary experiments, the peakareas of the standards were found to be linear with 0.1–15 ng OTA/mL(not shown). The OTA standards were prepared by adding knownamounts of stock solution of OTA to portions of OTA-free urine andcontrol (OTA-untreated) kidney and liver tissue homogenates beforethe extraction. The concentration of OTA stock solution was checkedspectrophotometrically at 333 nm using 6640 M−1 cm−1 as theextinction coefficient.

Determination of malondialdehyde (MDA) and 8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG). To determine a lipid peroxidation product MDA, urinesamples were processed by the method of Drury et al. (1997), whereasthe renal (cortex plus outer stripe) and liver homogenates wereprocessed by the method of Ohkawa et al. (1979).

MDA was measured by HPLC, using the columns described abovefor OTA. Themobile phase (50mMKH2PO4 andmethanol (60:40, v/v),

285V. Žlender et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 239 (2009) 284–296

pH 6.8) was degassed before use in the ultrasonic bath for 15 min. Theflow-rate was 1mLmin−1, and the UV detector was set at 532 nm. Theinjection volume was 20 μL, and temperature in the column ovenwasset at 32°C. Under these conditions, the retention time of MDA wasabout 2.5 min. Quantification of MDA in tissue homogenates and urinewas performed by comparing the peak area with the regression curvefor MDA standards in aqueous solution, which was linear in the rangeof 0.3–15 μmol/L (not shown).

8-OHdG, an oxidative DNA adduct, was determined only in theurine by HPLC, as described in detail in our recent publication(Domijan and Peraica, 2008). Quantification of 8-OHdG in urine wasperformed from the measured peak area using the regression curvefor aqueous standard solution, which was linear in the range of50–400 nmol/L (not shown).

Tissue fixation, immunofluorescence staining, and tissue morphology.In anesthetized rats the circulatory systemwas perfused in vivo via theleft ventricle of the heart with aerated (95% O2/5% CO2) andtemperature-equilibrated (37°C) phosphate-buffered saline (PBS; inmM: 137 NaCl, 2.7 KCl, 8 Na2HPO4, 2 K2PO4, pH 7.4) for 2–3 min. Theleft kidney was then ligated and removed for preparation of tissuehomogenates and RNA isolation (vide infra). The right kidney wasfurther perfused with 150 ml of fixative (4% p-formaldehyde). Furtherhandling of the tissues, cutting of 4-μm thick tissue cryosections, rOat-and α-tubulin-specific retrieval steps to reveal the cryptic antibodybinding sites, blocking with albumin solution, as well as incubationwith optimal dilutions of primary and secondary antibodies weredescribed in detail elsewhere (Ljubojevic et al., 2004, 2007; Sabolicet al., 2006).

The stained sections were examined with an Opton III RSfluorescence microscope (Opton Feintechnik, Oberkochen, Germany)and photographed using a Spot RT Slider digital camera and software(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). The photos wereimported into Adobe Photoshop 6.0 for processing and labeling. TheCY3-related immunostaining was inspected under the specific filterfor red fluorescence, whereas the tissue autofluorescence under thefilter for green fluorescence was used to monitor morphology of thetubules in non-stained or CY3-stained sections. Where required, theAdobe Photoshop software was later used to convert red or greenfluorescence into black and white mode.

Preparation of tissue homogenates and membranes for PAGE. Theremoved left kidney was decapsulated and either used in toto orsagitally sliced, and the pooled tissue (cortex plus outer stripe) wasdissected manually. The tissue was homogenized (10% homogenate)in a chilled buffer (in mM: 300 mannitol, 5 EGTA, 12 Tris–HCl, pH 7.4,1 PMSF, 0.1 benzamidine, and 0.1 μg/mL antipain) with a Powergen-125 homogenizer (Fisher Scientific, New Jersey, NJ, USA) at themaximal setting (1 min homogenization–2 min pause–1 minhomogenization). Total cell membranes (TCM) were isolated fromtissue homogenates by differential centrifugation using refrigeratedcentrifuges. The cell debris was first removed by centrifugation at6000 ×g for 15 min, and the supernatant was centrifuged at150,000 ×g for 1 h. The resulting pellet (TCM) was resuspended ina chilled buffer (150 mM mannitol, 2.5 mM EGTA, 6 mM Tris–HCl,pH 7.4). The protein was determined by the dye-binding assay(Bradford, 1976), adjusted to the desired concentration, and themembranes were stored at −70°C until further use.

SDS-PAGE and Western blotting. Following the optimal conditionsfor SDS-PAGE and Western blotting of various rOats in isolated renalmembranes (Ljubojevic et al., 2004, 2007), frozen TCM were thawedat 37°C, mixed with Laemmli buffer (final: 1% SDS, 12% glycerol,30 mM Tris–HCl, pH 6.8), and heated in nondenaturing conditions(without SH-reagents) at 65°C for 15 min. Protein separation through10% SDS-PAGE, electrophoretic transfer to Immobilon (Millipore,

Bedford, MA, USA), incubation of this membrane in blotto-buffer(5% non-fat dry milk, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100, 20 mM Tris–HCl,pH 7.4) without or with the optimal concentrations of primary andsecondary antibodies, as well as visualization of the labeled proteinbands with the alkaline phosphatase activity-mediated reaction, weredescribed in detail in our recent publications (Ljubojevic et al., 2004,2007). Intensity of the labeled protein bands was scanned andexpressed in arbitrary units, relative to the strongest band (=1arbitrary unit) in control samples.

Isolation of RNA and synthesis of first-strand cDNA. The unfixedkidney was removed, decapsulated, cut into ∼2 mm thick sagittalslices, and one (middle) slice was immediately submerged into theRNAlater solution (Sigma, St. Louis, MO, USA). The pooled tissue(cortex plus outer stripe) was later dissected manually and used infurther isolation steps. Total cellular RNA was extracted using Trizol(Invitrogen) according to manufacturer's conditions. RNAconcentration and its purity were estimated by measuring the opticaldensity at 260 and 280 nm. The quality and integrity of RNA wereverified by agarose gel electrophoresis. Isolated RNAs were stored at−70°C and subsequently used for RT-PCR studies.

First-strand cDNA synthesis was performed using the First StrandcDNA Synthesis Kit (Fermentas Int., Ontario, Canada) following themanufacturer's instructions. Total cellular RNA (3 μg) was denaturedat 70°C for 5 min in the reaction mixture containing 0.5 μg oligo dT(18) and reversed transcribed in total volume of 20 μL reactionmixture containing 1× reverse transcription buffer, 20 U of ribonu-clease inhibitor, 1 mM of dNTP mix, and 40 U of Moloney murineleukemia virus reverse transcriptase. The reaction mixture wasincubated at 37°C for 60 min followed by incubation at 72°C for10 min. cDNAs were diluted 5× in DNase/RNase free water (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) and stored at −20°C until use.

End-point RT-PCR. PCR was performed in total volume of 20 μLusing: 1 μL of 5× diluted first-strand cDNA, 0.4 μMspecific primers andready to use PCR Master Mix (Fermentas Int., Ontario, Canada)following instructions by the manufacturer. To avoid amplification ofgenomic DNA, intron over-spanning primers were used. Customprimers for rOats and GAPDH were purchased from Invitrogen.Forward and reverse sequences of these primers are listed inTable 1. Reaction conditions used for PCR were: initial denaturationfor 3 min at 94°C, denaturation for 30 s at 95°C, annealing for 30 s at57°C, and elongation for 45 s at 72°C. RT-PCR products were resolvedby electrophoresis in 1% agarose gel stained with ethidium bromide,and visualized under ultraviolet light. The housekeeping gene GAPDHwas used as a control for variations in the input of RNA. To obtainquantitative results, preliminary experiments were done to determinethe optimal number of the PCR cycles within the exponential phase ofthe PCR reaction. The resulting optimal number of cycles was: 25 forrOat1, 32 for rOat2, 26 for rOat3 and rOat5, and 21 for GAPDH.

Table 1Primer sequences used for end-point RT-PCR.

Gene Forward and reverseprimers (5′–3′)

Gene bankaccession no.

Location RT-PCRproductsize, bp

rOat1 F: GGCACCTTGATTGGCTATGT NM_017224.2 712–731 372R: CCACAGCATGGAGAGACAGA 1064–1083

rOat2 F: CGCTCAGAATTCTCCTCCAC NM_053537.2 374–393 311R: ACATCCAGCCACTCCAACTC 665–684

rOat3 F: CGGAATAGCCAACCACAACT NM_031332.1 210–229 333R: ATCACAGGTCCTCCAACCAG 523–542

rOat5 F: GGAGGCAGCAGAGACAAAAC XM_342011.2 1104–1123 346R: TTGCTCCTCCTAATGATGCC 1431–1450

GAPDH F: GGTGATGCTGGTGCTGAGTA NM_017008.3 332–351 369R: GGATGCAGGGATGATGTTCT 681–700

Genes: rat orthologs of organic anion transporters and GAPDH. F, forward; R, reverse.

286 V. Žlender et al. / Toxicology and Applied Pharmacology 239 (2009) 284–296

Real-time RT-PCR. Real-time RT-PCR was performed in a 50 μLvolume using 3.3 μL (100 ng) of the first-strand cDNA template,2.5 μL of 20× Taqman Gene Expression Assays mix, 25 μL of the 2×TaqMan Universal PCR Master Mix (all from Applied Biosystems,Foster City, CA, USA) and 19.2 μL of nuclease-free water. Primers andprobes were designed by Applied Biosystems and supplied asTaqman Gene Expression Assays Mix containing a 20× mix ofunlabeled PCR forward and reverse primers as well as TaqMan MGBprobe. Amplification and detection were performed using the 7500Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Thermal cycling

conditions included initial 2 min at 50°C, then 10 min at 95°C,followed by 40 two-step cycles of denaturation (15 s at 95°C) andannealing/extension (1 min at 60°C). To standardize the input ofcDNA amount, an endogenous control, i.e., the housekeeping geneβ-actin was run, quantified, and the results were normalized to thesevalues. Each sample was performed in duplicate. Relativequantification of rOats mRNA amount (mean fold changes±S.E.Mof duplicate measurements) was accomplished by comparative Ct-method using the Relative Quantification Study Software (AppliedBiosystems).

Fig. 1. Morphology of tubules in the superficial cortex (A–E), medullary rays (F–J, P) and outer stripe (K–O) in vehicle (0) and OTA-treated (50–500 μg OTA/kg b.m.) rats. In thesuperficial cortex (A–E), morphology of glomeruli (asterisks) and various tubules, including the proximal convoluted tubules (PCT), was not visibly affected by OTA treatment. In themedullary rays (I–J, P), the PT S3 segments exhibited the OTA dose-dependent damage; in animals treated with 50 μg OTA/kg b.m., only the individual cells in some S3 profiles weredamaged (G, arrows), whereas with higher OTA doses, the damage was more extensive and dose-dependent, exhibiting loss of tubular form, desquamation of BBM and epithelialcells, thinning of epithelium, and accumulation of cell debris in the tubule lumen (H–J, arrows). At 500 μg OTA/kg b.m., nearly all S3 profiles in the medullary rays were heavilydamaged (J, arrows). However, the more distal parts of these profiles at the border with outer stripe were less or not at all affected (H–J, P, arrowheads). In the outer stripe (K–O), theS3 profiles remained unaffected by OTA treatment; the tubule profiles with damaged cells were rare (not shown). Bar=20 μm. (Q) The number of S3 profiles (mean±SEM; N=4 ineach experimental group) in the medullary rays, which exhibited a clear damage of epithelium. Damaged S3 profiles were counted in sagittal cryosection from themiddle slice of theright kidney from each rat. Statistics (ANOVA): a:b and c:d, N.S.; all other relations, Pb0.05. Morphology of the more distal parts of the nephron was visually unchanged by OTAtreatment (not shown).


Presentation of the data. The immunocytochemical and Westernblotting data represent findings in 4 animals in each experimentalgroup. The end-point and real-time RT-PCR data were obtained withindependent cDNA (mRNA) preparations from two control and twoOTA-treated animals in each experimental group. RNA for end-pointRT-PCR and for real-time RT-PCR were isolated from different animals.The numeric data were expressed as means±SE and, where applied,statistically evaluated by using Student's t-test or ANOVAwith Duncantest at the 5% level of significance.

Results

Reabsorptive functions of renal tubules in OTA-treated rats

In order to determine the OTA-induced renal functional andstructural changes, specific urine parameters were analyzed andmicroscopic examination of the tissue cryosections was performed inrats treatedwith vehicle or various OTA doses for 10 days. In this initialstudy, in the 24-h urine from 8 vehicle-treated and 8 OTA-treated(50–500 μg/kg b.m.) animals we compared the urine volume, glucose,creatinine, phosphate, potassium, chloride, and sodium, and foundthat these parameters in control and OTA-treated animals were notsignificantly different (data not shown). Furthermore, the OTAtreatment did not induce major change in urine protein (data notshown), except the rats treatedwith the highest OTAdose exhibited anelevated proteinuria (45.9±2.48 mg protein/24 h), which was,however, not statistically different from that in vehicle-treated animals(27.8±8.39 mg protein/24 h). These data thus indicated that, overall,the 10-day treatment of rats with up to 500 μg OTA/kg b.m. did notcause major loss of reabsorptive kidney functions.

Morphology of renal tubules in OTA-treated rats

The study of tissue morphology revealed the OTA dose-dependentdamage of PT S3 segments, predominantly in the medullary rays(Fig. 1). Whereas the proximal convoluted tubules (S1/S2 segments)and other tubule profiles in the kidney cortex were not affected by anyOTA dose (A–E), S3 segments in the medullary rays exhibited an OTAdose-dependent damage, which was manifested by variable loss ofregular tubular structure and cell membrane, desquamation of theluminal membrane and whole cells, thinning of epithelium, andaccumulation of the cell debris in the tubule lumen (F–J). In controls(F), and more at 50 μg OTA/kg b.m. (G), only the individual cells insome S3 were damaged (arrows). Damage was more extensive athigher OTA doses (H–J, arrows); at 500 μg OTA/kg b.m., practically allS3 profiles in the medullary rays were heavily damaged (J, arrows).The proximal convoluted segments in the vicinity of S3, but outsidethe medullary rays, showed no signs of damage (G–J, PCT). Thenumber of S3 profiles in the medullary rays, which had at least somecells damaged, was visually counted over the surface of one middlecryosection through the right kidney from each animal; as shown inFig. 1Q, the number of damaged S3 profiles in the medullary raysincreased dramatically with increasing the OTA dose. Damage wasmore extensive in the proximal parts of S3, whereas the most distalparts of S3 located in the medullary rays (H–J, P; arrowheads), as wellas the S3 profiles in the outer stripe (K–O), exhibited only a small(occasional individual cells; not shown) or no visible damage of theepithelium.

Effects of OTA treatment on epithelial morphology in renal tubuleswas further tested by immunostaining microtubules, one of thecytoskeletal elements known to be sensitive marker of the cellintegrity in various conditions associatedwith oxidative stress inducedby hypoxia and heavy metal toxicity (Sabolic, 2006, and referencesthere in). Fig. 2 shows microtubules in various nephron segmentslocalized in the superficial cortex (A–C), medullary rays (D–F), andouter stripe (G–I) of control and OTA-treated rats. In all three

regions in vehicle-treated rats (A, D, G), the strongly stainedmicrotubules in various tubules were assembled in regular, apico-basally oriented bundles of tread-like filaments, which were moreabundant in distal tubules and collecting ducts. However, in ratstreated with 125 μg OTA/kg b.m. (B, E, H), 250 μg OTA/kg b.m. (datanot shown), and 500 μg OTA/kg b.m. (C, F, I), in all three regions weobserved the OTA dose-dependent general decrease in stainingintensity and deranged microtubule bundles, whereas the damagedS3 profiles in the medullary rays exhibited heavily derangedmicrotubule network (E, F; arrows).

Cell domain-specific immunolocalization of rOats in the rat nephron

In accordance with our previous immunolocalization studies ofOat1, Oat2, Oat3, and Oat5 with specific polyclonal antibodies in therat and mouse kidneys (Anzai et al., 2005; Ljubojevic et al., 2004,2007), in Fig. 3 we confirmed localization of these rOats in the specificcell membrane domains along the rat nephron. The green imagesshowing morphology of various tubule profiles in the kidney cortex(A, B) and outer stripe (C, D) were overlapped with the redimmunostaining related to specific rOats in the same tubules.Accordingly, rOat1 was localized to the BLM of PT S2 segments inthe cortex (A, strong staining) and S3 segments in the outer stripe

Fig. 2. Immunostaining of microtubules with tubulin-ab in cryosections of thesuperficial kidney cortex (A–C), medullary rays (D–F) and outer stripe (G–I) fromrats treated with vehicle (0) or OTA (125 or 500 μg/kg b.m.). In vehicle-treated rats (0),microtubules in various tubules were arranged in apico-basally oriented regularbundles, which were more abundant in distal tubules and collecting ducts. Glomeruli(G) were also strongly stained. In rats treated with 125 μg OTA/kg b.m., and even moreso in those treated with 500 μg OTA/kg b.m., the staining intensity and the regularity ofmicrotubule bundles were overall diminished in all tissue zones. In the damaged S3profiles in the medullary rays, microtubules were heavily deranged (E, F; S3, arrows),whereas in the less damaged distal parts of S3, a limited regularity of microtubules wasstill retained (E, arrowheads). The S3 profiles in the outer stripe (G–I) showed the OTAdose-dependent loss of staining intensity. G, glomeruli; PCT, proximal convolutedtubules; DT, distal tubules; CD, collecting ducts. Bar=20 μm.


(not shown, weak staining), rOat3 was localized to the BLM of varioustubules in the cortex (B) and other kidney zones (not shown), rOat2was localized to the BBM of PT S3 segments in the outer stripe (C),whereas rOat5was localized to the BBM and intracellular organelles ofPT S3 segments in the outer stripe (D).

OTA treatment changed the expression of basolateral OA transportersOat1 and Oat3

In accordance with our recent studies in the rat kidneys(Ljubojevic et al., 2004, 2007), in immunoblots of TCM from thekidney cortex and outer stripe the rOat1-ab labeled the complex(glycosylation-related) ∼68 kDa protein band, whereas the actin-ablabeled the 42 kDa protein band (Fig. 4). The pattern (A) anddensitometric evaluation of these bands (B) show that the OTAtreatment resulted in a dose-dependent change in rOat1 proteinabundance, exhibiting a significant (∼50% above controls) increase at125 μg OTA/kg b.m. and strong decrease (∼70% vs. controls) at500 μg OTA/kg b.m. The abundance of α-actin was not affected byOTA. By immunocytochemistry, in control rats the rOat1-ab stainedthe BLM of PT S2 segments in the cortex (strongly) and S3 segmentsin the medullary rays and outer stripe (weakly) (C). In OTA-treatedrats, the cortical tubules were stained with an increased intensity atlower (50–250 μg/kg b.m.) and a strongly decreased intensity at thehighest (500 μg/kg b.m.) mycotoxin dose. The S3 segments in theouter stripe only showed a decreased intensity at the highest OTAdose (C). The data of end-point (D) and real-time RT-PCR (E) showthat in comparison with controls, the expression of rOat1 mRNA inthe renal tissue (pooled cortex and outer stripe) was unchanged at50–250 μg OTA/kg b.m.), and dramatically decreased (∼85%) at thehighest OTA dose.

In accordance with previous findings in the rat kidney (Kojima etal., 2002; Ljubojevic et al., 2004), the rOat3-ab in TCM from the renaltissue of control rats labeled the glycosylation-related complexprotein band of ∼66 kDa (Fig. 5A) and stained the BLM of varioustubules in the cortex and outer stripe (C). As shown by the labeled

bands (A), and by densitometric evaluation of these bands (B), in OTA-treated rats the abundance of rOat3 protein in TCM was stronglyincreased (∼200% above the values in controls) at 125–250 μg OTA/kgb.m., and then leveled off at 500 μg OTA/kg b.m. The immunostainingdata in the kidney cortex corroborated the Western blotting data (C);compared with controls, the staining intensity was strongly enhancedin rats treated with 125–250 μg OTA/kg b.m., whereas in rats treatedwith 500 μg OTA/kg b.m., the staining of cortical tubules was similar tothat in controls. In the outer stripe, the staining intensity wasunaffected by OTA treatment. The end-point and real-time RT-PCRdata showed that the expression of rOat3 mRNA in the renal tissuewas largely unaffected in rats treated with 50–250 μg OTA/kg b.m.,and strongly decreased (∼40% with respect to controls) at 500 μgOTA/kg b.m. (D, E).

OTA treatment changed the expression of brush-border OA transportersOat2 and Oat5

Previous immunochemical studies in adult rats described therOat2 protein of ∼66 kDa in the BBM of PT S3 segments in the outerstripe and medullary rays (Kojima et al., 2002; Ljubojevic et al., 2007).Accordingly, in the kidney samples from control rats the rOat2-ablabeled the 66 kDa protein in TCM (Fig. 6A) and weakly stained theapical domain of S3 in the outer stripe (C). The pattern of proteinbands (A) and their densitometric evaluation (B) indicate that theabundance of rOat2 protein in TCM strongly increased (∼140% abovecontrols) at 125–250 μg OTA/kg b.m. and declined to the control levelsat 500 μg OTA/kg b.m. This patternwas confirmed by immunostainingtubules in the outer stripe; in controls, only the occasional tubuleswere weakly apically positive, in animals treated with 125 (notshown) and 250 μg OTA/kg b.m. (C), many positive tubules withhigher staining intensity were observed, whereas the staining wasnegligible at 500 μg OTA/kg b.m. The end-point (D) and real-time (E)RT-PCR data show that the rOat2mRNA expressionwas not affected byup to 250 μg OTA/kg b.m., and strongly decreased (∼60% vs. controls)at 500 μg OTA/kg b.m.

Fig. 3. Cell membrane domain-specific immunolocalization of rOats in various nephron segments of male rats. The images showing morphology of various tubule profiles in thekidney cortex (A, B) and outer stripe (C, D) were taken under the green fluorescent filter. The red, rOat-specific immunostaining in the same tubules was taken separately, and bothgreen and red images were merged in Photoshop. (A) rOat1 was localized to the BLM (arrows) of PT S2 segments in the cortex; the S1 segments and distal tubules (DT) wereunstained. The S3 segments in the medullary rays and outer stripe were also weakly stained (not shown). (B) rOat3 was stained with various intensities in the BLM (arrows) ofproximal convoluted tubules (PCT), collecting ducts (CD) and other tubules in the cortex. Various nephron segments in other kidney zones were alsoweakly stained (not shown). (C)rOat2 was weakly stained in the BBM (arrowheads) of PT S3 segments in the outer stripe; the surrounding collecting ducts (CD) were not stained. (D) rOat5 was localized to the BBM(arrowheads) and intracellular organelles of PT S3 segments in the outer stripe; other tubule profiles were negative. Bar=20 μm.


In accordance with previous findings (Anzai et al., 2005; Kwaket al., 2005), the rOat5 protein was immunolocalized to the BBM andintracellular organelles of PT S3 segments in the outer stripe andmedullary rays (c.f., Fig. 3D, and Fig. 7C). By Western blotting of TCMfrom the renal tissue, the protein was detected as the 72 kDa band(Fig. 7A). The immunoblot in A, and densitometric evaluation of thebands in B indicated an increased abundance of rOat5 protein in themembranes at OTA doses of 50–250 μg/kg b.m. (up to ∼150% abovecontrols), whereas in rats treated with 500 μg OTA/kg b.m., theprotein abundance matched the control values. In tissue cryosections,the staining intensity and the number of stained tubules in the outerstripe increased in rats treatedwith OTA doses of 125 (not shown) and

250 μg/kg b.m., while the staining at 500 μg OTA/kg b.m. was similarto that in controls (C). The end-point (D) and real-time RT-PCR (E)studies showed no change in the rOat5mRNA expression at 50–250 μgOTA/kg b.m., and clear downregulation (∼50% vs. controls) at 500 μgOTA/kg b.m.

OTA and parameters of oxidative stress in the renal tissue and urine

In order to test if the observed changes in the expression ofvarious OTA-transporting Oats are associated with the tissueaccumulation of OTA and oxidative stress, in the following experi-ment we measured OTA in the renal tissue and urine, and two

Fig. 4. rOat1 expression in rats treated with various doses of OTA. (A) Representative Western blots of rOat1 and α-actin proteins in TCM from the pooled kidney tissue (cortex plusouter stripe). (B) Densitometry of the protein bands is shown in A. Each bar is the mean±SE of the data from 4 independent TCM preparations. Versus the data in control rats (0), theabundance of rOat1 protein in isolated TCM increased ∼50% at 125 μg OTA/kg b.m. and decreased ∼70% at 500 μg OTA/kg b.m., respectively (Pb0.05: cNa, e; eba, b, c, d). Theabundance of α-actin remained unchanged at all OTA doses. (C) Representative immunostaining of rOat1 in cryosections of the kidney cortex (CO) and outer stripe (OS). rOat1 waslocalized to the BLMof PT S2 (strong staining in the CO) and S3 segments (weak staining in the OS). The staining intensity visibly increased in the CO of rats treatedwith 125 μg OTA/kgb.m., and strongly diminished in both CO and OS of rats treatedwith 500 μg OTA/kg b.m. Bar=20 μm. (D) The representative end-point RT-PCR data, performedwith the independentcDNApreparations from two animals in each experimental group: the rOat1mRNAexpressionwas not visibly affected byup to 250 μgOTA/kg b.m., andwas strongly downregulated inrats treated with 500 μg OTA/kg b.m. The expression of mRNA for housekeeping gene GAPDH remained unchanged in the animals treated with all OTA doses. (E) The representativereal-time RT-PCR data are provided in duplicate measurements in cDNAs from two animals of each experimental group (mean±SE): the relative expression for Oat1 mRNA wasunaffected by 125 μg OTA/kg b.m., whereas the OTA dose of 500 μg/kg b.m. strongly (∼85%) downregulated its expression.


parameters of oxidative stress, e.g., MDA in the renal tissue and urineand 8-OHdG in the urine of control (vehicle-treated) and OTA-treated rats. A lipid peroxidation product MDA, and an oxidative DNAadduct 8-OHdG, are the indicators of oxidative stress that can bemeasured in the affected tissue and/or urine (reviewed by Cookeet al., 2000 and Draper et al., 2000). The OTA treatment wasperformed with 250 or 500 μg OTA/kg b.m., e.g., with doses that inthe precedent studies resulted in upregulation and downregulationof the tested Oats, respectively. Where possible, the data before thetreatment, as well as the comparable data in liver, were alsoprovided.

The respective data are summarized in Table 2. Within the 10-dayperiod, the treatment with both OTA doses did not affect the animalbody mass, the kidney mass, and the volume of 24-h urine.Furthermore, control rats did not contain OTA in the renal tissueand urine. On the contrary, rats treated with 250 μg OTA/kg b.m.exhibited a marked accumulation of this mycotoxin in the renal tissueand excretion in the urine, whereas in rats treatedwith 500 μg OTA/kgb.m., the OTA accumulation in the renal tissue further increased 2.3-fold, and the OTA excretion in the urine further increased 3.9-fold.However, the levels of MDA were not increased neither in the renaltissue nor in urine, whereas the levels of 8-OHdG in the urine of both

Fig. 5. rOat3 expression in rats treated with various doses of OTA. (A) Representative Western blots of rOat3 and α-actin proteins in TCM from the pooled kidney cortex and outerstripe tissue. (B) Densitometry of the protein bands shown in A. Each bar is the mean±SE of the data from 4 independent TCM preparations. The abundance of rOat3 protein in TCMincreased with increasing OTA dose, reaching its maximum at 125–250 μg OTA/kg b.m. (∼200% above controls; Pb0.05: cNa, b, e; dNa, b, e), and then decreased to about controllevels at 500 μg OTA/kg b.m. The abundance of α-actin remained unchanged in all OTA-treated groups. (C) Representative immunostaining of rOat3 in cryosections of the kidneycortex (CO) and outer stripe (OS): rOat3 was localized to the BLM in various nephron segments in these zones and in the inner stripe and inner medulla (data not shown; cf.Ljubojevic et al., 2004). In the CO tubules, the staining intensity was clearly stronger in rats treated with 125–250 μg OTA/kg b.m., whereas at 500 μg OTA/kg b.m., the stainingintensity in the COwas similar to that in controls. In the tubules of OS, and innermedulla (not shown), the staining intensity remained unaffected by OTA treatment. Bar=20 μm. (D)Representative end-point RT-PCR data, performed with independent cDNA preparations from two animals in each experimental group, showed a largely unaffected expression ofrOat3 mRNA by up to 250 μg OTA/kg b.m., and partial downregulation at the highest OTA dose. The housekeeping gene GAPDHmRNA expression was not affected by any OTA dose.(E) Representative real-time RT-PCR data, are provided in duplicate measurements in cDNAs from two animals of each experimental group (mean±SE): the relative mRNAexpression for rOat3 was unaffected by OTA dose of 125 μg/kg b.m., and decreased (∼40% in respect to control) by OTA dose of 500 μg/kg b.m.


vehicle-treated and OTA-treated rats were highly variable and similar,but 3–4-fold higher than the levels before the treatment. Therefore,the urine 8-OHdG seems to be elevated due to the treatment-relatedstress (gavage of the vehicle/OTA and/or collection of urine in themetabolic cages) and not due to the OTA-related oxidative stress inthe renal tissue. Contrary to the situation in kidneys, the liver tissue ofthe same animals accumulated OTA in similar concentrations, but theMDA concentration increased moderately (∼30%) in rats treated with250 μg OTA/kg b.m., and strongly (∼100%) in rats treated with 500 μgOTA/kg b.m. (Table 2). In additional experiments, in kidneys of theserats we have tested two other cellular parameters of oxidative stress(Sato and Bremner, 1993; Sabolic, 2006, and references therein), e.g.,the concentration of glutathione (GSH) in the kidney tissuebiochemically, and the expression of metallothionein in PT immuno-

cytochemically. The tissue concentration of GSH remained unaffectedby both OTA doses (data not shown). The application of commercialmonoclonal antibody against the horse metallothionein revealed incontrol rats a heterogeneous intensity of the cytoplasmic staining inPT cells; this staining pattern was not affected in rats treated with 50–250 μg OTA/kg b.m., but in rats treated with 500 μg OTA/kg b.m., theoverall staining intensity was strongly diminished (data not shown).

Discussion

Previous studies in OTA-treated mice, rats and rabbits describedalterations in renal function and structure induced with subchronictreatment with high doses (≥500 μg/kg b.m./day, for 5–10 days) orwith chronic treatment with lower doses (100–250 μg/kg b.m./day,

Fig. 6. rOat2 expression in rats treated with various doses of OTA. (A) Representative Western blots of rOat2 and α-actin proteins in TCM from the pooled kidney cortex and outerstripe tissue. (B) Densitometry of the protein bands shown in A. Each bar is the mean±SE of the data from 4 independent TCM preparations. The abundance of rOat2 protein in TCMincreased with increasing the OTA dose, reaching maximum at 125–250 μg OTA/kg b.m. (∼140% above controls), and decreased to control levels at 500 μg OTA/kg b.m. (Pb0.05: cNa,b, e; dNa, b, e). The abundance ofα-actin remained unchanged in all OTA-treated groups. (C) Representative immunostaining of rOat2 in cryosections of the kidney outer stripe (OS),where rOat2 protein is localized in low abundance to the brush border of PT S3 segments (Ljubojevic et al., 2007). In control animals (0), most of the S3 segments were negative andoccasional tubules wereweakly apically positive. In animals treatedwith 125 (not shown) and 250 μg OTA/kg b.m., more positive tubules with higher staining intensity were found inrespect to controls. At OTA dose of 500 μg/kg b.m., the immunostaining was negligible. Bar=20 μm. (D) Representative RT-PCR data are performed with independent cDNApreparations from two animals in each experimental group: rOat2 mRNA expression was similar at OTA doses of up to 250 μg/kg b.m., and clearly diminished at 500 μg OTA/kg b.m.The expression of mRNA for housekeeping gene GAPDH was unaffected in all OTA-treated rats. (E) Representative real-time RT-PCR data are provided in duplicate measurements incDNAs from two animals of each experimental group (mean±SE), revealed that the relativemRNA expression for rOat2was unaffected and strongly downregulated (∼65% in respectto control) by OTA doses of 125 and 500 μg/kg b.m., respectively.


for a few weeks to two years) of this mycotoxin. These studiesrevealed only limited, OTA dose-dependent defects in renal reabsorp-tive and secretory functions, whereas the morphological damage wasobserved primarily in PT at high OTA doses applied for a longer time(Gekle et al., 1993; Gekle and Silbernagl, 1996; Kumar et al., 2007;Rached et al., 2007; Rasonyi et al., 1999). In the present study, we alsodid not observe major changes in the usual urinary parameters (urinevolume, glucose, creatinine, protein, phosphate, potassium, chloride,and sodium), which remained largely unaffected even in rats treatedwith the highest OTA dose, thus indicating that, overall, thereabsorptive and secretory kidney functions in our rats were notsignificantly affected with OTA.

Our studies of tissue morphology and integrity of microtubulesclearly revealed an OTA dose-dependent damage of epithelial cells,predominantly in the PT S3 segments located in themedullary rays. S3segments in the outer stripe as well as the proximal convoluted

tubules and other nephron segments in the cortex and inner medullaexhibited no visible morphological damage. However, the upregulat-ing effects upon rOats in all PT segments, as well as the damagingeffect upon microtubule network in proximal and other tubules,indicate that the whole nephron underwent some OTA-related toxicinfluences. Our data support the findings by others, showing S3segments in the medullary rays as the most sensitive nephron part toOTA in rats (Rached et al., 2007; Rasonyi et al., 1999). The studies inisolated microperfused tubules from rat kidneys indicated S3 as thesite of highest reabsorption of OTA (Dahlmann et al., 1998), whichmaybe mediated by the H+-dipeptide cotransporter (possibly PEPT2) andby several OA transporter (Oat2, Oat5, and OAT-K1) predominantlylocalized in the BBM of this PT segment (Anzai et al., 2005; Kwak et al.,2005; Ljubojevic et al., 2007; Masuda et al., 1997; Shen et al., 1999).The reason for such hypersensitivity of S3 cells in the medullary raysto OTA is not clear. These cells may have either the highly efficient

Fig. 7. rOat5 expression in rats treated with various doses of OTA. (A) Representative Western blots of rOat5 and α-actin proteins in TCM from the pooled kidney cortex and outerstripe tissue. (B) Densitometry of the protein bands shown in A. Each bar is the mean±SE of the data from 4 independent TCM preparations. The OTA doses of 50–250 μg/kg b.m.significantly increased the abundance of rOat5 protein in TCM (up to ∼150% above controls), whereas the dose of 500 μg OTA/kg b.m. had no effect compared with controls (Pb0.05:bNa; cNa, e; dNa, e). The abundance of α-actin remained unchanged in TCM from all OTA-treated groups of rats. (C) Representative immunostaining of rOat5 in cryosections of thekidney outer stripe (OS). The staining was localized to the brush border and intracellular vesicles in the cells of PT S3 segments (c.f., Fig. 2D). The staining intensity and the number ofpositive tubules increased in rats treated with OTA doses of 125 (not shown) and 250 μg/kg b.m., whereas the staining at OTA dose of 500 μg/kg b.m. was similar to that in controls.Bar=20 μm. (D) Representative RT-PCR data, performed with independent cDNA preparations from two animals in each experimental group: the expression of mRNA for rOat5 wasunaffected by OTA doses of up to 250 μg/kg b.m., and visibly diminished at the highest dose. The expression of GAPDH mRNA in all OTA-treated rats remained unchanged. (E)Representative real-time RT-PCR data are provided in duplicatemeasurements in cDNAs from two animals of each experimental group (mean±SE): the relativemRNA expression forrOat5 was unaffected and downregulated (∼50% in respect to control) by OTA doses of 125 and 500 μg/kg b.m., respectively.


mechanisms of OTA accumulation and/or highly inefficient mechan-isms for its elimination, and/or a very low content of intracellular ROSscavengers and other molecules that could protect from the possibleOTA-generated oxidative stress and damage. It is, however, interestingthat in rats treated even with the highest OTA dose, a significantdamage of S3 in the medullary rays did not disturb the urineparameters related to the kidney function, such as the volume,glucose, protein, creatinine and various ions. This indicates that eitherthe respective part of S3 played an overall minor role in handling theseparameters or that other, unaffected S3 segments in the outer stripeand the distal parts of the nephron compensated for the functionalloss of the damaged S3 segment in the medullary rays.

The immunochemical and RT-PCR data show that the OTAtreatment had a dose-dependent effect on the rOats abundance inthe cell membrane and the expression of their mRNA in the renaltissue. In rats treated with lower OTA doses (≤250 μg/kg b.m.) weobserved an upregulation of the tested rOat proteins without a changein their mRNA expression. The unchanged expression of rOats mRNAindicates an involvement of post-transcriptional, stimulatory effects oflow OTA doses on the transporter abundances. Previous short-termstudies have identified a number of compounds and some peptidehormones that stimulated or inhibited the OA transport and/orchanged the activity of relevant Oats in various experimental modelsin vitro and in vivo (reviewed in Terlouw et al., 2003). These effects,however, occurred within a few minutes to a few hours throughprotein kinase-mediated intracellular signaling which involved chan-ging in phosphorylation of the transporters and/or exocytoticrecruitment of dormant transporters from an intracellular storagecompartment. These mechanisms are not expected to change the totalabundance of a transporter in the cell/isolated TCM, and thus areunlikely cause of the enhanced abundance of four renal rOats in ourrats treated with low OTA doses. On the other side, the long-termregulation of expression of rat renal rOat1 and rOat3 proteins is drivenby strong androgen stimulation and weak estrogen inhibition at theirmRNA level (Buist et al., 2002; Ljubojevic et al., 2004), whereas theexpression of rOat2 and rOat5 proteins is regulated by strongandrogen inhibition and weak estrogen stimulation, also at their

mRNA level (Ljubojevic et al., 2007; Sabolic et al., 2007, and referencesthere in). Since these hormones have completely different effects onthe transporters in opposite membrane domains, the low OTA dose-induced upregulation of both basolateral and apical rOats can not bemediated by the levels of sex hormones. We, however, cannot excludethe possibility that low doses of OTA affected the levels of thyroidhormones and/or glucocorticoids, which were previously shown tostimulate the rOat1-mediated PAH uptake in the renal cortical slicesfrom rats treated with these hormones (Bahn et al., 2003; Terlouwet al., 2003). Since OTA is a substrate for all four rOats, their higherexpression driven by low OTA doses may represent a phenomenon ofsubstrate-induced stimulation, similar to that observed for rOat1 after7-day administration of loop diuretics in rats (Kim et al., 2003), whichmay result from a post-transcriptional increased synthesis and/ordecreased degradation of rOat proteins.

The highest OTA dose (500 μg/kg b.m.) affected the expression ofrOats at the level of both protein and mRNA. However, at the level ofprotein in isolated TCM, only the rOat1 abundance decreased belowthe control values (∼70%). Considering strong upregulation of all fourrOats with the OTA doses of 125–250 μg/kg b.m., the lower (albeitcontrol) levels of protein abundances in rats treated with the highestOTA dose point to an active downregulating process, which issupported by RT-PCR data showing diminished expression of mRNAfor all four rOats. mRNA for the housekeeping gene GAPDH was notaffected by any OTA dose, indicating that OTA was not generally toxicbut exhibited some specificity in targeting. Diminished expression ofrOat1 protein in PT in rats treated with the highest OTA dose mayexplain the previously observed OTA-induced reduction of PAHtransport in the mammalian kidney in vivo and in vitro (Friis et al.,1988; Gekle and Silbernagl, 1994; Groves et al., 1998, 1999; Sauvant etal., 1998; Welborn et al., 1998). Having the highest affinity for PAH,rOat1 was recently described as a major contributor to the renal PAHtransport/secretion in physiological and toxic conditions in rats (Habuet al., 2003), rabbits (Zhang et al., 2004), mice (Eraly et al., 2006) andhumans (Nozaki et al., 2007), whereas Oat3 and Oats in the PT BBMplay a relatively minor role in this process. Based on the down-regulating pattern of mRNA expression for other Oats with the highestOTA dose, one can assume that with longer treatment (N10 days) withthe highest OTA dose, the abundances of all rOat proteins in PT wouldfurther decrease and thus contribute to the loss of renal capacity inPAH secretion. However, our finding of a dramatic accumulation ofOTA in the renal tissue in rats treatedwith 250, and evenmore so with500 μg/kg b.m., indicates that the previously observed impaired PAHaccumulation in the renal cortical slices, and excretion via urine, mayhave two reasons: a) following subchronic treatment with low OTAdoses, the accumulated OTA may directly interact with, and inhibittransport/secretion of PAH and other OA, and b) following chronictreatment with low OTA doses, or subchronic treatment with highOTA doses, the PAH transport may be inhibited by concerted action ofaccumulated OTA in the cells, lower expression of Oats in therespective membrane domains of PT, and loss of secretory and/orreabsorptive surface in the damaged epithelial cells.

An increased abundance of the renal OTA-transporting Oats inrats treated with low OTA doses (≤250 μm/kg b.m.) may have widerpathophysiological meaning. Previous in vivo and in vitro studieshave shown fair correlation between the expression level of variousOats and the transport rate of relevant OA (Bahn et al., 2003; Habuet al., 2003; Sabolic et al., 2007, and references there in; Schneideret al., 2007; Zhang et al., 2004). One can thus assume that thesimultaneous upregulation of both basolateral (rOat1, rOat3) andapical (rOat2, rOat5) OTA transporters in the PT, as found in our ratstreated with low OTA doses, may contribute to development of OTAnephrotoxicity with possibly the following pattern: a) the enhancedexpression of rOat1 and rOat3 proteins may accelerate theintracellular OTA uptake via the BLM, whereas the enhancedexpression rOat2 and rOat5 proteins may accelerate the OTA

Table 2Body and kidney mass, accumulation of OTA and MDA in the renal and liver tissues, andurine excretion of OTA, MDA, and 8-OHdG in rats before and after the 10-day treatmentwith vehicle (0) or two different doses of OTA.

OTA dose (μg/kg b.m.) Before thetreatment

After the treatment

0 0 250 500

Body mass (g) 291±3.4 318±9.4 319±11.6 318±1.7Kidney mass (mg)a N.D. 1501±38 1599±40 1516±53

Parameters in the renal tissue (cortex plus outer stripe)OTA (ng/g tissue) N.D. 0 40±7.0 92±4.8b

MDA (nmol/g tissue) N.D. 130±10.6 150±8.4 159±16.1

Parameters in the liver tissueOTA (ng/g tissue) N.D. 0 52±8.5 112±18b

MDA (nmol/g tissue) N.D. 128±9.8 167±19.4 261±5.1b

Parameters in urineVolume (mL/24 h) 24.7±2.86 26.0±2.83 24.5±2.21 23.8±3.35OTA (ng/mL) 0 0 1.31±0.40 5.10±0.80b

MDA (μmol/L) 0.81±0.15 0.78±0.20 0.40±0.10c 0.41±0.13(μmol/g creatinine) 1.05±0.24 1.59±0.43 0.71±0.18 0.60±0.15

8-OHdG (nmol/L) 85±28 266±67c 225±57c 200±53(nmol/g creatinine) 115±43 514±111c 422±139 376±125

Shown are the data (mean±SEM) measured in the tissue samples, and in urine beforethe treatment (N=12 in each group) and after the 10-day treatment with indicatedOTA doses (N=4 in each experimental group). N.D., not determined.

a Both kidneys.b Significantly different from the data obtained with 250 μg OTA/kg b.m.c Significantly different from the “before the treatment” data. Other comparisons are

not significant.


reabsorption via the BBM, b) the accumulated OTA may directlyinterfere with the cellular handling of endogenous non-toxic andtoxic OA, and impair their elimination by secretion into urine, and c)the accumulated both OTA and toxic OA may damage variousintracellular structures/organelles directly and/or inhibit mitochon-drial oxidative phosphorylation, decreasing production of ATP (Jungand Endou, 1989) and increasing generation of ROS, with furthertoxic consequences related to ROS. However, the levels of the wellknown indicators of oxidative stress, e.g., MDA, GSH, and 8-OHdG inthe kidney tissue and/or urine of our rats treated with 250–500 μgOTA/kg b.m. did not change. The insensitivity of the appliedmethods was not the problem; the same methods detected asignificant OTA dose-dependent increase in MDA in the liver tissue.Furthermore, low OTA doses (≤250 mg/kg b.m.) did not affect theexpression of metallothionein in PT, but the dose of 500 mg/kg b.m.strongly downregulated it, indicating an unspecific, general toxicityof the high OTA dose in PT cells. However, a limited dose-dependenttoxicity of OTA in other parts of the nephron, and particularly in theS3 segment, was demonstrated by the deranged structure and loss ofthe oxidative stress-sensitive microtubules. Therefore, most of ourfindings do not support the view that the accumulated OTA had asignificant effect in generating oxidative stress in PT cells. Rather, theaccumulated OTA may have directly affected the rOats expression atthe mRNA and/or protein level, and damaged the cell cytoskeletonand morphology. Alternatively, MDA, GSH, metallothionein, and 8-OHdG may have been insensitive indicators of a limited oxidativestress in the kidney tissue.

Conflict of interest statement

The authors declare no conflict of interest regarding this collaborative work.

Acknowledgments

The authors acknowledge the expert technical assistance by EvaHeršak, Mirjana Matašin and Jasna Mileković. This study wasapproved by the Ethical Committee of the Institute for MedicalResearch and Occupational Health in Zagreb. The funding wasprovided by grants No. 022-0222148-2142 (M. Peraica) and 022-0222148-2146 (I. Sabolic) from the Ministry of Science, Education andSports, Republic of Croatia.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found, inthe online version, at doi:10.1016/j.taap.2009.06.008.

References

Anzai, N., Jutabha, P., Enomoto, A., Yokoyama, H., Nonoguchi, H., Hirata, T., Shiraya, K.,He, X., Seok, H.C., Takeda, M., Miyazaki, H., Sakata, T., Tomita, K., Igarashi, T., Kanai,Y., Endou, H., 2005. Functional characterization of rat organic anion transporter 5(Slc22a19) at the apical membrane of renal proximal tubules. J. Pharmacol. Exp.Ther. 315, 534–544.

Babu, E., Takeda, M., Narikawa, S., Kobayashi, Y., Enomoto, A., Tojo, A., Cha, S.H., Sekine,T., Sakthisekaran, D., Endou, H., 2002. Role of human organic anion transporter 4 inthe transport of ochratoxin A. Biochim. Biophys. Acta 1590, 64–75.

Bahn, A., Hauss, A., Appenroth, D., Ebbinghaus, D., Hagos, Y., Steinmetzer, P., Burckhardt,G., Fleck, C., 2003. RT-PCR-based evidence for the in vivo stimulation of renaltubular p-aminohippurate (PAH) transport by triiodothyronine (T3) or dexa-methasone (DEXA) in kidney tissue of immature and adult rats. Exp. Toxicol. Pathol.54, 367–373.

Bahnemann, E., Kerling, H.P., Ensminger, S., Schwerdt, G., Silbernagl, S., Gekle, M., 1997.Renal transepithelial secretion of ochratoxin A in the non-filtering toad kidney.Toxicology 120, 11–17.

Bauer von, J., Gareis, M., Gedek, B., 1984. Zum Nachweis und Vorkommen vonOchratoxin A bei Schlachtschweinen. Berl Münch Tierärztl Wschr 97, 279–283.

Boorman, G.A., McDonald, M.R., Imoto, S., Persing, R., 1992. Renal lesions induced byochratoxin A exposure in the F344 rat. Toxicol. Pathol. 20, 236–245.

Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem.72, 248–254.

Breitholtz-Emanuelsson, A., Olsen, M., Oskarsson, A., Palminger, I., Hult, K., 1993.Ochratoxin A in cow's milk and in human milk with corresponding human bloodsamples. J. AOAC Int. 76, 842–846.

Buist, S.C.N., Cherrington, N.J., Choudhuri, S., Hartley, D.P., Klaassen, C.D., 2002. Gender-specific and developmental influences on the expression of rat organic aniontransporters. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301, 145–151.

Castegnaro, M., Mohr, U., Pfuhl-Leszkowicz, A., Estève, J., Steinmann, J., Tillmann, T.,Michelon, J., Bartsch, H., 1998. Sex- and strain-specific induction of renal tumorsby ochratoxin A in rats correlates with DNA adduction. Int. J. Cancer Suppl. 77,70–75.

Cavin, C., Delatour, T., Marin-Kuan, M., Holzhäuser, D., Higgins, L., Bezençon, C.,Guignard, G., Junod, S., Richoz-Payot, J., Gremaud, E., Hayes, J.D., Nestler, S., Mantle,P., Schilter, B., 2007. Reduction in antioxidant defenses may contribute to ochratoxinA toxicity and carcinogenicity. Toxicol. Sci. 96, 30–39.

Cha, S.H., Sekine, T., Fukushima, J.I., Kanai, Y., Kobayashi, Y., Goya, T., Endou, H., 2001.Identification and characterization of human organic anion transporter 3 expres-sing predominantly in the kidney. Mol. Pharmacol. 59, 1277–1286.

Cooke, M.S., Evans, M.D., Herbert, K.E., Lunec, J., 2000. Urinary 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine — source, significance and supplements. Free Radic. Res. 32,381–397.

Dahlmann, A., Dantzler, W.H., Silbernagl, S., Gekle, M., 1998. Detailed mapping ofochratoxin a reabsorption along the rat nephron in vivo: the nephrotoxin can bereabsorbed in all nephron segments by different mechanisms. J. Pharmacol. Exp.Ther. 286, 157–162.

Domijan, A-M, Peraica, M., 2008. Determination of 8-hydroxyguanosine in urine usingHPLC with electrochemical detection. Arh Hig Rada Toksikol 59, 181–277.

Draper, H.H., Csallany, A.S., Hadley, M., 2000. Urinary aldehydes as indicators of lipidperoxidation in vivo. Free Radic. Biol. Med. 29, 1071–1077.

Drury, J.A., Nycyk, J.A., Cooke, R.W.I., 1997. Comparison of urinary and plasmamalondialdehyde in preterm infants. Clin. Chim. Acta 263, 177–185.

EFSA., 2006. Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on arequest from the commission related to ochratoxin A in food. Question number:EFSA-Q-2005-154. EFSA Journal 1–56.

Enomoto, A., Takeda, M., Shimoda, M., Narikawa, S., Kobayashi, Y., Kobayashi, Y.,Yamamoto, T., Sekine, T., Cha, S.H., Niwa, T., Endou, H., 2002. Interaction of humanorganic anion transporters 2 and 4 with organic anion transport inhibitors.J. Pharmacol. Exp. Ther. 301, 797–802.

Eraly, S.A., Vallon, V., Vaughan, D.A., Gangoiti, J.A., Richter, K., Nagle, M., Monte, J.C., Rieg,T., Truong, D.M., Long, J.M., Barshop, B.A., Kaler, G., Nigam, S.K., 2006. Decreasedrenal organic anion secretion and plasma accumulation of endogenous organicanions in OAT1 knock-out mice. J. Biol. Chem. 281, 5072–5083.

Friis, C., Brinn, R., Hald, B., 1988. Uptake of ochratoxin A by slices of pig kidney cortex.Toxicology 52, 209–217.

Fuchs, R., Hult, K., 1992. Ochratoxin A in blood and its pharmacokinetic properties. FoodChem. Toxicol. 30, 201–204.

Gekle, M., Silbernagl, S., 1994. The role of the proximal tubule in ochratoxin Anephrotoxicity in vivo: toxodynamic and toxokinetic aspects. Ren. Physiol.Biochem. 17, 40–49.

Gekle, M., Silbernagl, S., 1996. Renal toxicodynamics of ochratoxin A: a pathophysio-logical approach. Kidney Blood Press. Res. 19, 225–235.

Gekle, M., Oberleithner, H., Silbernagl, S., 1993. Ochratoxin A impairs “postproximal”nephron function in vivo and blocks plasma membrane anion conductance inMadin–Darby canine kidney cells in vitro. Pflugers Arch. 425, 401–408.

Grosse, Y., Chekir-Ghedira, L., Huc, A., Obrecht-Pflumio, S., Dirheimer, G., Bacha, H.,Pfohl-Leszkowicz, A., 1997. Retinol, ascorbic acid and α-tocopherol prevent DNAadduct formation in mice treated with the mycotoxins ochratoxin A andzearalenone. Cancer Lett. 114, 225–229.

Groves, C.E., Morales, M., Wright, S.H., 1998. Peritubular transport of ochratoxin A inrabbit renal proximal tubules. J. Pharmacol. Exp. Ther. 284, 943–948.

Groves, C.E., Nowak, G., Morales, M., 1999. Ochratoxin A secretion in primary cultures ofrabbit renal proximal tubule cells. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 13–20.

Habu, Y., Yano, I., Takeuchi, A., Saito, H., Okuda, M., Fukatsu, A., Inui, K.I., 2003. Decreasedactivity of basolateral organic ion transports in hyperuricemic rat kidney: roles oforganic ion transporters, rOAT1, rOAT3 and rOCT2. Biochem. Pharmacol. 66,1107–1114.

Jung, K.Y., Endou, H., 1989. Nephrotoxicity assessment by measuring cellular ATPcontent. II. Intranephron site of ochratoxin A nephrotoxicity. Toxicol. Appl.Pharmacol. 100, 383–390.

Jung, K.Y., Takeda, M., Kim, D.K., Tojo, A., Narikawa, S., Yoo, B.S., Hosoyamada, M., Cha,S.H., Sekine, T., Endou, H., 2001. Characterization of ochratoxin A transport byhuman organic anion transporters. Life Sci. 69, 2123–2135.

Kamp, H.G., Eisenbrand, G., Janzowski, C., Kiossev, J., Latendresse, J.R., Schlatter, J.,Turesky, R.J., 2005. Ochratoxin A induces oxidative DNA damage in liver and kidneyafter oral dosing to rats. Mol. Nutr. Food Res. 49, 1160–1167.

Kim, G.H., Na, K.Y., Kim, S.Y., Joo, K.W., Oh, Y.K., Chae, S.W., Endou, H., Han, J.S., 2003. Up-regulation of organic anion transporter 1 protein is induced by chronic furosemideor hydrochlorothiazide infusion in rat kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 18,1505–1511.

Kobayashi, Y., Ohshiro, N., Shibusawa, A., Sasaki, T., Tokuyama, S., Sekine, T., Endou, H.,Yamamoto, T., 2002. Isolation, characterization and differential gene expression ofmultispecific organic anion transporter 2 in mice. Mol. Pharmacol. 62, 7–14.

Kojima, R., Sekine, T., Kawachi, M., Seok, H.C., Suzuki, Y., Endou, H., 2002.Immunolocalization of multispecific organic anion transporters, OAT1, OAT2, andOAT3, in rat kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 848–857.

Kuiper-Goodman, T., Scott, P.M., 1989. Risk assessment of the mycotoxin ochratoxin A.Biomed. Environ. Sci. 2, 179–248.


http://dx.doi.org/10.1016/j.taap.2009.06.008

Kumar, M., Dwivedi, P., Sharma, A.K., Singh, N.D., Patil, R.D., 2007. Ochratoxin A andcitrinin nephrotoxicity in New Zealand White rabbits: an ultrastructural assess-ment. Mycopathologia 163, 21–30.

Kusuhara, H., Sekine, T., Utsunomiya-Tate, N., Tsuda, M., Kojima, R., Cha, S.H., Sugiyama,Y., Kanai, Y., Endou, H., 1999. Molecular cloning and characterization of a newmultispecific organic anion transporter from rat brain. J. Biol. Chem. 274,13675–13680.

Kwak, J.O., Kim, H.W., Oh, K.J., Ko, C.B., Park, H., Cha, S.H., 2005. Characterization ofmouse organic anion transporter 5 as a renal steroid sulfate transporter. J. SteroidBiochem. Mol. Biol. 97, 369–375.

Lee, S.C., Beery, J.T., Chu, F.S., 1984. Immunohistochemical fate of ochratoxin A in mice.Toxicol. Appl. Pharmacol. 72, 218–227.

Leier, I., Hummel-Eisenbeiss, J., Cui, Y., Keppler, D., 2000. ATP-dependent para-aminohippurate transport by apical multidrug resistance protein MRP2. KidneyInt. 57, 1636–1642.

Ljubojevic, M., Herak-Kramberger, C.M., Hagos, Y., Bahn, A., Endou, H., Burckhardt, G.,Sabolic, I., 2004. Rat renal cortical OAT1 and OAT3 exhibit gender differencesdetermined by both androgen stimulation and estrogen inhibition. Am. J. Physiol.Renal. Physiol. 287, F124–F138.

Ljubojevic, M., Balen, D., Breljak, D., Kusan, M., Anzai, N., Bahn, A., Burckhardt, G.,Sabolic, I., 2007. Renal expression of organic anion transporter OAT2 in rats andmice is regulated by sex hormones. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 292, F361–F372.

Masuda, S., Saito, H., Nonoguchi, H., Tomita, K., Inui, K.I., 1997. mRNA distribution andmembrane localization of the OAT-K1 organic anion transporter in rat renal tubules.FEBS Lett. 407, 127–131.

Nozaki, Y., Kusuhara, H., Kondo, T., Hasegawa, M., Shiroyanagi, Y., Nakazawa, H., Okano,T., Sugiyama, Y., 2007. Characterization of the uptake of organic anion transporter(OAT) 1 and OAT3 substrates by human kidney slices. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321,362–369.

Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K., 1979. Assay for lipid peroxides in animal tissue bythiobarbituric acid reaction. Analyt. Biochem 95, 351–358.

Petrik, J., Zanic-Grubisic, T., Barisic, K., Pepeljnjak, S., Radic, B., Ferencic, Z., Cepelak, I.,2003. Apoptosis and oxidative stress induced by ochratoxin A in rat kidney. Arch.Toxicol. 77, 685–693.

Pfohl-Leszkowicz, A., Manderville, R.A., 2007. Ochratoxin A: an overview on toxicity andcarcinogenicity in animals and humans. Mol. Nutr. Food Res. 51, 61–99.

Rached, E., Hard, G.C., Blumbach, K., Weber, K., Draheim, R., Lutz, W.K., Ozden, S., Steger,U., Dekant, W., Mally, A., 2007. Ochratoxin A: 13-week oral toxicity and cellproliferation in male F344/N rats. Toxicol. Sci. 97, 288–298.

Rasonyi, T., Schlatter, J., Dietrich, D.R., 1999. The role of α2u-globulin in ochratoxin Ainduced renal toxicity and tumors in F344 rats. Toxicol. Lett. 104, 83–92.

Ringot, D., Chango, A., Schneider, Y.J., Larondelle, Y., 2006. Toxicokinetics andtoxicodynamics of ochratoxin A, an update. Chem. Biol. Interact. 159, 18–46.

Sabolic, I., 2006. Common mechanisms in nephropathy induced by toxic metals.Nephron. Physiol. 104, 107–114.

Sabolic, I., Herak-Kramberger, C.M., Antolovic, R., Breton, S., Brown, D, 2006. Loss ofbasolateral invaginations in proximal tubules of cadmium-intoxicated rats isindependent on microtubules and clathrin. Toxicology 218, 149–163.

Sabolic, I., Asif, A., Budach, W., Wanke, C., Bahn, A., Burckhardt, G., 2007. Genderdifferences in kidney function. Pflugers Arch.- Eur. J. Physiol. 455, 397–429.

Sato, M., Bremner, I., 1993. Oxygen free radicals and metallothionein. Free Radicals Biol.Med. 14, 325–337.

Sauvant, C., Silbernagl, S., Gekle, M., 1998. Exposure to ochratoxin A impairs organicanion transport in proximal-tubule-derived opossum kidney cells. J. Pharmacol.Exp. Ther. 287, 13–20.

Sauvant, C., Holzinger, H., Gekle, M., 2005. The nephrotoxin ochratoxin A induces keyparameters of chronic interstitial nephropathy in renal proximal tubular cells. CellPhysiol. Biochem. 15, 125–134.

Schaaf, G.J., Nijmeijer, S.M., Maas, R.F.M., Roestenberg, P., De Groene, E.M., Fink-Gremmels, J., 2002. The role of oxidative stress in the ochratoxin A-mediatedtoxicity in proximal tubular cells. Biochim. Biophys. Acta 1588, 149–158.

Schneider, R., Sauvant, C., Betz, B., Otremba, M., Fischer, D., Holzinger, H., Wanner, C.,Galle, J., Gekle, M., 2007. Downregulation of organic anion transporters OAT1 andOAT3 correlates with impaired secretion of para-aminohippurate after ischemicacute renal failure in rats. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 292, F1599–F1605.

Shen, H., Smith, D.E., Yang, T., Huang, Y.G., Schneemann, J.B., Brosius 3rd, F.C., 1999.Localization of PEPT1 and PEPT2 proton-coupled oligopeptide transporter mRNAand protein in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 276, F658–F665.

Sokol, P.P., Ripich, G., Holohan, P.D., Ross, C.R., 1988. Mechanism of ochratoxin Atransport in kidney. J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 460–465.

Takeuchi, A., Masuda, S., Saito, H., Abe, T., Inui, K.I., 2001. Multispecific substraterecognition of kidney-specific organic anion transporters OAT-K1 and OAT-K2.J. Pharmacol. Exp. Ther. 299, 261–267.

Terlouw, S.A., Masereeuw, R., Russel, F.G.M., 2003. Modulatory effects of hormones,drugs, and toxic events on renal organic anion transport. Biochem. Pharmacol. 65,1393–1405.

Tsuda, M., Sekine, T., Takeda, M., Cha, S.H., Kanai, Y., Kimura, M., Endou, H., 1999.Transport of ochratoxin A by renal multispecific organic anion transporter 1.J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1301–1305.

Welborn, J.R., Groves, C.E., Wright, S.H., 1998. Peritubular transport of ochratoxin A bysingle rabbit renal proximal tubules. J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1973–1982.

Youngblood, G.L., Sweet, D.H., 2004. Identification and functional assessment of thenovel murine organic anion transporter Oat5 (Slc22a19) expressed in kidney. Am. J.Physiol. Renal. Physiol. 287, F236–F244.

Zhang, X., Groves, C.E., Bahn, A., Barendt, W.M., Prado, M.D., Rodiger, M., Chatsudthi-pong, V., Burckhardt, G., Wright, S.H., 2004. Relative contribution of OAT and OCTtransporters to organic electrolyte transport in rabbit proximal tubule. Am. J.Physiol. Renal. Physiol. 287, F999–F1010.

Zingerle, M., Silbernagl, S., Gekle, M., 1997. Reabsorption of the nephrotoxin ochratoxinA along the rat nephron in vivo. J. Pharmacol. Exp. Ther. 280, 220–224.


uČinak oksidacijskog stresa u mehanizmu toksiČnosti · životinjskog porijekla ~meso, mlijeko,...

Documents