This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Uridineinbau in die Nucleinsäuren von Furchungsstadien der Eier des Seeigels Paracentrotus Lividus

G . C Z I H A K , H . G . W I T T M A N N u n d I . H I N D E N N A C H

Stazione zoologica, Napoli, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin und Max-Planck-Institut

für Meeresbiologie, Abt. BAUER, Tübingen (Z. Naturforschg. 22 b, 1176—1182 [1967] ; eingegangen am 2. Juni 1967)

1. Uridine taken up during the 16,h-cell stage of the sea urchin egg is stored in acid soluble form.

2. During the interphase of this stage uridine is used for an RNA-synthesis in the micromeres, the smallest blastomeres of the egg, which have a prolonged interphase. There seems to occur no RNA-synthesis in the other blastomeres of this stage or the synthesis in these cells is considerably smaller. The RNA of the micromeres has a high turnover, it is neither tRNA nor rRNA but prob-ably mRNA.

3. 2V2 hours after the 16th-cell stage — this is in the young blastula stage —• about 5V2 hours after fertilization, at least half of the micromere-RNA is already decomposed, the fission products of which having been used together with the stored uridine to synthesize rRNA and (after methylation of the uridine) DNA.

Bei autoradiographischer Untersuchung der RNS-Synthese in Furchungsstadien des mediterranen Para-centrotus lividus war festgestellt worden, daß im 16-Zellenstadium nur die Mikromeren, die 4 kleinsten Zellen des Embryo am vegetativen Pol, Uridin in die RNS einbauen, und daß später auch andere Blastomeren „markiert" sind ( C Z I H A K h 2 ) . Da die Eier nur im 16-Zellenstadium für 20 — 30 Min. in Kontakt mit in Seewasser gelöstem markierten Uri-din waren, war es naheliegend anzunehmen, daß die später in allen Blastomeren auftretende Markierung durch Weitergabe markierter Substanzen aus den Mikromeren zustande kommt. Doch war bei manchen Keimen die Menge markierter Substanzen in den animalen und vegetativen Blastomeren 2 Stdn. nach dem Uridinangebot so hoch, daß es schwer vorstell-bar erschien, daß diese beträchtliche Menge auf die in den Mikromeren im 16-Zellenstadium gebildete RNS zurückzuführen ist. Es erschien vielmehr denk-bar, daß alle Blastomeren des Seeigelkeimes Uridin in säurelöslicher Form speichern können, daß im 16-Zellenstadium nur die Mikromeren das Uridin in die RNS einbauen, und daß später auch die anderen Blastomeren sich der Uridinreserven in ihrem eige-nen Plasma bedienen könnten. Da jedoch das Uridin durch die angewendete Alkohol-Eisessig-Fixierung ausgewaschen werden kann, solange es nicht in die RNS aufgenommen ist, ist eine Uridinspeicherung nach dieser Fixierung nicht nachweisbar.

1 G. CZIHAK, Naturwissenschaften 6 , 141 [1965].

Deshalb wurden zunächst neue Autoradiographie-Serien unter Berücksichtigung quantitativer Aspekte mit Einwirkung von Nucleasen untersucht, und anschließend wurden in biochemischen Aufarbeitun-gen die Aufnahme und Speicherung des Uridins und seine Verwendung in den einzelnen Blastomeren ver-folgt.

Herrn Dr. P . D O H R N und seinen Mitarb., besonders Dr. A. P A C K A R D danken wir herzlichst für vielfache Unterstützung, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s -g e m e i n s c h a f t für finanzielle Hilfe.

Material und Methoden

Die Geschlechtsprodukte von Paracentrotus lividus aus Neapel wurden in der üblichen Weise durch Aus-schütteln der Gonaden in filtriertem Seewasser gewon-nen. Die Eier wurden nach der Befruchtung mehrfach gewaschen und in großen Petrischalen auf Schaukel-tischen bis zum 16-Zellenstadium gehalten. Sie wurden wiederholt auf Synchronic der Entwicklung untersucht, weil oft die Furchung erst nach dem 2-Zellenstadium unregelmäßig wird. Im 16-Zellenstadium wurden die Eier in Seewasser mit 0,5 — 5 /^Ci/ml radioaktivem Uri-din gebracht. Für die Autoradiographic wurde 3H-Uri-din (NEN) und für die biochemische Analyse 14C-ring-markiertes Uridin (Amersham) verwendet. Einzelheiten werden bei den entsprechenden Versuchsergebnissen be-schrieben.

Die Inkubationszeit war nicht immer konstant, weil die Temperatur und die Entwicklungsgeschwindigkeit nicht immer konstant waren. Das Ziel bei allen Ver-suchen war, die Eier stets nur in der Interphase des

2 G. CZIHAK, ROUX' Arch. Entwicklungsmechan. Organismen 156, 504 [1965] ; 157,199 [1966].

16-Zellenstadiums mit Uridin in Kontakt zu halten und das nicht aufgenommene Uridin mit Beginn des 28-Zellenstadiums auszuwaschen. Deshalb wurden die Eier zu diesem Zeitpunkt 4- bis 5-mal mit filtriertem See-wasser gewaschen. Fixiert wurden die Eier für die Auto-radiographie und alkalische Hydrolyse der RNS in Äthanol-Eisessig 3 : 1 bei 20 — 25 °C, für die Phenol-extraktion der Nucleinsäuren in Äthanol-Diäthyläther 3 : 1 30 min bei 50°, eine Methode, die wir Dr. O R E N G O

verdanken. Das Autoradio graphie-Material wurde folgender-

maßen weiterbehandelt: über die Alkoholreihe und Benzol wurden die Eier in Zentrifugenröhrchen mit Paraffin durchtränkt, in Gelatinekapseln überführt, an-schließend geschnitten, entparaffiniert, in dest. Wasser überführt und mit Kodak AR 10-Film überzogen und nach 3 — 5 Tagen entwickelt. Die Nuclease- Versuche wurden mit Ribonuclease (DNasefrei, Serva) und Des-oxyribonuclease (RNasefrei, Worthington) durchge-führt; Konzentration der RNase: 0,5 mg/ml, S ö r e n -s e n - Puffer PH 7,6, Einwirkungszeit: 1 Stde. bei 37 °C; Konzentration der DNase: 1 mg/ml S ö r e n s e n - Puf-fer, pH 7,6, Einwirkungszeit: 14 Stdn. bei 37 °C.

Das für die Aktivitätsbestimmung der RNS nach al-kalischer Hydrolyse vorgesehene Material wurde in 2 Portionen von Äthanol-Eisessig fixiert und gewaschen, um das nicht in Nucleinsäuren eingebaute Uridin zu entfernen. Das Verhältnis der Eier zu Fixierungsflüs-sigkeit war etwa 1 : 50.

Nach absolutem Äthanol wurde das Material schließ-lich in Diäthyläther gebracht, luftgetrocknet und im Tiefkühlschrank bis zur Aufarbeitung aufbewahrt. Die RNS wurde nach der Methode von S C O T T , F R A C C A S T O R O

und T A F T 3 hydrolysiert, indem das trockene Eipulver mit 0,5 ml n-NaOH Übergossen wurde, der nach 1 Stde. 0,1 ml 6-n. HCl zur Neutralisierung zugefügt wurde. Anschließend wurden jeweils 50 oder 100 ju\ des Über-standes auf Whatman-Glasfaserpapier-Scheibchen auf-gebracht und unter einer Wärmelampe getrocknet. Die Filterscheibchen mit dem RNS-Hydrolysat wurden schließlich im Scintillationszähler mit nicht wassertole-rantem Medium im Tritiumkanal oder 14C-Kanal aus-gezählt.

Das Material für die Phenolextraktion wurde nach der Fixierung in Äthanol-Diäthyläther (3 : 1 bei 50°) und unter ständigem Rühren mit einem Glasstab mit einer Portion Diäthyläther gewaschen und ebenfalls luftgetrocknet. Durch die Behandlung mit heißem Ätha-nol-Diäthyläther wird die RNase der Eier zerstört.

Nucleinsäure-Isolierung: In einem typischen Versuch wurden die Seeigel-Eier (20 mg) mit Phenol (3 ml), Seesand (3 g), Natriumdodecylsulfat (6 mg) und Phos-phatpuffer (3 ml, pn 6,8, 0,05-molar) in einer vorge-kühlten Reibschale bei 4 cC zerrieben. Die Emulsion wurde 20 min in einem Scheidetrichter kräftig geschüt-telt und anschließend zentrifugiert (15 000 g, 30 min). Die Phenolausschüttelung der Wasserphase wurde noch zweimal (je 10 min) wiederholt. Nach Entfernen des

3 J . F . SCOTT, A. P . FRACCASTORO U. E. B . T A F T , J . Histochem. Cytochem. [Baltimore] 4 ,1 [1956].

Phenols durch Äther wurden die Nucleinsäuren mit zwei Volumenteilen kalten Äthanols ( —10 °C) und et-was Natriumacetat (0,3 ml einer 1-m. Lösung) gefällt und nach 1 Stde. zentrifugiert. Das Sediment wurde in Phosphatpuffer (2 ml, pn 6,8, 0,05-m.) aufgenommen, und es wurden die UV-Absorptionskurve und die Nu-cleinsäuremenge im Zeiß-Spektralphotometer PM Q II bestimmt. Die isolierte Nucleinsäuremenge betrug 783 jug, der Quotient des Absorptions-Maximums (bei 262 nm) zum Minimum (bei 229 nm) war 2,42.

Säulenchromatographie: Die Trennung der verschie-denen Nucleinsäuretypen geschah in einer Säule (20 • 1 cm) mit Hydroxylapatit (Bio-Rad, München), das mit Phosphatpuffer (PH 6,8, 0,05-m.) äquilibriert war. Ein Aliquot der in Phosphatpuffer gelösten Nucleinsäuren wurde aufgetragen und ein linearer Gradient (0,05-m. -> 0,4-m. Phosphatpuffer, pu 6,8, je 300 ml) ange-schlossen. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde mit einer Chromatographiepumpe auf 20 ml/h eingestellt. Die Fraktionsgröße betrug 3,5 ml. Die Säulenchromato-graphie erfolgte bei Raumtemperatur (18 — 22 °C). Aliquote jeder Fraktion wurden a) im Zeiß-Spektral-photometer (bei 260 nm), b) im Packard-Szintillations-zähler (nach Auftragen auf Whatman-Glasfaserpapier-Scheibchen) und c) im Radiometer-Leitfähigkeitsmesser CDM 2 gemessen.

Nucleotid- und Basenanalysen: Die zu einem Gipfel gehörenden Fraktionen wurden vereinigt und gegen Wasser in der Kälte dialysiert. Zur Vermeidung des enzymatischen Abbaus der Nucleinsäuren wurde ausge-kochtes Wasser und in einer 1-proz. Natriumdodecyl-sulfat-Lösung gekochte Dialysierschläuche benutzt, und es wurde mit Kunststoffhandschuhen gearbeitet. Nach der Dialyse wurden die Lösungen im Rotationsverdamp-fer konzentriert und Aliquote einer sauren (6-n. HCl, 120 °C, 2 h) bzw. alkalischen Hydrolyse (0,33-re. KOH, 45 min, 85 °C, danach Neutralisation durch Perchlor-säure) unterworfen. Die Auftrennung der durch die al-kalische Hydrolyse entstandenen Nucleotide geschah elektrophoretisch (0,2-m. Natriumacetat, pn 3,7, 40 V /cm) nach der Methode von C L I C K 4 , jedoch nicht auf Chromatographiepapier, sondern auf mit MN-Cellulose-pulver beschichteten Folien und die der durch saure Hydrolyse entstandenen Basen chromatographisch (n-Butanol : H20 = 860 ml : 140 ml). Die Bestimmung der Radioaktivität in den Flecken auf den Elektropho-rese* bzw. Chromatogrammstreifen wurde in dem re-gistrierenden Streifenblatt-Scanner der Fa. Packard durchgeführt.

Ergebnisse

1. Ergebnisse der autoradiographischen U nter suchungen

Am 29.10.65 12h36' befruchtete Eier von Para-centrotus lividus wurden bei 21 °C gehalten und um 15h24' in 5 pC 6-3H-Uridin/ml Seewasser gebracht.

4 R. CLICK, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 129, 4 2 4 [ 1 9 6 6 ] ,

Um 15h 18' hatten rund 50% (re = 64) das 16-Zellen-stadium erreicht, um 15h 22' bereits 70% (rc = 100) und um 15h 34' befanden sich 91% im 16-Zellenstadium und 9% (n = 280) noch im 8-Zellenstadium. 15h 48' waren die ersten 32-Zellenstadien zu finden. Von 15h 48' bis 16h0l ' wurde 4-mal in filtriertem Seewasser gewaschen. Um 16h 11' wurde die 1. Gruppe fixiert und um 18h 20' die letzte, die bis dahin noch einige Male mit filtriertem Seewasser gewaschen wurde, um evtl. abgegebenes aktives Substrat wieder zu entfernen.

Fast alle der um 16h I i ' fixierten Keime befanden sich im 28-32-Zellenstadium, einige später befruchtete noch im 16-Zellenstadium (spätere Befruchtung tritt in jedem Einsatz auf, da einige zunächst noch nicht befruchtungsfähige Eier reifen und später als zum Zeitpunkt der allgemeinen Insemination von noch vorhandenen Spermien befruchtet werden).

Abb. 1 * zeigt Schnitte durch zwei solcher 16-Zellen-stadien nach der Autoradiographic. Es wird damit der frühere Befund, daß im 16-Zellenstadium das Uridin fast ausschließlich in säureunlösliche Substanz der Mikromeren eingebaut wird, bestätigt. Früher war auch gezeigt worden, daß die Markierung nach RNase-Behandlung verschwindet. Die markierte Sub-stanz der Mikromeren ist demnach RNS, d. h. daß im 16-Zellenstadium RNS ausschließlich in den Mikromeren gebildet wird und in den anderen Zellen, wenn überhaupt, in einer vergleichsweise viel geringeren Menge ( C Z I H A K 11 2 ) .

Bei der Mehrzahl der Keime dieser Gruppe, die sich im 28 bis 32-Zellenstadium befinden, ist die RNS in den Mikromeren geringer geworden. Die Kerne und in großem Maß auch das Cytoplasma der übrigen Blastomeren zeigen dagegen eine stärkere Markierung als im 16-Zellenstadium. Daraus wurde früher geschlossen, daß markierte Substanz (en) von den Mikromeren in die anderen Blastomeren wandert (CZIHAK1'2), da die Keime nach dem Waschen in Seewasser keine markierte Substanz von außen mehr aufnehmen können. Jeweils ein Teil der Markierung ist DNase — bzw. RNase resistent, sodaß ange-nommen werden muß, daß der größte Teil der Markierung von der DNS herrührt (Abb. 2 b ) . In älteren Keimen erscheint nämlich nach RNase-Be-handlung die Markierung weniger stark reduziert als nach DNase-Behandlung (Abb. 2 c ) . Zweieinhalb Stunden nach dem Inkubationsende war bei gleicher Expositionsdauer der Autoradiographien die Ge-samtmarkierung der Keime, die bis dahin das frühe Blastulastadium erreicht hatten, wesentlich stärker

* Abbn. 1 - 3 s.Tafel S. 1178au. b.

geworden (Abb. 3 a) . Der visuelle Eindruck der weit stärkeren Markierung (vgl. die Abbn. 3 a und 2 a) zeigt auch ohne quantitative Methoden, daß die in der Blastula vorhandene Markierung nicht auf die vergleichsweise geringe Markierung der Mikro-meren im 16-Zellenstadium zurückgeführt werden kann. Das bedeutet, daß der Seeigelkeim im 16-Zellenstadium die Fähigkeit haben muß, Uridin (in Äthanol-Essigsäure löslicher Form) zu speichern, um es für spätere Synthesen bis zur Blastula zu ver-wenden. Im 16-Zellenstadium sind es nur die Mikro-meren, die sich dieses Depots für eine RNS-Synthese bedienen. Die anderen Blastomeren verwenden das gespeicherte Uridin zunächst nicht, sondern erst V2 — 2 Stdn. nach der Inkubation. Da bei den älteren Keimen der größte Teil der Markierung nach RNase erhalten bleibt, muß man annehmen, daß radio-aktives Uridin methyliert und als Thymidin in die DNS eingebaut worden ist. Nach DNase-Einwirkung bleibt eine geringe Plasmamarkierung in den älteren Keimen zurück, die wohl von einer RNS herrühren dürfte. Auch eine etwas stärkere Kernmarkierung ist nach der DNase-Behandlung noch zu sehen, die von einer Kern-RNS stammen könnte. Es ist aller-dings auch denkbar, daß die 14-stdg. Einwirkung der DNase noch zu kurz ist und daß etwas radioaktiv markierte DNS noch nicht gespalten worden war. Da die Wirkung der Nucleasen auf Schnitte immer mit Unsicherheiten behaftet ist, wurden zur Klärung des Uridineinbaus biochemische Analysen durchge-führt.

2. Untersuchung des Uridineinbaues in die RNS durch Scintillationszählung nach alkalischer Hydrolyse

Wie bei den „Methoden" näher ausgeführt ist, wurde die eingebaute Uridinmenge durch alkalische Hydrolyse der RNS und Bestimmung der danach freiwerdenden Radioaktivität ermittelt. Da die DNS gegen 1 -n. NaOH resistent ist und das nicht einge-baute Uridin durch die Fixierung in Athanol-Eis-essig ausgewaschen wird, können bei der alkalischen Hydrolyse nur die Nucleotide frei werden, die in eine RNS eingebaut waren ( S C O T T , F R A C C A S T O R O

u n d T A F T 3 ) .

Bei allen Untersuchungen — insgesamt wurde der Uridineinbau auf diese Weise bei 8 verschiedenen Eisuspensionen an mehreren Tagen ausgeführt — wurde festgestellt, daß die Aktivität der RNS der Ganzkeime etwa 30 min nach Inkubationsende ihr

G . C Z I H A K , H . G . W I T T M A N N und I . H I N D E N N A C H , Uriilineinbau in (S. 1176)

Abb. 1. Autoradiographien von 16 —28-Zellenstadien, die nach Befruchtung am 29. 10. 65/12h 36' von 15h 24' bis 15h 48' in 5 [xCi 6-3H-Uridin inkubiert worden waren. Einbau hauptsäch-

lich in den am vegetativen Pol liegenden Mikromeren.

ie Nucleinsäuren von Furchungsstadien der Eier des Seeigels

* *

£

J u r y

**

Abb. 2. Material und Fixierungszeitpunkt wie bei Abb. 1. 32-Zellenstadien a: Kontrolle, b : nach RNase, c : nach DNase.

•ty.'

. Ät*

' ' X '

Abb. 3. Material wie Abb. 1, Fixierung 18" 20', also 3 Stdn. nach Inkubationsbeginn, etwa 21/2 Stdn. nach Inkubations-ende. a: Kontrolle, b: nach RNase, c : nach DNase. Der im Vergleich mit den Abbn. 1 und 2 sichtbar stärkere Einbau

kann nur von gespeichertem Uridin herrühren.

Maximum erreicht. Das bedeutet, daß die RNS-Synthese gegen Ende des 16-Zellenstadiums, also dann wenn sich die übrigen Blastomeren weiter-teilen, den höchsten Wert erreicht hat. Die Aktivität der RNS sinkt in der folgenden Stde. um 20 - 25% und nach drei Stdn. auf etwa 50% des Maximal-wertes. Die im 16-Zellenstadium gebildete RNS ist also kurzlebig, wie das für mRNS charakteristisch ist. Das beim RNS-Abbau freiwerdende und seit der Inkubation gespeicherte Uridin kann höchstens für eine weitere RNS-Synthese kleineren Ausmaßes verwendet werden, weil in der Aktivität nur ein schwacher neuer Anstieg zu verzeichnen ist. Eine RNS-Synthese kleineren Ausmaßes ist tatsächlich nachzuweisen, wie im 3. Abschnitt gezeigt werden wird. Daher ist der Abbau der mRNS noch drasti-scher als aus den Kurven der Abb. 4 zu ersehen ist.

Abb. 4. Radioaktivität der RNS nach Uridineinbau von etwa 2h 30' bis 3h nach der Befruchtung bei drei verschiedenen Ei-sätzen (A—C). Der Übersichtlichkeit halber ist für jeden Eisatz ein eigener Maßstab für die cpm auf der Ordinate ver-

wendet worden.

Die Daten der Versuche, die in Abb. 4 wiedergege-ben wurden, sind:

A: Befruchtung 15.10.65/ l lh 56 Temperatur 23 °C; 12h 28: 9 Einzellstadien, 127 Zweizellstadien; 14h35: 21 Achtzellstadien, 79 Sechzehnzellstadien; Inkubations-beginn: 14h 35; Inkubationsende: 14h 55 ( = 3h p. f.) ; nach 5-maligem Waschen mit Seewasser Fixierungen: 15h 02, 15h 22, 15h 52, 16h34, 17h22, 18h 23. Be-fruchtung 3.11.65/l0h31 Temperatur 22-23°C; 13 h l l B: 4 Achtzellstadien, 123Sechzehnzellstadien; 13h31 die

ersten 28-Zellstadien; Inkubation von 13h 13 bis 13h 33 ( = 3h 02' p. f . ) ; Fixierungen: 13h53 und 14h 34.

C: Befruchtung 17. 10. 65/l6h 51 Temperatur 23 °C, Inkubation von 19h22 bis 19h 52, Fixierungen: 19h 57, 20h 09, 20h 25.

Die Daten und Ergebnisse der übrigen untersuchten Eisätze sind so ähnlich, daß eine Wiedergabe nicht loh-nend erscheint.

3. Ergebnisse der Säulenchromatographie und Hydrolyse der Nucleinsäuren

Das für diese Untersuchungen verwendete Material wurde am 5.4.1966 um 12h 05 befruchtet und von 15h 16 bis 15h 38 im Uridin inkubiert. 15h 13 waren 65 Embryonen im 8-Zellenstadium, 30 im 16-Zellen-stadium und 5 hatten sich irregulär gefurcht (Poly-spermie?). Nach fünfmaligem Waschen in filtriertem Seewasser wurde das Material in zwei gleiche Teile ge-teilt und die eine Hälfte (Abb. 5) 16h 07 im 3 2 - 5 6 -Zellenstadium fixiert. Die andere Hälfte (Abb. 6) wurde erst 17h57 im Blastulastadium fixiert, hatte also ohne weitere Uridinaufnahme die Gelegenheit, das in den Blastomeren vorhandene radioaktive Material umzu-bauen.

Die Abbn. 5 und 6 enthalten die Ergebnisse über die Auftrennung der verschiedenen Nucleinsäurearten auf der Hydroxylapatitsäule. Die UV-Absorptions-kurve der Fraktionen Nr. 9, 16, 111 und 118 der Abb. 7 folgen nicht einem Nucleinsäure-Spektrum, sondern fallen vom kurz- zum langwelligen UV stetig ab, während die Fraktionen 59 und 69 ein UV-Spektrum mit einem Absorptionsmaximum um 260 nm und einem Minimum um 230 nm aufweisen. Es wurde geprüft, in welchem der Gipfel RNS bzw. DNS enthalten ist. Dies geschah einerseits durch Orcinol- und D i s c h e - Reaktion und andererseits durch Trennung der nach saurer bzw. alkalischer Hydrolyse entstandenen Basen bzw. Nucleotide und durch Bestimmung, welche Base bzw. welches Nucleo-i d radioaktiv ist.

Unterwirft man die in den Gipfeln „ M " , „ R " und „ D " der Abb. 6 enthaltenen Nucleinsäuren einer alkalischen Hydrolyse und trennt die ent-standenen Nucleotide elektrophoretisch auf, so zeigt sich, daß die Radioaktivität bei den Gipfeln „ M " und „ R " vor allem in der Uridylsäure enthalten ist, während sie beim Gipfel „ D " am Start bleibt (Abb. 7 ) . Offensichtlich ist die im Gipfel „ D " ent-haltene Nucleinsäure durch die angewendete alka-lische Behandlung nicht hydrolysiert. Da RNS, nicht jedoch DNS durch verdünntes Alkali hydrolysiert wird, kann man aus den genannten Befunden

Abb. 5. Trennung der verschiedenen Nucleinsäuren auf Hy-droxylapatit (Details vgl. „Material und Methoden"). Die 14C-Uridin-Inkubation erfolgte im 16-Zellenstadium für 22 Minu-ten. Fixierung 29 Min. nach dem Inkubationsende. Die Gipfel der OD und cpm bei M (Frakt.-Nr. 55 — 56) stimmen nicht

genau überein!

Abb. 6. Trennung der verschiedenen Nucleinsäuren auf Hy-droxylapatit unter denselben Versuchsbedingungen wie in Abb. 5. Auch die Inkubationszeit im 16-Zellenstadium ist die-selbe, wie für das Material der Abb. 5 angegeben wurde (glei-cher Ei-Satz), doch wurde erst nach 2h 19' nach Inkubations-ende (im Blastulastadium) = lh 50' nach dem Material der Abb. 5 fixiert. Der Unterschied zwischen den Nucleinsäure-profilen der Abbn. 5 und 6 zeigt den Auf- und Umbau der Nucleinsäuren zwischen dem 32 —56-Zellstadium und dem

Blastulastadium.

Frakt. Nr. Frakt. Nr.

schließen, daß in den Gipfeln „ M " und „ R " RNS und in Gipfel „ D " DNS enthalten sind. Dieser Schluß wird dadurch bestätigt, daß nach saurer Hydrolyse und chromatographischer Auftrennung der Basen ein großer Teil der Radioaktivität bei „ M " und „ R " im Uracil und bei „ D " im Thymin enthalten ist (Abb. 8 ) . Bemerkenswert ist, daß auf dem Chro-matogramm von „ D " ein beträchtlicher Teil der Radioaktivität schneller als Thymin wandert, das von den in der RNS bzw. DNS normalerweise vor-kommenden Basen in dem angewendeten Chromato-graphiesystem den größten Rf-Wert hat. Aus ihrem chromatographischen Verhalten läßt sich schließen,

daß die unbekannte Substanz stärker hydrophob sein muß als Thymin.

Die in den Abbn. 5 bis 8 wiedergegebenen Ergeb-nisse wurden auch in weiteren unabhängigen Ver-suchen, die nicht im einzelnen aufgeführt sind, erhalten. Sie führten zu folgendem Schluß: Gipfel „ M " enthält eine RNS mit hoher Umsatzrate, Gipfel „ R " eine RNS mit niedriger Umsatzrate (sehr wahrscheinlich ribosomale RNS) und Gipfel „ D " DNS.

Abb. 7. Verteilung der Radioaktivität auf die Nucleotide, die durch alkalische Hydrolyse freigesetzt und elektrophoretisch getrennt wurden, a) Gipfel „M" , b) Gipfel „R" , c) Gipfel „D" .

Diskussion der Ergebnisse

Die zuerst von A G R E L L 5 cytochemisch nachge-wiesene RNS-Akkumulation in den Mikromeren des 16-Zellenstadiums beruht auf einer starken RNS-Synthese in den Kernen der Mikromeren, wie an Autoradiographien nach Uridineinbau festgestellt werden konnte ( C Z I H A K 2 ) . Die jetzt vorgelegten Ergebnisse zeigen, daß die in den Mikromeren im 16-Zellenstadium gebildete RNS, nach Säulenchro-matographie in der optischen Dichte kaum nachzu-weisen, durch 14C-Uridin sehr stark markiert wird, eine hohe Umsatzrate hat (nach l h 50 ' geht die Aktivität von max. 4700 cpm auf 1420 cpm zurück

5 I . AGRELL, Ark. Zool. 1 1 , 435 [1958]. 8 V. R. GLISIN U. M. V. GLISIN, Proc. nat. Acad. Sei., USA 52,

1548 [1964].

e O O S t . — U T

Abb. 8. Verteilung der Radioaktivität auf die Basen, die durch saure Hydrolyse freigesetzt und chromatographisch getrennt

wurden, a) Gipfel „M" , b) Gipfel „R" , c) Gipfel „D" .

— vgl. Abbn. 5 und 6 ! ) und auf der Hydroxylapatit-Säule im Salzgradienten vor der rRNS eluiert wird, also mit großer Wahrscheinlichkeit mRNS ist. Eine Synthese von tRNS kommt nach G L I S I N und G L I S I N 6

wahrscheinlich auch im 16-Zellenstadium vor, doch wäre tRNS wegen ihrer leichten Löslichkeit in säurehaltigen Fixierungsmitteln in den Autoradio-graphien nicht erhalten geblieben. N E M E R 7 ' 8 , und G L I S I N und G L I S I N 6 haben darauf hingewiesen, daß die mRNS-Synthese bereits in Furdiungsstadien (vor dem 8-, bzw. 32-Zellenstadium) beginnt. Die Abb. 2 B in N E M E R S Artikel von 1963 zeigt eine gewisse Ähnlichkeit mit unserer Abb. 6. Andere Autoren glauben, daß es bis zum Ende des Blastula-

7 M. NEMER, Proc. nat. Acad. Sei., USA 5 0 , 230 [1963]. 8 M. NEMER, Science [Washington] 1 5 0 , 214 [1965].

Stadiums keine RNS-Synthese im Seeigelembryo gibt. Allerdings hat keiner der Autoren bisher die RNS-Synthese des 16-Zellenstadiums untersucht, ver-mutlich, weil die Arbeiten von A G R E L L 5 und C O W D E N

und L E H M A N N 9 bei Biochemikern unbekannt blieben. Die in den Mikromeren im 16-Zellenstadium ge-

bildete RNS ist für die Untersuchung der Differen-zierung im Echinidenembryo besonders interessant, weil die Mikromeren urdarminduzierende Fähig-keiten haben, ihre RNS Gastrulation und Ento-blastem-Differenzierung steuert, und weil diese RNS möglicherweise der Induktor dieser Differenzierungen in den benachbarten Makromeren ist ( C Z I H A K 2 ) .

Die vorliegenden Untersuchungen zeigen auch, daß von außen angebotenes Uridin in den Seeigel-embryonen säurelöslich gespeichert, in Thymidin umgewandelt und dieses nach der RNS-Synthese im 16-Zellenstadium für alle DNS-Synthesen im weiteren Furchungsverlauf verwendet wird. Inwieweit das ge-speicherte Uridin auch für weitere RNS-Synthesen Verwendung findet, ist noch nicht bekannt. Die auto-radiographischen Befunde werden durch die Ergeb-

9 R. COWDEN U. H . LEHMANN, Growth 27, 185 [1963], 1 0 V . NIGON U. S . GILLOT, Cahiers Biol. mar. 4, 277 [1963], 1 1 A . FICQ, F . AIELLO U. E. SCARANO, Exp. Cell Res. 2 9 , 128

[1963].

nisse der Säulentrennung der Nucleinsäuren be-stätigt. Sie stehen in Einklang mit den Befunden von N I G O N u n d G I L L O T 1 0 , F I C Q , A I E L L O u n d S C A R A N O 1 1

( M A Z I A , bei F I C Q et al. zitierte persönliche Mit-teilung) , nach denen bei anderen Entwicklungs-stadien die ursprünglich im Uridin enthaltene Radio-aktivität zum beträchtlichen Teil auch in die DNS eingebaut wird. Auch bei anderen Organismen wurde ein Einbau von Uridin-Radioaktivität in die DNS nachgewiesen (vgl. C O M I N G S 1 2) . Wie die Chromato-graphie der DNS-Basen nach saurer Hydrolyse (Abb. 8) erkennen läßt, wird das Uridin im Seeigel-embryo in den untersuchten Stadien nicht in Cytidin sondern in Thymidin umgebaut.

Unsere Ergebnisse ergänzen auch die Befunde von M I T C H I S O N u n d C U M M I N S 1 3 u n d P I A T I G O R S K Y u n d

W H I T E L E Y 14 für spätere Entwicklungsstadien, wo-nach Nucleotide nach der Befruchtung des Seeigeleies durch einen aktiven Transportmechanismus ins Ei-plasma gebracht, dort gespeichert und beim leben-den Embryo durch nucleotidfreies Seewasser nicht wieder ausgewaschen werden können. 1 2 D . E. COMINGS, Exp. Cell Res. 4 1 , 6 7 7 [ 1 9 6 6 ] . 1 3 J . M . MITCHISON U . J . E . CUMMINS, J . Cell Sei. 1 , 3 5 [ 1 9 6 6 ] . 1 4 J . PIATIGORSKY U . A. H . WHITELEY, Biochim. biophysica Acta

[Amsterdam] 108, 404 [1965].

Zur Chemie chilenischer Flechten XVII I 1

Über die Inhaltsstoffe einiger Stictaceen2

S I E G F R I E D H U N E C K

Institut für Pflanzenchemie der Technischen Universität Dresden in Tharandt bei Dresden und G E R H A R D F O L L M A N N

Kryptogamenabteilung des Botanischen Museums, Berlin

(Z . Naturforschg. 22 b , 1182—1185 [1967] ; e ingegangen am 17. März 1967)

Es wird die Isolierung und Charakterisierung der Inhaltsstoffe aus fünf chilenischen Pseudo-cyphellaria-Arten beschrieben. Pseudocyphellaria intricata (DEL.) WAIN. var. thouarsii (DEL.) WAIN, enthält 7/?-Acetoxy-22-hydroxyhopan (I) und 15a-22-Dihydroxyhopan (II), Pseudocyphel-laria durvillei (DEL.) WAIN. Pulvinsäurelacton (III), Calycin (IV), die beiden neuen Triterpene Durvillonol und Durvilldiol sowie eine nicht näher definierte Substanz vom Schmp. 98 — 99°, Pseudocyphellaria hirsula (MONT.) MALME III, IV, Usninsäure, Ergosterin und D-Mannit, Pseu-docyphellaria crocata (L.) WAIN. III, IV und ein phenolisches Produkt vom Schmp. 258 — 260° und Pseudocyphellaria aurata (ACH.) WAIN. III und IV.

Die großlagrigen Stictaceen treten besonders in den neuseeländischen und südamerikanischen Pro-vinzen des subantarktischen Vegetationsraumes in großer Formenmannigfaltigkeit und oftmals gerade-zu Landschaftscharakter-bestimmend auf. Insonder-heit die Gattung Pseudocyphellaria besitzt dort ihren 1 42. Mitteilung über Flechteninhaltsstoffe; 41. Mitteilung:

S. HUNECK u. G. FOLLMANN, Z. Naturforschg. 22 b, 689 [1967].

Ausbreitungsschwerpunkt. Es schien daher reizvoll, unsere phytochemischen Untersuchungen mit chileni-schen Arten fortzusetzen, die aus dem Gebiet noch nicht chemotaxonomisch bekannt waren und anderer-seits auch in den natürlichen Pflanzengesellschaften eine wichtige Rolle spielen. 2 Herrn Dir. a. D. Dr. h. c. 0 . KLEMENT (Kreuzthal-Eisenbach)

zum 70. Geburtstag gewidmet.