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Utilização de enzimas citocromo P- 450 de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadores
no monitoramento da qualidade da água do Rio Guandu
Mayra Mansur Reimann
Rio de Janeiro Julho de 2012
MAYRA MANSUR REIMANN Aluna do curso de Ciências Biológicas – Produção Químico-Biológica
Matrícula: 0823800175
UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS CITOCROMO P- 450 DE TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS NILOTICUS) COMO
BIOMARCADORES NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA ÁGUA DO RIO GUANDU
Rio de Janeiro 2012
Trabalho de conclusão de curso,
TCC, apresentado ao curso de
graduação em Ciências Biológicas,
da UEZO como parte dos pré-
requisitos para obtenção do grau de
Bacharel em Ciências Biológicas,
sob a orientação do professor Dr.
João Bosco de Salles e Co-
orientação do Professor Adriano
Arnóbio José da Silva e Silva.
ii
UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS CITOCROMO P- 450 DE TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS NILOTICUS) COMO
BIOMARCADORES NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE DA ÁGUA DO RIO GUANDU
Elaborado por Mayra Mansur Reimann Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: _10_
Rio de Janeiro, 12 de julho de 2012
______________________________________________ Jayme da Cunha Bastos Neto, Dr. em Ciências (Bioquímica)
______________________________________________ Cristiane Martins Cardoso de Salles,
Dra em Ciências (Biologia/Biociências Nucleares)
______________________________________________ João Bosco de Salles, Dr. em Ciências (Biologia/Biociências Nucleares)
(Orientador/Presidente da Banca) ______________________________________________
Adriano Arnóbio José da Silva e Silva MSc em Ciências Médicas (Co orientador)
Rio de Janeiro, RJ - Brasil
Julho de 2012
iii
Dedico este trabalho a meus pais, que estiveram sempre presentes e fizeram o impossível pela minha formação, com muito amor e carinho.
iv
Agradecimentos
A Deus em primeiro lugar, pois sem ele nada seria possível.
A minha família que amo e sempre me apoiou e me deu forças para
seguir em frente.
Ao meu Professor orientador Dr. João Bosco por ter me dado a
oportunidade de realizar este trabalho e por ser sempre paciente e
dedicado.
Ao meu co-orientador professor Adriano Arnóbio, pelo carinho e
paciência ao me ensinar análise estatística.
As minhas amigas Amanda e Raquel que vou amar para sempre, por
me ajudarem a passar por todos os momentos da graduação tornando-os
mais amenos e divertidos.
As minhas amigas e colegas de laboratório, Cristiane, e Nataly que
me presentearam com sua amizade e paciência, me ajudando sempre,
sendo indispensáveis para conclusão deste trabalho.
A todos os meus colegas de turma e professores que, mesmo
passando por alguns atritos fizeram parte de um momento muito
importante em minha vida e contribuíram para meu melhor entendimento
do conteúdo.
v
Resumo
O rio Guandu é responsável pelo fornecimento de água potável para
mais de 10 milhões de pessoas da região metropolitana do Rio de Janeiro.
Entretanto, diversos estudos têm demonstrado que esse rio apresenta
elevados níveis de contaminação por substâncias que podem causar
mutações e câncer. Portanto, são necessárias providências para melhorar
a qualidade da água dessa bacia hidrográfica. O objetivo deste estudo foi
avaliar o potencial do uso de enzimas do Citocromo P-450 (etoxicumarina
O-desetilase – ECOD e etoxiresorufina O-desetilase - EROD) hepáticas de
tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadores no
monitoramento da qualidade da água do rio Guandu. As atividades das
enzimas foram determinadas por fluorimetria em microssoma e frações
pós-mitocondriais de tilápias capturadas no rio Guandu e em dois sítios
controles. Nossos resultados apontaram que a ECOD não é um bom
biomarcador de poluição, já que não apresentou diferença significativa em
sua atividade entre as tilápias do rio Guandu e de sítios controles. Por
outro lado, a EROD apresentou atividade 700% maior nas tilápias do rio
Guandu do que naquelas dos sítios controles, indicando ser favorável sua
utilização no monitoramento de mananciais hídricos de água doce. Este
estudo confirmou ainda a poluição do rio Guandu por indutores de CYP1A.
Finalmente, demonstramos que a utilização de fração pós-mitocondrial é
mais viável do que microssoma no ensaio da atividade de EROD no
monitoramento, por ser esta de mais simples preparo e apresentar
resultados mais homogênios dentre os animais de mesmo sítio.
Palavras–chave: Rio Guandu, poluição, tilápias, monitoramento, citocromo
P-450.
vi
Abstract
Guandu River is responsible for providing drinking water for more than 10
million people in the metropolitan region of Rio de Janeiro. However,
several studies have shown that this river has high levels of substances
that can cause cell damage, like mutations and cancer. For those reasons,
analysis of chemicals concentrations must be done to monitored water
quality in this watershed. The aim of this study was to evaluate the
potential use of hepatic cytochrome P-450 enzymes (ethoxycoumarin O-
deethylase - ECOD and ethoxyresorufin O-deethylase - EROD) of an
introduced fish species, tilapia (Oreochromis niloticus niloticus). Enzyme
activities were determined by fluorescence method in microsomal and post-
mitochondrial fractions of tilapias caught in Guandu River and compared to
two control sites. Our results indicated that ECOD activity is not a good
pollution biomarker, since no significant difference was detected between
tilapias of Guandu river or control sites. On the other hand, EROD activity
showed 700% higher in tilapias of Guandu River when compared to those
of control sites. These results indicated that EROD activity can be used as
contamination biomarker of fresh water sources. With this study, it is
becoming clear that the mechanism of CYP1A induction is closely related to
Guandu river pollution. Finally, we could demonstrate that post-
mitochondrial fraction is more feasible than microsomal fraction to assay
EROD activity.
Key-words: Guandu River, pollution, tilapia, monitoring, cytochrome P-450.
vii
“Mais pessoas morrem hoje por causa da água
poluída e contaminada do que por todas as formas de
violência, inclusive as guerras"
(UNEP)
viii
SUMÁRIO
Página
Resumo ........................................................................................................ v
Abstract ....................................................................................................... vi
1 - Introdução ............................................................................................... 1
1.1 – O Rio Guandu ................................................................................... 2
1.2 – Avaliações de risco ecológico ........................................................... 3
1.3 – Biomarcadores .................................................................................. 3
1.4 – Enzimas ............................................................................................. 4
1.5 – Tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) .......................................... 6
1.6 – Justificativa ........................................................................................ 7
2 – Objetivos ............................................................................................. 8
2.1 – Geral ............................................................................................... 8
2.2 – Específico ....................................................................................... 8
3 – Métodos ............................................................................................ 9
3.1 – Animais ............................................................................................. 9
3.2 – Preparo de frações pós-mitocondriais e microssomais..................... 9
3.3 – Determinação das concentrações protéicas................................... 10
3.4 – Determinação da atividade da 7-etoxicumarina O-desetilase (ECOD)
..................................................................................................................... 10
3.5 - Efeito da quantidade de proteínas sobre a atividade de
ECOD ........................................................................................... 11
3.6 – Curva padrão de umbeliferona .......................................... 11
3.7 - Determinação da atividade da 7-etoxiresorufina O-desetilase
(EROD) .......................................................................................... 11
3.8 – Curva padrão de resorufina ............................................... 12
3.9 – Estatística empregada .......................................................12
4 – Resultados ............................................................................. 13
5 – Discussão .............................................................................. 20
6 – Conclusões ............................................................................ 23
7 – Referências Bibliográficas .................................................... 24
1 – INTRODUÇÃO:
A poluição ambiental aquática acontece desde o início da história da
civilização humana, entretanto não teve a devida atenção até que fosse
atingido um limite onde foi possível notar as conseqüências dessa poluição
nesse ecossistema e nos organismos que o habitam. Fazendo surgir assim
um interesse global em relação a essas questões de poluição aquática,
apesar de ainda haver países que despejam enormes quantidades de
poluição com tendência a aumentar (Shahidul Islam & Tanaka, 2004).
As atividades industriais, agrícolas e domésticas são responsáveis por
utilizar mais de um terço da água doce acessível, além de serem também
as principais responsáveis por sua poluição, com compostos sintéticos.
Essas águas poluídas atingem rios, lagos, nascentes e oceanos com uma
infinidade de compostos químicos (Fent, 2004).
Para o estabelecimento de uma condição homeostática destes
ambientes é extremamente necessária a realização de monitoramento
dessas áreas, possibilitando assim a realização de ações corretivas
(Monserrat et al., 2007). Porém o monitoramento e a avaliação de risco
ambiental não podem ser somente baseados em análises químicas de
amostras ambientais, já que essas análises não são apropriadas para
indicação e predição de efeitos deletérios causados por contaminantes na
biota (Barsiene et al., 2006, Cajaraville et al., 2000). Assim para avaliar os
impactos que os poluentes causam na qualidade ambiental é necessário
que sejam identificados os efeitos que essas substâncias causam nos
seres vivos deste ecossistema (Wells et al., 2001).
Deste modo, faz-se necessário o emprego de um grupo de respostas
biológicas apropriadas, conhecidas como biomarcadores, para determinar
o grau de impacto no bem estar da biota, além de identificar os estressores
ou poluentes responsáveis por esse efeito (Fuentes-Rios et al., 2005).
2
1.1 - O Rio Guandu
O aumento da procura por água potável vem desencadeando muitas
discussões envolvendo o desenvolvimento ambiental sustentável de países
em ascensão, fazendo-se necessário e de suma importância o
planejamento do crescimento urbano juntamente com o manejo da água
(WHO, 2005).
O rio Guandu é responsável pelo fornecimento de 80% da água
potável consumida pela região metropolitana do Rio de Janeiro, suprindo
cerca de 10 milhões de habitantes. Cerca de 60% da água deste rio é
adquirida a partir da transposição do rio Paraíba do Sul. Esta transposição
foi projetada para produção de energia elétrica, mas hoje é de vital
importância para o suprimento de água da região metropolitana do Rio de
Janeiro. A água transposta do rio Paraíba do Sul pretende diluir um pouco
da poluição que o rio Guandu recebe de seus efluentes originados de
municípios como Paracambi, Queimados, Nova Iguaçu, Japeri, Seropédica,
que, além de esgoto doméstico, também inclui esgoto industrial (Massena,
2007).
A construção de barragens e reservatórios para a transposição do rio
Paraíba do Sul para o rio Guandu, aumentou a vazão do rio Guandu de
20m³ s-1 para aproximadamente 160m³ s-1, o que possibilitou a
disponibilização dessa água para o abastecimento público (DNAEE, 2001).
Porém, devido ao crescimento demográfico, ao forte e diverso
desenvolvimento industrial e também às atividades agrícolas na região do
rio Guandu, esse manancial tornou-se excessivamente vulnerável
(Massena, 2007). Diversos estudos vêm demonstrando que o rio Guandu
apresenta elevados níveis de contaminação por dibenzo-p-dioxinas
policloradas (PCDD), bifenilas policloradas (PCB) e hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPA), substâncias que podem provocar mutações
e câncer (Parente et al., 2008), e que são originadas principalmente do
excesso no uso de pesticidas, que acaba chegando ao rio e contribuindo
para sua poluição.
3
Desde os anos 80 a utilização de determinados pesticidas tem sido
severamente proibida no Brasil, porém é possível que existam em
fazendas, estoques dessas substâncias que acabam vendidas ilegalmente
(Torres, 2002).
1.2 - Avaliações de risco ecológico
A definição de avaliação de risco ecológico é tida como a
probabilidade condicional da ocorrência de um determinado evento
ecológico específico, que deve ser relacionado com a explicação de suas
conseqüências ecológicas, como por exemplo, a redução da
biodiversidade, perda de recursos comerciais importantes ou instabilidade
do ecossistema (Tallini et al., 2012).
A poluição de mares e rios decorrentes da adição direta e/ou indireta
de contaminantes químicos representa hoje uma das maiores
preocupações da população mundial, já que resulta em perda na
biodiversidade dos ambientes afetados, impactando assim todos os
recursos explorados pela economia, ou processos biogeoquímicos
importantes (Veiga, 2010).
Na realização da avaliação do efeito nocivo de um determinado
contaminante despejado no ambiente, se estiver abaixo dos níveis
permitidos pela legislação, são utilizados testes de toxicidade. Estes,
porém caracterizam-se pela impossibilidade de confiança em seus dados,
tornando o uso dos biomarcadores mais efetivos na avaliação de risco
ecológico (Jesus & Carvalho, 2008).
1.3 - Biomarcadores
Os biomarcadores são excelentes ferramentas de avaliação do efeito
de substâncias poluentes em ambientes aquáticos, que através da
aplicação e desenvolvimento de técnicas de exposição e/ou efeito, torna
4
possível o esclarecimento da relação causa-efeito e dose-efeito, na
avaliação de risco à saúde (Jesus & Carvalho, 2008).
As respostas biológicas aos poluentes servem como indicadoras de
danos aos peixes, e podem ser utilizadas como biomarcadores, esses
biomarcadores são parâmetros biológicos que se alteram em resposta a
xenobióticos e outros estressores fisiológicos e ambientais, indicando tanto
a exposição de seres a poluentes, como os efeitos de compostos tóxicos
(Chambers et. al., 2002).
Na utilização de enzimas como biomarcadores de exposição e efeito
são necessários conhecimentos sobre as substâncias tóxicas propriamente
ditas, as enzimas das espécies estudadas e fatores intrínsecos /
extrínsecos, como por exemplo, a estação do ano na época da coleta, pois
todos esses parâmetros podem influenciar a atividade enzimática
(Domingues et al., 2010).
Os biomarcadores têm sido muito utilizados como ferramentas no
monitoramento ambiental, avaliando respostas dos organismos a
contaminantes presentes no ambiente (Durieux et al., 2011). O uso de
enzimas de biotransformação envolvidas na desintoxicação celular e
excreção de poluentes como biomarcadores de exposição a xenobióticos
tem sido de grande interesse (Pennec, 2003).
1.4 - Enzimas
Para o desenvolvimento deste trabalho foram escolhidas atividades de
enzimas da Fase I de Biotransformação: Sistema Citocromo P-450
(Etoxiresorufina O-Desetilase “EROD” / Etoxicumarina O-Desetilase
“ECOD”).
O sistema monoxigenase de função mista (MFO) desempenha um
papel central no metabolismo oxidativo e na eliminação de substâncias de
ocorrência natural e xenobióticos (Bonacci et al., 2007). O citocromo p-450
é uma família de enzimas que faz parte deste sistema e que apresenta
5
muitas isoformas, com diferentes funções no metabolismo de compostos
endógenos e xenobióticos (Goksøyr & Förlin, 1992).
Citocromo P-450 1A subfamília (CYP1A) são enzimas expressas
principalmente no fígado e em outros tecidos e fazem parte da ativação
metabólica de uma grande variedade de genotóxicos e agentes
cancerígenos. Os mamíferos expressam duas isoformas do citocromo P-
450, CYP1A1 / 1A2, assim como as aves que também expressam duas
isoformas 1A4 / 1A5, já as espécies de peixes, com exceção das enguias e
salmões, parecem expressar apenas uma enzima CYP1A (Goldstone &
Stegeman, 2006).
A classe das isoenzimas pertencentes ao citocromo P-450, a
subfamília CYP1A presente nos peixes, é responsável pela
biotransformação de uma grande quantidade de xenobióticos. A atividade
de CYP1A tem sido utilizada como biomarcador de contaminação
ambiental em peixes pelo fato destas enzimas serem induzidas por
compostos como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (Jung et al.,
2001) e bifenilas policloradas (Rice & Roszell, 1998). A função catalítica e
a regulação do CYP1A podem definir a suscetibilidade de diferentes
células, órgãos, indivíduos e espécies de animais a compostos estranhos,
particularmente àqueles compostos cuja toxicidade depende de
biotransformação.
Muitas subfamílias do citocromo P-450 são conhecidas por possuírem
um metabolismo oxidativo ativado por diferentes substratos, dentre elas
estão às enzimas do CYP1A, em especial a etoxiresorufina O-desetilase
(EROD) e a etoxicumarina O-desetilase (ECOD). Estas isoformas
desempenham um importante papel na biotransformação de compostos
orgânicos, incluindo hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs),
bifenilas policloradas (PCBs) e dioxinas, que estão entre os compostos
mais perigosos liberados em habitats aquáticos (Safe & Phil, 1990).
A enzima EROD, presente tanto em vertebrados quanto em
invertebrados, transforma compostos lipofílicos em compostos mais
hidrofílicos, auxiliando sua excreção. Porém, muitos metabólitos formados
durante esse processo são extremamente reativos, podendo ser
6
genotóxicos e causar sérios danos ao DNA e, em casos extremos, podem
levar a carcinogênese. Após a contaminação do ambiente por xenobióticos,
os níveis de EROD se elevam, sendo esta a base para o uso desta enzima
como biomarcadora dos efeitos da contaminação de habitats aquáticos por
poluentes orgânicos (Cajaraville et al., 2000).
A utilização da enzima EROD como biomarcador é uma das mais bem
estudadas, além de ser considerada extremamente eficaz na detecção de
efeitos de compostos poluentes em peixes (Pacheco et al., 2005).
1.5 - Tilápia (Oreochromis niloticus niloticus)
Foi selecionada para realização deste projeto a espécie de tilápia
Oreochromis niloticus niloticus (figura 1), que é uma espécie originada das
bacias de rios africanos e foi trazida e inserida em vários pontos da
América do Sul.
A espécie é muito utilizada por pescadores e piscicultores, sendo
espalhadas assim, por todo território brasileiro (Graça, 2007). Alimenta-se,
preferencialmente, de larvas de insetos e detritos (Beyruth et al., 2004).
Esta espécie de tilápia, embora exótica, representa hoje o maior número
de peixes pescados na bacia do rio Guandu. Sendo assim, escolhemos
trabalhar com esta espécie, primeiramente por ser muito estudada, e
também por ser facilmente encontrada na bacia do rio Guandu. Finalmente,
entendemos que, por ser exótica, a captura de espécimes de tilápias no rio
Guandu não prejudica a biodiversidade deste ecossistema.
Figura 1 – Tilápia (Oreochromis niloticus niloticus); Família: Cichlidae; Subfamília: Pseudocrenilabrinae; Ordem: Perciformes. Fonte: Sindicato dos trabalhadores de Iguatu.
7
1.6 - Justificativa
A região hidrográfica do rio Guandu, responsável pelo fornecimento
de água para 80% da população metropolitana do Rio de Janeiro, tem
demonstrado grande crescimento industrial, e deverá receber cerca de R$
10 bilhões em investimentos privados após a construção do arco
metropolitano do Rio de Janeiro. Entretanto, muitos cuidados devem ser
tomados para evitar que esses investimentos acabem por acarretar mais
impactos a esta região que já se encontra muito degradada. Sendo assim,
é necessária a realização de monitoramentos e criação de parâmetros para
controlar e fiscalizar a qualidade da água desta importante bacia
hidrográfica.
8
2 – OBJETIVOS:
2.1 - Geral
Desenvolvimento de bioensaios que possam ser empregados na
avaliação da qualidade de corpos d'água através da utilização de enzimas
de fígado de Tilápias (Oreochromis niloticus niloticus) como biomarcadoras
de exposição e efeitos subletais de poluentes.
2.2 - Específico
Comparar atividades hepáticas de ECOD e EROD de tilápias
capturadas em água livre de contaminação ambiental (Represa de Ribeirão
das Lajes, RJ / piscicultura de Taubaté, SP) com aquelas capturadas nas
águas supostamente poluídas do rio Guandu.
9
3 – MÉTODOS:
3.1 - Animais
Os animais foram obtidos ainda vivos, junto a pescadores em três
locais diferentes: na represa de Ribeirão das Lajes, principal tributária
natural do rio Guandu, em uma piscicultura comercial em Taubaté-SP
(fazem parte do grupo controle), e no rio Guandu, próximo à estação de
tratamento de água da CEDAE (ETA – GUANDU).
Estes animais foram medidos e sacrificados por ruptura da coluna
vertebral. Os fígados foram coletados e armazenados em nitrogênio
líquido. As coletas foram realizadas no inverno e no verão.
3.2 - Preparo de frações pós-mitocondriais e microssomais
Para o preparo de frações pós-mitocondriais os fígados foram
descongelados, pesados e homogeneizados em homogeneizador Potter-
Elvejhem teflon/vidro, numa proporção de 1,0 g de fígado para 4,0 mL de
solução tampão gelada (fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0, contendo 0,25
M de sacarose). Os homogeneizados hepáticos foram subsequentemente
centrifugados a 9.000 x g por 30 min a 4 ºC. Alíquotas do sobrenadante
(fração pós-mitocondrial) foram congeladas em nitrogênio líquido até o
uso. O restante das frações pós-mitocondriais foram usadas para o
preparo de microssomas hepáticos. Estas frações foram centrifugadas em
ultracentrífuga Hitachi, a 100.000 x g por 60 min a 4 ºC. Os sedimentos
obtidos foram ressuspensos no mesmo tampão de homogeneização (1,0
mL de tampão/grama de tecido), re-homogeneizados manualmente em
Potter, e congelados em nitrogênio líquido.
10
3.3 - Determinação das concentrações protéicas
As concentrações de proteínas dos microssomas hepáticos e das
frações pós-mitocondriais foram determinadas conforme o método de
Peterson (1977).
3.4 - Determinação da atividade da 7-etoxicumarina-O-desetilase
(ECOD)
A atividade de 7-etoxicumarina-O-desetilase (ECOD) foi determinada
conforme descrito por Greenlee & Poland (1978), com pequenas
modificações. Foram adicionados em tubos eppendorfs, em banho de gelo,
o tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,8 (q.s.p. 500 µL), 5,0 µL de
cloreto de magnésio (MgCl2) 1,0 M em água (10 mM final), 5,0 µL de
etoxicumarina 100 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) da Merck (1,0 mM
final), e 400 µg de microssoma hepático. Após 1 minuto de pré-incubação a
37°C, a reação foi disparada pela adição 20 µL de NADPH 25 mM em água
(1,0 mM final), sendo paralisada 10 min depois pela adição 500 µL de uma
solução de ácido tricloroacético (TCA) 5% (2,5 % final). Após incubação,
os tubos foram centrifugados a 1000 rpm por 8 minutos a 5 °C, e 500 µL
sobrenadantes foram retirados e adicionados a tubos de vidro.
Imediatamente antes da leitura da fluorescência, foram adicionados aos
tubos 2,0 mL de tampão glicina/hidróxido de sódio (NaOH) 1,6 M pH 10,3
para alcalinizar o meio. A fluorescência foi avaliada com excitação a 390
nm e emissão a 440 nm. Os brancos da reação foram feitos basicamente
da mesma maneira que os ensaios, exceto pelo fato do microssoma ter
sido incluído apenas após o acréscimo do TCA.
11
3.5 - Efeito da quantidade de proteínas sobre a atividade de ECOD
Foi avaliado o efeito de diversas quantidades de proteínas
microssomais hepáticas de tilápias sobre a atividade de ECOD. Usamos
quantidade de proteínas entre 100 e 800 µg/mL.
3.6 - Curva padrão de umbeliferona
Inicialmente preparamos uma solução de umbeliferona em etanol
absoluto a 1,0 mM. Esta solução foi então diluída em etanol até chegar a
10 µM. Adicionamos em tubos eppendorfs o tampão fosfato de potássio 0,1
M em pH 7,8, a umbeliferona (50, 100, 200 e 400 pmol), o etanol nos
controle, e o 500 µL TCA 5%. No momento da leitura foram adicionados
2,0 mL de tampão glicina-NaOH 1,6 M, pH 10,3 em temperatura ambiente e
a leitura da fluorescência foi feita com excitação a 390 nm, emissão a 440
nm, e fendas de 1:1.
3.7 – Determinação da atividade da 7-etoxiresorufina-O-desetilase
(EROD)
A atividade da 7-etoxiresorufina-O-desetilase foi determinada
basicamente conforme descrito por Burke et al. (1985), com pequenas
modificações.
Em cubeta de quartzo, posicionada dentro do espectrofluorímetro
(com temperatura controlada a 37°C por um banho-maria com circulação
de água), foram pipetados o tampão fosfato de potássio 0,1M pH 7,8 (q.s.p.
2,0 mL), 10 µL de cloreto de magnésio (MgCl2)1,0 M em água destilada (5
mM final), 10 µL de 7-etoxiresorufina 1,0 mM em DMSO da Merck (5,0 µM
final) e microssoma hepático ou fração pós-mitocondrial. Após 3 min de
pré-incubação, a reação foi disparada com a adição de 20 µL de NADPH
25 mM em água (0,25 mM final). A velocidade da reação foi determinada
12
pelo aumento da fluorescência causada pelo acúmulo de resorufina. A
fluorescência foi lida continuamente por 90 segundos em um
espectrofluorímetro com excitação a 550 nm e emissão a 582 nm, com
fendas 1/1.
3.8 - Curva padrão de resorufina
Inicialmente preparamos uma solução de resorufina 0,1 mM em água
destilada. Esta solução foi então diluída em água até chegar a 1,0 µM e a
0,1 µM. Adicionamos em tubos eppendorfs o tampão fosfato de potássio
0,1 M pH 7,8 (q.s.p. 2,0 mL) e a resorufina (de 2,5 a 80 pmol), e
procedemos a leitura no espectrofluorímetro com excitação a 550 nm e
emissão a 582 nm, com fendas 1/1.
3.9 - Estatística empregada
Na realização dos testes estatísticos foi utilizado o Software livre
Bioestat 5.0. Primeiramente foi realizada a análise de variância através do
teste de Kruskal-Wallis, já que as amostras não são paramétricas, em
seguida foi realizado o teste de Mann-Whitney para amostras
independentes, já que o número de indivíduos é diferente. Para comparar
os grupos de fração microssomal e fração pós-mitocondrial foi realizada a
estatística descritiva para dados quantitativos.
13
4 – RESULTADOS:
A fim de analisarmos a atividade da enzima 7-etoxicumarina O-
desetilase (ECOD), fizemos inicialmente uma curva padrão de
umbeliferona (figura 2), o produto desta enzima quando usamos
etoxicumarina como substrato.
y = 1133.8x + 7637.5
R² = 1
0
100000
200000
300000
400000
500000
0 100 200 300 400 500
Flu
ore
scê
nci
a
picomols de umbeliferona
Figura 2 – Análise da variação da fluorescência versus a concentração de umbeliferona usada. Excitação a 390 nm e emissão a 440 nm, em temperatura ambiente.
A figura 3 apresenta a proporcionalidade da atividade da
etoxicumarina O-desetilase (ECOD) microssomal hepática de tilápia
determinada com diferentes quantidades de proteína, até a concentração
de 800 microgramas/mL. A partir deste experimento, passamos a usar 400
microgramas de proteína para a determinação da ECOD.
14
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 200 400 600 800
Inte
nsi
da
de
de
flu
ore
scê
nci
a
Microgramas de proteína microssomal hepática
Figura 3 – Efeito da variação da quantidade de proteína sobre a atividade da 7-etoxicumarina O-desetilase microssomal hepática de tilápia. A atividade da enzima foi determinada usando-se um pool de microssomas hepáticos de três tilápias da Represa de Ribeirão das Lajes.
Como apresentado na figura 4, as atividades de ECOD em fração
microssomal hepática de tilápias coletadas no rio Guandu (G1) e em
Ribeirão das Lajes (C1) não apresentaram diferenças significativas (p >
0,05).
Com intuito de analisarmos a atividade da enzima 7-etoxiresorufina O-
desetilase (EROD), fizemos uma curva padrão de resorufina (figura 5), o
produto desta enzima quando usamos como substrato a 7-etoxiresorufina.
Como observado, obtivemos uma curva com excelente linearidade até 80
pmols de resorufina.
15
Figura 4 - Atividade da Etoxicumarina O-desetilase (pmol de umbeliferona.min-1.mg-
1) em fração microssomal hepática de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C1, Represa de Ribeirão das Lajes – 8 animais contendo entre 22 a 25 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G1 – 9 animais contendo entre 16 e 19,5 cm), em agosto/setembro de 2011. O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney.
y = 5526.3x + 3948.1
R² = 0.9992
0
100000
200000
300000
400000
500000
0 20 40 60 80
Flu
ore
scê
nci
a
Pmols de resorufina
Figura 5 – Análise da variação da fluorescência versus a concentração de resorufina usada. Excitação a 550 nm e emissão a 582 nm, a 37 ºC.
16
Na figura 6 estão comparadas as atividades da 7-etoxiresorufina O-
desetilase (EROD) microssomal hepática de tilápias de sítios controle (C1
– inverno e C2 – verão) com aquelas do rio Guandu (G1 – inverno e G2 –
verão). Como pode ser claramente observado, as tilápias do rio Guandu,
de ambas as coletas apresentam atividades bem maiores que aquelas dos
sítios controles.
A atividade específica média de EROD das tilápias do grupo C1, foi
6,99 ± 3,35 pmols de resorufina.min-1.mg-1, enquanto a atividade específica
média desta mesma enzima nos animais coletados no rio Guandu (G1) foi
51,13 ± 45,30 pmols de resorufina.min-1.mg-1. Portanto estas últimas
apresentaram atividade de EROD 700% maior que os do sítio controle 1.
Este resultado é comprovado ao dosarmos a atividade específica
média de EROD das tilápias do grupo C2, que foi 4,75 ± 1,82 pmols de
resorufina.min-1.mg-1, e a atividade específica média desta mesma enzima
nos animais coletados no rio Guandu (G1) foi 30,64 ± 21,95 pmols de
resorufina.min-1.mg-1. Portanto estas últimas também apresentaram
atividade de EROD 700% maior que os do sítio controle 2.
Ao realizar o teste estatístico encontramos p < 0,05, confirmando que
obtivemos uma diferença significativa entre as atividades de EROD
microssomal hepática das tilápias dos grupos controles e aquelas
coletadas no rio Guandu.
17
Figura 6 – Atividade da Etoxiresorufina O-desetilase (pmol de resorufina.min-1.mg-1) em fração microssomal hepática de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C1, Represa de Ribeirão das Lajes / setembro de 2011 - 8 animais contendo entre 22 a 25 cm e C2, piscicultura comercial em Taubaté-SP / março de 2012 – 8 animais contendo entre 21 a 26 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G1 – 9 animais contendo entre 16 e 19,5 cm coletados em agosto de 2011 e G2 – 7 animais contendo entre 16 a 25 cm coletados em março de 2012). O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney. Foram excluídos dois resultados do grupo G1 (0,53 e 1,14 pmol de resorufina.min-1.mg-1) e um resultado do grupo G2 (1,36 pmol de resorufina.min-1.mg-1), pois apresentaram valores menores que qualquer controle, caracterizando outline (Biostatistical Analysis, 2007).
Visto que observamos grande variabilidade individual na atividade de
EROD em fração microssomal, mesmo no grupo controle, resolvemos
analisar esta atividade também em fração pós-mitocondrial (S9).
Como já era de se esperar, a atividade de EROD medida em fração
microssomal hepática de tilápia foi maior do que a mesma atividade
medida em fração pós-mitocondrial (FPM), sendo a primeira
aproximadamente duas vezes maior do que a segunda, como mostra a
figura 7.
Os resultados também mostraram que apesar da atividade de EROD
em FPM ser menor do que em fração microssomal hepática, existe uma
18
boa relação linear entre as duas frações, sugerindo, portanto que a
atividade de EROD em fração pós-mitocondrial hepática é um biomarcador
suficientemente sensível na avaliação da exposição de tilápia
(Oreochromis niloticus niloticus) a substâncias poluentes presentes no rio
Guandu, além de seu preparo ser muito mais simples de realizar.
Ao realizar o teste estatístico encontramos que p < 0,05, confirmando
que obtivemos uma diferença significativa entre o grupo controle e o grupo
de teste para fração pós-mitocondrial.
Figura 7 - Atividade da Etoxiresorufina O-desetilase (pmol resorufina.min-1.mg-1) em frações microssomais (C2 e G2) e pós-mitocondriais (C2P e G2P) hepáticas de tilápias (Oreochromis niloticus niloticus). Coletadas em sítio controle (C2 / C2P, piscicultura comercial em Taubaté-SP – 8 animais contendo entre 21 a 26 cm) e no rio Guandu, próximo à captação de água da ETA - Guandu (G2 / G2P – 7 animais contendo entre 16 a 25 cm), em março de 2012. O “boxplot” mostra a mediana (linha dentro da caixa), os quartis 75% e 25% (bordas superior e inferior da caixa) e os valores mínimo e máximo dos dados (extremidades da linha vertical). Os dados foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e em seguida pelo teste U de Mann-Whitney. Foi excluído um resultado do grupo G2 (1,36 pmol de resorufina.min-1.mg-1) e um resultado do grupo G2P (0,61 pmol de resorufina.min-1.mg-1), pois apresentaram valores menores que qualquer controle, caracterizando outline (Biostatistical Analysis, 2007).
Como pode ser observado na tabela 1, os coeficientes de variação
obtidos através do teste de estatística descritiva foram bem menores para
fração pós-mitocondrial do que para fração microssomal, o que claramente
indica que a fração pós-mitocondrial é a melhor opção para realizar a
19
determinação da atividade da enzima EROD em fígado de tilápia, por
fornecer um conjunto de dados mais homogêneos.
EROD Média Aritmética Desvio Padrão Coeficiente de Variação (%)
C2 4,74 1,82 38,41
G2 36,50 18,58 50,91
C2P 2,45 0,48 19,62
G2P 25,05 10,81 43,18
Tabela 1 – Comparação de variabilidade da enzima EROD em frações microssomais (C2/G2) e pós-mitocondriais (C2P/G2P) hepáticas de tilápia. Resultados obtidos através do teste de estatística descritiva para dados quantitativos.
20
5 – DISCUSSÃO:
O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de
bioensaios que possam ser empregados na avaliação da qualidade de
corpos d'água através da utilização de enzimas de Tilápias (Oreochromis
niloticus niloticus) como biomarcadoras de exposição e efeitos subletais de
poluentes. Neste sentido, realizamos uma comparação entre as atividades
enzimáticas das tilápias coletadas no rio Guandu, com aquelas coletadas
em áreas supostamente livres de poluição (represa de Ribeirão das Lajes e
piscicultura comercial).
Os resultados obtidos com a enzima ECOD não apresentaram
diferença significativa entre as atividades das tilápias coletadas no rio
Guandu com aquelas coletadas em área livre de poluição. Desta forma
podemos concluir que esta enzima não é um bom biomarcador para realização do
monitoramento de habitats aquáticos.
Já os resultados obtidos com EROD demonstraram que houve uma indução
significativa na atividade desta enzima em fígado de tilápia, caracterizando um
aumento superior a 700% no grupo do rio Guandu.
Os resultados fornecem forte indício da exposição das tilápias do rio
Guandu a contaminantes indutores de CYP1A. Esta grande elevação da
atividade da enzima EROD em frações pós-mitocondriais e microssomais
hepáticas de tilápias capturadas no rio Guandu em comparação com a
atividade dessa mesma enzima nas tilápias capturadas em sítios controles.
Esses resultados vem confirmar os estudos de Parente et al. (2004/2008),
que também sugerem que a bacia hidrográfica do rio Guandu está
contaminada por substâncias químicas indutoras de CYP1A, já que os
resultados obtidos no nosso estudo também indicam essa contaminação.
As substâncias químicas citadas são produzidas por uma variedade de
processos industriais.
Nossos resultados mostraram que o uso de frações pós-mitocondriais
(FPM) para a determinação da atividade de EROD hepática de tilápias é
mais favorável do que o uso de microssomas. As FPM fornecem resultados
mais homogêneos e são mais fáceis de preparar. Estes dados validam os
21
resultados descritos por Parente et al. (2008), que também obtiveram resultados
positivos com FPM.
Dois afluentes do rio Guandu passam pelo distrito industrial de
Queimados (rio Poços e rio Queimados), onde diversas indústrias se
estabeleceram durante os últimos anos. Também está localizado neste
distrito, próximo ao rio Queimados, um depósito de resíduos químicos
perigosos, uma mistura de hidrocarbonetos clorados que tem como base
óleo de ascarel, usado como fluido isolante para transformadores elétricos.
Infelizmente quando a utilização deste óleo foi interrompida, o depósito foi
abandonado com uma quantidade substancial de resíduos ambientalmente
persistentes. Com condições erradas de armazenamento, os recipientes
foram corroídos e seu conteúdo vazou contaminado solo e água. Além
deste fato aconteceram pelo menos dois incêndios neste depósito nos
últimos anos, resultando numa provável produção de uma quantidade
considerável de dioxinas (Pinto, 2001).
Consequentemente, PCBs e dioxinas são possíveis indutores de
CYP1A, contaminantes da área do rio Guandu (Parente et al., 2008).
Apesar de o rio Guandu receber grandes quantidades de resíduos
industriais, o deságüe de esgoto doméstico parece ser a principal fonte de
contaminação desta bacia hidrográfica (Parente et al., 2008).
Vale ressaltar que a tilápia, Oreochromis niloticus niloticus, provou ser
uma boa espécie sentinela para realização do monitoramento de corpos
d’água nas áreas metropolitanas do Brasil, por ser uma espécie muito
resistente e possuir uma taxa de crescimento rápida. A princípio a espécie,
originária da África, foi introduzida no Brasil a fim de servir como fonte de
proteína animal em reservatórios nas regiões áridas e semi-áridas do
nordeste do Brasil em 1970 (Bizerril & Primo, 2001). Entretanto a espécie
se popularizou e passou a ser utilizada para cultura de peixes e tem se
espalhado por todo país, está hoje entre os peixes de água doce mais
consumidos nas regiões sul e sudeste do Brasil, onde além se serem
criadas em fazendas, são também encontradas em reservatórios, rios,
lagos e barragens (Parente et al., 2008).
22
A tilápia (Oreochromis niloticus niloticus) é uma das espécies mais
interessantes para a realização de programas de monitoramento ambiental
no Brasil. Uma de suas vantagens é o fato de essa espécie ser
amplamente utilizada em pisciculturas, sendo estes empreendimentos
contínuos fornecedores de grupos controles para a análise de mananciais
híbridos supostamente contaminados (Parente et al., 2008).
23
6 – CONCLUSÕES:
• A enzima ECOD não parece ser uma boa alternativa como
biomarcadora de contaminação de corpos hídricos, visto que
não apresentou alteração significativa de atividade se
comparada entre os sítios controles e o rio Guandu.
• A enzima EROD pode ser usada como excelente biomarcadora
de contaminação de corpos hídricos. Mostrou-se intensamente
induzida em fígado de tilápias no rio Guandu, quando
comparada com tilápias de sítios controles.
• O rio Guandu apresenta-se contaminado com indutores de
CYP1A, provavelmente hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos.
• A fração pós mitocondrial de fígado de tilápia é mais prática e
segura que o microssoma para o monitoramento da qualidade
de corpos hídricos, usando-se a enzima EROD como
biomarcadora.
24
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