VET 412

Gıda Hijyeni ve Kontrolü

Dersi Uygulama Kitapçığı

2012

Öğrencinin;

Adı Soyadı :

Numarası :

2

Uygulamanın adı Giriş, Laboratuvarların gezilmesi, alet ve cihazların tanıtılması

Yapılacağı hafta I. Hafta Uygulamanın temel hedefi Gıdaların analizinde kullanılan alet, cihaz ve

malzemelerin tanıtılmasıKullanılacak materyal ve malzeme adı Alet ve Cihazlar: Etüv, sterilizatör, otoklav,

Kjelfox protein tayin cihazı, kül fırını, distile su cihazı, pH metre, su banyosu, manyetik karıştırıcı, hassas terazi, stomacher, refraktometre, ELİSA cihazı, vortex, otomatik pipet, Gerber santrifüjüMalzemeler: Desikatör, cam-pipet, bullu pipet, erlen, beher, balon, balon joje, mezür, huni, spatül, cam baget, petri kutusu, deney tüpü, bütirometrelerDiğer: Maşa, kroze, öze, port tüp, piset, trommel, süzgeç kağıdı, steril poşet

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Etüv: Mikrobiyolojik ekimlerin yapıldığı besi yerlerinin gerekli süre ve sıcaklık için inkübasyona bırakıldığı, sıcaklığı sabit tutan, değişik tipleri (soğutmalı tip, soğutmasız tip ve CO2’li) olan bir cihazdır.Otoklav: Besi yerlerinin ve kuru hava sterilizatöründe sterilizasyona uygun olmayan materyallerin sterilizasyonunda kullanılan ve basınçlı buhar (121°C’de, 1.1 atmosfer basınç altında en az 15 dakika) prensibine göre çalışan bir cihazdır.Kjelfox Protein Tayin cihazı: Gıdalarda ham protein tayini için kullanılan bir cihazıdır.Kül fırını: Analizi yapılacak numunenin yüksek sıcaklık derecelerinde (650°C’ye kadar) yakılmasının sağlandığı bir cihazdır.Distile su cihazı: Besi yerlerinin hazırlanmasında distile su kullanılır. Bu cihaz da normal şebeke suyunun distilasyonunu sağlamaktadır.pH metre: Probunun ucunda bulunan elektrot sayesinde batırıldığı numunenin pH’sını ölçmekte olup değişik hassasiyetlerde dijital olanlarının yanı sıra dijital olmayanları da mevcuttur.Su banyosu (Ben mari): İçerisine koyulan duyarlı numuneyi 0–100°C’ye kadar homojen olarak ısıtabilen ve istenilen derecelerde sabit tutmaya yarayan cihazdır. Distile su ile çalıştırılmaktadır. Bazı besi yerlerinin kesinlikle otoklava girmemeleri, sadece su banyosunda yeterli süre ısıtılmaları gerekmektedir.Manyetik karıştırıcı: Özellikle asitlik tayininde ya da hazırlanmış solüsyonların, gerekirse ısıtılmalarını da sağlayarak karışmalarını, beher ya da erlen içinde manyetik dalgalar yardımı ile sürekli dönen bir balık yardımı ile sağlayan cihazdır.Stomacher: Gıda maddelerinin mikrobiyolojik analizleri öncesinde homojenizasyonunu sağlayan cihazdır.Vorteks: Deney tüpünün içindeki sulandırma sıvısının ve içine ilave edilen numunenin homojen bir şekilde karışmasını sağlayan cihazdır.

3

Otomatik pipet: Özellikle çekilecek sıvıların çok az miktarda (l) olmaları durumunda kullanılmaktadırlar.Sterilizatör: Mikrobiyoloji laboratuarında kullanılacak steril malzemelerin (özellikle cam malzemelerin) kuru hava ile sterilize edilmesinde kullanılır. Bu amaçla cihaz, 170–175°C’lerde az 1 saat çalıştırılmaktadır (Karşılaştırınız: otoklav).Refraktometre: Sütün yağsız kuru maddesinin % olarak belirlenmesinde kullanılır. 2 tipi vardır: Süt refraktometresi ve şeker refraktometresi. Sütün yağsız kuru maddesinin belirlenmesi amacıyla cihazın öncelikle kalibre edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla ilgili kısma 1 damla distile su damlatılıp refraktometrenin skalası 0 (sıfır)’a ayarlanır. ELISA cihazı: Süt ve süt ürünlerinde başlıca Aflatoksin M1 tayini olmak üzere çeşitli serolojik testler amacıyla kullanılmaktadır.Gerber santrifüjü: Süt ve süt ürünlerinin yağ miktarının belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.Desikatör (eksikatör): Kalın camdan yapılmış iki bölümlü ve cam kapaklı nemsiz ortamda saklanması gereken maddelerin muhafaza edildiği kaplardır. Üç kısımdan oluşur: Kapak, gövde ve delikli porselen tabla ve tablanın altında nem çekici özelliği olan maddeler (CaCl2 P2O2, derişik H2SO4) bulunur. Orta kısma konulan tabla (ızgara) üzerine oda sıcaklığında kurutulmak istenen maddeler veya kuru yerde muhafazası istenilen maddeler yerleştirilir. Kapağın temas yüzeylerine vazelin sürülerek kullanılır. Desikatör kapağı açılırken yukarı doğru kaldırılarak değil, yana doğru kaydırılarak açılmalıdır. Cam pipet (Dereceli pipet): İstenilen sıvı madde miktarının alınıp aktarılması, titrasyon gibi işlemlerde kullanılır. Bu pipetlerin sıvı çekilen kısımlarının, 1ml’lik pipetlerde sarı, 2 ml’ik olanlarda siyah, 5 ml’lik olanlarda vişne kırmızısı ya da mavi ve 10 ml’lik olanlarda turuncu renkte olduğu unutulmamalıdır.Bullu pipet (Bullü pipet, joje pipet): Üzerlerinde ağza yakın kısımda hacmi bildiren bir çizgi vardır. Orta kısmı, çekilen sıvının ağza kaçmasının engellenmesi amacıyla şişkindir. 11 ml’e ayarlı süt pipetleri böyle pipetlerdendir.Erlen (Erlenmayer): Hacimleri 25 ml'den bir kaç litreye kadar değişebilen en çok titrasyonda, aktarma işlemlerinde, besi yerlerinin hazırlanmasında vb... kullanılan ağzı dar, dip kısmı geniş bir cam malzemedir.Beher (Beherglas): Hacimleri 10 ml'den bir kaç litreye kadar değişen, geniş ağızlı, kenarları dışa kıvrık ve silindirik şekilli bir cam malzemedir. Laboratuarda yapılan analizlerde, aktarma işleminde vb... kullanılır.Balon (Balonjoje): Cam balonlar düz ve yuvarlak dipli olmak üzere iki şekilde olup yuvarlak dipli olanlar kaynatma çalışmalarında özel ısıtıcılara oturtulabilen balonlardır. Dibi düz olanlar solüsyon hazırlamak, saklamak, distilasyon yapmak amacıyla kullanılır. Bu balonların boyun kısımlarında ölçü çizgisi yoktur.Port tüp: Deney tüplerinin yerleştirildiği, bunların düşmemelerinin sağlandığı düzeneklerdir.Balon joje (Ölçü balonu): İnce, uzun boyunlu olup boyun kısmındaki çizgiye kadar doldurulması halinde üzerinde yazan hacmi aldığını gösterir. Özellikle % solüsyonların hazırlanmasında kullanılır.Mezür: 25 ml’den birkaç litreye kadar değişen hassasiyette olup özellikle aktarma işlemlerinde kullanılmaktadır.

4

Huni: Çeşitli boyun uzunluğuna ve ağız çaplarına sahiptirler. Sıvıları dar ağızlı kaplara aktarmak için kullanılırlar. Süzgeç kağıdı ile birlikte süzme işleminde kullanılırlar.Petri kutusu: Kapak ve kutudan oluşup mikrobiyolojik ekimlerde besi yerlerinin hazırlanmasında kullanılırlar.Deney tüpü: Mikrobiyolojik ekimlerde kullanılan sulandırma sıvılarının, yatık ve düz agarların, sıvı besi yerlerinin hazırlandığı, kapaklı ya da kapaksız tipleri bulunan ve farklı hacimlerde olan mikrobiyolojik ya da kimyasal analiz tüpleridir.Bütirometreler: Süt ve süt ürünlerinde yağ tayini için kullanılan haznesi, tıpası ve sıkalası bulunmaktadır. Süt, peynir ve tereyağı tipleri bulunmaktadırKroze: Yakma işlemlerinde kullanılmakta olup çok yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olan porselen malzemedir.Öze: Sıvı besi yerlerinden katı besi yerlerine veya katıdan katıya geçişlerin yapıldığı durumlarda kullanılmakta olup platin olan uçları iğne ya da yuvarlak tiptedir. Özellikle saf kültürlerin (tek bir tane olan kültürün) hazırlanmasında kullanılmaktadır.Piset: Solüsyonların hazırlanmasında gerekli hacmin tamamlanmasına az bir miktar kala hata yapma olasılığını en aza indirgemek amacıyla bundan sonraki sıvının tamamlanmasına pisetlerle devam edilir.Trommel: Sterilize edilecek malzemenin (petri kutusu, pipet vb) koyulduğu ve muhafaza edildiği, paslanmaz çelik, silindir şeklinde, kapaklı bir malzemedir.

5

Uygulamanın adı Gıdaların kimyasal analizleri IYapılacağı hafta II. haftaUygulamanın temel hedefi Gıdanın kimyasal kalitesinin anlaşılması ve

teknolojik işlemlere ve tüketime uygun olup olmadığının belirlenmesi

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Petri kabı, etüv, desikatör, hassas terazi, kroze, kül fırını, erlen, distile su, su banyosu, Carrez Ι, Carrez ΙI, süzgeç kağıdı, pipet, huni, %10’luk potasyum kromat, N/10’luk AgNO3

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Gıdalarda kuru madde tayiniTemiz bir petri kabı 105°C’lik etüvde 1 saat kurutulup, desikatörde 15 dakika soğutulur ve tartılır (G1). Üzerine iyice homojenize edilmiş 3–5 ml/g gıda örneği konur. Numune miktarı da bir yere yazılarak (G2) tekrar suyunu uçurmak için 105°C’lik etüvde 4–5 saat tutulur. Yaklaşık 4 saatlik etüvde tutma işleminden sonra her yarım saatte bir petri kutusunun desikatörde soğutulmasından sonra tartılması yapılır, son iki tartım eşit oluncaya kadar bu işlem devam ettirilir. Son iki tartımın eşit olması, numunedeki suyun tamamen uzaklaştırıldığına dair bir işarettir ve bu son tartım (G3) formülde yerine konur.

%Kuru madde= [(G3-G1) / (G2)] x 100

Soru: Darası 25,8787 g gelen bir petri kutusuna 3,6767 g örnek konarak kurumaya bırakılmıştır. Kurutma sonrası tartım ise 26,5757 olarak yapılmıştır. Örneğimizin kuru madde miktarını % cinsinden hesaplayınız.

Sonuç:

6

Gıdalarda Kül Tayini300–400°C’ye ısıtılıp soğutulan porselen krozenin darası alınır (K1). Homojenize edilmiş gıda numunesinden 3–5 g/ml alınır, tartılır (numune miktarı=K2). 550–600°C’de kül fırınında yakılır, porselen kroze, 5–6 saatlik bir sürenin ardından son iki tartımın eşit olması durumunda desikatörde soğutulur ve tartılır (K3).

% Kül Miktarı = [(K3-K1) / (K2)] x 100

Soru: Darası 33,4747 g gelen bir porselen krozeye 4,3737 g örnek konarak yakmaya bırakılmıştır. Yakma sonrası tartım ise 33,5757 g olarak yapılmıştır. Örneğimizin kül miktarını % cinsinden hesaplayınız.

Sonuç:

Tuz tayiniHomojenize edilmiş numuden 10 g alınarak 200 ml işaretli erlene konur. 3/4’üne kadar distile su ile doldurulan erlen su banyosunda 20 dakika tutulur ve dışarı alınarak soğutulur. Üzerine önce 10 ml Carrez Ι (150g potasyum fero siyanit/1000ml distile suya tamamlanır) + 10ml Carrez ΙΙ (300g çinko sülfat/1000ml distile suya tamamlanır) konarak 200 ml’ye distile su ile tamamlanır. Daha sonra karışım süzülür. Bu süzüntüden 20 ml alınıp içine indikatör olarak 1 ml %10’luk potasyum kromat konur ve N/10’luk AgNO3 çözeltisi ile kaybolmayan kiremit kırmızısı renk oluşuncaya kadar titre edilir.

%TUZ=(5,85 × Harcanan N/10 AgNO3(ml) × Faktör) / Alınan Numune Miktarı(g)

Sonuç ve Karar:

7

Uygulamanın adı Gıdaların Kimyasal Analizleri IIYapılacağı hafta III. haftaUygulamanın temel hedefi Gıdanın kimyasal kalitesinin anlaşılması ve

teknolojik işlemlere ve tüketime uygun olup olmadığının belirlenmesi

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Kjeldahl tüpü, H2SO4, katalizör tablet, distile su, erlen, HCl, fenol fitalein, balon, etüv, desikatör, kartuş, Soxhelet cihazı, eter

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Protein TayiniProtein tayini 3 aşamadan oluşmaktadır:1. Yakma (Digestion) aşaması: Numuneden 2 g tartılır ve Kjeldahl tüplerinin içine 20 ml derişik H2SO4 ilave edildikten sonra 2 adet katalizör tablet (3,5g K2SO4 + 0,0035g Se) konur. Tüp cihaza yerleştirilir ve 400°C’de 2-2,5 saat yakılır. Bu süre sonunda tüp soğutulur ve distilasyon aşamasına geçilir.2. Distilasyon Aşaması: Bu tüplerin içine 50 ml distile su ilave edilir, 250 ml’lik erlen içine de 25-30 ml HCl konarak cihazın distilasyon kısmına yerleştirilir. Bu ünite 900 saniyede çalışması programlanarak toplanan distilattan 150 ml alınır.3. Titrasyon aşaması: Toplanan 150 ml distilat içine 1 ml fenol fitalein renk indikatörü damlatılır ve oluşan pembe renk tamamen beyazlaşıncaya kadar HCl ile titre edilir. Harcanan HCl miktarı ile distilasyon aşamasında erlene konulmuş HCl miktarı toplanarak formülde yerine konulur ve % protein değeri hesaplanır.

% Protein = (VHCl x F x 14.007 x 6.25) / N x 100

VHCl = Harcanan konsantre HCl miktarı (ml) F= Konsantre HCl’nin düzeltme faktörüN= Numune miktarı

Sonuç ve Karar:

8

Yağ tayiniBir balon 105°C’de etüvde kurutulur (B1), desikatörde soğutulduktan sonra darası alınır. Homojenize edilmiş numuneden 5–10 g bir kartuş içine tartılır ve üzerine çok az pamuk kapatılır. Kartuş ve darası alınmış balon Soxhelet cihazına yerleştirilerek eterle 5–6 saat extraksiyona tabi tutulur. Yağ ve eter karışımını içeren ve darası bilinen balon alınıp 105ºC’lik etüvde 1 saat bekletilir. Desikatörde soğutulduktan sonra tartım alınır (B2).

%Yağ =[( B2 − B1)/A]×100

B1: Balonun Darası, gB2: Balonun darası + Yağ Miktarı, gA: Numune miktarı, g

Soru: Darası 95,8998 g gelen bir balon cihaza yerleştirildikten sonra kartuş içine 7,7887 g örnek konarak extraksiyona bırakılmıştır. Extraksiyona sonrası yapılan tartım ise 97,5757 g olarak yapılmıştır. Örneğimizin yağ miktarını % cinsinden hesaplayınız.

Sonuç ve Karar:

9

Uygulamanın adı Suların Kimyasal AnalizleriYapılacağı hafta IV. Hafta Uygulamanın temel hedefi Suların kimyasal kalitelerinin belirlenip

tüketime uygun olup olmadıklarına karar vermek

Kullanılacak materyal ve malzeme adı H2SO4, KMnO4, Amonyum okzalat, bek, pipet, erlen, Nessler ayracı, deney tüpü, difenilamin ayıracı, mezür, 6N HCl, %0.4 sülfanilamid, % 0.2 N-(1-naphthyl) ethyl-enediamine dihydrochloride, pH metre, distile su, amonyum tampon çözeltisi, inhibitör, Eriochrom Black T indikatörü, EDTA

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Laboratuara su numunesinin gönderilmesiBu amaçla genellikle 1 lt’lik koyu renkli cam şişeler kullanılmaktadır. Kapalı sistemlerde önce musluk veya tulumbalar açılıp yaklaşık 5 dakika akıtıldıktan sonra numune alınmalıdır. Göl, su deposu, havuz gibi durgun sulardan daldırarak, nehir ve derelerden mümkün olduğu kadar uzun bir araca bağlı şişenin ağzı suyun aktığı tarafa çevrilerek doldurulmalıdır. Şişeler, su ile tıpa ya da kapak arasında 2–3 cm boşluk kalacak şekilde doldurulmalıdır. Kapağın kapatılması ile birlikte suyun nereden alındığı, tarihi, kim tarafından gönderildiği bildirilmelidir.

Toplam Organik madde tayiniSularda organik maddeler, insanlar, hayvanlar ve bitkiler kaynaklı olabilmektedir. Organik madde varlığı, sağlık üzerine direk olarak etili değildir. Özellikle kaynağı hayvansal olanların geldikleri yollardan beraberinde mikroorganizmaları getirebilme olasılıkları ile sularda var olan mikroorganizmaların bu organik maddeler varlığında çabuk çoğalma olasılığından dolayı organik madde varlığı önem kazanmaktadır. Bu metot, asit ortamda permanganat kullanımı ile su içinde bulunan organik maddelerin oksitlenmesi prensibine dayanır.

100 ml su numunesi üzerine 10 ml H2SO4 ve 10 ml KMnO4 ilave edilir, 5 dakika kaynatılır. Soğumasına izin vermeden, üzerine 10 ml Amonyum okzalat ilave edilir. Gene sıcak iken KMnO4 çözeltisi ile hafif pembe renk oluşuncaya kadar titre edilir.

Organik Madde (mg O2/lt) = Harcanan KMnO4 (ml) x 0.8

İyi su: 1 mg’dan az, İçilebilir su: 1–2 mg, Şüpheli su: 2–4 mg ve Kötü su: 4 mg’dan fazla

Sonuç ve Karar:

10

Amonyak tayini Temiz bir tüp içerisine su numunesinden 20 ml konulur. Üzerine 1–2 damla Nessler ayıracı damlatılır. Bir süre beklendikten sonra renk değişimi kontrol edilir. Oluşan sarı-turuncu renk, su numunesinde amonyak varlığını gösterir.

Sonuç ve Karar:

Nitrat tayini Temiz bir tüp içerisine su numunesinden 5 ml konulur, ikinci bir tüpe 5 ml difenilamin ayıracı konulur. İki tüp ağız ağıza getirilerek tüp çeperi üzerinden ayıraç su bulunan tüpe aktarılır (Ayıraç su numunesinin bulunduğu tüpün çeperinden yavaş olarak akıtılması ile su numunesinin hızlı karışması ve oluşabilecek mavi rengin görülememesi riski ortadan kaldırılır). Tüpte sıvıların birbirine değdiği yüzeyde oluşan mavi renk kontrol edilir. Mavi renk oluşması, su numunesinde nitrat varlığını göstermektedir.

Sonuç ve Karar:

Nitrit tayini 100 ml su numunesi erlenmayer içerisine mezür ile ölçülerek konulur. Üzerine sırasıyla 1 ml 6N HCl, 2 ml % 0.4 sülfanilamid, 1 ml % 0.2 N-(1-naphthyl) ethyl-enediamine dihydrochloride ilave edilir. Bir süre beklendikten sonra renk değişimi kontrol edilir. Oluşan pembe renk su numunesinde nitrit varlığını gösterir.

Sonuç ve Karar:

11

pH tayini pH metre çalıştırılır ve kalibrasyonu yapılır. pH metre elektrotu distile su ile yıkanır ve kurulanır. Su numunesi içerisine elektrot yerleştirilir ve ölçüm yapılmaya başlanır. Ölçülen değer skaladan okunur. pH metre elektrotu numuneden çıkartılır ve distile su ile yıkanıp kurutulur. Elektrot ucu 3M KCl bulunan tüp içerisine bırakılır.

Sonuç ve Karar:

Sertlik tayini50 ml su numunesi erlenmayer içerisine mezür ile ölçülerek konulur. Üzerine sırasıyla 1 ml amonyum tampon çözeltisi, 1 ml inhibitör ve 1-2 damla Eriochrom Black T indikatörü damlatılır. Oluşan şarap kırmızısı renk maviye dönüşünceye kadar EDTA çözeltisi ile titrasyon yapılır. Harcanan EDTA miktarı formülde yerine konularak, sertlik derecesi Fransız sertlik derecesi cinsinden belirlenir.

Toplam sertlik Fr0 = ( Harcanan EDTA miktarı / Numune miktarı) x 100

Soru: Bir erlenmayer içerisine 100 ml su alınmış ve sertlik açısından incelenmiştir. Titrasyonda 8 ml EDTA harcandığına göre suyun sertliğini hesaplayınız.

Sonuç ve Karar:

12

Uygulamanın adı Mikrobiyolojik Ekimlerde Kullanılan Besi yerleri ve Hazırlanmaları

Yapılacağı hafta V. haftaUygulamanın temel hedefi Besi yerleri hakkında bilgilendirmek ve farklı

mikroorganizmaların gelişebilecekleri farklı özellikteki besi yerlerinin hazırlanabilmesini sağlamak.

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Besiyeri, spatül, besiyeri şişesi, distile su, mezür, deney tüpü, petri kutusu, su banyosu, bek, otoklav, pipet, hassas terazi

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Besi yerleri (vasat; media; besi ortamı; kültür ortamı; kültür besi yeri) mikroorganizmaların gelişebilecekleri ortamlar olarak tanımlanır ve basit olarak su ve besin maddelerini içerir. Besi yerleri granüler veya toz şeklinde olabilirler. Granüler besi yerlerinin, toz besi yerlerine göre sağlık güvencesi (tartım sırasında toz bulutu oluşmamasına ve bunun solunmasına bağlı tehlikelerin ortadan kaldırılması), tartım sorunlarının ortadan kaldırılması (spatüle, tartım kabına yapışmaların olmaması), daha iyi erime, depolamada topaklaşmanın kayda değer ölçüde azalması, düşük nem içeriğine bağlı olarak daha uzun depolama gibi üstünlükleri vardır.Besi yerleri farklı başlıklar altında gruplandırılabilir. Fiziksel özelliklerine göre sıvı ve katı olmak üzere 2 gruba ayrılırken orijinlerine göre bitkisel, hayvansal, sentetik, türev, karışık vb şekillerde sınıflandırılabilirler.Besi yerlerinin kullanım amaçlarına göre sınıflandırılmalarında "genel besi yerleri" ve "özel besi yerleri" olarak 2 gruba ayrılmakta, özel besi yerleri ise kendi içinde alt gruplara ayrılmaktadır.

Genel Besi yerleri: Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin, herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor gelişen (fastidious) mikroorganizmaların da dahil olduğu çok sayıda bakterinin gelişmesini sağlayan besi yerleridir.Genel besi yerleri başlıca, çeşitli örneklerdeki toplam mezofil aerob bakteri sayımı, toplam psikrofil aerob bakteri sayımı, bozulma/hastalık etmeninin ön izolasyonu amaçları ile kullanılır. Başta gıda maddeleri olmak üzere pek çok örnekte "toplam mezofil aerob bakteri sayısı" ile "toplam psikrofil aerob bakteri sayısı" tayinleri önemli kalite kriterleridir. Gıda mikrobiyolojisi açısından mezofil aerob bakterilerin sayılabileceği Plate Count Agar, CASO (Tryptic Soy) Agar, Nutrient Agar genel besi yeri örnekleri genel besi yer olarak kabul edilmektedir.

13

Özel Besi yerleri: Genel besi yerleri dışında kalan tüm besi yerleri "özel besi yerleri" grubuna girer. Özel besi yerleri de kendi içinde 4 gruba ayrılır.

1. Selektif Besi yerleri: Selektif besi yerleri, karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri baskılamak ve inhibe etmek, ancak gelişmesi istenenler için herhangi bir olumsuz etki yapmamak üzere formülüze edilirler. Bu amaçla çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. Selektif besi yerleri, belirli bir grup hatta yüksek selektivite gösterenlerde tek bir cins/ tür mikroorganizmanın gelişmesine izin vereceğinden bu besi yerleri selektif izolasyon, selektif sayım ve hatta ön identifikasyon amaçları ile kullanılır. Bir besi yerine selektivite kazandırılması her zaman inhibitör madde ilavesi ile yapılmaz. Geliştirilmesi istenilen mikroorganizmanın kullanabileceği, ancak refakatçi mikroflora tarafından kullanılamayan besin maddeleri besi yerine katılarak selektivite sağlanabilir.

2. Diferansiyel Besi yerleri: Diferansiyel besi yerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir, ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır.Diferansiyel besi yerinde gelişen mikroorganizmaların ayrımı koloni morfolojisi, enzimatik aktivitelerin belirlenmesi, gaz oluşumunun izlenmesi vb çıplak gözle yapılabileceği gibi bunlara ilave olarak fluoresansa dayalı olarak da yapılabilmektedir. MUG ilave edilmiş besi yerleri E. coli için yaygın bir şekilde kullanılırken, setrimid (=cetrimide) katılmış besiyerlerinde Pseudomonas aeruginosa yine UV ile ayırt edilmektedir.

3. Zenginleştirme Besiyerleri: Karışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek, sayısını artırmak vb amaçlarla kullanılan zenginleştirme besi yerleri, ön zenginleştirme besi yerleri ve selektif zenginleştirme besi yerleri olarak 2 alt gruba ayrılırlar. Ön zenginleştirme besi yerleri genel olarak hasar görmüş (=injured =yaralanmış) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan, bileşiminde inhibitör içermeyen ve dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir.Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besi yerleridir. Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler çeşitli selektif inhibitörler ile engellenir. Selektif zenginleştirme aşamasını genellikle selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak aranan bakterinin selektif izolasyonu aşaması izler. Bu çerçevede selektif zenginleştirmenin amacı, selektif izolasyonda başarı şansını artırmak için aranan mikroorganizmanın karışık kültür içindeki sayısını artırmaktır.

14

4. İdentifikasyon Besi yerleri: İdentifikasyon besi yerleri, mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (genellikle karbohidratlar) kullanıp/kullanmadığının saptanması, belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin triptofandan indol) oluşturup/oluşturmadığının belirlenmesi vb amaçlar ile kullanılır. Bakterinin hareketli olup olmadığının saptanması amacıyla kullanılan yarı katı (semi solid) besi yerleri de identifikasyon besi yerleri grubuna katılmaktadır.Diğer Besi yerleri Çeşitleri: Antimikrobiyel duyarlık testlerinde kullanılan agar disk difüzyon besi yerleri ile minimal inhibisyon konsantrasyonu testlerinde kullanılan sıvı ve katı besi yerleri, vitaminlerin ve aminoasitlerin mikrobiyel yolla belirlenmesinde kullanılan besi yerleri, saf kültürlerin korunması (=kolleksiyonu) amacıyla kullanılan besi yerleri, taşıma besi yerleri gibi özel amaçlara yönelik olarak kullanılan çeşitli besi yerleri de vardır.

Besi yerlerinin HazırlanmalarıBesi yeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış, besi yeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve kurutulmuş olması gerekmektedir. Besi yerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeteri büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen, ancak önemli bir ayrıntıdır. Cam kapların hacmi yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır.Tartımın yapılacağı terazinin 0,01 gram duyarlıkta olması gerekir. Tartım sırasında her besi yeri için temiz spatül kullanılması, besi yeri ve/veya besi yeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra tartımın hemen yapılması ve besi yeri kapağının sıkıca kapatılması, tartımlar sırasında besi yeri ve/veya besi yeri bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmesi, eğer toz bulutu oluştu ise bunun kesinlikle solunulmaması, tartım sırasında besi yeri ve/veya besi yeri bileşenlerinin çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesinin sağlaması, eğer temas varsa bol su ile hemen yıkanması gereklidir.Bazı besi yeri/besi yeri bileşenleri suda kolay erimezler. Bu gibi durumlarda besi yerinin 50oC’a kadar ısıtılarak karıştırılması ve/veya suyun bu sıcaklıkta kullanılması erimeyi hızlandırır. Eğer besi yeri sıvı ise (Broth/Buyyon) besi yeri/ besi yeri bileşenleri tümüyle eridikten sonra tüplere, küçük hacimli erlenlere/balonlara dağıtılır veya doğrudan sterilize edilebilir.Usulüne uygun olarak depolanmış ve raf ömrü bitmemiş besi yerlerinde nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması, besi yeri sterilizasyonunun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besi yeri pH’sında bir sorun çıkmaz. Besi yeri pH’sı ayarlanacak ise sterilizasyon öncesi yapılması yanlış olacaktır. Çünkü pH, sterilizasyon sonrasında az da olsa bir miktar değişir. Dolayısı ile pH’nın sterilizasyon öncesinde ayarlanması, sterilizasyon sonrasında yanlış pH elde edilmesine yol açacaktır. pH ayarlanmasında 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılırSterilizasyon, yaygın olarak ısıl işlem uygulaması ile ve zorunlu hallerde filitrasyon ile yapılır. Isıl işlem, özel olarak aksine bir uyarı yoksa otoklavda ve 121oC’de yapılır ve ısıl işlem uygulama süresi çoğunlukla 15 dakika olarak verilir. Sterilizasyonun amacı dehidre besi yeri, besi yeri katkıları, cam malzeme, tartım ekipmanı, su ve pamuk/vidalı kapak vb.’den gelebilecek tüm mikroorganizmaları öldürmektir.

15

Böylece besi yerinde gelişen mikroorganizma, çalışma özelliğine göre örnekten/ana kültürden gelmiş olacaktır. Bu çerçevede besi yerinin içinde bulunabilecek tüm mikroorganizmaları öldürmek, ancak besi yerine en az zarar verecek bir ısıl işlem normunun seçilmesi gerekir ki, bu norm 121oC’de 15 dakika olarak ortaya çıkar. Otoklavda sterilizasyonun ne denli sağlandığı sterilizasyon indikatörleri ile belirli sıklıklarla kontrol edilmelidir. Hatta otoklav bantlarının her otoklavlama için kullanılması önerilir. Sterilizasyon kontrolünde en sık kullanılan indikatörler biyolojik indikatörler (spor suspansiyonları) ve çeşitli kimyasal indikatörlerdir.Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla petri kutularına dökülerek kullanılır. Agarlı besi yerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar, erlende yatık agar, Rouxe şişelerinde kullanım vs sayılabilir. Sayılan bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besi yeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. Ancak, agarlı besi yerlerinin petri kutularında sterilize edilmeleri uygulanan bir şekil değildir. Agarlı besi yerleri her zaman erlen/balon/şişelerde sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril petri kutularına aseptik koşularda dökülür. Petri kutularında agarlı besi yeri kalınlığı 5 mm kadar olmalıdır.Agarlı besi yeri kullanımında tartışmasız en doğru uygulama otoklav sonrası besi yerinin hızla 50oC’e soğutulması ve bu sıcaklıkta petri kutularına dökülmesidir. Eğer petri kutusunda "dökme yöntemi kültürel sayım" amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 45oC olmalıdır. Bu uygulamada dikkat edilmesi gereken bir diğer husus petri kutusunda bulunan mikroorganizmaları olası termal şok zararlarından korumak için petrilerin oda sıcaklığında tutulması gerekliliğidir.Kapağı açılmış besi yerleri ve/veya besi yeri bileşenleri kuru, karanlık ve serin yerde saklanmalıdır. Toz haldeki besi yeri ve/veya besi yeri bileşenleri için en büyük tehlike bunların nem almasıdır. Orijinal ambalaj kapağının açılmasından sonraki raf ömrü doğrudan saklama koşullarına bağlıdır.Aksine ve net bir uyarı yoksa besi yerlerinin oda sıcaklığında depolanması yeterlidir. Bazı besi yerleri ambalajlarında 15oC altında saklanması önerisine uyulması gerekir. Dehidre besi yerlerinin buzdolabında saklanması önerilmez. Bunun nedeni buzdolabından çıkarıldıktan sonra kutu üzerindeki kondensasyon riskidir. Besi yerleri otoklav ve/veya yıkama odası, su banyosu ve kaynar su banyosu yakını gibi nemin yüksek olduğu yerlerde ve doğrudan güneş ışını alan dolaplarda depolanmamalıdır.Besi yerinde topaklaşma ve/veya renk değişimi gibi nem aldığını gösteren bir kanıt varsa o besi yeri kesinlikle kullanılmamalıdır. Aksi halde sahte negatif sonuçlar alınır.

16

Uygulamanın adı Mikrobiyolojik analizlere hazırlık ve Ekim Yöntemleri

Yapılacağı hafta VI. hafta Uygulamanın temel hedefi Yapılacak olan mikrobiyolojik çalışmalarda

gerekli olan ön çalışmaların belirlenmesiKullanılacak materyal ve malzeme adı Tüp, petri kutusu, hassas terazi, stomacher,

stomacher torbası, makas, pens, pipet, drigalski spatülü, besiyeri, etüv

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Alınan Örneklerin Mikrobiyolojik Ekime Hazırlanması Usulüne göre alınan örnekler, mikroorganizma sayısında artış ya da azalış olmayacak şekilde soğuk koşullarda en kısa zamanda laboratuara getirilmelidir. Örneklerin içine konulduğu kaplar, deney tüpleri, petri kutularının olası bir karışmayı önlemek için üzerleri silinmeyecek şekilde işaretlenmeli ve kontaminasyona yol açmayacak şekilde tutulmalıdır. Bu nedenle:- Ambalajlı ürünlerin ambalajlarının dış kısımları açıldıkları yerde % 70'lik etil alkol ile temizlenmeli, mümkünse flambe edilmelidir.- Ambalajı açmak için kullanılan bütün aletler (makas, pens, konserve açacağı vb.) steril olmalıdır.

Örneklerinin Homojenizasyonu ve Seyreltimi (Dilüsyonu)Mikrobiyolojik kontrol için alınan numuneler ya pamuk ile ya da örnekten doğrudan alınmaktadır. Pamukla alınan örnekler (Pamuk Sürtme Yöntemi, Trigger Yöntemi), laboratuarlarda içinde 10 ml fizyolojik tuzlu su veya ringer çözeltisi bulunan tüplere konulur. Bu tüplerde, pamuk içerdiği bakterileri çözeltiye bırakır. Bakterilerin tam olarak çözeltiye geçmesini sağlamak için, suda eriyen pamuklar kullanılır. Bundan sonra, ekimi yapılmış petri kutuları etüvlere konarak gerekli sürenin sonuna kadar bekletilip değerlendirilirler. Alınan örnekler bir pamukla olmayıp, doğrudan örneğin kendisi ise (et ve et ürünlerinde olduğu gibi), o zaman örnekten 10 gr alınarak içinde 90 ml steril fizyolojik tuzlu su bulunan diğer bir kaba konur. Sıvının homojen bir durum alması sağlandıktan sonra, sulandırma işlemine istenilen sayıda devam edilir ve takiben ekim yapmaya geçilir. Bunun için her karışımdan 0.1 veya 1 ml alınarak, içinde besi yerleri bulunan petri kutularına konulup plağın her tarafına yayılır. Daha sonra, bu plaklar etüvlere konularak belli sürelerde bekletilir ve değerlendirmeye tabi tutulurlar.Katı gıdalarda, mikroorganizmaların ayrılması ve sayımı için, örneklerin sıvı bir ortama alınarak homojenize edilmeleri gerekir. Dilüsyonların hazırlanması prensibi, analiz numunesindeki mikroorganizmaların mümkün olduğunca homojen dağılmasını sağlayacak şekilde ana dilüsyonun hazırlanması ve ekimi takiben petri kaplarında kolonilerin sayılabilmesidir. Bir başka deyişle birim hacimde izin verilen mikroorganizmaların sayılabilmesi için gerektiği kadar ondalık dilüsyonlar hazırlayarak mikroorganizmaların sayılarının azaltılması esasına dayanır. Genellikle mikroorganizmaların dağılımında uygun kabul edilen sayı; Kuvvetle Muhtemel Sayı

17

Tekniği’nde 3 tüp tekniği kullanıldığında en yüksek dilüsyonun 10 ml’sinde 1 mikroorganizma iken, koloni sayım tekniğinde ise 30 ile 300 koloni arasında (koliformlar için 15-150 koloni) dır. Ana dilüsyon, analiz numunesinde hacim veya kütlece alınan belli miktardaki deney numunesinin 9 katı sulandırma sıvısı ile karıştırılması, gerektiğinde karıştırıcı kullanılarak ve varsa büyük partiküllerin çökmesi beklenilerek hazırlanan karışımdır.Sulandırma tekniğinin esası, hücre sayısını bir seri sulandırma yaparak orantılı bir şekilde azaltmaktır. Bu amaçla genellikle 1/9 (10 katı ) oranında sulandırma yapılır.Örnek: Materyalin 1 ml’sinde 50.000 canlı hücre olduğu varsayılırsa, tüp içindeki 9 ml sulandırma sıvısına 1 ml aktarıldığında tüpteki toplam hacim 9+1=10 ml olur. Materyalin her ml'sinde 50.000 canlı hücre olduğuna göre tüp içinde 50.000 canlı hücre olacaktır. Diğer değişle ilk tüpteki her 1 ml içinde 5.000 adet canlı hücre olacaktır. Bu tüpten yine 9 ml sulandırma sıvısı bulunan başka bir tüpe 1 ml aktarılırsa bu tüpte de 5.000 adet/10 ml = 500 adet /ml canlı organizma bulunacaktır. Üçüncü sulandırmada ise canlı hücre sayısı 500 adet/10 ml = 50 adet/ 1 ml olacaktır. Bu şekilde birinci tüp materyale göre 10 kez; ikinci tüp ilk tüpe göre 10 kez, materyale göre 100 kez daha az sayıda canlı organizma içerecektir. Sulandırma tekniği ile canlı organizma sayısı giderek azalmaktadır. Nitekim üçüncü tüpten kültürel sayım yöntemlerinden dökme ekim için 1 ml alındığında petri kabında inkübasyon sonunda 50 koloni oluşması beklenir. Benzer şekilde 1 nolu tüpten yapılan 1 ml ekim sonunda 5.000, 2 nolu tüpten 500, 4 nolu tüpten 5 koloni oluşması beklenir. 50 koloni 3 nolu tüpün 1 ml'sindeki canlı organizma sayısını vermektedir. 3 nolu tüp materyale göre 1000 kez seyreltildiği için materyaldeki canlı hücre sayısı 50 x 1000 = 50.000 adet /ml’dir. Eğer 3 nolu tüpten 1 ml yerine petri kutusuna 0.1 ml yüzey yayma ekim yapılsa ve inkübasyon sonunda 50 koloni sayılsaydı, 50 koloni 3 nolu tüpün 0.1 ml'sindeki organizma sayısını verecekti. Dolayısıyla materyalde 50 x 10 x 1000 = 500.000 adet/ml canlı hücre var denecekti. Sonuç: 500.000 = 5.0x10 5

adet/ml olarak verilir (sayım sonucunun standart verilmesi A.b x 10c şeklinde olur).

Seyreltme SıvılarıÖzel durumlar hariç seyreltme işlemlerinde steril peptonlu fizyolojik tuzlu su kullanılır. Sulandırma sıvılarının pH'ları sterilizasyondan sonra, sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanılarak ayarlanır. Sulandırma sıvısı, ana dilüsyon için uygun hacimdeki balon veya erlenlere ve ondalık dilüsyonlar için uygun hacimdeki deney tüplerine dağıtılır. Deney tüplerinde miktar sterilizasyondan sonra 9 ml veya 9 ml'nin katları hacminde (veya istenilen diğer miktarlarda) ve erlenler içerisinde ise 90 ml veya katları miktarında olmalıdır. Tüp ve erlenlerin ağızları kapak veya pamuk ile kapatılarak, 121°C’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Sulandırma sıvısı hemen kullanılmayacak ise 0°C ila +5°C sıcaklıkta, 1 aydan fazla olmamak şartıyla muhafaza edilebilir.

18

Seyreltilmiş tüplerden yapılan ekim sonuçlarına göre materyaldeki canlı hücre sayısı şu formülle hesaplanır:

Sayı / ml-g = (Koloni sayısı x seyreltme oranı) / Sulandırma sıvısından petriye aktarılan hacim (ml)

Seyreltme sıvılarından peptonlu fizyolojik su (% 0.1’lik peptonlu su + % 0.85’lik NaCl) ‘dan başka tamponlanmış peptonlu su, Ringer çözeltisi ve çok mecbur kalındığında fizyolojik tuzlu su da kullanılmaktadır. Adı geçen bütün bu seyreltme sıvılarının hepsi, canlı hücreler için izotoniktir. Yani mikroorganizmalar, bu sıvıların içinde canlılıklarını devam ettirirler, ekim sonuçlarında da bizleri yanlış bir sonuca götürmezler. Seyreltme sıvısı olarak distile su kullanıldığında, canlı hücreler için izotonik olmaması nedeniyle, hücreler bu ortamda canlılıklarını devam ettiremezler. Sonuçta o numunede var olan gerçek mikroorganizma sayısı elde edilemez.

Birinci aşamada sarf edilecek olan sulandırma sıvısı miktarı, alınacak olan numune miktarının her zaman 9 katıdır. Alınacak olan numune miktarı ise, aranacak olan mikroorganizma türüne bağlı olarak değişmektedir. Bu miktar, genellikle en az 10 g olmakla birlikte, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salomonella spp, Aeromonas hydrophila aranması durumunda bu miktar en az 25 g olmalıdır.

Yüzey Ekim YöntemiYüzey ekim yöntemi kendi arasında 3 gruba ayrılır.1.Yayma Plak YöntemiBu yöntem daha önce petrilere dökülerek katılaşması sağlanmış besi yerlerinin yüzeyine gıda örneğinden hazırlanan seyreltimlerden konularak özel bir cam çubuk (drigalski spatülü) ile yayılması ve uygun koşullarda inkübasyonu sonucu oluşan kolonilerin sayılması esasına dayanır. Ekim için hazırlanan seyreltim tüplerinden 0,1’er ml alınıp besi yerine aktarılır. Steril drigalski spatülleri ile besi ortamının yüzeyine homojen olarak dağılımları sağlanır. İnkübasyon ve sayım, dökme plak tekniğinde belirtildiği gibi yapılır. Sonuçların değerlendirilmesinde ise 0.1 ml ekim yapıldığı göz önünde bulundurularak sayılan ortalama koloni değerleri seyreltim faktörü ve 10 ile çarpılarak örneğin gramındaki veya mililitresindeki mikroorganizma sayısı ifade edilir. Yüzey ekim yönteminin dökme ekim yöntemine göre bazı üstünlükleri vardır. Bunlar:

-Dökme ekim yönteminde sıcağa duyarlı organizmalar döküm sıcaklığı yüksek olursa zarar görebilir. Tersine döküm sıcaklığı düşük olursa, besi yeri ile örneğin iyi karışması sağlanamaz.

-Yüzey ekim yönteminde koloniler daha doğru şekilde sayılabilir.-Aerob mikroorganizmalar dökme ekim yönteminde yüzeyin altında kalabilir ve

inkübasyonda iyi gelişme gösteremez iken yüzeyde gelişebilenler daha çabuk ve büyük koloni oluşturarak sayımda yanılgılara neden olabilir.

19

2.Damla Plak YöntemiYöntemin esası, yayma plak yönteminin aynısıdır. Aradaki fark, damla yöntemiyle bir plağa 6 ayrı örnek ekilebilmesinden ileri gelmektedir. Böylece besi yeri kullanımı tam plak ekme yöntemine göre 1/6 oranında azaltılmış olmaktadır. Damla yöntemi ile yapılan uygulamalarda başarıya ulaşmak için kullanılan plaklarda tam bir kuruma olmalı ve ekimde kapillar pipet kullanılmalıdır. Pratikte, genellikle pastör pipetleri kullanılmaktadır. Bu pipetler çok ince uçlu, derecesiz ve iç kısımlarındaki boşluk her tarafta aynı orandadır. Kapillar özellik nedeni ile aynı ölçüde küçük damlalar elde etmek olasıdır. Her şeye rağmen, pipetlerin her sterilizasyondan sonra optik gözle kontrolü gerekir. Bu pipet kullanılacağında önce damla hacmi ölçülmelidir. Bu amaçla genellikle 20 damlanın ağırlığı hassas terazide tartılır ve 1 damlanın ağırlığı hesaplanır. Piyasada bulunan 1 ml’lik pastör pipetlerinin 1 damlasının normal olarak 0,032 ml olduğuna göz önüne alırsak, her örnekten 3 damla alınması ile iş kolaylaştırılmış olur. Ekim işlemi, cam kalemi ile eşit şekilde 6'ya bölünmüş ve numaralanmış petri kutularındaki bölmeler üzerine pastör pipeti yardımıyla örnekten damlatmakla olmaktadır. Sonra damla, çizgi sınırını aşmayacak şekilde sallanarak bölme içine yayılır. Diğer bölmelere de aynı şekilde ekim yapıldıktan sonra plak etüve konup ön görülen süre zarfında bekletilir ve yüzeyde üreyen koloniler sayılır. Koloni sayımında 20 den az ve 100 den fazla olanlar sayılmaz. Plakların etüvde bekleme süresi genel olarak 18-24 saattir. Bu yöntemle yapılan uygulamalarda, aynı örnekten paralel 3-4 ekim yapılması araştırıcılar tarafından önerilmektedir. Aynı hacimde damlalar elde etmek amacı ile pipetler dik tutulmalı, besi yeri yüzeyine çarpan damlaların etrafa sıçramaması için, pipet ucu ile besi yeri yüzeyi arasındaki mesafenin 1-2 cm arasında olmasına dikkat edilmelidir. Her pastör pipetinden elde edilecek damlanın hacmi farklı olacağından, petri kutusuna pipet numarası da yazılmalıdır.Örnek: 10-2 sulandırmadan yapılan ekimlerde 2 sayım alanında sırasıyla 13,15 koloni sayılmıştır. Pipette 1 damlanın ağırlığı 0,0043 g'dır. Orijinal materyaldeki canlı organizma sayısı nedir?(13+15) x 102 / 2x 0.0043 = 3.3x105 adet/ml 3.Membran Filtre Kullanılarak Çabuk Koloni Sayım YöntemiDaha çok işletmelerde üretim kontrolü için kullanılır. Pamuk sürtme yöntemi de uygulanabilir. Membran filtre yöntemi ile 2-4 saatte netice alınabilmektedir. Özellikle, taze veya donmuş sebzelerin kontrolünde başarı ile kullanıldığı bildirilmektedir. Bu yöntemin uygulanması için 50 g örnekten alınır, içerisinde 450 ml steril peptonlu fizyolojik su bulunan kaba konarak 1 dakika süreyle iyice karıştırılır. Sonra karışımdan 10 ml alınarak 8 mm kalınlığındaki filtreden geçirilir ve steril su ile iyice yıkanır. Böylece karışımda bulunan kaba partiküller ayrılmış olur. Süzülen filtrat 0.45 mm kalınlığındaki filtreden tekrar geçirildikten sonra filtre 3 kısma ayrılır. Ayrılan membran filtreler, 2 ml Plate Count Agar emdirilmiş özel kartonların üzerine konur. 4,5-6 saat sonra sırayla membran filtreler alınarak 5 dakika 105°C lik etüvde sıcak hava cereyanına bırakılır. Kuruyan bu kısımların üzerine boya maddeleri dökülerek boyanır. Tekrar 10 dakika 105°C de kurumaya tabi tutulan filtre, bir lamel üzerine konulup sedir yağı damlatılarak mikroskobun 40-100 defa büyüyen objektif altında incelenir ve mavi renkte boyanan mikroorganizmalar sayılır.

20

Dökme Plak YöntemiBu yöntem, bir önceki bölümde açıklandığı şekilde hazırlanan gıda örneği seyreltimlerinden 1’er ml petrilere aktırılarak üzerine 15-20 ml kadar yaklaşık 45°C’ye soğutulmuş agarlı besi ortamından dökülmesi ve uygun koşullarda inkübasyonu takiben oluşan kolonilerin sayılmasından ibarettir. Bu yöntem kendi arasında 4 kısma ayrılmaktadır.

1.Tek Kat Dökme YöntemiGıda maddesi homojenize edilir ve uygun seyreltimler yapılır. Eğer ekimi yapılan gıda maddesinin içerdiği yaklaşık mikroorganizma yükü tahmin edilebiliyorsa seyreltim oranı ona göre ayarlanır. Ancak en az üç seyreltim yapılması gerekir. Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış paralelli steril petri kutularına 1/10, 1/100 ve 1/1000...’lık seyreltim tüplerinden 1’er ml alınarak aktarılır. Agarlı besi yeri kaynar su banyosunda veya mikrodalga fırında eritilir, 44-46°C’ye soğutulur. Her petriye 15-20 ml besi yeri dökülür. İşlem 10 dakika içerisinde tamamlanmalıdır. Petrilere hafif salınım ve çevirme hareketleri verilerek örnek sıvısı ile besi ortamının homojen karışımı sağlanmış olur. Sterilitenin kontrolü için ekilmemiş besi ve seyreltim sıvısı da petriye dökülür ve inkübe edilir. Besi yerleri katılaştıktan sonra petri kutuları ters çevrilir ve mezofil bakteri sayımı isteniyorsa 30±1°C’de 48-72 saat inkübe edilir. 2.Çift Katlı Dökme YöntemiBu yöntem ile uygulamada, gerekli seyreltimlerin hazırlanmasını takiben, 1 ml örnek boş steril petri plaklarına bir pipet yardımıyla aktarılır. 44-46°C’ye soğutulan besi yerinden 15-20 ml ilave edildikten sonra petrilere hafif salınım ve çevirme hareketleri verilerek örnek sıvısı ile besi yerinin homojen karışımı sağlanır. Karışım katılaştıktan sonra aynı petri plaklarına 15-20 ml daha besi yeri dökülerek bir süre daha bekletilir. Koliform bakteri sayımı için plaklar ters çevrilerek etüvde 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılır. Dökme sırasında besi yerinin 45°C'nin altında donacağı unutulmamalıdır. Bu uygulama sisteminde, koloniler 2-3 mm kalınlığındaki besi yerinde üredikleri için koloni sayımı diğerlerine nazaran daha kolay olmaktadır. Bundan başka olası biyokimyasal reaksiyonların da görülebilmesi için 2 tabaka halinde olan besi yerleri ayrı olarak seçilebilir. Bu yöntemin kullanılması basit olmasına rağmen pratikte çok az kullanılmaktadır.

3.Yuvarlak Tüp Damla YöntemiDaha çok İngiltere'de kullanılmaktadır. Bu yöntemde özel tüpler kullanılır. Tüplerin bir ucunda ısıya dayanıklı lastik tıpa vardır. Kullanılması aynen yukarıda anlatılan yöntemde olduğu gibidir. Yöntemin daha çok kullanılan diğer bir şeklinde ise normal tüpler kullanılır. Sterilizasyondan sonra 45°C’de besi yeri sıvı hale getirilir ve üzerine örnekten 1 ml dökülür. Tüp iyice karıştırıldıktan sonra yatık olarak dondurulup etüve konur ve sonra da değerlendirmeye tabi tutulur.

4.Küçük Plak Dökme YöntemiÇok az materyalin kullanıldığı bu yöntem, özellikle mikroorganizmaların devamlı kontrolü gerektiği şeker endüstrisinde kullanılmaktadır.

21

Uygulamanın adı Gıdalardan Clostrudium ve Vibrio cinsi

22

bakterilerin aranması Yapılacağı hafta VII. hafta Uygulamanın temel hedefi Gıdalarda Clostrudium ve Vibrio varlığını

belirlemekKullanılacak materyal ve malzeme adı Otoklav, etüv, bek, su banyosu, erlenmayer

(100 ml, 250 ml, 500 ml), pipet (1 ml, 10 ml), deney tüpü, petri kutusu, drigalski spatülü, stomacher, stomacher torbası

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Clostridium perfringens aranmasıSülfit indirgeyen anaerobların sayımı EMS yöntemi ile yapılır. Bu amaçla en yaygın olarak Differantial Reinforced Clostridial Broth besiyeri kullanılır. Standart yöntemle tüplere ekimden sonra tüplerin üstü anaerob ortam sağlamak üzere yaklaşık 2 cm (4 ml) sıvı parafin ilave edilip vejetatif hücrelerin öldürülmesi ve sporların germinasyonunu sağlamak için su banyosunda 75°C' de 30 dakika bekletilir. İnkübasyon 30°C' de 7 güne kadar devam eder. Pozitif reaksiyon genellikle 3–4 gün içinde alınır. Siyah renk oluşumu sülfit indirgeyen Clostridium’ ların varlığını gösterir. Sülfit indirgeyen Clostridium 'ların sayılması katı besiyerinde de yapılabilir. Bu amaçla yumurta sarısı ilave edilmiş Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) Agar besiyeri kullanılabilir. Ekimi yapılan petri kutularının üzerine besiyeri katılaştıktan sonra standart (yumurta sarısı emülsiyonu içermeyen) TSC Agar besiyerinden ikinci katman olarak yaklaşık 10 ml dökülür. 37°C' de 24 saat anaerobik inkübasyon sonunda siyah renkli koloniler sülfit indirgeyen Clostridium 'lar olarak sayılırken Cl. perfringens lesitinaz aktivitesine bağlı olarak etrafında opak bir zon olan 2–4 mm çaplı siyah koloniler oluşturur.Şüpheli bir gıdada Cl. perfringens aranmasında dikkat edilecek en önemli hususlardan birisi Cl. perfringens 'in dondurma ya da uzun süreli soğukta depolama işlemlerinde canlılığını yitireceğidir. Dolayısıyla Cl. perfringens aranacak gıda analizden önce donduruldu veya uzun süreli soğukta bekletildi ise önceden zehirlenmeye neden olan bu gıdada Cl. perfringens saptanamayabilir.Cl. perfringens aranacak gıdalarda şüpheli örnekten tam bir porsiyon alınması, bu mümkün değilse gıdanın farklı yerlerinden toplam 25 g örnek alınması gerekir. Cl. perfringens 1 porsiyon gıdanın sadece küçük bir bölgesinde lokalize olabilir. Bu nedenle alınacak örneğin tüm porsiyonu temsil etmesi önemlidir.Gıda örneği en geç 8 saat içinde analize alınmalı ve bu süre içinde 10°C' de tutulmalıdır. Zorunlu nedenlerle bu süre geçilecek ise analiz örneği tamponlanmış steril gliserin-tuz çözeltisi içinde -60°C' de dondurulmalıdır. Bu amaçla 25 g gıda için 25 ml çözelti yeterlidir. Gıda ile tamponlanmış steril gliserin tuz çözeltisi iyice karıştırıldıktan sonra kuru buz içinde hızla dondurulur. Dondurulmuş bu örnek laboratuvara taşıma, bekletme gibi aşamalarda aynı sıcaklıkta korunmalıdır.Cl. perfringens aranmasında dikkat edilecek ikinci önemli husus homojenizasyondur. Bu işlemde blender kullanılacak ise düşük devir ve kısa süre kullanılmalıdır. Her ne kadar Cl. perfringens aerotolerant bir anaerob bakteri ise de blenderdeki homojenizasyon sırasında oluşacak anafora bağlı olarak hücreler aşırı miktarda

23

oksijen ile temas eder ve oksijen Cl. perfringens 'e zarar verir.

Vibrio parahaemolyticus aranmasıGıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara gönderilir. 25 g katı gıda 225 ml Alkali Pepton besiyeri içinde homojenize edilir. Sıvı gıda doğrudan bu besiyerlerine eklenir. İnkübasyon, 35–37ºC’de 8 saat süre ile yapılır. Dondurulmuş ürünlerde inkübasyon süresinin 18–24 saat olması önerilmektedir. Bu sürenin sonunda TCSB Agar besiyerine öze ile sürme yapılır, 35–37ºC’de 18–24 saat inkübasyona bırakılır. Tipik V. parahaemolyticus kolonilerine rastlanması halinde temel biyokimyasal testlerle tanımlama yapılır. V. parahaemolyticus TCSB Agar besiyerinde yeşil, dairesel ve yaklaşık 2 mm çaplı koloni oluşturur. Tanımlanması için bir seri biyokimyasal test uygulanmalıdır. NaCl (30,0 g/L) ilave edilmiş Triple Sugar Iron Agar (yatık) besiyerine standart şekilde daldırma ve yüzeye sürme şeklinde ekim yapılır. 35–37°C 24 saat inkübasyondan sonra V. parahaemolyticus reaksiyonu yüzey kırmızı (laktoz ve sakkaroz negatif), dip sarı (glikoz pozitif, H2S negatif), gaz yarıkları yok (glikozdan gaz oluşturma negatif) şeklindedir. NaCl (25,0 g/L) ilave edilmiş Tryptone Water besiyerine inokulasyon ve 35–37°C’de 24 saat inkubasyon yapılır. V. parahaemolyticus indol pozitif bir bakteridir.

Test - Sonuç Oksidaz +Hareketlilik +Glikozdan gaz oluşumu −Lisin dekarboksilaz + H2S −%8 NaCl + Voges-Proskauer −β Galaktozidaz − Katalaz +Glikoz +Sakaroz −Laktoz −İndol oluşumu +

TSC Agarda Cl. perfringensUygulamanın adı Yumurtada Tazelik-Bayatlık Muayenesi

24

Yapılacağı hafta VIII. haftaUygulamanın temel hedefi Taze yumurta ile bayat yumurtanın ayırt

edilebilmesiKullanılacak materyal ve malzeme adı Beher, NaCl, yumurta, petri kutusuGerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Dış bakı: Dıştan yapılan incelemede yumurtanın ağırlığı, şekli, kabuk rengi ve temizliği, çatlak bulunup bulunmadığı, yüzeyin mat veya parlak oluşu belirlenir. Bir mercek yardımı ile kabuk üzerindeki porların açık olup olmadığı araştırılır.

Çalkalama testi: Pratikte yumurtalar kulak hizasında, elle hafifçe çalkalanmak suretiyle muayene edilir. Şiddetli çalkantı sesinin duyulması, yumurtanın bayat ve bozuk olduğunun göstergesidir.

Işık muayenesi: Bu muayenede kapalı bir kutu içine yerleştirilen ışık kaynağından yararlanılır. Yumurtanın geniş tarafı lambaya tutulmak suretiyle kabuk yapısı, hava boşluğu, yumurta akı ve sarısının şekli ve pozisyonu ile yumurta içerisindeki kan vb. bozukluklar incelenir. Taze yumurtada ak kısmı berrak, sarı kısmı da yuvarlak şekilde yumurtanın ortasında görülür. Hava kesesi en fazla 5 mm yüksekliğindedir. Yumurta bayatladıkça kese genişler, yumurta sarısı kabuğun bir tarafına daha yakın olur ve yumurta akı da bulanıklaşır.

Tuzlu su muayenesi: Yumurtaların tazelik ve bayatlık muayenesinde en çok uygulanan yöntemlerden birisi de, yumurtanın özgül ağırlığının karşılaştırılması prensibine dayanır. Bu amaçla %8 (A) ve %11’lik (B) tuz solüsyonlarından yararlanılır. Çok taze yumurtalar A ve B solüsyonlarında dibe çöker; taze yumurtalar A solüsyonunda çöker, B solüsyonunda yüzer; bayat yumurtalar ise her ikisinde de yüzer.

Kırarak muayene: Yumurtanın tazeliği en iyi kırıldığında anlaşılır. Yumurta, temiz düz bir kap içine parçalanmadan kırılır. Bu şekilde yumurta içeriğinin dağılımı, sarısının rengi, kokusu, şekli, yüksekliği, direnci ve içerisinde kan lekeleri ile embriyo içerip içermediği; yumurta akının rengi, yoğunluğu ve bulanıklık olup olmadığı kontrol edilir. Taze yumurta kırıldığında, yumurta akı ve sarısı tamamıyla yayılmaz ve birbirine karışmaz. Yumurta sarısı yüksek görünümdedir. Bayat yumurtada, ak kısmı gevşek ve tabakalar belirsizdir. Sarı kısım ise, basık ve daha geniş bir alana yayılmış durumdadır.

25

Sonuç ve Karar:

Uygulamanın adı Gıdalarda Koliform bakteri ve E. coli

26

aranmasıYapılacağı hafta IXUygulamanın temel hedefi Gıdaların Koliform bakteriler ile E. coli

sayıları bakımından Gıda Kodeksine uygun olup olmadığını belirlemek.

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Otoklav, etüv, bek, su banyosu, erlenmayer (100 ml, 250 ml, 500 ml), pipet (1 ml, 10 ml), deney tüpü, petri kutusu, Violet Red Bile Agar, sivri uçlu öze, Durham tüpü, Laktoz Broth, SIM medium, MR-VP Medium, Simmons Citrate Agar, Kovacs Çözeltisi, Metil-Red Ayıracı, % 40 KOH, a-naftol Çözeltisi

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Bunun için öncelikle Violet Red Bile Agar’a (VRB) çift katlı dökme plak tekniği ile ekim işlemi gerçekleştirilir ve plaklar 37ºC’de 24-48 saat süreyle inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda kırmızı renkli koloniler koliform bakterileri olarak değerlendirilir. İnkübasyon sonunda koliform bakterilerin oluşturduğu kırmızı renkli koloniler içerisinde E.coli için tipik (kırmızı renkli olup etrafında pembe zon bulunan) olan koloniler seçilerek 44ºC’de 24 saat içerisinde asit (laktik asit) ve gaz (CO2) oluşturma testi ve IMVIC testleri uygulanır.Bu amaçla oluşan tipik koloniler steril sivri uçlu bir özeyle alınarak, içerisinde ters çevrilmiş Durham tüpü ve 9 ml Laktoz Broth bulunan tüplere inokule edilir. Bu tüpler 44ºC’de 24 saat inkübe edilerek asit ve gaz oluşumu kontrol edilir. Oluşan gaz Durham tüplerinde görünürken, besi ortamının bulanıklığı asit oluşumunu gösterir. Ayrıca gaz oluşan bu tüplerden yararlanılarak IMVIC testleri uygulanır.

IMViC Testleri 1- İndol deneyi: Bazı enterik bakteriler triptofanaz enzimiyle triptofanın yan zincirini kopararak piruvat, NH4 ve indol oluştururlar. Bu amaçla gaz oluşan tüplerden öze yardımıyla alınarak, Semisolid Indol Motility (SIM Medium) besi ortamını içeren tüplere aşılanan bakteriler 37°C'de 24 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda tüplere 0.2-0.3 ml Kovacs çözeltisi eklenip, 10 dakika beklenir. Bu süre sonunda koyu kırmızı vişne rengi oluşumu pozitif olarak, portakal rengi (+/-), sarı renk ise negatif olarak değerlendirilir.

2-Metil-Red deneyi: Bazı koliform mikroorganizmalar ve E.coli, glikoz içeren besi ortamlarının pH'sını 4.5 ve daha düşük asit değerlere düşürür. Bu amaçla gaz oluşan tüplerden alınan bir öze dolusu kültür, içerisinde 10 ml Glikoz Fosfat besi ortamı bulunan tüplere inokule edilir ve 37°C’de 1-5 günlük inkubasyona bırakılır. İnkübasyonu takiben besi ortamı 5'er ml olmak üzere ikiye bölünür. Ayrılan ilk 5 ml'lik besi ortamına birkaç damla metil kırmızısı ilave edilir ve belirgin kırmızı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilir.

27

3-Voges-Proskauer deneyi: Bazı koliform bakteriler glikozdan asetil-metil-karbinol meydana getirir. Bu madde de kuvvetli alkali ortamda diasetile dönüşür. Diasetil de peptonla reaksiyona girerek kırmızı rengin meydana gelmesini sağlar. Bu amaçla Glukaoz Fosfat besi ortamının diğer 5 ml'lik kısmı üzerine, 5 ml % 40'lık NaOH veya KOH çözeltisi ilave edilip çalkalanır ve takiben 0.6 ml miktarında alfa naftol katılarak renk değişimi gözlenir. Kırmızı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilir. 4-Sitrat kullanım testi: Bağırsak bakterileri; karbon kaynağı olarak sodyum sitrat bulunan sıvı yada katı besi yerlerinde, sitrattan yararlanarak üreme özelliğine sahiptir. Bu amaçla gaz oluşan tüplerden öze ile kültür alınarak, Simon’s Citrate Agar bulunan yatık agar tüplerine aşılanır. 37°C'de 24 saatlik inkübasyon sonunda; besi yerinin normal rengi olan yeşil renk gözlemlenirse sonuç negatif, renk maviye dönüşmüş ise pozitif olarak değerlendirilir.44ºC’de 24 saat içerisinde asit ve gaz oluşturma yanında; İndol (+), Metil-Red (+), Voges-proskauer (-) ve Sitrat (-) sonuçları, kıymada E.coli tip I’in varlığını gösterir.E.coli sayısının belirlenmesi: VRB agar’da oluşan E.coli şüpheli tipik kolonilere yukarıda belirtilen testler uygulanır ve elde edilen sonuçlar şu formülde yerine konularak E.coli sayısı hesaplanır.

Tipik koloni sayısı x pozitif sonuç alınan koloni sayısı E.coli sayısı = x dilüsyon oranı

IMVIC testi uygulanan koloni sayısı

Örneğin;Tipik koloni sayısı: 10IMVIC testleri uygulanan koloni sayısı: 5IMVIC testleri sonucu pozitif sonuç alınan koloni sayısı: 3Dilüsyon oranı: 10-2

E.coli sayısı: 10 x 3 x 102 / 5 = 6x102 kob / g

En Muhtemel Sayı Yöntemi1)Tahmin DeneyiHer bir seyreltimden içinde LST broth ortamı veya LB bulunan üçer tüpe 1’er ml inoküle edilir. Ekimi yapılan tüpler 35-37°C’de 24-48 saat inkübe edilir. 24 saat sonunda gaz oluşan tüpler kaydedilir, negatif olanlar ise 24 saat daha inkube edilir. Pozitif reaksiyon gösteren tüplerin sayısına göre Çizelge 1’de belirtilen gıdadaki (g veya ml) tahmini koliform bakteri miktarı belirlenir. Örnek: Son üç tüpte pozitif sonuç veren dilüsyonlar 1/100, 1/1000, 1/10000 ve bu dilüsyonlardaki pozitif tüp sayısı sırası ile 3, 1 ve 0 olduğunda; 1 g ve 1 ml örnekteki EMS = (Çizeldeki MPN / 100) x orta basamaktaki tüplerin dilüsyon faktörüMPN/g = (40 / 100) x 1000 = 400 olur.

28

Çizelge: Kuvvetle Muhtemel Bakteri Sayısı (MPN)Her Dilüsyonda (+) Tüp Sayısı Güven Sınırları10 -1 10 -2 10 -3 MPN % 99 %95 0 1 0 3 1 23 1 171 0 0 4 1 28 1 211 0 1 7 1 35 2 271 1 0 7 1 36 2 281 2 0 11 2 44 4 352 0 0 9 1 50 2 382 0 1 14 3 62 5 432 1 0 15 3 65 5 502 1 1 20 5 77 8 612 2 0 21 5 80 8 633 0 0 23 4 177 7 1293 0 1 40 10 230 10 1803 1 0 40 10 290 20 2103 1 1 70 20 370 20 2803 2 0 90 20 520 30 3903 2 1 150 30 660 50 5103 2 2 210 50 820 80 6403 3 0 200 100 1900 100 14003 3 1 500 100 3200 200 24003 3 2 1100 200 6400 300 4800

2) Doğrulama DeneyiGaz oluşumu gözlenen LST broth tüplerinden BGLB broth’a ve L-EMB agara öze ile ekim yapılır. Tüpler ve petri plakları 35-37°C’de 24-48 saat süre ile inkübasyonu takiben tüplerdeki gaz oluşumu ve katı besi yerindeki tipik kolonlerin (2-3 mm çapında, koyu mor merkezli, metalik parlaklık gösteren) oluşumu incelenir.

3) Tamamlama DeneyiBGLB broth’da gaz oluşumu gözlenen tüplerden, EC broth ortamına öze ile ekim yapılır ve tüpler 44.5°C’de 24 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonucu, gaz oluşumu gösteren tüpler “fekal koliformlar” açısından pozitif olarak değerlendirilir. Ayrıca koliform bakterileri tür düzeyinde belirlemek amacıyla, L-EMB agarda üreyen tipik kolonilere IMVIC testleri (İndol. Metil-Red, Voges-Proskauer ve Sitrat) uygulanır.

Koliform Bakterilerin Tiplerinin AyırımıReaksiyonlarKoliform Bakteriler İndol MR VP Citrate 44°C E. coli tip I + + - - +E. coli tip II - + - - -Enterobacter cloaceae - - + + -Enterobacter aerogenes - - + + -Citrobacter freundii - + - + -

29

İndol testi Metil red testi

Voges-praskouer testi Sitrat testi

30

Soru : Aşağıda laboratuvarımıza gelen bir peynir örneğinin EMS yöntemine göre koliform bakteri yönünden aranmasını görmektesiniz. Boşlukları doldurduktan sonra aşağıdaki soruyu yanıtlayınız.

İnkübasyon sonucunda 1, 3, 5, 7 no’lu tüpler pozitif sonuç göstermiştir. Bu tüplere yapılan doğrulama ve tamamlama deneylerinde sadece 1 no’lu tüp E. coli açısından pozitif olarak bulunmuştur. Bu bilgiler ışığında örnekteki koliform bakteri ve E. coli sayısını birimiyle beraber belirtiniz.

Koliform bakteri :…………………………

E. coli :…………………………

Soru : Salam numunesinden Violet Red Bile Agar (VRB)’a 10 -2 lik dilüsyondan dökme plak ekim yöntemine göre yapılan ekimde inkübasyon sonucu 25 koloni üremiştir. Bunların 15’i şüpheli görüldükten sonra 5 koloniye IMViC testi uygulanmış ve 3 koloni

31

1 ml 1 ml

Lactose broth

1ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10-1 10-3

Peynir

10-2

pozitif yanıt vermiştir. Buna göre numunemizdeki koliform bakteri ve E.coli sayısını birimiyle beraber belirtiniz.

Koliform bakteri :…………………………

E. coli :…………………………

Uygulamanın adı Kanatlı ve Balık Etlerinin MuayenesiYapılacağı hafta XUygulamanın temel hedefi Kanatlı ve balık etlerinin insan tüketimine

uygun olup olmadığını belirlemekKullanılacak materyal ve malzeme adıGerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİKanatlı Muayenesi

Kanatlı kesimi için gerekli belgeler• Veteriner sağlık raporu • Menşe şahadetnamesi

Karkas ve sakatatın tüketilmesine izin verilmeyecek hastalık ve durumlar• İnsanlara geçebilecek patojenik etkenler veya bunların toxinlerinin yol

açmasından kuşku duyulan lokal yaralar ve mantar enfeksiyonları• Zehirlenme• Kaşeksi• Anormal renk, koku• Çok sayıda tümör, apse ve vücutta su toplanması• Genel kirlenme veya bulaşma• Büyük yaralar, zedelenmeler• Karında su toplanması• Deri altında ve ette yaygın parazit invazyonları • Kas içinde sulu kanlı ödemler• Kaslarda bozulma

Kısmi imhalar• Lokal parazit invazyonu • Lokal ur, apse ve yaralar• Kısmi kas veya organların atrofisi • Belirli bölgelerde kireçlenme veya renk değişikliği• Lokalize yaralar

Kesimi yasak hastalıklar• Kolera, veba• Tifo, paratifo

32

• Ornitoz, kuduz• Newcastle, çiçek

İhbarı zorunlu hastalıklar• Tifo, veba• Newcastle, pullorum

Zoonoz hastalıklar• Salmonelloz, ornitoz • Tuberküloz, listerioz • Erisipelas, newcastle • Kuduz, çiçek• Veba, kolera

Antemortem muayene• Hastalık ve besi durumları saptanır• Kümeslerde yapılır• Şüpheli hayvanlar kesilmez, tedaviye alınır

Postmortem muayene• Kesimden önce 1-4 saat yem ve su verilmez• Kesin tanı konulamazsa bakteriyolojik, hayvan deneyleri veya serolojik muayeneler

yapılır

Balık MuayenesiBalık etinin daha erken bozulmasının nedenleri

Kasaplık hayvan Balık

Etkenler Mezofil (30-37oC) Psikrofil (12-15oC)

Etin yapısı Fascia ve tendo zengin,Yağlar doymuş yağ asitlerinden zengin

Kaslar yumuşak, su oranı yüksek,Yağlar doymamış yağ asitlerinden zengin

Etin hazırlanması İç organlar hemen çıkar, karkas yüzeyi hemen kurur

Deri ıslak, iç organlar çıkmaz

Enzimatik aktivite Normal düzeyde aktif ve istenilendir

Çok daha aktif ve istenilmez

pH pH düşer morg.ın çoğalmaları pH nötre yakın, enzimatik ve

33

engellenir mikrobial aktivite

Taze-bayat balık ayırımı

Özellik Taze balık Bayat balık

Görünüş Parlak ve canlı Donuk ve mat

Koku Deniz ve yosun Tiksindirici

Deri Parlak, berrak Soluk

Gözler Parlak, kabarık Donuk ve çökmüş

Ağız Kapalı Açık

Solungaçlar Parlak, kırmızı Solgun, kurşuni

Pullar Parlak, sıkı Solgun, gevşek

Yüzeydeki mukoz sıvı

Doğal, ince kıvamda Koyu kıvamda, fena kokulu

Et Parlak, sert, kılçıktan zor ayrılır

Pürüzlü, yumuşak, kılçıktan kolay ayrılır

Palpasyon Parmak izi kalmaz Parmak izi kalır

Karın Normal dolgun Şişkin

Anüs Normal Şişkin

Kan Parlak, kırmızı Koyu, siyah

Suya atılınca Batar Yüzer

Periton Sıkıca tutunmuş Kolay ayrılır

34

Kuyruk veya boyundan elle tutulunca

Düz kalır Bükülür, eğilir

Organ ve aortta kan rengi

Parlak kırmızı renk Kahverengimsi renkte

Balık eti rengi Renk değişikliği yok Pembe veya kırmızı

Uygulamanın adı Gıdalardan Salmonella spp, Listeria monocytogenes ve E. coli O157:H7 aranması

Yapılacağı hafta XIUygulamanın temel hedefi Gıdaların Salmonella spp, Listeria

monocytogenes ve E. coli O157:H7 durumu bakımından Gıda Kodeksine uygun olup olmadığını belirlemek.

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Otoklav, etüv, bek, su banyosu, erlenmayer (100 ml, 250 ml, 500 ml), pipet (1 ml, 10 ml), deney tüpü, petri kutusu, Tamponlamış peptonlu su, Rappaport vassiliadis enrichment broth, XLD Agar, üre broth, Triple sugar iron agar, Lizin iron agar; Fraser Broth, Oxford Agar, microbact12L

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİSalmonella aranması25 ml-g, örnek alınır. 225 ml tamponlanmış peptonlu su (TPS)’da homojenizasyonu yapılır ve 37ºC’de 24 saat inkübe edilir (Ön zenginleştirme). Bu süre sonunda ön zenginleştirmesi yapılmış numuneden steril bir pipet yardımı ile bek alevinin yanında 0,1 ml alınır ve Rappaport vassiliadis enrichment broth’a geçilerek 41.5 ºC’de 24 saat inkübe edilir (selektif zenginleştirme). Bu sürenin sonunda SS agara, Brillant green phenol red agara, XLD agara ya da XLT4 agara öze yardımı ile geçişler yapılır ve 37 ºC’de 24 saat inkübe edilir. Şüpheli salmonella kolonileri siyah renkte ya da merkezi siyah olan kırmızı renkte üremektedir. İleri identifikasyon amacıyla, bu şüpheli koloni öze yardımı ile üre brotha geçilir ve 37ºC’de 24 saat inkübe edilir. Salmonella üre negatiftir. Üre negatif ise Triple sugar iron agar (TSI)’a ve Lizin iron agar (LIA)’a geçişler yapılır.

Aminoasit kaynağıTSI LIAPepton, proteoz pepton, et ekstraktı, maya ekstraktı

Pepton, maya ekstraktı, lizin

İlave edilmiş amino asit yok Lizin

35

Fermente edilebilen şekerler

Laktoz (%1), sükroz (%1), glikoz (%0,1)

Glikoz (%0,1)

pH indikatörü Fenol red;Net asitlik: SarıNet alkalilik: kırmızı

Brom kresol purpleNet asitlik: SarıNet alkalilik: mor-menekşe

H2S oluşumu (siyah renk) Sodyum tiyosülfat Sodyum tiyosülfatH2S oluşumu indikatörü Ferrus sülfat Ferrik amonyum sitrat

TSI agarın içermiş olduğu şekerler fermente edildiğinde, oluşan asit üretimi fenol kırmızısı indikatörü ile saptanır. Oluşan renk değişimleri asit üretimi için sarı ve alkalinizasyon için kırmızıdır. Laktoz ve sükroz, glikozdan daha yüksek konsantrasyonlarda bulunduğundan, uçta asit oluşumu bu şekerlere bağlı iken, glikozdan asit oluşumu tüpün yatık alanında az miktarda asidin hızlı oksidasyonu ile baskılanarak yalnızca glikoz fermente olduğunda nötral veya bazik pH reaksiyonuna yol açar. Eklenen sükroz, 24-48 saatlik inkübasyon süresinde laktoza değil ancak sükroza saldırabilen belirli koliform ve Proteus organizmalarının hariç tutulmasına olanak sağlar. Nötral veya bazik pH’ta, hidrojen sülfit (sodyum tiyosülfattan üretilen) ferröz amonyum tuzu ile reaksiyona girerek, siyah demir sülfit verir.TSI’da, Salmonella yüzeyde kırmızı, dipte sarı ve siyah renk oluşturur. Bazen siyah renk sarı rengi kapatacak kadar yoğun olur. Besiyerinde gaz delikleri ve/veya gaz yarıkları Salmonella için tipiktir.

LIA agarda; Lizin dekarboksilasyonu uçta bazik (mor) bir reaksiyon ile saptanır. Lizin deaminasyonu kırmızı bir slant ile saptanır. Hidrojen sülfit üretimi siyah bir çökelti oluşması ile saptanır. Negatif bir reaksiyon (mor slant ve sarı uç) yalnızca dekstrozun fermentasyonunu gösterir.Uçta asit üretimi, oluşumunu baskılayabileceğinden bu besiyerinde lizin dekarboksilaz aktivitesi açısından negatif organizmalar tarafından hidrojen sülfit üretimi saptanmayabilir.8 Bu sebeple H2S üreten Proteus türleri bu besiyerini karartmaz.

Salmonella Aranması 2. Yöntem:25 g/ml örnek 225 ml laktoz broth ile 37ºC’de 24 saat ön zenginleştirmesi yapılır. Bu besi yerindeki ön zenginleştirmesinden sonra 10 ml selenit sistein broth ve 10 ml tetratiyonat broth içeren tüplere 1 ml aktarılır, 37ºC’de 24 saat inkübe edilir. Bu besi yerlerinin yüzeyinden öze yardımıyla Hektoen enterik agar, Bizmut sülfit agar, XLD agar gibi besi yerlerine geçişler yapılıp 37ºC’de 24 saat inkübe edilir.

Listeria monocytogenes aranması25 g örnek 225 ml half fraser brothda 30°C’de 24 saat canlandırıldıktan sonra, 10 ml fraser broth içeren tüplere 0.1 ml geçilir ve 35°C’de 48 saat ikinci zenginleştirmesi gerçekleştirilir. Daha sonra birinci zenginleştirmeden ve ikinci zenginleştirmeden oxford agara geçişler yapılıp 30°C’de ve 35°C’de 24 – 48 saat inkübasyona tabii tutulur. 24 saatlik inkübasyondaki küçük, grimsi ve siyah zonlu koloniler, 24 saatlik inkübasyondan sonra ise yaklaşık 2 mm çapındaki ortası çökmüş, siyah zonlu koloniler, L. monocytogenes açısından şüpheli olarak kabul edilir. Bu şüpheli koloniler, API ya da microbact gibi hızlı identifikasyon kitleri ile (şeker fermentasyon

36

kitleri) test edilip kesin tanı konur.

E. coli O157:H7 aranmasıStandart Analiz YöntemiE. coli O157:H7’nin belirlenmesi için kullanılan klasik yöntemlerin büyük çoğunluğu selektif zenginleştirme ve katı besiyerine ekim aşamalarını içeren var/yok testleri şeklindedir. Bu testler ile analiz edilen belirli bir miktar örnekte bu bakterinin varlığı ya da yokluğu araştırılır. Gıdalarda bu bakteri sadece aranır, sayısı önemli değildir. Bir diğer deyiş ile 25 g (ya da ml) gıdada bu bakteri olmamalıdır. Buna göre eğer varsa kaç adet olduğu önemsizdir.

FDA/BAM AOAC tarafından önerilen yönteme göre E. coli O157:H7 aranması zenginleştirme, izolasyon ve doğrulama aşamalarından oluşmaktadır. Zenginleştirme: E. coli O157:H7’nin zenginleştirilmesinde kullanılan besiyerlerinden bazıları modifiye Tryptic Soy Broth (mTSB), EHEC Enrichment Broth (EEB), Trypticase Novobiocin (TN) Broth veya Lauryl Sulphate Triptose Broth besiyerlerinden biri veya birkaçı birlikte kullanılmaktadır. Buna göre 10-25 g gıda maddesi 90-225 ml sıvı besiyerinde homojenize edilmekte ve 37 oC’da 6-24 saat inkübasyona bırakılmaktadır. Zenginleştirme besiyerinde antibiyotik kullanımından başka inkübasyon sıcaklığının 43 - 44 oC’a çıkarılması ile de refakatçi flora baskılanabilmektedir.mTSB besiyerinin bileşimine filitre ile sterilize edilmek üzere cefixime 0,05 mg/l; cefsulodin 10,0 mg/l ve vancomycin 8,0 mg/l ilavesi ile besiyerinin seçiciliği artırılmaktadır.İzolasyon: Katı besiyerleri kullanılarak E. coli O157:H7 izolasyonunda, bu serotipin sorbitol negatif, ß-glucuronidase negatif olma özelliğinden yararlanılmaktadır. Standart yönteme göre E. coli O157:H7 izolasyonunda Sorbitol MacConkey Agar (SMAC), Hemorajik Kolitis (HC; hemorrhagic colitis) Agar ve Tellurite-Cefixime-SMAC (TC SMAC) Agar besiyerleri kullanılması önerilmektedir. SMAC Agar besiyerinde 35 oC' de 18 saat inkübasyon sonunda sorbitol negatif koloniler soluk pembe veya renksiz, pozitif E. coli türleri ve diğer enterikler ise parlak pembe renkte koloni oluşturmaktadırlar. SMAC Agar besiyerinin bileşimine MUG katılarak glukuronidaz aktivitesi de tespit edilebileceği gibi, bileşiminde MUG bulunan Fluorocult E. coli O157 Agar gibi bir besiyerine sorbitol negatif kolonilerden sürme yapılarak da fluoresan negatif koloniler izole edilebilmektedir.E. coli O157:H7 aranmasında kullanılan diğer besiyeri, sorbitol ve MUG içeren HC Agar besiyeridir. HC Agar besiyerinin bileşiminde MUG yerine 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl ß-D-glucuronide (BCGI) de kullanılabilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken nokta inkübasyon süresi uzar ise fluoresansın tüm besiyerinin yüzeyine yayılacağıdır. Selektif katı besiyeri olarak bu gün en yaygın kullanılan sorbitol MacConkey (SMAC) agar ve bu besiyerinin çeşitli modifikasyonlarıdır. Bu besiyerinin standart MacConkey agardan farkı bileşiminde laktoz yerine sorbitol bulunmasıdır. E. coli O157:H7 serotipi sorbitol negatif olduğu için bu besiyerinde renksiz koloniler oluşturmakta, buna karşı sorbitolü kullanan bakterilerin oluşturduğu asitlik bir pH indikatörü yardımı ile kolonilerin kırmızı görülmesine neden olmakta, böylece E. coli O157:H7 serotipi sorbitol pozitif bakterilerden ayırt edilmektedir. SMAC agar %100 duyarlı, %85

37

spesifik ve %86 doğru sonuç veren bir besiyeri olarak tanımlanmaktadır.Son zamanlarda E. coli O157:H7 izolasyonunda TC SMAC besiyerinin kullanımı giderek yaygınlaşmaktadır. Besiyerinin bileşiminde bulunan antibiyotikler diğer mikroorganizmaların gelişmesini etkili bir şekilde önlemektedir. Bu besiyerinin bileşimi SMAC Agar ile aynı olup, sterilizasyon işleminden sonra filitre ile sterilize edilmiş potasyum tellürit (2,50 mg/l) ve sefiksim (0,05 mg/l) katılarak hazırlanmaktadır. Cefixime sorbitol negatif olan Proteus spp.’nin inhibisyonu için önemli olmaktadır. Tellurit ile desteklendiğinde E. coli O157:H7 dışında kalan ve başta yükseltilmiş inkübasyon sıcaklığı olmak üzere diğer yöntemler ile baskılanamayan diğer E coli’ leri de önemli ölçüde etkilemektedir. Bununla beraber özellikle stres altındaki E. coli O157:H7 suşları CT varlığında daha zayıf olarak gelişmektedir.TC SMAC Agar besiyeri kullanılması durumunda standart yönteme göre önce 25 g gıda örneği 225 ml EEB içerisinde homojenize edildikten sonra 37 oC’ de çalkalamalı inkübatörde 6 saat inkübe edilir. Buradan 0,1 ml örnek alınıp TC SMAC Agar üzerine ekim yapılırken, başka bir petri kutusuna da sürme yapılarak 37 oC’ de bir gece inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda sorbitol pozitif koloniler pembe veya kırmızı renkte, tipik O157:H7 kolonileri ise renksiz veya dumanımsı gri renkte 1-2 mm çapında koloniler oluşturmaktadır. Eğer TC SMAC Agar üzerinde tipik koloniler yoksa zenginleştirme aşaması 24 saate çıkarılarak analiz tekrarlanır.SMAC dışında, phenol red sorbitol (PRS) + MUG agar, L-EMB agar, hemorragic colitis (HC) agar, enterohemorrhagic E. coli (EHEC) agar, BCM O157 agar, CHROMagar O157, modifiye edilmiş EMB (mEMB) agar, Fluorocult E. coli O157 agar, standart enterik agar ve purple agar base + %1 sorbitol besiyeri kombinasyonu besiyerleri de çeşitli denemelerde kullanılmıştır. HC agar MUG ve sorbitol içermesi ile MUG ve sorbitol negatif kolonilerin izolasyonuna olanak sağlamaktadır. Bununla beraber inkübasyonun uzamasına bağlı olarak floresansın yayılması MUG reaksiyonunun sağlıklı olarak değerlendirilebilmesini olanaksız kılmaktadır. Bu nedenle MUG yerine kolorimetrik bir katkı olan BCIG’in kullanılması daha yüksek doğrulukla izolasyon yapılabilme olasılığı vermektedir.Tanımlama: Selektif zenginleştirme ve katı besiyerinde inkübasyon aşamalarından sonra izolasyonu yapılan kültürlerin E. coli O157:H7 serotipi olduklarının, E. coli O157:H7 lateks test kitleri, E. coli O157 ve E. coli H7 antiserumları ve biyokimyasal testler uygulanarak doğrulanması gerekmektedir.Lateks aglütinasyon doğrulama testi E. coli O157:H7’nin hızlı identifikasyonu için kullanılan bir test kitidir. E. coli O157:H7 lateks testi gıda sanayiinin kullanımına sunulan, yüksek duyarlığa sahip bir yöntemdir. Kit, iki adet lateks solüsyonu içermektedir. Test solüsyonu, E. coli O157 antijenine özel, tavşandan elde edilen antikorlarla kaplanmış lateks partiküllerinden oluşmaktadır. Kontrol solüsyonu ise pre-immün halde tavşan globulinleri içermektedir. Test edilen kültürler SMAC Agar üzerinde geliştirildikten sonra sorbitol negatif olan kolonilere lateks testi uygulanmakta ve test sonucu bir dakika içinde tespit edilebilmektedir. Ancak bu testte dikkat edilmesi gereken bir nokta; çiğ süt ve dana eti gibi gıdalardan izole edilen E. hermannii’nin de sorbitol negatif olup, E. coli O157 antiserumu ile aglütine olabilmesi ve böylece E. coli O157:H7 ile karıştırılabilmesidir. Bunu önlemek için, özellikle gıdalarda bulunan E. hermannii’nin izolasyonunda, SMAC Agar besiyeri ile birlikte Sellobiyoz-MacConkey Agar besiyerinin de kullanılması gerekmektedir. Ayrıca

38

mutlaka H7 antiserumu ile kontrol edilmesi ve KCN’de üreme testlerinin yapılması gerekmektedir. E. coli O157:H7 sellobiyoz ve KCN’de üreme negatif, H7 antiserum kontrolünde ise pozitif sonuç vermektedir.

Sonuç ve Karar:

XLD Adarda Salmonella Rambach Agarda Salmonella

Oxford Agarda L.monocytogenes

39

Uygulamanın adı Gıdalardan (süt ve süt ürünlerinden) laktik asit bakterilerinin aranması

Yapılacağı hafta XIIUygulamanın temel hedefi Sütün içermiş olduğu toplam spesifik canlı

miktarının belirlenmesiKullanılacak materyal ve malzeme adı MRS Agar, M17 Agar, hassas terazi, pipet,

deney tüpü, petri kutusu, otoklav, etüv, bek, drigalski spatülü, sulandırma sıvısı, besiyeri şişesi, spatül

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİSüt, non starter laktik asit bakterileri diye adlandırılan bir bakteri grubunu içermektedir. Bu grup bakteriler, sütün pastörize edilmesi ile birlikte bir miktar yıkımlanmakla birlikte yoğurt, peynir gibi ürünlerde belli bir miktarın altında olması istenmemektedir.

İşlem: Süt orjinli Laktik Asit Bakterileri (LAB)’nden önemlileri; Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus’tur. Bu grup bakterilerden özellikle laktobasilluslar de Man Rogosa Sharpe (MRS) agarda, laktokoklar ise M17 agarda spesifik olarak üremektedir. Bu grup mikroorganizmanın belirlenmesi amacıyla; süt ürününden hassas terazide 10g tartılır ve 90 ml sulandırma sıvısında homojenize edilir (10 -1). Bu dilüye etme işlemi seri olarak 10-4 ve 10-5’inci dilüsyona kadar sürdürülür. Bu dilüsyon oranlarından MRS ve M17 agara yayma plak ya da dökme plak yöntemine göre ekimler yapılır. Her iki besi yeri, 35ºC’de 48 saat inkübasyona bırakılır. Bu sürenin sonunda her iki besi yerinde üremiş olan petri kutularındaki üreyen koloni sayısı 10-300 arasındaki dikkate alınır ve her iki besi yerinde üremiş olan koloniler sayılarak toplanır ve bu sayımın 1.0

40

x 107’den düşük olmaması istenir.

Örnek;Yayma plak yöntemine göre yapılan ekimlerin İnkübasyonları sonucunda MRS agarın 10-4’üncü dilüyon oranından yapılan ekimlerden 48, M17 agarın 10-4’üncü dilüsyonundan yapılan ekimlerde 18 tane koloni sayılırken, 10-5’inci dilüsyonlarından sırasıyla 6 ve 3 adet koloni sayılmış olsun. Kurala göre 10-300 arasındaki koloni sayıları dikkate alınır. O halde 10-5’inci dilüsyon oranlarından yapılan ekimler sonucunda karşımıza çıkmış olan 6 ve 3 sayıları dikkate alınmaz.

10-4’üncü dilüsyon MRS 4810-4’üncü dilüsyon M17 18 48 + 18 = 66

Sonuç: Sayılan koloni sayısı x dilüsyon oranı x 10 (yayma plak yöntemine göre!)

66 x 104 x 10 = 6,6 x 106 kob/g-mlBulunan bu sonuç, 1.0 x 107’den küçük olduğu için bu süt ürünü LAB (toplam spesifik canlı) bakımından uygun değildir denir.

Soru: Peynirin 10 -5 ’inci dilüsyonundan yayma plak yöntemine göre MRS ve M17 Agarlarda yapılan ekimlerde toplam spesifik canlı sayısı 24 koloni olarak belirlenmiştir. Buna göre sonuç ………………..kob/g’dır ve toplam spesifik canlı sayısı bakımından bu peynirin uygun olup olmadığını sebebiyle belirtiniz.

Sonuç ve Karar:

41

Uygulamanın adı Gıdalarda Toplam Bakteri, Maya-Küf ve Stapylococcus aureus aranması

Yapılacağı hafta XIIIUygulamanın temel hedefi Gıdaların içermiş olduğu genel canlı yükleri

ile maya-küf ve Stapylococcus aureus sayıları ile tüketime uygun olmadıklarını belirlemek

Kullanılacak materyal ve malzeme adı Baird Parker Agar, Nutrient Broth, deney tüpü, tavşan plazması, Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar, hassas terazi, etüv, stomacher, stomacher torbası, spatül, makas, drigalski spatülü, petri kutusu, pipet

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Staphylococcus aureus aranmasıBaird Parker Agar (BPA) besi ortamına yayma plak tekniği ile ekim yapılarak plaklar 37ºC’de 24-48 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda oluşan siyah renkli stafilokok-mikrokok olarak değerlendirilir, siyah renkli stafilokok kolonileri içerisinde S.aureus için tipik olan (siyah renkli, etrafında açık renkli zon bulunan) koloniler seçilerek koagülaz testi uygulanır. Koagülaz testi: BPA’da üreyen S.aureus için süpheli koloniler 10 ml Nutrient Broth içeren tüplere aktarılarak 37ºC’de 18-24 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda, 0.3 ml tavşan plazması içeren tüplere Nutrient Broth’da gelişen kültürden 0.1 ml inokule edilerek 37ºC’de inkübasyona bırakılır. 4 saat sonra pıhtılaşma durumu kontrol edilir ve pıhtılaşmanın gözlenmesi koagülaz testi yönünden pozitif olarak değerlendirilir.Örneğin 1 gramındaki S.aureus sayısı; tipik koloni sayısı ile koagülaz (+) sonuç alınan koloni sayısı ve dilüsyon oranının çarpımının, koagülaz testi uygulanan tipik koloni

42

sayısına oranlanması ile saptanır.

Örneğin;Tipik koloni sayısı: 25Koagülaz testi uygulanan tipik koloni sayısı: 5Koagülaz (+) sonuç veren koloni sayısı: 3Dilüsyon oranı: 10-3

S.aureus sayısı: 25 x 3 x 103 x10 / 5 = 15 x 104 = 1.5 x 105 kob / g

Aerob-mezofil genel canlı aranmasıPlate Count Agar (PCA) besi ortamına yayma plak tekniği ile ekimi takiben, plaklar 37ºC’de 24-48 saat inkübe edilir ve inkübasyon sonrası oluşan koloniler sayılarak aerobik mezofilik bakteri sayısı saptanır. Maya-küf sayımıPotato Dextrose Agar (PDA) besi ortamına yayma plak tekniği ile ekimi takiben, plaklar 22ºC’de 3-5 gün inkübe edilir ve inkübasyon sonrası oluşan koloniler sayılarak maya küf sayısı saptanır.

Soru: Gıdalarda S. aureus sayısını belirlemek için …………………………………besi yeri kullanılır. Uygun dilüsyondan yapılan ekim sonrası üreyen siyah kolonilerin hepsi toplam ………………………- ……………………… sayısını verir. Bunların içinde ………………………. renkte zon oluşturanlar S. aureus şüphelidir. Şüpheli kolonilere …………………………………… testi uygulanarak S.aureus sayısı belirlenir.

Soru: Sucuk numunesinden Plate Count Agar (PCA)’a 10 -2 lik dilüsyondan yayma plak yöntemine göre yapılan ekimde inkübasyon sonucu 25 koloni üremiştir. Buna göre numunemizdeki koloni sayısı nedir?

Sonuç ve Karar:

Soru: Tipik koloni sayısı: 50Koagülaz testi uygulanan tipik koloni sayısı: 5Koagülaz (+) sonuç veren koloni sayısı: 4

43

Dilüsyon oranı: 10-2

S.aureus sayısı: ?

Sonuç ve Karar:

Uygulamanın adı Suların Mikrobiyolojik AnalizleriYapılacağı hafta XIVUygulamanın temel hedefi Suların, mikrobiyolojik açıdan tüketime

uygun olup olmadıklarını belirlemekKullanılacak materyal ve malzeme adı Plate Count Agar, Otoklav, etüv, bek, su

banyosu, erlenmayer (100 ml, 250 ml, 500 ml), pipet (1 ml, 10 ml), deney tüpü, petri kutusu, sivri uçlu öze, Durham tüpü, Laktoz Broth, SIM medium, MR-VP Medium, Simmons Citrate Agar, Kovacs Çözeltisi, Metil-Red Ayıracı, % 40 KOH, a-naftol Çözeltisi

Gerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Genel canlı bakteri sayımı: Suda optimum üreme ısıları farklı çeşitli mikroorganizmalar olduğundan, bunlar iki başlık altında toplanır: 1- Optimum üreme ısıları 25°C veya daha az olanlar: Bunlar genellikle suda doğal olarak bulunan saprofit ve toprak kökenli mikroorganizmalardır. 2- Optimum üreme ısıları 37°C olanlar: Bunlar suda az bir hızla ürerler. Suda varlıkları bir kontaminasyonu gösterir.Bu iki grup mikroorganizmanın suda varlıkları farklı sonuçları gösterdiğinden, bunların sayımlarının ayrı ayrı yapılması tercih edilir.

Plak metodu: Bu amaçla Plate Count Agar (PCA) besi yeri içeren dört adet petri plağına, suyun kontaminasyon derecesine göre kendisinden veya dilüsyonlarından yayma plak tekniği ile ekimleri yapılır. Her serideki dört petri kutusundan iki tanesi 37±0,5°C’de 24±2 saat, diğer iki tanesi 20-22°C’de 72 saat inkube edilir. İnkübasyon

44

sonrası oluşan koloniler sayılır.

Tahmini koliform organizmaların sayımı ve E.coli’nin belirlenmesi: Suda çok az sayıda bile olsa, koliform organizmaların varlıkları arzu edilmediğinden, fazla miktarda su numunesinin deneye sokulması gerekir. Bunun için çok tüp metodundan yararlanılır. Çok tüp metodu: Koliform organizmalar, laktozu fermente ederek asit ve gaz oluşturma yeteneğine sahip olduklarından, tahmini koliform organizmaların sayımı için kullanılan besi yerleri laktoz ve bir asit indikatörü kapsar. Laktozdan oluşacak gazın tespiti için besi yerini kapsayan tüpün içinde, ters çevrilmiş bir iç tüp (durham tüpü) bulundurulur.

Koliform bakteri aranması Tahmin, doğrulama ve tamamlama olmak üzere üç aşamadan oluşur.

a- Tahmin deneyi: Bu deney için çift güçlü ve tek güçlü laktoz broth kullanılmaktadır. Tek güçlü laktoz broth, çift güçlü besi yerine 1/1 oranında distile su ilavesi ve sterilize edilmesi ile hazırlanır.

Ekim: Deney, 9 tüp metoduna göre yapılır. Bir deney için, 3 tanesi çift güçlü ve 6 tanesi tek güçlü olmak üzere toplam 9 adet besi yeri kullanılır. Çift güçlü besi yerlerine 10'ar ml, 3 tane tek güçlü besi yerine 1 ml ve 3 tane besi yerine 0,1 ml numune ekilir, 37°C'lik etüvde 24 saat inkube edilir. 100 ml su numunesindeki koliform organizmaların tahmini sayısını belirlemek amacıyla Tablodan yararlanılır (bakınız: Gıdalarda Koliform bakteri ve E. coli aranması, Çizelge: Kuvvetle Muhtemel Bakteri Sayısı) Sonuç, “100 ml su numunesindeki koliform organizmaların kuvvetle muhtemel sayısı........dır” şeklinde ifade edilir. b- Doğrulama deneyi: Bu deneyin amacı, tahmin deneyinde oluşan gazın, koliform bakteriler tarafından oluşturulduğunu doğrulamaktır. Kültür ortamının zar, köpük kısımlarından alınmamasına dikkat edilir. 5 mm çapında bir öze dolusu kültür alınır, katı besi yerine ekim yapılır, 37°C'de 24 saat inkube edilir. Kullanılan besi yeri, Eosin Metilen Blue (EMB) agar olup E. coli suşları bu besi yerinde metalik yeşil röfle verir. c- Tamamlama deneyi: Katı besi yerinde üremiş tek tek kolonilerden İMVİC testleri yapılır (Bakınız 9. Hafta, gıdalarda koliform bakteri ve E. coli aranması)

Sonuç ve Karar:

45

Uygulamanın adı Eksik uygulamaların tamamlanmasıYapılacağı hafta XVUygulamanın temel hedefi Uygulamalarda eksik kalan ya da

anlaşılmayan kısımların tekrar edilmesiKullanılacak materyal ve malzeme adıGerekli olan güvenlik uygulamaları

UYGULAMA BİLGİSİ

Karşılıklı konuşmalar ile eksik kalan yerlerin tekrar gözden geçirilmesi planlanmıştır.

46

47

48