VVäzbová analýza äzbová analýza

aamapovanie mapovanie

génovgénov

IdentifikIdentifikácia génovácia génov Funkčné klonovanieFunkčné klonovanie - identifikácia génu na základe znalosti proteínu- identifikácia génu na základe znalosti proteínu napr. F-VIII napr. F-VIII --hemofília Ahemofília A; PAH g; PAH gén én - - fenylketonúria fenylketonúria - získanie časti génu sekvenovaním proteínu- získanie časti génu sekvenovaním proteínu - nev- nevýhody: nutnosť poznania proteínuýhody: nutnosť poznania proteínu purifikácia proteínu, protilátky, cDNA purifikácia proteínu, protilátky, cDNA

knižniceknižnice degenerovanosť genetického kódudegenerovanosť genetického kódu Pozičné klonovaniePozičné klonovanie - identifikácia neznámeho génu určením - identifikácia neznámeho génu určením jeho lokalizácie, bez potreby poznania funkcie proteínujeho lokalizácie, bez potreby poznania funkcie proteínu - nevýhody: analýza DNA viacerých jedincov- nevýhody: analýza DNA viacerých jedincov analýza väčších resp. viacerých rodokmeňovanalýza väčších resp. viacerých rodokmeňov lokusová heterogenitalokusová heterogenita

História mapovania génovHistória mapovania génov Lokalizácia daltonizmu, hemofílie, DMD na X chromozóm Lokalizácia daltonizmu, hemofílie, DMD na X chromozóm

na základe dedičnostina základe dedičnosti Metóda chromozómových markerov – lokalizácia Amy2B Metóda chromozómových markerov – lokalizácia Amy2B

génu na 1q génu na 1q

„ „uncoiler“ chromozómuncoiler“ chromozóm Metóda štúdia efektu dávky:Metóda štúdia efektu dávky:

trizómie: 150trizómie: 150%, %, chromozómové chromozómové deldelécie 50écie 50% d% dávkyávky Chromozómová lokalizácia:Chromozómová lokalizácia: - Metóda medzidruhovej hybridizácie somatických buniek- Metóda medzidruhovej hybridizácie somatických buniek Subchromozomálna lokalizácia:Subchromozomálna lokalizácia: - Hybridizácia buniek s čiastočne deletovanými chromozómami- Hybridizácia buniek s čiastočne deletovanými chromozómami

- chromosome-mediated gene transfer - chromosome-mediated gene transfer

- Radiačné hybridy a parciálne štiepenie restrikčnými - Radiačné hybridy a parciálne štiepenie restrikčnými endonukleázamiendonukleázami

- FISH- FISH

HybridizHybridizácia somatických ácia somatických buniekbuniek

Hybridizácia ľudských a myších buniek

Vznik nestabilného hybridu,

u ktorého v následných mitózach dochádza k strate väčšiny ľudských chromozómov

Možnosť vytvoriť súbor (panel) viac-menejstabilných hybridných línií obsahujúcichkaždý ľudský chromozóm Monochromozomálne hybridné línie možno vytvoriť aj priamo fúziou mikrobuniek(micocell – vznik po pôsobení colcemidu)

Fúzia buniek s chromozomálnymi Fúzia buniek s chromozomálnymi deléciamideléciami

Zostavenie kontigov pokrývajúcich Zostavenie kontigov pokrývajúcich celý chromozómcelý chromozóm

Fluorescence in situ Fluorescence in situ hybridizationhybridization

(FISH)(FISH)

Chromosome paintingChromosome painting

Genetické markeryGenetické markery

U modelových organizmov mapovanie dvoch U modelových organizmov mapovanie dvoch fenotypových znakov fenotypových znakov ≠ u človeka ≠ u človeka

Potreba nových DNA markerov pre mapovanie Potreba nových DNA markerov pre mapovanie génov u človeka.génov u človeka.

19001900 krvné skupinykrvné skupiny cca 20 cca 2019601960 sérové proteíny a izoenzýmysérové proteíny a izoenzýmy 10 1022

19801980 DNA RFLPDNA RFLP 10 1033

19851985 VNTR - minisatelityVNTR - minisatelity 10 1044

19901990 - mikrosatelity (STR) 10 - mikrosatelity (STR) 1055

19951995 SNP (single nt polymorphisms) 10SNP (single nt polymorphisms) 1066

Informatívnosť Informatívnosť polymorfizmovpolymorfizmov

1. početnosť a lokalizácia na genóme1. početnosť a lokalizácia na genóme - krvné a sérové skupiny – malý počet - krvné a sérové skupiny – malý počet - VNTR prevažne v telomerických oblastiach- VNTR prevažne v telomerických oblastiach - STR rozptýlené po chromozómoch- STR rozptýlené po chromozómoch

2. informatívnosť polymorfizmov2. informatívnosť polymorfizmov - RFLP/SNP polymorfizmy majú len 2 alely- RFLP/SNP polymorfizmy majú len 2 alely

k k

heterozygozita H = 1 – heterozygozita H = 1 – ΣΣ x xii22

i=1i=1

(preto takmer ideálne sú STR polymorfizmy s (preto takmer ideálne sú STR polymorfizmy s vysokýmvysokým

počtom rovnomerne zastúpených aliel) počtom rovnomerne zastúpených aliel)

V súčasnosti využívané V súčasnosti využívané polymorfizmypolymorfizmy

STR polymorfizmySTR polymorfizmy - rozptýlené po celom genóme,- rozptýlené po celom genóme, - väčší počet aliel =› vysoká informatívnosť,- väčší počet aliel =› vysoká informatívnosť, - na pokrytie genómu postačuje 400 STR (- na pokrytie genómu postačuje 400 STR (~~ 10cM) 10cM) - nevýhodou je absencia „high-throughput“ metódy - nevýhodou je absencia „high-throughput“ metódy SNP polymorfizmySNP polymorfizmy - takmer vždy len dve alely =› nižšia informatívnosť- takmer vždy len dve alely =› nižšia informatívnosť - vyvážené je to ich obrovským počtom (›10- vyvážené je to ich obrovským počtom (›1066) ) - „high-throughput“ čipová analýza (až 100 tisíc SNP- „high-throughput“ čipová analýza (až 100 tisíc SNP v jednej analýze)v jednej analýze)

Meiotický crossing-overMeiotický crossing-over

Väzba génov (lokusov)Väzba génov (lokusov)- voľná kombinovateľnosť – lokusy na rôznych chromozómoch- synténia – lokalizácia lokusov na jednom chromozóme vzhľadom k dĺžke chromozómov sa vzdialené lokusy javia ako pri voľnej kombinovateľnosti- väzba lokusov – medzi blízko ležiacimi lokusmi pravdepodobnosť rekombinácie zavisí od vzájomnej vzdialenosti

Porovnanie fyzickej a genetickej Porovnanie fyzickej a genetickej vzdialenostivzdialenosti

Rekombinačná frekvencia – θ - je % pravdepodobnosť meiotickej rekombinácie medzi dvomi lokusmi

θ = 0 úplná väzbaθ = 0,5 voľná kombinovateľnosť

Závisí od: Oblasti na chromozóme ter>cen pohlavia ženy > muži

Mapová vzdialenosťcM – centimorgan

1cM = 1% rekombinácie (θ= 0,01)1cM ~ 1Mb

Viacnásobný cross-overViacnásobný cross-overVzdialenosť M1 – D = θ1 Vzdialenosť D- M2 = θ2

Ale vzdialenosť M1 – M2 ≠ θ1 + θ2

V skutočnosti je

θM1-M2 < θ1 + θ2

V dôsledku dvojitých crossoverov

preto

θM1-M2 = θ1 + θ2

platí len pre malé vzdialenosti

Identifikácia rekombinantov v Identifikácia rekombinantov v rodokmeňovej analýzerodokmeňovej analýze

Je potrebné poznať fázu Analýza trojgeneračných rodokmeňov

Mapovanie génu do oblasti na Mapovanie génu do oblasti na chromozómechromozóme

Linkage mappingLinkage mappingMetóda LOD score:

Testovanie pravdepodobnosti, že dva sledované lokusy sú vo väzbe k pravdepodobnosti ich voľnej kombinovateľnosti

- Väzba pri rekombinačnej frekvencii θ- Voľná kombinovateľnosť θ = 0,5

(1- θ)N . θR

Z(θ) = log 10 -------------- 0,5 N+R

väzba dokázaná, ak Z>3 (log10 1000= 3)väzba vylúčená , ak Z<-2 (log10 1/100= -2)

Autozygosity mappingAutozygosity mapping

Autozygosity mappingAutozygosity mapping

Autozygosity mappingAutozygosity mapping

Genotypy príbuzných postihnutých v dvoch STR polymorfizmoch

a) polymorfizmus vzdialený od génu zodpovedného za ochorenie

b) polymorfizmus ležiaci v blízkosti hľadaného génu

Využitie väzbovej analýzyVyužitie väzbovej analýzy

Lokalizácia a identifikácia génov Lokalizácia a identifikácia génov zodpovedných za dedičné ochorenia,zodpovedných za dedičné ochorenia,

Využitie v nepriamej DNA diagnostike Využitie v nepriamej DNA diagnostike ochorení,ochorení,

Identifikácia lokusovej heterogenity Identifikácia lokusovej heterogenity niektorých ochorení,niektorých ochorení,

zostrojenie genetickej mapy celého zostrojenie genetickej mapy celého genómu - triangulácia genómu potrebná genómu - triangulácia genómu potrebná pre úplné sekvenovanie genómupre úplné sekvenovanie genómu

Informatívne meiózyInformatívne meiózypri nepriamej diagnostikepri nepriamej diagnostike

AD dedičnosť

1. Lokus – ochorenie (gén)2. Lokus – DNA

polymorfizmus s alelami A1, A2, A3, A4

Rodokmene A, B neinformatívne

Rodokmene C, D informatívne