vũ phương nhung t bỊ Ế cyp2c9 cyp3a5 v cyp2d6
TRANSCRIPT
BÔ GIAO DUC VA
ĐAO TAO
VIÊN HAN LÂM KHOA HOC VA
CÔNG NGHÊ VIÊT NAM
HOC VIÊN KHOA HOC VA CÔNG NGHÊ
----------------------------
Vu Phương Nhung
NGHIÊN CƯU ĐA HINH/ĐÔT BIÊN GEN CYP2C9,
CYP2C19, CYP3A5 VA CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ơ
NGƯƠI KINH VIÊT NAM
Chuyên nganh: Công nghê sinh hoc
Ma sô: 9420201
TOM TĂT LUÂN AN TIÊN SI SINH HOC
Ha Nôi - Năm 2020
Luận án được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ-Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Nguyễn Hải Hà
Người hướng dẫn khoa học 2: GS. TS. Nông Văn Hải
Phản biện 1: ………………………
Phản biện 2: ………………………
Phản biện 3: ………………………
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …’, ngày ….. tháng ….. năm 20…..
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh
khỏi trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse
drugs reaction-ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của
các trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Từ
năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical
Pharmacogenetics Implementation Consortium-CPIC) đã cung cấp các
thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng trong tối ưu hóa
phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC cũng đã
đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Các gen CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP có tính đa hình cao mà các
dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển hóa từng
loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu.
Cho tới nay, các hiểu biết về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP
tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam còn rất hạn chế. Ngày nay,
với vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc và
tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần đầu tư nghiên
cứu. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như
xác định cả những allele mới ở người Việt Nam. Số liệu thu được từ nghiên
cứu sẽ cung cấp những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen
CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Đây cũng
là những tiền đề có ý nghĩa và đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh
vực di truyền dược học và y học cá thể trong tương lai.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Xây dưng cơ sơ dư liêu vê đa hinh/đôt biên cua 04 gen CYP2C9,
CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ơ ngươi Kinh Viêt Nam.
- Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đông thơi phân tich
va dư đoan chưc năng cua cac biên thê mơi.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Thu thập và tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 136 người Kinh
Việt Nam khoe manh, không co quan hê huyêt thông.
- Xác định tất cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với 9
exon và vùng biên của 03 gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 bằng phương
2
pháp giải trình tự. Đối với gen CYP3A5, giai trinh tư cac vung gen chưa cac
biên thê đa đươc công bô la *3, *6, *8 và *9.
- Xác định các biến thể số bản sao (copy number variant-CNV) của
các gen bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối
(Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA).
- Xác định thành phần kiểu gen và tần số allele của các gen CYP450
trên người Việt Nam.
- So sánh tần số và mức độ phân bố các allele của các gen CYP450 ở
quần thể người Việt Nam so với các quần thể khác.
- Dự đoán chức năng in silico của các đa hình/đột biến mới phát hiện.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan
Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein
biểu hiện chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan
và biểu mô ruột non (ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác). Ở người,
có 115 gen CYP450 bao gồm cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1
và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein được mã hóa bởi các CYP450 được
phân loại dựa trên độ tương đồng về trình tự các amino acid thành các cấp
độ từ họ (ví dụ: CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: CYP1A, CYP2B…) và
enzyme riêng lẻ (ví dụ: CYP1A1, CYP2D6…). Trong số các CYP450 được
biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu hiện mạnh nhất (chiếm
22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9 (14,6%) tính
trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho
nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa
vòng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N-
alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy).
1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia
chuyển hóa thuốc
Các kiểu đa hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết
định về mặt chức năng và kiểu hình chuyển hóa thuốc: chuyển hóa thuốc
bình thường (Extensive metabolizer-EM), chuyển hóa thuốc trung bình
(Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-
PM) và chuyển hóa thốc cực nhanh (Ultra rapid Metabolizer-UM). Những
CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện
nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói
3
trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc
thường được kê đơn. Trong số các protein thuộc 18 họ CYP450, các protein
có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 và
CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các phân họ khác
có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức năng
chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị
trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và
CYP2E.
1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR
và sự khác biệt trong đáp ứng thuốc
ADR là một đáp ứng với thuốc dưới dạng ngộ độc và ngoài ý muốn
mặc dù dùng thuốc ở liều thông thường phục vụ cho mục đích dự phòng,
điều trị hay chẩn đoán cũng như điều chỉnh chức năng sinh lý (Theo Tổ chức
Y tế thế giới).
Đã có nhiều báo cáo về ảnh hưởng của các biến thể thuộc các gen
CYP450 mã hóa cho enzyme chuyển hóa thuốc pha I đến sự khác biệt trong
đáp ứng thuốc của mỗi cá nhân. Một số bằng chứng cho thấy những kiểu
gen CYP2B6 gây ra kiểu hình PM (đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép đối với
2 allele *6 và/hoặc *8) có liên quan đến giảm lượng thuốc efavirenz được
chuyển hóa, đồng thời tăng nguy cơ ngộ độc thuốc này. Đối với phenytoin,
CYP2C9 đóng vai trò chuyển hóa 90% loại thuốc này, trong đó các allele
CYP2C9*2 và *3 làm giảm hoạt tính enzyme trong phản ứng chuyển hóa
phenytoin. Bên cạnh đó, các allele *4 và *6 đã được báo cáo là xuất hiện ở
những bệnh nhân có phản ứng phụ khi điều trị với phenytoin. Các trường
hợp đa hình của CYP2D6 cũng đã được chỉ ra là có ảnh hưởng đến chuyển
hóa thuốc sử dụng trong điều trị ung thư, rối loạn tim mạch, rối loạn tâm
thần và giảm đau. Ngoài các enzyme chuyển hóa thuốc pha I và pha II, đa
hình của các gen mã hóa cho các kênh vận chuyển thuốc cũng góp phần tạo
nên ADR.
1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng
Trong tương lai, các nghiên cứu xa hơn về di truyền dược học cần phải
tăng cường sự hợp tác giữa các nhóm nghiên cứu trên toàn cầu. Nghiên cứu
di truyền dược học cần thực hiện thu thập mẫu và phân tích tạo nên các cơ
sở dữ liệu nhằm phục vụ cho quá trình phát triển thuốc. Trong các giai đoạn
thử nghiệm thuốc lâm sàng, số liệu thu được của di truyền dược học có thể
được áp dụng nhằm dự đoán đáp ứng thuốc cá nhân ở các cấp độ như: đáp
4
ứng thuốc tốt, nguy cơ ADR, không đạt hiệu quả điều trị. Một trong những
thử thách mà lĩnh vực hệ gen dược học đang đối mặt đó là cần phải phát
triển các phương pháp thông lượng cao, qua đó có thể phân tích chức năng
của số lượng lớn các biến thể chưa rõ chức năng tìm được khi sử dụng
phương pháp giải trình tự thế hệ mới trên một lượng lớn các đối tượng bệnh
nhân. Trong những năm gần đây, rất nhiều các nghiên cứu tương quan toàn bộ
hệ gen về đáp ứng thuốc đã được tiến hành.
1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen
CYP450
Các phương pháp sinh học phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi
trong nghiên cứu đa dạng di truyền các gen CYP450 như: giải trình tự
Sanger, khuếch đại đặc hiệu và cắt bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP), và
SNP array nhằm phát hiện các đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide
polymorphism-SNP) và các indel. Các phương pháp được sử dụng phổ biến
để nghiên cứu các CNV của các gen CYP450 bao gồm: real-time PCR,
phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex
ligation-dependent probe amplification-MLPA), phương pháp lai so sánh
toàn bộ hệ gen (Comparative Genomic Hybridization-CGH), PCR kĩ thuật
số.
1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên
người Việt Nam và phạm vi nghiên cứu của luận án
Đối với nhóm gen CYP450 mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển
hóa thuốc ở người, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện
K Trung ương đã tập trung vào đa hình phổ biến của CYP2D6 là
CYP2D6*10. Năm 2018, nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Y dược-Đại học
quốc gia Hà Nội bước đầu nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình
CYP2C19 tới hiện tượng kết tập tiểu cầu trên bệnh nhân mắc hội chứng
mạch vành cấp tính tại Việt Nam. Cho đến nay mới chỉ có 06 công bố quốc
tế về tần số của các allele đã biết gây kiểu hình PM, IM và UM của các gen
CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 và CYP3A5
trên người Việt Nam. Như vậy, chưa có thông tin về toàn bộ các biến thể
trên các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt
Nam. Luận án tập trung nghiên cứu sự phân bố của toàn bộ các allele thuộc
CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và các allele với chức năng đã biết của
CYP3A5 (*3, *5, *6 và *8) ở người Kinh Việt Nam sử dụng phương pháp
giải trình tự trực tiếp. Ngoài ra, luận án cũng tiến hành phân tích các CNV
của 4 gen nghiên cứu trên đối tượng người Kinh.
5
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Một trăm ba mươi sáu người Kinh khỏe mạnh và không có quan hệ
huyết thống tuổi từ 18-35 tình nguyện tham gia vào nghiên cứu (55 nam, 81
nữ.
2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
Các máy móc, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm phục vụ cho nghiên cứu
thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
Mẫu máu ngoại vi (2ml mỗi cá thể) được thu vào ống chứa máu EDTA
K2 và lưu giữ ở -200C cho đến khi sử dụng. DNA tổng số được tách chiết
bằng ExgeneTM Blood SV mini Kit (GeneAll, Hàn Quốc), sau đó kiểm tra
bằng điện di trên agrose 0,8% và đo nồng độ DNA.
2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số
2.3.3. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và
CYP3A5
Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho các vùng gen của CYP2C9,
CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 dùng trong nghiên cứu được thiết kế bằng
phần mềm Primer 3 (v.0.4.0) dựa trên trình tự gen tham chiếu của các gen
nói trên tại cơ sở dữ liệu NCBI. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết
kế, vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và các vùng biên của 3 gen
CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và các đoạn gen của CYP3A5 mang các biến
thể *3, *6, *8 và *9 được khuếch đại theo quy trình chuẩn. Tất cả các sản
phẩm sau khi PCR được tinh sạch bằng Multiscreen PCR 96 Filter Plate
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.4. Giải trình tự Sanger
Khuôn dùng cho phản ứng PCR này là sản phẩm PCR đặc hiệu đã tinh
sạch như nêu ở trên. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự, các đoạn
DNA được điện di mao quản trên máy giải trình tự ABI 3500 Genetic
Analyzer. Tín hiệu được ghi tự động, lưu trữ và phân tích trên máy tính.
2.3.5. Phương pháp MLPA
6
Các CNV của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 được
phân tích bằng phương pháp MLPA sử dụng bộ kit thương mại SALSA
MLPA P128-C1 Cytochrome P450 Probemix. Các đầu dò của bộ kit được
thiết kế đặc hiệu cho việc lai và khuếch đại một số exon của các 04 gen nói
trên. DNA được biến tính ở 98oC và lai với các đầu dò ở 60oC trong 16h.
Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 54oC và sau đó các đoạn đầu dò được
ghép nối tiếp tục được khuếch đại. Cuối cùng, các sản phẩm khuếch đại
được điện di mao quản nhằm phân tách các đoạn theo kích thước trên máy
giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer.
2.3.6. Long range (LR) PCR
Để xác định biến thể CYP2D6*5, phản ứng LR-PCR được thực hiện
với tổng thể tích là 25μl và sử dụng các cặp mồi được tham khảo từ nghiên
cứu trước đó. Tất cả các sản phẩm LR-PCR được điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%.
2.3.7. Real-time PCR
Số bản sao CYP2C9 của các mẫu được kiểm chứng lại bằng phương
pháp real-time PCR. Phản ứng real-time PCR được thực hiện sử dụng hóa
chất Luna Universal qPCR Master Mix (NEB). Các cặp mồi được thiết kế
nhằm định lượng số bản sao của CYP2C9 tại vị trí exon 4 và 7. Mẫu đối
chứng là mẫu mà trước đó được xác định là có số bản sao bình thường (2
bản sao CYP2C9) từ dữ liệu MLPA.
2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu
Phần mềm Bioedit được sử dụng để phân tích các kết quả giải trình tự
từ máy giải trình tự tự động. Trạng thái cân bằng quần thể Hardy-Weinberg
của mỗi biến thể được tiến hành thông qua phần mềm HAPLOVIEW.
Kiểm định khi bình phương (χ2) và Fisher exact trên Microsoft Excel
2010 được áp dụng để so sánh tần số allele của các gen trong nghiên cứu
với các quần thể khác trên thế giới.
2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới
Chức năng của các biến thể mới được dự đoán sử dụng các công cụ
như Polyphen-2, PROVEAN (cho các biến thể làm thay đổi amino acid),
Human Splicing Finder (cho các biến thể trong vùng intron) và MATCH
(cho các biến thể trong vùng promoter).
7
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số sau khi tách chiết từ máu ngoại vi được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose 0,8%. DNA tổng số thu được không bị đứt gẫy và
có độ tinh khiết cao, với nồng độ nằm trong khoảng từ 19,4 đến 139,6 ng/µl.
3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5
và giải trình tự
Nghiên cứu này đã tiến hành khuếch đại đặc hiệu thành công vùng
promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của 2 gen CYP2C9, CYP2C19 và các
đoạn gen CYP3A5 mang các biến thể *3, *6, *8 và *9 của tổng số 100 mẫu
nghiên cứu (40 nam, 60 nữ). Đối với gen CYP2D6, chúng tôi đã khuếch đại
đặc hiệu thành công vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của136
mẫu nghiên cứu (55 nam, 81 nữ). Các băng điện di có kích thước phù hợp
với tính toán lý thuyết và tất cả sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử
dụng cho các phản ứng giải trình tự tiếp theo.
3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và
CYP3A5 ở quần thể người Kinh Việt Nam
3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9
Đối với CYP2C9, nghiên cứu này đã xác định được tổng số 14 biến
thể. Đáng chú ý, có 6 biến thể mới của CYP2C9 chưa được công bố trên cả
3 cơ sở dữ liệu đa hình di truyền dược học, NCBI dbSNP và 1000 Genomes.
Những biến thể mới này bao gồm 4 thay đổi đơn nucleotide trong intron 2
(3415C>T), 6 (33622t>C, 38658A>G) và 7 (42801A>G), 01 biến thể xóa
nucleotide trong intron 8 (47543delT) và một biến thể thay thế đơn
nucleotide trong exon 7 (42627C>A) (Hình 3.6).
Khi tiến hành xác định các CNV của CYP2C9 bằng phương pháp
MLPA, có 3/100 mẫu nghiên cứu được xác định là mất 1 bản sao của gen
này. Kết quả MLPA được kiểm tra lại bằng real-time PCR cho thấy tương
đồng 100% ở 2 phương pháp này. Hiện tượng tăng số bản sao của CYP2C9
không được xác định trong tất cả 100 mẫu nghiên cứu.
8
Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9
Các biến thể mới được xác định trong vùng từ intron 2 đến intron 8 của CYP2C9, bao
gồm 5 biến thể mới trong intron và 1 biến thể mới trong exon 7. a) 3415C>T (intron
2), b) 33622T>C (intron 6), c) 38658A>G (intron 6), e) 42801A>G (intron 7), f)
47543delT (intron 8), và d) 42627C>A (exon 7). Vị trí nucleotide bị thay đổi được
đánh dấu bằng mũi tên.
Từ các số liệu thu được, nghiên cứu này xác định được 3 kiểu gen của
CYP2C9 trong 100 mẫu nghiên cứu (Bảng 3.3). Trong đó, kiểu gen chiếm
tần số lớn nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 (90%) có hoạt tính
enzyme bình thường. Hai kiểu gen ít phổ biến hơn là dị hợp tử
CYP2C9*1/*3 (7%) có hoạt tính enzyme giảm (chuyển hóa thuốc trung
bình) và CYP2C9*1/Del (mất 1 allele) với hoạt tính enzyme chưa rõ. Từ đó,
tổng số có 3 allele của CYP2C9 đã được xác định trong nghiên cứu này là
9
CYP2C9*1, CYP2C9*3 và CYP2C9Del (Bảng 3.4). Trong đó, *1 là allele
kiểu dại và chiếm tỉ lệ cao nhất trong quần thể với 95%, *3 chiếm tỉ lệ thấp
hơn với 3,5% và tỉ lệ thấp nhất là Del với 1,5%.
Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam
Kiểu gen
Kiểu hình
chuyển hóa thuốc
(Theo CPIC)
Tổng số
(N=100)
Tần số
(%)
*1/*1 EM 90 90
*1/*3 IM 7 7
*1/Del - 3 3
N: tổng số mẫu nghiên cứu
Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam
n: tổng số allele trong quần thể
3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19
Đối với CYP2C19, tổng số 14 biến thể đã được xác định trong trong
số 100 mẫu nghiên cứu. Các biến thể mới bao gồm 12637C>G (intron 2),
57637delG (intron 5) và 90008C> (intron 8) (Hình 3.9). Có 6 kiểu gen của
CYP2C19 được xác định với tỉ lệ dao động từ 1%-58% (Bảng 3.7). Kiểu gen
phổ biến nhất là CYP2C19*1/*1 (58%) và dị hợp tử CYP2C19*1/*2 (32%).
Kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2/*3 chiếm tỉ lệ thấp nhất với 1%. Tổng số
có 4 allele của CYP2C19 đã được tìm thấy trong số 100 mẫu nghiên cứu bao
gồm: CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 (Bảng 3.8).
Allele kiểu dại CYP2C19*1 chiếm tần số cao nhất với 76% trong số các mẫu
nghiên cứu. Trong khi đó, các allele còn lại là CYP2C19*2, CYP2C19*3 và
CYP2C19*17 lần lượt chiếm tỉ lệ 20,5%, 2,5% và 1%. Phân tích MLPA cho
Allele Tổng số (n=200) Tần số (%)
*1 190 95
*3 7 3,5
Del 3 1,5
10
thấy không có CNV nào của CYP2C19 được xác định ở 100 mẫu nghiên
cứu.
Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19.
Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19:
a) biến thể 2637C>G (intron 2), b) biến thể 57637delG (intron 5) và c) biến thể
90008C>T (intron 8-sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị
biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên.
Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam
Kiểu gen Tổng số Kiểu hình chuyển hóa thuốc
(Theo CPIC)
Tần số (%)
(N=100)
*1/*1 58 EM 58
*1/*2 32 IM 32
*1/*3 4 IM 4
*2/*2 3 PM 3
*2/*3 1 PM 1
*2/*17 2 IM 2
N: Tổng số mẫu nghiên cứu
11
Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt
Nam
Allele Tổng số Tần số % (n=200)
*1 154 76
*2 41 20,5
*3 5 2,5
*17 2 1
n: tổng số allele trong quần thể
3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6
Phương pháp giải trình tự đã xác định được tổng số 30 biến thể trong
136 mẫu nghiên cứu, trong đó có 7 biến thể mới. Các biến thể mới bao gồm
3 biến thể trong vùng promoter (-498C>A, -184A>T, -175A>T) (Hình
3.10), 2 biến thể trong intron 4 và 6 (2137G>C, 2988G>A) và 2 biến thể
trong exon 7 và exon 8 (3157G>T, 3851G>A) (Hình 3.11).
Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6
Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng promoter (sử dụng mồi
ngược cho giải trìn tự): a) biến thể -175A>T, b) biến thể -184A>T, c) biến thể -
498C>A. Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể
12
trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử, riêng biến thể -498C>A được xác định
cả ở trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử.
Hình 3.11. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2D6
Nghiên cứu này xác định được 2 biến thể mới trong intron và 2 biến thể mới trong
exon của CYP2D6: a) biến thể 2137G>C (intron 4), b) biến thể 2988G>A (intron 6),
c) biến thể 3157G>T (exon 7), d) biến thể 3851G>A (exon 8- sử dụng mồi ngược cho
giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến
thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử.
Kết quả phân tích số bản sao bằng MLPA cho thấy có 12 kiểu tập hợp
số bản sao của CYP2D6. Một số mẫu cho thấy bị mất 1 bản sao của CYP2D6
được kiểm tra lại ngẫu nhiên bằng LR-PCR và kết quả phù hợp 100% với
dữ liệu thu được từ MLPA (Hình 3.15). Ngoài ra, không có mẫu nào trong
số 136 mẫu nghiên cứu xuất hiện biến thể tăng số bản sao của CYP2D6.
13
a)
b)
Hình.3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5.
a) Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng cho LR-PCR tương ứng với các allele CYP2D6*1
và CYP2D6*5. Đột biến mất 1 allele CYP2D6 sẽ tạo sản phẩm là 2 đoạn có kích
thước 3,2kb-allele *5 (cặp mồi Dup và Dlow) và 5,1kb-allele kiểu dại *1(cặp mồi
DPKup và DPKlow). Các mẫu đồng hợp tử kiểu dại chỉ xuất hiện 1 sản phẩm có
kích thước 5,1kb. b) Giếng 1: Thang DNA chuẩn, giếng 2-3: các mẫu đồng hợp tử
kiểu dại CYP2D6*1/*1, giếng 4-5: các mẫu mất 1 bản sao CYP2D6 có kiểu gen dị
hợp tử CYP2D6*1/*5.
Các dữ liệu thu được từ giải trình tự và phân tích số bản sao bằng
MLPA được kết hợp để đưa ra kiểu gen cuối cùng ở mỗi mẫu nghiên cứu.
Trong số 136 mẫu nghiên cứu, có 29 kiểu gen khác nhau đã được xác định
với tần số dao động từ 0,7% đến 22,8%. Trong số đó, những kiểu gen chiếm
tỉ lệ nhiều nhất đó là CYP2D6*10/*10 (22,8%), tiếp theo là dị hợp tử
CYP2D6*1/*10 (15,4%) và CYP2D6*10/*36-*10 (11%).
Từ số liệu về kiểu gen của136 mẫu Kinh, nghiên cứu đã xác định được 9 kiểu allele CYP2D6 đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar
(75,37%), 8 biến thể cấu trúc (Structual vriant-SV) (3 biến thể dạng hybrid,
5 biến thể dạng tandem arrangements) trên locus CYP2D6 (16,54%) và 01
CNV (mất 1 allele) của gen này (8,09%) (Bảng 3.11).
Trong số 9 kiểu allele của CYP2D6, allele CYP2D6*10 (gây giảm chức
năng của enzyme) chiếm tỉ lệ cao nhất là 43,75%, trong khi đó các allele
14
CYP2D6*1 và *2 (kiểu hình bình thường) lần lượt chiếm tỉ lệ là 18,75% và
7,35%. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng xác định được 5 allele không chức
năng của CYP2D6 chiếm tỉ lệ từ 0,37% đến 8,09% (*4, *5, *14, *15 và *36).
Bên cạnh đó, có 3 allele với chức năng chưa rõ cũng được xác định đó là
*60 (0,74%), *65 (2,94%) và *86 (0,37%). Trong số những biến thể dạng
tandem rearrangements, CYP2D6*36-*10 là biến thể chiếm tỉ lệ lớn nhất
(12,13%).
Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam
Loại biến thể/Allele STT Biến
thể/Allele
Tần số (%) Chức năng
(Theo CPIC)
SNP/indel
1 *1 18,75 Bình thường
2 *2 7,35 Bình thường
3 *4 0,74 Không
4 *10 43,75 Giảm
5 *14 0,37 Không
6 *15 0,37 Không
7 *60 0,74 Chưa biết
8 *65 2,94 Chưa biết
9 *86 0,37 Chưa biết
Cấu trúc
(SV)
CNV 1 *5 8,09 Không
Hybrid
2 *13 1,547 Không
3 *36 0,37 Không
4 *67 0,37 Chưa biết
Tandem
arrangements
5 *13-*1 0,74 Bình thường
6 *13-*2 0,74 Bình thường
7 *36-*36-*10 0,37 Giảm
8 *36-*10 12,13 Giảm
9 *68-*4 0,37 Không
15
Chi tiết của các biến thể SV của CYP2D6 trong nghiên cứu này được
thể hiện trong Hình 3.16.
Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh
a) Locus gen tham chiếu CYP2D6 (màu đỏ) và các gen giả CYP2D7 (màu xanh) và
CYP2D8 (màu ghi). REP6 (màu tím) và REP7 (màu đen) là các trình tự lặp lại nằm xuôi
chiều CYP2D6 và CYP2D7. b) Đột biến mất toàn bộ CYP2D6. c) Các cấu trúc lai của
CYP2D6 bao gồm các dạng lai CYP2D6-2D7 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D6 và vùng
3’ có nguồn gốc từ CYP2D7) và CYP2D7-2D6 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D7 và vùng
3’ có nguồn gốc từ CYP2D6). d) Biến thể về sắp xếp của CYP2D6, biến thể dạng này bao
gồm 2 hoặc nhiều hơn 2 bản sao của CYP2D6 nằm cạnh nhau trên cùng 1 allele và các bản
sao này không giống nhau. Biến thể dạng này được phân biệt với loại biến thể tăng số
lượng bản sao của CYP2D6 là duplication và multiplication. #Thông tin chi tiết về các SV
của CYP2D6 được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar
(https://www.pharmvar.org/gene/CYP2D6). ∆Chi tiết của các SV này được báo cáo trong
nghiên cứu của Gaedik và cộng sự.
16
3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5
Kết quả nghiên cứu không xác định được sự tồn tại của CYP3A5*6, *8
và *9 trên các mẫu nghiên cứu. Đối với biến thể CYP3A5*3, kết quả giải
trình tự 100 mẫu nghiên cứu xác định được sự tồn tại của allele này ở trạng
thái dị hợp tử *1/*3 và đồng hợp tử *3/*3 (Hình 3.17). Cụ thể, có 90% số
người trong nghiên cứu mang ít nhất một allele CYP3A5*3 (*1/*3 và *3/*3,
N=90) trong khi đó chỉ 10% số người mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại
CYP3A5*1/*1.
Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3.
a) Đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5 *1/*1 (AA), b) Dị hợp tử CYP3A5 *1/*3 (AG), c) Đồng
hợp tử đột biến CYP3A5 *3/*3 (GG). Vị trí nucleotide bị biến đổi đánh dấu bằng mũi tên.
Tần số allele kiểu dại CYP3A5*1 được xác định là 32,5% còn tần số
allele CYP3A5*3 (6986A>G) là 67,5% (Bảng 3.12). Với tần số kiểu gen và
allele như vậy, quần thể nghiên cứu xấp xỉ đạt trạng thái cân bằng Hardy-
Weinberg (p=0,9677).
Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt
Nam
Tần số Kiểu gen (N=100) Allele (n=200)
*1/*1 *1/*3 *3/*3 *1 *3
Nghiên cứu này 10
(10%)
45
(45%)
45
(45%)
65
(32,5%)
135
(67,5%) Hardy-Weinberg 10,56% 43,88% 45,56%
p= 0,9677
N: Tổng số mẫu nghiên cứu, n: Tổng số allele của quần thể nghiên cứu
17
Phân tích MLPA cho thấy không có biến thể số bản sao nào của
CYP3A5 được xác định ở 100 mẫu nghiên cứu. Tất cả các mẫu nghiên cứu
đều cho tỉ lệ của các đầu dò sau chuẩn hóa nằm trong khoảng 0,8-1,2.
3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và
CYP2D6
Phân tích liên kết các biến thể (Linkage disequilibrium-LD) được tiến
hành nhằm xác định mối liên hệ giữa các SNP sử dụng phần mềm
Haploview 4.2 và giá trị D’. Đối với các biến thể của CYP2C9, phân tích
Haploview cho thấy có 2 block thể hiện 2 nhóm liên kết. Những marker
trong 2 block này không thể hiện độ liên kết chặt chẽ với giá trị LOD<2 và
D’=1 (hiển thị bằng màu xanh nhạt). Đối với CYP2C19, chúng tôi xác định
được 1 LD block từ những dữ liệu giải trình tự của gen này. Block này kéo
dài 87kb từ vị trí -98 trong vùng promoter (marker -98T>C) đến 87106 ở
intron 7 (marker 87106T>C). Đối với CYP2D6, Nghiên cứu này đã xác định
được 1 LD block kéo dài từ vị trí 214 ở intron 1 (marker 214G>C) đến vị trí
245 ở intron 1 (marker 245G>C). Các marker trong block này có mối liên
kết chặt với LOD # 2 và D’=1.
3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên
CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6
*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C9
Đối với gen CYP2C9, 2 mô hình HumDiv và HumVar của Polyphen-
2 đều đưa ra kết quả dự đoán chức năng của biến thể 42627C>A
(p.Pro363His) có khả năng gây hại đến protein được mã hóa với Score = 1.
Tương tự, công cụ PROVEAN cũng cho thấy sự kiện thay thế proline bằng
histidin tại vị trí 363 trên chuỗi polypeptide có khả năng gây hại đến protein
này với Score = -8.373 (Hình 3.21). Khi tiến hành so sánh trình tự amino
acid trên các loài động vật có xương sống, dữ liệu đưa ra cho thấy vị trí
amino acid 363-Proline trên CYP2C9 có tính bảo thủ cao giữa các loài (Hình
3.22).
Phân tích bằng Human Splicing Finder cho thấy cả 5 biến thể mới trong
intron của CYP2C9 đều không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cắt nối tự nhiên
của mRNA.
18
Hình 3.21. Dự đoán chức năng biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen
2 (a) và PROVEAN (b)
Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9
Vị trí amino acid Proline 363 trên CYP2C9 được đánh dấu với nét đứt màu đỏ.
*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C19
Đối với các biến thể mới của CYP2C19, dự đoán bằng Human Splicing
Finder cho thấy cả 3 biến thể mới trong intron của CYP2C19 đều không làm
thay đổi mô hình cắt nối tự nhiên của mRNA của gen này.
*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2D6
Để đánh giá ảnh hưởng lên quá trình điều hòa phiên mã của 3 biến thể
mới này, công cụ MATCH được sử dụng để phân tích vùng trình tự mang
các biến thể -498C>A, -184A>T và -175A>T. Tuy nhiên, kết quả phân tích
cho thấy những biến thể này không nằm ở những vị trí kết hợp với các yếu
tố phiên mã trong promoter của CYP2D6.
19
Đối với gen CYP2D6, biến thể 3157G>T (exon 7) làm thay thế amino
acid arginin thành leucine tại vị trí 329 (p.Arg329Leu). Phân tích bằng
Polyphen-2 cho kết quả là thay thế này không gây ảnh hưởng đến chức năng
của protein được mã hóa (Hình 3.23a). Ngược lại, phân tích bằng
PROVEAN lại chỉ ra rằng biến thể này có gây hại với score = -4.236 (Hình
3.23b). Khi tiến hành kiểm tra tính bảo thủ của amino acid Arginine tại vị trí
329 trên CYP2D6, dữ liệu cho thấy amino acid tại này có tính bảo thủ cao giữa
các loài (Hình 3.24).
Đối với các biến thể mới trong intron, kết quả phân tích cho thấy biến thể
2988G>A (intron 6) có khả năng làm thay đổi mô hình cắt nối tự nhiên của
mRNA CYP2D6 do ảnh hưởng đến trình tự nhánh (branch points) (Hình
3.23c). Trong khi đó, biến thể 2137G>C (intron 4) được dự đoán là không gây
ảnh hưởng đến cắt nối mRNA.
Hình 3.23. Dự đoán chức năng của các biến thể 3157G>T và
2988G>A thuộc CYP2D6 a)Dự đoán chức năng của biến thể 3157G>T bằng Polyphen-2, b) Dự đoán chức năng
của biến thể 3157G>T bằng PROVEAN, c) Dự đoán ảnh hưởng tới phân cắt mRNA
của biến thể 2988G>A trong intron 6.
Hình 3.24. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Arginine 329 trên protein
CYP2D6 Vị trí Arginine 329 trên CYP2D6 được đánh dấu với nét đứt màu đỏ.
20
3.6. So sánh tần số allele của các gen nghiên cứu giữa quần thể người
Kinh Việt Nam với các quần thể người khác trên thế giới
Đối với gen CYP2C9, tần số CYP2C9*3 ở quần thể nghiên cứu có sự
tương đồng khi so sánh với các quần thể ở khu vực châu Á và người Mĩ-
Phi. Tuy nhiên, tần số allele này ở quần thể người Kinh Việt Nam có sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê so với khu vực Nam Á (p<0,05) và Tây Á (p<0,001)
cũng như khu vực Châu Âu (p<0,001).
Đối với gen CYP2C19, đối với allele CYP2C19*2, tần số allele này ở
quần thể nghiên cứu cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các quần thể khác
ở khu vực Tây Á và khu vực châu Âu. Trong khi đó tần số CYP2C19*3
trong quần thể nghiên cứu thấp hơn Nhật Bản và Hàn Quốc nhưng cao hơn
khu vực Nam Á, Tây Á và Châu Âu. Đối với allele CYP2C19*17, tần số
allele này trong quần thể nghiên cứu thấp hơn có ý nghĩa thống kê khi so
sánh với khu vực châu Âu và người Mĩ-Phi (p<0,001).
Đối với gen CYP2D6, trong số những allele không chức năng thì
CYP2D6*4 có tần số thấp hơn các quần thể ở khu vực châu Âu và châu Phi
(p<0,0001). Trong khu vực châu Á, allele CYP2D6*5 có tần số tương đương
giữa các nước trừ Thái Lan (p<0,05). Tần số của các allele khác không có
hoạt tính enzyme (*13, *14 và *15) không thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
giữa các quần thể trên thế giới bao gồm cả quần thể trong nghiên cứu này.
Trong số các biến thể gây giảm hoạt tính enzyme thì CYP2D6*10 trong
nghiên cứu này có tần số cao hơn hẳn so với khu vực châu Âu và châu Phi
(p<0,001) cũng như các khu vực khác trên thế giới.
Đối với gen CYP3A5, tần số biến thể CYP3A5*3 ở quần thể người
Kinh trong nghiên cứu này (67,5%) thấp hơn so với các quần thể người da
trắng (p<0,0001) và cao hơn so với các quần thể người da đen (p<0,0001).
Trong khu vực châu Á, tỷ lệ này không khác biệt nhiều với tần số allele
CYP3A5*3 trung bình của người Nam Á (p>0,05) và Đông Á (p>0,05)
nhưng lại thấp hơn rõ rệt so với khu vực Tây Á (p<0,0001) và người da trắng
(p< 0,0001).
3.7. Thảo luận
3.7.1. Sự phân bố của các biến thể dạng SNP gây ảnh hưởng chức năng
protein CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở các quần thể người
trên thế giới
21
Đối với gen CYP2C9, kết quả thu được của nghiên cứu này tương đồng
với những công bố trước đây trên các quần thể người châu Á, trong đó
CYP2C9*3 là biến thể phổ biến nhất ở các quần thể khu vực này. Đối với
CYP2C19, sau allele kiểu dại thì allele CYP2C19*2 là allele xuất hiện với
tần số cao nhất trong quần thể nghiên cứu, điều này cũng tương tự như
những báo cáo trước đây về đa hình CYP2C19 ở người Kinh Việt Nam và
các quần thể khác thuộc châu Á. Sự khác biệt trong phân bố của biến thể
của CYP2C9 và CYP2C19 giữa các vùng khác nhau ở Châu Á và trên thế
giới có thể được giải thích bằng sư khac biêt vê phân bô đia ly.
Đối với gen CYP2D6, nghiên cứu này một lần nữa khẳng định các
quần thể khu vực châu Á có đặc trưng bởi tần số cao của allele CYP2D6*10
so với các khu vực khác trên thế giới. Ngược lại, các quần thể khu vực châu
Âu, châu Phi và Trung Đông lại có tần số allele CYP2D6*4 cao hơn có ý
nghĩa thống kê. Những báo cáo trước đây cũng cho thấy xu thế giảm dần tần
số của allele CYP2D6*4 từ khu vực châu Âu sang châu Á. Những số liệu
thu được về tần số các allele CYP2D6 cũng giải thích phần nào sự xuất hiện
phổ biến của kiểu hình chuyển hóa thuốc IM ở người châu Á nói chung và
người Kinh Việt Nam nói riêng.
Đối với gen CYP3A5, allele CYP3A5*3 là allele xuất hiện với tần số
rất cao ở các quần thể người da trắng và khu vực Tây Á (80-98%), thấp nhất
ở người da đen như Mỹ-Phi, Nam Phi, Nigeria (14,5-27%). Áp lực chọn lọc
khác nhau ở mỗi khu vực địa lý lên mỗi biến thể di truyền cũng có thể là
nguyên nhân dẫn tới sự đa dạng trong phân bố của các biến thể này.
3.7.2. Phân tich liên kêt giưa cac biên thê va y nghia trong nghiên cưu đa
dang di truyên cac gen CYP450
Xuât phat tư y nghia cua phân tich liên kêt biên thê đo la xac đinh môi
liên kêt không ngâu nhiên cua cac biên thê thuôc cac locus khac nhau cua
môt gen. Nêu xac đinh đươc môi liên kêt giưa môt sô biên thê thi co thê suy
ra đươc cac biên thê năm trong khôi liên kêt chăt đo se co xu hương di truyên
cung nhau. Trong pham vi nghiên cưu đa hinh di truyên cua cac gen
CYP450, sư xuât hiên biên thê mơi ma đươc dư đoan gây anh hương tiêu
cưc đên chưc năng cua protein se co nhiêu y nghia nêu phat hiên đươc biên
thê đo năm trong môi liên kêt chăt vơi môt biên thê khac-không gây hai đa
biêt. Điêu nay co y nghia trong viêc phat hiên allele thưc sư la nguyên nhân
gây nên thay đôi hoat tinh cua enzyme đươc ma hoa. Phân tich liên kêt 14
22
biên thê cua CYP2C9 co 2 block đươc xac đinh lân lươt co kich thươc la 5
kb va 32 kb. Tuy nhiên cac SNP trong ca 2 block nay đêu liên kêt vơi nhau
không chăt che. Đôi vơi gen CYP2C19 va CYP2D6 thi chi xac đinh đươc 1
khôi liên kêt duy nhât (87 kb va khoang 31 bp). Chưa xac đinh đươc môi
liên kêt chăt nao giưa cac SNP cua 2 gen nay vơi cac SNP con lai.
3.7.3. Vai trò của các CNV và SV của các gen nghiên cứu trong đa dạng
đáp ứng thuốc cá nhân.
Đối với gen CYP2C9, nghiên cứu này lần đầu tiên xác định được sự
có mặt của biến thể mang 1 bản sao gen này trên người Kinh Việt Nam
(3/100 mẫu). Đối với gen CYP2D6, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam
và trên thế giới kết hợp phương pháp giải trình tự và MLPA để xác định tất
cả các biến thể của gen này ở quần thể người Kinh Việt Nam. Trong nghiên
cứu này, hơn 50% (40/76) kiểu gen CYP2D6 có mang allele *10 đã được
xác định lại là kiểu gen có chứa cấu trúc lai (*13, *36 và *67) và tandem
arragements (*36-*10, *36-*36-*10 và *68-*4) sau khi tiếp tục phân tích
CNV bằng phương pháp MLPA. Hơn nữa, có 22/136 cá thể mang các allele
*5, *13-*1 và *13-*2, đây là những allele chỉ có thể xác định được sau khi
phân tích kết quả MLPA kết hợp với giải trình tự. Ngoài ra, không có CNV
nào của CYP2C19 và CYP3A5 được xác định trong 100 mẫu người Kinh.
Tổng hợp kết quả phân tích biến thể số bản sao của 4 gen CYP450 cho thấy
CYP2D6 là gen có số lượng CNV xuất hiện nhiều nhất trong quần thể người
Kinh. Bởi vậy, khi tiến hành nghiên cứu về đa dạng di truyền của CYP2D6,
bên cạnh các biến thể dạng SNP hay indel thì nên cân nhắc sử dụng các
phương pháp phù hợp để không bỏ sót các CNV của gen này. Có thể thấy,
các CNV của các gen dược học mã hóa cho 3 enzyme CYP2C9, CYP2C19,
CYP3A5 đóng vai trò không đáng kể trong những khác biệt đáp ứng thuốc.
3.7.4. Vai trò của các biến thể mới của CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6
đối với chức năng của các protein tương ứng
Biến thể mới phát hiện trong exon 7 (42627C>A) của CYP2C9 là đột
biến sai nghĩa làm thay đổi amino acid tại vị trí 363 (p.Pro363His). Kết quả
dự đoán chức năng bằng các phần mềm chuyên dụng như Polyphen-2 và
PROVEAN đều cho thấy sự thay đổi amino acid này gây hại đến protein
tương ứng. Đối với CYP2D6, cả 2 biến thể mới nằm trong vùng mã hóa đều
có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein tương ứng. Cụ thể là biến thể
3851G>A (p.Trp358X) trong exon 8 sẽ tạo mã kết thúc sớm và sản phẩm
23
protein được tạo ra ngắn hơn bình thường, biến thể 3157G>T
(p.Arg329Leu) trong exon 7 qua phân tích bằng PROVEAN cho thấy có khả
năng gây hại cho protein tương ứng. Như vậy, chức năng của các biến thể
mới làm thay đổi amino acid trên CYP2C9, CYP2D6 cần được phân tích
trong các nghiên cứu sâu hơn.
3.7.5. Ý nghĩa của việc sử dụng thông tin di truyền các gen CYP450 tham
gia chuyển hóa thuốc trong tối ưu hiệu quả dùng thuốc trên người Kinh
Việt Nam
Sự đa dạng trong phân bố các allele của các gen CYP450 ở các quần
thể thuộc các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới có thể đóng góp vào
quá trình tối ưu hiệu quả sử dụng thuốc trong lâm sàng.
Cụ thể, kiểu gen CYP2C9*1/*3 (chiếm 7% trong 100 mẫu nghiên cứu)
có kiểu hình chuyển hóa thuốc trung bình (IM), đây là kiểu hình nên lưu ý
chỉ sử dụng 65% liều warfarin so với liều thông thường. Như vậy việc sàng
lọc di truyền liên quan đến allele CYP2C9*3 cần được lưu ý trước khi tiến
hành kê đơn thuốc cũng như quyết định liều thuốc sẽ sử dụng cho bệnh nhân
Việt Nam khi sử dụng các loại thuốc được chuyển hóa bởi enzyme này.
Riêng đối với clopidogrel (được chuyển hóa bởi CYP2C19), hiệp hội CPIC
đã có khuyến cáo đối với những bệnh nhân sử dụng clopidogrel mà có kiểu
hình chuyển hóa thuốc dạng IM và PM nên chuyển sang loại thuốc chống
kết tập tiểu cầu khác. Trong nghiên cứu này, 38% số mẫu có kiểu hình
chuyển hóa thuốc IM (*1/*2, *1/*3, *2/*17) và 4% số mẫu có xuất hiện kiểu
hình PM (*2/*2, *2/*3), có thể thấy đối với người Kinh Việt Nam thì nên
có sự cân nhắc khi sử dụng clopidogrel do có nguy cơ gặp phải thất bại trong
điều trị. Codein (được chuyển hóa bởi enzyme CYP2D6) là một loại thuốc
giảm đau thuộc nhóm opioid được sử dụng để điều trị các cơn đau từ nhẹ
đến vừa phải. Kiểu hình chuyển hóa thuốc yếu (PM) và cực nhanh (UM) là
những kiểu hình được CPIC lưu ý tránh sử dụng codein trong giảm đau. Với
tần số kiểu hình PM (1,4%) và UM (0%) thì có thể thấy người Kinh Việt
Nam nên dùng codeine với liều thông thường mà không cần cân nhắc đến
loại thuốc giảm đau khác. Tuy nhiên trên thực tế, CPIC đưa ra chỉ dẫn cho
kiểu hình IM khi sử dụng codein mà không có đáp ứng thuốc là cần thay thế
codein bằng morphine hoặc các thuốc giảm đau không opioid, đây cũng là
kiểu hình chuyển hóa thuốc chiếm tỉ lệ cao nhất trong số 136 mẫu nghiên
cứu (53,5%).
24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1.Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đa hình di truyền cho các gen
CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 (100 mẫu) và CYP2D6 (136 mẫu) ở người
Kinh sử dụng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp và phân tích số bản
sao bằng MLPA.
2.Đã xác định được thành phần kiểu gen, tần số allele và các biến thể
mới của 4 gen như sau: 3 kiểu gen, 3 allele và 6 biến thể mới của gen
CYP2C9; 6 kiểu gen, 4 allele và 3 biến thể mới của gen CYP2C19, 29 kiểu
gen, 18 allele và 7 biến thể mới của gen CYP2D6; 3 kiểu gen và 2 allele của
gen CYP3A5.
Kiến nghị
Từ những kết quả đạt được, chúng tôi xin đưa ra kiến nghị như sau:
1. Nên cân nhắc sàng lọc đối với các biến thể di truyền đã biết gây ảnh
hưởng tới hoạt tính enzyme thuộc các gen: CYP2C9 (*3), CYP2C19 (*2, *3,
*17), CYP2D6 (*5, *10, *13, *36-*10) và CYP3A5 (*3). Với tầm quan trọng
của đa hình di truyền các gen CYP450 trong đáp ứng thuốc cá nhân, cần tiến
hành những nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình
đáp ứng thuốc trên người Việt Nam.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Xác định được một số biến thể mới trong promoter và intron của các
gen CYP450, cụ thể: 5 biến thể mới trong in tron của CYP2C9, 3 biến thể
mới trong intron của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể
mới trong intron của CYP2D6và 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của 2
gen CYP2C9 và CYP2D6. Đã phân tích in silico cho thấy những biến thể
này gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein.
Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-
*10 đã được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm
giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là:
8,09%, 43,75%, 1,547% và 12,13%.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
CỦA TÁC GIẢ
1. Nhung Phuong Vu, Thuong Thi Huyen Ma, Ngoc Thi Bich Tran, Hue
Thi Thu Huynh, Ton Dang Nguyen, Duong Thuy Nguyen, Hai Van Nong,
Ha Hai Nguyen. Polymorphic analysis of CYP2C9 gene in Vietnamese
population. Molecular Biology Reports, 45(5):893-900 (2018).
2. Ha Hai Nguyen, Thuong Thi Huyen Ma, Nhung Phuong Vu, Quynh
Bach Thi Nhu, Thang Hong Vu, Ton Dang Nguyen, Hai Van Nong. Single
nucleotide and structural variants of CYP2D6 gene in Kinh Vietnamese
population. Medicine, 98(22):e15891 (2019).
3. Nhung Phuong Vu, Hoa Thi Thanh Nguyen, Ngoc Thi Bich Tran, Ton
Dang Nguyen, Hue Thi Thu Huynh, Xuan Thi Nguyen, Duong Thuy
Nguyen, Hai Van Nong, Ha Hai Nguyen. CYP2C19 genetic polymorphism
in the Vietnamese population. Annals of Human Biology, 46(6):491-497
(2019).
4. Vũ Phương Nhung, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Hải Hà. Nghiên cứu đa
hình gen CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam. Tạp chí Sinh học, 42(1): 111-
123 (2020).
5. Vũ Phương Nhung, Nguyễn Đăng Tôn, Nông Văn Hải, Nguyễn Hải
Hà. Đa dạng di truyền một số gen dược học. Tạp chí Công nghệ sinh học
18(3): 393-416 (2020).