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VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL
ACUEDUCTO DE ZIPAQUIRA
AUTORES: SANDRA CAROLINA ALFARO GARZON
MARIA XIMENA ROJAS SANCHEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de Microbióloga
Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA, D.C
2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
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VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL
ACUEDUCTO DE ZIPAQUIRA
AUTORES: SANDRA CAROLINA ALFARO GARZON
MARIA XIMENA ROJAS SANCHEZ
APROBADO
DIRECTORA CODIRECTORA ________________________ ______________________ GLORIA MARITZA BERNAL JANETH ARIAS PALACIOS QUIMICA INDUSTRIAL BACTERIOLOGA M.sc
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VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Y SUSTRATO
DEFINIDO READYCULT, PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y ESCHERICHIA COLI EN AGUAS CRUDAS, TRATADAS Y POTABLES EN EL
ACUEDUCTO DE ZIPAQUIRA
AUTORES: SANDRA CAROLINA ALFARO GARZON
MARIA XIMENA ROJAS SANCHEZ
APROBADO
________________________ ______________________ Angela Umaña. M. Phil. David Gómez
Decana Académica Director de la carrera Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
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Le doy gracias a Dios por permitirme cumplir mi sueño y hacer de este día una realidad.
A mi Mami por apoyarme siempre y por permitirme llegar hasta aquí porque nada seria
posible sin tu esfuerzo y dedicación, a mis abuelos que son también mis padres por ser
mi fortaleza en los días difíciles y por enseñarme a ser, valiente pero sobre todo por su
amor; a mi hermano porque siempre será el mayor de los ejemplos pero sobre todo por
ser mi amigo, a Mauro porque se robo mi amor y mi corazón y siempre creyó en mi y a
mi mejor amiga Ximena por acompañarme en mi sueño y poderlo alcanzar juntas.
Carolina
Le doy gracias a Dios por haber culminado esta importante etapa de mi vida y por
convertir este sueño en realidad. A mis padres, ya que sin su apoyo esto seria solo eso,
un sueño. A mi hermana, que con su ingenio y creatividad se ha convertido en un a
ejemplo a seguir. A Sandris, por lograr juntas llegar hasta el final de este sueño y por su
apoyo incondicional. Al Gordo porque estuvo siempre conmigo y fue mi apoyo a lo largo
de etapa. A Ernesto por transmitirme esa motivación y su continua búsqueda de
mejorar. A Lucecita por su interés de superación y su amor ilimitado. A mis amigas
Sandris, Caro, Aleja y Andreita porque aprendí con ustedes y de ustedes.
Ximena
Finalmente agradecemos Al Acueducto de Zipaquirá por permitirnos llevar a cabo este
trabajo, pero sobre todo a la Doctora Maritza Bernal quien nos apoyo siempre y creyó en
nosotras así como a la Universidad, en especial a Janeth Arias y a cada uno de los
profesores por permitirnos crecer como personas, pero sobre todo por hacer de nosotras
las mejores profesionales.
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
INDICE DE TABLAS Tabla 1. Comparación de Coliformes totales y E.coli 28 Tabla 2. Determinación del límite de detección para filtración
por membrana y limite de cuantificación para sustrato definido
Readycult utilizando E.coli. 32
Tabla 3. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente
de variación para E. coli en filtración por membrana 33
Tabla 4. Porcentaje de Presencia y disminución según diluciones
para A/P en E.coli. 33
Tabla 5. Resultados del limite de cuantificación para las pruebas de
filtración por membrana y limite de detección Ausencia / Presencia
Readycult para Klebsiella pneumoniae 34
Tabla 6. Porcentaje de disminución en filtración por membrana
para Klebsiella pneumoniae. 35
Tabla 7. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de
variación para Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana 36
Tabla 8. Resultados del limite de cuantificación para las pruebas
de filtración por membrana y limite de detección Ausencia / Presencia
Readycult para Citrobacter freundii 36
Tabla 9. Porcentaje de disminución y porcentaje de presencia en
filtración por membrana para Klebsiella pneumoniae 37
Tabla 10.Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente
de variación para Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana 37
Tabla11. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana
y sustrato definido Readycult (A/P) para E.coli 38 Tabla12. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana
y sustrato definido Readycult (A/P) para Klebsiella pneumoniae 38
Tabla 13. Sensibilidad para los métodos de Filtración por
membrana y sustrato definido Readycult (A/P) para Citrobacter
freundii 39
Tabla 14. Replicas de repetibilidad, porcentaje de variación
intramuestra y variación con el Stock 39
Tabla 15. Repetibilidad, desviación estándar y coeficiente de variación 40
Tabla 16. Reproducibilidad en función de la temperatura y el tiempo
de incubación para el método de filtración por membrana. 41
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Tabla 17. Robustez según la temperatura y el tiempo de
incubación para el método de filtración por membrana. 43
Tabla 18. Promedio temperaturas de incubación, desviación
estándar y coeficiente de variación para filtración por membrana. 43
Tabla 19. Promedio horas de incubación, desviación estándar
y coeficiente de variación para filtración por membrana. 43
Tabla 20. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según
temperatura de incubación. 45
Tabla 21. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según
tiempo de incubación 45
Tabla 22. Pruebas de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult (ausencia/presencia) para aguas potables 46
Tabla 23. Comparación de los métodos de filtración por membrana
y Readycult ausencia/presencia (A/P) en la Planta Galán (PGT)
y en la planta del alto del Águila (PAA) para aguas tratadas
no potables. 48
Tabla 24. Comparación de los métodos de filtración por membrana
y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Regional
para aguas tratadas no potables. 48
Tabla 25. Comparación de los métodos de filtración por
membrana y Readycult ausencia/presencia (A/P) en las fuentes
de agua cruda 49
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INDICE DE GRAFICAS
Grafica 1. Filtración de membrana para E.coli 34
Grafica 2. Filtración por membrana Klebsiella pneumonie
concentración vs. UFC/100ml 35
Grafica 3. Concentración vs. UFC/100ml para Citrobacter freundii 37
Grafica 4. Analistas vs. Coeficiente de variación 40
Grafica 5. Reproducibilidad a las 24 horas de incubación. 41
Grafica 6. Reproducibilidad a las 48 horas de incubación. 41
Grafica 7. Reproducibilidad a las 72 horas de incubación. 42
Grafica 8. Reproducibilidad a las 24, 48 y 72 horas de incubación. 42
Grafica 9. Robustez según temperatura para analista 1, 2 y 3. 44
Grafica 10. Robustez según tiempo, analista 1. 44
Grafica 11. Robustez según tiempo, analista 2. 44
Grafica 12. Robustez según tiempo, analista 3. 45
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Acción de los Sustratos Cromogénicos en Coliformes
Totales Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua
y los riesgos para la salud 26
Figura 2. Acción de los sustratos Cromogénicos y Fluorogénicos
en E.coli Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El
agua y los riesgos para la salud 27
Figura 3. Comparación de los métodos de filtración por membrana
y sustrato definido Readycult para E. coli 33
Figura 4. Método de Ausencia/Presencia Readycult para
klebsiella pneumoniae 35
Figura 5. Comparación de los métodos de filtración por membrana
y sustrato definido Readycult para Citrobacter freuindii 36
Figuras 6 y 7. Comparación de los métodos de filtración por
membrana y sustrato definido Readycult en diferentes tipos
de aguas potables 47
Figura 8. Comparación de los métodos de filtración por
membrana y sustrato definido Readycult en las plantas de
tratamiento (aguas tratadas no potables) 48
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TABLA DE CONTENIDO
PAG
INDICE DE TABLAS 6 INDICE DE GRAFICAS 8 LISTA DE FIGURAS 9
1. INTRODUCCION 12 2. JUSTIFICACION 13 3. OBJETIVOS 14 3.1 Objetivo General 14
3.2 Objetivos Específicos 14
4. MATERIALES Y METODOS 15 4.1 Método de Filtración de Membrana para la detección de Coliformes totales
y Escherichia coli
17
4.2 Técnica Readycult Coliformes 100 sustrato definido Ausencia/presencia 19
5. VALIDACION 20 5.1 Tipos de validación 21 5.1.1 Validación Prospectiva 21
5.1.2 Validación Concurrente 21
5.1.3 Validación Retrospectiva 22
5.14 Revalidación 22
6. FILTRACION POR MEMBRANA 23 6.1 Fundamento del método MF 23
6.2 Unidades de filtración 24
6.3 Filtro de membrana 24
7. PRUEBA DE PRESENCIA AUSENCIA PARA COLIFORMES (A/P) 25
8. GRUPO COLIFORMES TOTALES 26
9. Escherichia coli 27
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10. Metodología 29 10.1. Preparación de stock de Escherichia coli 29
10.2 Preparación de stock de Coliformes Totales (Klebsiella pneumoniae) 30 10.3 Preparación de stock de Coliformes Totales (Citrobacter freundii) 31 11. RESULTADOS 32 11.1 Limite de cuantificación 32
11.2 Limite de detección 32
11.3 Sensibilidad 38
11.4 Especificidad 39
11.5 Repetibilidad 39
11.6 Reproducibilidad 40
11.7 Robustez 42
12. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS SUSTRATO DEFINIDO READYCULT Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA
46
12.1 Comparación de los métodos Sustrato definido Readycult y filtración por
membrana en las diferentes fuentes de aguas potables
46
12.2 Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult
Ausencia/Presencia (A/P) en la planta galán (PGT) y en la planta del alto del
águila (PAA) y planta regional tratada para aguas tratadas no potables
48
12.3 Comparación de los métodos Sustrato definido Readycult y filtración por
membrana en las fuentes de agua cruda
49
13. DISCUSION DE RESULTADOS 50 CONCLUSIONES 53 RECOMENDACIONES 54
ANEXO ESPECIFICACIONES 55 BIBLIOGRAFIA 63
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INTRODUCCION
El objetivo principal de la validación, es demostrar con un alto grado de confianza, por medio
de réplicas y de evidencia documentada que un proceso especifico producirá de forma
consistente y permanente productos que reunirán las características de calidad predefinidas.
En el presente trabajo se demostró, por medio de análisis estadístico tipo descriptivo, que las
técnicas de Filtración por membrana y Sustrato definido Readycult 100 de Merck, empleadas
para la detección de Coliformes totales y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y potables
en el acueducto de Zipaquirá, son realmente eficaces y arrojan resultados confiables.
Asimismo, se concluyó que el método de filtración por membrana, empleando tres tipos de
microorganismos, E.coli, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumonie, es mas sensible que
sustrato definido Readycult, ya que se estableció que el límite de cuantificación de la técnica de
filtración por membrana es de 1 UFC/100 ml, mientras que el límite de detección del método
sustrato definido Readycult es a partir de 22 UFC/100 ml. Por esta razón, se determinó que
para aguas potables y tratadas es necesario emplear el método de filtración por membrana, y
para aguas crudas, el método de sustrato definido Readycult es 100% efectivo si únicamente
se necesita determinar la ausencia o presencia de Coliformes totales o de E. coli, debido a que
la carga microbiana es lo suficientemente alta. Sin embargo, se puede hacer uso del método de
filtración por membrana mediante el empleo de diluciones.
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2. JUSTIFICACION
El agua puede ser considerada un alimento de alto consumo a nivel mundial. Por consiguiente,
es de vital importancia determinar la calidad de la misma, para así evitar posibles riesgos de
enfermedad que perjudiquen la salud Humana. Debido a esto, y a los requerimientos
necesarios para mejorar e implementar sistemas de gestión de calidad en la Empresa de
acueducto, Alcantarillado y aseo de Zipaquirá, y de acuerdo a sus políticas de calidad que
buscan mejorar sus procesos de manera continua con tecnología, personal adecuado y
cumplimiento a cabalidad de la normatividad, se hace conveniente entregar a la comunidad
agua potable que garantice la ausencia de Coliformes Totales y Escherichia coli, causantes de
enfermedades gastrointestinales.
El progresivo interés por la calidad de las aguas y la obligatoriedad de su control hacen
necesario establecer y poner en marcha programas de garantía de calidad que confirmen la
validez de los datos analíticos. Este trabajo busca validar las técnicas de filtración por
membrana y sustrato definido Readycult, ampliamente utilizadas para la detección de
Coliformes Totales y Escherichia coli, ya que estos microorganismos son la base para evaluar
la calidad microbiológica del agua. Además, dichas técnicas son aceptadas y utilizadas a nivel
nacional e internacional por los entes reguladores, debido a su fácil manejo y empleo. Por lo
tanto, esta investigación se hace con el fin de comprobar la eficiencia, sensibilidad,
reproducibilidad, y las características propias de cada uno de los métodos determinando así,
por medio de una comparación, cual de las dos técnicas tiene una mayor confiabilidad.
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3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Iniciar un proceso de validación de los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido
para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y
potables procedentes del Acueducto de Zipaquirá
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Determinar los diferentes parámetros para realizar una primera fase de validación como
lo son la reproducibilidad, la repetibilidad, el límite de detección y el límite de cuantificación,
robustez y la variación intramuestra, para la identificación de Coliformes Totales y Escherichia
coli, mediante los métodos de sustrato definido y filtración por membrana.
• Comparar los resultados obtenidos al tratar una misma muestra por ambos métodos,
para así determinar la eficacia de estos, empleando controles a concentraciones conocidas.
• Comprobar la efectividad de los métodos utilizados.
• Verificar los parámetros y los requerimientos necesarios para la realización de la
validación.
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4. MATERIALES Y MÉTODOS
El número de muestras a analizar son:
114 muestras de las cuales: 78 corresponden a agua potable, 12 a aguas tratadas y 24 a
aguas crudas.
• 78 muestras de agua potable: Cada punto de muestreo por triplicado
A. Prados del mirador
B. San Rafael.
C. Cambujos
D. Liberia
E. La esperanza
F. Potosí 1
G. El prado
H. Algarra I
I. Algarra II
J. Algarra III
K. San Pablo
L. San Carlos
M. Las Villas
N. Parcelación Santa Isabel
O. La Paz
P. La Mariela
Q. San Miguel
R. Pasoancho
S. Portachuelo
T. El Rudal
U. Casablanca
V. La Concepción
W. San Juanito
X. Coclies
Y. América 500 años
Z. Bosques de Silesia
• 12 muestras de agua Tratada: Cada punto de muestreo por cuatro
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A. Planta Galán Tratada: PGT
B. Planta Regional Tratada: PRT
C. Planta Alto del Águila Tratada: PAA.
• 24 muestras de agua cruda: Bocatomas. Cada punto de muestreo por cuatro.
A. Rio frio
B. Arteza.
C. Clavel
H. La Hoya
G. Neusa
I. Borrachero
1. Material de vidrio: Frascos Schott por 250ml, pipetas volumétricas de 1, 2,5 y 10ml; Cajas
de Petri; Fiolas de 500ml; Tubos de 16 x 150, campanas de DURHAM
2. Material de plástico: 200 cajas de petri
3. Filtros de 0.45 µm
4. Reactivos: (Ver anexo especificaciones)
• Tiosulfato de sodio 0.1N
• Colorantes de Gram
• Reactivo de Kovacs
• Aceite de Inmersión
5. Medios de Cultivo: (Ver anexo especificaciones)
• Chromocult
• Plate Count
• Readycult
• Caldo Lactosado
• Caldo Brilla
6. Equipos: (Ver anexo especificaciones)
• Microscopio
• Incubadora
• Balanza analítica
• Lámpara U.V
• Turbidímetro
7. Cepas: (Ver anexo especificaciones) Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Citrobacter freundii
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
4.1. METODO DE FILTRACION DE MENBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli
El método de recuento de Coliformes totales y Escherichia coli esta descrito por la APHA-
AWWA-WPCF “Standard Methods” 1992
Lavado del equipo
Añadir 5 ml de alcohol y luego entre 20-30 ml de agua esterilizada
Filtro Tipo AC 0.45µm (SARTORIUS)
Equipo de filtrado SM 168-28 de, SM 16201/19/20 SARTORIUS
Abrir la llave y dejar pasar por el sistema
Colocar con pinzas estériles un filtro de membrana sobre la placa porosa del receptáculo
Situar con precaución el embudo sobre el correspondiente
receptáculo y se fija
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 17
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Reads, tratadas y pota
ycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas cruda bles en el acueducto de Zipaquirá.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 18
Se añade 100 ml de la muestra de agua
Para aguas crudas hacer previa
dilución
Añadir agente declorador en aguas
tratadas:1 ml de Tiosulfato 0.1N
para 200 ml de t
Dejar filtrar completamente
Se cierra el sistema
Se retira el filtro con pinzas estériles
Se lleva al medio de cultivo seleccionado
Chromocult (Merck, 1994)
Incubar: 24 horas entre 35-37°C
Leer e interpretar los resultados
Nota: Descontamínese el equipo entre filtraciones sucesivas adicionando 5 ml de alcohol y
luego entre 20-30 ml de agua esterilizada para de esta manera lavar el sistema y evitar
contaminaciones
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4.2. TECNICA READYCULT COLIFORMES 100 SUSTRATO DEFINIDO AUSENCIA/PRESENCIA
Método descrito según MERCK
Test de presencia/ausencia para la detección simultanea de Coliformes totales y E.coli en el
análisis de aguas de acuerdo a la norma para Coliformes USEPA (Sec.141.21)
100 ml de la muestra de agua
Nota: Los frascos empleados para el procedimiento no deben ser fluorescentes y deben
tener una capacidad mínima de 120 ml, además para una muestra de 100ml de agua tratada o
potable se le debe adicionar 0.5 ml de Tiosulfato de sodio al 0.1N
Añadir una cápsula de Readycult Coliformes 100
Para evitar el riesgo de contaminación, no tocar la
abertura de la cápsula cuando se abra
Cerrar el recipiente y agitar hasta la completa disolución de los gránulos
Incubar: 24h 35-37◦C O
48h 20-25◦C
Leer e interpretar los resultados
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 19
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
5. VALIDACIÓN Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada
que un proceso especifico producirá de forma consistente y permanente productos que
reunirán las características de calidad predefinidas. (CORTES, 2002)
La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales de ensayo. Esto
puede conseguirse utilizando productos contaminados naturalmente o productos inoculados
con un nivel conocido de microorganismos contaminantes. El analista debe ser consciente que
la inoculación de una matriz con microorganismos contaminantes imita tan sólo de una manera
superficial la presencia de contaminantes naturales. No obstante, a menudo es la mejor y la
única solución disponible. La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su
aplicación. (ENAC, 2002)
Los métodos de ensayo microbiológicos cualitativos, tales como los que el resultado se
expresa en términos de detectado/no detectado, y los procedimientos de confirmación e
identificación, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad,
exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial,
repetibilidad y reproducibilidad. (ENAC, 2002)
En el caso de ensayos microbiológicos cuantitativos, debe considerarse la especificidad,
sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad,
reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y, en caso
necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las
matrices deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados
deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados. (ENAC, 2002)
Los laboratorios deben mantener los datos sobre validación de los sistemas de ensayo
comerciales (kits) que utilicen. Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de intercomparación
o de datos sobre validación remitidos por los fabricantes y sujetos a la evaluación de una
tercera parte. Si no se dispone de datos sobre validación o si éstos no son plenamente
aplicables, el laboratorio será responsable de completar la validación del método. (ENAC,
2002)
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 20
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas
especificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizando
replicas. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que ser estadísticamente
válidos. (ENAC, 2002)
Incluso cuando se haya realizado la validación, el laboratorio tendrá que verificar
periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, utilizando, por ejemplo,
muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más
representativas. (ENAC, 2002)
El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o desarrolla,
los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones y
modificaciones de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el
fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las
necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El laboratorio debe
registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validación y una
declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto. (ISO 17025)
5.1 Tipos de validación 5.1.1. Validación Prospectiva Este tipo de validación se basa en la información obtenida antes de implantar el proceso de
validación. Se realiza durante la etapa de desarrollo, mediante análisis de riesgo del proceso
de producción, que se divide en pasos individuales, estos se evalúan entonces a la luz de la
experiencia para determinar si podían conducir a situaciones criticas; se investigan posibles
causas y se determina la probabilidad de que suceda y su magnitud, se trazan los planes de
ensayo y se fijan las prioridades; a continuación se efectúan y se evalúan los ensayos y se
hace una valoración general; si los resultados son aceptables al final, el proceso es
satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una
nueva validación demuestre su carácter satisfactorio. Este tipo de validación es importante para
limitar el riesgo de errores que se producen a escala de producción. (CORTES, 2002)
5.1.2. Validación Concurrente La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la implementación del
mismo. Se debe tener en cuento el monitoreo en el proceso de las variables críticas que
demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso
en estado productivo. (CORTES, 2002) Este es el tipo de validación utilizado en el presente trabajo.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 21
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
5.1.3. Validación retrospectiva
Este tipo de validación se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información
histórica del proceso. Se deben tomar como mínimo 20 o 30 lotes que cuenten con reportes
analíticos sólidos y confiables, documentación que muestre condiciones de los procesos y
estudios de reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validación es
necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles
microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos analíticos y especificaciones; es aplicada
para productos que se encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera
estable, además cuando por las características del producto, económicamente no se justifica
hacer una validación prospectiva.
La validación retrospectiva también puede ser útil en el establecimiento de las prioridades en
un programa de validación. (CORTES, 2002)
5.1.4. Revalidación Es la repetición de un procedimiento de validación o una parte del mismo. Esto no significa
que el programan original debe ser repetido. Se aplica cuando se presenta cambio de
uno de los componentes críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en
un sistema o equipo, cambio en instalaciones, cambio en tamaño del lote de fabricación y por
unidades producidas fuera de especificaciones en lotes consecutivos.
La revalidación periódica se presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales,
incluso si operarios experimentados trabajan correctamente aplicando los métodos
establecidos. De manera análoga el desgaste del equipo puede causar también cambios
graduales. Por consiguiente es aconsejable realizar revalidación a intervalos programados,
incluso sin introducir cambios deliberados. La decisión de implantar la revalidación periódica
debe basarse esencialmente en un examen de datos históricos, es decir, datos producidos
durante las pruebas del proceso de fabricación y del producto terminado efectuadas después
de la validación mas reciente, con el objetivo de verificar si el proceso esta bien controlado. Al
examinar esos datos históricos se debe evaluar cualquier tendencia observada en los datos
compilados. (CARDENAS, 2002)
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
6. FILTRACIÓN POR MEMBRANA (MF)
La técnica de filtración por membrana (MF) es altamente reproducible, puede utilizarse para
estudiar volúmenes relativamente grandes de muestras y proporciona resultados numéricos
más rápidos que el método de tubos múltiples. (APHA, 1992)
La técnica de filtración por membrana es extraordinariamente útil para controlar las posibles
situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas
naturales. Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, sobre todo para estudiar aguas con
elevada turbidez o que contengan bacterias no Coliformes. (APHA 1992)
Este método es una manera rápida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua.
El método MF es especialmente útil al evaluar grandes volúmenes o al realizar diariamente
muchas pruebas de Coliformes. (HACH, 2000)
6.1. Fundamento del método MF
El método MF se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de
membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.
(MILLIPORE, 2005)
Actualmente se utilizan membranas Sartorius tipo AC con un diámetro de poro 0.45 µm.
Dichas membranas cumplen con las especificaciones referenciadas en el los Métodos Estándar
y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. (SARTORIUS, 2003).
Bastara incubar la membrana sobre un medio de cultivo adecuado, a la temperatura y durante
el tiempo necesario, para posteriormente contar directamente las colonias sobre la superficie
de la membrana. (MILLIPORE, 2005)
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
6.2. Unidades de filtración.
El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente a autoclave, porcelana o
acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de
cierre o mantenido en su lugar mediante una fuerza magnética. (APHA, 1992)
El diseño debe permitir que el diseño de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa
porosa del receptáculo, sin que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a
través de la membrana durante la filtración. (APHA, 1992)
6.3. Filtro de membrana Se debe utilizar filtros de membrana con un diámetro de poro que permita una completa
retención de las bacterias Coliformes.
Solo se emplean filtros en los que se haya comprobado, mediante una adecuada prueba de
control de calidad y por la garantía del fabricante, que permitan una retención de las bacterias
Coliformes. (APHA, 1992)
Se debe tener en cuenta que dichos filtros deben ser libres de químicos susceptibles de inhibir
el crecimiento y desarrollo bacterianos, que posean una velocidad de filtración satisfactoria (en
cinco minutos), ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de ± 0.2
unidades) y que no produzcan un aumento en el numero de colonias confluentes o expansivas,
en comparación con los filtros de membrana de control. (APHA, 1992)
Las membranas marcadas con una trama se utilizaran de forma que no inhiban ni estimulen el
crecimiento bacteriano cuando se incuben con las bacterias retenidas en un medio adecuado.
(APHA, 1992)
Es preferible utilizar filtros de recientes y, si es necesario, guardarlos, debe hacerse en un
ambiente sin cambios extremos de temperatura o humedad.
Se recomienda emplear filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen que
la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades físicas o
químicas de la membrana.
Si estas se esterilizan en el laboratorio se deben someter al autoclave por 10 minutos a 121ºC.
(APHA, 1992)
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
7. PRUEBA DE PRESENCIA/ AUSENCIA PARA COLIFORMES (A/P)
La prueba de presencia ausencia de Coliformes es una sencilla modificación del procedimiento
de tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande “100 ml”
en una sola botella de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia o
ausencia de Coliformes, se justifica por la teoría de la falta de estos microorganismos en una
muestra de 100 ml de agua potable. La prueba de A/P proporciona además una oportunidad
opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores
(Coliformes fecales, Aeromonas, Staphylococos, Pseudomonas, Streptococos fecales y
Clostridium) también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un
mayor numero de muestras por unidad de tiempo y hacer estudios comparativos con el
procedimiento del filtro de membrana que indica que la prueba de A/P puede aumentar al
máximo la detección de Coliformes en muestras que contienen microorganismos que podrían
sobrepasar en su crecimiento al de las colonias de Coliformes provocando problemas para su
detección. (APHA, 1992)
La prueba de A/P se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los
sistemas de distribución o en las plantas de tratamiento de aguas. En principio se estudian
alrededor de 100 muestras por los métodos del filtro de membrana o de los tubos múltiples,
además de la prueba de A/P.
Una vez establecido que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para
Coliformes, se pueden utilizar únicamente la prueba de A/P.
Cuando una muestra produce un resultado positivo en una prueba se estudiaran las posteriores
muestras repetidas mediante un método cuantitativo hasta que se vuelvan a obtener resultados
negativos en dos muestras consecutivas. (APHA, 1992)
Las muestras tomadas en locaciones poco habituales, como los pozos privados, se analizaran
con métodos de tubos múltiples o de filtro de membrana. (APHA, 1992
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
8. GRUPO COLIFORMES TOTALES
Los Coliformes son bacterias Gram negativas, no formadoras de esporas, oxidasa negativa y
con forma de bacilo, que pueden crecer en medio aerobio y anaerobio facultativo en presencia
de sales biliares y capaces de fermentar lactosa con producción de ácido y aldehído en 48
horas cuando se incuban a una temperatura de 36 +/- 2 º C. Las bacterias Coliformes poseen
la enzima ß Galactosidasa. (Millipore, 2005)
La prueba mas relevante utilizada para la identificación del grupo coliformes, es la hidrólisis de
la lactosa. El rompimiento de este disacárido es catalizado por la enzima ß-D-galactosidasa.
Ambos monosacáridos (la galactosa después es transformada en glucosa por reacciones
bioquímicas) posteriormente son metabolizados a través de los ciclos glicolítico y del citrato.
Los productos metabólicos de estos ciclos son ácidos y/o CO2. Para la La determinación de la
ß-galactosidasa se utilizan sustratos cromógenos tales como Chromocult y Readycult.
(MANAFI, 1998)
Figura 1: Acción de los Sustratos Cromogénicos en Coliformes Totales
Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud
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9. Escherichia coli.
Las bacterias E. Coli son bacterias coliformes capaces de producir Indol a partir de triptófano,
en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5 ºC. También poseen la enzima ß Galactosidasa, reaccionan
positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden decarboxilar el ácido L-glutámico, pero
no son capaces de producir acetil metil carbitol, de utilizar citrato como única fuente de carbono
o de crecer en un caldo de cultivo con cianuro de potasio (KCN). (Millipore, 2005)
E. coli es la única especie dentro de las enterobacterias que presenta la β-D- glucoronidasa.
Esta enzima degrada el sustrato 4-metilumbeliferil- β-D-glucoronido (MUG), formando 4-
metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando
se ilumina con luz ultravioleta.(MANAFI,1998)
Figura 2: Acción de los sustratos Cromogénicos y Fluorogénicos en E.coli Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Tabla 1. Comparación de Coliformes totales y E.coli
Tomado de: Tomado de: Memorias Seminario Internacional: El agua y los riesgos para la salud
Coliformes totales Bacterias Gram Negativas
No esporulados
Anaerobios facultativos
Fermentadores de la lactosa con producción de
ácido y gas a 36±1º C en 24-48h
Hábitat: Tracto gastrointestinal de animales de
sangre caliente (son bacterias entéricas,)
además son comunes en otros ambientes como
en suelos, vegetales, etc.
Ej.: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae.
E.coli Bacterias Gram Negativas
No esporuladas
Anaerobios facultativos
Fermentadores de la lactosa
con producción de ácido y
gas a 36±1º C en 24-48h y a
44.5 ±0.2 º C en 24 h
Característica de heces de
animales homeotermos
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10. METODOLOGÍA
10.1. PREPARACION DE STOCK DE Escherichia coli
Escherichia coli OXOID CULTI-LOOPS LT: 6088911
Repique y aislamiento de la CEPA en medio Chromocult y Plate count
Observar las colonias
Incubar 24 horas a 37ºC
Verificar pureza del cultivo mediante coloración de Gram y Bioquímicas
Incubar a 37ºC por 24 Horas, observar e
interpretar los resultados
A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y
resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).
Hacer recuento en placa por profundidad en medio Chromocult
Incubar a 37ºC por 24 Horas y determinar el número de colonias
como ufc/ml
A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es
decir, que se obtienen 3 replicas por dilucion para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las
diluciones se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99
ml de agua destilada estéril.
Las diluciones se realizan en frascos Schott de 120 ml.
Se procede a realizar filtración por membrana a las 3 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7,
comenzando desde la mas diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se
desinfecta con alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.
Sde l
e comprueba la efectividad a desinfección del equipo filtración mediante el uso
de alcohol al 70% y agua destilada, pasando una
muestra de agua estéril al nal del procedimiento, que seria el control negativo, esperando observar la
ausencia de crecimiento después de la incubación
de
fi
Se realiza coloracion de Gram y pruebas
bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC por 24
horas.
Las membranas de filtración se llevan a
cajas de Petri con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el numero de colonias,
luego se leen a las 48 horas para observar si
se incrementa el numero (falsos positivos).
A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el medio
Readycult coliform 100, de Merck, y se homogeniza hasta que se disuelva.
Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una
posterior lectura de resultados.
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10.2. PREPARACION DE STOCK DE Coliformes Totales (Klebsiella pneumoniae)
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Repique y aislamiento de la CEPA en medio Chromocult y Plate count
Observar las colonias
Incubar 24 horas a 37ºC
Verificar pureza del cultivo mediante coloración de Gram y Bioquímicas
Incubar a 37ºC por 24 Horas, observar e
interpretar los resultados
A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).
Hacer recuento en placa por
profundidad en
Incubar a 37ºC por 24 Horas y determinar el número de colonias
como ufc/ml
A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es decir,que se obtienen 3 replicas por dilucion para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las diluciones
se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99 ml de agua destilada
estéril.
Las diluciones se realizan en frascos Schott de 120 ml.
Se procede a realizar filtración por membrana a las 3 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7, comenzando desde la mas
diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se desinfecta con
alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.
Se comprueba la efectividad de la desinfección del equipo de filtración mediante el uso
de alcohol al 70% y agua destilada, pasando una
muestra de agua estéril al final del procedimiento, que
seria el control negativo, esperando observar la
ausencia de crecimiento después de la incubación
Se realiza coloracion de Gram y pruebas
bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC por 24
horas.
Las membranas de filtración se llevan a cajas
de Petri con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el numero de colonias, luego se leen a
las 48 horas para observar si se incrementa el numero
(falsos positivos).
A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el medio Readycult coliform 100, de Merck, y se
homogeniza hasta que se disuelva
Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una posterior lectura de
resultados.
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
10.3. PRAPARACION DE STOCK DE Coliformes Totales (Citrobacter freundii)
Citrobacter freundii ATCC 8090
Repique y aislamiento de la CEPA en medio Chromocult y Plate count
Observar las colonias
Incubar 24 horas a 37ºC
Verificar pureza del cultivo mediante coloración de Gram y Bioquímicas
Incubar a 37ºC por 24 Horas, observar e
interpretar los resultados
A partir de una colonia axenica aislada recoger con asa estéril y resuspenderla en 100 ml de agua destilada estéril (solución patrón).
Hacer recuento en placa por profundidad en medio
Chromocult
Incubar a 37ºC por 24 Horas y
determinar el ero de colonias
como ufc/mlnúm
11. RESULTADOS
A partir de esta solución hacer diluciones hasta 10-7. Este procedimiento se realiza 6 veces. Es decir,que se obtienen 3 replicas por dilución para filtración por membrana y 3 replicas para A/P. las diluciones
se realizan de la siguiente manera: Tomar 11 ml de la solución patrón y verter en 99 ml de agua destilada
estéril.
Las diluciones se realizan en frascos Schott de 120 ml.
Se procede a realizar filtración por membrana a las 4 replicas desde la dilución 10-1 a 10-7,
comenzando desde la mas diluida hasta la mas concentrada para evitar contaminación. Entre muestra y muestra, el embudo de filtración se
desinfecta con alcohol al 70% y se enjuaga con agua destilada estéril.
Se comprueba la efectividad de la desinfección del equipo de filtración mediante el uso
de alcohol al 70% y agua destilada, pasando una
muestra de agua estéril al final del procedimiento, que seria el control negativo, esperando
observar la ausencia de crecimiento después de la
Se realiza coloración de Gram y pruebas
bioquímicas, las cuales se incuban a 37ºC 24 h
Las membranas de filtración se llevan a cajas de Petri
con medio Chromocult y se llevan a incubar por 24 horas
a 37 ºC. Se leen a las 24 horas y se informa el
numero de colonias, luego se leen a las 48 horas para observar si se incrementa el numero (falsos positivos).
A las 3 replicas restantes, para ausencia/presencia, se les adiciona el
medio Readycult coliform 100, de Merck, y se homogeniza hasta que se
suelva. di
Se llevan a incubar por 24 horas a 37 ºC, para una posterior lectura de
resultados.
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
11. RESULTADOS
En todos los ensayos, las mismas replicas se evalúan por los dos métodos utilizados, filtración
por membrana y sustrato definido Ausencia/Presencia (A/P).
11.1. Límite de cuantificación.
Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos –Numero mínimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del
método evaluado.
11.2. Límite de detección. Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos –Numero mínimo de microorganismos que
pueden ser detectados pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.
Tabla 2. Determinación del límite de detección para filtración por membrana y limite de
cuantificación para sustrato definido Readycult utilizando E.coli.
Solución patrón 1600 UFC/100ml Filtración por membrana (FM) Sustrato definido Ausencia/Presencia (A/P)
DILUCION FM1 FM2 FM3 FM4 dil. A/P1 A/P2 A/P3 A/P410-1 1600 1600 1600 1600 10-1 P P P P10-2 1600 1600 1600 1600 10-2 P P P P10-3 1296 1302 1290 1306 10-3 P P P P10-4 228 223 234 230 10-4 P P P P10-5 21 24 23 24 10-5 A P P P10-6 4 3 3 2 10-6 A A A A10-7 1 1 1 10-7 A A A A1
Limite de cuantificación para filtración por membrana
Limite de detección para Sustrato definido Readycult
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Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Figura 3. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult para E. coli
Tabla 3. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para E. coli
en filtración por membrana
10-1 1600 0 0 010-2 1600 0 0 010-3 1298 36,749 0.00478 6,062110-4 229 15,75 1.73 3,968610-5 23 1,2247 6.52 1,510-6 3 1,2247 23.57 0,707110-7 1 0 0 0
Promedio UFC Coeficiente de variacion Dilución Varianza Desviación Estandar
Tabla 4. Porcentaje de Presencia y disminución según diluciones para A/P en E.coli
10-1 100 010-2 100 010-3 100 010-4 100 010-5 75 -2510-6 0 -10010-7 0 -100
Dilución % Presencia % Disminución
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 33
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Grafica 1. Filtración de membrana para E.coli
Filtración por membrana E.coli
R2 = 0,8449
-5000
5001.0001.5002.000
0,100
0000
0,010
0000
0,001
0000
0,000
1000
0,000
0100
0,000
0010
0,000
0001
UFC
Tabla 5. Resultados del límite de cuantificación para las pruebas de filtración por membrana y
límite de detección Ausencia / Presencia Readycult para Klebsiella pneumoniae
Solución Patrón: 1000 ufc/ml Solución Patrón: 1000 ufc/ml Filtración por membrana (FM) Sustrato definido
Ausencia/Presencia (A/P)
10-1 1000 1000 100010-2 676 681 66410-3 110 101 11910-4 18 25 2210-5 1 3 210-6 1 1 110-7 0 0 0
Replica 1 Replica 3Dilución Replica 210-1 P P P10-2 P P P10-3 P P P10-4 A P P10-5 A A A10-6 A A A10-7 A A A
Replica 3Dilución Replica 2Replica 1
Limite de cuantificación para filtración por membrana
Limite de detección para Sustrato definido A/P Readycult
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Figura 4. Método de Ausencia/Presencia Readycult para Klebsiella pneumoniae
Gráfica 2. Filtración por membrana para Klebsiella pneumoniae concentración vs
UFC/100ml
Filtración por membrana Klebsiella
pneumonie
R2 = 0,7086
-5000
5001.0001.500
0,10
0000
0
0,01
0000
0
0,00
1000
0
0,00
0100
0
0,00
0010
0
0,00
0001
0
0,00
0000
1
Concentración (Dilucion)
UFC
Tabla 6. Porcentaje de disminución en filtración por membrana para Klebsiella
pneumoniae.
10-1 1000 - 10010-2 675 -32,6 10010-3 110 -83,68 10010-4 21 -80.909 6610-5 2 -90.476 010-6 1 -5010-7 0 -100
UFC/ml % Disminución PresenciaDilución
00
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 35
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Tabla 7. Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para
Klebsiella pneumonie en filtración por membrana
10-1 1.000 0 0 010-2 674 7,1336 50,8882 1.05810-3 110 7,3484 53,9989 6.6810-4 21 2,1602 4,6666 0.102810-5 2 0,8164 0,6665 40.8210-6 1 0 0 010-7 0 0 0 0
Dilución Desviación Estandar Varianza Coeficiente de variación Promedio UFC/ml
Tabla 8. Resultados del límite de cuantificación para las pruebas de filtración por
membrana y limite de detección Ausencia / Presencia Readycult para Citrobacter freundii
Solución Patrón: 1000 ufc/ml Solucion Patron: 1000 ufc/ml
Filtración por membrana(FM) Ausencia/Presencia (A/P)
10-1 1000 1000 100010-2 600 615 60210-3 73 78 7510-4 24 23 2010-5 2 2 2
10-6 1 1 1
10-7 0 0 0
Replica 1 Replica 3Dilución Replica 210-1 P P P10-2 P P P10-3 P P P10-4 P P A10-5 A A A10-6 A A A10-7 A A A
Replica 3Dilución Replica 2Replica 1
Límite de cuantificación para filtración por membrana Límite de detección para Readycult (A/P)
Figura 5. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult para Citrobacter freundii
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 36
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Grafica 3. Concentración vs UFC/100ml para Citrobacter freundii
Filtracion por Membrana Citrobacter freundii
R2 = 0,6813
-5000
5001.0001.500
0,0000000 0,0200000 0,0400000 0,0600000 0,0800000 0,1000000 0,1200000
Concentracion
UFC
Tabla 9. Porcentaje de disminución y porcentaje de presencia en filtración por membrana
para Klebsiella pneumoniae
10-1 1000 - 10010-2 606 -39,4 10010-3 75 -87,6237624 10010-4 22 -70.666.666 010-5 2 -90.909.090 010-6 1 -5010-7 0 -100
Dilución Promedio UFC/ml % Disminución % Presencia
00
Tabla 10.Estadística: Desviación estándar, varianza y coeficiente de variación para
Klebsiella pneumoniae en filtración por membrana
DesviaciónEstandar
10-1 1.000 0 0 010-2 606 6,6499 44,2211 0,150310-3 75 2,0548 4,2222 0,486610-4 22 1,6996 28.888 1,224910-5 2 0 0 010-6 1 0 0 010-7 0 0 0 0
Dilución Varianza Coeficiente de variaciónPromedio UFC/ml
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 37
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
11.3Sensibilidad:
Fracción del número total de cultivos o de colonias correctamente asignados en el análisis
presuntivo.
a/a+c
Con pocas excepciones, se confirman más del 90% de los resultados presuntamente positivos.
Tabla11. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido
Readycult (A/P) para E.coli
Dilución10-110-210-310-410-510-610-7
4/4=1 0/4= 04/4=1 0/4= 0
4/4=1 4/4= 14/4=1 3/4= 0,75
4/4=1 4/4= 14/4=1 4/4= 1
Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P4/4= 1 4/4= 1
Tabla12. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido
Readycult (A/P) para Klebsiella pneumoniae
Dilución Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P10-1 3/3= 1 3/3=110-2 3/3=1 3/3=110-3 3/3=1 3/3=110-4 3/3=1 2/3=0,6610-5 3/3=1 0/3=010-6 3/3=1 0/3=010-7 0/3=0 0/3=0
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 38
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Tabla 13. Sensibilidad para los métodos de Filtración por membrana y sustrato definido
Readycult (A/P) para Citrobacter freundii
Dilución Sensibilidad para FM Sensibilidad para A/P
10-1 3/3= 1 3/3=110-2 3/3=1 3/3=110-3 3/3=1 3/3=110-4 3/3=1 2/3=0,6610-5 3/3=1 0/3=010-6 3/3=1 0/3=010-7 0/3=0 0/3=0
11.4 Especificidad Fracción del número total de cultivos o de colonias negativos correctamente asignados en el
análisis presuntivo.
Los medios utilizados demostraron ser 100% específicos:
En filtración por membrana se utilizó Chromocult medio selectivo específico para la
diferenciación de Coliformes totales característicos por presentar colonias rojas y E.coli por
evidenciar colonias moradas.
En cuanto a Ausencia presencia se empleo Readycult 100 de Merck, donde los Coliformes
totales se denotan por presentar una coloración verde y E.coli se confirma por fluorescencia
bajo lámpara UV e Indol positivo.
11.5 Repetibilidad Grado de acuerdo entre los resultados obtenidos en medidas sucesivas del mismo mesurando
realizados en las mismas condiciones de medidas.
La repetibilidad se calcula como r =2.8 sr donde sr es la desviación estándar de repetibilidad.
Stock: 10 UFC/100ml
Tabla 14. Replicas de repetibilidad, porcentaje de variación intramuestra y variación con el
Stock
1 8 10 9 20 102 9 10 9,5 10 53 8 9 8,5 10 154 9 10 9,5 10 105 9 10 9,5 10 10
% Variacion con el stockAnalistas Repetibilidad X % Variacion
intramuestra
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 39
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Tabla 15. Repetibilidad, desviación estándar y coeficiente de variación
1 9 1 1 11,11 2,82 9,5 0,25 0,5 5,26 1,43 8,5 0,25 0,5 5,26 1,44 9,5 0,25 0,5 5,26 1,45 9,5 0,25 0,5 5,26 1,4
Analista X Varianza Desviación estándar CV % Repetibilidad
Grafica 4. Analistas vs coeficiente de variación
Analista Vs Coeficiente de Variacion
0
5
10
15
0 2 4
Analistas
CV
%
6
11.6 Reproducibilidad
Grado de acuerdo entre los resultados obtenidos en medidas sucesivas del mismo
mesurando realizados en distintas condiciones de medida.
La reproducibilidad se calcula como R=2.8 sR donde sR es la desviación estándar de la
reproducibilidad, generalmente compuesta por la desviación típica de diferentes
laboratorios, diferentes analistas, diferentes días, diferentes instrumentos, sL y la
desviación típica de repetibilidad, sr, es decir :
sR=√sL²+ sr²
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 40
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Stock: 10 UFC/100ml
Tabla 16. Reproducibilidad en función de la temperatura y el tiempo de incubación para el
método de filtración por membrana.
Analista1 8 ufc/ml 10ufc/ml 8 ufc/ml 10ufc/ml2 9ufc/ml 10ufc/ml 9ufc/ml 10ufc/ml3 8ufc/ml 9ufc/ml 8ufc/ml 9ufc/ml
Analista1 8 ufc/ml 10ufc/ml 8 ufc/ml 11 ufc/ml2 9ufc/ml 10ufc/ml 9ufc/ml 12 ufc/ml3 8ufc/ml 9ufc/ml 8ufc/ml 13ufc/ml9ufc/ml 11ufc/ml
10ufc/ml 12ufc/ml10ufc/ml 11ufc/ml
9ufc/ml 8ufc/ml24 horas 48 horas 72 horas *
10ufc/ml 8 ufc/ml10ufc/ml 9ufc/ml
33ºC 35ºC 38ºC
* El medio se deshidrata y se observan falsos positivos
Grafica 5. Reproducibilidad a las 24 horas de incubación.
Reproducibilidad a las 24 horas
88,5
99,510
0 1 2 3
analistas
Prom
edio
de
UFC
/100
ml
4
Grafica 6. Reproducibilidad a las 48 horas de incubación.
Reproducibilidad a las 48 horas
88,5
99,510
0 1 2 3 4
Analistas
Prom
edio
de
UFC
/100
ml
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 41
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Grafica 7. Reproducibilidad a las 72 horas de incubación.
Reproducibilidad a las 72 Horas
11,411,611,8
1212,2
0 1 2 3 4
Analistas
Prom
edio
de
UFC
/100
ml
Grafica 8. Reproducibilidad a las 24, 48 y 72 horas de incubación.
Reproducibilidad a las 24,48 y 72 horas
0
5
10
15
0 20 40 60 8
Horas
Prom
edio
de
UFC
/100
ml
0
11.7 Robustez Insensibilidad de un método analítico a pequeños cambios en el procedimiento.
Para examinar la robustez es aconsejable forzar las condiciones del método de un modo
controlado.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 42
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Stock: 10 UFC E. coli / 100ml
Tabla 17. Robustez según la temperatura y el tiempo de incubación para el método de
filtración por membrana.
Analista
10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml
10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml
10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml
10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 11ufc/ml 11ufc/ml10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 11ufc/ml 12ufc/ml
10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 10ufc/ml 13ufc/ml 11ufc/ml23
24 horas 48 horas 72 horas *1
123
Analista
34ºC 35ºC 36ºC
El medio se deshidrata y se observan falsos negativos
Tabla 18. Promedio temperaturas de incubación, desviación estándar y coeficiente de variación
para filtración por membrana.
Promedio Promedio Promedio33ºC 35ºC 38ºC
1 9 ufc/ml 9 ufc/ml 9 ufc/ml 0 0
2 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 0 0
3 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 0 0
Analista Desviación estándar CV %
Tabla 19. Promedio horas de incubación, desviación estándar y coeficiente de variación
para filtración por membrana
Promedio Promedio Promedio24 horas 48 horas 72 horas
1 9 ufc/ml 9 ufc/ml 11,5ufc/ml 1,178 11,98
2 9,5 ufc/ml 9,5 ufc/ml 11,5ufc/ml 0,942 8,88
3 8,5 ufc/ml 8,5 ufc/ml 12 ufc/ml 1,649 17,07
Analista Desviacion estandar CV %
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 43
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Grafica 9. Robustez según temperatura para analista 1, 2 y 3
Robustez segun Temperatura para analista 1, 2 y 3
01020
33,5 34 34,5 35 35,5 36 36,5
temperatura
UFC
/ml
Grafica 10. Robustez según tiempo, analista 1.
Robuztez segun tiempo analista 1
9,510
10,511
11,5
0 20 40 60 8
Tiempo en Horas
UFC
/ml
0
Grafica 11. Robustez según tiempo, analista 2.
Robuztez segun tiempo analista 2
9,510
10,511
11,512
0 20 40 60 8
Tiempo en Horas
UFC
/ml
0
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 44
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Grafica 12. Robustez según tiempo, analista 3.
Robuztez segun tiempo analista 3
05
1015
0 20 40 60 8
Tiempo en Horas
UFC
/ml
0
STOCK 100 UFC de E. coli/ 100ml
Tabla 20. Reproducibilidad Sustrato definido Readycult según temperatura de incubación.
Tabla 21. Reproducibilidad Sustrato definido según tiempo de incubación.
Analista
1 P P P2 P P P3 P P P
33ºC 35ºC 38ºC
P* Reducción de color, de fluorescencia y la reacción del Indol es casi nula.
1 P P P*2 P P P*3 P P P*
Analista 72 horas * 48 horas24 horas
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 45
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
12. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS SUSTRATO DEFINIDO READYCULT Y FILTRACIÓN POR MEMBRANA
12.1 Comparación de los métodos de sustrato definido Readycult (A/P) y filtración por membrana en las diferentes fuentes de aguas potables
Tabla 22. Pruebas de filtración por membrana y sustrato definido Readycult
(Ausencia/Presencia) para aguas potables
R1 R2 R3 R1 R2 R3Pasoancho A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Juanito A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
La Esperanza A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLa Paz A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlPotosi A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlCoclies A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Nueva Navarra A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLas Villas A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
La Concepción A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Carlos A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan pablo A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Bosques de Silecia A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra I A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra II A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAlgarra III A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Prados del Mirador A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Rafael A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlCambulos A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Liberia A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlSan Miguel A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlLa Mariela A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Parcelacion Santa Isabel A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlEl Rudal A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Portachuelo A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100mlAmerica 500 años A A A 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml 0 ufc/100ml
Filtracion por membrana sin diluciónPuntos Muestreados
Sustrato definidoAusencia/Presencia (A/P)
Sin dilución
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 46
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
Figura 6. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult en diferentes tipos de aguas potables
Figura 7. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult en diferentes tipos de aguas potables
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 47
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
12.2. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en la planta galán (PGT), en la planta del alto del águila (PAA) y en la planta regional tratada para aguas tratadas no potables
Tabla 23. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult
Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Galán (PGT) y en la planta del alto del Águila (PAA) para
aguas tratadas no potables
Tabla 24. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult
Ausencia/Presencia (A/P) en la planta Regional para aguas
tratadas no potables
Figura 8. Comparación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido
Readycult en las plantas de tratamiento (aguas tratadas no potables)
Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 41 1 0 1 3 0 0 1 0
E. coli Coliformes totales
Coliformes totales E. coli Coliformes
totalesColiformes
totalesColiformes
totalesColiformes
totalesColiformes
totales
Ausencia/Presencia (A/P) A A A A A A AA
filtración membrana
Planta Galán (PGT) Planta del alto del Águila (PAA)Replica 4
Método Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4Filtración 5 5 7 8Readycult A A A A
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 48
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
12.3. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult Ausencia/Presencia (A/P) en las fuentes de agua cruda
Tabla 25. Comparación de los métodos de filtración por membrana y Readycult
Ausencia/Presencia (A/P) en las fuentes de agua cruda
Nota: En este caso se entiende como (P) la presencia de Coliformes totales (C.T) y E.coli
y (A) la ausencia de los mismos
FUENTE E. coli C.T E. coli C.T E. coli C.TArteza 102 105 90 92 61 65 P P P P P
Rio Frio 2 6 6 8 5 9 A A A P PBorrachero 0 5 4 11 0 4 A A A P P
Clavel 0 12 0 7 2 9 A A A P PLa Hoya 4 6 4 10 2 8 A A A P PNeusa 2 4 2 5 0 4 A A A P P
Replica 2 Replica 3 Replica 2
Filtración por membrana (dilución 10-2)
Replica 1Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1
Readycult Ausencia/Presencia (A/P) (dilución 10-2)
Readycult Ausencia/Presencia (A/P) sin dilución
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 49
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
13. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Debido a que la validación es un proceso que permite demostrar que un método es capaz de
cumplir la función a la cual esta destinado; detectar o cuantificar un microorganismo o un grupo
de microorganismos con la exactitud y precisión requeridas, y según el método secundario de
validación o verificación cuyo objetivo es recopilar los datos que permitan demostrar que el
laboratorio es capaz de cumplir con las especificaciones establecidas en la validación primaria,
se emplean una seria de datos estadísticos para determinar que realmente los métodos de
filtración por membrana y sustrato definido, empleados para la detección de Coliformes totales
y Escherichia coli en aguas crudas, tratadas y potables, son realmente eficaces y arrojan
resultados confiables.
Con los resultados obtenidos en la validación se demuestra que el método de filtración por
membrana, empleando tres tipos de microorganismos, E.coli, Citrobacter freundii y Klebsiella
pneumonie, es mas sensible que sustrato definido Readycult, ya que como se muestra en las
tablas 2, 5 y 8 y de acuerdo a su límite de cuantificación donde se utilizó un análisis estadístico
de tipo descriptivo para hallar dicho límite, el primer método mencionado es capaz de detectar
concentraciones a partir de 1ufc/100ml, que correspondió a la ultima dilución 10 -7 partiendo de
un stock de 1600 ufc/ 100 ml.
De esta manera se denota que dicha técnica es capaz de hallar microorganismos a la más
mínima concentración. Se debe resaltar que el método de filtración por membrana es una
técnica que concentra las bacterias en una membrana de 0.45 µm y de ahí su efectividad para
hallar microorganismos a bajas concentraciones, además el medio utilizado Chromocult es
bastante especifico y sensible.
Mientras que el método Readycult de Merck (A/P) demostró que su límite de detección es a
partir de 22 UFC/100ml ya que como se muestra en las tablas 2 ,5 y 8, cuando se llevó a cabo
un recuento de 20 UFC/100ml para Citrobacter freundii, 18 UFC/ 100 ml para Klebsiella
pneumoniae y 21 para E. coli, el método mostró ausencia en los tres casos, mientras como se
menciono anteriormente, al evaluar cantidades iguales o mayores a 22 UFC/ml el método
demostró presencia en todas las replicas para los tres microorganismos.
Mediante el estudio se demuestra que la sensibilidad se hace menor en Readycult (A/P) a
medida que las diluciones se hacen más grandes demostrándose así que dicho método es
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 50
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
incapaz de detectar microorganismos a concentraciones muy bajas, mientras que
filtración por membrana es capaz de detectar la mínima concentración posible.
Aunque el método de filtración por membrana requiere de más pasos, se demostró que es
más sensible que el método de Ausencia/Presencia Readycult. Esta razón, lo hace el método
de preferencia para el análisis microbiológico de aguas potables.
Se debe tener en cuenta que la variabilidad de los resultados entre una replica y otra, o entre
diferentes microorganismos, se debe básicamente a que estos no son solutos como los iones,
que para análisis químicos se puede asumir su distribución homogénea. Cuando están
introducidos en el agua, los microorganismos no forman una solución perfecta sino una
suspensión que imparte un grado significativo de heterogeneidad inherente. (David P Sartory,
2005)
Asimismo, hay una variabilidad impartida por las células microbianas en una muestra, por
encontrarse en las diferentes etapas de crecimiento, el estado de estrés en el que se
encuentren y el estado metabólico a la hora del análisis. (David P Sartory, 2005)
Todos estos factores afectan la respuesta de las bacterias en los métodos cuantitativos que
requieren crecimiento selectivo, dando lugar a una variabilidad natural significativa en la
recuperación de microorganismos del agua, que debe ser considerada al idear los protocolos
analíticos y estadísticos para comparar métodos cuantitativos, particularmente cuando la
población microbiana que se encuentra en muestras de rutina tiende a ser muy baja, como en
el caso del agua potable. (David P Sartory, 2005)
Por otro lado, al determinar la robustez de ambos métodos (Tablas16,17,18 y graficas
9,10,11,12 ) se encontró en el caso de filtración por membrana, empleando medio Chromocult,
que la técnica es robusta entre 33 y 38 ºC, lo que indica que en este rango de temperatura no
se observa ninguna variación ya que el número de colonias no se modifica, se mantiene en 10
UFC/100ml en todos los casos, mientras que cuando se varia el tiempo de incubación se
observa que el numero de colonias se mantiene entre 24 y 48 horas pero cuando se excede
este tiempo y se determina el numero de colonias a las 72 horas, en el caso de Filtración por
membrana el numero de colonias aumenta, además el medio se deshidrata y los filtros de
membrana tienden a deformarse.
Así mismo, cuando se determina la robustez de la técnica Readycult se encuentra que entre
33 y 38ºC la técnica muestra presencia de E.coli, la cual se evidencia por cambio de color,
fluorescencia e Indol positivo.
Mientras que cuando se evalúa el tiempo, la técnica es robusta entre 24 y 48 horas, ya que a
las 72 horas se disminuye notablemente el color al igual que la fluorescencia y la presencia del
Indol, debido a que el metabolismo de las bacterias disminuye a medida que el sustrato del
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 51
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
medio desaparece y se hace menor, haciendo que las bacterias lleguen a una fase de
decadencia y de muerte.
En cuanto a la reproducibilidad, como se observa en las tablas 16,19 y 20 y en las graficas 5, 6,
7 y 8, el medio es reproducible entre 24 y 48 horas entre 33 y 38 ºC pero no es reproducible a
las 72 horas, ya que en este tiempo el número de bacterias tiende a aumentarse y a presentar
falsos positivos.
La repetibilidad analizada como el grado de acuerdo entre los resultados obtenidos usando un
mismo stock para 5 analistas, como se observa en la tabla 14, y tras las mismas condiciones
de trabajo, temperatura y tiempo, demuestran que los resultados para la técnica por filtración
por membrana no varían notablemente, ya que la concordancia de los datos, determinada por
el coeficiente de variación, no excede el 20% lo que indica que dichos resultados mantienen
una similitud entre los diferentes analistas y las replicas analizadas.
Según la tabla 21 y figuras 6 y 7, se demuestra que el proceso de Potabilización del agua que
se lleva a cabo en el acueducto de Zipaquira es efectivo, ya que los resultados obtenidos en el
estudio muestran la ausencia total de Coliformes totales y por ende de E. coli. Por esta razón
se determina que para aguas potables es necesario emplear el método de filtración por
membrana. De igual manera, se debe utilizar filtración por membrana para aguas tratadas ya
que como se muestra en la tabla 22, el número de microorganismos presentes solo es
detectado por filtración por membrana.
Por otro lado, para aguas crudas (ver tabla 23, figura 8) se determina que Readycult es 100%
efectivo si únicamente se necesita determinar la ausencia o presencia de Coliformes totales o
de E. coli, debido a que la carga microbiana es lo suficientemente alta. Sin embargo, si se
desea determinar el número de la población microbiana presente en el agua, se puede hacer
uso del método de filtración por membrana mediante el empleo de diluciones.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 52
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
CONCLUSIONES
Se demuestra a través del estudio, que el método de filtración por membrana es capaz
de detectar concentraciones a partir de 1 UFC/100 ml, mientras que el método de
Ausencia/Presencia Readycult 100 de Merck detecta a partir de 22 UFC/100ml.
Se comprobó la sensibilidad de las técnicas de filtración por membrana y Readycult
100 de Merck, determinando que la primera tiene una sensibilidad del 100% lo que la
hace más efectiva.
Las dos técnicas son 100% específicas para Coliformes totales y E. coli, ya que
permiten evidenciar sus características metabólicas.
Las dos técnicas utilizadas demostraron ser altamente repetibles, reproducibles y
robustas entre 33ºC y 38ºC y en un rango de tiempo 24 a 48 horas.
Se comprueba que para aguas potables, tratadas o crudas con dilución igual o mayor a
10-2, es indispensable utilizar la técnica de filtración por membrana, mientras que para
aguas crudas o con una alta carga microbiana, se puede utilizar el método de
Readycult 100 de Merck.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 53
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
RECOMENDACIONES
Se recomienda utilizar filtración por membrana en aguas potables y tratadas, cuando se
sospeche que el agua a analizar tiene baja carga microbiana o cuando se empleen diluciones
mayores a 10-2 para aguas crudas, ya que se comprobó que estas mantienen una
concentración baja de microorganismos que no son detectables por la técnica Readycult 100
de Merck. Además, se debe tener en cuenta la morfología y el color de la colonia ya que si se
presentan microorganismos atípicos se sugiere realizar coloración de Gram y pruebas
bioquímicas para determinar la veracidad de los resultados.
Al igual, se debe tener presente que en ambos métodos es indispensable la temperatura y el
tiempo de incubación, el cual no debe exceder de 48 horas y así mismo se debe mantener
siempre un rango de temperatura entre 33 y 38ºC para garantizar de esta manera unos buenos
resultados.
Cuando se realicen diluciones se debe tener la mayor precisión posible y se sugiere en aguas
crudas practicar diluciones iguales o mayores a 10-2 para poder hacer un fácil recuento de las
colonias.
Es necesario cumplir a cabalidad todos los pasos de la técnica, ya que el proceso de validación
se realizó de acuerdo al método estandarizado propuesto por el Standar Methods para filtración
por membrana y Merck para Readycult 100. Si se lleva a cabo una variación por parte del
laboratorio en las técnicas propuestas, es necesario llevar a cabo un nuevo proceso de
validación.
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ANEXO ESPECIFICACIONES
INSTALACIONES Y EQUIPOS. En general todas las instalaciones y los equipos deben mantenerse limpios y en condiciones
adecuadas de trabajo. Se deben monitorear las operaciones de mantenimiento y revisar
regularmente los instrumentos de monitoreo.
REACTIVOS 1. Solución Tiosulfato de Sodio 0.1N: c ( Na2S2O3 5 H2O) = 0.1mol/l
MERCK: 1.09147.1000.
2. Colorantes de Gram:
A. Violeta de Gram (100ml): Colorante primario tinción de gram. ALBOR QUIMICOS
Composición: C25H30C1N3 0.68%
C2H5OH 10 %
C2H2O4 (NH3)2*H2O 0.4%
Cristal violeta 2.0 g
Oxalato de amonio 0.8 g
Alcohol etílico 20 ml
Agua destilada 80 ml
B. Lugol (300 ml). LAB. SAR LTDA Composición: Yodo metálico 1g
Yoduro potásico 2g
Agua destilada 300 ml
C. Alcohol acetona (100ml) LAB. SAR LTDA
Composición: Acetona al 0.1% 1 ml
Alcohol absoluto 100 ml
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D. Fucsina de Gram (100ml): LAB. SAR LTDA Composición: Fucsina básica 0.25g
Alcohol etílico 95% 10 ml
Agua destilada 90 ml
3. Aceite de inmersión: MERCK Índice de refracción (n D 20º)= 1.516
4. REACTIVO DEL INDOL seg. KOVACS: MERCK 109293 Para la demostración del Indol producido microbianamente, para la identificación de
microorganismos Indol positivos e Indol negativos, seg. KOVACS (1928)
Fundamento: Diversos microorganismos son capaces de escindir el triptófano, presente en
abundancia, especialmente en la peptona sometida a digestión tríptica, dando ácido pirúvico,
amoniaco e Indol. Este reacciona con 4-dimetilaminobenzaldehído dando una coloración rojo-
oscura. No obstante dado que también el triptófano da una reacción coloreada con el 4-
dimetilaminobenzaldehído, es necesario hacer una separación del Indol. Este último se
consigue con Butanol, el cual extrae selectivamente al Indol.
Composición: n-Butanol, ácido clorhídrico, 4-dimetilaminobenzaldehído
EQUIPOS: 1. Embudo y Portafiltros metálico:
SM 16201/19/20 de SARTORIUS.
El equipo del soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente al autoclave, porcelana o
acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de
cierre o mantenido en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que el
filtro de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa del receptáculo, sin que
sufra daño mecánico, de manera que todo e liquido pase a través de la membrana durante la
filtración.
2. Bomba eléctrica de vacío: SM 16612/16615 de SARTORIUS
3. Soporte de los embudos y portafiltros:
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SM 16826 de SARTORIUS:
Actúa sobre la presión del agua para asegurar la filtración de la totalidad de la muestra.
4. Dosificador Jeringa: SM 16685 de SARTORIUS
Se utiliza para dosificar pequeños volúmenes de agua estéril entre filtraciones
5. Microscopio: Modelo CHT N. 3C0319 Marca OLYMPUS OPTICAL CO, LTDA.
Un microscopio óptico tiene objetivos con diferente aumento. El objetivo de alto aumento con
aceite de inmersión permite la observación de la morfología del microorganismo en suspensión
acuosa o después de coloreado. El microscopio debe estar equipado preferiblemente con un
objetivo de contraste de fase y con un condensador para mejorar el examen de los cultivos
vivos. Nota: Se pueden usar instrumentos con bajo poder de aumento (microscopio con láminas) e
idealmente estereoscopios con focalización para la realización del examen de colonias de
bacterias en un medio de cultivo de agar.
6. Incubadora: Tipo B53 N. 901686 WTC BINDER Una incubadora esta constituida por una cámara capaz de mantener una temperatura estable,
distribuida uniformemente dentro de ± 1ºC, a menos que se especifique de otro modo.
La incubadora debe estar ocupada por un sistema de regulación de la temperatura, el cual
debe mantenerse uniforme y estable para los volúmenes de trabajo.
Si la temperatura del ambiente se encuentra cerca o es mayor que la de la incubadora, es
conveniente adicionar un sistema de enfriamiento a la cámara.
Las paredes de la incubadora deben estar protegidas de los rayos directos del sol.
Si es posible, la incubadora no se debe llenar completamente en una sola operación, porque
los medios de cultivo requieren mucho tiempo para lograr el equilibrio de la temperatura,
cualquiera que sea el tipo de cultivo que requieren mucho tiempo para lograr el equilibrio de la
temperatura, cualquiera que sea el tipo de incubadora que se use (por convección de aire
forzado o cualquier otro).
Durante la carga de la incubadora, se debe tener en cuenta la circulación del aire; bajo ninguna
circunstancia se deben colocar las cajas de Petri; estas deben separarse por lo menos 25 mm.
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7. Autoclave: Modelo 25x Marca All American.
El autoclave es un instrumento, que proporciona vapor saturado a una temperatura de por los
menos 121 ºC (245 kpa), cuyo objetivo es destruir microorganismos.
Durante el mismo ciclo de esterilización el autoclave no debe usarse para esterilizar material
limpio (y /o medio de cultivo) y/o para descontaminar material ya usado (y/o medio de cultivo ya
usado). Es preferible usar autoclaves por separado para estos dos procesos.
El autoclave debe estar equipado con:
• Al menos una válvula de seguridad;
• Un medidor de presión;
• Una llave de drenado;
• Un dispositivo de regulación que permita mantener la temperatura entre ±1 ºC del valor
establecido;
Un termómetro o un registro de termocupla.
Además, el autoclave debe estar provisto preferiblemente con un indicador de duración o un
programador de tiempo.
En el caso de esterilización con vapor, todo el aire debe expulsarse entes de que el equipo sea
presurizado. Si el autoclave no posee un dispositivo de evacuación automático, se debe
remover el aire hasta que haya emisión continua de vapor.
8. pHmetro: 320/SET WTW
El medidor de PH se usa para medir la diferencia de potencial, a una determinada temperatura,
entre el electrodo de medida y otro usado como referencia. Ambos electrodos deben
introducirse en el producto. El medidor de PH debe ser capaz de medir con una resolución de ±
0.1 unidades de PH y la mínima medida del umbral de 0.001 unidades de PH: El medidor de
PH debe equiparse con corrección por temperatura manual o automática.
Nota: El electrodo de medición y el de referencia se agrupan usualmente en un sistema de
electrodos combinados.
Se usa para medir el PH de cada lote del medio de cultivo y el de los reactivos y para verificar,
si se necesita un ajuste de PH. Además, se pude usar para medir y o ajustar el PH de la
muestra de ensayo o de la suspensión inicial. El uso del medidor de PH se debe discutir en la
norma específica del producto que se va a analizar en la cual se especifica las condiciones
para la determinación del PH, para el ajuste del PH, así como el método de limpieza y de
descontaminación de los electrodos.
9. Balanza: SP 250 Scientech
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Un laboratorio de microbiología de alimentos debe estar equipado con balanzas con el
rango y la resolución adecuadas para los diferentes productos que se requieren pesar. En
general, se necesitan dos grados de resolución: ± 0.01g y ± 0.0001 g.
Estas balanzas se usan principalmente para el pesaje de la porción de ensayo de la muestra
que se va a analizar, de los componentes del medio de cultivo y de los reactivos. Además es
posible usarlas para la medición de volúmenes por peso de los fluidos de dilución.
10. Lámpara UV: MERCK 13203 Para la detección de sustancias fluorescentes.
La lámpara UV puede utilizarse para la demostración de E.coli mediante la escisión del MUG
en los medios de cultivo que contienen esta sustancia.
DATOS TÉCNICOS: Potencia: 4 Watios
Longitud de onda: 366 nm
Baterías: 5 de 1,5 V
Peso: aprox. 400g
Medidas: 16x9x2.5 cm.
MEDIOS DE CULTIVO 1. READYCULT Coliformes 100: MERCK 1.01298.001 Test de presencia ausencia para la detección simultanea de Coliformes totales y E. coli en el
análisis de agua.
FUNDAMENTO: La elevada calidad nutricional de las peptonas y el tampón fosfato
incorporado garantizan un rápido crecimiento de los Coliformes mientras que el Lauril sulfato
inhibe de forma sustancial la flora acompañante, especialmente la grampositiva. La detección
simultanea de Coliformes y E. coli es posible por el sustrato cromogénico X-GAL y el sustrato
fluorogénico MUG. Una coloración azul-verdosa del caldo indica la presencia de Coliformes
totales, y la de E.coli por una fluorescencia azul bajo luz UV (365nm).
COMPOSICION en g/cápsula: Triptosa 0.5; Sodio cloruro 0.5; sorbitol 0.1; Triptófano 0.1; Di-
potasio hidrogeno fosfato 0.27; Potasio dihidrogenado fosfato 0.2; Lauril sulfato Sodio sal 0.01;
X-GAL 0.008; MUG 0.005; IPTG 0.01.
2. CHROMOCULT Agar para Coliformes: MERCK 10426 Agar selectivo para la identificación simultánea de Coliformes totales y E.coli en muestras de
agua y de alimentos.
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FUNDAMENTO: Gracias a la acción conjunta de peptonas selectas, piruvato y tampón de
fosfatos se garantiza un rápido crecimiento también de coniforme con daños subletales. El
contenido en Lauril Sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacterias grampositivas, sin
tener influencias negativas sobre el crecimiento de Coliformes.
La identificación simultanea de Coliformes totales y E.coli se hace posible de dos sustitos
cromógenos.
El sustrato Salmon-GAL es encendido por el enzima β-D galactosidasa característico de de
Coliformes y provoca una coloración roja de las colonias de Coliformes. La identificación de la
β-D-glucoronidasa característica para E.coli tiene lugar mediante el sustito X-glucoronido, cuyo
producto de escisión produce una coloración azul de las colonias positivas. Ya que E.coli
enciende tanto Salmon-Gal como X-glucoronido, las colonias se tiñen de violeta azul oscuro y
debido a ello son fáciles de diferenciar de las restantes Coliformes, que se presentan de color
rojo.
El contenido en triptófano mejora la reacción de Indol para la confirmación adicional de E.coli y
aumenta con ella la seguridad de identificación en combinación con la reacción Salmon-GAL y
la reacción X-glucoronido.
COMPOSICION g/litro: Peptona 3.0; cloruro sódico 5.0; dihidrogenofosfato potásico 1.7;
hidrogenofosfato dipotásico 3.0; piruvato sodico1.0; triptófano; Agar-agar 21.0; Lauril sulfato
sódico 0.1; mezcla de cromógenos 0.2
PREPARACIÓN: Disolver 27 g/l en agua desmineralizada por calentamiento en el baño de
agua hirviendo o en vapor fluente.
NO AUTOCLAVAR, enfriar de 45-50ºC y verter en las cajas.
pH: 6.8± 0.1 a 25ºC.
3. AGAR PLATE COUNT: Agar–peptona de caseína-glucosa-extracto de levadura MERCK 5463. Medio de cultivo exento de sustancias inhibitorias y de indicadores, concebido esencialmente
para la determinación del número total de gérmenes en leches, productos lácteos, aguas y
otros minerales.
Por su composición corresponde a lo prescrito en la APHA para el análisis de leche y productos
lácteos (1985) y de agua (1981), en las normas analíticas apartado 35 de la LMBG para el
análisis de alimentos y a los productos derivados del huevo (1975)
COMPOSICIÓN g/litro: Peptona de caseína 5.0; extracto de levadura 2.5; D(+)-glucosa 1.0;
Agar-agar 14.0.
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PREPARACIÓN: Disolver 22.5 g/litro y esterilizar en autoclave (15 min. a 121ºC)
pH: 7.0± 0.1
Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.
4. CALDO BRILA: Caldo-verde brillante-bilis-lactosa. MERCK 5454 Para el enriquecimiento selectivo y numeración de Escherichia coli en aguas, leche alimentos
y otros materiales mediante la determinación del titulo o según la técnica de NMP.
FUNDAMENTO: La bilis y el verde brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora
indeseable acompañante.
La fermentación de la lactosa con formación de gas, que es un indicativo de la presencia de
E.coli, se demuestra mediante campanas DURHAM.
Los restantes Coliformes no fecales también crecen en este medio, pero caso siempre sin
formación de gas.
COMPOSICIÓN: Peptona 10.0; lactosa10.0; bilis de buey desecada 20.0; verde brillante
0.0133
PREPARACIÓN: Disolver 40g/litro, distribuir en tubos de ensayo provistos de campana de DURHAM y esterilizar
en autoclave (15 min. a 121ºC)
pH: 7.2± 0.1
El caldo preparado es claro de color verdoso.
5. CALDO LACTOSA: MERCK 7661 Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo previo orientado a Bacterias
Coliformes especialmente de E.coli.
FUNDAMENTO: La utilización de lactosa se demuestra por la formación de gas, que se recoge
en campanas de DURHAM
COMPOSICIÓN g/litro: Peptona de gelatina 5.0; extracto de carne 3.0; lactosa 5.0
PREPARACIÓN: Disolver 13 g/litro, distribuir en tubos de ensayo provistos de campanas
DURHAM y esterilizar en autoclave (15mim a 121ºC)
pH: 6.9±0.1
El caldo preparado es claro e incoloro.
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CEPAS 1. Escherichia coli: OXOID CULTI-LOOPS
C 750
QTY: 10
LT: 6088911
2006/07/31
2. Klebsiella pneumoniae
CMDM-PUJ 095
ATCC700603
3. Citrobacter freundii.
CMDM -PUJ
ATCC 8090
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BIBLIOGRAFIA
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2. HACH, 2000. Manual de Análisis de Agua. Edición segunda. HACH COMPANY.
Loveland, Colorado; EE.UU. 217 páginas.
3. MILLIPORE, 2005. Análisis Microbiológico. 2005 edición. Madrid, España. 48 páginas.
4. MERCK, 1994. Manual de medios de Cultivo. MERCK. Darmstad, Alemania. 364
páginas.
5. JAIME, Carolina. 2002. Validación de desinfectantes usados en las áreas de producción de
una industria farmacéutica en Bogota. Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología Industrial. Bogota. 89 páginas.
6. CORTES, Alejandra. 2002. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales
preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología Industrial. Bogota. 93 páginas
7. CARDENAS, Zulma; FAJARDO, Gineth, 2002. Validación de la prueba de Endotoxinas
bacterianas para productos Farmacéuticos inyectables mediante el Método de Gelificación “
Lisado de Amebocito de Limus” (L.A.L). Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología Industrial. Bogota. 131
páginas.
8. SARTORIUS, 2003. Microbiological Testing of Foods, Beverages and Pharmaceuticals.
SARTORIUS. Publication No.:SM-4017-e97116. Goettingen, Germany. 19 páginas.
9. Manafi, M. New approaches for the fast detection of indicators, in
particular enzyme detection methods (EDM). 1998
10. NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4092 Reglas generales para análisis
microbiológico 11. ENAC, 2002. Guía para la Acreditación de Laboratorios que realizan Análisis
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12. CENIACUA, 2005. Seminario Internacional, el agua y los riesgos Microbiológicos para la
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13. David P Sartory, 2005. Review Validation, verification and comparison:
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14. CARRIE M. LEWIS* AND JEANNIE L. MAK. 1989. Comparison of Membrane Filtration and
Autoanalysis Colilert Presence-Absence Techniques for Analysis of Total Coliforms and
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 63
Validación de los métodos de filtración por membrana y sustrato definido Readycult para la detección de E.coli y Coliformes totales en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de Zipaquirá.
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15. EPA. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration
Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium) . 2002. EPA 821-R02 – 024.
Sandra Carolina Alfaro Garzón María Ximena Rojas Sánchez 64