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Validación de metodologías analíticas para la determinación de
productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Nancy Yohanna Velandia Rodríguez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
Año 2013
Validación de metodologías analíticas para la determinación de
productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Nancy Yohanna Velandia Rodríguez
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Química
Director:
Ph.D., Jairo Arturo Guerrero Dallos
Línea de Investigación:
Residualidad ambiental – Química analítica
Grupo de Investigación:
Residualidad y destino ambiental de plaguicidas en sistemas agrícolas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
Año 2013
A Cami Linares…Eres toda mi fuerza
Agradecimientos A Camila, mi brújula, mi fuerza, mi motivo, mi soporte y mi apoyo, mi mejor amiga y mi
compañía, gracias por entender, por ensañarme más de lo que yo te he enseñado a ti,
por abrazarme y darme tu apoyo y tus sabias palabras cuando más lo he necesitado
¡Eres mi ángel!.
A mi mami, la mujer a la que admiro, la persona más buena que conozco, quien me ha
puesto con sus tiernas manos, con su amor y su ayuda incondicionales en el lugar donde
estoy, sin ella no hubiera dado ni el primer paso.
A mi director, el profe Jairo, por haberme acogido en su equipo de trabajo y haberme
transmitido todo su conocimiento, por la paciencia, el apoyo, la confianza, la colaboración
y también por los regaños, que de vez en cuando, son útiles y necesarios.
A Julio César, mi mejor amigo, gracias por la compañía y por hacerme sonreir, vale
mucho más de lo que parece.
A mi Dianita, por estar allí en todos los momentos difíciles y con palabras sabias
ayudarme a levantar la cabeza. Gracias por hacerme ver que no hay que tener miedo,
incluso si las estrellas se desvanecen.
A mis amigos del LARP, Jamer, Darío, Danny y Alexander, gracias por enseñarme tanto,
por su colaboración durante mis primeros meses en el laboratorio y por hacerme sentir
como en casa.
A los profesores del departamento de Química, por haber contribuido en mi formación, la
misma que hoy continúa y culmina una nueva etapa.
VIII Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
A la Universidad Nacional y a la Facultad de Ciencias por su programa de becas de
exención y finalmente, al Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas – LARP y al
Organismo Internacional de Energía Atómica, por la colaboración y la financiación de
éste trabajo.
Resumen y Abstract IX
Resumen Los ditiocarbamatos son fungicidas ampliamente utilizados en la agricultura a nivel
mundial. La etilentiourea (ETU) y propilentiourea (PTU), los principales compuestos de
degradación del mancozeb y propineb, respectivamente son de especial importancia, ya
que están clasificados como carcinógenos y teratogénicos. El objetivo principal del
presente trabajo consistió en desarrollar y validar metodologías para la determinación de
ETU y PTU como productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos en frutas y
hortalizas y en suelos.
Para la determinación de los analitos en frutas y hortalizas se seleccionó y optimizó un
método de extracción utilizando una mezcla de MeOH: agua 3:1 y posterior limpieza con
partición liquido-líquido soportada sobre Extrelut. Así mismo se seleccionó una
metodología para el análisis de ETU y PTU en suelo, la cual consistió en una extracción
con agitación manual fuerte durante dos minutos utilizando 20 mL de agua y 10 g de
suelo previamente secado y homogenizado. En los dos casos, la determinación analítica
se llevó a cabo por HPLC – DAD.
Se realizó la validación en las dos matrices, encontrando que la metodología es
selectiva, específica, precisa, robusta y exacta, presentando límites de detección y
cuantificación adecuados para el análisis de ETU y PTU en frutas y hortalizas y en
suelos.
Utilizando las metodologías validadas se llevó a cabo la determinación de residuos en
algunas muestras de papa y tomate obtenidas en el mercado local y en una zona de
comercialización primaria, y suelos de cultivo de papa. Los análisis muestran la
presencia de PTU a nivel de trazas en una muestra de papa y de ETU en una muestra
de tomate. Las concentraciones determinadas se encuentran por debajo del límite
máximo de residuos de Sudáfirca, el cual el más estricto. Se encontró presencia de PTU
a nivel de trazas en una de las muestras de suelo analizadas.
Palabras clave: Ditiocarbamatos, etilentiourea, propilentiourea, frutas y horatlizas,
metabolitos, productos de degradación
X Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Abstract Dithiocarbamates are widely used fungicides in agriculture worldwide. In Colombia,
Mancozeb and Propineb are some of the best-selling fungicides and they are applied in
main crops. Ethylenethiourea (ETU) and propylenethiourea (PTU), the main degradation
products of Mancozeb and Propineb, respectively, are particullary important because they
are classified as carcinogens and teratogenics. The aim of this study was to develop and
to validate methodologies in fruits and vegetables and in soils for determination of ETU
and PTU as degradation products of dithiocarbamate fungicides.
For the determination of analytes in fruits and vegetables were considered four methods
of extraction, and after evaluation process of the performance of each one, was selected
and optimized an extraction method using a mixture of MeOH: water 3:1 and subsequent
cleaning liquid-liquid partition supported on Extrelut. Similarly, was selected a
methodology for the analysis of ETU and PTU in soil, which consisted of extraction of 10
g of dry and homogenized soil during two minutes using 20 mL of water. In both cases,
the analytical determination was carried out by HPLC - DAD.
The Validation methodology was performed. In both cases, the methodology is selective,
specific, robust and accurate, showing limits of detection and quantification suitable for
the analysis of ETU and PTU in fruits and vegetables and soils.
Using validated methodologies, it was carried out the determination of residues in some
potato and tomato samples obtained in the local market and primary trading area, and
potato cropping soils. The analysis showed the presence of trace level of PTU in one
potato sample and the presence of ETU in one tomato sample. The determined
concentrations were below the maximum residue limit more stringent. The presence of
PTU was found at trace levels in one of the soil samples analyzed.
Keywords: palabras Dithiocarbamates, ethylenethiourea, porpylenethiourea, fruits and
vegetables, metabolites, degradation products.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen .............................................................................................................................. IX
Lista de figuras ................................................................................................................ XIV
Lista de tablas .................................................................................................................. XVI
Lista de gráficos ............................................................................................................ XVIII
Introducción ....................................................................................................................... 21
1. Capítulo 1. Estado del arte. ....................................................................................... 24 1.1 El problema con los plaguicidas ........................................................................ 27 1.2 Marco normativo ................................................................................................ 28
1.2.1 Límites máximos de residuos ................................................................. 30 1.3 Implicaciones toxicológicas y ambientales ....................................................... 31
1.3.1 Ditiocarbamatos y sus productos de degradación ................................. 31 1.3.2 ETU y PTU .............................................................................................. 33
1.4 Metodologías analíticas para la determinación de ETU y PTU a nivel de trazas35 1.4.1 Técnicas basadas en separación por cromatografía de gases ............. 36 1.4.2 Técnicas basadas en cromatografía líquida .......................................... 38
1.5 Justificación – planteamiento del problema ...................................................... 46
2. Capítulo 2. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en frutas y hortalizas ................................................... 49
2.1 Estándares de referencia, matrices de ensayo, equipos, materiales, solventes y reactivos ..................................................................................................................... 50
2.1.1 Estándares de referencia ....................................................................... 50 2.1.2 Matrices de ensayo ................................................................................ 50 2.1.3 Materiales y equipos ............................................................................... 51 2.1.4 Reactivos y solventes ............................................................................. 51
2.2 Sistema instrumental ......................................................................................... 52 2.3 Preparación y homogenización de la muestra .................................................. 52 2.4 Selección de la metodología – Parte experimental .......................................... 52
2.4.1 Extracción con solventes de baja polaridad (M1) .................................. 53 2.4.2 Dispersión de matriz en fase sólida (M2) ............................................... 54 2.4.3 Metodología QuEChERS (M3) ............................................................... 55 2.4.4 Extracción con solventes polares – Limpieza con partición (M4) ......... 57
2.5 Selección de la metodología - Resultados y discusión .................................... 58 2.5.1 Extracción con solventes de baja polaridad M1 .................................... 58 2.5.2 Dispersión de matriz en fase sólida M2 ................................................. 60
XII Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
2.5.3 Metodología QuEChERS M3 ................................................................. 65 2.5.4 Extracción con solventes polares M4 .................................................... 66
2.6 Optimización de la metodología – parte experimental ..................................... 70 2.6.1 Optimización de la etapa de limpieza .................................................... 70 2.6.2 Optimización de la etapa de extracción ................................................. 71
2.7 Optimización de la metodología - Resultados y discusión ............................... 71 2.8 Evaluación de la metodología con diferentes matrices – Parte experimental . 78 2.9 Evaluación de la metodología con diferentes matrices – Resultados .............. 79 2.10 Validación de la metodología – Parte experimental ......................................... 80
2.10.1 Especificidad-Selectividad ...................................................................... 80 2.10.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología....................... 80 2.10.3 Linealidad – Efecto matriz ...................................................................... 81 2.10.4 Exactitud ................................................................................................. 82 2.10.5 Precisión ................................................................................................. 83 2.10.6 Robustez de la metodología................................................................... 83
2.11 Validación de la metodología – Resultados ...................................................... 84 2.11.1 Especificidad-Selectividad ...................................................................... 85 2.11.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología....................... 86 2.11.3 Linealidad –Efecto matriz ....................................................................... 89 2.11.4 Exactitud ................................................................................................. 93 2.11.5 Precisión ................................................................................................. 95 2.11.6 Robustez de la metodología................................................................... 97
2.12 Cuantificación de los analitos en muestras comerciales ................................ 100 2.12.1 Análisis de muestras ............................................................................ 103
3. Capítulo 3. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en suelos ..................................................................... 107
3.1 Equipos, materiales, estándares de referencia, solventes y reactivos .......... 108 3.1.1 Estándares, solventes y reactivos ........................................................ 108 3.1.2 Matrices de ensayo .............................................................................. 108 3.1.3 Materiales y equipos ............................................................................. 109 3.1.4 Reactivos y solventes ........................................................................... 109 3.1.5 Sistema instrumental ............................................................................ 110
3.2 Preparación y homogenización de la muestra – Suelos de ensayo .............. 110 3.3 Selección de la metodología – Parte experimental ........................................ 110 3.4 Selección de la metodología – Resultados y discusión.................................. 112 3.5 Validación de la metodología – Parte experimental ....................................... 113
3.5.1 Especificidad-Selectividad .................................................................... 113 3.5.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología..................... 113 3.5.3 Linealidad – Efecto matriz .................................................................... 114 3.5.4 Precisión ............................................................................................... 116 3.5.5 Robustez de la metodología................................................................. 116
3.6 Validación de la metodología – Resultados y discusión ................................ 117 3.6.1 Especificidad-Selectividad .................................................................... 117 3.6.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología..................... 118 3.6.3 Linealidad –Efecto matriz ..................................................................... 121 3.6.4 Exactitud ............................................................................................... 124 3.6.5 Precisión ............................................................................................... 125 3.6.6 Robustez de la metodología................................................................. 127
3.7 Determinación de residuos de ETU y PTU en suelos de uso agrícola .......... 129
Contenido XIII
3.7.1 Zona de muestreo ................................................................................ 130
4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 135 4.1 Conclusiones ................................................................................................... 135 4.2 Recomendaciones ........................................................................................... 136
Anexo 1: Cálculos estadísticos ..................................................................................... 139
Anexo 2: Datos Validación ............................................................................................. 147
Anexo 3: Resultados análisis de muestras .................................................................. 158
Bibliografía ....................................................................................................................... 161
Contenido XIV
Lista de figuras Figura 1. Cromatogramas obtenidos en detector ECD y NPD para extracto blanco de manzana fortificado con ETU a 0.05mg/kg [15]. ................................................................ 37 Figura 2. Proceso de extracción en fase solida. [17] ......................................................... 39 Figura 3. Cromatogramas CL-EM en modo SIM para una solución estándar utilizando (A)APCI y (B) ESI. (1) ETU, 0.5 µgml−1; (2) PTU, 0.5 µgml−1; (3) dazomet, 1 µgml−1; (4) thiram, 1µgml-1; and (5) disulfiram, 1 µgml−1. [20] ........................................................... 41 Figura 4. Proceso general para la extracción mediante DMFS. ........................................ 42 Figura 5. Determinación simultanea de Maneb y sus Metabolitos de degradación (1) ETU; (2) EBIS; (3) EU; (4) Maneb. [22] ....................................................................................... 42 Figura 6. Fase estacionaria [24] utilizada para la separación de ETU por Tölgyesi et. al. [23] ...................................................................................................................................... 44 Figura 7. Cromatogramas obtenidos para blanco de tomate y blanco fortificado con ETU 0,007 mg/kg [23] ................................................................................................................. 44 Figura 8. Cromatograma del análisis de ETU a diferentes concentraciones. ................... 46 Figura 9. Procedimiento de extracción = M1. .................................................................... 54 Figura 10. Procedimiento para dispersión de matriz en fase sólida = (M2) ...................... 55 Figura 11. Procedimiento para metodología QuEChERS = M3.[23] ................................. 56 Figura 12. Procedimiento para extracción con solventes polares = M4 ............................ 57 Figura 13. Cromatograma blanco de matriz, estándar y blanco fortificado extracción M1 58 Figura 14. Estructura porosa del carbón activado. ............................................................ 60 Figura 15. Grupos superficiales presentes en la superficie del carbón activado. ............. 61 Figura 16 Efecto de la forma del soluto en la fuerza de retención sobre la superficie de carbón grafitizado ............................................................................................................... 62 Figura 17. Representación esquemática de la retención de un analito polar con a. Carga positiva y b. Carga negativa, aproximándose a la superficie del grafito. .......................... 62 Figura 18. Blanco de matriz, estándar y recuperado metodología M2 C18. ..................... 63 Figura 19. Blanco de matriz y estándar metodología M3 .................................................. 65 Figura 20. Estructura adsorbente PSA ............................................................................... 66 Figura 21. Estándar, blanco y blanco fortificado para el ensayo con la metodología M4 . 67 Figura 22. Esquema del proceso de partición líquido-líquido soportado sobre extrelut. .. 72 Figura 23. Tautomerismo tiona-tiol en ETU y PTU ............................................................ 73 Figura 24. Tautomeria tiona-tiol catalizada. ....................................................................... 74 Figura 25. Procedimiento para la determinación de ETU y PTU en frutas y hortalizas. ... 78 Figura 26. Cromatograma obtenido para blanco de matriz y mezcla de analitos. Especificidad de la metodología. ........................................................................................ 85
Contenido XV
Figura 27. Cromatograma obtenido al fortificar el extracto de matriz blanco con los analitos al límite de detección 0.003 mg/kg ETU y 0.006 mg/kg PTU. ............................. 88 Figura 28. Cromatograma de muestra de papa PTU en trazas. Confirmación de señal con adición estándar. ............................................................................................................... 104 Figura 29. Cromatograma de muestra de tomate ETU en trazas. Confirmación de señal con adición estándar ......................................................................................................... 105 Figura 30. Cromatograma obtenido para extracto de suelo blanco y mezcla de analitos. Especificidad de la metodología. ...................................................................................... 118 Figura 31. Cromatograma obtenido al fortificar el extracto de suelo blanco con los analitos al límite de detección 0.01 mg/kg ETU y 0.02 mg/kg PTU. ............................................. 120 Figura 32. Cromatograma de extractos de suelo blanco inyectados en columna C18 150 mm y C18 250 mm comparados con inyección de estándar en solvente. ...................... 129 Figura 33. Zonas de muestreo Cundinamarca. ............................................................... 131 Figura 34. Cromatogramas de análisis de muestra de suelo región de Ubaté (Cundinamarca) con presencia de PTU a nivel de trazas. Confirmación con adición de estándar. ........................................................................................................................... 132
XVI Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Lista de tablas Pág.
Tabla 1. Plaguicidas más vendidos en Colombia en 2007 ................................................ 26 Tabla 2. Estructuras de ditiocarbamatos ............................................................................ 33 Tabla 3. Porcentajes de recuperación y coeficientes de variación para M1 ..................... 59 Tabla 4. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M1 ............. 59 Tabla 5. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M2 C18 ..... 64 Tabla 6. Exactitud y precisión para la metodología M4 ..................................................... 66 Tabla 7. Criterios de selección de la metodología. ............................................................ 69 Tabla 8. Concentraciones de los niveles de calibración .................................................... 81 Tabla 9. Criterios de aceptación linealidad ........................................................................ 82 Tabla 10. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. ............ 83 Tabla 11. Diseño experimental para evaluación de la robustez. ....................................... 84 Tabla 12. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación ................................................................................................... 86 Tabla 13. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación .............................................................................................. 87 Tabla 14. Límites de detección y cuantificación estimados ............................................... 87 Tabla 15. Recuperación al límite de cuantificación 0.010 mg/kg ETU y 0.020 mg/kg PTU............................................................................................................................................. 88 Tabla 16. Efecto matriz pata ETU. ..................................................................................... 90 Tabla 17. Efecto matriz para PTU. ..................................................................................... 90 Tabla 18. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente .............................. 93 Tabla 19. Resultados ensayo de exactitud (n=7) ............................................................... 94 Tabla 20. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad. ................................. 96 Tabla 21. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia ..................... 96 Tabla 22. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método ................................... 97 Tabla 23. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez. .................. 99 Tabla 24. Resultados de monitoreo de residuos de ETU y PTU en muestras de papa y tomate ............................................................................................................................... 103 Tabla 25. Propiedades fisicoquímicas de la calicata utilizada en la validación de la metodología ...................................................................................................................... 109 Tabla 26. Resultados selección de la metodología de extracción en suelos. ................. 112 Tabla 27. Concentraciones de los niveles de calibración ................................................ 115
Contenido XVII
Tabla 28. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. .......... 116 Tabla 29. Diseño experimental para evaluación de la robustez. ..................................... 117 Tabla 30. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación ................................................................................................. 118 Tabla 31. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación ............................................................................................ 119 Tabla 32. Límites de detección y cuantificación estimados ............................................. 119 Tabla 33. Recuperación al límite de cuantificación 0.020 mg/kg ETU y 0.040 mg/kg PTU .......................................................................................................................................... 120 Tabla 34. Efecto matriz pata ETU. ................................................................................... 121 Tabla 35. Efecto matriz para PTU. ................................................................................... 121 Tabla 36. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente ............................ 123 Tabla 37. Resultados ensayo de exactitud de la metodología n=7. ................................ 124 Tabla 38. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad. ............................... 125 Tabla 39. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia ................... 126 Tabla 40. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método ................................. 126 Tabla 41. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez. ................ 127 Tabla 42. Resultados de análisis de muestras de suelo de uso agrícola ....................... 131 Tabla 43. Linealidad ETU Solvente. Frutas y hortalizas. ................................................. 147 Tabla 44. Linealidad PTU Solvente. Frutas y hortalizas. ................................................. 148 Tabla 45. Linealidad ETU Matriz. Frutas y hortalizas. ..................................................... 149 Tabla 46. Linealidad PTU Matriz. Frutas y hortalizas. ..................................................... 150 Tabla 47. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en solvente. Frutas y hortalizas. ............................................................................................ 151 Tabla 48. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en matriz. Frutas y hortalizas. ............................................................................................... 151 Tabla 49. Análisis de varianza ETU solvente. Frutas y hortalizas................................... 152 Tabla 50. Análisis de varianza PTU solvente. Frutas y hortalizas................................... 152 Tabla 51. Linealidad ETU Solvente. Suelo. ..................................................................... 153 Tabla 52. Linealidad PTU Solvente. Suelo. ..................................................................... 154 Tabla 53. Linealidad ETU Matriz. Suelo. .......................................................................... 155 Tabla 54. Linealidad PTU Matriz. Suelo. .......................................................................... 155 Tabla 55. Resultados muestras de papa con señales en tiempo de retención PTU ...... 158 Tabla 56. Resultados confirmación de muestras de papa con señales, repetición de ensayo y adición estándar. ............................................................................................... 158 Tabla 57. Resultados muestras de tomate con señales en tiempo de retención ETU ... 159 Tabla 58. Resultados confirmación de muestras de tomate con señales en el tiempo de retención de ETU, repetición de ensayo y adición estándar. .......................................... 159
Contenido XVIII
Lista de gráficos Gráfico 1. Destino geográfico de plaguicidas en Colombia. [5] ......................................... 26 Gráfico 2. Efecto del pH en la recuperación en la etapa de limpieza. ............................... 75 Gráfico 3. Efecto de la adición de sal en la recuperación en la etapa de limpieza. .......... 76 Gráfico 4. Volumen de diclorometano necesario para le elución de los analitos. ............. 77 Gráfico 5. Efecto de la composición del extractante en la recuperación de la metodología.............................................................................................................................................. 77 Gráfico 6. Evaluación de la recuperación de la metodología optimizada para a. ETU y b. PTU en diferentes matrices. ............................................................................................... 79 Gráfico 7. Curvas de calibración en solvente y en matriz ETU. ........................................ 91 Gráfico 8. Curvas de calibración en solvente y en matriz PTU. ........................................ 92 Gráfico 9. Número de registros nacionales de productos que contienen mancozeb o propineb por tipo de cultivo. ............................................................................................. 101 Gráfico 10. Curvas de calibración en solvente y en matriz ETU. .................................... 122 Gráfico 11. Curvas de calibración en solvente y en matriz PTU. .................................... 123
Contenido XIX
21
Introducción De 1960 a 1990 la agricultura experimentó un gran incremento en la productividad en
muchas regiones del mundo, la producción de maíz, trigo, arroz y otros cultivos se
duplicó, logrando el suministro de alimentos y estabilización de sus precios. Este periodo
se denominó Revolución Verde y se caracterizó por el mejoramiento genético de los
cultivos, la innovación de nuevos plaguicidas, fertilizantes, grandes obras de irrigación,
asesoría técnica a los productores para fomentar el uso de nuevas tecnologías y la
mecanización de las labores agrícolas. A partir de 1990, los efectos negativos de la
Revolución Verde empezaron a reflejarse con la pérdida de la biodiversidad agrícola y el
uso indiscriminado de productos químicos. Hoy en día en las grandes regiones
productoras, los productores abandonaron las variedades locales por variedades
mejoradas provocando los monocultivos de maíz, trigo, sorgo y algodón, por citar algunos
cultivos. Asimismo, en cierto grado con los plaguicidas se han contaminado los suelos y
las fuentes de agua.
A pesar de lo anterior, el desafío actual de la agricultura es aumentar la producción de
alimentos y aunque la tendencia es hacia métodos alternativos que involucran el control
de plagas mediante manejo integrado y la implementación de agricultura orgánica, se
debe suplir la demanda de una población que crece de forma exponencial y que para
2050 probablemente superará los 9.000 millones de personas. En este escenario los
plaguicidas son de especial importancia, pues su utilización permite controlar las plagas
de una forma económica y eficiente para asegurar el abastecimiento de alimentos, pues
usarlos significa que hay un suministro abundante y variedad de productos de alta
calidad a precios razonables. La sociedad moderna exige alimentos nutritivos libres de
daños causados por las plagas lo cual sería muy difícil sin el uso de plaguicidas. Sin
embargo, dado que son sustancias sintéticas que han sido fabricadas para ser biocidas,
existe un riesgo potencial de que residuos de ésta moléculas queden como
contaminantes en los alimentos y su efecto detallado sobre la salud se desconoce.
22 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Dentro del grupo de los plaguicidas, los fungicidas son de especial importancia pues son
usados ampliamente en la industria, la agricultura, el hogar y el jardín para múltiples
propósitos entre los cuales se incluyen la protección de semillas y granos durante su
almacenamiento, germinación y transporte; la protección de cultivos, eliminación de
mohos y hongos que atacan superficies, protección de alfombras y telas entre muchos
otros. Existen más de 100 especies de hongos que atacan los cultivos produciendo
enfermedades en las plantas, proliferando sobre los alimentos y causando su
descomposición o contaminándolos con toxinas. El 80% de las patologías vegetales se
debe a la presencia de hongos y se conocen más de 50 especies de estos que producen
daños de gran importancia comercial. Para combatirlos se han sintetizado cientos de
fungicidas y varias decenas de ellos tienen aplicación hoy para la agricultura, en forma de
pulverizaciones foliares, en gránulos para tratamiento del suelo, como recubrimiento para
semillas y para tratamiento de los frutos. Dado que existe una gran variedad de
moléculas empleadas como fungicidas, el potencial que tienen para causar efectos
adversos en los humanos varía enormemente. Históricamente, algunas de las epidemias
más trágicas de envenenamiento por fungicidas han ocurrido mediante el consumo de
semillas de granos que fueron tratadas con mercurio orgánico o hexaclorobenceno. Sin
embargo, es improbable que la mayoría de los fungicidas que se utilizan en la actualidad
causen severos envenenamientos frecuentes o sistémicos debido a varias razones. En
primer lugar, muchos de ellos tienen una toxicidad inherente baja para los mamíferos y
son absorbidos ineficazmente. En segundo lugar, muchos fungicidas se formulan en una
suspensión de polvos y gránulos absorbentes en agua, por lo cual una absorción rápida y
eficiente es improbable. En tercer lugar, los métodos de aplicación son tales que
relativamente son pocos los individuos que están altamente expuestos. Aparte de los
envenenamientos sistémicos, los fungicidas son responsables probablemente de un
número desproporcional de daños irritantes a la piel, las membranas mucosas y
sensibilización cutánea.
La biotransformación de los plaguicidas puede dar como resultado sustancias de
reducida toxicidad o químicamente inactivas, como ocurre con el metabolito final del
dimetoato. Por el contrario, pueden generarse sustancias tóxicamente más activas que el
compuesto original, como es el caso del carbosulfán al transformarse en carbofurán, o
del paratión que da origen al paraoxón, metabolitos con alta afinidad por el ADN y con
Capítulo 1 23
capacidad mutágena importante. Es el caso de los fungicidas ditiocarbamatos, que son
considerados como de baja toxicidad, sin embargo, sus principales metabolitos,
Etilentiourea y Propilentiourea presentan elevada toxicidad y alta movilidad en el
ambiente.
En Colombia los fungicidas ocupan un renglón importante en el mercado de
agroquímicos, siendo el Mancozeb el más vendido y aplicado. La presencia de productos
de degradación de elevada toxicidad como residuos en los productos agrícolas, tanto de
consumo interno como de exportación puede tener implicaciones en diferentes ámbitos.
Dado que en Colombia no se han desarrollado metodologías para la determinación de
ETU y PTU en matrices como suelo o frutas y hortalizas, este trabajo pretende optimizar
y validar metodologías analíticas para la determinación de estos productos de
degradación, optimizando el método de extracción y limpieza, así como la separación
cromatográfica y la detección de los analitos, con el fin de obtener porcentajes de
recuperación adecuados y bajos limites de cuantificación.
24 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
1. Capítulo 1. Estado del arte.
Según estudios de la FAO y de la división de población del departamento de asuntos
económicos y sociales de las Naciones Unidas, en el año 2050 la población mundial será
de 9 billones de personas, cifra dos veces superior a la registrada para 1980 [1],motivo
por el cual la producción de alimentos deberá ser casi el doble de la actual. Al mismo
tiempo, la disponibilidad de tierras para labranza disminuirá como resultado de la
urbanización. Resolver el problema implica la necesidad de elevar los rendimientos
agrícolas, proteger mejor a los cultivos y al ganado contra la agresión de las plagas,
incrementar la extensión de tierras cultivables y lograr que la gente disponga de más
dinero para la adquisición de alimentos. El aumento de la producción alimentaria
mediante la utilización de agroquímicos es de especial importancia, sobre todo para los
países en desarrollo.
Actualmente no es posible obtener altos rendimientos en la agricultura sin la utilización
de medidas de protección de plantas, entre las cuales los plaguicidas siguen teniendo
una participación considerable, aunque los enfoques han cambiado significativamente. Si
bien los plaguicidas ayudan a producir alimentos y fibras de manera más fácil,
abundante, económica y eficiente, su uso intensivo y desmedido ha traído como
consecuencia resultados bastante contradictorios. Por un lado, el uso de productos
fitosanitarios o agroquímicos han contribuido a incrementar la disponibilidad de alimentos
y el uso del insecticida DDT ha evitado que más de mil millones de individuos padezcan
de malaria. Así mismo, en países tropicales cuando no se protegen los cultivos, los
rendimientos bajan y con frecuencia son nulos debido a la pérdida que causan las
plagas. Pero por otro lado, los plaguicidas aún están causando efectos adversos para el
medio ambiente, la salud pública y los enemigos naturales, así como riesgo en la salud
Capítulo 1 25
humana. Según la UNESCO (2005) cada año resultan afectados por plaguicidas entre
3,5 y 5 millones de personas en el mundo. De la misma manera se hace notar que, por
ejemplo, en estados unidos, ¾ partes del agua subterránea de california se encuentra
contaminada por residuos de actividades agrícolas, entre ellos, los plaguicidas [2].
La utilización de plaguicidas dentro de una agricultura sostenible debe considerar los
mecanismos de control necesarios con el fin de garantizar que debido a ellos no existan
efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente. Teniendo conciencia de la
problemática que representan los residuos de plaguicidas en los alimentos, se establecen
los límites máximos de residuos LMR con el fin de proteger la salud de los consumidores.
Así mismo, determinar la distribución del plaguicida en los diferentes compartimentos
ambientales permite adquirir conocimientos más exactos sobre su movilidad en el medio
ambiente, así como los procesos que afectan su persistencia y biodisponibilidad, con el
fin de evaluar el impacto ambiental real que puede tener su uso.
La determinación de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas, así como en
productos alimenticios es en la actualidad de gran importancia a nivel mundial, ya que es
un requisito de calidad que asegura la inocuidad del producto y en el cual se hace énfasis
en la normatividad de comercialización de productos agrícolas a nivel internacional.
En países industrializados el monitoreo de residuos de plaguicidas y de sus productos de
degradación de importancia toxicológica en alimentos se realiza continuamente. Aunque
el control de los plaguicidas es más eficaz en estos países, se han reportado alimentos,
tales como leche o frutas y verduras, con niveles residuales de plaguicidas por encima de
los límites máximos [3, 4]. Para sustentar los resultados de los análisis de residuos de
plaguicidas realizados en alimentos, es primordial emplear técnicas y metodologías
sistemáticas que permitan la extracción, separación, identificación y cuantificación.
Además, es importante validar los métodos considerando varios parámetros de calidad,
entre ellos, precisión (repetibilidad y reproducibilidad), límites de detección (LD) y límites
de cuantificación (LC) con el fin de demostrar de forma experimental y previamente a su
utilización, que el método es adecuado para el propósito que se ha fijado y que produce
resultados confiables y reproducibles.
Colombia es un país principalmente agrícola y el mercado de plaguicidas incluye
principalmente insecticidas, herbicidas y fungicidas, dominado principalmente por un gran
número de filiales y multinacionales. En la industria nacional principalmente existen
26
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Capítulo 1 27
Mancozeb y Propineb pertenecen a la familia química de los ditiocarbamatos (DTCs), que
son fungicidas no sistémicos utilizados considerablemente debido a su eficiencia frente a
un amplio espectro de hongos y enfermedades de las plantas asociadas a ellos.
Recientemente se ha incrementado la preocupación respecto a los peligros que pueden
causar los residuos de este tipo de compuestos y productos de transformación. La
etilentiourea (ETU) y propilentiourea (PTU), principales Metabolitos de degradación de
Mancozeb y Propineb, respectivamente, son de especial importancia debido a que los
estudios han mostrado que poseen efectos carcinógenos y teratogénicos [6].
1.1 El problema con los plaguicidas
La FAO define los plaguicidas como cualquier sustancia destinada a prevenir, destruir,
atraer, repeler o combatir cualquier plaga, incluidas las especies indeseadas de plantas o
animales, durante la producción, almacenamiento, transporte, distribución y elaboración
de alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales, o que pueda administrarse
a los animales para combatir ectoparásitos. El término incluye las sustancias destinadas
a utilizarse como reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes,
agentes para reducir la densidad de fruta o inhibidores de la germinación, y las
sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el
producto contra el deterioro durante el almacenamiento y transporte. El término no
incluye normalmente los fertilizantes, nutrientes de origen vegetal o animal, aditivos
alimentarios ni medicamentos para animales [7].
Cuando se habla de plaguicidas es estrictamente necesario citar la relación
riesgo/beneficio que su uso implica. En la actualidad no es posible desarrollar una
agricultura con altos rendimientos sin la utilización de medidas de protección de cultivos,
entre las cuales los plaguicidas químicos siguen teniendo una participación significativa.
El empleo sistemático de plaguicidas en la agricultura se inicio hace algo más de cien
años y su consumo ha ido aumentando. Es bien sabido que la utilización de plaguicidas
implica un peligro latente para los consumidores, debido a que tanto las sustancias como
sus productos de degradación o reacción pueden dejar residuos en los alimentos que
podrían generar efectos adversos para la salud pública, por lo cual, desde el punto de
28 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
vista toxicológico, resulta esencial mantener el nivel de residuos de plaguicidas en los
alimentos en niveles aceptables.
De la cantidad aplicada, la que toma contacto directo con el objetivo es solo un
porcentaje mínimo, por lo que es probable encontrar especies, comunidades o
ecosistemas completos con efectos colaterales indeseables. La contaminación de los
recursos hídricos es una de las preocupaciones más recientes y sobre la cual se ha
desarrollado un gran número de estudios con el fin de determinar la movilidad y el
destino ambiental de los plaguicidas, para conocer su distribución en los compartimentos
ambientales y así determinar si existe el riesgo de contaminación de aguas superficiales
o subterráneas.
A nivel mundial, los plaguicidas son controlados a través de un ciclo, en el cual se
consideran las etapas de producción, comercialización, transporte y mercadeo,
utilización, manejo de desechos y residualidad en el producto al consumidor y en el
medio ambiente. Para ello existen regulaciones internacionales que son acogidas por los
diferentes países del mundo. A nivel local, cada país crea su conjunto de normas de
acuerdo a su infraestructura y sus necesidades.
1.2 Marco normativo
A nivel internacional, acuerdos multilaterales se han suscrito con el fin de controlar la
producción y los mercados de plaguicidas, tales como el convenio de Róterdam para la
aplicación del procedimiento de consentimiento fundamentado previo a ciertos
plaguicidas y productos químicos peligrosos objeto del comercio internacional; el
Convenio de Basilea para el control de los desplazamientos transfronterizos de desechos
peligrosos y su eliminación por parte de los países generadores; el Convenio sobre los
contaminantes orgánicos persistentes –COPs- que reconoce que los contaminantes
orgánicos son un problema global, que se debe proveer asistencia técnica y tecnológica
a las Naciones en desarrollo para cumplir el convenio y señala la lista denominada “la
docena sucia”, que incluye igual número de químicos entre ellos el DDT. Para los países
Capítulo 1 29
andinos aplica la Resolución 630 de 2002 que es un manual técnico andino para el
registro y control de plaguicidas químicos de uso agrícola.
En cuanto al control de residuos de plaguicidas en alimentos y productos alimenticios, la
FAO y la OMS establecen la Comisión del Codex Alimentarius, que fue creada en 1963
para desarrollar normas alimentarias, reglamentos y otros textos relacionados tales como
códigos de prácticas bajo el Programa Conjunto FAO/OMS de Normas Alimentarias. Las
materias principales de este programa son la protección de la salud de los consumidores,
asegurar unas prácticas de comercio claras y promocionar la coordinación de todas las
normas alimentarias acordadas por las organizaciones gubernamentales y no
gubernamentales.
En Colombia se han creado mecanismos de regulación y control para todas las etapas
del ciclo de vida de un plaguicida, entre los cuales se tienen:
• Ley 9 de 1979: Código sanitario Nacional. Incluye normas generales sobre la
producción, formulación, almacenamiento, distribución, movilización y aplicación
aérea de los plaguicidas.
• Decreto 1843 de 1991. Reglamenta la Ley 9 de 1979 sobre uso y manejo de
plaguicidas con el objeto de evitar que afecten la salud de la comunidad, la
sanidad animal y vegetal o causen deterioro al medio ambiente
• Ley 430 de 1998. Regula la prohibición de introducir desechos peligrosos al país.
• Decisión 436 de 1998. Norma Andina para el Registro y Control de Plaguicidas
Químicos de Uso Agrícola
• Resolución 630 de 2002. Manual Técnico Andino para el Registro y Control de
Plaguicidas Químicos de Uso Agrícola.
• Resolución 00150 del 21 de enero de 2003 del ICA. Por la cual se adopta el
reglamento técnico de fertilizantes y acondicionadores de suelos para Colombia.
• Decreto 502 de 2003. Por el cual se reglamenta la decisión andina 436 de 1998
para el registro y control de plaguicidas químicos de uso agrícola.
• Resolución 770 de 2003. Por la cual se dictan disposiciones para el registro y
control de plaguicidas
• Resolución 3759 de 2003. Por la cual se dictan disposiciones sobre el Registro y
Control de los Plaguicidas Químicos de uso Agrícola
30 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
• Resolución 2906 de 2007. Por la cual se establecen los Límites Máximos de
Residuos de Plaguicidas – LMR en alimentos para consumo humano y en piensos
o forrajes.
Dentro de la legislación mencionada, es de especial importancia la resolución que
reglamenta los Límites máximos de residuos de plaguicidas en alimentos de consumo
humano. En su artículo 3 menciona que “los alimentos deberán cumplir con los límites
Máximos de Residuos de Plaguicidas –LMR- del Codex Alimentarius CAC/MRL 3,
actualizada al 2007”; cabe anotar que muchos de los productos agrícolas colombianos de
exportación corresponden a frutas exóticas, para las cuales no se tienen Límites
máximos de residuos; en este caso, la legislación de la unión europea, reglamenta un
LMR de 0.01 mg/kg por defecto. Sin embargo, la legislación estadounidense en sus
criterios de importación indica que si un producto presenta residualidad de un
contaminante para el cual no se tienen establecidos límites máximos de residuos
específicos en esa matriz, el producto debe ser rechazado, lo cual se convierte en una
barrera no arancelaria para la exportación colombiana.
1.2.1 Límites máximos de residuos
En general no pueden utilizarse productos fitosanitarios a menos que se haya establecido
científicamente que no producen efectos perjudiciales en los consumidores, agricultores
o terceros y que son suficientemente eficaces. Los alimentos deben de estar libres de
residuos de plaguicidas o las concentraciones halladas deben ser lo más bajas posibles,
pero se deben cumplir con los límites máximos de residuos. El límite máximo de residuos
LMR es la concentración máxima de residuos de un plaguicida (expresada en mg/kg),
legalmente aceptada en alimentos o piensos.
Los LMR se calculan con base en datos de residuos de plaguicidas en productos que han
sido sembrados y cosechados bajo los lineamientos de las buenas prácticas agrícolas
(BPA) y datos toxicológicos del plaguicida y tienen por objeto garantizar que los
alimentos sean seguros para el consumidor. Para asegurarse de que los LMR sean lo
más bajos posibles, quienes soliciten su establecimiento deben presentar información
Capítulo 1 31
científica bajo lineamientos de BPL sobre las cantidades mínimas de plaguicida
necesarias para proteger una cosecha y el nivel de residuos que quede en el producto
después de dicho tratamiento.
En la comunidad europea, Reglamento (CE) nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del
Consejo, de 23 de febrero de 2005, relativo a los límites máximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal, compila en un solo texto y
armoniza los límites aplicables a los diferentes productos de alimentación humana o
animal, y fija un límite máximo aplicable por defecto para las sustancias no contempladas
en dicho reglamento. Mediante programas plurianuales comunitarios y nacionales
actualizados cada año, los Estados miembros realizan controles de los residuos de
plaguicidas para verificar el cumplimiento de los LMR. Dichos controles consisten, en
particular, en la toma de muestras, en la realización de análisis y en la identificación de
los plaguicidas presentes, así como sus niveles de residuos respectivos. Algunos países
de la comunidad europea desarrollan sus propios programas de evaluación para
establecer LMR propios del país, es el caso de Alemania y Países bajos.
Para nuestro país es de especial importancia la existencia de laboratorios de
investigación y prestación de servicios acreditados, en donde se lleve a cabo el
desarrollo de metodologías analíticas que permitan evaluar los residuos de plaguicidas y
sus compuestos de degradación a concentraciones, por lo menos, iguales a los LMR
establecidos en los países hacia los cuales se realizan las exportaciones de productos
agrícolas colombianos, con el fin de garantizar la inocuidad de los alimentos exportados,
dado que las legislaciones son, en muchos casos más estrictas que las nacionales.
1.3 Implicaciones toxicológicas y ambientales
1.3.1 Ditiocarbamatos y sus productos de degradación
Como familia química, los EBDCs son considerados como fungicidas con una amplia
gama de usos incluyendo el control de plagas tempranas y tardías para tratar
enfermedades en cultivos de vegetales, frutas y cereales.
32 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Los ditiocarbamatos fueron patentados en los años 30, pero fueron los derivados del
acido dimetilditiocarbamico y etilenbisditiocarbamico los que se popularizaron en mayor
medida en los años 40. Los ditiocarbamatos N-monosustituidos incluyendo sales del
acido N,N-etilenbisditiocarbámico con manganeso (maneb), zinc (zineb) y mezcla
manganeso/zinc (Mancozeb) y propilenbisditiocarbamatos de zinc (Propineb) son de
amplia aplicación. En la Tabla 2 se observan las estructuras correspondientes a algunos
ditiocarbamatos. Las sales sódicas son fácilmente solubles en agua y no son adecuadas
para utilizar como fungicidas protectores superficiales debido al riesgo de fitotoxicidad y a
su poca fijación a la superficie de las plantas. Los ditiocarbamatos convertidos a
derivados de sales metálicas o derivados disulfuro son menos solubles y son usados
como protectores superficiales.Bajo condiciones acidas, los ditiocarbamatos se
descomponen en disulfuro de carbono y la amina correspondiente, lo cual significa que
los ácidos ditiocarbámicos son inestables y su aislamiento como ácidos libres es
imposible.
El Mancozeb, fungicida de mayor uso en Colombia, en cuanto al destino ambiental es
considerado como de baja persistencia, con un tiempo de vida media en suelo de 6 a 15
días, degradándose principalmente por fotólisis e hidrólisis. En el suelo se retiene
ligándose fuertemente a los coloides y el humus; es considerado de baja movilidad
debido a su elevado valor de Koc ( 363 - 2334 mL/g, [8] )
En agua es poco soluble, degradándose por hidrólisis; puede contaminar aguas
superficiales por aspersiones aéreas o terrestres propias del uso del producto, a través
del agua de irrigación o por movilización sobre agregados de suelo transportados por
erosión. Dado su alto coeficiente de adsorción tiene poca posibilidad de lixiviarse y
contaminar aguas subterráneas. Debido a su baja presión de vapor (<0,0075 mmHg) no
presenta efecto de contaminación del aire. Sin embargo, su principal metabolito de
degradación, la ETU, es un compuesto que aunque presenta un tiempo de vida media en
suelos no estériles menor a dos días, es soluble y estable en agua y presenta un bajo
coeficiente de adsorción (Kd 0,51-1,13 [8]), encontrándose en estudios realizados en
cinco tipos de suelos a 8 cm de la superficie al cabo de 21 días [9].
Capítulo 1 33
Tabla 2. Estructuras de ditiocarbamatos
Según dictámenes técnicos ambientales para producción e importación de Mancozeb
existe un límite para el contenido de ETU como impureza en el ingrediente activo,
máximo 2g/kg, pero no se concluye sobre el impacto ambiental y toxicológico de la ETU
como producto de degradación del Mancozeb en la emisión del dictamen técnico y
ambiental para los productos [10].
1.3.2 ETU y PTU
Recientemente se ha prestado mucha atención a la presencia de residuos de ETU en
muestras de alimentos tratados con EBDCs. La ETU puede encontrarse presente como
contaminante en el plaguicida, resultante de su proceso de fabricación, o puede provenir
Compuesto Estructura
Mancozeb
Maneb
Metiram
Metam Sodio
Propineb
Thiram
34 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
de la degradación del EBDC. De la misma manera, residuos de PTU pueden ser
encontrados en productos tratados con Propineb. Las cantidades presentes pueden
variar de una muestra a otra, ya que estudios han mostrado que la producción de ETU a
partir del bisditiocarbamato está influenciada por las condiciones de almacenamiento, en
especial, por variables como la temperatura, humedad y presencia de luz.
La cantidad de ETU formada por degradación de EBDCs depende de la estabilidad del
compuesto padre, del sustrato y de las condiciones de reacción. Bajo condiciones
neutras y alcalinas, incrementos en la temperatura promueven la formación de ETU.
Los estudios experimentales sobre la transformación de los ditiocarbamatos en los
cultivos y en el suelo, indican que éstos se metabolizan a ETU, o permanecen
inalterados, [11] y que los efectos de la degradación son favorecidos por las altas
temperaturas y la acción de los rayos solares, que aumentan la velocidad de
metabolización, sobre todo en el trópico.
La ETU es una molécula estable químicamente. Ensayos con ratas tratadas durante 90
días a altos niveles de ETU muestran que la acumulación de ésta produce trastornos
tiroideos e induce defectos congénitos [12]. Experimentos toxicológicos han mostrado
que causa varios efectos patológicos, entre los que se encuentran efectos mutagénicos y
teratogénicos [13] . Los estudios toxicológicos en trabajadores expuestos a EBDCs y a
ETU no han sido suficientes para demostrar la asociación entre la exposición a ETU y las
anormalidades de tiroides, evidenciadas en ensayos con animales de experimentación.
Se ha demostrado también que cuando los productos agrícolas que contienen residuos
de EBDCs son sometidos a calentamiento, ocurre un aumento en la velocidad de
degradación a ETU; los niveles de ETU en los productos elaborados no guardan relación
alguna con la concentración del compuesto en los productos sin elaborar, sino que
dependen de las concentraciones específicas de EBDC en ciertas fases determinantes
del proceso de elaboración en las que tenga lugar el calentamiento, así como la duración
de este y la temperatura alcanzada [3, 14].
En su revisión, Houeto, et.al. [6], hace una recopilación de estudios en los que se han
encontrado pequeños residuos de ETU en alimentos comprados en las tiendas locales,
en su presentación final al consumidor, entre los cuales se encuentran tomates, jugo,
Capítulo 1 35
sopa y salsa de tomates, papas, pepinos, calabazas y melones. Incluso en productos
como la cerveza y el tabaco, en cigarrillos, se han detectado residuos de este compuesto
en cantidades apreciables.
En el codex alimentarius no existe LMR en la actualidad para ETU, sin embargo se
encontraba establecido un límite de 0,05 mg/kg, el cual fu revocado en 1997 con el
argumento que los niveles encontrados en los alimentos no guardan relación con los
niveles esperados por aplicación del compuesto padre. Así mismo, en la Comunidad
Europea no se encuentra reportado LMR para ETU o PTU, sin embargo, en los
programas anuales de monitoreo es evaluada su presencia con el fin de determinar si se
requiere el establecimiento de límites, dada su elevada toxicidad. En contraste, países
que tienen su propio sistema de evaluación de LMRs tienen establecido un valor límite
para el contenido de estos metabolitos en los alimentos. (Alemania 0.05 mg/kg; Países
Bajos 0.02 mg/kg; Sudáfrica 0.01 mg/kg ).
1.4 Metodologías analíticas para la determinación de ETU y PTU a nivel de trazas
El método oficial de la FDA para la determinación de EBDCs se basa en la obtención de
disulfuro de carbono como producto de la degradación acida y su posterior análisis por
cromatografía de gases. La limitante de esta técnica es que no puede diferenciar entre
los residuos provenientes de los diferentes ditiocarbamatos. Existen metodologías
actuales por medio de las cuales se pueden separar y medir los residuos de
ditiocarbamatos individuales, pero los LMR aun no han sido establecidos en función de
las cantidades particulares.
Las metodologías para la determinación de ETU y PTU han sido desarrolladas más
activamente en la actualidad, debido a que la presencia de éstos compuestos como
residuo en los alimentos es de gran preocupación por su toxicidad y efectos sobre la
salud humana. La metodología de la FDA no permite evaluar residuos de ETU o PTU
dado que dichos compuestos no evolucionan a CS2 en medio acido, sin embargo gran
variedad de metodologías han sido desarrolladas.
36 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
1.4.1 Técnicas basadas en separación por cromatografía de
gases
La IUPAC presentó una comunicación en 1977 [3] en donde se hace una revisión de las
técnicas de análisis reportadas y utilizadas hasta esa fecha, entre las cuales se nombran
la cromatografía en capa fina, la polarografía y técnicas con isotopos radiomarcados. Sin
embargo, fue la cromatografía de gases la técnica que se utilizo más ampliamente en un
principio para el análisis de residuos de ETU, utilizando una derivatización pre columna
para convertir la ETU en un derivado volátil y térmicamente estable, características
necesarias para el análisis por cromatografía de gases. Acoples a diferentes detectores
como el de captura electrónica, detector de ionización de llama o termoiónico son
utilizados en diferentes estudios, obteniéndose los límites de detección más bajos con el
detector de captura electrónica.
En una publicación más reciente [15] se realiza la determinación de ETU en productos
alimenticios utilizando dos pasos de derivatización previa. Las muestras se separan por
cromatografía de gases y la detección de hace en paralelo por ECD y NPD. Los
porcentajes de recuperación son entre el 82 y el 92% en tomates, peras, manzanas y
alimento para bebes, y los limites de detección son cercanos a 0.001 mg/kg. En la Figura
1 se observan los cromatogramas obtenidos para un blanco fortificado de extracto de
manzana; se puede ver que la separación cromatográfica del derivado de la ETU es
adecuada.
Utilizando esta metodología, se obtienen bajos límites de detección y buena separación,
sin embargo, el proceso es bastante engorroso y costoso, ya que para los pasos de
derivatización se requiere cloruro de bencilo como primer reactivo derivatizante y además
la adición de 50 mL de metanol y 30 minutos de calentamiento con reflujo.
Posteriormente, se realizan dos extracciones con 10 mL de DICLOROMETANO cada
una, los cuales se descartan. Seguidamente se agregan 9 mL de solución de KOH y 10
mL más de DICLOROMETANO, para posteriormente llevar el extracto a sequedad y
someterlo a la segunda derivatización agregando 0,5 mL de anhídrido trifluoroacético al
10% en tolueno. Se deja en reposo 15 minutos a temperatura ambiente, se evapora a
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38 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
1.4.2 Técnicas basadas en cromatografía líquida
Dada la polaridad y la solubilidad en agua de la ETU, es posible pensar en su
determinación utilizando cromatografía liquida con el fin de realizar el análisis del
compuesto sin realizar pasos de derivatización precolumna, dado que esta técnica
permite el análisis de compuestos polares de poca volatilidad. Los primeros estudios que
se realizaron empleando cromatografía liquida tenían acoples al sistema cromatográfico
con un detector UV; posteriormente se encuentran reportes en los cuales se hace la
determinación en un detector de arreglo de diodos, pero recientemente se han publicado
un gran número de estudios en los cuales se utiliza el acople con el detector selectivo de
masas, el cual proporciona la valiosa herramienta de la identificación del analito, así
como mejoras en la separación dada su selectividad. El uso de este detector implica la
optimización de condiciones de ionización para minimizar el efecto de la matriz.
El desafío de la implementación de esta técnica involucra el procedimiento de extracción
y limpieza de la muestra. Variedad de tácticas analíticas han sido reportadas, y en la gran
mayoría la tendencia es llevar el consumo de solventes, la cantidad de muestra, el
tiempo y complejidad del procedimiento analítico al mínimo, en conjunto con la obtención
de porcentajes de recuperación cercanos al 100% y limites de detección cada vez
menores.
Para ello se han implementado metodologías como la extracción en fase sólida (EFS) y
la dispersión de matriz en fase sólida (DMFS), que son procesos con los cuales el
consumo de solventes es, por mucho, 10 veces menor que con las metodologías
tradicionales de extracción, como son la partición liquido-liquido, utilizando tan solo 10 o
15 mL de solventes y pasando de cantidades como 5 g de muestra, a tan solo 0,5 g
además de disminuir el tiempo de análisis en un 80%.
La EFS es una potente y simple técnica de extracción y limpieza de muestras que es, al
mismo tiempo, rápida y económica. Una columna de EFS consiste en un lecho
adsorbente de partículas gruesas mantenido entre dos discos porosos en un tubo
Capítulo 1 39
desechable. La EFS permite la pre-concentración de la muestra con un riesgo mínimo de
pérdida o contaminación de la misma. El componente de interés resulta retenido en una
fase sólida mientras que los contaminantes de la matriz se eluyen.
Inicialmente se realiza un paso de activación, en el que se utiliza un solvente orgánico
para humidificar la fase. Seguidamente, la fase estacionaria se acondiciona con el mismo
solvente de la matriz; esto permite adecuar las cadenas de fase estacionaria lejos de la
superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria.
Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, permitiendo que lo analitos
sean retenidos en la parte superior de la columna. Para maximizar las interacciones entre
loa analitos y la fase estacionaria, la mezcla (analitos + matriz) debe cargarse a
aproximadamente 3mL/min, así los componentes de interés han de retenerse en el
adsorbente mientras que la matriz y los contaminantes se eluyen y descartan. En estas
tres etapas debe mantenerse húmedo el adsorbente, puesto que el secado del mismo
acarrearía una pérdida de muestra.
Utilizando un solvente, o una serie de solventes de polaridad adecuada, pueden
eliminarse del adsorbente las interferencias hasta que solo los analitos de interés queden
atrapados, para por último realizar la elución de los analitos con un solvente adecuado
generalmente a 1mL/min. El adsorbente y la interacción analito-adsorbente determinan el
solvente final de elución. En la Figura 2 se observa el esquema para el procedimiento de
EFS.
Figura 2. Proceso de extracción en fase solida. [17]
En el análisis de residuos de plaguicidas la extracción en fase sólida ha tenido un amplio
uso, como lo reporta Brouwer et. al.[18], en una revisión sobre métodos de determinación
de plaguicidas y otros contaminantes en sistemas acuáticos. Las técnicas
40 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
cromatográficas acopladas on-line a la EFS proporcionan un aumento en la velocidad del
análisis, en la selectividad y sensibilidad, y una considerable disminución del uso de
solventes y de los límites de detección, así como en la cantidad de muestra usada.
Geerdink et.al. [19], realiza una reseña sobre la determinación de plaguicidas en agua,
donde se puede ver como se usa la EFS seguida de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas para la determinación multiresiduo de 86 contaminantes en
agua de rio. Así mismo, la EFS con posterior análisis por cromatografía liquida acoplada
a espectrometría de masas se uso para realizar el monitoreo de la presencia de
plaguicidas en aguas superficiales y subterráneas.
En 2004, Blasco & Picó [20], realizaron un estudio interesante en el cual por medio de
cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas, determinaron
simultáneamente tres fungicidas ditiocarbamatos y sus productos de degradación, ETU y
PTU, comparando las técnicas de extracción EFS y DMFS, utilizando diferentes
sorbentes tales como sílica, alúmina, carbón, extrelut, C8 y C18 y realizando la elución
de las interferencias con agua y la de los analitos con acetonitrilo, encontrando
porcentajes de recuperación aceptables para los compuestos padre (69-89%), pero
insuficientes para los productos de degradación ETU y PTU. En la Figura 3 se muestran
los cromatogramas obtenidos en este estudio y se puede ver que para la ETU y PTU es
en modo de ionización APCI donde se obtienen los mejores resultados.
Aunque los porcentajes de recuperación para ETU y PTU obtenidos en este estudio son
muy bajos (<20%) se puede considerar la posibilidad de aplicar esta metodología para
los compuestos de interés, ya que se argumenta que las recuperaciones fueron bastante
pobres, o nulas en algunos casos, debido a que la ETU y PTU no fueron retenidas en
ninguna fase estacionaria, debido a su alta solubilidad en agua y alta polaridad y a que
se trabajó con fases desactivadas con el fin de retener los demás analitos que se tenían
como objetivo del estudio. Trabajar con fases estacionarias o dispersantes más polares,
como sílice o carbón activados en determinados porcentajes podría funcionar para la
retención de los analitos, así como la elución de las interferencias con un solvente de
menor polaridad y la de los analitos con el solvente más polar.
Capítulo 1 41
Paralelamente, Garcinuño et.al [21], realizó la determinación de ETU y EBIS
(Etilenbisisotiocianato sulfuro) en almendras, utilizando DMFS, donde utiliza arena como
fase dispersante y tan solo 0,4 g de muestra, con una subsecuente limpieza con EFS. En
primer lugar, a la muestra homogenizada por maceración con fase dispersante y
empacada en una columna, se le realiza un procedimiento de extracción de las grasas
eluyendo con NaOH 0.2 N; el eluato cae sobre una segunda columna que contiene
alúmina, donde se realiza la limpieza de la muestra por EFS. A esta segunda columna se
le hace una elución inicial de las interferencias con acetonitrilo y una posterior elución de
los analitos con metanol, obteniendo así porcentajes de recuperación entre 76 y 85% y
limites de detección entre 0,05 y 0,07 mg/kg realizando la separación en HPLC-DAD.
Figura 3. Cromatogramas CL-EM en modo SIM para una solución estándar utilizando (A)APCI y (B) ESI. (1) ETU, 0.5 µgml−1; (2) PTU, 0.5 µgml−1; (3) dazomet, 1 µgml−1; (4) thiram, 1µgml-1; and (5) disulfiram, 1 µgml−1. [20] .
Esta metodología presenta la ventaja de minimizar el uso de solventes y economizar
tiempo de análisis considerablemente, además de la obtención de bajos limites de
detección utilizando detector de arreglo de diodos. En este estudio se muestra que la
DMFS es una técnica aplicable a todo tipo de analitos y que requiere la optimización del
adsorbente y solventes de elución para proporcionar los resultados adecuados, siendo
una técnica lo suficientemente sensible para la determinación de ETU y PTU en
diferentes matrices. En la Figura 4 se observa el proceso general para la DMFS.
42 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Figura 4. Proceso general para la extracción mediante DMFS.
Otra metodología analítica con marcadas diferencias se encuentra en un estudio en el
que se utiliza extracción liquido – liquido miniaturizada para extraer maneb y sus
productos de degradación en matriz de tomate, realizando a 1 g de muestra tres
extracciones consecutivas con 5 mL de una mezcla de solventes Acetonitrilo:
diclorometano:Cloroformo 1:1:1, cada una durante dos minutos de agitación mecánica.
Los extractos combinados se llevan a sequedad bajo corriente de argón para
posteriormente ser redisueltos en 500 µL de mezcla Acetonitrilo:Agua 1:1 e inyectados
en el sistema cromatográfico HPLC-DAD. La lectura de maneb se realiza a 280 nm,
mientras que sus Metabolitos se determinan a 232 nm. Los cromatogramas obtenidos se
muestran en laFigura 5. [22]
Figura 5. Determinación simultanea de Maneb y sus Metabolitos de degradación (1) ETU; (2) EBIS; (3) EU; (4) Maneb. [22]
Capítulo 1 43
Este procedimiento tiene como ventaja la minimización del uso de disolventes respecto a
las técnicas convencionales, ya que se requieren 15 mL de solvente para la preparación
de una muestra, además de presentar buena resolución de los picos cromatográficos y
limites de detección bajos con HPLC-DAD (0.04 mg/kg para ETU).
La EFS no solamente se puede usar como metodología de extracción, sino que puede
ser complemento del procedimiento analítico, aportando sus excepcionales
características en la etapa de limpieza del extracto. En numerosos estudios, se realiza la
extracción de los compuestos mediante DMFS para realizar una posterior limpieza con
un adsorbente en EFS.
Un estudio reciente muestra el uso de cromatografía liquida de interacción hidrofílica
acoplada a detección selectiva de masas (HILIC-MS) utilizando una extracción con
acetonitrilo y una limpieza en fase solida dispersiva con la metodología QuEChERS la
cual fue utilizada para la determinación de PTU en tomate. [23]
La cromatografía de interacción hidrofílica se ha practicado durante mucho tiempo,
aunque el término HILIC se ha empezado a utilizar de forma común recientemente. Los
analitos son compuestos muy polares como péptidos, hidratos de carbono o metabolitos
polares, grupo dentro del cual se encuentran los analitos de interés. La HILIC se puede
considerar una extensión de la cromatografía en fase normal en el ámbito de las fases
móviles acuosas. Las fases móviles son mezclas de agua o soluciones buffer (< 40%)
con eluyentes orgánicos. Las fases estacionarias son adsorbentes polares muy
hidrofílicos como la sílice, fases enlazadas polares, rellenos poliméricos polares e
intercambiadores iónicos. El factor común de todas estas fases estacionarias es que
pueden adsorber fácilmente agua, de ahí su clasificación como «hidrofílicas». En su
estudio Tölgyesi et. al. [23], realiza la separación de ETU en una columna ZORBAX
Eclipse Plus Phenyl-Hexyl RRHT (Figura 6) la cual contiene una fase químicamente
enlazada que forma una monocapa densa de fase estacionaria, sobre un soporte de
sílica porosa, diseñado para eliminar o reducir la fuerte adsorción de los compuestos
básicos o altamente polares. Como fase móvil se utilizó un gradiente de formiato de
amonio 0,1% y una mezcla de metanol:acetonitrilo 1:1. El sistema cromatográfico se
encontraba acoplado a detector de UV a 235 nm y a detector selectivo ESI-TOF MS.
44
Figura al. [23]
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Capítulo 1 45
En cuanto a la determinación de ETU en suelos, se han realizado estudios en donde la
metodología analítica aplicada consiste en la extracción de 10 g de suelo con metanol
para posteriormente realizar el proceso de derivatización y análisis por cromatografía de
gases con detección NPD y ECD [25] con el fin de realizar el monitoreo del metabolito en
suelos y aguas en una región de producción bananera en México. Los límites de
detección obtenidos son bajos (0.01 mg/kg) y los porcentajes de recuperación son
mayores al 90%, sin embargo el consumo de tiempo, solventes y reactivos se evidencian
como desventajas de esta metodología analítica.
En este estudio se encontró ETU en el suelo como residuo no detectable o en
concentraciones a nivel de trazas, dada su capacidad de movilizarse por su alta
solubilidad en agua y poca retención. Sin embargo, altas concentraciones de ETU fueron
encontradas en aguas superficiales (Máximo 22,5 mg/kg), las cuales se encuentran por
encima del límite de seguridad para organismos acuáticos (1mg/kg), evidenciando un
nivel de contaminación preocupante para la vida acuática y la salud humana.
En la universidad de Antioquia se desarrolló un metodología para la determinación de
ETU en suelos cultivados con tomate chonto [26], que parte de un extracto acuoso del
suelo, dada la alta solubilidad del analito en agua, empleando 1,5 g de suelo al cual se le
agregaron 20 mL de agua a pH 10,5, realizando una posterior agitación en vortex durante
2 minutos, seguida de un calentamiento al baño maría a 70°C por 8 minutos.
Posteriormente se somete la muestra a ultrasonido durante 13 minutos y por último se
realiza una centrifugación para separar el sobrenadante y, sobre el residuo sólido,
realizar una segunda extracción; El extracto acuoso se inyecta en cromatografía liquida
utilizando una columna C18 de 250 x 4,6 mm y 5µ de diámetro interno. La detección se
realiza con UV a 232 nm y se usa una fase móvil compuesta por Agua:Acetonitrilo 98:2.
En la Figura 8 se observa el cromatograma obtenido bajo las condiciones mencionadas.
Los porcentajes de recuperación son elevados, cercanos al 90% lo cual muestra que es
una metodología adecuada para la determinación de ETU como residuo de degradación
de EBDCs en suelos. El procedimiento tiene la ventaja de no utilizar solventes orgánicos
para la extracción, lo cual supone una metodología ambiental y económicamente
amigable, además de utilizar tan solo un 2% de acetonitrilo en la separación
46
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Capítulo 1 47
separación y detección analítica, ya que muchas metodologías incluyen pasos de
transformación para poder analizarlas en un sistema de cromatografía de gases; por otra
parte, el análisis por cromatografía liquida de este tipo de moléculas es complicado
debido a que su alta polaridad evita que se retengan en un sistema de cromatografía en
fase reversa o hace que se queden retenidas por largos tiempos en un sistema
cromatográfico en fase normal. La extracción en matrices complejas como son los
suelos, frutas y hortalizas, implica el uso de solventes polares, los cuales extraen una
gran cantidad de interferentes, siendo necesario involucrar estratégicamente etapas de
limpieza que retire dichas interferencias sin dar lugar a pérdidas de los analitos de
interés.
En nuestro país no se han desarrollado metodologías para determinar ETU y PTU en
frutas y hortalizas ni existe legislación con respecto a su residualidad, así como no se
tienen estudios sobre su impacto en la salud de los consumidores y en el medio
ambiente. Es por esto que es necesario que el país genere, valide y aplique
metodologías rápidas y confiables que sirvan de base para posteriores estudios y que
permitan garantizar la inocuidad de los alimentos y así, el bienestar de los consumidores,
tanto Colombianos como del mundo, dado al incremento gradual que se ha observado en
la exportación de frutas tropicales y tubérculos hacia otros continentes.
48 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
49
2. Capítulo 2. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en frutas y hortalizas
Las metodologías multiresiduo presentan grandes ventajas, sin embargo existen
sustancias que por su elevada polaridad son excluidas de éste tipo de técnicas, pues no
son extraídas eficientemente o a que las interferencias coextraidas no pueden ser
retiradas en las etapas de limpieza realizadas. La etilentiourea y la propilentiourea se
encuentran dentro de este grupo de analitos polares y la importancia de su determinación
radica en que son productos de degradación de fungicidas ditiocarbamatos ampliamente
aplicados en Colombia y presentan elevada toxicidad. A nivel mundial, estas sustancias
son monitoreadas constantemente por las autoridades sanitarias internacionales y dado
que las frutas tropicales se han convertido en un producto de exportación de importancia
creciente se requiere contar con metodologías que garanticen que los productos de
consumo, tanto interno como de exportación se encuentren libres de residuos de estas
sustancias de toxicidad relevante.
Se han realizado variaciones metodológicas desde inicios de los años 70 como estrategia
para la determinación a nivel de trazas de éstos analitos, las cuales involucraron en un
principio, la extracción con solventes polares para posteriormente realizar una etapa de
derivatización, obteniendo así productos de reacción de menor polaridad y con volatilidad
adecuada para ser analizados por cromatografía de gases. Sin embargo, los bajos
rendimientos de reacción en la derivatización y el elevado consumo de tiempo,
materiales, reactivos y solventes obligaron a pensar en una nueva estrategia
metodológica para su análisis; es así como se involucró la cromatografía líquida como
método de separación, pues esta técnica es adecuada para el análisis de moléculas
pequeñas de elevada polaridad y baja volatilidad. El uso del detector de arreglo de
diodos implica como desafío la implementación de etapas de limpieza del extracto que
50 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
permitan retirar la mayor cantidad de sustancias coextraídas para evitar interferencias en
la detección. Con base en la revisión de literatura se seleccionaron cuatro metodologías
aplicables al análisis de ETU y PTU en frutas y hortalizas con el objetivo de determinar
una metodología para el análisis de éstos compuestos con la instrumentación disponible
en el laboratorio. Los resultados se muestran en el presente capitulo y con base en ello
se seleccionó, optimizó y validó la metodología que proporcionó los mejores resultados.
2.1 Estándares de referencia, matrices de ensayo, equipos, materiales, solventes y reactivos
2.1.1 Estándares de referencia
Los estándares de etilentiourea y propilentiourea empleados en este trabajo fueron
suministrados por Dr Ehrenstorfer con pureza mayor al 98%. Las soluciones madre
fueron preparadas en acetonitrilo y fueron almacenadas en frascos ambar a -20°C.
Diluciones de 50 µg/mL de ETU y 100 µg/mL de PTU fueron preparadas en acetonitrilo y
a partir de ellas se prepararon a diario los estándares de calibración para la inyección en
HPLC utilizando agua como disolvente.
2.1.2 Matrices de ensayo
Se utilizaron muestras de Uchuva (L, Physalis peruviana), granadilla (Passiflora ligularis),
pitaya (Hylocereus triangularis), banano bocadillo (Musa acuminata) y tomate (Solanum
lycopersicum) exentas de plaguicidas, obtenidas en supermercados de cadena y
certificadas como orgánicas. Se lavaron con abundante agua y se retiró el material ajeno
según las indicaciones del Codex Alimentarius [27]
Capítulo 2 51
2.1.3 Materiales y equipos Para la homogenización de las matrices de ensayo se contó con un homogenizador
Stephan Blender 2010 y una licuadora Waring. El pesaje de las muestras se llevó a cabo
en una balanza de platillo externo Mettler Toledo y los estándares de referencia se
pesaron en una balanza analítica Scaltec SAC22. Durante el proceso de extracción se
utilizó un evaporador rotatorio Heidolph, un ultrasonido marca Elma con una frecuencia
de 35 KHz y una centrifuga refrigerada marca Thermo. Se utilizó un sistema de filtración
de solventes marca Millipore para la filtración de los solventes a usar en HPLC. Para el
almacenamiento de las matrices de ensayo se utilizó un congelador Frigidaire de 200 L.
Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia marca Agilent Technlogies con
bomba cuaternaria G1310A, detector de arreglo de diodos G1365B, compartimento
termostado para columna G1316A y sistema de desgasificación G1379A de la serie 1100
acoplado a un sistema de inyección automática G1329A de la serie 1200.
2.1.4 Reactivos y solventes
Todos los solventes utilizados en este estudio fueron marca J.T. Baker grado residuos y
grado HPLC. Previo a su uso en HPLC fueron filtrados a través de una membrana de
0.45 µm. Se utilizó Cloruro de sodio, Sulfato de sodio, Sulfato de Magnesio, Citrato
tribásico de sodio, Citrato dibásico de sodio sesquihdratado, hidróxido de sodio y cloruro
de amonio marca J.T. Baker. Para la limpieza bajo el método QuEChERS se utilizó PSA
marca Varian. Los ensayos de dispersión de matiz en fase sólida se utilizaron
adsorbentes C18 y Carbón grafitizado marca Agilent y carbón activado proporcionado por
el grupo de investigación de Carbones del Departamento de Química. La limpieza en el
método de extracción con solventes polares se realizó utilizando Extrelut bulk marca
Merck.
52 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
2.2 Sistema instrumental
Se realizó la inyección de soluciones de estándares individuales y en mezcla en
diferentes disolventes: acetonitrilo, metanol, agua y mezclas agua:metanol. Se realizaron
inyecciones de 20, 50 y 100 µL. La detección se realizó a 232 nm, temperatura de
columna 25°C y composición de la fase móvil Agua:Metanol 98:2, según referencias de
literatura. Se realizaron variaciones de flujo entre 1 y 1.3 mL/min para encontrar el flujo
óptimo. La separación se realizó en una columna analítica LiChrosphere RP-18, 250 x 4
mm., 5µm., con guardacolumna C18.
2.3 Preparación y homogenización de la muestra
1 kg de cada una de las matrices de ensayo fue introducido en el homogenizador
Stephan blender y homogenizado durante 3 minutos. Luego porciones de 400 g fueron
homogenizadas en la licuadora Waring durante 2 minutos. La totalidad de la muestra fue
mezclada para luego ser almacenada en bolsas plásticas con cierre en el congelador a -
20°C.
2.4 Selección de la metodología – Parte experimental
Con base en la revisión de literatura, fueron seleccionadas cuatro metodologías como
punto de partida con el fin de evaluar su desempeño en cuanto a la exactitud en la
recuperación de los analitos y en la capacidad de obtener limites de detección y
cuantificación cercanos a los 0.01 mg/kg; así mismo para la selección del método, se
consideró la posibilidad de ejecución como metodología de análisis de rutina en el
laboratorio.
Los ensayos para selección de la metodología se realizaron utilizando matriz blanco de
Uchuva homogenizada y congelada. Cada lote de ensayos estaba compuesto por tres
blancos de matriz y tres blancos fortificados con la mezcla de analitos de interés. En
todos los ensayos, la fortificación se llevó a cabo sobre la muestra homogenizada a
Capítulo 2 53
temperatura ambiente, se mezcló utilizando agitador vortex y se dejó en reposo por una
hora.
base en la revisión de literatura, fueron seleccionadas cuatro metodologías como punto
de partida con el fin de evaluar su desempeño en cuanto a la exactitud en la
recuperación de los analitos y en la capacidad de obtener limites de detección y
cuantificación cercanos a los 0.01 mg/kg; así mismo para la selección del método, se
consideró la posibilidad de ejecución como metodología de análisis de rutina en el
laboratorio.
Los ensayos para selección de la metodología se realizaron utilizando matriz blanco de
Uchuva homogenizada y congelada. Cada lote de ensayos estaba compuesto por tres
blancos de matriz y tres blancos fortificados con la mezcla de analitos de interés. En
todos los ensayos, la fortificación se llevó a cabo sobre la muestra homogenizada a
temperatura ambiente, se mezcló utilizando agitador vortex y se dejó en reposo por una
hora. 2.4.1.
2.4.1 Extracción con solventes de baja polaridad (M1)
1 g de matriz fue sometido a tres extracciones sucesivas con 3 mL de mezcla
ACN:CH2Cl2:CHCL3 (1:1:1). El extracto combinado fue concentrado en un evaporador
rotatorio hasta 0.5 mL, llevado a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y finalmente
reconstituido con 0.5 mL de agua e inyectado en el sistema cromatográfico. En la Figura
9 se observa el esquema del procedimiento realizado. [22]
54
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Capítulo 2
2.4.4 Extr(M4
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Capítulo 2 59
Tabla 3. Porcentajes de recuperación y coeficientes de variación para M1
Ensayo % de recuperación
ETU PTU
R1 76,3 74,7
R2 53,7 68,7
R3 93,7 83,8
Promedio 74,6 75,8
CV 26,9 10,1
En su publicación, Garcinuño et.al [22], reporta resultados de ensayos de recuperación
utilizando los solventes individuales pero no menciona los porcentajes de recuperación
obtenidos con la mezcla de solventes, aunque indica que la proporción fue optimizada y
que es con la relación 1:1:1 que se obtienen los mejores resultados. La exactitud de la
metodología es adecuada, pues los porcentajes de recuperación promedio se encuentran
dentro de los rangos establecidos (70-120%); si bien el coeficiente de variación es alto,
un mayor número de ensayos a diferentes concentraciones de analito en la matriz y en
diferentes días podría mostrar la variabilidad real de la metodología.
Utilizando el método EPA para la determinación de límites críticos [29], se estimaron los
límites de detección y cuantificación y se relacionan a continuación en la
Tabla 4.
Tabla 4. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M1
Analito ETU PTU
LD (mg/kg) 0.03 0.06
LC (mg/kg) 0.10 0.20
Debido a la pequeña cantidad de muestra que se toma para el análisis (1g) y a los
interferentes presentes en la matriz, los límites de detección y cuantificación estimados
son algo elevados para el propósito de la metodología y tomar una cantidad de muestra
mayor aumentaría la carga de matriz en el inyectable, lo que tendría como consecuencia
el incremento en la intensidad de las interferencias.
60 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
2.5.2 Dispersión de matriz en fase sólida M2
Con base en los procedimientos utilizados en las publicaciones de Blasco et. al.,
Garcinuño et. al y Mojica et. al [20, 21, 28] , se seleccionaron los adsorbentes CA, CG y
C18. El objetivo del proceso de extracción utilizando dispersión de matriz en fase sólida
era retener los analitos en el sólido adsorbente al efectuar la maceración, para luego
eluirlos selectivamente con ACN evitando eluir las interferencias de la matriz. Contrario a
lo reportado por los autores mencionados, en este estudio utilizando CA y CG la
recuperación de los analitos es nula.
En la metodología M2 CA, con carbón activado, la retención total ocurre debido a que los
analitos, por su naturaleza polar y un pequeño tamaño se quedan retenidos por procesos
de fisiadsorcion en la superficie de elevada área superficial y altamente porosa (Figura
14), y de quimiadsorción en la superficie químicamente activa del carbón (Figura
15Figura 15).
Figura 14. Estructura porosa del carbón activado.
Experimentos preliminares de determinación de la química superficial del carbón utilizado
muestran que tiene una naturaleza ácida, por lo tanto los grupos superficiales
predominantes serán de tipo carboxilo o lactona (Figura 15). La presencia de estos
grupos oxigenados da lugar a centros primarios de adsorción de moléculas de agua que
a su vez adsorberán nuevas moléculas por formación de puentes de hidrógeno.
Capítulo 2 61
Figura 15. Grupos superficiales presentes en la superficie del carbón activado.
En el caso del método M2 CG, la retención de compuestos como la ETU y la PTU es total
dado que, aunque la superficie del carbón tiene carácter hidrofóbico, también tiene una
capacidad excepcional de retención de analitos polares.
A escala molecular, la superficie del grafito es plana y altamente cristalina. La retención
de sustancias polares está dada por la interacción de grupos polares o polarizables en
las moléculas de analito con la superficie del grafito. La fuerza de las interacciones
depende del área molecular en contacto con la superficie y de la naturaleza y tipo de los
grupos funcionales en los puntos de interacción. Moléculas de tipo planar tienen la
posibilidad de interactuar en mayor medida con la superficie, como es el caso de ETU y
PTU, y así tener un máximo de retención. Moléculas tridimensionales rígidas que tienen
pocos puntos de contacto con la superficie son menos retenidas en comparación con
moléculas planas de la misma masa molecular como se muestra en la Figura 16.
62
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Capítulo 2
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64 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
embargo, los cromatogramas que se observan en la Figura 18 muestran la presencia de
interferencias en tiempos de retención cercanos al de los analito, y se evidencia que que
el método cromatográfico no es capaz de resolverlas adecuadamente.
Usando C18 como fase estacionaria y acetonitilo como solvente de elución, se tiene un
sistema tipo fase reversa, en donde los analitos de elevada polaridad son poco retenidos
y el acetonitrilo, que tiene elevada fuerza de elución es capaz de vencer las pocas
interacciones de tipo hidrofóbico que se puedan dar entre las moléculas polares y la fase
estacionaria, recuperando en elevada proporción los compuestos de interés; Sin
embargo, moléculas estructuralmente similares sufren el mismo efecto, con lo que se
tiene gran cantidad de interferencias eluidas y dado que el sistema de separación en
HPLC es también de fase reversa, la separación cromatografica no da buenos
resultados.
Así mismo, la pequeña cantidad de muestra limita la capacidad del método para obtener
limites de detección y cuantificación adecuados, pues los estimados que se muestran en
la Tabla 5 son muy elevados para esta lograr el cumplimiento de los objetivos del
presente trabajo.
Tabla 5. Limites de detección y cuantificación estimados de la metodología M2 C18
Analito ETU PTU
LD (mg/kg) 0.15 0.98
LC (mg/kg) 0.51 0.33
Además de la limitación en la sensibilidad de la técnica, el uso de pequeñas cantidades
de muestra en ensayos de rutina no es del todo apropiado debido a la representatividad
de la porción analítica.
C
2
E
[2
m
e
a
F
E
Q
s
q
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p
g
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a
Capítulo 2
2.5.3 Met
Esta técnica
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analitos con
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Esto ocurre
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65
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s
66 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Figura 20. Estructura adsorbente PSA
2.5.4 Extracción con solventes polares M4
Con base en la publicación de Kontou et.al [31] se realizó un ensayo en donde se utiliza
la misma cantidad de muestra, pero se minimiza el consumo de solvente de extracción,
reactivos y solventes en la etapa de limpieza. En el análisis por cromatografía se
observan extractos sin interferencias en el tiempo de retención de los analitos (Figura
21), por lo cual la relación S/N es adecuada y los límites de detección estimados son
apropiados para el desarrollo de la metodología en el marco de los objetivos propuestos.
Los porcentajes de recuperación promedio para los dos analitos son aceptables (Tabla 6)
aunque para la PTU la recuperación se encuentra por debajo del rango deseado.
Tabla 6. Exactitud y precisión para la metodología M4
Ensayo % de recuperación
ETU PTU
R1 83.74 68.13
R2 80.70 66.54
R3 80.98 66.74
Promedio 80.79 66.64
CV 5.16 3.18
Kontou et.al en su publicación muestra resultados para determinación de ETU en tomate
y productos de tomate. Los porcentajes de recuperación son mayores al 70%, lo cual es
concordante con lo obtenido, pero no se reportan porcentajes de recuperación para la
PTU. Aunque las cantidades de muestra, reactivos y solventes empleados en dicho
estudio son 10 veces superiores a las empleadas para el presente ensayo, los resultados
finales no son dispares. Los cromatogramas son muy similares, presentando extractos
sin interferencias ni ruido en la línea base causado por la matriz, lo cual indica que gran
C
p
q
L
e
FM
U
e
Capítulo 2
parte de las
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Los limites d
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68 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
recuperación se encuentre en dicho rango es deseable, mas no se convierte en
una exigencia, pues aunque la metodología presente bajos porcentajes de
recuperación, si la sensibilidad es adecuada para el propósito del método y la
dispersión de los resultados es baja, puede garantizarse que los resultados sean
confiables a través del tiempo y en su ejecución en diferentes escenarios.
• LIMITES CRITICOS: El objetivo es encontrar una metodología adecuada para la
determinación de ETU y PTU a nivel de trazas. La concentración requerida se
propone con base en la legislación internacional que reglamenta los límites
máximos de residuos de estos compuestos en los alimentos. Países como
Alemania y Holanda tienen establecidos límites máximos de residuos
generalizados para todos los alimentos en 0,05 y 0,02 mg de ETU por kg,
respectivamente. La legislación más estricta tiene como límite 0.01 mg de ETU
por kg para todas las matrices, por lo cual esta última, que es la más baja, se
establece como el objetivo de la metodología en cuanto al límite de detección.
• EJECUCION: Se requiere que la metodología seleccionada sea viable de aplicar
como método de análisis de rutina en el laboratorio, con miras hacia que en un
futuro puedan realizarse planes de monitoreo de la presencia de residuos de
éstos contaminantes en los alimentos de consumo interno en el país, o pueda
prestarse el servicio al sector productivo para garantizar la inocuidad de sus
productos en cuanto a estos residuos.
Para la evaluación de la posibilidad de ejecución, el tiempo y complejidad del análisis son
considerados, así como la representatividad de la porción analítica para minimizar la
incertidumbre en los resultados y garantizar que el dato obtenido en el laboratorio es fiel
a lo que se encuentra en la totalidad de la matriz de ensayo.
En cuanto a la exactitud, las metodologías M1, M2 C18 y M4 proporcionaron resultados
que son satisfactorios y pueden ser optimizados para lograr el mínimo de pérdidas de los
analitos o el máximo de recuperación durante la ejecución del análisis. La metodología
M3 no cumple con ninguno de los parámetros de evaluación para la selección, pues no
es posible observar los analitos a bajas concentraciones, por lo que no se puede evaluar
Capítulo 2 69
la recuperación y calcular limites críticos no tiene sentido práctico, pues con el elevado
ruido de la matriz, serian muy altos como para ser considerada como una metodología
aplicable para el objetivo propuesto.
La capacidad de la metodología para determinar los analitos a concentraciones cercanas
a 0.01 mg/kg es una característica que solo los métodos M1 y M4 poseen, pues los
limites de detección y cuantificación estimados para el método M3 son demasiado
elevados debido a las interferencias de la matriz y a la poca cantidad de muestra que se
toma para el ensayo.
Así mismo, para garantizar los resultados de cada ensayo y dar la posibilidad de ejecutar
la metodología como técnica de análisis de rutina en laboratorios acreditados bajo un
sistema de gestión de la calidad, es necesario garantizar la representatividad de la
porción analítica, con lo cual los métodos M3 y M4, en los que la muestra es de 10 g
tienen la mejor posibilidad.
Tabla 7. Criterios de selección de la metodología. Metodología Exactitud Límites críticos Ejecución
M1 M2 C18 M3
M4
En la Tabla 7 se resumen los criterios aplicados para la selección de la metodología;
como se puede observar, el método M4, extracción con solventes polares, es el que
presenta los mejores resultados abordando los tres parámetros propuestos, por lo cual es
el método seleccionado para continuar con la fase de optimización, pues se pretende
mejorar los porcentajes de recuperación.
70
2.6 O
En la F
metodo
seleccio
eluir los
individu
el utiliza
por tripl
medio d
Figura
2.6.1
En la e
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Valida
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de análisis d
17. Paráme
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ANO necesa
Adición de
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5%
10%
analíticas p
degra
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metodología
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3. VolumenCH2Cl2 necepara eluir
analitos
5 m
7m
10m
rminación d
fungicidas d
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ROMETANO
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L
L
mL
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ditiocarbam
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4. Compode la mezextrac
MeO
MeO
H
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no fue
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on por
sal y
osición zcla de ción
OH:H2O
3:1
OH:H2O
2:1
H2O
Capítulo 2 71
Para la evaluación del efecto del pH se tomaron 2 mL del extracto antes del proceso de
partición y se realizó el ajuste de pH a 4 y a 9 con solución de Cloruro de amonio 1N e
hidróxido de sodio 1 N, respectivamente, sin modificar las demás variables del proceso
original.
Para la evaluación del efecto de la adición de sal en el proceso de partición se ajustó el
pH a 9 con NaOH 1N a 2 mL de extracto y 0.0, 0.05 y 0.1 g de NaCl fueron adicionados
antes de la partición manteniendo las demás variables sin modificar.
Para evaluar el efecto del volumen de diclorometano necesario para eluir los analitos se
ajustó el pH a 9 y no se realizó adición de sal antes de la partición. Al realizar la elución
se recogieron las fracciones de 0-5, 5-7 y 7-10 mL, y se evaluó el porcentaje de
recuperación en cada una de ellas.
2.6.2 Optimización de la etapa de extracción
En la etapa de extracción se observó el efecto de la proporción de MeOH en la mezcla de
extracción utilizando como alternativas los siguientes extractantes: MeOH:Agua 3:1,
mezcla MeOH:Agua 2:1 y agua.
2.7 Optimización de la metodología - Resultados y discusión
Dada la dificultad instrumental para detectar los analitos en el extracto crudo, se optimizó
en primer lugar la etapa de limpieza. Tres parámetros fueron considerados en diseños
consecutivos completamente al azar utilizando análisis de varianza para determinar la
existencia de diferencias significativas (p<0.05) entre los grupos de datos y se utilizó la
prueba de comparación de medias de Tukey para determinar cuál era el mejor.
La etapa de limpieza realizada con extrelut es una técnica que reemplaza la extracción
liquido-liquido mediante la sustitución del embudo de decantación, la cual presenta
grandes ventajas, como el ahorro de solventes y la facilidad en la ejecución dado el poco
72
tiempo
adsorbe
encuen
inerte e
estacio
no son
halogen
Figura extrelu
Los an
dispers
ácidos
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22. Esqut.
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e acuosa.
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n líquido-
muchas otr
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olubles en
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rminación d
fungicidas d
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aleza silicea
cual actúa
do solvente
de etilo o
líquido so
ras sustanc
matriz, como
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el diclorome
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de producto
ditiocarbam
mna del ma
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a químicam
como una
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oportado s
cias solubl
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minerales
insolubles
n la fase acu
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erés, que ti
etano, van
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matos
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a fase
s que
buros
sobre
es o
cares,
entre
en la
uosa,
trelut,
ienen
a ser
tener
cie de
Capítulo 2 73
contacto entre las dos capas inmiscibles, permitiendo que se dé un gran número de
equilibrios de partición, con lo que la recuperación de los analitos resulta elevada.
Como primer parámetro para optimizar éste proceso, se evaluó el efecto del ajuste de pH
en la alícuota antes del proceso de partición. Este parámetro fue seleccionado debido a
que el pH afecta la estructura molecular de los compuestos de interés en solución.
ETU y PTU pertenecen a la familia química de las tioureas, sustancias susceptibles a
presentar tautomerismo tiona-tiol (Figura 23), análogo al tautomerismo ceto-enol
presentado en los compuestos carbonílicos que tienen hidrógenos en el carbono alfa al
carbonilo. En ETU y PTU, este equilibrio se encuentra desplazado hacia la forma tiona,
de menor polaridad.
S
NHNH
CH3
S
NHNH
S
NNH
H
CH3
NNH
SH
Tiona Tiol
Figura 23. Tautomerismo tiona-tiol en ETU y PTU
El desplazamiento hacia la forma tiol puede verse catalizado por la presencia de ácidos o
bases como se muestra en la Figura 24. Los extractos acuosos de las matrices
empleadas en este estudio presentan grandes variaciones en cuanto al pH, pues se
trabaja con matrices de elevada acidez, como la uchuva y el tomate, y otras cuyos
ETU
PTU
74 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
extractos son cercanos a la neutralidad, como el banano y la granadilla, por lo tanto se
requiere realizar un ajuste de pH con el fin de minimizar la variabilidad entre matrices.
S
NHNH
S
N-NH
OH-
NHNH
S-
H+
NNH
SHOH
-
OH-
Catálisis básica
Deprotonación del Nitrógeno alfaReprotonacion del S
Catálisis ácida
S
NHNH
SH+
NHNHNHNH
C+
SHH
+
NNH
SHOH
-
OH-
Protonación del S Deprotonacion en el Nitrogeno alfa
H+
Tiona TiolIon tiolato
Tiona TiolCarbonilo protonado
Figura 24. Tautomeria tiona-tiol catalizada.
ETU y PTU son estables en el rango de pH 4-9 [31] por lo tanto, valores extremos dentro
del rango de estabilidad fueron seleccionados como niveles del factor de prueba, con el
fin de evitar puntos extremos donde se viera favorecida la formación del tiol;
adicionalmente, a valores de pH extremadamente altos, en presencia de una base
suficientemente fuerte, tanto la forma tiona como el tiol pierden cuantitativamente un
protón. El resultado (ion tiolato) es el mismo y sólo difiere en el lugar donde está situada
la carga, siendo ambas estructuras formas resonantes y no especies en equilibrio. La
existencia de esta especie cargada no favorece la partición liquido-liquido, pues la
solubilidad en agua aumentaría y las moléculas no pasarían a la fase orgánica.
C
L
e
re
P
a
ti
e
n
G
C
fa
re
u
(p
A
fa
p
Capítulo 2
Los resultad
efecto signif
eportado po
PTU, encont
acido la PTU
ol y éste es
esta dado p
itrógeno.
Gráfico 2. E
Con el fin d
ase acuosa
emoción de
na partició
p>0.05) en
Al agregar u
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40
60
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100
120
Porcen
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or Kontou e
trándose m
U se recupe
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85
O
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zcla, causa
s moléculas
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ETU
Optimizació
el Gráfico 2
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etilo extra
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88,841
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e que intera
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101,74
75
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0.05). A pH
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(Gráfico 3).
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mento en la
5
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H
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l
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.
a
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76
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Con el
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120
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O
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90,8777,6
ETU
Optimizació
todologías
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0.05) cuand
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05) al obten
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10 mL de
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10
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ón, se
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0 mL,
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C
G
Gm
Capítulo 2
Gráfico 4. V
Gráfico 5. metodologí
0
20
40
60
80
100
120
Porcen
taje de recupe
racion
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Op
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porcen
taje de recupe
ración
(%)
O
Volumen de
Efecto deía.
ptimización
80,2
ptimización
M
e diclorome
e la compo
49,84
10,34
30,69
ETU
n de la limpi
4
49,85 52,4
ETU
n de la extra
etanol:Agua 3
etano nece
osición de
Analit
ieza. Efecto
5 mL 7
43
A
acción. Efec
3:1
esario para
el extracta
to
o del volume
7 mL 10
7
nalito
cto del solv
Metanol:Ag
a le elución
ante en la
67,35
3,75
30,64
PTU
en de solve
0 mL
77,90
58,51
PTU
vente de ext
gua 2:1
n de los ana
recuperac
ente
62,32
tracción
Agua
77
alitos.
ción de la
7
a
78
Una ve
recuper
muestra
Figura hortaliz
2.8 E–
La meto
y toma
recuper
10 g
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E
Rem
Valida
ez evaluado
ración se
a a continua
25. Procezas.
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ate realizan
ración a 0,0
g de matriz
icionar en mna con 0,5e Sulfato de o y 0,5 g deExtrelut
eposo 20 minutos
ción de me
o el efecto
determinó
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ión de lexperimptimizada fu
ndo extracc
05 mg/kg po
5
e
todologías
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la metodo
Figura 25.
para la d
la metomental
ue evaluada
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or triplicado
Adición demL de
Metanol:A3:1
ConcentrarmL
Elución conmL de
dicloromet
analíticas p
degra
arámetros s
ología anal
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a en uchuv
un blanco
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e 20
Agua
r a 1
n 10
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na.
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rminación d
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ETU y PT
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a, pitaya, b
matriz y e
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ar pH a 9 aOH 3 N
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ditiocarbam
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ón
e
ón e
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2
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p
la
p
c
Capítulo 2
2.9 Eval– Re
Gráfico 6. Ey b. PTU en
Como se ob
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20
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0
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77
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79
matrices
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una misma
9
s
U
s
n
o
a
80 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
2.10 Validación de la metodología – Parte experimental
La validación fue realizada bajo los parámetros del documento SANCO [32]. Se utilizó
matriz blanco de uchuva, dado que no se encontraron diferencias significativas en la
recuperación entre las diferentes matrices.
2.10.1 Especificidad-Selectividad
Muestras blanco de granadilla, pitaya, banano bocadillo y tomate fueron extraídas y
analizadas por HPLC en conjunto con estándares de 0,02 µg/mL disueltos en agua. Se
inyectaron en una misma secuencia cromatográfica y se determinó la presencia o
ausencia de interferencias en el tiempo de retención de los analitos.
2.10.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología
Se calculó el ruido para inyecciones de extractos de matriz blanco realizadas en el
proceso de evaluación de especificidad-selectividad al tiempo de retención de los
analitos. En la misma secuencia se inyectó una mezcla de estándares de ETU (0,02
µg/mL) y PTU ((0,04 µg/mL). Utilizando la respuesta en altura de las inyecciones de los
estándares se estimaron los límites de detección LD y cuantificación LC.
3
10
Para corroborar la estimación del LD, se fortificó extracto de matriz blanco a dicha
concentración y se inyectó en el sistema cromatográfico. La respuesta de los analitos
debe ser mayor que 3 veces el promedio del ruido de los blancos.
Para corroborar la estimación del límite de cuantificación, se realizó un experimento de
recuperación por triplicado a la concentración equivalente al límite de cuantificación, para
evaluar su exactitud y precisión.
Capítulo 2 81
2.10.3 Linealidad – Efecto matriz
Se prepararon e inyectaron en una misma secuencia los niveles 1, 3 y 5 de la curva de
calibración (Tabla 8) en solvente y en extracto de matriz blanco. Se calculó el efecto
matriz como se muestra a continuación:
%
100
Si en alguno de los niveles el porcentaje de efecto matriz supera el 120%, se considera
que existe efecto matriz y las curvas de calibración y la cuantificación deben hacerse con
estándares preparados en extracto blanco de matriz.
Se evaluó la respuesta del sistema a cinco diferentes niveles de concentración según la
Tabla 8.
Tabla 8. Concentraciones de los niveles de calibración
Nivel ETU PTU
(µg/mL) (mg/kg) (µg/mL) (mg/kg) 1 6,67 0,010 13,33 0,020
2 13,33 0,020 26,67 0,040
3 33,33 0,050 66,67 0,100
4 66,67 0,100 133,33 0,200
5 166,67 0,250 333,33 0,500
Se determinó estadísticamente el coeficiente de correlación lineal y la ecuación
correspondiente al ajuste lineal. Se evaluó el valor estadístico t Student para la
pendiente, el intercepto y la correlación. Utilizando el método estadístico ANOVA se
evaluaron los parámetros F para regresión y ajuste de linealidad. En el Anexo 1 se
presenta las ecuaciones correspondientes.
82 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 9. Criterios de aceptación linealidad
Parámetro Aceptación
Pendiente La pendiente es estadísticamente diferente de cero
Intercepto El intercepto es estadísticamente igual a cero
Correlación entre X y Y Existe correlación entre la respuesta y la concentración
Regresión entre X y Y Existe regresión lineal entre la respuesta y la concentración
Desvío a la linealidad No se presenta desvió de la linealidad
2.10.4 Exactitud
Se evaluó a los niveles 1, 3 y 5 de la curva de calibración. Muestras blanco de matriz
fueron fortificadas a los niveles de evaluación (mg/kg). Se realizó el procedimiento
analítico sobre la matriz fortificada (n=4). Se prepararon estándares de calibración a los
niveles de evaluación (µg/mL). En una misma secuencia fueron inyectados estándares y
recuperados y se calculó el porcentaje de recuperación así:
%
100
Se calculó la homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Cochran (Anexo 1).
El G calculado debe ser menor al G teórico, con un nivel de confianza del 95 %. Esta
condición acepta que el nivel de concentración no afecta la variabilidad de los
porcentajes de recuperación, por tal motivo se pueden expresar el porcentaje de
recuperación y el coeficiente de variación típico.
Capítulo 2 83
2.10.5 Precisión
• Repetibilidad
En un mismo día, se hicieron ensayos de recuperación (n=4) de muestras fortificadas a
cada uno de los niveles de evaluación y se inyectaron en una misma secuencia
cromatográfica. Se calculó el porcentaje de recuperación para cada ensayo (%R) y la
desviación estándar de la población (Sn-1), el porcentaje de recuperación promedio de
cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de variación CV.
• Precisión intermedia
Se realizaron ensayos de recuperación en cuatro días diferentes (D1, D2, D3 y D4, n=4,
uno cada dia), de cada uno de los niveles de evaluación. Se calculó el porcentaje de
recuperación para cada ensayo (%R) y la desviación estándar de la población (Sn-1), el
porcentaje de recuperación promedio de cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de
variación CV.
2.10.6 Robustez de la metodología
Siete variables fueron seleccionadas (Tabla 10) para la evaluación de la robustez
utilizando un diseño de Youden-Steiner como se muestra en la Tabla 11.
Tabla 10. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método. Valor nominal Valor Alterado
Variable Denominación Valor Denominación Valor Tiempo de agitación (min) A 2,0 a 1,5
Modo de agitación B manual b Vortex
Temperatura de evaporación(°C) C 35 c 33
Masa de extrelut (g) D 0,5 d 0,6
Tiempo de contacto (min) E 20 e 25
Longitud de onda (nm) F 232 f 240
Fase móvil (Composición) G 98:2 g 99:1
84 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 11. Diseño experimental para evaluación de la robustez.
Variable 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo de agitación (min) A A A a a a a A
Modo de agitación B b b B B b b B
Temperatura de evaporación(°C) c C c C c C c C
Masa de extrelut (g) D d d d d D D D
Tiempo de contacto (min) e E e e E e E E
Longitud de onda (nm) f f F F f f F F
Fase móvil (Composición) g g G g G G g G
2.11 Validación de la metodología – Resultados
La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los
resultados entregados por dicho método son confiables. Es necesario realizar
experimentos encaminados a obtener evidencia objetiva que permita demostrar, con
fundamentos estadísticos que el método es adecuado para los fines previstos. El objetivo
principal de desarrollar un proceso de validación es evaluar las capacidades del método y
confirmar la concordancia de éstas con el objetivo que se ha propuesto para su
ejecución.
En este proceso se encuentra implícito que los ensayos y experimentos se han realizado
utilizando equipos dentro de especificaciones de correcto funcionamiento, calibrados y
verificados y que han sido ejecutados por personal idóneo. La validación del método está
estrechamente ligada al desarrollo y optimización que se han desarrollado previamente.
A continuación se muestran los resultados de validación para los parámetros
considerados en el DOCUMENTO SANCO y explicados previamente.
C
2
L
p
c
m
e
E
lo
ti
p
d
FE L
u
Capítulo 2
2.11.1
La selectivid
presencia de
ondiciones
matrices fue
en el sistema
En la Figura
os analitos
empos de r
permitiendo
e la matriz.
Figura 26. Especificida
Los resultad
na señal cla
Espec
dad es el gr
e otras sust
de ejecució
eron sometid
a cromatog
a 26 se mue
de interés
retención de
analizar ET
Cromatograd de la me
dos muestra
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ificidad-S
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tancias, end
ón del méto
dos a la me
ráfico.
estra un cro
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e los analito
TU y PTU i
rama obteetodología
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nciada y res
Selectivi
e un método
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odo. Para e
etodología d
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individualm
nido para a.
istema es e
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de análisis
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anto la meto
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blanco de
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uantificar o i
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y los extrac
blanco de m
e observan
odología es
esencia de
e matriz y
y selectivo,
e los compo
identificar a
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blancos de
ctos fueron
matriz super
interferenc
selectiva y
las demás
mezcla d
pues es ca
onentes de
85
al analito en
triz bajo las
e diferentes
inyectados
rpuesto con
cias en los
y especifica
sustancias
e analitos
apaz de dar
interés.
5
n
s
s
s
n
s
,
s
.
r
86 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
2.11.2 Limites de detección y cuantificación de la
metodología
El límite de detección es la concentración mínima de analito que puede ser detectada e
identificada con un determinado grado de confianza (95%). Así mismo, el límite de
cuantificación es la concentración mínima de analito que puede ser cuantificada por la
metodología con precisión y exactitud aceptables.
Para estimar el límite de detección pueden usarse varios métodos, todos ellos dependen
del análisis de blancos de procedimiento y de la determinación de la relación entre la
señal y el ruido. En este caso se utilizó el método “Aproximación de dos pasos” descrito
por Corley en [29], mediante el cual se realiza la estimación de los límites de detección y
cuantificación del método con base en la respuesta instrumental ante la inyección de
soluciones estándar y la determinación del ruido en el tiempo de retención de los analitos
al inyectar blancos de procedimiento. Posteriormente, dichos límites estimados son
puestos a prueba mediante la inyección de blancos fortificados al límite de detección y la
ejecución de ensayos de recuperación en blancos de matriz fortificados al límite de
cuantificación. A partir de la inyección de estándares de bajas concentraciones (Tabla
12), se determino la altura correspondiente a cada pico.
Tabla 12. Valores de altura de analitos individuales para estimación del límite de detección y cuantificación
Rango tr H (mUA) Concentración (µg/L)
ETU 3,4-3,7 0,44 0,0063
PTU 6,1-6,5 0,55 0.0125
Realizando extracciones de matrices blanco de banano, granadilla, pitaya, Uchuva y
tomate se calcularon los ruidos en el rango del tiempo de retención de los analitos según
se observa en la Tabla 13.
Capítulo 2 87
Tabla 13. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación
Ruido (mUA) 3Ruido (mUA) 10 Ruido (mUA)
Matriz ETU PTU ETU PTU ETU PTU Banano 3,34E-02 2,48E-02 1,00E-01 7,44E-02 0,334 0,248
Granadilla 3,26E-02 7,79E-02 9,78E-02 2,34E-01 0,326 0,779
Pitaya 3,19E-02 3,18E-02 9,57E-02 9,54E-02 0,319 0,318
Uchuva 3,30E-02 9,81E-02 9,90E-02 2,94E-01 0,33 0,981
Banano 2,67E-02 4,38E-02 8,01E-02 1,31E-01 0,267 0,438
Tomate 2,39E-02 2,58E-02 7,17E-02 7,74E-02 0,239 0,258
Promedio 9,08E-02 1,51E-01 3,03E-01 5,04E-01
Utilizando el promedio del ruido y los valores de altura de los estándares y sus
concentraciones se estimaron los límites de detección y cuantificación y se reportan en la
Tabla 14.
Tabla 14. Límites de detección y cuantificación estimados ETU PTU
LD Est (µg/mL) 0,0015 0,0034
LC Est (µg/mL) 0,0043 0,0115
LD Est (mg/kg) 0,002 0,005 LC Est (mg/kg) 0,006 0,017
Se realizó la inyección del blanco fortificado a las concentraciones estimadas como límite
de detección. Los picos de los analitos no presentaron la respuesta esperada, por lo que
se decide aumentar la cantidad fortificada; a esa concentración se obtuvo un valor de
altura del pico aceptable y diferenciable del ruido y se decide establecerla como límite de
detección. El cromatograma se observa en la Figura 27. Estos valores corresponden a
0.003 mg/kg de ETU y 0.006 mg/kg de PTU.
88
Figura analito
El límite
PTU; co
exactitu
Tabla 1PTU
Los po
permite
Valida
27. Cromas al límite d
e de cuant
on éstos va
ud y precisió
15. Recupe
orcentajes d
en establece
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Pr
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en 0.010
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cuantificaci
ETU %rec
77,94
76,47
70,59
75,00
5,19
120%) y lo
os valores d
para la dete
adación de f
el extracto y 0.006 mg
mg/kg para
imentos de
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ión 0.010 m
PTU %rec
82,30
93,65
88,10
88,02
6,45
os coeficie
de concent
rminación d
fungicidas d
de matriz g/kg PTU.
a ETU y 0.
e recuperac
uestran en
mg/kg ETU
entes de va
ración se p
de producto
ditiocarbam
blanco co
020 mg/kg
ión para ev
la Tabla 15
U y 0.020 m
ariación (<
puede cuan
os de
matos
n los
para
valuar
5.
mg/kg
20%)
tificar
Capítulo 2 89
dichos analitos en una muestra. Se establece que el nivel más bajo de calibración
corresponde a éstos valores.
Cabe anotar que detectar concentraciones tan bajas solo es posible gracias a que la
metodología involucra una etapa de limpieza con extrelut, la cual es extraordinariamente
eficiente en la remoción de interferencias de los analitos de interés, ya que el extracto
blanco de matriz antes de la limpieza presenta una gran cantidad de compuestos
coextraidos de elevada polaridad y de elución temprana en HPLC, y que por lo tanto
interfieren en la detección de los analitos de interés. El cambio después de la limpieza
con extrelut es dramático, pues retira un elevado porcentaje de interferencias permitiendo
disminuir en gran proporción la relación señal/ruido y así poder detectar los analitos a
bajas concentraciones.
2.11.3 Linealidad –Efecto matriz
El documento SANCO define el efecto matriz como la influencia de uno o más
componentes no detectados de la muestra en la medición de la concentración de analito.
La respuesta de algunos sistemas, como la cromatografía de gases o la cromatografia
líquida acoplada a espectrometría de masas , a ciertos analitos, puede verse afectada
por la presencia de sustancias coextraidas o coeluidas de la matriz. Estos efectos de
matriz se pueden presentar como un incremento o una disminución de la respuesta del
analito disuelto en el extracto de la matriz en comparación con el analito en solvente
puro. El efecto matriz provoca un error sistemático que puede ser dependiente de la
concentración del analito en la muestra.
La presencia o ausencia de tales efectos puede evaluarse mediante la comparación de la
respuesta del analito disuelto en un solvente puro, con la obtenida en la presencia del
extracto de la matriz a partir de la misma cantidad de analito.
Los efectos de matriz pueden ser muy variados e imprevisibles, pues dependen de
muchos factores, como de la estructura y propiedades fisicoquimicas, tanto del
componente de interés como de todas las demás sustancias presentes en la matriz, asi
como de la técnica analítica utilizada, aunque técnicas como la utilizada en este estudio,
90 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
HPLC con detección UV o DAD son inherentemente menos propensas a ser
influenciadas por dicho efecto. Realizar las curvas de calibración o los estándares de
cuantificación en extracto de matriz blanco, es una forma de compensar los efectos de la
matriz, sin embargo, no elimina la causa.
La evaluación del efecto matriz puede hacerse mediante diferentes técnicas estadísticas,
como porcentaje de efecto matriz, prueba pareada, métodos de regresión y análisis de
covarianza. Dado que la cromatografía líquida con detector de arreglo de diodos no es
una técnica cuyos resultados puedan verse influenciados por dicho efecto, el cálculo del
porcentaje de efecto matriz es apto para evaluar este efecto.
En la Tabla 16 y en la
Tabla 17 se muestran los resultados del cálculo del porcentaje de efecto matriz para los
dos analitos en los cinco niveles de calibración.
Tabla 16. Efecto matriz pata ETU.
Nivel Concentración
(µg/mL) Solvente
(mUA/min)Matriz
(mUA/min)EM %
1 10,0 3,6 3,6 100,93
2 20,0 7,6 7,8 102,63
3 50,0 18,9 18,8 99,30
4 100,0 40,6 41,0 100,99
5 250,0 102,2 104,2 101,96
Tabla 17. Efecto matriz para PTU.
Nivel Concentracion
(µg/L) Solvente
(mUA/min)Matriz
(mUA/min)EM %
1 20,0 6,2 6,2 100,00
2 40,0 13,7 13,8 101,22
3 100,0 35,5 36,9 103,85
4 200,0 76,8 77,0 100,26
C
D
p
h
G L
in
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C
c
la
m
p
c
A
Capítulo 2
Dado que no
para ninguno
acerse prep
Gráfico 7. C
La linealidad
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Con el fin de
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0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
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120,0
0,000
Area
5
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(%EM <120
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resultados
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curva de ca
n –1 y 1. E
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,060 0,08
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Curva de ca
LC ETU So
02,7
0) en ningun
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n en solven
nte y en ma
do de aná
instrumenta
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relación ent
alibración, e
El valor máx
pendiente p
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y = 618,18xR² = 0,9Solve
80 0,100
ntración (µg/m
alibración E
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214,1
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ma.
gía se realiz
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ximo de 1
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X e Y. En la
x ‐ 0,86259997nte
y = 630R²
0,120
mL)
ETU
CC ETU Mat
105,66
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indica una
uando r=0
a práctica s
0,75x ‐ 1,0829= 0,9989Matriz
0,140 0
triz LC
91
alibración y
lidad puede
determinado
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ración (X) y
Los valores
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9
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n
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92
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Gráfico
Se real
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130,
180,
230,
Area
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una curva
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o 8. Curvas
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curva de ca
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0
0
0
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ción de me
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Tabla 18, m
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aluación de
alibración, c
cepto, pend
elo lineal. P
zó un análi
), en donde
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0,1
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todologías
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n éste caso
muestran u
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LC ET
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se obtuvo u
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Concentra
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para la dete
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la
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un 95 % de
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ísticamente
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y = 616,5R² = 0Solv
0,2
ción (µg/mL
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CC ET
rminación d
fungicidas d
una proba
coeficiente
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correlación
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TU.
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e confianza
s obtenidos
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la existenc
del desvío
5x ‐ 3,73860,9996vente
y
0,3
TU Matriz
de producto
ditiocarbam
abilidad elev
de correl
admite un
n lineal, qu
entre la va
concentra
nyecciones
tica de prue
, como un m
por la prue
e análisis d
cia de regr
o de la linea
= 652x ‐ 5,16R² = 0,9987Solvente
0,3
LC ETU
os de
matos
vada.
ación
valor
ue se
riable
ación.
de la
eba t-
mejor
eba t-
de la
resión
alidad
89
0,4
Matriz
Capítulo 2 93
En la Tabla 18 se observan los resultados de la aplicación de las pruebas estadísticas a
las curvas de linealidad para ETU y PTU. Para los dos analitos el intercepto es
significativamente diferente de cero, lo cual indica que debe usarse la ecuación de la
curva de calibración para el cálculo de las concentraciones en una muestra problema,
incluyendo el valor del intercepto; la pendiente, para los dos analitos, es diferente de
cero, existe correlación lineal entre el área y la concentración al igual que regresión y no
hay desvíos significativos de la linealidad en el rango evaluado.
Tabla 18. Resultados pruebas estadísticas de linealidad en solvente ETU PTU Conclusiones linealidad
Pendiente 618,2 616,5 La pendiente es significativamente
diferente de cero
Intercepto -0,86 -3,74 El intercepto es significativamente
diferente de cero
Correlación 0,9997 0,9997 Existe correlación entre área y
concentración
Regresión S(*) S(*) Existe regresión entre el área y la
concentración
Desvío NS(**) NS(**) No hay desvío significativo de la
linealidad
(*) Estadístico F en ANOVA de linealidad no significativo para H0= no existe regresión entre X e Y, H
1= existe regresión entre X e Y.
(**)Estadístico F en ANOVA de linealidad significativo para H0= no existe desvio de la linealidad, H
1= existe desvio de la linealidad.
2.11.4 Exactitud
El documento SANCO define la exactitud como la diferencia entre el valor promedio
medido y el valor real. El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados
de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente
común de error sistemático o sesgo.
94 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Para la validación del método la exactitud fue evaluada como porcentaje de recuperación
a tres niveles de concentración: un nivel mínimo, equivalente al límite de cuantificación,
uno intermedio y uno máximo en el rango de linealidad establecido. En la Tabla 19 se
observan los resultados de exactitud de la metodología.
Para evaluar la significancia en la diferencia del porcentaje de recuperación con el 100 %
se realiza una prueba t (95% confianza, n=4) de comparación con un valor fijo. Las
ecuaciones pueden verse en el anexo 1. En la Tabla 19 se observa que para la mayoría
de los ensayos realizados (más del 80%) se obtienen porcentajes de recuperación que
se encuentran dentro del rango de aceptación de 70-120 % y todos los promedios
cumplen con encontrarse dentro de éste rango deseable.
Tabla 19. Resultados ensayo de exactitud (n=7) Analito ETU PTU
N1 N3 N5 N1 N3 N5
1 76,94 67,37 82,01 102,76 69,43 82,64
2 71,67 77,98 78,21 70,13 88,29 90,40
3 79,72 74,80 86,54 100,49 80,57 93,71
4 78,13 63,13 77,39 75,09 82,57 83,87
5 78,12 75,00 80,11 75,06 81,17 84,57
6 83,87 76,19 83,89 77,41 82,35 84,90
7 84,85 74,31 84,07 86,89 77,08 85,53
Promedio por
nivel 79,04 72,68 81,75 83,97 80,21 86,52
Promedio metodología
77,82 83,57
Así mismo, no existen diferencias significativas entre las varianzas para la recuperación
en los diferentes niveles de concentración de los analitos en matriz como lo muestra la
prueba de Cochran (No significativa); sin embargo, la prueba t de comparación con un
valor especificado, utilizada para determinar la diferencia estadística entre el porcentaje
de recuperación promedio y el 100% presenta diferencias significativas para los dos
analitos en todos los niveles de concentración, excepto para PTU al nivel del límite de
Capítulo 2 95
cuantificación. Dada esta significancia, se sugiere que los resultados de cuantificación en
muestras reales sean corregidos con el porcentaje de recuperación.
2.11.5 Precisión
La precisión mide el grado de concordancia entre los resultados analíticos obtenidos de
una serie de mediciones repetidas del mismo analito realizadas en las condiciones
previstas en el método. La precisión refleja los errores aleatorios que se producen
cuando se utiliza un método. Las condiciones en que se mide la precisión se dividen,
según opinión general, en condiciones repetibles y condiciones reproducibles.
La repetibilidad de las condiciones existe cuando el mismo analista analiza muestras el
mismo día y con el mismo instrumento o utilizando los mismos materiales, como
reactivos o solventes, y ejecutando el ensayo en el mismo laboratorio. Cualquier cambio
de estas condiciones, por ejemplo, diferentes analistas, diferentes días, diferentes
instrumentos, diferentes laboratorios, implica que las condiciones de precisión intermedia
o reproducibilidad.
La precisión normalmente se mide en términos de coeficiente de variación o desviación
estándar relativa, en este caso, del porcentaje de recuperación calculado para ensayos
de recuperación. La precisión depende de la concentración y debe medirse con
concentraciones diferentes dentro del rango aceptado, normalmente en la parte baja,
media y alta de éste. Una precisión aceptable en el nivel inferior de concentración es del
20%. Con concentraciones más altas la precisión debe ser mayor, sin embargo, según el
documento SANCO, para la determinación de residuos de plaguicidas y sus metabolitos
se tiene un máximo de variabilidad del 20%. La precisión fue evaluada a tres niveles de
concentración, N1, N3 y N5 de la curva de calibración como repetibilidad y como
precisión intermedia.
• Repetibilidad
Los resultados de la ejecución de experimentos de recuperación (n=4) a cada uno de los
niveles de calibración mencionados y su coeficiente de variación se muestran a
96 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
continuación en la Tabla 20. Los coeficientes de variación se encuentran por debajo del
máximo permitido para bajas concentraciones (<20%) en todos los niveles y para los dos
analitos.
Tabla 20. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad.
% Recuperación
Promedio (n=4) CV
ETU PTU ETU PTU
N1 76,61 87,12 4,55 19,40
N3 70,82 80,21 9,58 9,85
N5 81,04 87,66 5,16 6,02
• Precisión intermedia
Se llevaron a cabo ensayos de recuperación en diferentes días para evaluar éste
parámetro. Los resultados se muestran en la
Tabla 21.
Tabla 21. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia
% Recuperación Promedio (n=4)
CV
ETU PTU ETU PTU
N1 79,63 77,38 7,64 9,08
N3 75,87 82,22 2,12 5,63
N5 80,56 86,35 5,14 3,16
Los anteriores resultados muestran en general una disminución del coeficiente de
variación, que expresa la variabilidad de la metodología, cuando se aumenta el nivel de
concentración, lo cual es de esperarse, pues a menores concentraciones la incertidumbre
en la medida es mayor.
Capítulo 2 97
Al comparar la dispersión de los datos obtenidos en los experimentos de repetibilidad y
precisión intermedia, es de esperarse que se observe una mayor variabilidad en los
resultados obtenidos en el ensayo de precisión intermedia, pues es realizado en días
diferentes y posiblemente hay mayores variaciones; sin embargo se observa que no hay
variaciones tan grandes entre los ensayos en días diferentes comparándolos con los
realizados el mismo día.
Como se mencionó anteriormente, se realizó la prueba estadística de Cochran y se
determinó que es posible calcular un porcentaje de recuperación típico. A partir de este
dato, se puede también obtener un coeficiente de variación típico de la metodología
como se muestra a continuación. Los resultados se observan en la
Tabla 22.
í %
Tabla 22. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método
% Recuperación Típico
CV Típico
ETU PTU ETU PTU
77,82 83,57 7,38 10,25
Los parámetros típicos de desempeño de la metodología en cuanto a exactitud y
precisión se encuentran dentro de los rangos establecidos.
2.11.6 Robustez de la metodología
La capacidad del método de permanecer inalterado ante variaciones hechas
deliberadamente según se planteó en la Tabla 11, provee un indicio de su veracidad
durante el uso como método de rutina. Se seleccionaron variables que podrían influenciar
el resultado si fuesen modificadas. Entre ellas se incluyen los tiempos de extracción,
pues de ser disminuidos podrían afectar negativamente la extracción de los compuestos;
la cantidad de extrelut o el tiempo de contacto, pues cantidades o tiempos superiores a
98 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
los establecidos podrían resultar en una mayor retención de los compuestos y la
temperatura de evaporación del metanol previa a la etapa de limpieza, pues podría
afectar la estabilidad de los analitos. Otras variables seleccionadas estaban enfocadas
hacia la evaluación de la ejecución de la metodología en el escenario instrumental, como
modificaciones en la longitud de onda de lectura o en la composición de la fase móvil,
pues influencian la separación y detección de los compuestos.
Para la evaluación de este parámetro es común emplear diseños experimentales
factoriales, que permitan evaluar el efecto de muchos factores modificados
simultáneamente. El procedimiento de Youden y Steiner es muy eficaz, ya que puede ser
evaluado el efecto de siete variables con sólo ocho experimentos. En primer lugar se
seleccionaron estratégicamente las variables que podrían influir en la recuperación de los
analitos, como se mencionó anteriormente y como se muestra en la Tabla 10. Cada
variable se estudio mediante un valor (o cualidades cuando esto no es posible)
establecido (A, B,...,G) y otro alterado (a, b,...,g) y se diseñaron ocho experimentos
(Tabla 10). Los resultados encontrados se representan con las letras s hasta la z.
A partir de los resultados se calculó el efecto de cada una de las variables promediando
los cuatro análisis que contienen la variable en su valor establecido (mayúsculas) y
aquellas que corresponden al valor alterado (minúsculas). Así, para evaluar el efecto de
la primera variable se tiene:
4 44
4 44
Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivale a “A” porque las seis
restantes variables presentes en estos cuatro resultados se anulan entre sí como
consecuencia de que existen siempre dos mayúsculas y dos minúsculas de cada
variable. Análogamente, la media de los resultados (w + x + y + z) equivalen a “a”. Al
comparar estos dos valores medios conocemos la influencia de la variable en estudio.
Estableciendo las siete comparaciones posibles (A – a,...,G – g) puede conocerse el
efecto de cada variable: Cuanto mayor sea la diferencia mayor influencia tendrá dicha
variable en el método analítico.
Capítulo 2 99
A partir de los resultados se calculó el valor absoluto de la diferencia de la media para
cada parámetro de forma individual y se comparó con el producto de la desviación
estándar del estudio de precisión como repetibilidad y la raíz de 2. Si la diferencia de la
media es menor que el valor del producto no hay diferencia significativa siendo robusto a
las modificaciones en la variable evaluada. En la
Tabla 23 se observa el efecto de las variables evaluadas sobre la robustez de la
metodología.
Tabla 23. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez.
Variable D
%R Diferencia de
las medias Influencia(*)
ETU PTU ETU PTU ETU PTU
1 Tiempo de agitación
(min) t 91,67 98,50 2,81 4,60 NS NS
2 Modo de agitación u 83,33 97,74 5,71 2,22 NS NS
3 Temperatura de
evaporación(°C) v 77,78 81,53 0,40 0,76 NS NS
4 Masa de extrelut (g) w 90,58 93,63 7,30 7,06 NS NS
5 Tiempo de contacto
(min) x 76,33 99,28 4,27 7,76 NS NS
6 Longitud de onda (nm) y 74,05 97,12 8,62 3,17 NS NS
7 Fase móvil
(Composición) z 96,04
105,4
7 9,50 4,52 NS NS
8 s 95,47 99,32 (*) Comparación con valor de comparación S√2 ETU: 9,60; PTU: 11,17.
Como se muestra en la
Tabla 23, la modificación de las variables seleccionadas no causa cambios significativos
en el porcentaje de recuperación de los analitos, por lo tanto, la metodología es robusta
para todos los parámetros evaluados. Sin embargo, existen variables para las cuales el
efecto es comparativamente elevado, como son la masa de extrelut y el tiempo de
contacto, en el caso de la PTU, lo que indica que modificaciones mayores podrían
resultar en cambios significativos en la recuperación de los analitos. Es de esperarse que
100 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
al tener una masa mayor de extrelut, las moléculas de analito se distribuyan sobre la
totalidad de la superficie en el proceso de partición liquido-liquido, haciendo que la
cantidad de diclorometano utilizado para la elución no sea suficiente para extraer todo el
analito. Así mismo, un mayor tiempo de contacto entre la fase acuosa y el adsorbente
resultaría en una retención mayor de los analitos, por lo tanto es recomendable mantener
las cantidades y tiempos establecidos en la metodología validada, no obstante, con las
variaciones realizadas el efecto es estadísticamente no significativo.
2.12 Cuantificación de los analitos en muestras comerciales
Colombia es un país agrícola en el cual el uso de plaguicidas es una herramienta
indispensable para controlar enfermedades en los cultivos. Sin embargo, el uso
inadecuado, particularmente excesivo, la aplicación en tiempos inapropiados y en cultivos
no registrados hace del uso de estas sustancias un riesgo potencial a la salud. A ello
debe sumarse que la aplicación indiscriminada causada por la práctica de monocultivo no
tecnificado y el bajo nivel educativo de las personas que manejan el producto en el
campo ocasionan un incremento en el nivel de riesgo para los agricultores y para los
consumidores finales.
En este estudio se realizó un monitoreo para determinar la presencia de ETU y PTU en
muestras de consumo. La selección del cultivo a evaluar se efectuó realizando una
revisión de la base de datos del ICA respecto a los registros nacionales de plaguicidas en
el año 2012. [33]
Como se observa en el Gráfico 9, el cultivo que tiene mayor número de productos
comerciales que contienen mancozeb o propineb registrados ante el ICA corresponde al
cultivo de papa, seguido por tomate y rosas.
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102 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Otro aspecto que ha propiciado la expansión del tomate en el país ha sido la
especialización de unas regiones en la producción de este alimento, teniendo en cuenta
que las características del suelo sean favorables para la siembra de una determinada
variedad, lo que ha conducido a departamentos como Boyacá y Norte de Santander a ser
abanderados en la producción de este alimento.
Son dos escenarios contrastantes, pues el cultivo de la papa tiende a mantenerse de
forma artesanal mientras que el tomate migra hacia la tecnificación y empleo de nuevas
técnicas de cultivo que permiten al productor colombiano entrar en mercados
internacionales. No obstante, es bien sabido que, en ambos cultivos, un alto porcentaje
de costos de producción se encuentra relacionado con el uso de fungicidas para la
protección del cultivo y que muchas veces son sobredosificados como una manera de
hacer frente al riesgo que implica la presencia cada vez más activa de plagas y
enfermedades como una forma de asegurar la elevada inversión económica por hectárea
cultivada.
Con base en lo mencionado anteriormente, se decidió realizar el monitoreo de ETU y
PTU en muestras de papa y tomate, considerando el elevado número de productos para
protección de cultivos que contienen mancozeb o propineb y que se encuentran
registrados. Adicionalmente, dado el manejo del cultivo y la cadena productiva, es posible
que se encuentren residuos de ETU y PTU como productos de transformacion de
ditiocarbamatos, por lo tanto se decidió realizar el análisis de muestras obtenidas en el
mercado local.
Para la papa el muestreo se realizó tomando cuatro muestras ubicadas en la segunda
instancia de la cadena productiva siendo obtenidas en el mercado local, mientras que
una de las muestras fue obtenida en el mercado de Ubaté (Cuindinamarca), ubicado en
la zona cundiboyacesnse, reconocida por la producción de éste tubérculo, y la cual
corresponde a eslabón primario. En el caso del tomate, las cinco muestras evaluadas
fueron obtenidas en tiendas comercializadoras minoristas en el mercado local.
Capítulo 2 103
2.12.1 Análisis de muestras
Los resultados de los análisis de las muestras se observan en la Tabla 24. Los datos
detallados se muestran en el anexo 3.
Tabla 24. Resultados de monitoreo de residuos de ETU y PTU en muestras de papa y tomate
Muestra N° Papa Tomate
ETU PTU ETU PTU
1 < LD < LD Trazas < LD
2 < LD < LD < LD < LD
3 < LD < LD < LD < LD
4 < LD < LD < LD < LD
5 < LD Trazas < LD < LD
Como puede observarse, ninguna muestra de papa presento residuos de ETU pero se
encontró PTU a nivel de trazas en una de las muestras evaluadas (Cromatograma en la
Figura 28) , correspondiente a la obtenida en el primer eslabón de la cadena productiva;
para este caso en particular, fue posible hablar con el agricultor e indagar en cuanto a los
productos aplicados para la protección del cultivo y se encontró que el agricultor utilizó
FITORAZ ® aproximadamente 20 días antes de la cosecha, pero no se confirmó un dato
preciso de la cantidad aplicada. Este producto es un fungicida protectante y curativo
desarrollado para el control de enfermedades causadas por los hongos que está
compuesto por una mezcla de propineb al 70% y cimoxanil al 6%.
La presencia de residuos puede darse si el agricultor no tuvo en cuenta el periodo de
carencia necesario para llevar su producto al mercado local, que para la mayoría de
productos que contienen propineb al 70%, como es el caso del FITORAZ® es de 14 dias.
Otra explicación para encontrar dicho metabolito en la papa es que residuos de PTU o
propineb hayan quedado adheridos al suelo y se hayan transferido a la papa durante su
transporte y almacenamiento. Cabe resaltar que el número de muestras tomadas en este
estudio es muy reducido como para sacar una conclusión definitiva.
104
Figura señal c
El cultiv
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106 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Es de especial importancia resaltar que las concentraciones determinadas se encuentran
por debajo del límite máximo de residuos más estricto a nivel mundial (0.01 mg/kg) y que
se requiere establecer un programa de monitoreo representativo y estructurado para
obtener datos concluyentes. Así mismo, la detección de los analitos ha sido realizada en
sistema de detección universal, como lo es el DAD por lo que los resultados obtenidos
para muestras positivas deben ser confirmados en un sistema cromatográfico con
detector selectivo de masas.
107
3. Capítulo 3. Desarrollo y validación de una metodología para el análisis de etilentiourea y propilentiourea en suelos
La evaluación del grado de contaminación del suelo por plaguicidas o sus productos de
transformación es de particular importancia debido a la transferencia de estos
contaminantes a los alimentos y a la posibilidad de migración de los mismos hacia otros
compartimentos ambientales. Así mismo, la fertilidad del suelo depende de la fauna y
flora presentes en éste, la cual puede verse afectada por sustancias exógenas
provenientes de la actividad agrícola.
Los plaguicidas o sus productos de transformación pueden cambiar las propiedades
químicas del suelo, ya que algunos se acumulan y pueden causar diversas alteraciones.
Dependiendo las propiedades fisicoquímicas, el compuesto puede sufrir diversos
procesos. La movilidad en el ambiente puede darse pos arrastre del contaminante a
través de la superficie del suelo por acción de aguas lluvias o agua de riego del cultivo,
por deriva causada en el momento de la aplicación por corrientes de viento que
depositen el plaguicida en fuentes de agua cercanas al sitio de aplicación. En el suelo,
las moléculas pueden sufrir variados procesos, tales como adsorción, absorción,
degradación, lixiviación, entre otros que pueden modificar su acción biológica y su
persistencia, así como las características fisicoquímicas del suelo alterando la fauna y
flora del mismo, y así su fertilidad.
El mancozeb y el propineb son compuestos de baja persistencia en suelos con tiempos
de vida media de entre 1 y 7 días, sin embargo, sus metabolitos, ETU y PTU pueden
persistir en el suelo de 5 a 10 semanas [25]. La importancia de su determinación radica
en que dada su elevada solubilidad y movilidad en agua, pueden potencialmente migrar
hacia aguas subterráneas. Estudios han determinado que, tras aplicaciones sucesivas de
108 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
mancozeb, la ETU puede encontrarse en bajas concentraciones en suelo, pero puede
movilizarse a cuerpos de agua superficiales y subsuperficiales por encima de los límites
de seguridad, siendo un riesgo potencial para la salud y la seguridad de los
consumidores próximos.
En este capítulo se muestran los resultados de selección y validación de una
metodología rápida, económica y ambientalmente amigable para la determinación de
ETU y PTU a nivel de trazas en suelos de uso agrícola, la cual puede ser utilizada en un
futuro como parte de programas de monitoreo para el estudio del destino ambiental de
dichos compuestos en suelos tropicales.
3.1 Equipos, materiales, estándares de referencia, solventes y reactivos
3.1.1 Estándares, solventes y reactivos
Los estándares de etilentiourea y propilentiourea empleados fueron suministrados por Dr
Ehrenstorfer con pureza mayor al 98%. Las soluciones madre fueron preparadas en
acetonitrilo y fueron almacenadas en frascos ambar a -20°C. Diluciones de 50 µg/mL de
ETU y 100 µg/mL de PTU fueron preparadas en acetonitrilo y a partir de ellas se
prepararon a diario los estándares de calibración para la inyección en HPLC utilizando
agua como disolvente.
3.1.2 Matrices de ensayo
Los suelos empleados como blancos de procedimiento fueron obtenidos en la vereda la
Hoya del departamento de Boyacá; son suelos de uso agrícola que han sido utilizados
principalmente para el cultivo de papa y arveja. En el muestreo se realizó una calicata de
un metro de profundidad tomando muestras cada 20 cm. Las propiedades del suelo
muestreado a cada profundidad se encuentran reportadas en la Tabla 25.
Capítulo 3 109
Tabla 25. Propiedades fisicoquímicas de la calicata utilizada en la validación de la metodología
Profundidad (cm)
% CO %Humedad higroscópi
ca pH
AI meq/100 g
CIC meq/100 g
%N %Arci
llas %Lim
os %Arenas
Textura
0-20 7,45 9,53 4,87 4,56 38,2 0,56 26 24 50 FArA
20-40 7,61 10,61 4,89 4,57 38,4 0,57 26 24 50 FArA
40-60 4,58 15,08 5,00 2,31 34,9 0,34 24 4 72 FArA
60-80 2,31 7,16 4,57 3,22 27,2 0,13 62 12 26 Ar
80-100 2,14 6,26 4,11 4,17 21,7 0,07 70 18 12 Ar
3.1.3 Materiales y equipos
El pesaje de las muestras se llevó a cabo en una balanza de platillo externo Mettler
Toledo y los estándares de referencia se pesaron en una balanza analítica Scaltec
SAC22. Para la optimización de la extracción se utilizó un ultrasonido marca Elma con
una frecuencia de 35 KHz, una centrifuga refrigerada marca Thermo y un agitador vortex
marca Heidolph. Se utilizó un sistema de filtración de solventes marca Millipore para la
filtración de los solventes a usar en HPLC. Para el almacenamiento de los blancos de
suelo se utilizó un congelador Frigidaire de 200 L.
Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia marca Agilent Technlogies con
bomba cuaternaria G1310A, detector de arreglo de diodos G1365B, compartimento
termostado para columna G1316A y sistema de desgasificación G1379A de la serie 1100
acoplado a un sistema de inyección automática G1329A de la serie 1200.
3.1.4 Reactivos y solventes
Todos los solventes utilizados en este estudio fueron marca J.T. Baker grado residuos y
grado HPLC. Previo a su uso en HPLC fueron filtrados a través de una membrana de
0.45 µm. Se utilizó agua ultrapura filtrada a través de un equipo de purificación marca
Millipore.
110 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
3.1.5 Sistema instrumental
La inyección se llevó a cabo utilizando agua como solvente. La separación se realizó en
una columna analítica LiChrosphere RP-18, 250 x 4 mm., 5µm., con guardacolumna C18
utilizando una fase móvil compuesta de agua:acetonitrilo 98:2 en modo isocrático a 1.2
mL/min y 25°C. Se inyectaron 100 µL de la muestra y la detección se llevó a cabo a 232
nm.
3.2 Preparación y homogenización de la muestra – Suelos de ensayo
Las muestras blanco de suelo fueron tomadas en campo realizando calicatas de 1 m2.
Fueron secadas a temperatura ambiente, trituradas, tamizadas y almacenadas a -20°C.
3.3 Selección de la metodología – Parte experimental
Las interacciones de contaminantes con el suelo pueden ser muy variadas y
principalmente se dan con la fracción coloidal, minerales de arcilla y materia orgánica;
así, es posible predecir el comportamiento de un compuesto determinado en función de
su estructura y de las características del suelo. La ETU y la PTU son sustancias polares,
muy solubles en agua, débilmente básicas y capaces de formar puentes de hidrógeno.
Su adsorción o fijación sobre la fracción arcillosa es poco probable, dado que no tienen
características catiónicas que le permitan intercambiarse con los cationes inorgánicos de
la arcilla, como ocurre con los herbicidas parquat o diquat, aunque su pequeño tamaño
posibilita la penetración en la interlámina. En la materia orgánica, las moléculas de ETU y
PTU pueden fijarse débilmente por medio de enlaces de hidrógeno y fuerzas de vander
waals.
En cuanto a la determinación de los compuestos de interés en suelo, se han publicado
principalmente, estudios en los que se usan radiotrazadores para evaluar la presencia y
Capítulo 3 111
distribución en diferentes compartimentos ambientales ; Johannesen et.al [11] utilizó una
metodología para evaluar la degradación de ETU en suelos arenosos superficiales y sub-
superficiales de Dinamarca, en la cual empleó radiotrazadores para determinar los
tiempos de mineralización de ETU realizando una extracción con solución de cloruro de
calcio 0.01 M en relación 2:1 con la cantidad de suelo. Realizando dicho proceso obtuvo
un porcentaje de recuperación de 71.5%. Por otro lado, Violette et.al. [25], en su estudio
utilizó una metodología de extracción y derivatización precolumna con inyección en
cromatografía de gases para realizar monitoreo de ETU en suelo y agua de regiones de
producción bananera, sin embargo, este procedimiento tiene desventajas inherentes.
Este trabajo propone evaluar una nueva metodología que sea de fácil ejecución, rápida y
económica.
Para realizar el proceso de extracción es necesario considerar los factores mencionados
previamente, pues es necesario vencer las interacciones que se presentan entre las
moléculas de los compuestos de interés y el suelo para transferirlas al solvente de
extracción. Se requiere entonces un solvente de alta polaridad y capaz de formar puentes
de hidrógeno, en el cual los analitos tengan elevada solubilidad; podría realizarse la
extracción con metanol, etanol o agua; se consideró la posibilidad de utilizar mezclas
agua:metanol, puesto que dieron los mejores resultados para la extracción en frutas y
hortalizas, sin embargo, el metanol o el etanol, dada su naturaleza orgánica podrían
extraer una mayor cantidad de interferencias polares provenientes de la materia
orgánica, las cuales podrían afectar la separación en cromatografía líquida, requiriendo
involucrar una etapa de limpieza del extracto. Así pues, el solvente seleccionado fue
agua, debido a la polaridad y solubilidad de ETU y PTU y a que minimiza la posibilidad de
extraer sustancias orgánicas no deseadas.
La extracción se realizó utilizando agua como solvente de extracción y evaluando cuatro
diferentes modos de agitación con el fin de seleccionar el que proporcionara los mejores
resultados de porcentajes de recuperación de los analitos, desde el punto de vista
cuantitativo, y los extractos con menos interferencias desde el punto de vista cualitativo.
Se seleccionaron metodologías de extracción fuerte y activa como la agitación vortex o
agitación manual ejecutadas en tiempos relativamente cortos, 2 minutos, en comparación
con técnicas pasivas pero con la posibilidad de ejecución en lote, como la agitación
rotativa o la aplicación de ultrasonido, ejecutadas en tiempos más largos, 20 minutos.
112 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Se utilizaron 20 mL de agua para realizar la extracción de los analitos a partir de 10 g de
suelo. Posteriormente se centrifugó la mezcla a 5000 rpm durante 10 minutos. 2 mL del
sobrenadante fueron filtrados a través de una membrana de 0,22 µm de tamaño de poro
para ser posteriormente inyectados en el sistema cromatográfico.
Se realizó la extracción de muestras de suelo fortificadas a 0,05 mg/kg de ETU y 0,10
mg/kg de PTU por triplicado, utilizando los cuatro modos de agitación mencionados. Se
utilizó análisis de varianza al 95 % de confianza para determinar las diferencias y prueba
de comparación de medias de tukey para seleccionar la metodología que proporcionaba
los mejores porcentajes de recuperación.
3.4 Selección de la metodología – Resultados y discusión
En la Tabla 26 se observan los resultados de porcentaje de recuperación y coeficiente de
variación para el ensayo de selección de la metodología. El análisis de varianza muestra
diferencias significativas (p<0,05) entre los cuatro grupos de datos, y la prueba de
comparación de medias de tukey evidencia que realizando la extracción con agitación
con vortex se obtienen porcentajes de recuperación estadísticamente superiores.
Tabla 26. Resultados selección de la metodología de extracción en suelos.
Modo de agitación % Recuperación CV
ETU PTU ETU PTURotativa 60,34 74,25 10,89 5,84Vortex 74,91 76,00 1,01 2,65Manual 64,57 74,40 0,65 5,62Ultrasonido 62,62 68,61 10,55 0,91
Así mismo, se puede observar que los coeficientes de variación de ETU en los ensayos
de extracción con agitación rotativa y utilizado ultrasonido son más elevados; esto debido
a la dificultad en la integración de los picos, pues se observan mas interferencias
cromatrográficas que no se resuelven de forma adecuada; estas metodologías de
Capítulo 3 113
extracción se evaluaron poniendo en contacto la muestra con el solvente de extracción
un mayor tiempo con el fin de dar la posibilidad a los analitos de migrar a la fase acuosa.
Sin embargo, el efecto logrado fue el de transferir mas interferencias al extracto, lo cual
se evidencia en los cromatogramas. La agitación rotativa tiene la gran ventaja de ofrecer
la posibilidad de hacer lotes de muestras, lo que economiza tiempo y esfuerzo, sin
embargo el porcentaje de recuperación de la ETU el más bajo; la extracción con
agitación manual y con agitador vortex presentan coeficientes de variación bajos pero
con vortex se obtienen los mejores porcentajes de recuperación, por lo que se selecciona
como metodología de extracción para la validación del método.
3.5 Validación de la metodología – Parte experimental
Se utilizó matriz blanco de suelo correspondiente al primer nivel (0-20 cm) de la calicata,
de textura Francoarcilloarenosa. Se evaluaron los parámetros mencionados a
continuación. Para todos los ensayos de recuperación, muestras blanco de suelo fueron
fortificadas al nivel de evaluación y dejadas en reposo durante una hora antes de
continuar con el proceso analítico.
3.5.1 Especificidad-Selectividad
Extractos de muestras blanco de suelo recolectadas entre 0 y 20 cm de profundidad
fueron inyectados en HPLC en conjunto con estándares de 0,05 µg/mL de ETU y 0.10
µg/mL de PTU disueltos en agua. Se inyectaron en una misma secuencia cromatográfica
y se determinó la presencia o ausencia de interferencias en el tiempo de retención de los
analitos.
3.5.2 Limites de detección y cuantificación de la metodología
Se calculó el ruido para inyecciones de extractos de matriz blanco realizadas en el
proceso de evaluación de especificidad-selectividad al tiempo de retención de los
analitos. En la misma secuencia se inyectó una mezcla de estándares de ETU (0,05
114 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
µg/mL) y PTU (0,10µg/mL). Utilizando la respuesta en altura de las inyecciones de los
estándares se estimaron los límites de detección LD y cuantificación LC.
3
10
Para corroborar la estimación del LD, se fortificó extracto de suelo blanco a dicha
concentración y se inyectó en el sistema cromatográfico. La respuesta de los analitos
debe ser mayor que 3 veces el promedio del ruido de los blancos. Para corroborar la
estimación del límite de cuantificación, se realizó un experimento de recuperación por
triplicado a la concentración equivalente al límite de cuantificación, para evaluar su
exactitud y precisión.
3.5.3 Linealidad – Efecto matriz
Se prepararon e inyectaron en una misma secuencia los niveles 1, 3 y 5 de la curva de
calibración en solvente y en extracto de suelo blanco. Se calculó el efecto matriz como se
muestra a continuación:
%
100
Si en alguno de los niveles el porcentaje de efecto matriz supera el 120%, se considera
que existe efecto matriz y las curvas de calibración y la cuantificación deben hacerse con
estándares preparados en extracto blanco de matriz.
Se evaluó la respuesta del sistema a cinco diferentes niveles de concentración según la
Tabla 27.
Capítulo 3 115
Tabla 27. Concentraciones de los niveles de calibración
Nivel ETU (µg/mL)
ETU (mg/kg)
PTU (µg/mL)
PTU (mg/kg)
1 0.01 0.02 0.02 0.04
2 0.02 0.04 0.04 0.08
3 0.05 0.10 0.10 0.20
4 0.10 0.20 0.20 0.40
5 0.25 0.50 0.50 1.00
Se determinó estadísticamente el coeficiente de correlación lineal y la ecuación
correspondiente al ajuste lineal. Se evaluó el valor estadístico t Student para la
pendiente, el intercepto y la correlación. Utilizando el método estadístico ANOVA se
evaluaron los parámetros F para regresión y ajuste de linealidad. Los parámetros de
aceptación se encuentran consignados en la Tabla 9.
1.1.1. Exactitud
Se evaluó a los niveles 1, 3 y 5 de la curva de calibración. Muestras de suelo blanco
fueron fortificadas a los niveles de evaluación (mg/kg). Se realizó el procedimiento
analítico sobre la matriz fortificada (n=7). Se prepararon estándares de calibración a los
niveles de evaluación (µg/mL) y se calculó el porcentaje de recuperación así:
%
100
Se calculó la homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Cochran (Anexo 1).
El G calculado debe ser menor al G teórico, con un nivel de confianza del 95 %. Esta
condición acepta que el nivel de concentración no afecta la variabilidad de los
porcentajes de recuperación, por tal motivo se puede expresar el porcentaje de
recuperación típico.
116 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
3.5.4 Precisión
• Repetibilidad En un mismo día, se hicieron ensayos de recuperación (n=4) de blancos de suelo
fortificados a cada uno de los niveles de evaluación y se inyectaron en una misma
secuencia cromatográfica. Se calculó el porcentaje de recuperación para cada ensayo
(%R) el porcentaje de recuperación promedio de cada nivel (%Rprom) y el coeficiente de
variación CV.
• Precisión intermedia
Se realizaron ensayos de recuperación en cuatro días diferentes (D1, D2, D3 y D4, n=4,
uno cada dia), de cada uno de los niveles de evaluación. Se calculó el porcentaje de
recuperación para cada ensayo (%R), el porcentaje de recuperación promedio de cada
nivel (%Rprom) y el coeficiente de variación CV.
3.5.5 Robustez de la metodología
Siete variables fueron seleccionadas (
Tabla 28) para la evaluación de la robustez utilizando un diseño de Youden-Steiner como
se muestra en la Tabla 29.
Tabla 28. Variables experimentales para evaluación de la robustez del método.
Valor nominal Valor Alterado
Variable Denominación Valor Denominación Valor Tipo de suelo A 0-20 a 80-100
Tiempo de fortificación (horas) B 1 b 72
Tiempo de Agitación (minutos) C 2 c 1
Tiempo de inyección (horas) D 2,0 d 48
Longitud de onda (nm) E 232 e 240
Fase Móvil F 98:2 f 99:1
Flujo (mL/min) G 1,2 g 1
Capítulo 3 117
Tabla 29. Diseño experimental para evaluación de la robustez.
Variable 1 2 3 4 5 6 7 8
Tipo de suelo A A A a a a a A
Tiempo de fortificación (horas) B b b B B b b B
Tiempo de Agitación (minutos) c C c C c C c C
Tiempo de inyección (horas) D d d d d D D D
Longitud de onda (nm) e E e e E e E E
Fase Móvil f f F F f f F F
Flujo (mL/min) g g G g G G g G
3.6 Validación de la metodología – Resultados y discusión
A continuación se muestran los resultados de evaluación de los parámetros de validación
para la metodología de extracción y determinación de ETU y PTU en suelo. La
metodología seleccionada es rápida, sencilla y económica de ejecutar en el laboratorio
en cuanto a tiempo e insumos y es ambientalmente amigable, pues utiliza únicamente
agua para la extracción y 98 % de agua en la separación cromatográfica.
3.6.1 Especificidad-Selectividad
Para evaluar la capacidad del método de responder ante los analitos objetivo en
presencia de otras sustancias coextraidas de la matriz se inyectaron extractos de suelo
blanco y se comparó la respuesta con la de la mezcla de analitos en solvente.
En la Figura 30 se muestra un cromatograma caracteristico de blanco de matriz
superpuesto con los analitos de interés inyectados en solvente; no se observan
interferencias en los tiempos de retención de los analitos, por lo tanto la metodología es
selectiva y especifica, permitiendo analizar ETU y PTU individualmente en presencia de
las demás sustancias de la matriz.
118
Figura
analito
Los res
una señ
3.6.2
A partir
la altura
Tabla 3detecc
Valida
30. Crom
s. Especifi
sultados mu
ñal clara, dif
Limites
r de la inyec
a correspon
30. Valoresión y cuan
ción de me
atograma
cidad de la
uestran que
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de detec
cción de est
ndiente a ca
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Analito
ETU PTU
todologías
obtenido
a metodolo
e el sistema
y resuelta p
cción y c
tándares de
ada pico.
a de analito
o Rango t
3,5-3,8
6,0-6,5
analíticas p
degra
para extra
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a es específ
para cada u
cuantifica
e bajas con
os individu
tr H (mUA
8 0,57
5 0,61
para la dete
adación de f
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fico y selec
uno de los c
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ncentracione
uales para
A) Conc. µ
0,006
0,012
rminación d
fungicidas d
uelo blanco
ctivo, pues e
componente
la metod
es (Tabla 3
estimació
µg/L
63
25
de producto
ditiocarbam
o y mezcl
es capaz d
es de interé
dología
0), se deter
ón del límit
os de
matos
la de
e dar
s.
rmino
te de
Capítulo 3 119
Realizando extracciones de suelo blanco se calcularon los ruidos en el rango del tiempo
de retención de los analitos según se observa en la Tabla 31.
Tabla 31. Ruidos determinados para cada blanco de matriz para la estimación del límite de detección y cuantificación
Ruido (mUA) 3Ruido (mUA) 10 Ruido (mUA)
Matriz ETU PTU ETU PTU ETU PTU B1 7,90E-02 7,00E-02 2,37E-01 2,10E-01 0,790 0,700
B2 4,30E-02 8,10E-02 1,29E-01 2,43E-01 0,430 0,810
B3 7,49E-02 7,76E-02 2,25E-01 2,33E-01 0,749 0,776
B4 7,91E-02 7,81E-02 2,37E-01 2,34E-01 0,791 0,781
B5 6,56E-02 4,56E-02 1,97E-01 1,37E-01 0,656 0,456
Promedio 2,05E-01 2,11E-01 6,83E-01 7,05E-01
Utilizando el promedio del ruido y los valores de altura de los estándares y sus
concentraciones se estimaron los límites de detección y cuantificación y se reportan en la
Tabla 32
Tabla 32. Límites de detección y cuantificación estimados
ETU PTU
LD Est (µg/mL) 0,002 0,004
LC Est (µg/mL) 0,007 0,014
LD Est (mg/kg) 0,004 0,009 LC Est (mg/kg) 0,015 0,029
Realizando la fortificación del extracto de suelo blanco se determinó que se hizo una
subestimación del límite de detección, pues la señal no es claramente diferenciable del
ruido, por tanto, se determinó que la concentración que proporciona una señal mayor a
tres veces el promedio del ruido corresponde a la equivalente 0.01 mg/kg de ETU y 0.02
mg/kg de PTU. El cromatograma se observa en la Figura 31.
Se realizaron los experimentos de recuperación para evaluar la exactitud y precisión y
establecer los límites de cuantificación. Los resultados se muestran en la Tabla 33.
120
Figura analito
Tabla 3PTU
Las con
cuantific
dispers
Valida
31. Cromas al límite d
33. Recupe
ncentracion
cación pue
ión de los r
ción de me
atograma ode detecció
eración al l
R1R2R3PrCV
es 0,020 m
esto que p
resultados.
todologías
obtenido alón 0.01 mg
límite de c
E%
1 7
2 7
3 8
romedio 7V 2
mg/kg ETU y
resentan b
analíticas p
degra
l fortificar g/kg ETU y
cuantificaci
ETU %rec
76,85
76,30
80,56
77,90 2,97
y 0,040 mg/
buenos los
para la dete
adación de f
el extracto0.02 mg/kg
ión 0.020 m
PTU %rec
67,13
68,52
75,00
70,22 5,98
/kg PTU se
porcentaje
rminación d
fungicidas d
o de suelo g PTU.
mg/kg ETU
e establecen
es de recup
de producto
ditiocarbam
blanco co
U y 0.040 m
n como lími
peración y
os de
matos
n los
mg/kg
ite de
baja
Capítulo 3 121
3.6.3 Linealidad –Efecto matriz En la Tabla 16Tabla 34 y en la Tabla 35 se muestran los resultados del cálculo del
porcentaje de efecto matriz para los dos analitos en los cinco niveles de calibración.
Tabla 34. Efecto matriz pata ETU.
Nivel Concentración
(µg/mL) Solvente
(mUA/min)Matriz
(mUA/min)EM %
1 0,010 5,4 5,4 100,62
2 0,020 12,0 12,6 104,38
3 0,050 29,8 32,3 108,27
4 0,100 62,6 62,8 100,27
5 0,200 120,6 122,8 101,88
Tabla 35. Efecto matriz para PTU.
Nivel Concentración
(µg/L)
Solvente
(mUA/min)
Matriz
(mUA/min)EM %
1 0,020 11,0 11,0 100,00
2 0,040 22,4 22,6 101,06
3 0,100 57,8 59,0 102,13
4 0,200 121,5 118,1 97,23
5 0,400 230,5 236,4 102,56
Dado que no existe efecto matiz (%EM <120) en ninguno de los niveles de calibración y
para ninguno de los dos analitos, la cuantificación puede hacerse preparando estándares
de calibración en solvente, así como la evaluación de la linealidad.
Para la determinación del rango lineal se realizaron las curvas de calibración graficando
la respuesta como área en función de la concentración y se muestran en el Gráfico 10
para la ETU y en el Gráfico 11 para la PTU. La concentración determinada como límite
122
de cuan
y para l
Gráfico
Una ve
evaluar
correlac
de la ex
Tabla 3
‐20,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
0
Area
Valida
ntificación f
a evaluació
o 10. Curva
ez establec
ron los esti
ción lineal,
xistencia de
36.
0,0
CC ETU
ción de me
fue establec
ón del rango
as de calibr
cida la varia
madores de
así como lo
e regresión
0,1
Solvente
todologías
cida como e
o lineal.
ración en s
ación de la
e la regres
os parámetr
y desvío de
Co
Curva d
LC CC ETU
analíticas p
degra
el nivel más
solvente y e
a respuesta
ión lineal: p
ros de anál
e la linealida
y = 61R
0,1
oncentración (m
de calibració
U Solvente
para la dete
adación de f
s bajo de d
en matriz E
a en funció
pendiente,
isis de vari
ad. Los resu
15,17x + 0,4341R² = 0,9996Matriz
mg/L)
n ETU
CC ETU M
rminación d
fungicidas d
ichas curva
ETU.
ón de la co
intercepto
anza para l
ultados se o
y = 607,35x ‐R² = 0,99Solven
1
0,2
Matriz
de producto
ditiocarbam
as de calibr
oncentració
y coeficien
la determin
observan en
‐ 0,0623994 te
0,2
LC ETU Matriz
os de
matos
ración
ón se
te de
ación
n la
z
C
G T
(*)
(**
A
Capítulo 3
Gráfico 11.
Tabla 36. Re
Valor de la
Pendiente
Valor del
Intercepto
Correlación
Regresión
Desvío
) Estadístico F en
*)Estadístico F en
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
300,0
0,0
Area
Curvas de
esultados
E
a
e 60
o -0
n 0,9
n S
NS
ANOVA de lineal
n ANOVA de linea
0,0 0
calibració
pruebas es
TU
07,3
0,06
9990
S(*)
S(**)
lidad no significati
alidad significativo
0,1 0,1
CC ETU Solven
ón en solve
stadísticas
PTU
580,8
0,34
0,9990
S(*)
NS(**)
ivo para H0= no e
para H0= no exis
1 0,2
Concent
Curva de ca
nte
ente y en m
s de linealid
La p
El in
Ex
Exis
No
existe regresión en
ste desvio de la lin
y = 593,4R²M
0,2
tración (mg/L)
alibración PT
CC ETU Matriz
matriz PTU.
dad en solv
Conclusio
pendiente es
diferen
ntercepto es
diferen
xiste correla
conce
ste regresió
conce
hay desvío
linentre X e Y, H
1= ex
nealidad, H1= exis
4x ‐ 0,7622² = 1
Matriz
0,3
TU
z LC
vente
ones lineali
s significativ
nte de cero
s significativ
nte de cero
ación entre
entración
ón entre el á
entración
o significativ
ealidad xiste regresión en
ste desvio de la lin
y = 580,8R² = Solv
0,3
C ETU Matriz
123
dad
vamente
vamente
área y
área y la
vo de la
tre X e Y.
nealidad.
85x + 0,3450,999vente
0,4
3
0,4
124 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Se observan que para los dos analitos el intercepto es significativamente diferente de
cero, por lo que debe considerarse al cuantificar; la pendiente, para los dos analitos, es
diferente de cero indicando una respuesta instrumental ante el aumento de concentración
de los analitos; existe correlación lineal entre el área y la concentración al igual que
regresión lineal y no hay desvíos significativos de la linealidad en el rango evaluado.
3.6.4 Exactitud
La exactitud, evaluada como porcentaje de recuperación se determinó a tres niveles de
concentración, un nivel mínimo, equivalente al límite de cuantificación, uno intermedio y
uno máximo en el rango de linealidad establecido tanto para el ensayo de repetibilidad
como para el de precisión intermedia. En la Tabla 37 se observan los resultados de
exactitud de la metodología.
Tabla 37. Resultados ensayo de exactitud de la metodología n=7. Analito ETU PTU
n N1 N3 N5 N1 N3 N5
1 76,85 78,52 73,13 66,20 71,62 72,08
2 76,30 80,83 77,77 68,52 79,26 75,07
3 80,56 78,28 77,52 75,00 75,05 76,57
4 79,63 77,49 79,23 72,40 68,82 77,40
5 70,45 72,45 71,30 72,40 70,50 70,51
6 91,67 81,76 73,45 87,19 79,55 78,21
7 74,05 98,41 77,31 86,35 82,51 82,05
Promedio por
nivel 78,50 81,11 75,67 75,44 75,33 75,98
Promedio metodología
76,69 72,66
Para evaluar la significancia en la diferencia del porcentaje de recuperación con el 100 %
se realiza una prueba t (95% confianza, n=7) de comparación con un valor fijo. Las
ecuaciones pueden verse en el anexo 1.
Capítulo 3 125
En la Tabla 37 se observa que para la mayoría de los ensayos realizados se obtienen
porcentajes de recuperación que se encuentran por encima del 70% al igual que los
promedios. La prueba de Cochran es no significativa, por lo que se puede expresar el
porcentaje de recuperación y el coeficiente de variación típicos de la metodología. La
prueba t de comparación con un valor especificado, utilizada para determinar la
diferencia estadística entre el porcentaje de recuperación promedio y el 100% presenta
diferencias significativas para los dos analitos en todos los niveles de concentración, por
lo cual los resultados de cuantificación en muestras reales deben ser corregidos con el
porcentaje de recuperación.
3.6.5 Precisión
• Repetibilidad
El rango de concordancia entre los resultados en la ejecución de experimentos de
recuperación (n=4) a cada uno de los niveles de calibración mencionados y su
coeficiente de variación se muestran a continuación en laTabla 38. El grado de dispersión
de los resultados es bajo en todos los niveles y para los dos analitos.
Tabla 38. Desempeño del método en condiciones de repetibilidad.
% Recuperación
Promedio CV
ETU PTU ETU PTU
N1 78,33 70,76 2,65 5,09
N3 78,78 73,69 1,82 6,11
N5 76,91 75,28 3,43 3,11
• Precisión intermedia
Se llevaron a cabo ensayos de recuperación en diferentes días (n=4) para evaluar éste
parámetro. Los resultados se muestran en la Tabla 39
126 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 39. Desempeño del método en condiciones de precisión intermedia
% Recuperación
Promedio CV
ETU PTU ETU PTU
N1 78,12 78,61 11,97 12,16
N3 83,36 77,96 13,04 6,65
N5 76,46 76,46 4,60 6,39
Se observa una disminución del coeficiente de variación para los niveles de
concentración más altos, lo cual es esperado, pues la incertidumbre en la medida de
concentraciones mayores es menor.
Se observa también un aumento en la variabilidad del experimento de precisión
intermedia con respecto al de repetibilidad, evidenciada en mayores valores de
coeficiente de variación, lo cual está relacionado con el aumento de variables o de
factores no homogenizados en la prueba de reproducibilidad, pues se realiza el ensayo
en días diferentes, con preparación de estándares diferentes.
Dada la no significancia en la prueba de Chocran, se puede obtener un coeficiente de
variación típico de la metodología como se muestra a continuación. Los resultados se
observan en la Tabla 40
í %
Tabla 40. Parámetros de exactitud y precisión típicos del método % Recuperación
Típico CV Típico
ETU PTU ETU PTU
78,43 75,58 8,22 7,63
Capítulo 3 127
Se observa que con la metodología propuesta se obtienen buenos porcentajes de
recuperación y la dispersión entre los datos es bastante baja, considerando el rango de
concentraciones de trabajo. los valores de porcentaje de recuperación son comparables
con los obtenidos por Johannesen et.al [11], en su estudio de degradación de ETU en
suelos, en donde se utilizó cloruro de calcio 0,01M para llevar a cabo la extracción.
3.6.6 Robustez de la metodología
Se ejecutó el experimento planteado en la Tabla 11 para evidenciar la capacidad del
método de permanecer invariable ante dichos cambios. Se evaluó el efecto del tipo de
suelo sobre el porcentaje de recuperación para determinar la variabilidad al cambiar las
características fisicoquímicas del suelo, pues pueden dificultar la extracción afectando la
recuperación. Así mismo, se ensayó el tiempo de fortificación, con el fin de asegurar que
los analitos no se quedan retenidos en gran porcentaje en el suelo por procesos de
adsorción sobre las arcillas o la materia orgánica.
Tabla 41. Efecto de las variables evaluadas en el experimento de robustez.
Ex
p Variable
Denomin
ación
%R tcalculado Influencia(*)
ETU PTU ETU PTU ETU PTU
1 Tipo de suelo t 74,19 74,22 1,222 0,490 NS NS
2 Tiempo de fortificación
(horas) u 71,00 70,48 3,497 4,596 NS NS
3 Tiempo de Agitación
(minutos) v 71,56 71,62 3,412 6,125 NS NS
4 Tiempo de inyección
(horas) w 64,67 60,90 3,199 3,273 NS NS
5 Longitud de onda (nm) x 68,45 72,99 0,074 1,061 NS NS
6 Fase Móvil y 71,81 73,68 1,690 4,414 NS NS
7 Flujo (mL/min) z 74,70 75,96 1,244 0,490 NS NS
8 s 67,77 65,24 (*) Comparación con valor de t calculado ETU: 3,73; PTU: 6,37
128 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
El tiempo de agitación en la extracción fue evaluado así como el tiempo transcurrido
entre la extracción de la muestra y la inyección del extracto, para garantizar la estabilidad
de los analitos en el extracto en condiciones de refrigeración. Parámetros instrumentales
fueron también evaluados para tener en cuenta variaciones en los equipos que pueden
presentarse en otros laboratorios que ejecuten el ensayo.
Como se muestra en la Tabla 41, la modificación de las variables seleccionadas no
causa cambios significativos en el porcentaje de recuperación de los analitos, por lo
tanto, la metodología es robusta para todos los parámetros evaluados.
Se observa que los analitos no se quedan significativamente retenidos después de 72
horas de fortificación, lo que se explica por los bajos coeficientes de adsorción que
poseen. El tipo de suelo tampoco afecta la recuperación de los analitos dada su elevada
solubilidad en agua y a que la extracción se realiza con agua a pH neutro, con lo que
aparentemente se reduce el número de interferencias en comparación a una extracción
con agua basificada, en la que pueden tenerse ácidos húmicos y fúlvicos del suelo [26].
El tiempo de inyección no afecta la recuperación de los analitos, lo cual indica que los
extractos pueden ser almacenados e inyectados, máximo, 48 horas después de ser
preparados, ya que éste fue el tiempo de evaluación. Los parámetros instrumentales
como la composición de la fase móvil, la longitud de onda de la fase móvil y el flujo no
afectan la recuperación de los analitos.
Sin embargo, cabe anotar que se realizó un experimento fuera del ensayo de robustez,
en el que se pretendía utilizar una columna de la misma fase estacionaria, C18, un poco
más corta, de 150 mm, pues se suponía que no afectaría notablemente la detección o
determinación de los analitos, sin embargo, la interferencia de la matriz cercana al tiempo
de retención de la ETU, que en la columna C18 de 250 mm se encuentra bien resuelta,
se superpone completamente con la ETU, impidiendo que se pueda realizar la
determinación.
Esta observación es de gran importancia dado que restringe la separación de los analitos
de interés a una columna de 250 mm, ya que dadas las condiciones de polaridad elevada
C
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7
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130 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
tiempos de descomposición de ETU en suelo a diferentes profundidades, que van desde
2 horas hasta 109 días, siendo mayor el tiempo de vida media a mayores profundidades,
potenciando así el riesgo de contaminación de aguas sub-superficiales y subterráneas.
En el suelo, la ETU se convierte a etilenurea (EU); ETU y EU pueden ser biológicamente
mineralizadas y convertidas en CO2 en suelos no estériles; el tiempo de vida media por
mineralización es de alrededor de 22 dias. Debido a su bajo coeficiente de adsorción y
elevada solubilidad en agua, ETU y PTU pueden ser lixiviadas o moverse a través del
perfil del suelo con facilidad en suelos húmedos, sin embargo, pueden quedarse
inmovilizadas en suelos secos.
Debido a la posibilidad de contaminación de los alimentos, principalmente de los
tuberculos como la papa, que está en contacto directo y permanente con el suelo, se
planteó la necesidad evaluar la presencia de ETU y PTU en suelos utilizados en cultivo
de papa.
Se recolectaron cuatro muestras en dos zonas de cultivo: una en el departamento de
Boyacá y tres en el departamento de Cundinamarca. Las muestras fueron tomadas en la
zona superficial del suelo, de 0 a 10 cm, transportadas, secadas a temperatura ambiente
para inmovilizar los compuestos y eliminar la presencia de microorganismos,
minimizando la posibilidad de degradación, y posteriormente fueron almacenadas a -
20ºC.
3.7.1 Zona de muestreo
Las muestras fueron recolectadas en zonas que han sido utilizadas para el cultivo de
papa y arveja alternadamente en los departamentos de Boyacá y Cundinamarca. En el
departamento de Cundinamarca la zona de cultivo fue dividida en tres parcelas debido a
las diferentes características geográficas del terreno (Figura 33). En las zonas 1 y 3, el
suelo es de características similares, por su apariencia, posee un elevado contenido de
materia orgánica y retiene bastante agua, mientras que el suelo de la zona 2, que
corresponde a una ladera, tiene características muy diferentes, pues su color amarillento
Capítulo 3 131
y grisáceo es evidencia inicial de su naturaleza arcillosa. En esta zona de cultivo se llevó
a cabo una aplicación de Fitoraz ® 20 días antes de la fecha de muestreo y dos días
antes se presentó un episodio de lluvia fuerte.
Figura 33. Zonas de muestreo Cundinamarca. El suelo recolectado en el departamento de Boyacá se tomó de una parcela individual
homogénea e igualmente se reportó una aplicación reciente de Fitoraz®.
Se llevó a cabo la determinación de residuos de ETU y PTU en las muestras
recolectadas utilizando la metodología validada. Los resultados se muestran en la Tabla
42. Los datos detallados se muestran en el anexo 3.
Tabla 42. Resultados de análisis de muestras de suelo de uso agrícola Muestra N° ETU PTU
1 < LD < LD
2 < LD < LD
3 < LD < LD
4 < LD Trazas
Como puede observase, ninguna de las muestras analizadas presento residuos de ETU
en concentraciones por encima del límite de detección de la metodología; sin embargo,
para una de las muestras analizadas se encontró una señal en el tiempo de retención de
la PTU determinando su concentración nivel de trazas.
132
Figura (Cundide está
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de anál
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fungicidas d
suelo regConfirmaci
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de propin
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de producto
ditiocarbam
gión de Uión con ad
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%, sin
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o por
hacia
ua en
n las
mg/kg,
Capítulo 3 133
apenas por encima del límite de detección de su metodología; el muestreo se llevó a
cabo durante la estación seca y se realizó en una zona donde semanalmente se hace
una aplicación de mancozeb por aspersión. No obstante, concentraciones elevadas de
ETU, por encima de los límites de seguridad fueron encontradas en aguas superficiales y
sub superficiales, lo que indica que este compuesto puede movilizase a través de los
diferentes compartimentos ambientales, incluso si no se tienen eventos de lluvia. Entre
los procesos que pueden estar involucrados se encuentran la movilización sobre
partículas de suelo causada por la erosión de partículas de suelo en las que pudiera
estar adsorbido mancozeb, o procesos de escorrentía superficial, descartando los
procesos de lixiviación a través del perfil del suelo, debido a que en aguas subterráneas
la ETU no se encontró por encima de los límites de detección.
En zonas de cultivo de papa, donde se practica el monocultivo y se aplican cantidades
elevadas de productos que contienen propineb en elevados porcentajes es necesario
realizar monitoreos para establecer la presencia de ETU y PTU en los diferentes
compartimentos ambientales, puesto que puede movilizarse por diferentes procesos.
134 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
135
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones Con el fin de seleccionar una metodología a validar para el análisis de ETU y PTU en
frutas y hortalizas a nivel de trazas, se evaluaron cuatro metodologías con diferentes
enfoques: extracción con solventes de baja polaridad, dispersión de matriz en fase solida,
método QuEChERS y extracción con solventes polares y posterior limpieza con partición
liquido-liquido. Para la selección se tuvo en cuenta la exactitud en la recuperación de los
analitos, la sensibilidad para la detección de bajas concentraciones y la confiabilidad para
su ejecución como método de rutina. La metodología de extracción con solventes polares
y posterior limpieza con partición liquido-liquido cumplió con todos los parámetros de
evaluación, por lo tanto fue seleccionada para la optimización.
En el proceso de optimización cuatro parámetros fueron evaluados para obtener los
mejores porcentajes de recuperación: el efecto del pH, la adición de sal y el volumen de
diclorometano requerido para eluir los analitos en la etapa de limpieza, y la composición
del extractante en la etapa de extracción. El pH no tiene efecto significativo en la
recuperación de ETU, pero afecta la recuperación de PTU, siendo mayores los
porcentajes de recuperación a pH 9. La adición de sal no tiene efecto y el volumen
mínimo necesario para eluir los analitos en la partición fue de 10 mL. Se observaron
diferencias significativas al disminuir o eliminar el metanol en el extractante, obteniendo
los mayores porcentajes de recuperación con la relación MeOH:H2O 3:1.
La metodología optimizada fue validada y se determinó que es específica, selectiva,
precisa y exacta, con porcentajes de recuperación de 77,82% para ETU y 83,57% para
PTU, y coeficientes de variación de 7,38% y 10,25% respectivamente. Se determinó que
la técnica presenta respuesta lineal en el rango de 0.01 – 0.25 µg/mL para ETU y 0.02 –
0.50 µg/mL para PTU, siendo la concentración más baja la equivalente al límite de
136 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
cuantificación de la metodología (0.01 mg/kg ETU y 0.02 mg/kg PTU). La metodología es
robusta para las variables evaluadas y no se observó efecto matriz en la respuesta para
ningún analito en todo el rango de concentración evaluado. Los límites de detección
establecidos son 0.003 mg/kg ETU y 0.006 mg/kg PTU, con lo cual se concluye que la
metodología es adecuada para el objetivo propuesto.
Así mismo, con base en las propiedades fisicoquímicas de ETU y PTU se seleccionó
agua como solvente para realizar la extracción de dichos analitos en muestras de suelo,
realizando una posterior filtración e inyección en HPLC. Cuatro diferentes modos de
agitación fueron puestos a prueba, siendo la agitación con vortex durante 2 minutos la
que proporcionó los mejores resultados.
La metodología fue validada y resultó ser específica y selectiva para los analitos de
interés. Los limites de detección determinados fueron 0.01 mg/kg para ETU y 0.02 mg/kg
para PTU, los cuales son apropiados para la utilización como metodología en estudios de
monitoreo ambiental. La concentración más baja a partir de la cual se obtienen
resultados de cuantificación precisos y exactos es de 0.02 mg/kg para ETU y 0.04 mg/kg
para PTU, y el rango lineal fue evaluado hasta 0.20 mg/kg de ETU y 0.40 mg/kg de PTU.
La exactitud, medida como porcentaje de recuperación corresponde a 78.43% para ETU
y 75.58 % para PTU con una variación del 8.22% y 7.63 % respectivamente. La
metodología fue puesta a prueba para verificar su robustez, siendo evaluados
parámetros como el tiempo de agitación en la extracción, el tiempo transcurrido entre la
extracción y la inyección y el transcurrido entre la fortificación y la inyección, encontrando
que la metodología es robusta a todos los factores avaluados, presentando un efecto
neto no significativo para cada uno de ellos.
4.2 Recomendaciones
Utilizando la metodología validada se efectuó la determinación de residuos de ETU y
PTU en muestras de papa y tomate de consumo interno, encontrando la presencia de
Conclusiones 137
PTU a nivel de trazas en una muestra de papa correspondiente a la comercialización
primaria, además de la presencia de ETU a nivel de trazas en una muestra de tomate. Se
realizó la confirmación de la presencia de señales con adición estándar. Se sugiere
plantear un programa de monitoreo más extenso para obtener resultados concluyentes
en cuanto a la exposición de los consumidores colombianos a estos compuestos de
toxicidad apreciable. Así mismo, se realizó la determinación de la concentración de ETU
y PTU en muestras de suelo de uso agrícola empleado para el cultivo de papa,
determinando que para los cuatro suelos evaluados ETU y PTU se encontraron por
debajo del límite de detección de la metodología. Sin embargo, es recomendable realizar
un programa de monitoreo que involucre muestreos a lo largo del perfil del suelo y
muestras de los cuerpos de agua aledaños al cultivo, para evaluar la movilidad de estos
analitos potencialmente peligrosos.
138 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
139
Anexo 1: Cálculos estadísticos
1.1. Regresión por mínimos cuadrados ordinaria
Promedios
Sumas de cuadrados
Modelo de regresión
Estimadores de a y b
Varianza residual 2
Desviación estándar residual 2
140 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Varianza de la pendiente y del intercepto
1
Desviación estándar de la pendiente
Desviación estándar del intercepto
Varianza de un estimado Y(x) 1
Límites de confianza para un estimado Y(x) ,
Varianza para un estimado X 1 1
Límites de confianza para un estimado X ,
Notación:
Las sumatorias tienen en cuenta todos los términos, i= 1, 2 ,…,n
n= número de puntos de calibración
xi= Concentración conocida(u otra variable independiente)
yi= Señal medida a xi
Sxx= Suma de los residuales cuadrados de x
Anexos 141
141
Syy= Suma de los residuales cuadrados de y
Sxy= Suma de los residuales del producto curzado de x*y
t(f,p)= factor t de student (dos colas) para n‐2 grados de libertad y probabilidad p
m= numero de replicas
y*= valor de la señal y/o promedio de señales yk para k=1…n, donde:
Y=valor esperado para un xi
X=concentración estimada para un y*
1.2. Pruebas de hipótesis
1.2.1. Test de student para la pendiente
H0= La pendiente es estadísticamente igual a cero
β=0
H1= La pendiente es estadísticamente diferente de cero
β≠0
Estimación t calculado:
Decisión: Si el valor de t(gl;p) <tc, entonces la hipótesis nula se rechaza y la pendiente es significativamente diferente de cero.
142 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
1.2.2. Test de student para el intercepto
H0= El intercepto es significativamente igual a cero
α=0
H1= El intercepto es significativamente diferente de cero
α≠0
Estimación t calculado:
Decisión: Si el valor de tc, <t(gl;p) entonces la hipótesis nula se acepta, el intercepto es estadísticamente igual a cero.
1.2.3. Coeficiente de correlación
Estimación t calculado | |√
√
H0: No existe correlación significativa entre x y y (concentración y respuesta)
H1: Existe correlación entre x y y (concentración y respuesta)
1.3. Análisis de varianza ANOVA
Suma de cuadrados en x ∑
Anexos 143
143
Suma de cuadrados en y ∑
Sumas de cuadrados de la regresión
Suma de cuadrados entre concentraciones ∑ ∑ ∑
Suma de cuadrados del error puro ∑ ∑
Suma de cuadrados para linealidad
Notación
n= Numero de puntos de calibración
m= Numero de repeticiones por nivel
k=
xi= Concentración conocida(u otra variable independiente)
yi= Señal medida a xi
1.4.1. Determinación de coeficientes f ANOVA
FV GL SC CM Fc Ft
Regresión 1 SCR (1;n‐k;α)
Linealidad k‐2 SCL (k‐2;n‐k;α)
144 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Error puro n‐k SCEp
Hipótesis para regresión:
H0= No hay regresión significativa en la curva de calibración
H1= Hay regresión significativa en la curva de calibración
Si Ft <Fc se rechaza Ho, es decir, existe regresión
Hipótesis para desvío de linealidad
H0= No hay desvío de la linealidad
H1= Hay desvío de la linealidad
Si Fc< Ft se acepta H0,es decir, la curva no presenta desvío de la linealidad.
1.5. Determinación del coeficiente de correlación lineal
1.6. Determinación de Homogeneidad de varianza Cochcran.
Anexos 145
145
Esta prueba mide la variabilidad de la exactitud en el rango de concentración escogido para la validación.
Tiene como hipótesis Nula (Ho) = El nivel de concentración no afecta la variabilidad en los resultados de los porcentajes de recuperación.
Si Gcalc<Gtab, La exactitud del sistema no se ve afectada por el nivel de calibración.
La ecuación para calcular del factor G es:
1 2 3 4 5
Donde
S2mayor= es la varianza mayor
S2(1‐5)=son las varianzas para cada concentración
146 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
147
Anexo 2: Datos Validación
Tabla 43. Linealidad ETU Solvente. Frutas y hortalizas.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 3,6 10,0 100 13 36 3,259 0,341260 0,116458 -76 5776 10,4721
5776 3,567 11 114 N1 2 3,6 10,0 100 13 36 3,259 0,341260 0,116458 -76 5776 10,4721
N1 3 3,5 10,0 100 12 35 3,259 0,241260 0,058206 -76 5776 7,4035
N2 1 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816
4356 7,600 23 520 N2 2 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816
N2 3 7,6 20,0 400 58 152 7,380 0,220042 0,048418 -66 4356 2,9816
N3 1 18,9 50,0 2500 357 945 19,744 -0,843614 0,711684 -36 1296 -4,2728
1296 18,933 57 322
6 N3 2 18,9 50,0 2500 357 945 19,744 -0,843614 0,711684 -36 1296 -4,2728
N3 3 19 50,0 2500 361 950 19,744 -0,743614 0,552961 -36 1296 -3,7664
N4 1 40,5 100,0 10000 1640 4050 40,350 0,150294 0,022588 14 196 0,3725
196 40,600 122 148
35 N4 2 40,5 100,0 10000 1640 4050 40,350 0,150294 0,022588 14 196 0,3725
N4 3 40,8 100,0 10000 1665 4080 40,350 0,450294 0,202765 14 196 1,1160
N5 1 100,8 250,0 62500 10161 25200 102,168 -1,367982 1,871375 164 26896 -1,3390
26896 102,200 307 940
04 N5 2 102,9 250,0 62500 10588 25725 102,168 0,732018 0,535850 164 26896 0,7165
N5 3 102,9 250,0 62500 10588 25725 102,168 0,732018 0,535850 164 26896 0,7165
148 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Sum
a 5,19E+02 1290,00 226500 3,76E+04 9,22E+04 5,19E+02 -9,24E-14 5,60E+00 0,00E+00 1,16E+05 2,69E+01 3,85E+04 1,73E+02
5,19E+02
1,13E+0
5 Promed
io 3,46E+01 86,00 15100 2,50E+03 6,15E+03 3,46E+01 -6,16E-15 3,74E-01 0,00E+00 7,70E+03 1,80E+00 7,70E+03 3,46
E+01 1,04E+02
2,25E+0
4
Tabla 44. Linealidad PTU Solvente. Frutas y hortalizas.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 6,2 20 400 38 124 4,481 1,719 2,954 -152 23104 38,3492
4356 6,167 19 342 N1 2 6,1 20 400 37 122 4,481 1,619 2,620 -152 23104 36,1178
N1 3 6,2 20 400 38 124 4,481 1,719 2,954 -152 23104 38,3492
N2 1 13,5 40 1600 182 540 12,701 0,799 0,638 -132 17424 6,2875
2116 13,667 41 168
1 N2 2 13,7 40 1600 188 548 12,701 0,999 0,997 -132 17424 7,8621
N2 3 13,8 40 1600 190 552 12,701 1,099 1,207 -132 17424 8,6494
N3 1 35,1 100 10000 1232 3510 37,361 -2,261 5,114 -72 5184 -6,0527
196 35,500 107 113
42 N3 2 35,4 100 10000 1253 3540 37,361 -1,961 3,847 -72 5184 -5,2497
N3 3 36 100 10000 1296 3600 37,361 -1,361 1,853 -72 5184 -3,6438
N4 1 76,5 200 40000 5852 15300 78,461 -1,961 3,847 28 784 -2,4997
12996 76,767 230 530
38 N4 2 76,9 200 40000 5914 15380 78,461 -1,561 2,438 28 784 -1,9899
N4 3 76,9 200 40000 5914 15380 78,461 -1,561 2,438 28 784 -1,9899
N5 1 198 500 250000 39204 99000 201,761 -3,761 14,146 328 107584 -1,8642
171396 202,667 608 369
664 N5 2 200 500 250000 40000 100000 201,761 -1,761 3,102 328 107584 -0,8729
N5 3 210 500 250000 44100 105000 201,761 8,239 67,878 328 107584 4,0835
Suma 1,00E+03 2580 906000 1,45E+05 362720 1,00E+03 0,000 116,032 0 4,62E+05 1,16E+02 191060 3,35
E+02 1,00E+03
4,36E+0
5 Promed
io 6,70E+01 172 60400 9,70E+03 24181 6,70E+01 0,000 7,735 0 3,08E+04 7,70E+00 38212 6,70
E+01 2,01E+02
8,72E+0
4
Anexos 149
149
Tabla 45. Linealidad ETU Matriz. Frutas y hortalizas.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31
5776 3,60 11 117 N1 2 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31
N1 3 3,6 10,00 100 13 36 3,122 0,48 0,23 -76 5776 15,31
N2 1 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45
4356 7,80 23 548 N2 2 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45
N2 3 7,8 20,00 400 61 156 7,327 0,47 0,22 -66 4356 6,45
N3 1 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73
1296 18,80 56 3181 N3 2 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73
N3 3 18,8 50,00 2500 353 940 19,942 -1,14 1,30 -36 1296 -5,73
N4 1 41 100,00 10000 1681 4100 40,967 0,03 0,00 14 196 0,08
196 41,00 123 15129 N4 2 41,1 100,00 10000 1689 4110 40,967 0,13 0,02 14 196 0,32
N4 3 40,9 100,00 10000 1673 4090 40,967 -0,07 0,00 14 196 -0,16
N5 1 105,9 250,00 62500 11215 26475 104,042 1,86 3,45 164 26896 1,79
26896 104,20 313 977
19 N5 2 100,9 250,00 62500 10181 25225 104,042 -3,14 9,87 164 26896 -3,02
N5 3 105,8 250,00 62500 11194 26450 104,042 1,76 3,09 164 26896 1,69
Suma 5,26E+02 1290,00 226500 3,89E+04 93846 5,26E+02 0,00 21,71 0 115560 48,80 38520 175,4
0 5,26E+02
1,17E+0
5 Promed
io 3,51E+01 86,00 15100 2,59E+03 6256 3,51E+01 5,95E-15 1,45E+00 0 7704 3,25 7704 35,08 1,05
E+02
2,33E+0
4
150 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 46. Linealidad PTU Matriz. Frutas y hortalizas.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 6,1 20,00 400 37 122 3,524 2,576 6,63 -152 23104 73,08
4356 6,17 19 342 N1 2 6 20,00 400 36 120 3,524 2,476 6,13 -152 23104 70,24
N1 3 6,4 20,00 400 41 128 3,524 2,876 8,27 -152 23104 81,59
N2 1 13,7 40,00 1600 188 548 12,218 1,482 2,20 -132 17424 12,13
2116 13,83 42 1722 N2 2 13,9 40,00 1600 193 556 12,218 1,682 2,83 -132 17424 13,77
N2 3 13,9 40,00 1600 193 556 12,218 1,682 2,83 -132 17424 13,77
N3 1 36,9 100,00 10000 1362 3690 38,298 -1,398 1,95 -72 5184 -3,65
196 36,87 111 12232 N3 2 37,1 100,00 10000 1376 3710 38,298 -1,198 1,43 -72 5184 -3,13
N3 3 36,6 100,00 10000 1340 3660 38,298 -1,698 2,88 -72 5184 -4,43
N4 1 78,1 200,00 40000 6100 15620 81,764 -3,664 13,42 28 784 -4,48
12996 76,97 231 53315 N4 2 76,9 200,00 40000 5914 15380 81,764 -4,864 23,66 28 784 -5,95
N4 3 75,9 200,00 40000 5761 15180 81,764 -5,864 34,39 28 784 -7,17
N5 1 206,1 500,00 250000 42477 103050 212,163 -6,063 36,76 328 107584 -2,86
171396 214,13 642 412
678 N5 2 216,4 500,00 250000 46829 108200 212,163 4,237 17,95 328 107584 2,00
N5 3 219,9 500,00 250000 48356 109950 212,163 7,737 59,86 328 107584 3,65
Suma 1,04E+03 2580,00 906000 1,60E+05 380470 1,04E+03 0,000 221,20 0 4,62E+05 238,56 191060 347,9
7 1,04E+03
4,80E+0
5 Promed
io 6,96E+01 172,00 60400 1,07E+04 25365 6,96E+01 0,000 14,75 0 3,08E+04 15,90 38212 69,59 2,09
E+02
9,61E+0
4
Anexos 151
151
Tabla 47. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en solvente. Frutas y hortalizas.
Compuesto Sy/X2 Sy/x Sa Sb tCalculado
a tteorico
a Ho tCalculado b
tteorico b Ho tCalculado
r tteorico
r Ho
PTU 8,93 2,99 1,08 0,004 3,46 2,16 Rechazada 93,53 2,16 Rechazada 93,53 2,16 Rechazada
ETU 0,43 0,66 0,24 0,002 3,63 2,16 Rechazada 213,38 2,16 Rechazada 213,38 2,16 Rechazada
Tabla 48. Prueba t de Student para intercepto, pendiente y coeficiente de correlación en matriz. Frutas y hortalizas.
Compuesto Sy/X2 Sy/x Sa Sb tCalculado
a tteorico
a Ho tCalculado b
tteorico b Ho tCalculado
r tteorico
r Ho
PTU 17,02 4,12 1,49 0,006 3,47 2,16 Rechazada 71,64 2,16 Rechazada 71,64 2,16 Rechazada
ETU 1,67 1,29 0,47 0,004 2,32 2,16 Rechazada 110,62 2,16 Rechazada 110,62 2,16 Rechazada
152 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 49. Análisis de varianza ETU solvente. Frutas y hortalizas.
Fuente de Variación Grados
de Libertad
Suma de Cuadrados
Media de Cuadrados Fcalculado Fteorico Resultado
Regresión 1 19627,22 19627,22 65134,58 4,96 Rechazada
Error 13 5,60
Desvío de linealidad 3 2,59 0,86 2,87 3,71 Aceptada
Error puro 10 3,01 Total 14 47624,8
Tabla 50. Análisis de varianza PTU solvente. Frutas y hortalizas.
Fuente de Variación Grados
de Libertad
Suma de Cuadrados
Media de Cuadrados Fcalculado Fteorico Resultado
Regresión 1 78081,85 78081,85 9379,58 4,96 Rechazada
Error 13 116,03
Desvío de linealidad 3 32,78 10,93 1,31 3,71 Aceptada
Error puro 10 83,25 Total 14 189980,4
Anexos 153
153
Tabla 51. Linealidad ETU Solvente. Suelo.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 5,3 10,00 100 28 53 6,011 -0,71 0,51 -66 4356 -11,83
4356,00 5,40 16,20 262,44 N1 2 5,6 10,00 100 31 56 6,011 -0,41 0,17 -66 4356 -6,84
N1 3 5,3 10,00 100 28 53 6,011 -0,71 0,51 -66 4356 -11,83
N2 1 12,2 20,00 400 149 244 12,085 0,12 0,01 -56 3136 0,95
3136,00 12,03 36,10 1303,21 N2 2 11,9 20,00 400 142 238 12,085 -0,18 0,03 -56 3136 -1,53
N2 3 12 20,00 400 144 240 12,085 -0,08 0,01 -56 3136 -0,70
N3 1 29,8 50,00 2500 888 1490 30,305 -0,51 0,26 -26 676 -1,67
676,00 29,83 89,50 8010,25 N3 2 30,1 50,00 2500 906 1505 30,305 -0,21 0,04 -26 676 -0,68
N3 3 29,6 50,00 2500 876 1480 30,305 -0,71 0,50 -26 676 -2,33
N4 1 60,2 100,00 10000 3624 6020 60,672 -0,47 0,22 24 576 -0,78
576,00 62,63 187,90
35306,4
1 N4 2 63,8 100,00 10000 4070 6380 60,672 3,13 9,78 24 576 5,16
N4 3 63,9 100,00 10000 4083 6390 60,672 3,23 10,42 24 576 5,32
N5 1 119,8 200,00 40000 14352 23960 121,407 -1,61 2,58 124 15376 -1,32
15376,00 120,58
361,74
130855,83
N5 2 120,9 200,00 40000 14617 24180 121,407 -0,51 0,26 124 15376 -0,42
N5 3 121,04 200,00 40000 14651 24208 121,407 -0,37 0,13 124 15376 -0,30
Suma 6,91E+02 1140,00 159000 5,86E+04 96497 6,91E+02 0,00 25,43 0 7,24E+04 -28,79 24120,00 230,4
8 691,4
4
175738,14
Promed
io 4,61E+01 76,00 10600 3,91E+03 6433 4,61E+01 0,00 1,70 0 4,82E+03 -1,92 4824,00 46,10 138,2
9
35147,6
3
154 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Tabla 52. Linealidad PTU Solvente. Suelo.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 10,8 20,00 400 125 224 12 -0,76 0,58 -132 17424 -6,37
3136 11 33 1082 N1 2 11,2 20,00 400 117 216 12 -1,16 1,35 -132 17424 -9,71
N1 3 10,9 20,00 400 119 218 12 -1,06 1,13 -132 17424 -8,88
N2 1 22,4 40,00 1600 502 896 24 -1,18 1,39 -112 12544 -5,00
1296 22 67 4517 N2 2 21,6 40,00 1600 467 864 24 -1,98 3,92 -112 12544 -8,39
N2 3 23,21 40,00 1600 539 928 24 -0,37 0,14 -112 12544 -1,56
N3 1 58 100,00 10000 3364 5800 58 -0,43 0,18 -52 2704 -0,74
576 58 173 30068 N3 2 57,8 100,00 10000 3341 5780 58 -0,63 0,40 -52 2704 -1,08
N3 3 57,6 100,00 10000 3318 5760 58 -0,83 0,69 -52 2704 -1,42
N4 1 122,1 200,00 40000 14908 24420 117 5,59 31,20 48 2304 4,79
15376 121 364 132787 N4 2 120 200,00 40000 14400 24000 117 3,49 12,15 48 2304 2,99
N4 3 122,3 200,00 40000 14957 24460 117 5,79 33,47 48 2304 4,97
N5 1 230,7 400,00 160000 53222 92280 233 -1,98 3,94 248 61504 -0,85
104976 231 692 478311 N5 2 229,9 400,00 160000 52854 91960 233 -2,78 7,75 248 61504 -1,20
N5 3 231 400,00 160000 53361 92400 233 -1,68 2,84 248 61504 -0,72
Suma 1,33E+03 2280,00 636000 215594 370206 1330 0,00 101,11 0 289440 -33,18 125360 443 1330 646
765 Promed
io 8,86E+01 152,00 42400 14373 24680 89 0,00 6,74 0 19296 -2,21 25072 89 266 129
353
Anexos 155
155
Tabla 53. Linealidad ETU Matriz. Suelo.
Nivel Area (Y)
Conc (µg/L)(X
) X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-
Ycal)/Ycal (Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 4,5 10,00 100 20 45 49,245 -44,7 2002,1 -12 144 -90,86
144,00 5,43 16 266 N1 2 6,2 10,00 100 38 62 49,245 -43,0 1852,9 -12 144 -87,41
N1 3 5,6 10,00 100 31 56 49,245 -43,6 1904,9 -12 144 -88,63
N2 1 12,56 20,00 400 158 251 47,530 -35,0 1222,9 -2 4 -73,57
4,00 12,56 38 1420 N2 2 12,12 20,00 400 147 242 47,530 -35,4 1253,9 -2 4 -74,50
N2 3 13 20,00 400 169 260 47,530 -34,5 1192,3 -2 4 -72,65
N3 1 32,7 50,00 2500 1069 1635 42,386 -9,7 93,8 28 784 -22,85
784,00 32,30 97 9390 N3 2 32,1 50,00 2500 1030 1605 42,386 -10,3 105,8 28 784 -24,27
N3 3 32,1 50,00 2500 1030 1605 42,386 -10,3 105,8 28 784 -24,27
N4 1 64,3 10,00 100 4134 643 49,245 15,1 226,6 -12 144 30,57
144,00 62,80 188 35495 N4 2 62,8 10,00 100 3944 628 49,245 13,6 183,7 -12 144 27,53
N4 3 61,3 10,00 100 3758 613 49,245 12,1 145,3 -12 144 24,48
N5 1 123,4 20,00 400 15228 2468 47,530 75,9 5756,2 -2 4 159,62
4,00 122,84 369 135
814 N5 2 123,02 20,00 400 15134 2460 47,530 75,5 5698,7 -2 4 158,82
N5 3 122,11 20,00 400 14911 2442 47,530 74,6 5562,1 -2 4 156,91
Suma 7,08E+02 330,00 10500 6,08E+04 15016 7,08E+02 0,0 27307,2 0 3,24E+03 -1,08 1080,00 235,9
4 7,08E+02
1,82E+0
5 Promed
io 4,72E+01 22,00 700 4,05E+03 1001 4,72E+01 0,0 1820,5 0 2,16E+02 -0,07 216,00 47,19 1,42
E+02
3,65E+0
4
Tabla 54. Linealidad PTU Matriz. Suelo.
156 Validación de metodologías analíticas para la determinación de productos de
degradación de fungicidas ditiocarbamatos
Nive
l Area (Y) Conc
(µg/L)(X)
X2 Y2 X*Y Ycal Y- Ycal (Y- Ycal)2 X-XProm (X-XProm)2 100*(Y-Ycal)/Ycal
(Xi-XP)2 Ypro
m Yj Yj2
N1 1 11,20 20,00 400 125 224 94,035 -82,8 6861,6 -24 576 -88,09
4,00 10,97 33 1082 N1 2 10,80 20,00 400 117 216 94,035 -83,2 6928,0 -24 576 -88,51
N1 3 10,90 20,00 400 119 218 94,035 -83,1 6911,4 -24 576 -88,41
N2 1 22,32 40,00 1600 498 893 90,201 -67,9 4607,9 -4 16 -75,26
324,00 22,64 68 4613 N2 2 22,70 40,00 1600 515 908 90,201 -67,5 4556,4 -4 16 -74,83
N2 3 22,90 40,00 1600 524 916 90,201 -67,3 4529,5 -4 16 -74,61
N3 1 59,90 100,00 10000 3588 5990 78,701 -18,8 353,5 56 3136 -23,89
6084,00 59,03 177 31364 N3 2 59,30 100,00 10000 3516 5930 78,701 -19,4 376,4 56 3136 -24,65
N3 3 57,90 100,00 10000 3352 5790 78,701 -20,8 432,7 56 3136 -26,43
N4 1 118,40 20,00 400 14019 2368 94,035 24,4 593,7 -24 576 25,91
4,00 118,10 354 125
528 N4 2 118,10 20,00 400 13948 2362 94,035 24,1 579,1 -24 576 25,59
N4 3 117,80 20,00 400 13877 2356 94,035 23,8 564,8 -24 576 25,27
N5 1 237,50 40,00 1600 56406 9500 90,201 147,3 21696,9 -4 16 163,30
324,00 236,43 709 503
106 N5 2 233,90 40,00 1600 54709 9356 90,201 143,7 20649,3 -4 16 159,31
N5 3 237,90 40,00 1600 56596 9516 90,201 147,7 21814,9 -4 16 163,74
Suma 1341,52 660,00 42000 2,22E+05 56543 1,34E+03 0,0 101456,0 0 1,30E+04 -1,56 6740,00 447,1
7 1,34E+03
6,66E+0
5 Promed
io 89,43 44,00 2800 1,48E+04 3770 8,94E+01 0,0 6763,7 0 8,64E+02 -0,10 1348,00 89,43 2,68
E+02
1,33E+0
5
158
Anexo 3: Resultados análisis de muestras
Tabla 55. Resultados muestras de papa con señales en tiempo de retención PTU
N3 ETU PTU Area ug/mL PTU
30,4 54,3 0,1 Factor 1,5
Area PTU ug/mL ug/kg NJVR004 (1) 2,06 0,0038 0,006 NJVR004 (2) 2,03 0,0037 0,006
NJVR005 (1) 4,53 0,0083 0,013
NJVR005 (2) 4,84 0,0089 0,013
Tabla 56. Resultados confirmación de muestras de papa con señales, repetición de ensayo y adición estándar.
N3 Area ETU PTU ug/mL PTU 27 50,3 0,1
Factor 1,5 Area PTU ug/mL ug/kg
NJVR004 (3) 1,10000 0,002 0,003 NJVR004 (4) 1,05000 0,002 0,003
NJVR005 (3) 3,52000 0,006 0,010
NJVR005 (4) 5,67000 0,010 0,016 NJVR005 (4) AE 7,83000 0,014 0,022 NJVR005 (4) AE 10,83000 0,020 0,030
Anexos 159
159
Tabla 57. Resultados muestras de tomate con señales en tiempo de retención ETU
N3 Area ETU ug/mL
30 0,05 Factor 1,5
Area ETU ug/mL ug/kg NJVR006 (1) 2,93 0,005 0,007
NJVR006 (2) 2,90 0,005 0,007
NJVR007 (1) 0,00 0,000 0,000
NJVR007 (2) 1,90 0,003 0,005
NJVR010 (1) 2,74 0,005 0,007 NJVR010 (2) 0,00 0,000 0,000
Tabla 58. Resultados confirmación de muestras de tomate con señales en el tiempo de retención de ETU, repetición de ensayo y adición estándar.
N3 ETU Area ug/mL
27 0,05 Factor 1,5
Area ETU ug/mL ug/kg NJVR006 (3) 2,10 0,004 0,006
NJVR006 (4) 1,97 0,004 0,005
NJVR006 (3) AE 4,80 0,009 0,014 NJVR007 (3) 0,00 0,000 0,000 NJVR007 (4) 0,00 0,000 0,000
NJVR010 (1) 0,00 0,000 0,000 NJVR010 (2) 0,00 0,000 0,000
161
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