VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAMSEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)

“RHEUMAKUR®”

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Andreas Suseno Wimbo Hapsoro

NIM : 078114057

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2011

i

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAMSEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)

“RHEUMAKUR®”

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Andreas Suseno Wimbo Hapsoro

NIM : 078114057

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2011

ii

iii

iv

Karya ini kupersembahkan bagikedua orang tuaku,

adikku,teman-teman dan almamaterku

yang luar biasa

v

vi

vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang penuh kasih, karena

berkat dan kasih karunia-Nya maka skripsi berjudul “VALIDASI METODE

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA

PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK

OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) RHEUMAKUR®” ini dapat

diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu

penulis dalam menyelesaikannya, maka pada kesempatan ini penulis

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, S.Si, Apt, M.Sc selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

banyak meluangkan waktunya dalam memberikan masukan, kritik, solusi,

semangat baik selama penelitian, penyusunan skripsi maupun saat

perkuliahan.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik dan Dosen

Penguji yang telah banyak memberikan masukan dan semangat baik selama

penyusunan skripsi maupun dalam perkuliahan.

4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran,

kritik dan semangat dalam penyusunan skripsi ini maupun dalam perkulihan.

viii

5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pengajar mata kuliah

Validasi Metode Analisis sehingga sangat membantu dalam penyusunan

skripsi, serta telah memberikan senyawa baku kurkumin kepada penulis

sehingga sangat berguna dalam penelitian

6. Dr.C.J. Soegihardjo, Apt. atas saran dan diskusi yang telah diberikan dalam

penyusunan skripsi.

7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga

sehingga berguna dalam proses penyusunan skripsi.

8. Theresia Weliana Kosasih dan Lilis Dumaria Pasaribu selaku teman

seperjuangan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

9. Eliz, Yunita, Venny, Katiti, Lala, Toro, Katarina, Benny, dan Dian selaku

teman yang melakukan penelitian dalam satu tema yang sama, terima kasih

atas dukungannya.

10. Seluruh staf laboratorium kimia: Bimo, Kunto, Parlan, dan Wagiran yang

telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

11. Cinthya, Yosafat, Edhi, Siska, Dika, Bella, Vivi, Robby, Tika, dan Puput

selaku teman yang sering bekerja kelompok bersama penulis, terima kasih

atas kerjasama, pengalaman, dan semangat yang luar biasa selama ini.

12. Kak Dewi, Grace, Zi, dan Bayu, atas laporan dan saran yang sangat berguna

bagi perkuliahan maupun penyusunan skripsi.

13. Teman-teman FST angkatan 2007 dan kelompok KKN 23 angkatan XL atas

pengalaman dan kebersamaannya.

ix

14. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak tertulis di sini, terima

kasih atas semua dukungan dan bantuannya.

Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih banyak

memiliki kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran

untuk perbaikan dan perkembangan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat

bermanfaat demi perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 11 Januari 2011

Penulis

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH.. vi

PRAKATA............................................................................................................ vii

DAFTAR ISI............................................................................................................x

DAFTAR TABEL................................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xv

DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii

INTISARI........................................................................................................... xviii

ABSTRACT........................................................................................................... xix

BAB I PENGANTAR..............................................................................................1

A. Latar Belakang ...................................................................................................1

1. Permumusan masalah...................................................................................3

2. Keaslian penelitian .......................................................................................3

3. Manfaat penelitian........................................................................................4

B. Tujuan Penelitian ...............................................................................................5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................6

A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar ..............................................................6

xi

B. Standarisasi Ekstrak ...........................................................................................7

C. Ekstrak Rimpang Kunyit....................................................................................9

D. Kurkumin ...........................................................................................................9

E. Kromatografi Lapis Tipis.................................................................................16

1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum............................................16

2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT ..........................................................16

3. Migrasi dan retensi solut ............................................................................17

4. Pemisahan kromatografi lapis tipis ............................................................17

5. Proses sorpsi-adsorpsi ................................................................................18

6. Profil puncak dan pelebaran puncak ..........................................................21

7. Puncak asimetri ..........................................................................................23

8. Resolusi kromatogram ...............................................................................24

9. Analisis kualitatif .......................................................................................25

10. Analisis kuantitatif .....................................................................................26

11. Aplikasi penotolan sampel .........................................................................27

F. Densitometri.....................................................................................................28

G. Validasi Metode Analisis .................................................................................32

1. Parameter validasi metode .........................................................................32

2. Kategori metode analisis ............................................................................38

H. Landasan Teori.................................................................................................39

I. Hipotesis...........................................................................................................40

BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................41

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .......................................................................41

xii

B. Variabel dan Definisi Operasional ...................................................................41

1. Klasifikasi variabel.....................................................................................41

2. Definisi operasional ...................................................................................42

C. Bahan................................................................................................................42

D. Alat...................................................................................................................43

E. Cara Penelitian .................................................................................................43

1. Pembuatan metanol pH 4 ...........................................................................43

2. Pengaktifan silika gel G 60 ........................................................................43

3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak ......................................................43

4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum...................................44

5. Penentuan kurva baku kurkumin................................................................44

6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV)

baku kurkumin ...........................................................................................45

7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan

presisi baku yang ditambahkan ke dalam sampel ......................................46

F. Analisis Hasil ...................................................................................................47

1. Selektivitas .................................................................................................47

2. Linearitas dan rentang ................................................................................48

3. Akurasi baku kurkumin..............................................................................48

4. Presisi baku kurkumin................................................................................49

5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel ...................49

6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel .....................49

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................51

xiii

A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Kurkumin .....................52

B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin..........................................55

C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin dalam

Sampel..............................................................................................................59

D. Pembuatan Kurva Baku....................................................................................63

E. Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri ...............................65

1. Selektivitas .................................................................................................65

2. Linearitas dan rentang ................................................................................67

3. Akurasi .......................................................................................................68

4. Presisi .........................................................................................................69

F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel ......................69

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................72

A. Kesimpulan ......................................................................................................72

B. Saran.................................................................................................................72

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................73

LAMPIRAN...........................................................................................................77

BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................103

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Daftar fase gerak ...............................................................................16

Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan....27

Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan .............35

Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit

yang berbeda .....................................................................................36

Tabel V. Kategori Analisis Kimia ...................................................................39

Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum

kurkumin...........................................................................................54

Tabel VII. Data nilai Rf baku dan sampel ..........................................................60

Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin ...............................................................63

Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2.....................67

Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku.......68

Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku ................................................69

Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel...............70

Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin

dalam sampel yang ditambah baku...................................................70

Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan

kurkumin dalam sampel yang ditambah baku ..................................71

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT) .................................................7

Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan Bis-demetoksi

kurkumin...........................................................................................10

Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin .......................................10

Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid ...................12

Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH .................................13

Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali......................................14

Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl )-2,4-dioxo-5-

hexenal ..............................................................................................15

Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin........................................................15

Gambar 9. Cara penentuan harga Rf ...................................................................18

Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel ...........................19

Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram ....................22

Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a).

Pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh

difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa .............................22

Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a).

Isoterm linier (b). Puncak tailing dan (c). Puncak fronting ..............23

Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil

kromatografi masing-masing bercak ................................................24

Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan ...............................25

xvi

Gambar 16. Pemantulan sinar...............................................................................29

Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin................53

Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin ................54

Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm............................................56

Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin ............................56

Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam.....................57

Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak ..............................................57

Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel.......................58

Gambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku

kurkumin (B).....................................................................................60

Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A

(kurkumin) dengan senyawa lainnya ................................................61

Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50

( replikasi I).......................................................................................65

Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan Rf baku

dengan puncak kurkumin pada sampel .............................................66

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin...................................................78

Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin.....................................................79

Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan

maksimum ......................................................................................81

Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan....................................84

Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin ..............................................86

Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku ................88

Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode...............................................90

Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery ....................93

Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV .....................................................95

Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel..96

Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin dengan

puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya ............................100

Lampiran 12. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam

matriks sampel..............................................................................101

xviii

INTISARI

Kurkumin merupakan senyawa polifenol yang memiliki aktivitas sebagaiantiinflamasi namun tidak stabil terhadap pH di atas 7 dan paparan cahaya.Kandungan kurkumin dalam ekstrak kunyit dimanfaatkan dalam produksi sediaankapsul lunak Obat Herbal Terstandar (OHT). Oleh karena itu, stabilitas kadarkurkumin pada saat distribusi dan penyimpanan sediaan OHT penting untukdiketahui.

Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHTdilakukan secara KLT-Densitometri. Sistem KLT-Densitometri yang digunakanadalah fase normal dengan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana(85 : 10 :5) v/v dan fase diam silika gel G 60 yang diukur pada 425 nm.

Parameter validasi metode yang ditentukan adalah selektivitas, linearitas,akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian validasi baku menunjukkan metodeKLT-Densitometri memiliki selektivitas yang baik dengan nilai resolusi padapemisahan sampel adalah 2,2399. Metode ini memiliki linearitas yang baik padakonsentrasi kurkumin 100 – 500 ppm (r = 0,9996) dan rentang 260 - 500 ppm.Perolehan kembali dan KV untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turutadalah 104,07%, 2,72%; 99,28%, 0,34%; dan 100,11%, 0,79%. Hasil validasibaku dalam matriks sampel memiliki perolehan kembali dan KV berturut-turutyaitu 102,07% dan 3,64%.

Kata kunci : kurkumin, kapsul lunak OHT, KLT-densitometri

xix

ABSTRACT

Curcumin is a polyphenol compound which has activity as an anti-inflammatory but not stable to pH above neutral and light exposure. The contentof curcumin in turmeric extract used in the production of Scientific Based HerbalMedicine (SBHM) soft capsule. Therefore, the stability of curcumin contentduring distribution and storage of SBHM dosage form important to know.

Curcumin content determination method performed by TLC-Densitometry. TLC-Densitometry system used is a normal phase with mobilephase chloroform: glacial acetic acid: hexane (85: 10: 5) v/v and stationary phasesilica gel G 60 that was measured at 425 nm.

Specified validation parameters are selectivity, linearity, accuracy,precision, and range. The results show the validation of raw-Densitometry TLCmethod has good selectivity with the resolution of the separation of the sample is2.2399. This method has good linearity of concentrations of curcumin from 100 to500 ppm (r = 0.9996) and range about 260 – 500 ppm. The recoveries and CV forlow, medium and high concentration respectively is 104.07%, 2.72%, 99.28%,0.34%, and 100.11%, 0.79%. The validation raw material in the sample matrixhad the recovery and CV, respectively, are 102.07% and 3.63%.

Key words: curcumin, SBHM soft capsule, TLC-densitometry

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kurkumin merupakan senyawa polifenol berwarna kuning oranye yang

berkhasiat sebagai analgesik-antiinflamasi. Kurkumin yang terkandung dalam

ekstrak simplisia rimpang kunyit (Curcumae domesticae Rhizoma) ditemukan

bersama kedua turunannya yaitu demetoksi kurkumin dan bis-demetoksi

kurkumin. Beberapa perusahaan telah mempergunakan kunyit sebagai bahan dasar

pembuatan Obat Herbal Terstandar (OHT) (Usia, 2010).

Dalam dua dasawarsa terakhir penggunaan obat tradisional mengalami

perkembangan yang sangat pesat (Usia, 2010). Minat masyarakat terhadap

sediaan obat tradisional meningkat karena sediaan obat tradisonal diyakini sebagai

obat alam yang memiliki akses hingga seluruh lapisan masyarakat, selain itu

harganya terjangkau bagi seluruh lapisan masyarakat. Oleh karena itu, Badan

Pengawas Obat dan Makanan melakukan peningkatan mutu obat tradisional

melalui standarisasi bahan baku dan uji praklinik menjadi produk OHT

(Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994).

Salah satu produk OHT yang mengandung kurkumin sebagai senyawa

aktif dominan adalah Rheumakur®. Rheumakur® mengandung kurkuminoid (10

mg) dan minyak atsiri dari ekstrak kunyit dan temulawak (100 mg). Rheumakur®

merupakan salah satu obat tradisional dalam sediaan kapsul lunak.

2

Senyawa aktif yang diteliti pada penelitian ini adalah kurkumin.

Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah terhadap pH dan paparan cahaya

(Stankovic, 2004). Hal ini mempengaruhi mutu sediaan karena kurkumin menjadi

tidak stabil dalam proses distribusi dan penyimpanan sehingga dimungkinkan

kadar kurkumin menjadi berkurang. Kadar kurkumin yang berkurang akan

berpengaruh terhadap besarnya efek antiinflamasi yang ditimbulkan. Mutu

sediaan OHT akan terjamin apabila jumlah dan kadar senyawa aktif pada setiap

sediaan yang didistribusikan seragam dan sesuai dengan yang tertera pada

kemasan. Untuk itu diperlukan penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak

OHT merk Rheumakur® pada nomor batch yang sama namun berbeda apotek

untuk mengetahui stabilitas kurkumin dalam penyimpanan.

Penelitian ini merupakan serangkaian proses yaitu optimasi, validasi

metode dan penetapan kadar kurkumin. Metode yang dilakukan pada penelitian

analisis kurkumin ini adalah KLT-densitometri. Sistem KLT yang digunakan

merupakan fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak

kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) yang merupakan hasil

optimasi. Metode yang digunakan adalah KLT-densitometri karena memiliki

kelebihan yaitu dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara

simultan.

Validasi metode diperlukan untuk membuktikan bahwa parameter

metode analisis yang dilakukan memenuhi persyaratan sesuai dengan yang

diharapkan. Parameter-parameter yang harus dipenuhi meliputi akurasi, presisi,

selektivitas, linearitas dan rentang. Nilai yang baik untuk akurasi baku kurkumin

3

ditentukan melalui perhitungan perolehan kembali (98-102%), presisi baku

kurkumin ditentukan melalui perhitungan koefisien variasi (<2%), selektivitas

ditentukan melalui nilai resolusi (>1,5) dan kesamaan faktor retardasi sampel dan

baku, serta linearitas dengan nilai r >0,999. Sedangkan akurasi dan presisi baku

kurkumin dengan kadar 0,01% dalam matriks sampel yang baik secara berturut-

turut ditunjukkan melalui nilai perolehan kembali 90-107% dan KV < 5,3%

(Harmita, 2004; United States Pharmacopeial Convention, 1995; Yuwono dan

Indrayatno, 2005).

1. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang, maka diperoleh permasalahan sebagai

berikut: Apakah metode KLT-Densitometri yang digunakan pada penetapan kadar

kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter

validasi meliputi selektivitas, linearitas, rentang , akurasi, dan presisi?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian validasi penetapan kadar

kurkumin secara KLT-densitometri yang sudah pernah dilakukan, antara lain:

Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri (Martono,

1996) dalam serbuk rhizoma Curcuma longa L. dengan fase gerak kloroform :

etanol : air suling (25 : 0,96 : 0,04), Simultaneous determination of curcuminoids

in curcuma samples using high performance thin layer chromatography (Gupta,

Gupta, Kumar, 1999) dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5),

Quantitative Analysis of Curcumin, Demethoxycurcumin and

Bisdemethoxycurcumin in the Crude Curcuminoid Extract from Curcuma longa in

4

Thailand by TLC-Densitometry (Pothitirat, Gritsanapan, 2005) dan Occurrence of

curcuminoids in curcuma longa: a quality standardization by HPTLC

(Paramasivam, Aktar, Poi, Banerjee, Bandyopadhyay, 2008) dengan fase gerak

kloroform : metanol (48 : 2).

Penelitian yang dilakukan penulis memiliki perbedaan terhadap

penelitian yang tercantum di atas. Penulis lebih menekankan pada penjaminan

mutu obat tradisional khususnya stabilitas kadar kurkumin dalam sediaan kapsul

Obat Herbal Terstandar, bukan dalam simplisia maupun ekstrak. Parameter lain

yang membedakan dengan penelitian sebelumnya adalam sistem fase gerak yang

digunakan penulis yaitu kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan

metode baru karena digunakan sistem fase gerak yang belum dilakukan pada

penelitian sebelumnya. Selain itu, penelitian ini juga diharapkan dapat

memberikan pemahaman mengenai parameter validasi antara lain selektivitas,

linearitas, rentang, akurasi, dan presisi pada validasi metode penetapan kadar

kurkumin secara Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri

b. Manfaat praktis. Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu

memberikan suatu informasi bahwa metode KLT-Densitometri dapat digunakan

untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan OHT.

5

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini secara umum adalah untuk melakukan

penjaminan mutu pada sediaan obat tradisional. Penjaminan mutu dilakukan

melalui penetapan kadar kurkumin. Untuk itu, tujuan penelitian ini secara khusus

adalah untuk mengetahui bahwa validasi metode KLT-Densitometri pada

penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak OHT Rheumakur® memenuhi

parameter validasi yang baik meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan

presisi.

6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar

Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari obat dalam cangkang keras

atau lunak yang dapat larut. Kapsul cangkang lunak umumnya terbuat dari gelatin.

Cangkang gelatin lunak umumnya mengandung 6% hingga 13% air. Umumnya

kapsul cangkang lunak diisi dengan cairan. Khususnya bahan aktif dilarutkan atau

disuspensikan dalam bahan pembawa cair. Digunakan pula bahan pembawa

minyak seperti minyak nabati. Keunggulan kapsul cangkang lunak adalah

keseragaman kandungan dan disolusi obatnya lebih baik daripada kapsul berisi

serbuk kering. Namun, kontak antara cangkang lunak atau keras dengan isi zat

cair lebih besar dibandingkan dengan kapsul berisi serbuk kering (Direktorat

Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Teknik pembuatan kapsul lunak yang berisi suspensi telah banyak

dilakukan pada produk obat maupun nutraceutical. Formulasi suspensi

membutuhkan agen pensuspensi untuk mencegah pengendapan padatan dan

menjaga homogenitas dalam kapsul. Agen pensuspensi yang banyak digunakan

dengan basis minyak adalah wax, contohnya adalah beeswax, sedangkan polietilen

glikol untuk basis tidak berminyak. Pada industri kapsul lunak, ekstrak kering

biasa dikombinasikan dengan minyak kedelai sebagai pembawa, beeswax kuning

sebagai agen pensuspensi dan pengental, dan lesitin sebagai lubrikan. Jumlah

7

ekstrak dan bahan lain bergantung pada dosis ekstrak yang hendak

diadministrasikan (Naguib, 2000).

Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT)

Berdasarkan PERMENKES No.246/MENKES/PER/V/1990 obat

tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan

hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dan bahan-bahan tersebut,

yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan

pengalaman. Sedangkan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar adalah sediaan

kapsul lunak obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya

secara ilmiah dengan uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi

(Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990).

B. Standarisasi Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani dengan menggunakan

pelarut yang sesuai. Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari simplisia nabati

dapat digunakan sebagai bahan awal, bahan antara, atau bahan produk jadi.

Ekstrak sebagai bahan awal dianalogkan dengan komoditi bahan baku obat yang

dengan teknologi fitofarmasi diproses menjadi produk jadi. Sedangkan ekstrak

sebagai bahan antara merupakan bahan yang dapat diproses lagi menjadi fraksi-

8

fraksi, isolat senyawa tunggal ataupun tetap sebagai campuran dengan ekstrak lain

(Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

Adapun jika sebagai produk jadi berarti ekstrak yang berada dalam

sediaan obat jadi siap digunakan. Ekstrak tersebut bisa dalam bentuk ekstrak

kering, ekstrak kental dan ekstrak cair yang proses pembuatannya disesuaikan

dengan bahan aktif yang dikandung serta maksud penggunaannya, apakah akan

dibuat menjadi sediaan dalam bentuk kapsul, tablet, cairan obat dalam, pil, dan

lainnya (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

Terpenuhinya standar mutu produk atau bahan ekstrak tidak terlepas dari

pengendalian proses, artinya bahwa proses yang terstandar dapat menjamin

produk yang terstandar tanpa penerapan pengujian atau pemeriksaan. Untuk

menjaga kualitas bahan baku obat alam perlu dilakukan usaha budidaya dan

standarisasi terhadap bahan baku tersebut, baik yang berupa simplisia maupun

yang berbentuk ekstrak atau sediaan galenik (Badan Pengawas Obat dan Makanan

Republik Indonesia, 2005).

Persyaratan mutu ekstrak terdiri dari berbagai parameter standar umum

dan parameter standar spesifik. Pengertian standardisasi juga berarti proses

menjamin bahwa produk akhir mempunyai nilai parameter tertentu yang konstan

dan ditetapkan terlebih dahulu (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik

Indonesia, 2005).

Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan

ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, fenolik, dan lain-lain.

Struktur kimia yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas

9

senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan , udara, cahaya, logam berat dan

derajat keasaman (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia,

2005).

C. Ekstrak Rimpang Kunyit

Curcumae domesticae Rhizoma (rimpang kunyit) adalah rimpang

Curcuma domestica Val. Pemerian yang dimiliki yaitu berbau khas aromatik, rasa

agak pahit, agak pedas, dan lama kelamaan menimbulkan rasa tebal. Dosis lazim

rimpang Kunyit yang diperbolehkan adalah 8 mg/kg (Direktorat Jenderal

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977).

Ekstrak kental rimpang kunyit adalah ekstrak yang dibuat dari rimpang

tumbuhan Curcuma domestica Val., mengandung minyak atsiri ≥ 3,2% dan

kurkuminoid ≥ 33,9% (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2004). Kandungan

dari ekstrak rimpang Kunyit antara lain kurkuminoid, minyak atsiri, lemak 1 -3 %,

karbohidrat 3%, protein 30%, pati 8%, vitamin C 45-55%, dan garam-garam

mineral (Rukmana, 1994). Dalam kurkuminoid, kandungan kurkumin sebesar 77

%, demetoksi kurkumin 17 % dan bis-demetoksi kurkumin 3% (Anggarwal,

1995).

D. Kurkumin

Kurkumin adalah senyawa aktif polifenol dengan rumus kimia

C21H20O6. Kurkumin memiliki nilai log P = 2,56 dan merupakan zat warna

kuning utama (0,5 –6%) yang terdapat dalam rhizoma Curcuma longa L atau

Curcuma domestica Val.. Kurkumin bersama turunan demetoksinya yaitu

10

demetoksi kurkumin (log P = 2,69) dan bis-demetoksi kurkumin (log P = 2,81)

dikenal dengan nama kurkuminoid (Martono, 1996). Kurkumin memiliki panjang

gelombang serapan maksimum pada 430 nm dalam pelarut metanol dan 425 nm

dalam pelarut etanol (Anggarwal, 1995). Kurkumin larut dalam alkohol dan asam

asetat glasial, tetapi tidak dapat larut dalam air dan eter (Windholz, 1981).

Struktur kurkumin ditampilkan sebagai berikut :

OH

R1 R2

OH

O O

R1 = -OCH3 dan R2 = -OCH3 (Kurkumin)R1 = -H dan R2 = -OCH3 (Demetoksi kurkumin)R1 = -H dan R2 = -H (Bis-demetoksi kurkumin)

Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan bis-demetoksi kurkumin(Anggarwal, 1995)

Selain konstituen mayor (kurkumin, demetoksi kurkumin, dan bis

demetoksi kurkumin), konstituen minor juga dapat diisolasi yang memiliki bentuk

isomer geometrikal dari senyawa 1-3 (Gambar 2). Satu dari antaranya berbentuk

isomer geometrik cis-trans (Gambar 3) memiliki titik lebur, stabilitas dalam

larutan dan cahaya yang lebih rendah (Stankovic, 2004).

Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin (Stankovic, 2004)

11

Kurkumin memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi pada penyakit

osteoartritis. Osteoartritis adalah penyakit reumatik dengan prevalensi yang terus

meningkat sesuai dengan pertambahan usia. Secara klinis osteoartritis ditandai

oleh nyeri, deformitas, pembesaran sendi, hambatan gerak; disamping itu juga

terjadi inflamasi tingkat ringan sampai berat (Kalim, 1996; Rahardjo, 1994).

Ekstrak rimpang kunyit dengan kadar kurkuminoid 3,66 ± 0,65 % b/b

dan 25 mL minyak atsiri rimpang temulawak yang mengandung kamfora, kamfen,

kurkumen, bergamoten, germakren B, kurserenon, germakron dan xanthorrhizol

mampu menurunkan angka leukosit di dalam cairan sinovial penderita

osteoartritis. Sehingga produksi sitokin yang menyebabkan inflamasi menjadi

berkurang (Kertia, Sudarsono, Imono, Mufrod, Catur, Rahardjo, dkk, 2005).

Kurkuminoid mempunyai aktivitas anti inflamasi yang menarik meliputi

penghambatan lipid peroksidase (anti oksidan) serta penghambatan aktivitas

enzim siklooksigenase dan lipooksigenase (Timmerman, 1995; Kohli, Ali, Ansari,

dan Raheman, 2005). Kurkumin mempunyai aktivitas yang paling kuat (IC 50 =

0,05 цM) dibandingkan senyawa turunannya (Agnam dkk, 1995). Selain itu,

jumlah kurkumin yang aman dikonsumsi oleh manusia adalah 100 mg/hari

(Commandeur dan Vermeulen, 1996). Oleh sebab itu, ekstrak rimpang kunyit

dimanfaatkan sebagai bahan dalam pembuatan obat tradisional (Anggarwal,

1995).

Parameter yang harus diperhatikan dalam pemanfaatan kurkumin dalam

pembuatan sediaan obat tradisional adalah stabilits kurkumin. Stabilitas kurkumin

sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Dalam larutan berair, kurkumin

12

mengalami reaksi hidrolisis dan degradasi yang disebabkan oleh adanya gugus

metilen aktif pada senyawa tersebut. Reaksi tersebut sangat dipengaruhi oleh pH

lingkungannya (Tonnesen dan Karlsen, 1985a).

Kurkumin di dalam larutan mengalami tautomerisasi menjadi bentuk

keto-enol bergantung pada pelarut yang digunakan. Sembilan puluh lima persen

berada dalam bentuk enol (Stankovic, 2004).

Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid (Stankovic, 2004)

Kinetika reaksi degradasi hidrolisis dari senyawa cis-trans (Gambar 3)

terjadi pada rentang pH 1-11 (Tonnesen dan Karlsen, 1985a). Pada pH <1,

diferuloilmetan pada larutan berair berwarna merah yang diindikasikan terjadi

protonasi dengan membentuk (H4A+). Pada pH 1-7, sebagian besar

diferuloilmetan berada dalam bentuk netral (H3A). Pada pH ini kelarutannya

dalam air sangat rendah dan larutan berwarna kuning. Pada pH>7,5 warna

berubah menjadi merah. Nilai pKa untuk disosiasi 3 proton asam pada senyawa

kurkumin (bentuk H2A-, HA2-, dan A3-) secara berturut-turut adalah 7,8;8,5; dan

9,0 (Stankovic, 2004).

13

OHO

OCH3

OH

H3CO

HO

OHOH

OCH3

O

H3CO

HO H

OHO

OCH3

O

H3CO

HO

OHO

OCH3

O

H3CO

O

OO

OCH3

O

H3CO

O

H4A+

H3A

H2A-

HA2-

A3-

Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH (Stankovic, 2004)

Prinsipnya kurkumin relatif stabil pada pH asam, tetapi akan

terdekomposisi secara cepat pada pH di atas netral. Pada penelitian degradasi

kimia pada pH basa terhadap senyawa kurkumin (Tonnesen dan Karlsen, 1985),

produk dekomposisi pada pH 7-10 ditentukan secara HPLC. Produk degradasi

terbentuk setelah 5 menit dan kromatogram diperoleh setelah 28 jam pada pH 8,5

menunjukkan degradasi alkali sehingga terbentuk asam ferulat dan feruloilmetan.

Feruloilmetan secara cepat membentuk produk kondensasi warna (kuning sampai

kuning kecoklatan). Produk degradasi yang terbentuk dari hidrolisis feruloilmetan

14

adalah vanilin dan aseton serta jumlahnya meningkat seiring bertambahnya waktu

(Stankovic, 2004).

Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali (Stankovic, 2004)

Penelitian lain (Wang dkk, 1997) kurkumin diinkubasi pada 0,1 M buffer

fosfat; pH 7,2 pada 37 ºC; dan sejumlah 90% terdekomposisi tidak kurang dari 30

menit. Trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal diprediksi

sebagai produk degradasi terbanyak sedang vanilin, asam ferulat, dan

feruloilmetan diidentifikasi sebagai produk degradasi minor. Pada bentuk netral,

kurkumin tidak stabil pada larutan berair dengan pH >7 (Stankovic, 2004).

15

O

O O

O

HO

Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal(Stankovic,2004)

Instabilitas kurkumin juga dipengaruhi oleh adanya cahaya yang

menyebabkan terjadinya degradasi fotokimia senyawa tersebut (Van der Goot,

1997). Prinsipnya, kurkumin tidak stabil terhadap cahaya, terutama dalam bentuk

larutan. Setelah mengalami foto-iradiasi, akan terdeteksi produk siklisasi, sama

halnya dengan produk dekomposisi asam vanilat, vanilin, dan asam ferulat

(Sasaki, Sat, Abe, Sugimoto, dan Maitani, 1998).

Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin (Stankovic, 2004)

16

E. Kromatografi Lapis Tipis

1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam

di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur (Mulja

dan Suharman, 1995). KLT dapat dipakai untuk dua tujuan, yaitu sebagai metode

untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparatif. Tujuan kedua yaitu

dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga (Gritter, Bobit, dan

Schwarting, 1991).

2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT

Fase diam yang banyak terpilih adalah silika gel. Silika gel G adalah

silika gel yang dicampur perekat CaSO4 lebih kurang 13% (Jork, Funk, Fischer,

dan Wimmer, 1990). Fase gerak dalam mediun KLT merupakan medium angkut

dan terdiri atas satu atau beberapa bahan pelarut yang bergerak di dalam fase

diam, karena ada gaya kapiler (Stahl, 1985). Berikut ini merupakan daftar fase

gerak beserta indeks polaritasnya:

Tabel I. Daftar fase gerak

EluotropicValue (e°)(on silica)

PolarityIndex(p’)

Viscosity(cP, 25°C)

Density(g/ml)

RefractiveIndex(25°)

BoilingPoint(°C)

Heksana 0.00 0.06 0.30 0.659 1.372 69Kloroform 0.31 4.40 0.53 1.483 1.443 61

AsamAsetatGlasial

>0.73 6.20 1.10 1.049 1.370 118

Metanol 0.73 6.60 0.54 0.791 1.326 65(Stahl, 1985)

17

3. Migrasi dan retensi solut

Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan

distribusinya (D), dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relatif solut pada pada

kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam konteks kromatografi, nilai D

didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan

dalam fase gerak (Cm) (Gandjar dan Rohman, 2007).

(1)

Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan

semakin kecil nilai D maka migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi

menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut

cukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan

(Gandjar dan Rohman, 2007).

4. Pemisahan kromatografi lapis tipis

Pemisahan kromatografi planar ini pada umumnya dihentikan sebelum

semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua

kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung

fase geraknya. Faktor retardasi solut (Rf) didefinisikan sebagai:

(2)

(Gandjar dan Rohman, 2007)

18

Gambaran untuk menghitung Rf terdapat dalam gambar berikut ini:

Gambar 9. Cara penentuan harga Rf (Gandjar dan Rohman, 2007)

Nilai Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana dalam

persamaan berikut:

(3)

(Gandjar dan Rohman, 2007)

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai

perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang berarti

solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum

Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di

permukaan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

5. Proses sorpsi – adsorpsi

Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam,

sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak)

disebut dengan desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara

19

terus menerus selama pemisahan kromatografi karenanya sistem kromatografi

berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara

dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga

keadaan kesetimbangan ini (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja. Adsorpsi pada

permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen,

penarikan dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan

bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan

adsorben (Skoog, Holler, dan Nieman, 1998).

Silika gel memiliki permukaan yang terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus

silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini

mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai

sangat polar (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel (Skoog, dkk, 1998)

Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu

mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel.

Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 105ºC (Gandjar dan

Rohman, 2007).

20

Semakin polar solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben

silika gel ini. Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai

sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi

memiliki afinitas yang kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi

dipol atau interaksi-interaksi yang diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar,

terutama yang mampu membentuk ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada

adsorben karenanya butuh fase gerak yang cukup polar untuk mengelusinya.

Berikut adalah urutan polaritas solut-solut organik: alkana < alkena < aromatis <

eter < ester < keton dan aldehid < tiol < amin dan amida < alkohol < fenol <

asam-asam organik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adsorbsi solut oleh fase diam atau oleh adsorben sangat tergantung pada:

(a) struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan

adsorben; (b) ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben,

maka luas permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solut juga

semakin luas; (c) kelarutan solut dalam fase gerak. Solut yang semakin mudah

larut dalam fase gerak akan semakin mudah lepas dari fase diam (Gandjar dan

Rohman, 2007).

Kedudukan gugus fungsional tertentu dalam suatu senyawa juga

menentukan interaksinya. Sorpsi adsorpsi ini umumnya terjadi pada kromatografi

padat cair sebagaimana dalam kromatografi lapis tipis dan pada kromatografi gas-

padat (Gandjar dan Rohman, 2007).

21

6. Profil puncak dan pelebaran puncak

Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk

profil konsentrasi yang simetri atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam

arah aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak atau pita, secara

perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik

karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam. Prinsip yang mendasari

alasan-alasan bentuk puncak dan pelebaran puncak dapat diringkas sebagai

berikut:

a. Sorpsi dan desorpsi solut yang terus menerus antara fase diam dan fase gerak,

secara inheren akan menghasilkan profil konsentrasi Gaussian yang akan

melebar karena solut bermigrasi lebih lanjut.

b. Perjalanan solut melalui partikel fase diam sedikit berbeda, sehingga

menyebabkan profil konsentrasinya melebar secara simetris. Keadaan seperti

ini disebut dengan pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect).

c. Spesies solut menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada di dalam

fase gerak. Difusi terjadi dengan arah yang sama dan berlawanan dengan

aliran fase gerak (longitudinal or axial diffusion) karenanya akan

berkontribusi terjadinya pelebaran pita secara simetris.

d. Sorpsi dan desorpsi, atau transfer massa antara fase diam dan fase gerak,

bukanlah suatu proses yang instan dan terkadang proses tersebut terjadi secara

lambat. Karena fase gerak berjalan secara terus-menerus, maka distribusi

kesetimbangan solut yang sebenarnya tidak pernah terjadi . Profil konsentrasi

dalam fase diam tertinggal sedikit dibanding profil konsentrasi dalam fase

22

gerak yang akan mengakibatkan adanya pelebaran puncak lebih lanjut.

Desorpsi yang lambat dapat juga menghasilkan puncak yang asimetris atau

condong.

e. Adanya variasi rasio distribusi solut dengan total konsentrasinya juga berperan

terjadinya puncak yang asimetris atau condong (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram (Gandjar dan Rohman,2007)

Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a). Pengaruh lintasanganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa

(Gandjar dan Rohman, 2007)

23

7. Puncak asimetri

Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi

solut (D) konstan selama kisaran konsentrasi keseluruhan puncak, sebagaimana

ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linier yang merupakan plot konsentrasi solut

dalam fase diam (Cs) terhadap konsentrasi solut dalam fase gerak (Cm).

Meskipun demikian, kurva isoterm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris

yakni membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu

(fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut kearah yang lebih besar

(Gandjar dan Rohman, 2007).

.

Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a). Isoterm linier (b).Puncak tailing dan (c). Puncak fronting (Gandjar dan Rohman, 2007)

Adanya puncak asimetri dapat disebabkan oleh beberapa hal. Yang

pertama apabila ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Yang kedua adalah

interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar

terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.

Ketiga adalah adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih

dahulu sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting) (Gandjar dan

Rohman, 2007).

24

8. Resolusi kromatogram

Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak

yang saling berdekatan (Δz = z2 – z1) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W1 +

W2)/2 sebagaimana dalam ilustrasi dan persamaan berikut ini:

Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil kromatografi masing-masing bercak (Sherma dan Fried, 1996)

(4)

(Sherma dan Fried, 1996)

Dari persamaan ini dapat diketahui bahwa yang sangat berpengaruh

terhadap pemisahan suatu komponen adalah: jarak masing-masing bercak solut

terhadap titik awal pengembanagn (z2 dan z1) serta lebar puncak masing-masing

komponen yang dipisahkan ((W1 dan W2) (Sherma dan Fried, 1996).

Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan

pemisahan puncak yang baik (base line resolution).

25

Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan (Gandjar dan Rohman, 2007)

9. Analisis kualitatif

Ada 3 pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu:

a. Perbandingan antara data retensi solut yang tidak diketahui dengan data

retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.

Untuk kromatografi lapis tipis, faktor retardasi (Rf) baku dan senyawa yang

tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara bersama-sama

untuk menghilangkan adanya variasi kondisi bahan yang digunakan dan

laboratorium.

b. Dengan cara spiking. Spiking dilakukan dengan menambah sampel yang

mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku

pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: pertama,

dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di-spiking. Kedua, sampel

yang telah di-spiking dengan senyawa baku dilakukan proses kromatografi.

Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki

terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan

dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat

diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.

26

c. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa. Cara ini

memberikan informasi data spektra solut dengan waktu retensi tertentu.

Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan spektra yang

ada di base komputer atau diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan

untuk solut yang belum ada baku murninya (Gandjar dan Rohman, 2007).

10. Analisis kuantitatif

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil

dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut

beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif: Analit (solut)

harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain dalam

kromatogram. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus

tersedia. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan. Penyerap atau

adsorben yang digunakan murni, begitu pula pelarutnya (Skoog, dkk, 1998).

Pengukuran respon dapat dilakukan dengan mengukur tinggi puncak atau dengan

menghitung luas puncak (Gandjar dan Rohman, 2007).

Salah satu metode kuantitasi untuk analisis kuantitatif dengan

kromatografi dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal.

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak

diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot

kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai

baku eksternal karena larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara

terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang

mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah

27

disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama.

Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi

atau secara numerik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Larutan baku disiapkan dengan konsentrasi tertentu yang sudah

diketahui. Sejumlah tertentu volume larutan ini diinjeksikan dan dianalisis, lalu

respon detektor (luas puncak) diplotkan terhadap konsentrasi (Gandjar dan

Rohman, 2007).

11. Aplikasi penotolan sampel

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh

hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit

mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang

digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang

tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda.

Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah

disarankan untuk digunakan dan diringkas pada tabel II.

Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan

TujuanDiameter bercak

(mm)Konsentrasisampel (%)

Banyaknyasampel (μg)

Densitometri2 mm untuk

volume sampel 0,5μl

0,02-2

0,1-1 (untukKLT-KT

1-10(konvensional)

Identifikasi3 mm untuk

volume sampel 1μl0,1-1 1-20

Ujikemurnian

4 mm untukvolume sampel 2μl

5 100

(Gandjar dan Rohman, 2007)

28

F. Densitometri

Densitometri merupakan salah satu dari metode analisa KLT kuantitatif.

Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur

kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Syarat-syarat untuk

senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985).

Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat.

Pada metode densitometri diperlukan adsorben dan fase gerak yang murni. Untuk

memperoleh hasil yang baik lazimnya digunakan adsorben siap pakai yang telah

mengalami pencucian (Gritter dkk, 1991).

Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak

pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.

Lazimnya lempeng itu digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari

sumber sinar tersebut(Sudjadi, 1988).

Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar

yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau

intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi). Teknik pengukuran

berdasarkan refleksi di mana sinar datang sebagian diserap dan sebagian lagi

dipantulkan.

29

Gambar 16. Pemantulan Sinar

(Mintarsih, 1990)

Sifat pemantulan ini akan menjadi sensitif dan selektif bila sinar yang

datang adalah monokromatis. Disini biasanya dipilih sinar pada panjang

gelombang yang diserap atau dipantulkan paling banyak oleh noda yang diteliti.

Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap oleh suatu alat yang disebut

reflection photomultiplier yang akan diteruskan ke pencatat atau rekorder untuk

diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram. Luas puncak atau tinggi puncak

sesuai dengan konsentrasi senyawa pada noda yang diukur kerapatannya

(Mintarsih, 1990).

Pada beberapa TLC scanner sudah dilengkapi alat pemproses data atau

mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut dapat

langsung direkam atau dicatat sebagai data sekaligus dengan kromatogramnya dan

dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya, melalui teknik

pemprograman tertentu. Noda yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu

puncak yang sempit dan tajam, sebaliknya noda yang lebar dan kurang intensif

akan menghasilkan puncak yang lebar maupun tumpul (Mintarsih, 1990).

Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horisontal maupun vertikal

(scanning horizontal atau scanning vertikal). Penelusuran bercak secara horisontal

30

dapat dilakukan satu per satu, atau apabila satu pelat bercak yang diperoleh

segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus.

Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat dilakukan satu per satu

(Mintarsih, 1990).

Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak

sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tersebut benar-benar

dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat

dengan bercak yang ditetapkan, karena ada kemungkinan bercak yang tidak

diinginkan ikut pula ditetapkan (Mintarsih, 1990).

Berdasarkan atas jalannya sinar, penelusuran dapat dilakukan dengan dua

cara yaitu penelusuran lurus dan penelusuran zig-zag (naik turun). Pada

penelusuran lurus, sinar yang mengenai bercak berjalan lurus dari kiri ke kanan,

sedangkan pada penelusuran zig-zag, sinar yang mengenai bercak berjalan zig-zag

dari kiri ke kanan. Besarnya jarak, naik turunnya sinar dapat diatur menurut

kebutuhan, yang diperhitungkan dengan besar kecilnya bercak, yang dalam

operasi alat dikenal sebagai lebar penelusuran (scan widht) (Mintarsih, 1990).

Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan

pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak

sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak

yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut

(Mintarsih, 1990).

Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan

pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang

31

kompak sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri,

yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang

kompaknya fase diam, sedangkan puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat

yang kurang rata (Mintarsih, 1990).

Pada umumnya tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan adalah

0,20-0,25 mm maksimum 0,33 mm, untuk mengurangi efek hamburan sinar yang

disebabkan oleh fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi

dari senyawa yang diteliti. Hubungan antara serapan terhadap konsentrasi

dilinearkan dengan dasar teori Kubelka-Munk, menggunakan kurva kerja linear

yang telah diprogramkan oleh suatu mikro komputer. Kurva serapan konsentrasi

tersebut ditentukan oleh harga parameter hamburan yang disebabkan oleh fase

diam. Harga parameter hamburan tersebut tergantung ukuran dan distribusi

partikel fase diam pada lempeng KLT ( Supardjan, 1987).

Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer. Pertama, setiap

kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan

dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah kurva)

sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat

kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh

dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam

konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari

AUCnya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan y = bx +

a dimana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan,

1987).

32

G. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang

digunakan untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan

tersebut sesuai yang diharapkan dengan akurasi dan presisi yang memadai(United

States Pharmacopeial Convention, 1995).

1. Parameter validasi metode

a. Akurasi. Akurasi dapat diartikan sebagai kedekatan hasil analisis

yang diperoleh menggunakan metode analisis tertentu dengan nilai yang

sebenarnya. Hal tersebut diperoleh dengan cara membandingkan kadar terukur

dari sejumah tertentu senyawa standar yang sengaja ditambahkan ke dalam

sampel dengan jumlah tertentu pula. Harga perbandingan tersebut disebut

perolehan kembali (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

Nilai perolehan kembali untuk bahan obat dengan kadar kecil biasanya

disepakati 90-110%, untuk kadar obat yang lebih besar 95-105%, akurasi untuk

bahan baku disepakati 98-102%, sedang untuk bioanalisis rentang akurasi 80-

120% masih bisa diterima (Mulja dan Suharman, 1995).

Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-

placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).

Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit

yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih

kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).

Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio

antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Persen perolehan

33

kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat,

cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya

80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis

dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat

sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau

karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder

pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi (Harmita, 2004).

Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit

dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan

metode tersebut. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa

persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Kriteria kecermatan sangat

tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan

metode (RSD). Selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang

pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga rata-rata

selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang. Kriteria tersebut dinyatakan secara

matematik sebagai berikut:

(5)(Harmita, 2004)

34

Kadar analit dan perolehan kembali dalam metode penambahan baku

dapat dihitung sebagai berikut:

(6)(Harmita, 2004)

Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan

lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu

pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan

pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dan lain-lain. Kriteria kecermatan

dilakukan sama seperti pada metode simulasi (Harmita, 2004).

Pada percobaan penetapan kecermatan, sedikitnya lima sampel yang

mengandung analit dan plasebo yang harus disiapkan dengan kadar antara 50%

sampai 150% dari kandungan yang diharapkan. Persen perolehan kembali

seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Rentang kesalahan yang diijinkan

pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel III:

35

Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan

Konsentrasi analit (%) UnitRata-rata perolehan kembali

(%)100 100 % 98-102≥ 10 10 % 98-102≥ 1 1 % 97-103≥ 0.1 0.1% 95-1050.01 100 ppm 90-107

0.001 10 ppm 90-1070.0001 1 ppm 80-110

0.00001 100 ppb 80-1100.000001 10 ppb 60-115

0.0000001 1 ppb 40-120

(Harmita, 2004)

b. Presisi. Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual

dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang

diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku

relatif (koefisien variasi). Suatu metode dikatakan memberikan presisi yang bagus

jika koefisien variasi (KV) < 2% (Mulja dan Suharman, 1995). Akan tetapi

kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa,

jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa

koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Pada

kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar

2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm)

RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada

metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%

(Harmita, 2004).

36

Untuk menetapkan presisi bahan campuran dan bahan sisa pada artikel

obat, formula berikut ini harus digunakan untuk menentukan metode ketertiruan

yang tepat (interlaboratorium) (Harmita, 2004).

RSD < 2 (1-0,5 log c) (7)

dan untuk keterulangan :

RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67 (8)

c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)

Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: Hasil analisis adalah

x1, x2, x3, x4,.....................xn maka simpangan bakunya adalah

(9)

Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah:

(10)

(Harmita, 2004)

Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit yang berbeda

Konsentrasi analit (%) Unit Presisi (RSD) ( %)100 100 % 1,3≥ 10 10 % 2,7≥ 1 1 % 2,8≥ 0,1 0,1% 3,70,01 100 ppm 5,3

0,001 10 ppm 7,30,0001 1 ppm 11

0,00001 100 ppb 150,000001 10 ppb 21

0,0000001 1 ppb 30

(Yuwono dan Indrayatno, 2005)

c. Sensitivitas. LOD (Limit of Detection) merupakan konsentrasi

analit terkecil dalam sampel yang masih dapat dideteksi tetapi tidak secara

37

kuantitatif. Penentuan LOD dengan cara membandingkan respon dari pengukuran

analit terhadap respon blangko. Konsentrasi analit yang mampu memberikan

respon 2-3 kali respon blangko disebut LOD(United States Pharmacopeial

Convention, 1995). LOQ merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel

yang masih dapat dianalisis dengan hasil penentuan kualitatif yang menuju

akurasi yang memadai. Penentuan LOQ pada metode instrumen dengan cara

membandingkan respon dari pengukuran analit terhadap respon blanko

konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 10 kali respon blanko (United

States Pharmacopeial Convention, 1995).

d. Selektivitas. Selektivitas dapat diartikan sebagai kemampuan dari

suatu metode analisis untuk mengukur keberadaan analit dalam sampel secara

tepat (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Jadi metode yang

digunakan hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan

adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas

seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias)

metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang

ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya,

dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan

lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).

Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis

sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing

lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan

bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji

38

keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat

diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel

yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji

lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti

kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry.

Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas.

Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan

melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita, 2004).

e. Linearitas dan rentang. Linearitas adalah rentang kadar terendah

sampai kadar tertinggi yang ditentukan dengan metode analisis dan dihubungkan

dengan tanggap detektor sehingga memberikan harga koefisien relasi pada tabel

statistik (Mulja dan Suharman, 1995). Rentang adalah interval antara kadar

terendah sampai kadar tertinggi dari analit yang dapat diukur secara kuantitif

menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan presisi dan keakuratan

yang mencukupi (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Persyaratan

data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r)

>0,999 (Snyder, Kirkland, dan Glajch, 1997).

f. Ketidakpastian. Ketidakpastian metode merupakan tingkat

kebolehjadian dari hasil tes analisis pada sampel yang sama di bawah kondisi

variasi tes normal (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

2. Kategori metode analisis

Kategori uji umum yang harus memenuhi validitas data yaitu kategori I,

II, dan III. Kategori I ini meliputi metode-metode analitik yang digunakan untuk

39

mengukur secara kuantitatif sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau

senyawa aktif dalam sediaan obat jadi. Kategori II meliputi metode-metode

analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam serbuk obat atau

penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi. Kategori III meliputi

metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat-sifat khusus seperti

kecepatan disolusi dan pelepasan obat. Parameter-parameter yang harus dipenuhi

pada masing-masing kategori dapat dilihat pada tabel V.

Tabel V. Kategori Analisis Kimia

Parameteranalitik

Kategori I Kategori II Kategori III

Uji kuantitatif Uji kualitatifAkurasiPresisiSpesifikasiLODLOQLinearitasRangeKetidakpastian

YaYaYa

TidakTidak

YaYaYa

YaYaYa

TidakYaYaYaYa

*YaYaYa

TidakTidak

*Ya

*Ya*****

Ya*Mungkin diperlukan, tergantung sifat uji spesifik yang dilakukan

(United States Pharmacopeial Convention,

1995).

H. Landasan Teori

Obat Herbal Terstandar adalah sediaan obat bahan alam yang telah lulus

uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi. Salah satu senyawa aktif

dominan yang biasa terdapat dalam sediaan Obat Herbal Terstandar adalah

kurkumin. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah dalam larutan dan

40

dipengaruhi oleh pH dan paparan cahaya. Kurkumin memiliki panjang gelombang

maksimum pada daerah panjang gelombang 425 nm dalam pelarut etanol.

KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen berdasarkan

perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut

pengembang atau pelarut pengembang campuran. Densitometri merupakan salah

satu dari metode analisa KLT kuantitatif untuk penetapan kadar suatu senyawa

dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT.

Validasi metode analisis adalah serangkaian prosedur yang digunakan

untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan tersebut sesuai

yang diharapkan dengan selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi yang

memadai. Nilai selektivitas yang baik untuk metode KLT memiliki resolusi > 1,5.

Linearitas dan rentang yang baik ditunjukkan melalui nilai faktor korelasi (r)

>0,999. Nilai akurasi yang memadai untuk senyawa baku dengan kemurnian

100% adalah memiliki perolehan kembali 98-102%, sedangkan untuk analit dalam

matriks sampel pada kadar 100 ppm adalah 90-107%. Nilai presisi yang baik

untuk senyawa baku memiliki nilai KV < 2%, sedang untuk analit dalam matriks

sampel pada kadar 100 ppm adalah 5,3%.

I. Hipotesis

Validasi metode KLT-Densitometri pada penetapan kadar kurkumin

dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter validasi

meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

41

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental deskriptif

karena tidak ada manipulasi dan perlakuan terhadap fenomena yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Klasifikasi variabel

a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah sistem kromatografi yang

menghasilkan pemisahan paling optimum. Sistem kromatografi yang

digunakan adalah fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak

kloroform:asam asetat glasial:heksana (85 : 10 : 5) v/v.

b. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter-parameter validasi

yaitu selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

c. Variabel pengacau terkendali yang terdapat dalam penelitian ini adalah

paparan cahaya, kemurnian pelarut dan pH. Paparan cahaya diminimalkan

dengan menutup larutan dengan kertas aluminium dan pengerjaan dilakukan

di ruang gelap. Pelarut dan fase gerak yang digunakan seluruhnya berkualitas

pro analisis. Seluruh larutan diatur pada pH 4 dimana kurkumin tetap stabil

dalam pelarut metanol.

42

2. Definisi operasional

a. Kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT merupakan salah satu senyawa

kurkuminoid, terdapat bersama minyak atsiri yang berasal dari Curcumae

xanthorrizae Rhizoma yang disuspensikan oleh beeswax sehingga berbentuk

semi padat dalam sediaan kapsul lunak.

b. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase normal yang digunakan adalah seperangkat

bejana kromatografi (CAMAG) dengan fase diam silika gel G 60 (E. Merck)

dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.

c. Kadar kurkumin dalam larutan sampel ditetapkan dengan satuan ppm

d. Parameter validasi metode analisis yang ditetapkan adalah selektivitas,

linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

C. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol p.a.

EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), kloroform p.a. EMSURE® ACS,

ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), heksana p.a. EMSURE® ACS (E. Merck), asam

asetat (glasial) 100% p.a. EMPARTA® ACS (E. Merck), lempeng KLT silika gel

G 60 (E. Merck), sampel kapsul lunak OHT Rheumakur®, dan kurkumin baku

(hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt yang telah dikonfirmasi

strukturnya dengan metode spektroskopi 1H-NMR dan Mass Spectra, kurkumin

hasil sintesis tersebut memiliki titik lebur 181,2-182,4 °C).

43

D. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi neraca; neraca analitik

(OHAUS Carat Series PAJ 1003 dengan spesifikasi max 60/120g; d = 0,01/0,1 mg

;dan e = 1 mg); Densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER.

No.160602); labu takar 5,0 mL; labu takar 10,0 mL; labu takar 50,0 mL, labu

takar 100,0 mL; cawan arloji; pipet mikro volume 0,1-2 μL; pipet mikro volume

0,5-5 mL; corong; flakon; pipet tetes; Bekker glass; sendok; pengaduk;

ultrasonikator Retsch tipe T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83 HF-Frequ. :

35 kHz); oven; dan bejana kromatografi (CAMAG).

E. Cara Penelitian

1. Pembuatan metanol pH 4

Metanol ditambahkan dengan asam asetat glasial dengan perbandingan

9:1 untuk setiap pembuatan larutan.

2. Pengaktifan silika Gel G 60

Lempeng silika gel G 60 dipanaskan di dalam oven pada suhu 105ºC

selama 1 jam sebelum digunakan.

3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak

Fase gerak dibuat dengan perbandingan kloroform:asam asetat

glasial:heksana sesuai hasil optimasi (85:10:5) v/v pada labu takar hingga 100,0

mL. Fase gerak dituang pada bejana kromatografi kemudian kertas saring

dimasukkan hingga menutup 2 sisi dinding bejana. Bejana ditutup rapat dan

dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.

44

4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum

Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan

dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan

dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk

diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang

mengandung kurkumin 100; 300; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku

kurkumin direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari

cahaya.

Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G

60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah

dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)

v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika

gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

Bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 300; dan 500

ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang 400-500 nm. Panjang

gelombang maksimum ditentukan berdasarkan serapan maksimum yang

dihasilkan oleh bercak tersebut.

5. Penentuan kurva baku kurkumin

Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan

dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan

dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk

diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang

45

mengandung kurkumin 100; 180; 260; 340; 420 dan 500 ppm. Semua larutan

baku harus terlindung dari cahaya.

Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G

60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah

dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)

v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika

gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

Bercak seri larutan baku kurkumin diukur AUC-nya dengan densitometer

pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram

dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linear, nilai

konsentrasi (ppm) diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku

sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon

(AUC), x merupakan konsentrasi senyawa baku (ppm), a adalah intersept, dan b

adalah slope. Pembuatan kurva baku direplikasi sebanyak 3 kali.

6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV) baku

kurkumin

Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan

dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan

dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk

diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang

mengandung kurkumin 100; 260; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku

direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari cahaya.

46

Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G

60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah

dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5)

v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika

gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

Tiga replikasi bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100;

260; dan 500 ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang

maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang

muncul diamati. Kadar kurkumin dihitung dengan persamaan kurva baku yang

telah diperoleh. Masing-masing seri kadar dihitung nilai perolehan kembali dan

koefisien variasinya (KV).

7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan presisi

baku yang ditambahkan ke dalam sampel

Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin dilarutkan dalam metanol pH 4

hingga 10,0 mL (larutan A). Sejumlah lebih kurang 1000,0 mg sampel ditambah

metanol pH 4 sebanyak 40 mL (larutan B). Larutan B kemudian diultrasonikasi

selama 15 menit. Sampel dipastikan sudah larut seluruhnya. Kemudian larutan B

disentrifugasi selama 15 menit. Supernatan kemudian diambil seluruhnya dengan

pipet. Supernatan ditambah metanol pH 4 hingga 50,0 mL (larutan C).

Sejumlah 0,5 mL larutan A dimasukkan dalam labu takar 5 mL (masing-

masing 5 kali). Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar yang

telah ditambahkan larutan A (masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar

47

ditambahkan metanol pH 4 hingga 5,0 mL(larutan D). Semua larutan harus

terlindung dari cahaya.

Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar 5,0 mL

(masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar ditambahkan metanol pH 4

hingga 5,0 mL (larutan E). Semua larutan sampel harus terlindung dari cahaya.

Masing-masing larutan D dan E ditotolkan sebanyak 1,0 L pada

lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana

kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat

glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan

setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan

setelah pengembangan selesai. Bercak masing-masing larutan D dan E diukur

dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.

F. Analisis Hasil

Perhitungan kadar kurkumin dalam setiap larutan dilakukan dengan

memasukkan nilai AUC sebagai y pada persamaan kurva baku y = bx + a

sehingga diperoleh nilai x sebagai kadar dengan satuan ppm. Sedangkan

kesahihan metode ditentukan dengan parameter selektivitas, linearitas, rentang,

akurasi, dan presisi dengan rumus sebagai berikut:

1. Selektivitas

Selektivitas ditentukan melalui pengamatan terhadap profil kromatogram

sampel yang menunjukkan pemisahan analit kurkumin hingga baseline terhadap

senyawa lain. Selektivitas ditunjukkan melalui kesamaan nilai Rf puncak

48

kurkumin sampel dengan Rf puncak kurkumin baku. Selain itu, pemisahan yang

baik ditunjukkan dengan nilai resolusi (Rs) > 1,5. Berikut ini merupakan metode

perhitungan Rf dan Rs:

(11)

(12)

Z2 – z1 merupakan selisih antara nilai Rf maksimum kurkumin dengan

nilai Rf maksimum senyawa di dekatnya. W1 adalah jarak yang ditempuh senyawa

di dekat puncak kurkumin, sedangkan W2 adalah jarak yang ditempuh puncak

kurkumin.

2. Linearitas dan rentang

Nilai linearitas ditunjukkan melalui nilai koefisien korelasi (r) yang

diperoleh melalui penentuan kurva baku dengan metode regresi linear. Nilai r

yang baik adalah > 0,999. Rentang yang baik ditunjukkan melalui seberapa besar

rentang konsentrasi seri baku dari kadar paling rendah hingga paling tinggi yang

masih memiliki linearitas, akurasi, dan presisi yang baik.

3. Akurasi baku kurkumin

Akurasi baku kurkumin ditentukan melalui nilai perolehan kembali

(recovery). Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai

perolehan kembali 98-102% (Mulja dan Suharman, 1995).

(13)

49

4. Presisi baku kurkumin

Presisi baku kurkumin ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV)

atau Coefficient Variation (CV). Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik

apabila nilai koefisien variasinya < 2% (Mulja dan Suharman, 1995).

(14)

5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel

Akurasi baku kurkumin dalam matriks sampel ditentukan melalui nilai

perolehan kembali (recovery) kadar baku yang ditambahkan ke dalam sampel.

Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai perolehan

kembali 90-107% pada kadar 100 ppm(Harmita, 2004).

(15)

CF merupakan kadar kurkumin yang terukur dalam larutan sampel yang

ditambah baku (larutan D). CA merupakan kadar kurkumin dalam larutan sampel

yang terukur (larutan E). C*A merupakan konsentrasi teoritis baku kurkumin yang

ditambahkan dalam volume pengenceran yang sama dengan larutan D dan E.

6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel

Presisi baku kurkumin yang ditambahkan dalam matriks sampel

ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV) atau Coefficient Variation (CV).

Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik apabila nilai koefisien variasinya <

5,3% pada kadar 100 ppm (Yuwono dan Indrayatno, 2005).

50

Kadar kurkumin baku yang ditambahkan (x) = kadar kurkumin larutan D – kadar

kurkumin larutan E

(16)

(17)

51

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode KLT-

Densitometri memenuhi parameter validasi yang ditetapkan. Metode yang

digunakan adalah KLT-Densitometri karena metode ini mampu memisahkan

senyawa dalam suatu campuran. Sampel yang dianalisis pada penelitian ini

merupakan Obat Herbal Terstandar yang dipastikan mengandung lebih dari satu

senyawa. Selain itu, metode KLT-Densitometri memiliki kelebihan yaitu dapat

digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara simultan. Penelitian ini

menggunakan KLT fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak

kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5).

Pada penelitian optimasi metode telah dilakukan penentuan stabilitas

kurkumin dalam pelarut metanol pH 3, 4, dan 5. Penentuan pH dimana kurkumin

tetap stabil dilakukan dengan mengukur panjang gelombang serapan maksimum

baku kurkumin dengan metode spektrofotometri visibel. Pelarut yang digunakan

adalah metanol karena kurkumin larut dalam pelarut metanol dan sukar larut

dalam air (Windholz, 1981). Metanol ditambahkan asam asetat untuk mengatur

pH larutan. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa stabilitas kurkumin pada pH 4

lebih baik karena panjang gelombang maksimum kurkumin stabil pada 432 nm.

Stabilitas kurkumin pada pH 3 dan 5 kurang baik karena panjang gelombang

maksimumnya tidak stabil dengan rentang 429 nm hingga 435 nm.

52

Kurkumin lebih stabil pada pH 4 karena kurkumin merupakan senyawa

yang bersifat asam lemah. Penambahan asam asetat glasial hingga pH 4 akan

menjaga kurkumin tetap dalam bentuk molekulnya sehingga kurkumin tetap stabil

dalam larutan. Pembuatan larutan baku maupun sampel dilakukan pada pH 4

dengan penambahan asam asetat glasial karena hasil menunjukkan kurkumin tetap

stabil pada pH 4.

A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum bertujuan untuk

memperoleh besar area di bawah kurva (AUC) kurkumin yang paling maksimum.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan dengan mengukur

kerapatan bercak dari larutan baku kurkumin kadar rendah (100 ppm), tengah

(300 ppm), dan tinggi (500 ppm) pada rentang panjang gelombang 400-500 nm.

Densitometer yang dipergunakan memiliki detektor visibel yang dapat

mengukur sinar yang dipantulkan oleh bercak suatu senyawa pada panjang

gelombang 380-800 nm. Untuk dapat diukur pada panjang gelombang tersebut,

senyawa yang dianalisis harus memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga

energi eksitasi yang dibutuhkan kecil (Gandjar dan Rohman, 2007). Kedua gugus

ini bertanggungjawab terhadap penyerapan sinar radiasi elektromagnetik pada

kurkumin.

Pada struktur kimia kurkumin terdapat gugus kromofor yang berupa

ikatan rangkap yang memiliki elektron π. Elektron π akan mudah tereksitasi ke

tingkat yang lebih tinggi (π*) ketika dikenai sinar radiasi elektromagnetik. Sedang

53

gugus auksokrom merupakan gugus yang memiliki atom dengan elektron bebas.

Gugus auksokrom terikat secara langsung pada gugus kromofor. Pasangan

elektron bebas pada elektron O akan berinteraksi dengan elektron π pada gugus

kromofor. Pengikatan ini akan menyebabkan pergeseran panjang gelombang

maksimum dan intensitas serapan maksimum dari kurkumin ke panjang

gelombang yang lebih besar. Berikut ini merupakan gugus kromofor dan

auksokrom yang terdapat pada struktur kurkumin (Gambar 17).

Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin

Gugus kromofor kurkumin yang panjang terdiri dari banyak ikatan π.

Energi yang dibutuhkan oleh ikatan π untuk mengalami eksitasi ke π* lebih

rendah daripada ikatan σ ke σ*, begitupula ikatan n pada atom O gugus

auksokrom dan gugus kromofor. Energi yang dibutuhkan untuk eksitasi

berbanding terbalik dengan panjang gelombang serapan suatu senyawa, oleh

karena itu kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum yang besar yaitu

pada daerah tampak. Hal tersebut menjadi dasar pemilihan pengukuran panjang

gelombang maksimum kurkumin pada rentang 400-500 nm.

54

Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin

Chan, Lam, Lee, dan Zhang (2004) menyatakan bahwa pergeseran

panjang gelombang maksimum yang diperbolehkan untuk rentang panjang

gelombang visibel adalah 3 nm. Kesesuaian panjang gelombang serapan

maksimum kurkumin pada percobaan dengan panjang gelombang maksimum

kurkumin teoritis menunjukkan bahwa senyawa yang dianalisis tetap stabil (tabel

VI).

Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum kurkumin

Panjang gelombang serapan maksimumSeri Kadar

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

100 ppm 425 nm 425 nm 425 nm

300 ppm 425 nm 425 nm 425 nm

500 ppm 425 nm 425 nm 425 nm

55

Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan terhadap bercak

kurkumin, sehingga yang terukur merupakan senyawa murni karena fase gerak

maupun pelarut telah menguap. Anggarwal (1995) menyatakan bahwa panjang

gelombang maksimum senyawa murni kurkumin adalah 425 nm. Hasil

pengukuran menunjukkan bahwa seluruh bercak larutan baku kurkumin memiliki

panjang gelombang maksimum 425 nm dan tidak terjadi pergeseran. Hal ini

menunjukkan bahwa kualitas baku dan stabilitas kurkumin dalam larutan masih

baik.

Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum pada rentang panjang

gelombang ultraviolet hingga visibel, hanya terdapat satu puncak saja. Profil

tersebut menunjukkan bahwa senyawa baku kurkumin memiliki kemurnian yang

tinggi dan tidak mengandung senyawa lain maupun produk degradasinya.

B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin

Pengamatan profil kromatogram kurkumin baku dilakukan untuk

memastikan senyawa kurkumin dapat terelusi dengan baik. Parameter yang

digunakan dalam pengamatan profil kromatografi adalah nilai faktor retardasi (Rf)

dan warna bercak. Rf biasa digunakan dalam analisis kualitatif. Hal ini disebabkan

karena nilai Rf bersifat selektif untuk senyawa tertentu dalam kondisi tertentu

pula.

Besarnya nilai Rf sangat dipengaruhi oleh interaksi antara senyawa yang

dianalisis (kurkumin) dengan fase gerak dan fase diam yang digunakan. Besarnya

56

nilai Rf ini ditentukan pula oleh polaritas senyawa analit, fase gerak, dan fase

diam.

Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm

Dari kromatogram (Gambar 19) dapat diketahui bahwa sistem fase gerak

pada KLT mampu mengelusi kurkumin dengan baik. Hal ini ditunjukkan dengan

nilai Rf baku kurkumin yaitu 0,85. Pada kromatogram baku kurkumin ini hanya

terdapat 1 buah peak saja. Hal ini menunjukkan bahwa baku kurkumin yang

digunakan memiliki kemurnian yang tinggi yaitu 100%.

O O

H3CO

HO

OCH3

OH

Gugus non polar

Gugus polar

Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin

Struktur kurkumin memiliki gugus polar dan gugus non polar. Masing-

masing gugus ini dapat berinteraksi dengan komponen fase gerak dan fase diam.

Fase gerak yang digunakan adalah kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 :

10 : 5) v/v dengan indeks polaritas 4,11 dan pH 4. Gugus polar kurkumin

57

berinteraksi dengan silika gel G 60 dan asam asetat glasial. Sedang gugus

nonpolar kurkumin berinteraksi dengan heksana. Gambar 21 dan 22 menunjukkan

interaksi kurkumin dengan fase diam dan fase gerak.

OO

O

O

O

O

Si

O

Si

O

H

O O

O O

Si

Si

O H

O

O

O Si

Si

O

H

O

O Si

O Si

O

O Si

O

O Si

O

O

H

H

O Si

O

SiO

O

H

O Si

O Si

O

O

H

Si

O

H

O

Si

H

CH3CH3

H

Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam

Interaksi gugus polar kurkumin dengan fase diam merupakan interaksi

hidrogen. Atom O pada silika gel, gugus metoksi dan fenol pada kurkumin

memiliki pasangan elektron bebas yang mampu berinteraksi dengan atom H yang

berada di dekatnya.

O

O

O

O

O O

H

interaksi van Der WaalsHeksana

interaksi Van der Waals kloroform

CH3

O

O

H

H

OH

O

CH3

interaksi hidrogenasam asetat glasial

interaksi van Der Waals Heksanainteraksi hidrogenasam asetat glasial

CH2

HCH3

H

O

OH2CH

interaksi hidrogenasam asetat glasial

H

O

O

CH3

Cl

H

Cl

Cl

Cl

H

Cl

Cl

Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak

58

Interaksi yang terjadi antara kurkumin dengan fase gerak adalah interaksi

Van der Waals antara atom C karbonil pada struktur kurkumin yang bersifat

parsial positif dan atom Cl pada kloroform yang bersifat parsial negatif. Interaksi

Van der Waals juga terjadi pada gugus non polar kurkumin dengan heksana.

Interaksi hidrogen terjadi antara atom O pada gugus karbonil, gugus metoksi, dan

gugus fenol kurkumin dengan asam asetat glasial.

Si

O

Si

O

H

O O

O O

Si

Si

O

H

O

Si

O

H

O

Si

H

O

O

H3C

Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel

Interaksi hidrogen yang terjadi antara kurkumin dengan silika, kurkumin

dengan asam asetat glasial serta asam asetat glasial dengan silika gel bersifat

kompetitif. Besarnya kekuatan masing-masing ikatan dipengaruhi oleh perbedaan

elektronegatifitas antar atom pada senyawa masing-masing.

Semakin polar komponen, maka akan lebih kuat diadsorpsi oleh silika

dan terelusi lebih lama. Polaritas fase gerak memiliki pengaruh utama dalam

pemisahan. Semakin polar fase gerak, semakin kompetitif untuk proses adsorpsi

sehingga analit lebih cepat terelusi. Asam asetat glasial bersifat lebih polar

daripada kurkumin sehingga interaksi asam asetat glasial dengan silika gel G lebih

kuat daripada interaksi kurkumin dengan silika gel G.

59

Kurkumin tidak larut dalam air sehingga dibutuhkan fase gerak yang

dapat melarutkan kurkumin. Kloroform dan heksana berfungsi untuk membantu

melarutkan kurkumin. Asam asetat glasial berfungsi untuk menjaga kurkumin

tetap stabil dan secara kompetitif berinteraksi dengan silika. Kekuatan adsorpsi

silika terhadap kurkumin lebih lemah dibandingkan dengan asam asetat glasial.

Asam asetat glasial bersifat lebih polar daripada kurkumin sehingga pada saat

bercak kurkumin dilewati oleh fase gerak yang mengandung asam asetat glasial,

interaksi hidrogen kurkumin dengan silika akan tergantikan oleh ikatan hidrogen

asam asetat dengan silika sehingga kurkumin berada dalam bentuk bebas.

Kurkumin dalam bentuk bebas akan lebih mudah berinteraksi dengan fase gerak

sehingga kurkumin lebih terbawa fase gerak. Hasil pengembangan menunjukkan

bahwa harga Rf kurkumin 0,85. Harga Rf yang tinggi menunjukkan bahwa fase

gerak dengan indeks polaritas 4,11 mampu mengelusi kurkumin dengan baik.

C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin

dalam Sampel

Preparasi sampel dilakukan 2 tahap yaitu ultrasonikasi dan sentrifugasi.

Ultrasonikasi merupakan cara untuk memaksimalkan proses ekstraksi. Pemberian

getaran ultrasonik pada frekuensi 35 kHz akan melepas ikatan kurkumin dengan

matriks sampel sehingga akan mempermudah metanol untuk menarik kurkumin

dan melarutkannya. Sentrifugasi merupakan teknik pemisahan dengan prinsip

gaya sentrifugal. Partikel basis kapsul lunak yang tersuspensi dengan bobot

60

molekul lebih besar akan mengendap sehingga akan terpisah dengan kurkumin

yang telah larut dalam metanol.

Pengamatan profil kromatogram kurkumin dalam sampel bertujuan untuk

mengetahui dan memastikan bahwa kurkumin dalam sampel memiliki bercak

dengan nilai Rf dan warna yang sama dengan baku. Nilai Rf dan warna bercak

yang sama digunakan sebagai analisis kualitatif untuk mengetahui keberadaan

senyawa analit dalam sampel. Gambar 24 A merupakan data kromatogram sampel

dan 24 B merupakan kromatogram baku.

A

BGambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku kurkumin (B)

Tabel VII. Data nilai Rf baku dan sampel

RfReplikasiBaku kurkumin Kurkumin dalam sampel

I 0,85 0,84

II 0,83 0,84

III 0,85 0,84

IV 0,84 0,83

V 0,84 0,84

Rata-rata 0,84 0,84

61

Hasil kromatogram menunjukkan bahwa puncak kurkumin pada sampel

(puncak 3) memiliki nilai Rf yang sama dengan baku. Nilai Rf baku yaitu 0,84

sedangkan Rf sampel yaitu 0,84. Bercak kurkumin sampel memiliki warna yang

sama dengan bercak kurkumin baku yaitu kuning-oranye. Oleh karena itu, puncak

3 pada kromatogram sampel benar-benar merupakan puncak kurkumin.

Pada kromatogram sampel (Gambar 24 A) terlihat bahwa terjadi

pemisahan antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa lain. Pemisahan

dapat terjadi karena setiap molekul memiliki keadaan kesetimbangan (equilibrium

state) yang berbeda dengan fase gerak serta fase diam. Keadaan setimbang

merupakan keadaan dimana analit berpindah dari keadaan bebas ke keadaan

teradsorpsi atau sebaliknya. Keadaan bebas yaitu seluruh analit terlarut dalam fase

gerak, sedangkan keadaan teradsorpsi yaitu analit tertahan pada permukaan fase

diam.

Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A (kurkumin)dengan senyawa lainnya

62

Keadaan setimbang dipengaruhi oleh polaritas dan ukuran molekul;

polaritas dari fase diam; dan polaritas fase gerak. Kurkumin (BM = 368,126)

bersifat tidak larut air. Puncak kurkumin terelusi lebih jauh daripada dua senyawa

lain karena bersifat lebih non polar. Semakin non polar analit, adsorpsi silika

terhadap analit akan lebih lemah sehingga analit akan terelusi lebih jauh.

Polaritas silika sangat berpengaruh terhadap pemisahan kurkumin.

Selisih elektronegativitas silikon (1,8) dan elektronegativitas oksigen (3,5) yaitu

1,7 membuat fase diam bersifat polar. Maka, semakin polar molekul yang akan

dipisahkan, semakin kuat gaya tarik fase diam terhadap molekul tersebut.

Kurkumin dapat terpisah dengan dua senyawa yang lain karena senyawa yang lain

tertahan pada silika. Senyawa yang lain lebih kuat teradsorpsi oleh silika karena

memiliki polaritas yang tidak sesuai dengan fase gerak.

Hukum “like-dissolve-like” dapat diaplikasikan pada pemisahan

kurkumin dengan sistem KLT. Molekul yang tidak larut air seperti kurkumin akan

memiliki afinitas yang lebih rendah terhadap fase diam dan akan terbawa pada

fase gerak yang bersifat nonpolar lebih lama. Polaritas fase gerak kloroform :

asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v mendekati kepolaran kurkumin

sehingga mampu mengelusi analit dengan baik sehingga dapat terpisah dengan

senyawa lain yang memiliki polaritas yang berbeda. Ilustrasi yang

menggambarkan pemisahan kurkumin dengan salah satu senyawa lain dalam

sampel dapat dilihat pada gambar 25.

63

D. Pembuatan Kurva Baku

Pembuatan kurva baku dilakukan untuk memperoleh persamaan regresi

linear. Pembuatan persamaan regresi linear dilakukan dengan mengukur AUC

beberapa bercak kurkumin dengan konsentrasi yang berbeda. Pada penelitian ini,

digunakan 6 seri konsentrasi kurkumin dari konsentrasi 100 hingga 500 ppm.

Pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada pengamatan terhadap respon detektor

dan respon analit. Konsentrasi baku yang baik memiliki respon detektor yang

tidak dipengaruhi oleh noise (peak pengotor) dan dalam rentang 50-150 % respon

analit.

Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin

ReplikasiKadar

kurkumin(ppm)

AUC AUC/50Perhitunganregresi linear

100 5537,6 110,752180 8894,3 177,886260 13097,4 261,948340 17220,8 344,416420 20902,0 418,04

I

500 24813,5 496,27

A= 8,9963B= 0,9752r= 0,9996α= 44,28ºy = 0,9752 x +8,9963

100 5871,6 117,432180 8134,9 162,689260 13011,2 260,224340 17132,2 342,644420 20613,8 412,276

II

500 25079,1 501,582

A= 4,6247B= 0,9828r= 0,9971α= 44,50ºy = 0,9828 x +4,6247

101 5932,8 118,656181,8 8488,7 169,774262,6 12945,1 258,902343,4 16880,4 337,608424,2 21156,3 423,126

III

505 24712,4 494,248

A= 9,3083B= 0,9607r= 0,9981α= 43,85ºy = 0,9607 x +9,3083

Kurva baku menunjukkan korelasi antara kenaikan kadar dengan

kenaikan respon yang berupa AUC. Dengan meningkatnya kadar maka AUC yang

64

terukur akan meningkat sebanding dengan peningkatan kadar sehingga hubungan

yang terbentuk merupakan hubungan yang proporsional. Hubungan yang

proporsional dipastikan memiliki korelasi yang baik.

Korelasi yang baik antara konsentrasi dan nilai AUC ditunjukkan dengan

nilai koefisien korelasi. Koefisien korelasi yang baik yaitu >0,999 (Snyder, dkk,

1997). Untuk mendapatkan koefisien korelasi yang terbaik, setiap seri konsentrasi

dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

Kurva baku yang dibuat dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan nilai

AUC menghasilkan kurva baku dengan sudut kemiringan 88º. Kurva baku tersebut

tidak layak untuk ditampilkan karena hampir menyentuh sumbu Y. Hubungan

konsentrasi dengan AUC yang baik ditunjukkan dengan kemiringan garis sebesar

45º. Oleh karena itu, faktor koreksi diperlukan untuk dapat menghasilkan segi

sensitivitas yang baik tersebut. Faktor koreksi yang digunakan yaitu 50 untuk

setiap perhitungan AUC.

Hasil pembuatan kurva baku dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan

AUC/50 menunjukkan bahwa kurva baku kurkumin replikasi I memiliki nilai r

yang memenuhi syarat yaitu sebesar 0,9996 dan kemiringan garis 44,28º. Oleh

karena itu, persamaan kurva baku replikasi I digunakan untuk perhitungan kadar

selanjutnya dan layak ditampilkan. Persamaan kurva baku tersebut yaitu y =

0,9752x + 8,9963.

65

Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50 (replikasi I)

E. Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin

Validasi metode analisis dilakukan dalam penelitian ini karena bertujuan

untuk membuktikan bahwa metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar

kurkumin memiliki validitas yang baik. Metode yang memiliki validitas yang

baik akan menghasilkan data yang terjamin realibilitas dan reprodusibilitasnya.

Metode dapat dikatakan valid apabila memenuhi syarat parameter-parameter yang

ditentukan berdasarkan pengujian yang dilakukan. Penelitian ini termasuk dalam

penelitian kategori I karena bertujuan untuk menganilisis senyawa aktif dalam

sampel dalam jumlah besar. Parameter-parameter yang harus dipenuhi pada

penelitian kategori I antara lain selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan

presisi.

1. Selektivitas

Selektivitas merupakan parameter yang menunjukkan bahwa metode

analisis yang digunakan mampu mengukur zat tertentu saja secara akurat dan

cermat walaupun dimungkinkan masih terdapat zat lain dalam matriks sampel.

Untuk mengetahui selektivitas metode KLT-densitometri, dilakukan pengamatan

66

terhadap profil kromatogram pemisahan sampel. Parameter selektivitas ditentukan

oleh nilai resolusi. Resolusi (Rs) merupakan parameter yang menunjukkan

seberapa besar senyawa yang dianalisis telah terpisah dengan senyawa yang lain.

Nilai Rs yang baik adalah lebih dari 1,5 sehingga senyawa yang dianalisis telah

terpisah secara sempurna dengan senyawa lain.

Pada penelitian ini, sampel mengandung senyawa kurkuminoid dan

minyak atsiri. Untuk dapat menetapkan kadar kurkumin, maka puncak kurkumin

harus terpisah dengan puncak-puncak senyawa lain.

Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan Rf baku dengan puncakkurkumin pada sampel

67

Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2

ReplikasiResolusi puncak kurkumin dengan

puncak senyawa 2I 2,1818II 2,4762III 2,1818IV 2,2727V 2,0870

Rata-rata 2,2399

Hasil penelitian menunjukkan nilai Rf kurkumin pada baku dan puncak

kurkumin pada sampel sama yaitu 0,84 dan 0,84 (Tabel VII). Rata-rata hasil

perhitungan resolusi antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2 (Gambar

27) adalah 2,2399. Resolusi yang menunjukkan pemisahan yang baik adalah >

1,5. Hal ini menunjukkan bahwa kurkumin telah terpisah dengan senyawa 2

secara sempurna. Pemisahan antara puncak senyawa 2 dan kurkumin terjadi

secara sempurna karena respon garis menyentuh hingga baseline. Pemisahan yang

baik ini membuktikan bahwa metode KLT-Densitometri ini selektif untuk

menganalisis dan memisahkan kurkumin yang terdapat bersama dengan senyawa

lain. Dari hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode KLT-

Densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dengan fase gerak kloroform :

asam asetat glasial : heksana (85 : 10 :5) v/v memiliki selektivitas yang baik.

2. Linearitas dan rentang

Linearitas merupakan parameter yang ditunjukkan melalui besarnya

koefisien korelasi (r). Nilai r diperoleh melalui perhitungan kurva baku

menggunakan metode regresi linear. Metode dikatakan memiliki linearitas yang

baik apabila memiliki nilai r lebih besar dari 0,999 (Snyder dkk., 1997).

68

Kurva baku kurkumin yang memiliki linearitas yang baik ditunjukkan

pada kurva baku replikasi I dengan nilai 0,9996. Sedangkan untuk replikasi II dan

replikasi III berturut-turut adalah 0,9971 dan 0,9981. Metode KLT-Densitometri

memiliki linearitas yang baik untuk penetapan kadar kurkumin.

Rentang merupakan parameter yang menentukan pada rentang

konsentrasi baku kurkumin berapa, metode yang digunakan masih bisa diperoleh

hubungan korelasi yang baik (r > 0,999) antara konsentrasi dengan respon serta

memenuhi parameter akurasi dan presisi. Metode ini memiliki rentang yang baik

pada konsentrasi baku dengan konsentrasi 260 – 500 ppm.

3. Akurasi

Akurasi merupakan kesesuaian antara kadar yang terukur dengan kadar

yang sebenarnya. Besarnya nilai akurasi ditunjukkan melalui besarnya perolehan

kembali (recovery). Perolehan kembali ditentukan dengan cara mengukur

sedikitnya 3 seri konsentrasi dengan masing-masing 3 replikasi. Nilai perolehan

kembali yang baik pada senyawa baku adalah 98-102% (Harmita, 2004).

Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku

% recovery kurkuminLevel Kadar

Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rata-rata

Kadar rendah 103,02% 107,42% 101,77% 103,02%Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69% 98,96%Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36% 98,70%

Hasil penentuan perolehan kembali menunjukkan bahwa pada kadar

sedang (260 ppm) dan tinggi (500 ppm) memenuhi persyaratan nilai perolehan

kembali yang baik. Oleh karena itu penetapan kadar kurkumin dilakukan pada

69

rentang konsentrasi 260 hingga 500 ppm. Hasil penetuan perolehan kembali

ditunjukkan pada tabel X.

4. Presisi

Presisi merupakan ukuran seberapa besar keseksamaan dari suatu metode

analisis. Keseksamaan ini ditunjukkan melalui penentuan koefisien variasi (KV).

Nilai KV yang semakin kecil menunjukkan bahwa presisi dari metode analisis

yang dilakukan semakin baik. Harmita (2004), menyatakan bahwa metode analisis

untuk senyawa baku memenuhi persyaratan akurasi apabila memiliki KV kurang

dari 2%.

Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku

Level kadar SD KVKadar rendah (100 ppm) 2,8416 2,72%Kadar tengah (260 ppm) 0,8810 0,34%Kadar tinggi (500 ppm) 3,9699 0,79%

Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai KV dari konsentrasi kurkumin

pada 260 dan 500 ppm memenuhi persyaratan KV yang baik. Oleh karena itu,

metode penetapan kadar kurkumin secara KLT-densitometri pada level kadar

tersebut memiliki presisi yang baik.

F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel

Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel merupakan

tahap kedua dari validasi metode yang dilakukan. Percobaan ini bertujuan untuk

memastikan bahwa metode ini sesuai dan mampu memberikan hasil yang reliable

dan reprodusibel untuk sampel yang dianalisis. Selain itu penentuan akurasi dan

presisi baku kurkumin dalam sampel bertujuan untuk mengetahui bahwa puncak

70

kurkumin pada kromatogram sampel betul-betul merupakan puncak kurkumin.

Hal ini dibuktikan dengan penambahan baku kurkumin ke dalam sampel hanya

akan menambah tinggi puncak dan AUC dari puncak kurkumin saja (puncak 3

pada gambar 27) tanpa adanya penambahan AUC dan tinggi pada puncak yang

lainnya. Penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel juga bertujuan sebagai

pedoman seberapa besar pengambilan sampel ketika penetapan kadar agar masuk

dalam rentang daerah kurva baku yang memenuhi parameter validasi.

Perolehan kembali yang baik untuk analisis senyawa baku dalam matriks

sampel adalah 90-107% (Yuwono dan Indrayatno, 2005). Sedangkan untuk nilai

KV yang baik berdasarkan Yuwono dan Indrayatno (2005) adalah ≤ 5,3%.

Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel

Replikasi

Kadarkurkumin

sampel(ppm)

Kadarkurkuminsampel +

baku (ppm)

Kadar bakukurkumin

dalamsampel

Perolehankembali

(%)KV

I 279,9853 379,9751 101,1670 101,17II 279,2368 382,9939 104,1858 104,19III 276,9542 381,3861 102,5780 102,58IV 280,2027 376,8003 97,9922 97,99V 277,6617 383,2216 104,4135 104,41

3,64%

Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin dalamsampel yang ditambah baku

AUC kurkumin dalam sampelAUC kurkumin dalam sampel

yang ditambah bakuReplikasi

PuncakI

PuncakII

Puncak III(kurkumin)

PuncakI

PuncakII

Puncak III(kurkumin)

I 1203,7 2807,5 14101,9 823,4 2647,7 18977,4II 830,4 2437,5 14064,4 684,8 2487,6 19124,6III 1233,7 2457,9 13954,1 955,7 1869,9 19046,2IV 985,5 2809,0 14112,5 773,4 2708,0 18822,6V 534,8 2458,8 13988,6 1050,7 2444,2 19135,7

71

Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan kurkumindalam sampel yang ditambah baku

AU kurkumin dalam sampelAU kurkumin dalam sampel

yang ditambah bakuReplikasi

PuncakI

PuncakII

Puncak III(kurkumin)

PuncakI

PuncakII

Puncak III(kurkumin)

I 32,8 73,4 358,2 23,8 69,3 458,0II 23,8 69,2 355,9 21,9 65,8 465,7III 32,8 64,1 344,7 22,6 53,4 462,3IV 23,5 76,2 363,8 23,0 63,0 463,3V 25,3 65,7 370,0 30,2 75,0 485,8

Hasil pengukuran menunjukkan bahwa nilai KV dan besarnya perolehan

kembali memenuhi syarat akurasi dan presisi. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh

baku kurkumin yang ditambahkan hanya terdeteksi pada puncak kurkumin saja

(puncak 3 pada gambar 27). Sedangkan puncak yang lain memiliki nilai AUC dan

tinggi puncak yang tidak berbeda setelah ditambahkan baku. Hal ini terlihat pada

tabel XIII dan XIV bahwa tidak terjadi peningkatan tinggi dan AUC pada senyawa

puncak 1 dan 2 (gambar 27 pada kromatogram sampel). Dari keseluruhan data

yang diperoleh, dapat diketahui bahwa metode KLT-Densitometri pada penetapan

kadar kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi

parameter validasi.

72

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah diperoleh, dapat disimpulkan bahwa:

validasi metode KLT-Densitometri dengan instrumen yang digunakan adalah

CAMAC TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602, fase gerak

kloroform : asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v, fase diam silika gel G

60, volume penotolan 1,0 μL, jarak pengembangan 10 cm, pada penetapan kadar

kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur®” memenuhi parameter-

parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan

presisi.

B. Saran

Perlu dilakukan penetapan kadar kurkumin terhadap sampel obat

tradisional Rheumakur® dengan menggunakan metode penelitian ini.

73

DAFTAR PUSTAKA

Aggarwal, B.B., 1995, Curcumin, Analogues, of Curcumin and Novel UsesThereof, http://www.thepowerhour.com/curcumin/Turmeric.pdf, diaksestanggal 20 Juli 2010.

Agnam, N., Samhoedi, H., Timmerman, H., Venie, U. A., Sugiyanto., Goot, H.,1995, The Relationship between Structure and Inhibition of LipoxygenaseActivity of Curcumin Derivates, International Symposium on CurcuminPharmacocheimistry (ISCP), Yogyakarta.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, Monografiekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Vol 1, Badan Pengawas Obat danMakanan Republik Indonesia, Jakarta, 51.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005, StandarisasiEkstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalamPengembangan Obat Asli Indonesia, InfoPOM, 6(4), 1-5.

Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y. C., Zhang, X-M., 2004, Analytical MethodValidation and Instrument Performance Verification, pp. 169, A John Wileyand Sons, Inc, Kanada.

Commandeur, J.N. dan Vermeulen, N.P., 1996, Cytotoxicity ang cytoprotectiveactivities of natural compounds : The case of curcumin, Xenobiotica 26, pp.667-680.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977, Materia MedikaIndonesia, Jilid I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 49-52, 147.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, FarmakopeIndonesia, Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2-4.

Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, 221-225.

Gritter, R.J., Bobit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, terbitan ke-2, 107-155, penerbitITB, Bandung.

Gupta, A.P., Gupta, M.M., Kumar, S., 1999, Simultaneous determination ofcurcuminoids in curcuma samples using high performance thin layerchromatography,http://203.190.147.121/bitstream/123456789/80/1/J_Journal_Liquid_Chromatography_Related_Technologies_22_1561.pdf , diakses tanggal 10 Februari2010.

74

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-135.

Jork, Funk, Fischer, Wimmer, 1990, Thin-Layer Chromatography, volume 1a,Hellmut Jork-Weinheim; Basel (Zwitzerland); Cambridge; New York.

Kalim, H., 1996, Penyakit Sendi Degeneratif (Osteoarthritis), Buku Ajar IlmuPenyakit Dalam, Jakarta, 74-86.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990, Peraturan Menteri KesehatanRepublik Indonesia No.246/MENKES/PER/V/1990 tentang Izin UsahaIndustri Obat Tradisional dan Pendaftaran Obat Tradisional, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994, Keputusan Menteri KesehatanRepublik Indonesia No.661/MENKES/SK/VII/1994 tentang Persyaratan ObatTradisional, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Kertia, N., Sudarsono, Imono, A.D., Mufrod, Catur., E., Rahardjo, P., dkk, 2005,Pengaruh pemberian kombinasi minyak atsiri temulawak dan ekstrak kunyitdibandingkan dengan piroksikam terhadap angka leukosit cairan sendipenderita dengan osteoarthritis lutut, Majalah Farmasi Indonesia, 16 (3),156-160.

Kohli, K., Ali J., Ansari M. J., dan Raheman Z., 2005, Curcumin : A NaturalAntiinflammatory Agent, Indian Journal of Pharmacology, New Delhi,Jarnia Hamdard University, pp. 141-142.

Martono, S., 1996, Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri, Buletin ISFI Yogyakarta, 2(4), 11-21.

Mintarsih, E.R.R., 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kinina dalam Akar, Batang,dan Daun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzch dari Daerah Kaliurangsecara Spektrodensitometri (TLC-Scanner), Skripsi, Fakultas Farmasi, UGM,Yogyakarta.

Mulja, H.M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,Surabaya, 6.

Naguib, Y., 2000, Soft Gel Capsules: An Elegant & Versatile Dosage Form,Supplement Industry Executive : The Business Magazine for DietarySupplement Industry Manufactures, East Brunswick.

Paramasivam, M., Aktar, W., Poi, R., Banerjee, H., Bandyopahyay, A., 2008,Occurrence of curcuminoids in Curcuma longa : A quality standardizationby HPTLC,http://www.banglajol.info/index.php/BJP/article/viewFile/833/913, diaksestanggal 10 Februari 2010.

75

Pothitirat, W., Gritsanapan, W., 2005, Quantitative Analysis of Curcumin,Demethoxycurcumin and Bisdemethoxycurcumin in the Crude CurcuminoidExtract from Curcuma longa in Thailand by TLC-Densitometry,http://www.bioponic.com/pdfs/TurmericAyurveda.pdf, diakses tanggal 10Februari 2010.

Rahardjo, P., 1994, Masalah dan Penanganan Osteoartritis, Konggres AhliRematologi Indonesia, Palembang.

Rukmana, R., 1994, Kunyit, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 2.

Sasaki, S.S., Sat, K., Abe, M., Sugimoto, N., & Maitani, T, 1998, Components ofturmeric oleoresin preparations and photo-stability of curcumin, Jpn. J. FoodChem., 5(1).

Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Edisi I, Liberty, Yogyakarta, 26-30.

Sherma, J., Fried, B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, MarcellDekker Inc., New York, pp. 56-57.

Skoog, D.A., Holler, F.J., & Nieman, T.A., 1998, Principles of InstrumentalAnalysis, 5th edition, Harcourt Brace College, Philadelphia, pp.329-351.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Glajch, K.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd Edition, 13, 690, 710, 723, John Wiley & Sons, Inc., NewYork.

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-7, Institut Teknologi Bandung,Bandung.

Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 75.

Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalamSediaan Tetrasiklin Secara KLT-Densitometri, Laporan Penelitian LembagaPenelitian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Supardjan, A.M., dan Meiyanto, E., 2002, Efek antiproliferatif pentagamavunon-0terhadap beberapa sel kanker, Laporan Penelitian Lembaga PenelitianUniversitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Stankovic, 2004, Curcumin : Chemical and Technical Assessment (CTA), JECFA61st edition, FAO, ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pdf,diakses tanggal 1 Desember 2010.

Timmerman, H., 1995, New perspective for anti-inflammatory drugs,International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry (ISCP),Yogyakarta.

76

Tonnesen, H.H. & Karlsen, J., 1985, Studies of curcumin and curcuminoids: V.Alkaline degradation of curcumin, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 180: 132-134.

Tonnesenn H.H., dan Karlsen, J., 1985a, Studies on curcumin and curcuminoids,VI: Kinetics of Curcumin Degradation in Aqueous Solution, Original Paper,Z. Lebensm. Unters. Fosch., pp. 402-404.

United States Pharmacopeial Convention, 1995, The United States Pharmacopeia,23th edition, United States Pharmacopeia Convention, Rockville, pp. 1982-1984.

Usia, T., 2010, Trend Penggunaan Obat Bahan Alam,http://www.isfinational.or.id/pt-isfi-penerbitan/123/433-trend-penggunaan-obat-bahan-alam.html, diakses tanggal 31 Maret 2010.

Van der Goot, H., 1997, The chemistry and qualitative structure-activityrelationships of curcumin, in Recent Development in CurcuminPharmacochemistry, Procedings of The International Symposium onCurcumin Pharmacochemistry (ISCP), Yogyakarta.

Wang, Y.J., Pan, M.H., Cheng, A.L., Lin, L.I., Ho, Y.S., Hsieh, C.Y., & Lin, J.K.,1997, Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of itsdegradation products, J. Pharm. Biomed. Anal., pp. 1867-1876.

Windholz, M., 1981, The Merck Index : An Encyclopedia of Chemicals and Drug,10th edition, Merck & Co., Inc., Rahmay, New York, pp. 2681.

Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methodsof Analysis, Profile of Drugs Substances, Excipients, and RelatedMethodology, Elsevier Inc , 32.

77

LAMPIRAN

78

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin

79

Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin

a. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 0,4 ppm

pada pH 4

b. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1 ppm

pada pH 4

80

c. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1,6 ppm

pada pH 4

Tabel hasil penentuan pH stabilitas kurkumin

Konsentrasi Repliaksi pH 3 pH 4 pH 5

I 425 nm 432 nm 432 nm

II 425 nm 432 nm 432 nm0,4 ppm

III 432 nm 432 nm 432 nm

I 432 nm 435 nm 435 nm

II 429 nm 435 nm 432 nm1 ppm

III 429 nm 433 nm 435 nm

I 432 nm 433 nm 429 nm

II 429 nm 432 nm 429 nm1,6 ppm

III 429 nm 432 nm 429 nm

81

Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan

maksimum kurkumin

82

Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan

Sistem KLT-Densito yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagaiberikut:

Stationary phasePlate size (X x Y) 7,0 x 13,0 cm dan 11,0 x 13,0 cmMaterial TLC plates silica gel GManufacturer E. MERCK KGaAPre-washing YesDrying device OvenTemperature 100ºCTime 60 MinutesCalibration parametersCalibration mode Single levelStatistics mode CVAvaluation mode Peak areaSample application-Nanomat / Manual deviceInstrument Graduated Disposable MicropipettesFirst application position X 10,0 mmApplication position Y 15,0 mmDistance between tracks 10,0 mmApplication volume 1,000 μlDevelopment – Glass tankChamber type Twin Trough Chamber 20x20 cmMobile phase Cloroform : Acetic Acid Glacial : Hexane

(85 : 10 : 5)Solvent front position 100,0 mmVolume 100,0 mLDrying device OvenTemperature 60ºCTime 5 MinutesDetection – CAMAG TLC Scanner 3Instrument CAMAG TLC Scanner 3

“Scanner3_160602” S/N 160602 (1. 14.28)Scan start pos. Y 15,0 mmScan end pos. Y 115,0 mmSlit dimensions 8,00 x 0,90 mm, MacroOptimize optical system LightScanning speed: 20 mm/sData resolution 100 μm/stepMeasurement TableWavelength 425Lamp D2 & WMeasurement Type RemissionMeasurement Mode AbsorptionOptical filter Second order

83

Detector mode AutomaticPM high voltage 312 VDetector propertiesY-position for 0 adjust 15,0 mmTrack # for 0 adjust 0Analog Offset 10%Sensitivity Automatic (27)IntegrationPropertiesData filtering Savitsky-Golay 7Baseline correction Lowest SlopePeak threshold min. slope 5Peak threshold min. height 10 AUPeak threshold min. area 50Peak threshold max. height 600 AUDisplay scaling 600

84

Contoh lampiran hasil analisis :

85

86

Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin

a. Seri baku 1: 100 ppm

87

b. Seri baku 2: 180 ppm

c. Seri baku 3: 260 ppm

d. Seri baku 4: 340 ppm

88

e. Seri baku 5: 420 ppm

f. Seri baku 6: 500 ppm

Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku

a. Penimbangan baku kurkumin

Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi IIIBerat Kertas 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gramBerat Kertas + Zat 0,1445 gram 0,1356 gram 0,1548 gramBerat Kertas + Sisa 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gramBerat Zat 0,0100 gram 0,0100 gram 0,0101 gram

b. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku

Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL

↓

89

Ambil 0,5;0,9;1,3;1,7;2,1; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan

methanol p.a pH 4 hingga 5,0 mL

c. Data AUC baku

Replikasi

Kadarkurkumin

(ppm)AUC AUC/50

Perhitunganregresi linier

100 5537,6 110,752180 8894,3 177,886260 13097,4 261,948340 17220,8 344,416420 20902,0 418,04

I

500 24813,5 496,27

A= 8,9963B= 0,9752r= 0,9996α= 44,28ºy = 0,9752 x +8,9963

100 5871,6 117,432180 8134,9 162,689260 13011,2 260,224340 17132,2 342,644420 20613,8 412,276

II

500 25079,1 501,582

A= 4,6247B= 0,9828r= 0,9971α= 44,50ºy = 0,9828 x +4,6247

101 5932,8 118,656181,8 8488,7 169,774262,6 12945,1 258,902343,4 16880,4 337,608424,2 21156,3 423,126

III

505 24712,4 494,248

A= 9,3083B= 0,9607r= 0,9981α= 43,85ºy = 0,9607 x +9,3083

d. Contoh perhitungan kadar baku (Replikasi I)

Kurkumin baku memiliki tingkat kemurnian 100%

Jumlah kurkumin = 10,0 mg x 100 = 10 mg

C1 V1 = C2 V2

Seri 1 : 1000 ppm x 0,5 mL = C2 x 5 mL

C2 = 100 ppm

NB : Perhitungan kadar seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang

sama dengan menyesuaikan volume pengambilan larutan stok baku

kurkumin.

90

Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode

a. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi I

b. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi II

c. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi III

91

d. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi I

e. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi II

f. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi III

92

g. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi I

h. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi II

i. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi III

93

Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery

1. Data penimbangan untuk penentuan perolehan kembali dan KV

Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Berat Kertas 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gramBerat Kertas + Zat 0,1306 gram 0,1378 gram 0,1352 gramBerat Kertas + Sisa 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gramBerat Zat 0,0101 gram 0,0100 gram 0,0100 gram

2. Data AUC kurkumin

AUC kurkumin

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Level Kadar

AUC AUC/50 AUC AUC/50 AUC AUC/50

Kadar rendah 5523,5 110,47 5687,4 113,748 5412,0 108,24Kadar sedang 13104,8 262,096 13023,4 260,468 13087,9 261,758Kadar tinggi 24752,5 495,05 25138,2 502,764 24916,4 498,328

3. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku

Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL

↓

Ambil 0,5; 1,3; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan methanol p.a pH

4 hingga 5,0 mL

↓

Masing-masing larutan seri dibuat sebanyak 3 kali

Contoh perhitungan perolehan kembali kurkumin

Replikasi I:

Perhitungan kadar teoritis

Kadar kurkumin = 10,1 x 100% (tingkat kemurnian kurkumin

= 10,1 mg

94

Cstok = 10,1 mg/10,0 mL

= 1010 ppm

C1V1=C2V2

Kadar rendah : 1010 ppm x 0,5 mL = C2 x 5 mL

C2 = 101 ppm

Kadar tengah : 1010 ppm x 1,3 mL = C2 x 5 mL

C2 = 262,26 ppm

Kadar tinggi : 1010 ppm x 2,5 mL = C2 x 5 mL

C2 = 505 ppm

Perhitungan kadar terukur:

y = 0,9752 x + 8,9963

y= AUC kurkumin/50

Kadar rendah : 110,47 = 0,9752 x + 8,9963

x = 104,0542 ppm

Kadar tengah : 262,096 = 0,9752 x + 8,9963

x = 259,5362 ppm

Kadar tinggi : 495,05= 0,9752 x + 8,9963

x = 498,4144 ppm

Perhitungan perolehan kembali (recovery):

Recovery =

95

Replikasi I

Data recovery kurkumin

% recovery kurkuminLevel Kadar

Replikasi I Replikasi II Replikasi IIIKadar rendah 103,02% 107,42% 101,77%Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69%Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36%

Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV

Tabel perhitungan SD dan CV

Levelkadar

Replikasi Kadar terukur Kadar rata-rata (x- )2

Replikasi I 104,0452 0,1294

Replikasi II 107,4156 9,0643

Replikasi III 101,7675

104,4049

6,9559

Kadarrendah

Jumlah 16,1496

Replikasi I 259,5362 0,4516

Replikasi II 257,8668 0,9948

Replikasi III 259,1896

258,8642

0,1059

Kadartengah

Jumlah 1,5523

Replikasi I 498,4144 14,1158

Replikasi II 506,3245 17,2474

Replikasi III 501,7757

502,1715

0,1567

Kadartinggi

Jumlah 31,5199

96

Contoh perhitungan SD dan CV pada level kadar rendah :

SD =

SD = 2,8416

CV =

CV = 2,72 %

Data hasil perhitungan SD dan CV

Level kadar SD CVKadar rendah 2,8416 2,72%Kadar tengah 0,8810 0,34%Kadar tinggi 3,9699 0,79%

Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam

sampel

97

a. Kromatogram sampel replikasi I

b. Kromatogram sampel replikasi II

c. Kromatogram sampel replikasi III

98

d. Kromatogram sampel replikasi IV

e. Kromatogram sampel replikasi V

f. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi I

99

g. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi II

h. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi III

i. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi IV

100

j. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi V

Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin

dengan puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya

Replikasi

Rfmaksimumpuncak 2

(z1)

Rfmaksimumkurkumin

(z2)

W1 puncak 2W

2kurkuminRs

I 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818

II 0,58 0,84 0,09 0,12 2,4762

III 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818IV 0,58 0,83 0,08 0,14 2,2727V 0,60 0,84 0,11 0,12 2,0870

Rata-rata 2,2399

101

Lampiran 11. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam matriks sampel

Tabel penentuan recovery dan CV baku dalam matriks sampel

Larutan E AUC AUC/50 Kadar(ppm)

Selisih kadarlarutan D-rerata kadarlarutan E

RecoveryBaku (%)

SD danCV

Replikasi I 14101,9 282,038 279,9853 101,1670 101,17

Replikasi II 14065,4 281,308 279,2368 104,1858 104,19

Replikasi III 13954,1 279,082 276,9542 102,5780 102,58

Replikasi IV 14112,5 282,25 280,2027 97,9922 97,99

Replikasi V 13988,6 279,772 277,6617 104,4135 104,41

Rata-rata 278,8081 102,0673

Larutan D AUC AUC/50 Kadar(ppm)

(x-x rata-rata)2

Replikasi I 18977,4 379,548 379,9751 0,8106 SD 3,7196

Replikasi II 19124,6 382,492 382,9939 4,4882 CV 3,64%

Replikasi III 19046,2 380,924 381,3861 0,2608

Replikasi IV 18822,6 376,452 376,8003 16,6060

Replikasi V 19135,7 382,714 383,2216 5,5046

102

103

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Validasi MetodeKromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri padaPenetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Obat HerbalTerstandar (OHT) Rheumakur®” ini bernama lengkapAndreas Suseno Wimbo Hapsoro, lahir di Klaten, 12Juni 1989. Merupakan anak sulung dari dua bersaudarapasangan Y. Nardiyo dan Sutarmi. Penulis telahmenyelesaikan pendidikannya di Sekolah Dasar NegeriIV Prambanan pada tahun 2001, di Sekolah MenegahPertama Negeri I Kalasan pada tahun 2004, dan diSekolah Menengah Atas Kolese De Britto pada tahun2007. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2007.Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,penulis pernah menjadi asisten praktikum Spektroskopi, Farmasi Fisika II,Formulasi dan Teknologi Sediaan Solid A, serta Analisis Sediaan ObatTradisional. Selain kegiatan akademik penulis juga pernah mengikuti beberapakegiatan non akademik yaitu pada kepanitiaan Talk Show Hari AIDS 2008 yangdiadakan oleh JMKI dan Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (TITRASI) 2009.