valorizaciÓn de hemicelulosas de biomasa vegetal

VALORIZACIÓN DE HEMICELULOSAS

DE BIOMASA VEGETAL

INTERNATIONAL DOCTORAL THESIS

Sandra Rivas Siota

Ourense, 2014

BIOMASS HEMICELLULOSE VALORIZATION

Juan Carlos Parajó Liñares, Catedrático de Universidad, Valentín Santos Reyes,

Profesor Titular de Universidad, y María Jesús González Muñoz, Investigadora

contratada, pertenecientes al Departamento de Ingeniería Química de la Universidad

de Vigo, con destino en la Facultad de Ciencias de Ourense,

INFORMAN

Que la memoria titulada “Valorización de hemicelulosas de biomasa vegetal”, que

para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Vigo presenta Sandra Rivas Siota,

ha sido realizada en el laboratorio de Ingeniería Química de la Facultad de Ciencias de

Ourense bajo nuestra dirección. Considerando que este trabajo resulta válido para su

presentación como Tesis Doctoral con Mención Internacional, autorizamos su

presentación.

Ourense, 18 de Diciembre de 2013

Juan Carlos Parajó Liñares Valentín Santos Reyes María Jesús González Muñoz

ÍNDICES

ÍNDICE GENERAL

I. SUMMARY __________________________________________________________ 1

II. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ______________________________________ 17

1. Materiales Lignocelulósicos _______________________________________________ 19

1.1. El concepto de biorrefinería aplicado a los materiales lignocelulósicos __________________ 19

1.2. Los materiales lignocelulósicos como materias primas renovables _____________________ 21

1.3. Disponibilidad de los recursos forestales __________________________________________ 24

1.3.1. Superficie forestal ________________________________________________________ 24

1.3.2. Existencias de madera _____________________________________________________ 27

1.3.3. Existencias de biomasa y de carbono _________________________________________ 27

1.3.4. Fines productivos de los recursos forestales ____________________________________ 28

1.4. Estructura de la pared de las células de los materiales lignocelulósicos __________________ 31

1.5. Composición de los materiales lignocelulósicos _____________________________________ 35

1.5.1. Componentes estructurales _________________________________________________ 37

1.5.1.1. Celulosa _____________________________________________________________ 38

1.5.1.2. Hemicelulosas ________________________________________________________ 39

1.5.1.3. Lignina ______________________________________________________________ 41

1.5.2. Componentes no estructurales ______________________________________________ 43

1.5.2.1. Agua _______________________________________________________________ 44

1.5.2.2. Cenizas _____________________________________________________________ 44

1.5.2.3. Extractos ____________________________________________________________ 44

1.5.2.4. Proteínas ____________________________________________________________ 44

2. Biorrefinería. Fraccionamiento de Materiales Lignocelulósicos ___________________ 47

2.1. Tratamientos para la solubilización de hemicelulosas ________________________________ 48

2.1.1. Tratamientos con agua_____________________________________________________ 48

2.1.1.1. Autohidrólisis ________________________________________________________ 48

2.1.1.2. Explosión con vapor ___________________________________________________ 49

2.1.2. Tratamientos con ácidos ___________________________________________________ 50

2.1.3. Tratamientos alcalinos _____________________________________________________ 51

2.1.4. Tratamientos con hemicelulasas _____________________________________________ 51

2.1.4.1. Xilanasas ____________________________________________________________ 52

2.1.4.2. Mananasas __________________________________________________________ 53

2.1.4.3. Inactivación e inhibición ________________________________________________ 54

2.2. Tratamientos de deslignificación ________________________________________________ 55

2.2.1. Métodos en medio acuoso _________________________________________________ 55

2.2.2. Métodos en medio orgánico («organosolv») ___________________________________ 56

2.3. Tratamientos de hidrólisis de la celulosa __________________________________________ 56

2.3.1. Hidrólisis ácida ___________________________________________________________ 56

2.3.2. Hidrólisis enzimática ______________________________________________________ 57

2.3.3. Tratamientos con líquidos iónicos ____________________________________________ 58

3. Hemicelulosas __________________________________________________________ 61

3.1. Clasificación de las hemicelulosas ________________________________________________ 61

3.1.1. Glucomananos ___________________________________________________________ 63

3.1.2. Galactoglucomananos _____________________________________________________ 64

3.1.3. Galactomananos __________________________________________________________ 67

3.1.4. Arabinogalactano _________________________________________________________ 68

3.1.5. Xilano __________________________________________________________________ 70

3.1.6. Arabinoxilano ____________________________________________________________ 70

3.1.7. Xiloglucano ______________________________________________________________ 73

3.1.8. β-glucanos ______________________________________________________________ 74

3.2. Propiedades fisicoquímicas de las hemicelulosas ___________________________________ 75

3.2.1. Solubilidad ______________________________________________________________ 75

3.2.1.1. Peso molecular y distribución de pesos moleculares _________________________ 76

3.2.2. Comportamiento reológico _________________________________________________ 78

3.2.3. Comportamiento térmico __________________________________________________ 79

3.2.4. Tensión superficial ________________________________________________________ 80

3.3. Hemicelulosas de madera de pino _______________________________________________ 80

3.4. Hemicelulosas de madera de Eucalyptus globulus ___________________________________ 81

3.5. Hemicelulosas de cáscaras de arroz ______________________________________________ 82

4. Productos a Partir de Hemicelulosas ________________________________________ 85

4.1. Oligosacáridos: Potencial como ingredientes para alimentos funcionales ________________ 86

4.1.1. Potencial prebiótico _______________________________________________________ 88

4.1.2. Potencial antioxidante _____________________________________________________ 91

4.1.3. Propiedades de los manooligosacáridos _______________________________________ 94

4.1.4. Propiedades de los xilooligosacáridos _________________________________________ 96

4.1.5. Métodos de purificación y refinado de oligosacáridos ____________________________ 99

4.1.5.1. Extracción con disolventes orgánicos ____________________________________ 100

4.1.5.2. Precipitación ________________________________________________________ 100

4.1.5.3. Adsorción con carbón activo ___________________________________________ 101

4.1.5.4. Separación con membranas ____________________________________________ 102

4.1.5.5. Evaporación y deshidratación __________________________________________ 104

4.1.5.6. Intercambio iónico ___________________________________________________ 104

4.1.5.7. Cromatografía _______________________________________________________ 105

4.1.6. Análisis estructural de oligosacáridos ________________________________________ 106

4.1.7. Determinación del potencial prebiótico ______________________________________ 107

4.1.7.1. Determinación de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) ____________________ 108

4.1.7.2. Dinámica de poblaciones bacterianas de la microbiota intestinal ______________ 108

4.1.8. Medida de la actividad antioxidante _________________________________________ 109

4.2. Productos de reacción de los azúcares hemicelulósicos _____________________________ 112

4.2.1. Reacciones de degradación de hexosas ______________________________________ 112

4.2.2. Reacciones de degradación de pentosas ______________________________________ 115

4.2.3. Tecnologías de producción ________________________________________________ 116

4.2.3.1. Tecnologías que emplean catalizadores ácidos en disolución _________________ 116

4.2.3.2. Tecnologías que emplean catalizadores sólidos ____________________________ 118

4.2.3.3. Sistemas líquidos bifásicos _____________________________________________ 118

4.2.3.4. Líquidos iónicos______________________________________________________ 119

4.2.4. Furfural ________________________________________________________________ 119

4.2.4.1. Propiedades físico-químicas ____________________________________________ 120

4.2.4.2. Aplicaciones ________________________________________________________ 120

4.2.4.3. Obtención __________________________________________________________ 121

4.2.5. Hidroximetilfurfural ______________________________________________________ 125


4.2.5.2. Aplicaciones ________________________________________________________ 126

4.2.5.3. Obtención __________________________________________________________ 127

4.2.6. Ácido levulínico _________________________________________________________ 129


4.2.6.2. Aplicaciones ________________________________________________________ 130

4.2.6.3. Obtención __________________________________________________________ 132

III. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO______________________________________ 139

5. Objetivos Generales y Específicos __________________________________________ 141

6. Plan de Trabajo ________________________________________________________ 145

6.1. Acondicionamiento y caracterización química de la madera de Pinus pinaster ___________ 145

6.2. Solubilización de la fracción hemicelulósica de Pinus pinaster mediante extracción con

agua caliente seguida de autohidrólisis ______________________________________________ 145

6.3. Desarrollo de procesos multietapa para el refinado y fraccionamiento de los licores de

autohidrólisis de madera de Pinus pinaster ___________________________________________ 146

6.4. Estudio de la composición de las fracciones purificadas, y de la estructura y distribución

de pesos moleculares de los sacáridos hemicelulósicos _________________________________ 146

6.5. Evaluación del potencial prebiótico de las fracciones obtenidas ______________________ 147

6.6. Acondicionamiento y caracterización química de cáscaras de arroz y madera de

Eucalyptus globulus _____________________________________________________________ 147

6.7. Obtención de los licores hemicelulósicos de las distintas materias primas y estudio de su

composición ___________________________________________________________________ 147

6.8. Desarrollo de procesos multietapa para la obtención de fracciones de sacáridos

hemicelulósicos _________________________________________________________________ 148

6.9. Estudio de la composición de las fracciones purificadas, y de la estructura y distribución

de pesos moleculares de los sacáridos hemicelulósicos solubles __________________________ 149

6.10. Evaluación del potencial antioxidante de sacáridos hemicelulósicos purificados ________ 149

6.11. Determinación de la influencia de la concentración de ácido en la cinética de

degradación de sacáridos solubilizados en los licores de autohidrósisis de madera de Pinus

pinaster a bajas temperaturas _____________________________________________________ 150

6.12. Modelización cinética de los resultados experimentales obtenidos en el apartado

anterior _______________________________________________________________________ 150

6.13. Estudio de la descomposición de sacáridos hemicelulósicos obtenidos a partir de

madera de Pinus pinaster en medio ácido a altas temperaturas __________________________ 150

6.14. Modelización cinética de los resultados experimentales obtenidos en el apartado

anterior _______________________________________________________________________ 151

6.15. Estudio de la descomposición de sacáridos solubles derivados de hemicelulosas de

madera de Pinus pinaster en presencia de dos fases líquidas ____________________________ 151

6.16. Optimización de las condiciones conducentes a máximos rendimientos de compuestos

furánicos ______________________________________________________________________ 151

6.17. Efecto de la adición de modificadores a los sistemas con dos fases líquidas ____________ 151

IV. RESULTS, DISCUSSION AND CONCLUSIONS/RESULTADOS, DISCUSIÓN Y

CONCLUSIONES _____________________________________________________ 155

7. Results, Discussion and Conclusions ________________________________________ 157

7.1. Prebiotic potential of hemicellulosic saccharides from Pinus pinaster wood _____________ 157

7.2. Evaluation of the antioxidant potential of saccharides obtained from rice husks,

Eucalyptus globulus wood and Pinus pinaster wood ____________________________________ 158

7.3. Influence of sulfuric acid concentration on the degradation kinetics of hemicellulosic

saccharides present in Pinus pinaster autohydrolysis liquors _____________________________ 159

7.4. Decomposition of hemicellulosic saccharides from Pinus pinaster wood in acidic media at

high temperatures ______________________________________________________________ 160

7.5. Production of furans from Pinus pinaster hemicellulosic saccharides using biphasic liquid

systems _______________________________________________________________________ 160

7. Resultados, Discusión y Conclusiones _______________________________________ 163

7.1. Evaluación del potencial prebiótico de los sacáridos hemicelulósicos de madera de Pinus

pinaster _______________________________________________________________________ 163

7.2. Evaluación del potencial antioxidante de sacáridos de cáscaras de arroz y de maderas de

Eucalyptus globulus y Pinus pinaster ________________________________________________ 164

7.3. Determinación de la influencia de la concentración de ácido sulfúrico en la cinética de

degradación de sacáridos hemicelulósicos presentes en licores de autohidrólisis de madera de

Pinus pinaster __________________________________________________________________ 165

7.4. Estudio de la descomposición de sacáridos hemicelulósicos obtenidos a partir de madera

de Pinus pinaster en medio ácido a altas temperaturas _________________________________ 166

7.5. Producción de furanos a partir de sacáridos de hemicelulosas de Pinus pinaster

empleando sistemas líquidos bifásicos ______________________________________________ 167

V. BIBLIOGRAFÍA ____________________________________________________ 171

VI. INFORMACIÓN Y CRITERIOS DE CALIDAD DE LAS PUBLICACIONES __________ 227

VII. ANEXOS ________________________________________________________ 235

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Distribución de la superficie forestal a nivel mundial_______________________________25

Figura 1.2. Superficie forestal en España__________________________________________________26

Figura 1.3. Morfología de la pared de la célula vegetal______________________________________33

Figura 1.4. Composición y organización de la pared celular___________________________________34

Figura 1.5. Componentes estructurales de los MLCs_________________________________________36

Figura 1.6. Componentes estructurales y no estructurales de los MLCs__________________________37

Figura 1.7. Estructura de la celulosa______________________________________________________39

Figura 1.8. Estructura química de las unidades estructurales de las hemicelulosas_________________40

Figura 1.9. Estructura modelo de la lignina de una madera blanda______________________________43

Figura 3.1. Estructura del GM en maderas duras____________________________________________63

Figura 3.2. Estructura del GaGM en maderas blandas________________________________________65

Figura 3.3. Estructura del ArGa de Larix occidentalis_________________________________________69

Figura 3.4. Estructuras químicas de xilanos presentes en maderas duras y maderas blandas_________72

Figura 3.5. Estructura química de la cadena de los XGs_______________________________________74

Figura 4.1. Descomposición de los MLCs catalizada por ácidos________________________________112

Figura 4.2. Esquema simplificado de la descomposición de la glucosa catalizada por ácidos_________113

Figura 4.3. Esquema simplificado para la transformación de hemicelulosas formadas por

homoxilano a furfural con catálisis ácida__________________________________________115

Figura 4.4. Estructura del furfural_______________________________________________________120

Figura 4.5. El furfural como compuesto químico base o precursor de combustibles_______________121

Figura 4.6. Estructura del HMF_________________________________________________________126

Figura 4.7. El HMF como compuesto de base para la síntesis de productos de interés comercial_____127

Figura 4.8. Estructura química del ácido levulínico_________________________________________130

Figura 4.9. El ácido levulínico como compuesto químico base o plataforma para la

síntesis de otros compuestos químicos o combustibles______________________________132

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.1. Volumen de cortas de madera por especie________________________________________30

Tabla 1.2. Cortas totales de coníferas y frondosas en distintas comunidades autónomas____________31

Tabla 1.3. Contenido en celulosa, hemicelulosas y lignina de diferentes MLCs____________________38

Tabla 3.1. Principales polisacáridos presentes en las hemicelulosas_____________________________62

Tabla 3.2. Relación molar de los constituyentes de GaGM____________________________________66

Tabla 3.3. Número, peso molecular e índice de polidispersidad de hemicelulosas aisladas

con distintos procedimientos____________________________________________________77

Tabla 4.1. Métodos in vitro utilizados habitualmente para determinar la actividad

antioxidante de extractos y compuestos puros_____________________________________110

Tabla 4.2. Propiedades físico-químicas del furfural_________________________________________120

Tabla 4.3. Producción de furfural: materias primas, tecnologías y rendimientos__________________123

Tabla 4.4. Propiedades físico-químicas del HMF___________________________________________126

Tabla 4.5. Propiedades físico-químicas del ácido levulínico___________________________________131

Tabla 4.6. Producción de ácido levulínico a partir de hexosas comerciales y celulosa

microcristalina en medios catalizados con ácidos inorgánicos_________________________134

Tabla 4.7. Resultados obtenidos en la producción de ácido levulínico a partir de diferentes

sustratos lignocelulósicos en pesencia de ácidos inorgánicos______________________________135

Tabla 4.8. Producción de ácido levulínico en sistemas catálisis heterogénea_____________________136

NOMENCLATURA

NOMENCLATURA

ABTS: Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)

ACA: Aldehyde-Carboxilic acid assay/Método aldehído-ácido carboxílico

AcGaGM: Acetilgalactoglucomanano

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AGCC: Ácidos Grasos de Cadena Corta

AMeGo: Ácido 4-O-metil-α-D-glucurónico

AMIM: 1-alil-3-metilimidazolio

Ara: Arabinosa

Araf: Arabinofuranosa

Arap: Arabinopiranosa

ArGa: Arabinogalactano

ArGoX: Arabinoglucuronoxilano

ArX: Arabinoxilano

ArXOS: Arabinoxilooligosacáridos

BHA: Butilhidroxianisol

BHT: Butilhidroxitolueno

BMIM: 1-butil-3-metil imidazolio

CE: Capilar Electrophoresis/Electroforesis Capilar

GC: Gas Chromatography/Cromatografía de Gases

GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry/ Cromatografía de Gases con Detección por

Espectrometría de Masas.

CNV: Componentes no volátiles

DFPH: 2,2-difenilo-1-picrilhidrazilo

DMEA: N,N-dimetiletanolamonio

DMSO: dimetil sulfóxido

DP: Degree of polymerization/Grado de polimerización

EMIM: 1-etil-3-metil-imidazolio

ERNs: especies reactivas de nitrógeno

EROs: especies reactivas de oxígeno

ET: Electron Transfer/Transferencia de Electrón

FACE: Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis/Electroforesis de Carbohidratos

Asistida por Fluoróforo

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations/Organización para la

Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas

FAOSTAT: FAO Statistics /División de Estadística de laFAO

FCR: Folin-Ciocalteu Reagent/Reactivo Folin-Ciocalteu

FDCA: Ácido 2,5-furandicarboxílico

FISH: Fluorescence in situ hybridization/Hibridación in situ con fluorescencia

FOS: Fructooligosacáridos

FOSHU: Foods for Specified Health Use/Alimentos para un Uso Específico en la Salud

FOX: Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay/Ensayo de Oxidación Ferrosa de Xilenol

FRA: Global Forest Resources Assessment/Evaluación de los Recursos Forestales Mundiales

FRAP: Ferric Reducing Antioxidant Power/Poder Antioxidante del Ión Férrico

FTC: Ferric Thiocyanate Assay/Ensayo con Tiocianato Férrico

Fucp: Fucopiranosa

FUFOSE: Functional Food Science in Europe

GaGM: Galactoglucomanano

Gal: Galactosa

Galp: Galactopiranosa

GaM: Galactomanano

GaOS: Galactooligosacáridos

Glup: Glucopiranosa

Glu: Glucosa

GM: Glucomanano

GoArX: Glucuronoarabinoxilano

GoX: Glucuronoxilano

GPC: Gel Permeation Chromatography/Cromatografía de permeación en gel

GRAS: Generally Recognized as Safe

HAT: Hidrogen Atom Transfer/Transferencia de Átomo de Hidrógeno

HMF: 5-Hidroximetilfurfural

HPAEC-PAD:High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric

Detection/Cromatografía de intercambio aniónico de alta eficacia con detección

amperométrica de pulsos.

HPLC: High Performance Liquid Chromatography/ Cromatografía Líquida de Alta Eficacia

HPSEC: High Performance Size Exclusion Chromatography/Cromatografía de exclusion de

tamaño de alta eficacia.

IMOS: Isomaltooligosacáridos

ISFE: Informe de Situación de los Bosques y Sector Forestal en España

IUB-IUPAC: International Union of Biochemistry-International Union of Pure and Applied

Chemistry

KGM: Konjac GlucoMannan/Glucomanano de Konjac

LDL: Low Density Lipoproteins/Lipoproteínas de Baja Densidad

MAGRAMA: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente

MALDI-TOF: Matrix Laser Desorption-Ionization coupled with Time Of Flight

Detector/Desorción-Ionización Láser asistida por Matriz con Detección por Tiempo de Vuelo.

Man: Manosa

Manp: Manopiranosa

MIBK: Metil-isobutil-cetona

MLCs: Materiales Lignocelulósicos

Mn: Masa molecular promedio en número

Mw: Masa molecular promedio

MS: Mass Spectrometry/Espectrometría de masas

MTHF: 2-metiltetrahidrofurano

NMMO: Óxido N - metil - morforlina

OCNV: Otros Componentes No Volátiles

ONDs: Oligosacáridos No Digeribles

ORAC: Oxygen Radical Antioxidant Capacity/Capacidad de Absorción del Radical de Oxígeno

PEG: Polietilenglicol

PET: polietileno tereftalato

POHs: Poly- and oligosaccharides derived from hemicellulose/Sacáridos Solubles de

Hemicelulosas de Naturaleza Poli- u Oligomérica

PTM: Presión Transmembrana

RLS: Relación Líquido Sólido

NMR: Nuclear Magnetic Resonance/Resonancia Magnética Nuclear

SOS: Soybean OligoSacharides/Oligosacáridos procedentes de la soja

TBHQ: Terc-butilhidroquinona

TEAC: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity/Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox

TFA: Trifluoroacetic Acid/Ácido Trifluoroacético

TLC: Thin Layer Chromatography/Cromatografía de Capa Fina

TRAP: Total Radical Antioxidant Parameter/ Parámetro Antioxidante de Captación Total de

Radicales

Trolox: Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico

UE: Unión Europea

X: Xilano

XG: Xiloglucano

Xil: Xilosa

Xilp: Xilopiranosa

XOS: Xilooligosacáridos

I. SUMMARY

-3-

Summary

Introduction

In the past few years, the interest in replacing non-renewable fossil raw materials by

renewable feedstocks has increased remarkably. This replacement is mandatory, as the

current model for economic growth (based on extensive utilization of non-renewable

resources) is not sustainable.

Renewable raw materials offer an interesting alternative to fossil resources.

Lignocellulosic materials are the most abundant renewable resource, and outstand for their

widespread occurrence, abundant supply and relatively low cost. They can be utilized by

processes involving their fractionation into the major components (so-called polymeric or

structural components): cellulose, hemicelluloses and lignin. The individual fractions from

processing can be used for multiple purposes.

The aim of this Ph. D. Thesis is to contribute to the knowledge on the manufacture of

value added products from the hemicellulosic fraction of selected lignocellulosic materials

(specially Pinus pinaster wood), by providing quantitative information on the manufacture and

properties of added-value products

.

Summary

-4-

The present work was developed on the grounds of the long term research developed

by the research group EQ-2, which belongs to the Chemical Engineering Department of the

University of Vigo (Faculty of Science, Campus Ourense). The generic subject of the said long

term research can be summarized as the “development of biotechnological and chemical

processes for the valorization of vegetal biomass”.

The experimental work carried out in this Thesis was defined on the basis of the tasks

included in two Spanish Research Projects, belonging to the Spanish National Research Plan,

and funded by the “Ministry of Science and Innovation”. The titles of the Research Projects are

“Properties of new food ingredients with prebiotic properties derived from hemicelluloses”

(reference AGL2008-02072/ALI) and “Development and evaluation of processing methods for

biorefineries” (reference CTQ2011-22972).

Summary

-5-

Biomass and biorefineries

Sustainable development can be defined as «the development that meets the needs of

the present without compromising the ability of future generations to meet their own needs»

(Brundtland Report, 1987). The dependence on fossil resources and their exhaustive use is

certainly an antithesis to sustainability, and mandates search for an alternative (Ghatak, 2011).

From the point of view of sustainability, the development of new manufacturing

technologies based on renewable raw materials is essential. Among the many alternative

sources currently under consideration, lignocellulosic biomass represents a sustainable

solution allowing security of supply and bringing economic advantage, in particular when

cheap raw materials (such as agricultural wastes or forest residues) are employed (Xu et al.,

2008).

Lignocellulosic materials are the most abundant type of biomass, and their efficient

use could open a practical route for the future development of the industry (Ghatak, 2011).

Lignocellulosic materials are renewable, generated at a high rate, appear in disperse locations,

and allow a secure and reliable supply. Primary products from forests, agricultural sources,

industrial byproducts (such as bagasses) or waste materials (such as residues from gardens and

parks) are typical lignocellulosic materials with potential as feedstocks for chemical processing.

Pinus pinaster wood has been the major raw material employed in this Thesis. Pines

are the most widespread softwoods in Spain (MAGRAMA, 2010), and present hemicelluloses

mainly made up of glucomannan, but also containing heteroxylan and other polysaccharides of

minor importance. For a comparative evaluation of the antioxidant capacity of hemicellulose -

derived saccharides, fractions derived from Eucalyptus globulus and rice husks were also

employed as raw materials. This choice was made to assess the differences among products

obtained from feedstocks having heteroxylan as a parent hemicellulosic polymer. E. globulus, a

hardwood, is also one of basic resources from Spanish forests, and present hemicelluloses

mainly made up of glucuronoxylan (MAGRAMA, 2010). Rice husks are cheap agricultural

wastes usually burned or used for farming purposes (Bronzeoak Ltd, 2003), and present

hemicelluloses mainly made up of arabinoxylan.

Reaching an effective utilization of feedstocks is a major issue in the chemical

industries, and the same idea can be directly applied to processes involving alternative,

renewable feedstocks instead of fossil resources. The recent technical progress in chemical

technology and biotechnology makes the efficient utilization of lignocellulosic materials

Summary

-6-

possible. For this purpose, the application of the biorefinery concept to processes based on

lignocellulosic feedstocks is especially attractive, as it enables an integral utilization of the

various feedstock fractions. In general, biorefineries deal with the separation of fractions from

lignocellulosic materials and their further conversion into food, feed, chemicals, materials,

goods or fuels (Cheng and Zhu, 2009). It has been suggested that the development of

biorefineries represents the key to future access to an integrated production of value-added

products, in order to sustain our way of life.

Fractionation of biomass

Lignocellulosic biomass offers potential for the sustainable production of separate

fractions accumulating individual structural components (or products derived from them),

which can be converted into value-added biofuels, materials or chemicals by further

processing. Achieving a cost-effective fractionation of biomass is a crucial aspect for economic

feasibility. By manufacturing multiple products, biorefineries can overcome the difficulties

derived from the heterogeneous nature and complex composition of native lignocellulosic

materials, enabling the production of a number of intermediates and maximizing the yields of

the final products, thus increasing the added value and improving the economic balance.

A number of biomass refining technologies have been considered in literature. Menon

and Rao (2012) reviewed the fractionation processes intending a selective solubilization of

hemicelluloses by hydrothermal processing (carried out in aqueous media in absence of

externally-added acid) or by prehydrolysis (performed in aqueous media in the presence of

externally added acid).

When performed under suitable conditions, the hydrothermal processing of

lignocellulosic materials enables the selective breakdown of hemicelluloses into soluble

fragments, which are transferred to the aqueous phase. As a result of this, two phases are

obtained: aqueous liquors containing soluble hemicellulosic saccharides, and spent solids

made up of small amounts of residual hemicelluloses together with cellulose and lignin.

An alternative approach starts with lignin removal from solid phase (as it happens in

the conventional or organosolv pulping). In many cases, delignification is accompanied by the

partial solubilization of hemicelluloses, yielding a solid of enhanced cellulose content. A

number of delignification (or pulping) processes have been reported in literature, including the

Summary

-7-

commercial technologies for chemical pulp production (sulphite and kraft), and methods based

on organic solvents or alkalis (Gullón et al., 2010c; Menon and Rao, 2012).

Besides the well known applications for pulp or paper manufacture, cellulose is a

starting material for obtaining a wide range of chemicals, from biofuels to bioplastics. For

example, hydrolysis-fermentation of cellulose may lead to fuels, solvents or polyfunctional

organic acids; whereas hydrolysis reactions catalyzed with acids or enzymes yield glucose

solutions suitable as fermentation media. On the other hand, lignin is a carbon-rich polymer

made up of aromatic units. The hydrothermal conversion of lignin is considered as a promising

method to produce not only bioenergy, but also value-added chemicals (Kang et al., 2013).

Hemicellulose Hydrolysis

Concerning the effects of hydrothermal processing on hemicelluloses, the major goal

to be achieved in most cases is the breakdown of polymeric chains into short, soluble

fragments that keep the major structural features of the parent polymer. The major

hemicellulosic polymers present in hardwoods (for example, Eucalyptus globulus wood) or

agricultural materials (for example, rice husks) are heteroxylans (glucuronoxylan and

arabinoxylan, respectively) (Gullón et al., 2010b and 2011a). The hemicellulosic fraction of

softwoods (including Pinus pinaster wood) is made up of a number of polysaccharides. Among

them, glucomannan (with a backbone made up or mannose and glucose, and substitution by

galactosyl moieties, acetyl groups and phenolic acids) is the predominant one, accounting for

about two thirds of the total pine hemicelluloses. The presence of other hemicellulosic

polysaccharides (for example, heteroxylan) in pine wood hemicelluloses has been reported

(Ebringerová et al., 2005; Price et al., 2011).

When the severity of the operational conditions employed in hydrothermal processing

is increased, the major reaction products from hemicelluloses shift from oligosaccharides to

hemicellulosic sugars, from sugars to furans, and from furans to organic acids and

condensation products (Gullón et al., 2010c). When native lignocellulosic materials are

employed as substrates for hydrothermal processing, extractive-derived compounds may also

appear in liquors, and can be recovered when this contributes to the economic feasibility of

the overall process.

Summary

-8-

In summary, complex reaction media are produced when native lignocellulosics are

employed as raw materials for autohydrolysis. Soluble saccharides of polymeric or oligomeric

nature (resulting from the partial hydrolysis of hemicellulosic polymers) are the major

products when operation is performed under standard reaction conditions. However, the

reaction liquors from hydrothermal processing also contain a variety of other compounds,

including sugar-degradation products, organic acids, extractives and phenolics. These non

saccharide components may have added-value, depending on the raw material employed and

on the manufacturing conditions. In many studies, non-saccharide compounds are considered

as contaminants (González-Muñoz et al., 2012).

Refining of hemicellulose-derived oligosaccharides

Owing to the complex composition of autohydrolysis liquors, refining stages have to be

implemented to achieve oligosaccharide concentrates having the degree of purity needed for

specific applications (for example, additives for functional foods).

Low molecular weight oligosaccharides are the preferred hemicellulose-derived

products for food applications. When appropriate, enzymatic complexes containing

endomannanases or endoxylanases (depending on the backbone of the predominant

hemicellulosic polymers) were employed to reduce the average molecular mass of soluble

saccharides derived from hemicelluloses (Chauhan et al., 2012; Gullón et al., 2010b).

Sugars, sugar-decomposition products, and acid soluble lignin are the major non-

saccharide components present in autohydrolysis liquors. Among other physicochemical

methods, membrane technologies (ultra- and/or nanofiltration, operating in concentration or

diafiltration modes in single or multiple stages), and ion exchange have been used for refining

mixtures of hemicellulose-derived saccharides from Pinus pinaster wood, Eucalyptus globulus

wood and rice husks (Persson et al., 2010; González-Muñoz et al., 2011 and 2013b; Gullón et

al., 2011a; Vegas et al., 2008b). The structural features and mass distributions of

oligosaccharides have been assessed using experimental techniques such as HPSEC, HPLC,

HPAEC-PAD and MALDI-TOF-MS (Price et al., 2011; Corradini et al., 2013). The elucidation of

the structural features of poly- oligosaccharides is essential to understand their biological

properties.

Summary

-9-

Evaluation of hemicellulose-derived saccharides as ingredients for functional

foods

Functional foods have been broadly defined as «foods similar in appearance to

conventional foods, which are consumed as part of a normal diet and have demonstrated

physiological benefits and/or reduce the risk of chronic disease beyond basic nutritional

functions» (Hsieh et al., 2010).

Functional foods contain ingredients (such of prebiotics, probiotics, antioxidants,

dietary fibers or vitamins) whose health benefits are well known. The biological properties of

oligosaccharides make them particularly interesting as bioactive additives for functional foods.

Prebiotic properties (Saad et al., 2013; Vidová et al., 2013), antioxidant activity, regulation of

glycemic index, stimulation of mineral absorption or stimulation of innate immune response

are properties reported for oligosaccharides (Moure et al., 2006).

This study includes the evaluation of the prebiotic properties and antioxidant potential

of oligosaccharides obtained by hydrothermal treatment of selected lignocellulosic materials.

Prebiotic properties of hemicellulose-derived saccharides

Gibson and Roberfroid (1995) defined prebiotic as «a non-digestible food ingredient

that beneficially affects the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one or

a limited number of bacteria in the colon, and thus improves host health». Non-digestible

oligosaccharides (NDOs) have been the focus of interest in the development of new prebiotic

ingredients. These NDOs must resist hydrolytic digestion while being susceptible to

fermentation in the large bowel, yielding short-chain fatty acids (SCFAs) and increasing the

populations of beneficial bacteria selectively.

Gibson and Roberfroid (1995) and Roberfroid et al. (2010) have summarized the

following health benefits associated to the intake of prebiotics: reduction of prevalence and

duration of infectious diarrhea, stimulation of intestinal motility and reduction of constipation

signs, reduction of symptoms associated with inflammatory bowel diseases, reduction of colon

cancer incidence, improvement of bioavailability and absorption of minerals, reduction of risk

factors for certain cardiovascular diseases, and promotion of weight loss.

Summary

-10-

In this Thesis, refined soluble saccharides of polymeric or oligomeric nature (POHs)

from Pinus pinaster wood hemicelluloses were employed as fermentation substrates in

experiments carried out with human fecal inocula. In order to measure their prebiotic

potential on a comparative basis, additional experiments were performed under similar

conditions using a well-known commercial prebiotic (a mixture of fructooligosaccharides). The

prebiotic potential of POHs from Pinus pinaster wood was confirmed by assessing the

production of SCFAs and lactate in the fermentation media, as well as by their bifidogenic

ability (confirmed by Fluorescence in situ Hybridization data) (see Annexes I and II).

Antioxidant activity of hemicellulose-derived saccharides

The interest in NDOs has increased in parallel to the increase in knowledge about their

prebiotic properties. On the other hand, their multifunctional character (based on multiple

biological activities, including antioxidant activity) also contributes to the interest of this

research (Patel and Goyal, 2011).

According to a widely used definition, an antioxidant is a substance that, when present

at low concentrations compared to those of an oxidizable substrate (for example, lipids,

proteins or carbohydrates), delays or prevents oxidation of that substrate (Halliwell and

Gutteridge, 1999; Halliwell, 2002). The use of antioxidants in foods may be beneficial for their

potential anti-cancer effects and by their ability to inhibit oxidation reactions that may be

harmful to the organism. The therapeutic use of antioxidants might be appropriate as anti-

inflammatory or anti-ischemic agents, or for preventing thrombus (Mukoda et al., 2001). When

present in functional foods, antioxidants can act as stabilizers during storage and protect

cooked food components from lipid oxidation (Pereira de Abreu et al., 2011).

An experimental assessment on the manufacture, refining and antioxidant activity of

three types of soluble hemicellulosic saccharides (derived from rice husks, Eucalyptus globulus

wood and Pinus pinaster wood) was carried out in the scope of this Thesis. The experimental

data allowed a comparative evaluation of various antioxidant activities, including reducing

power, ability for free radical scavenging and protection from oxidation in emulsion. This

information is of primary importance for the further development of commercial products

combining prebiotic and antioxidant properties (Annex III).

Summary

-11-

Degradation reactions of hemicelluloses-derived saccharides

One attractive option for the valorization of biomass is the production of high added

value products from saccharides. It is well known that monosaccharides can be decomposed in

acidic media, leading to the formation of «platform chemicals» that can be used for obtaining

a variety of commercial products, including fuels, chemicals, and/or biobased materials (Hayes

et al., 2008).

Reported studies provide valuable information on the decomposition pathways of

selected monosaccharides in aqueous acidic media (Kabyemela et al., 1999; Srokol et al., 2004;

Girisuta et al., 2006).

Lü and Saka (2012) studied the reactions of monosaccharides appearing as structural

units in polysaccharides of representative lignocellulosic materials. When operation is carried

out in media containing hot, compressed water, this latter plays a double role, as a reactant

and as a solvent. Isomerization, dehydration and fragmentation products were formed from

the studied substrates, and new reaction mechanisms were proposed. For example, glucose,

mannose and fructose were isomerized each other, while galactose was isomerized to

tagatose and talose. On the other hand, arabinose was isomerized to ribulose and ribose,

while xylose was isomerized to xylulose and lyxose. Additionally, furfural was generated in

some extent from hexoses, and HMF from pentoses. Isomerization and reversion reactions

were also observed in media containing externally added acids (Girisuta et al., 2006; Pagan-

Torres et al., 2012).

Decomposition of hexoses such as glucose, galactose, and mannose in acidic media led

to the formation of formic acid and levulinic acid through a mechanism involving the formation

of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) as an intermediate. HMF is formed by dehydration of

hexoses (Rackemann and Doherty, 2011). In the case of fructose, a direct route explained the

superior HMF yields obtained when using this sugar instead of other hexoses. Oppositely, the

production of HMF from glucose and other hexoses goes through the formation of the enediol,

which is further transformed to HMF via additional intermediates. Rehydration of HMF leads

to the formation of levulinic acid, whose yield is decreased by parasitic reactions leading to the

formation of dark, colored solids usually referred to as humins (Girisuta et al., 2006; Girisuta,

2007).

Following a related mechanism, dehydration of some pentoses (including xylose and

arabinose) in acid-catalyzed media leads to the formation of furfural, which in turn can be

Summary

-12-

converted into formic acid and humins, again with the participation of side reactions (Enslow

and Bell, 2012).

A number of technologies are potentially suitable for the manufacture of furans and/or

levulinic acid from saccharides. In this field, operational methods involving the utilization of

homogeneous acid catalysts, ionic liquids, biphasic media or heterogeneous catalysts have

been employed, depending on the desired reaction product (Amiri et al., 2010; Rackemann

and Doherty, 2011; Pagán-Torres et al., 2012; van Putten et al., 2013).

Manufacture of levulinic acid from hemicellulose-derived saccharides

Levulinic acid is a versatile platform molecule considered as one of the «12 top value-

added chemicals from biomass» in a study funded by the US Department of Energy. It can be

used for manufacturing high-volume organic chemicals with numerous industrial applications,

including utilization as solvents, food flavoring agents, monomers for synthesis of resins or

polymers, plasticizers, herbicides, antifreeze agents and pharmaceuticals (Rackemann and

Doherty, 2011). Several efforts have been oriented towards the production of fuels or fuel

additives: for example, methyltetrahydrofuran (MTHF) or γ-valerolactone can be obtained

from levulinic acid; and this latter can be converted into pentenoate esters or hydrogenated to

pentanoic acid, alkanes or alcohols. In turn, alcohols may be dehydrated to alkenes, which are

further oligomerized to hydrocarbons containing between 6 and 27 carbons. Alternatively, the

deoxygenation of levulinic acid leads to the formation of aromatic and cyclic compounds,

which can be easily converted into fuels (Rackemann and Doherty, 2011).

The hemicellulose-derived saccharides obtained from Pinus pinaster wood by

autohydrolysis processing include hexoses, pentoses, soluble polysaccharides and

oligosaccharides. Glucose, galactose, mannose, arabinose, and xylose are the major monomers

making part of hemicelluloses and polymeric (or oligomeric) saccharides derived from them.

In this study, the liquors from pine wood autohydrolysis were reacted in media

supplemented with dilute sulfuric acid. A set of experiments was carried out operating in

autoclave during selected reaction times at different acid concentrations and temperatures,

and concentration profiles were determined for sugars, furans, formic acid and levulinic acid.

The experimental data were interpreted on the basis of a mechanism involving the following

reactions: conversion of oligomers into monosaccharides, conversion of hexoses into HMF,

Summary

-13-

decomposition of this latter into levulinic and formic acids, dehydration of pentoses into

furfural, and conversion of this latter into formic acid. The kinetic coefficients governing the

various reactions were determined by analysis of data. Under the best conditions assayed, the

yield in levulinic acid accounted for 66% of the stoichiometric value (Annex IV).

Non-isothermal conditions were also employed in experiments performed using a

stirred, pressurized batch reactor. The sulfuric acid concentration was fixed at 1 g/100 g of

solution, and temperature was kept in the range 130-250 ˚C. The levulinic acid yield decreased

when temperature increased, confirming that higher temperatures favoured the reactions

leading to humin formation preferentially respect to the ones leading to HMF formation.

Oppositely, the furfural yield was boosted by temperature. No satisfactory compromise

between the production of levulinic acid (from hexoses) and furfural (from pentoses) was

achieved, owing to the very different kinetic behavior of the respective potential substrates.

HMF was highly susceptible to decomposition in acidic medium, undergoing a fast conversion

into levulinic acid, and reaching just limited maximum concentrations under all the assayed

conditions. The optimal levulinic acid yields were obtained at low temperatures at prolonged

reaction time (Annex V).

Production of furans from hemicellulose-derived saccharides

Furans (including furfural and HMF) have a wide scope of applications in the

manufacture of fine chemicals and plastics (Chheda et al., 2007b; Lange et al., 2012). Furfural

has been identified as one of the key green chemicals, and can be produced in biorefineries

using lignocellulose as a raw material. Furfural is mainly employed for the production of

furfuryl alcohol (for resin manufacture), foundry sand applications, lubricants for oil extraction,

and as a nematicide. Furfural is expected to play an important role in the field of green fuels,

as one of its derivatives (MTHF) makes part of the promising P-series fuels. Interestingly, MTHF

can be mixed with gasoline at 15-55 volume percent without causing adverse effects on the

performance of conventional combustion engines (Department of Energy, USA, 1999). These

fuel mixtures are considered ecofriendly due to their high content of additives coming from

biomass. Additionally, furfural is considered as an important platform chemical with a bright

future, based on its character of sustainable chemical intermediate obtained from renewable

resources (De Jong and Marcotullio, 2010). A study supported by US Department of Energy

Summary

-14-

aiming at the identification of the most promising platform chemicals included furfural among

the 30 most promising ones (Werpy et al., 2004).

Substantial efforts have been directed to develop technologies for manufacturing HMF

from biomass, due to the versatility of this furan as an intermediate for the production of fuels

and chemicals, including levulinic acid (Zhang and Weitz, 2012). HMF can be converted into

biofuels as 2-methylfuran and 2,5-dimethylfuran by catalysis in aqueous media. Alternatively,

it can be oxidized to bifunctional monomers such as 2,5-furandicarbaldehide or 2,5-

furandicarboxilic acid (FDCA), with potential in the manufacture of polymers by

polycondensation reactions. In particular, FDCA can replace terephthalic acid in the

manufacture of polymers, as the properties of the resulting products are similar to the ones of

polyethylene terephthalate (PET) and other polyesters widely used in packaging (Lange et al.,

2012; Zhang and Weitz, 2012).

Monosaccharide processing in aqueous media catalyzed wit acids leads to furans (HMF

and furfural) at limited yields, due to the incidence of rehydration reactions undergone by

furfural (leading to the formation of formic acid) and HMF (resulting in the production of

levulinic acid and formic acid), together with parasitic reactions leading to the formation of

intermediates and humins. On the other hand, isomerization reactions between sugars are

promoted in aqueous media (Lü and Saka, 2012). In this context, biphasic systems show

potential for minimizing side reactions, enabling improved yields of furans. The solvents

employed in literature for furan production in biphasic media include 2-sec-butylphenol and

methyl isobutyl ketone (MIBK) (Weingarten et al., 2010; Pagán-Torres et al., 2012).

Modification of the organic and/or aqueous phases may result in improved yields and/or

selectivities. Dimethyl sulfoxide (DMSO) and 1-butanol have been employed to limit the

rehydration reactions and to improve the extraction selectivity (Román-Leshkov et al., 2006).

This work includes an experimental assessment on the production of furans from

hemicellulosic saccharides obtained by autohydrolysis of Pinus pinaster wood. Operation was

carried out in media made up of two immiscible liquid phases (autohydrolysis liquors and

MIBK). In the first set of experiments, the conversion of saccharides into furans and furan-

derived products was carried out under a variety of operational conditions, in order to assess

the influence of selected variables (volume ratio of organic to aqueous phase, temperature

and reaction time) on the composition of the liquid phases and on the yields of the target

products. The structure of the experimental plan allowed the empirical modeling of

experimental data and the calculation of surface responses describing the interrelationships

Summary

-15-

between dependent and independent variables. The empirical models enabled the

identification of the optimal conditions leading to the maximum furfural production (about

70% of the stoichiometric amount) and to optimal HMF production (about 40% of the

stoichiometric amount). Additional experiments were carried out under selected conditions to

assess the possible benefits derived from the addition of phase modifiers (DMSO and 1-

butanol) to the biphasic reaction media. The experimental data showed that the addition of

DMSO improved the HMF yield by limiting its decomposition into levulinic acid (Annex VI).

II. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS

-19-

1. Materiales Lignocelulósicos

Denominamos materiales lignocelulósicos (MLCs) a los distintos tipos de biomasa de

origen vegetal que tienen como característica común el estar compuestos fundamentalmente

por polisacáridos (celulosa y hemicelulosas) y lignina (un polímero de naturaleza fenólica).

La composición y propiedades de los MLCs los hacen aptos para ser empleados como

materias primas en multitud de procesos. Su carácter renovable, abundancia y bajo coste

aumentan el interés de su utilización a nivel industrial y fundamentan el interés de los estudios

que desarrollan sus aplicaciones potenciales.

1.1. El concepto de biorrefinería aplicado a los materiales lignocelulósicos

El desarrollo sostenible puede definirse como: «satisfacer las necesidades del presente

sin poner en peligro la capacidad de las generaciones futuras para atender sus propias

necesidades» (Brundtland Report, 1987). Para ello, debe limitarse el consumo de los recursos

naturales, y mantenerlo dentro de la capacidad de suministro, así como disminuir la

contaminación y suministrar cantidades suficientes de los productos que se necesitan (Ghatak,

2011).

El modelo actual de producción y consumo no resulta sostenible, al basarse en el

empleo masivo de materias primas fósiles. Desde el punto de vista de la sostenibilidad, se hace

imprescindible el desarrollo de nuevas tecnologías de producción basadas en materias primas

alternativas de carácter renovable capaces de lograr un aprovechamiento eficiente y rentable

de las mismas. Ante un panorama mundial definido por la escasez de materias primas y

Antecedentes bibliográficos

-20-

energía, junto con factores asociados como la emisión de gases de efecto invernadero y

problemas sociológicos relacionados con el mundo agrario, forestal y rural, los materiales

lignocelulósicos se revelan como una fuente de materias primas ubicua y sostenible (López et

al., 2010; Cheng y Zhu, 2009).

El concepto de desarrollo sostenible conlleva la interdependencia entre economía,

medioambiente y sociedad. Dicho concepto se está concretando en iniciativas muy diversas

protagonizadas por distintos sectores de la sociedad que incluyen a consumidores, gobierno e

industria. El desarrollo sostenible implica producir de forma diferente incidiendo en el

aumento de la eficacia y en la reutilización de materiales (Pezzey, 1992).

En este sentido, los nuevos procesos industriales deben ser más respetuosos con el

medio ambiente que los ya existentes lo que permite reducir los costes de fabricación,

promover una producción eficiente y mejorar la calidad del producto. En la industria estos

propósitos pueden lograrse mediante las siguientes estrategias:

i. reemplazando recursos no renovables por recursos renovables, y

ii. desarrollando tecnologías más eficientes, que pueden basarse en la utilización de

residuos o subproductos como materias primas de nuevos procesos.

Los principios generales del desarrollo sostenible pueden aplicarse específicamente a

la industria y a las prácticas industriales. Para ser sostenible, la industria debe reunir los

siguientes requisitos:

- Ser económicamente viable.

- Ser medioambientalmente compatible. Se busca el menor impacto medioambiental

posible, así como la mínima generación de contaminantes.

- Usar los recursos de modo eficiente. Esto puede lograrse a través del desarrollo de

procesos industriales «limpios» sin que se comprometa su rentabilidad.

En los sectores agrícola y forestal existe una gran cantidad de pequeñas y medianas

empresas de transformación primaria en las que se procesan materias primas de origen

vegetal. En algunos casos estas industrias generan residuos o subproductos que podrían

aprovecharse como recursos renovables para obtener a partir de ellos productos de alto valor

añadido.


-21-

Siguiendo este modo de pensar, los MLCs pueden procesarse de un modo

conceptualmente similar a como se trata el petróleo en una refinería, es decir, aislando

distintas «fracciones» que se destinan a diferentes aplicaciones. La bibliografía está prestando

una atención creciente a este modo de operar. De este modo, se ha acuñado el término de

«refinería de biomasa» o «biorrefinería» (Cheng y Zhu, 2009) para hacer referencia a las

instalaciones en las que se lleva a cabo el fraccionamiento y transformación de biomasa para

producir combustibles, energía y/o productos químicos. Esta filosofía se ha considerado

prometedora de cara al desarrollo de una nueva industria basada en el uso de materiales

renovables (Kamm y Kamm, 2007; Clark et al., 2012; Menon y Rao, 2012).

En el fraccionamiento de biomasa lignocelulósica juega un papel importante su

composición, definida por una compleja naturaleza heterogénea. A través de su

fraccionamiento, se intenta aumentar el valor añadido generando múltiples productos. Una

biorrefinería puede, y suele, compaginar la producción de uno o varios productos en pequeñas

cantidades (de elevado valor por unidad de masa) junto con otro u otros de mayor volumen de

producción (pero de menor valor por unidad de masa, como combustibles líquidos, pasta de

celulosa, etc.). En términos de aprovechamiento energético, el calor que se genera durante el

proceso se puede emplear para el autoabastecimiento (total o parcial, complementado con la

posibilidad de producir electricidad por cogeneración), y en su caso, para comercializar

posibles excedentes. En un contexto global, los productos de alto valor aumentan la

rentabilidad, la utilización de residuos como biocombustibles disminuye la necesidad de

importar recursos energéticos y la coproducción de electricidad reduce costes y emisiones de

gases causantes del efecto invernadero (FitzPatrick et al., 2010).

1.2. Los materiales lignocelulósicos como materias primas renovables

Los MLCs son la materia prima de carácter renovable más abundante. Se estima que la

cantidad de biomasa vegetal existente en el mundo es del orden de unas 1,7 1012 toneladas

(Wilkie, 1983; Liu, 2010), y que la tasa de generación alcanza 1,0 1011 −1,2 1011 toneladas por

año (Babbar, 1978; Blanch y Wilke, 1983; Holtzapple, 1993; Thompson, 1995) en donde más

del 80% de la misma corresponde a los MLCs (Hon, 2000).

Atendiendo a su procedencia, los MLCs se pueden clasificar según su origen en las

siguientes categorías (Camacho et al., 1985; Menéndez, 1999; Balat, 2011):


-22-

- Materiales de origen agrícola, compuestos por restos de cosechas, principalmente

tallos y hojas. Como ejemplos, cabe citar paja de trigo, arroz u otros cereales, tallos

de maíz, restos de podas, etc.

- Materiales de origen forestal, de los cuales la madera de los bosques constituye la

fuente principal, con una contribución anual del orden del 70% del total generado.

- Materiales de origen industrial: productos o residuos de procesos industriales

relacionados con la transformación de la madera (celulosa, fibras, astillas, cortezas,

etc.) y procedentes de industrias alimentarias (cascarilla de cebada separada en las

industrias de malteado, residuos de la industria azucarera, restos de frutas, etc.).

- Materiales de origen urbano, procedentes de parques, jardines (como césped y

hojas) o procedentes de actividades humanas (papel usado, cartón, madera

desechada procedente del sector de la construcción, etc.).

En base a las propiedades mecánicas, a las características físicas y a la composición

química, los MLCs también se pueden clasificar en:

- Maderas de resinosas o coníferas (también llamadas «softwoods» o maderas

blandas), que incluyen las especies pertenecientes al orden coniferales que, a su

vez, comprende la mayor parte de las incluidas en la división de las gimnospermas.

Son ejemplos de coníferas las distintas especies de pino (Pinus pinaster, Pinus

radiata, Pinus sylvestris, Pinus nigra, Pinus pinea, etc.), abeto y cedro.

- Maderas de frondosas (también llamadas «hardwoods» o maderas duras), que

incluyen las especies leñosas clasificadas como angiospermas dicotiledóneas (a

veces subdivididas en frondosas boreales, australes y tropicales). Son ejemplos de

maderas frondosas las distintas especies de Eucalyptus, Populus o Betula, así como

Quercus robur, Fagus sylvatica, Castanea Sativa, etc.

- Materiales agrícolas, que engloban principalmente restos de cosechas de naturaleza

herbácea, pajas, arbustos y restos de podas.

Esta clasificación de las maderas en coníferas o frondosas no es de todo correcta, pero

es la más sencilla y reconocida a efectos prácticos. La correcta utilización de estos términos

sería la que indica la taxonomía botánica dentro de las gimnospermas y angiospermas. Con

respecto a los materiales de origen forestal, la bibliografía generalmente emplea la

clasificación en maderas duras o blandas (Sanchez y Cardona, 2008; Hadar, 2013).


-23-

En los últimos años, el desarrollo de procesos para la utilización de estos materiales ha

abarcado dos áreas importantes:

- La obtención de productos químicos, energéticos y nuevos materiales a partir de

fuentes renovables que sustituyan parcial o totalmente a productos

tradicionalmente obtenidos de materias primas fósiles como el petróleo, el gas o el

carbón.

- El aprovechamiento de materiales residuales procedentes de bosques, cultivos e

industrias.

La biomasa forestal constituye la mayor fuente potencial de energía renovable

(Jefferson, 2006; Clark, 2007). Su aprovechamiento completo permitiría, además, la obtención

de una gran variedad de productos químicos. Este hecho exige un desarrollo tecnológico

integrado de todas las etapas desde el cultivo y recolección hasta las etapas de

fraccionamiento y conversión a diferentes productos (Sanders, 2007). Hoy en día, sólo

alrededor del 5% de todos los productos químicos son producidos a partir de recursos

renovables, lo que se considera como muy por debajo de la cantidad potencial.

Normalmente, la bibliografía enfoca el fraccionamiento de los MLCs hacia la

separación de los constituyentes principales (celulosa, hemicelulosas y lignina) susceptibles de

un posterior aprovechamiento individualizado. Además, las materias primas lignocelulósicas

contienen otros compuestos en menores proporciones (por ejemplo: ceras, terpenos, fenoles

simples, etc.) que pueden emplearse para distintas aplicaciones en campos específicos.

Esta tesis se centra principalmente en la valorización de las hemicelulosas de Pinus

pinaster. Además, se ha desarrollado parte del estudio con hemicelulosas de distinto origen

con fines comparativos. Así, se ha estudiado el potencial antioxidante de los productos de

hidrólisis parcial de hemicelulosas de una madera dura (Eucalyptus globulus), un subproducto

agroindustrial (cáscaras de arroz) y una madera blanda (Pinus pinaster). La optimización de los

procesos de obtención de oligosacáridos a partir de hemicelulosas de Eucalyptus globulus y

cáscaras de arroz ya han sido objeto de estudios anteriores de este grupo de investigación

(Vegas et al., 2004; Gullón et al., 2010b; Gullón et al., 2011a y c)

Las cáscaras de arroz son un producto agroindustrial con aplicaciones escasas y de

poco valor comercial, por lo que en la práctica se las puede considerar como un residuo. En el

año 2009, a nivel mundial se produjeron más de 670 millones de toneladas de granos de arroz,

de las cuales aproximadamente un 20% en peso corresponden a las cáscaras. En la mayoría de


-24-

los países productores de arroz la cáscara se quema o emplea con fines ganaderos (Bronzeoak

Ltd, 2003). Dentro del mercado europeo, España es el segundo país productor de arroz

después de Italia, alcanzando una cuota aproximada del 30%.

Respecto a los recursos forestales, a continuación se revisa su disponibilidad. En el

capítulo 3 de esta Tesis se comenta de forma más extensa el modo de obtención de las

distintas fracciones oligoméricas derivadas de las hemicelulosas de Pinus pinaster, Eucalyptus

globulus y cáscaras de arroz.

1.3. Disponibilidad de los recursos forestales

El camino hacia un desarrollo sostenible pasa por la utilización de recursos renovables

para la obtención de compuestos químicos o productos de consumo. La biomasa, en particular

la biomasa lignocelulósica, se ha considerado como una materia prima «necesaria» por

razones de disponibilidad, precio e implicaciones ambientales (en particular, la reducción de

emisiones de CO2).

Tradicionalmente, la principal utilización de las maderas en el sector químico ha sido la

fabricación de pastas (para papel o para disolver). Otros sectores que emplean cantidades

importantes de madera incluyen a la industria del mueble, de la construcción y de

combustibles sólidos.

1.3.1. Superficie forestal

Según la FAO, en 2010 los bosques constituían en torno a 4.033 millones de hectáreas

de la superficie terrestre, lo que suponía el 31% del total. Sin embargo, la superficie forestal no

está distribuida de manera homogénea (ver Figura 1.1). A nivel continental, América tiene un

38% de su área total dedicada a bosque seguida por Europa (incluyendo la Federación de

Rusia) con un 25%, Oceanía con un 21%, África con un 17% y Asia con un 15%.


-25-

Figura 1.1. Distribución de la superficie forestal a nivel mundial: Porcentaje de superficie ocupada de

bosque por país(FAOSTAT, 2010)

Los bosques tropicales y subtropicales comprenden el 56% de la superficie forestal

mundial, y los bosques templados y boreales comprenden la superficie restante. Se estima que

los bosques primarios (bosques de especies nativas en los que no hay muestras visibles de

actividad humana) suman un 36% del bosque total. Los bosques regenerados de modo natural

reúnen cerca del 57%, mientras que los bosques plantados por el hombre representan

aproximadamente el 7% del total.

A nivel de países, la Federación de Rusia acumula el 20% del total de área de bosque

mundial. Siete países cuentan con más de 100 millones de hectáreas cada uno, y los diez países

con mayor riqueza forestal (la Federación de Rusia, Brasil, Canadá, Estados Unidos, China,

República Democrática del Congo, Australia, Indonesia, Sudán y la India) suman el 67% del

total (FRA, 2010). La UE cuenta con 178 millones de hectáreas de bosques y otras tierras

boscosas. Durante los últimos 20 años, los bosques han incrementado su superficie en un 5%,

aunque la tasa varía considerablemente entre países. La superficie forestal de la Unión

Europea en 2010 era de 177,7 millones de hectáreas de las cuales 27,7 millones correspondían

a España, que se situaba como segundo país con mayor superficie forestal de Europa por

detrás de Suecia.


-26-

Dentro de la superficie forestal de la UE-27, la superficie arbolada en 2010 era de

156,9 millones de hectáreas, de las cuales 18,2 millones de hectáreas correspondían a España,

lo que la situaba en el tercer lugar por detrás de Suecia y Finlandia. Desde 1990, España ha

aumentado su superficie arbolada a un ritmo anual del 2,19% muy superior a la media europea

(0,51%), por lo que se convierte en el país de Europa con mayor incremento de superficie de

bosque (91.050 hectáreas/año durante veinte años) y el que aporta más del 40% del

incremento del total europeo (ISFE, 2013) (ver Figura 1.2).

Figura 1.2. Superficie forestal en España (MAGRAMA, 2011)

De la superficie arbolada total nacional, 6,4 millones de hectáreas están ocupadas por

coníferas (34,5% de la superficie forestal arbolada) y 8,6 millones de hectáreas por frondosas

(46,4% de la superficie forestal arbolada), correspondiendo 3,5 millones de hectáreas a

superficies mixtas (19,1% superficie total arbolada) (MARM, 2009). Galicia cuenta con una

superficie arbolada de 1,43 millones de hectáreas dentro de una superficie forestal total de

algo más de dos millones de hectáreas.


-27-

1.3.2. Existencias de madera

Las existencias de madera presentes en el bosque aportan información sobre los

recursos existentes y proporcionan la base para la estimación de las existencias totales y del

carbono contenido en ellas. En 2010, el total de las existencias en los bosques del mundo era

de 527.000 millones de m³ equivalentes a 131 m³/ha. En el año 2010, el volumen maderable

en la UE-27 alcanzó los 24.079 millones de m3. Los países escandinavos y los centroeuropeos

poseen las mayores existencias de Europa. Destacan Alemania, Suecia, Francia y Finlandia que

representaban en conjunto el 48,4% de las existencias forestales en el año 2010.

Durante las dos últimas décadas, el aumento de las reservas en los montes europeos

ha seguido diferentes ritmos según la zona considerada. Países como Dinamarca o España han

aumentado sus existencias en más de un 60% en tan sólo 20 años (64,5 y 62,6%,

respectivamente), una cifra muy superior a la media de la UE-27 (24,4%). Durante el periodo

1975-2010, todas las Comunidades Autónomas españolas han incrementado las existencias

totales en sus bosques. En el caso de Galicia, este incremento ha sido de 62,3 millones de m3.

Con respecto a la evolución de las existencias totales de las diferentes especies forestales en

España, el 53% del incremento de volumen de madera se agrupa en seis especies: Pinus

sylvestris (15,2%), Pinus pinaster (15,0%), Fagus sylvatica (7,7%), Pinus halepensis (7,5%), Pinus

nigra (7,4%) y Quercus ilex (6,8%). En términos cuantitativos, cabe destacar el incremento

experimentado por el Pinus pinaster (43 106 m³). Además, tres especies han incrementado sus

existencias de madera en más de un 200%: Fraxinus sp. (383%), Eucalyptus globulus (263%) y

Quercus pyrenaica/Quercus humilis (227%). Las coníferas acumulan la mayor parte de las

existencias de madera en el conjunto del país (531,5·106 m³, un 57% del total) en comparación

con el 43% aportado por las frondosas (396,2·106 m³) (ISFE, 2013).

1.3.3. Existencias de biomasa y de carbono

La biomasa forestal, expresada en términos de peso seco, es un parámetro importante

para medir la productividad de los ecosistemas, para evaluar su potencial energético y para

estudiar la función de los bosques en el ciclo de carbono. Según la bibliografía, el carbono

fijado en la biomasa es una variable que se correlaciona directamente con las existencias de

biomasa a través del factor 0,48 kg carbono/kg biomasa seca (ISFE, 2013). Este parámetro

suele emplearse también para estimar la cantidad de carbono presente en la materia orgánica

muerta y en el suelo.


-28-

Se estima que los suelos forestales contienen 291.662 millones de toneladas de

carbono, que equivalen a 72,3 toneladas/ha, lo que representa una proporción algo superior al

carbono presente en la biomasa forestal correspondiente. Si se suman los totales de carbono

en la biomasa, en la madera muerta, en la hojarasca y en los suelos, el total estimado de

existencias de carbono en los bosques en 2010 era de 652.000 millones de toneladas, que

equivalen a 161,8 toneladas/ha. Un 44% de esta cantidad se encuentra en la biomasa forestal,

un 11% en la madera muerta y hojarasca, y un 45% en el suelo.

Centrándonos exclusivamente en las cantidades de biomasa forestal y de carbono

fijado en esta, en los países de la UE-27 se aprecia una tendencia creciente en los últimos 20

años. En el año 2010, las existencias de carbono procedentes de la biomasa forestal alcanzaron

los 9.799 millones de toneladas. En la actualidad, los países escandinavos y los centroeuropeos

poseen las mayores existencias de Europa. Destacan Alemania, Suecia, Francia, Polonia y

Finlandia que representan el 57,8% de las existencias de carbono presente en biomasa forestal

(FRA, 2010).

En el año 2010, España aportaba el 4,3% del carbono almacenado en la biomasa

forestal de la UE-27 (actualmente un total de 422 millones de toneladas). La biomasa forestal

asciende a un total de 904,37 millones de toneladas de materia seca con un promedio de 49,4

toneladas/ha. La biomasa forestal en Galicia supone un 13,66% de la existente en España.

1.3.4. Fines productivos de los recursos forestales

Los bosques españoles son marcadamente multifuncionales. Destaca su papel

protector del ecosistema, su función de regulación del ciclo hidrológico y de la biodiversidad,

así como la capacidad productiva de materias primas. En función de esta capacidad productiva,

se pueden clasificar los productos forestales en maderables o no maderables.

- Productos forestales maderables: madera en rollo, leñas y carbón vegetal, o

madera para usos energéticos.

- Productos forestales no maderables: corcho, resinas, setas comestibles, piñones,

etc.

Con respecto a los productos forestales maderables, la producción mundial de madera

en rollo en 2010 fue de 3.405 millones de m³. Asia (30,3%) es el mayor continente productor

seguido de África (20,3%) y de Europa (19,2%). La cifra de producción de leña y carbón vegetal


-29-

se estimaba en 1.867 millones de m³, donde el grueso de la producción corresponde a Asia

(41%) y África (33%). La producción en la UE-27 en el 2010 fue de 421,3 millones de m3. Los

países que presentan actualmente mayor producción en madera de rollo son Suecia, Francia,

Alemania y Finlandia.

Con respecto a la producción de leña y carbón vegetal, el volumen empleado en 2010

fue de 82,9 millones de m3. El aumento de consumo y el uso de la biomasa forestal como una

materia prima de referencia en el sector energético primario han relanzado la producción en

toda la UE-27. Claros ejemplos de este auge son Alemania, que en el periodo 1990-2010

aumentó un 247% su producción, Francia (250% de aumento) o Finlandia (casi el 100%). En el

caso de España no se han producido aumentos reseñables.

En 2010, se produjeron en España 15,6 millones de m³ de madera en rollo y 2,5

millones de m³ de leña y carbón vegetal. A grandes rasgos, los tres principales destinos por

volumen de madera en rollo han sido: aserrado (36%), trituración para pasta de papel (27%) y

trituración para la fabricación de tableros (25%). Por lo que se respecta a la producción de

leña, se emplearon 2,4 millones de toneladas principalmente de coníferas (41% del total).

Pinus pinaster y Eucalyptus globulus fueron las dos especies forestales más destacadas

en los aprovechamientos forestales maderables en España en el año 2010 con 3,2 y 4,8

millones de m³ respectivamente. El 75% de las cortas se realizan en el 14% de la superficie que

se sitúa en la zona atlántica. Si ampliamos al 90% las cortas, estas se producen en el 36% de la

superficie arbolada (ver Tabla 1.1.).


-30-

Tabla 1.1. Volumen de cortas de madera por especie (m3 con corteza, año 2010) (MAGRAMA,

2010)

Especies principales Volumen cortado (m3 con corteza)

CO

NÍF

ERA

S

Pinus pinaster 3.171.485

Pinus radiata 1.552.850

Pinus sylvestris 646.742

Pinus nigra 363.777

Pinus pinea 80.953

Pinus helepensis 238.371

Otras coníferas autóctonas 80.625

Otras coníferas alóctonas (Chamaecyparis,

Larix, Picea y Pseudotsuga)

29.136

FRO

ND

OSA

S

Eucalyptus spp. 4.760.900

Populus spp. 537.307

Quercus robur y Quercus petraea 121.297

Quercus ilex 32.913

Quercus pirenaica 31.251

Castanea sativa 76.543

Betula spp 48.936

Otros Quercus 30.119

Otras frondosas autóctonas 38.315

Otras frondosas alóctonas 14.489

A nivel de comunidades autónomas, Galicia es la comunidad con mayor volumen de

cortas, que supusieron un 57,5% del total nacional y un 65,0% de las cortas de frondosas en el

año 2009. Otras comunidades autónomas con un volumen destacado de cortas son Castilla y

León (11,1% del total) y País Vasco (7,7%) (Ver Tabla 1.2).


-31-

Tabla 1.2. Cortas totales de coníferas y frondosas en distintas comunidades

autónomas (en miles de m3 de madera clasificada sin corteza, año 2009) (ISFE, 2013)

Comunidad Autónoma Frondosas Coníferas Total

Andalucía 357 48 405

Aragón 67 17 84

Asturias 130 483 586

Canarias 5 3 8

Cantabria 16 319 335

Castilla La Mancha 145 21 166

Castilla y León 819 470 1.289

Cataluña 355 92 448

Com. Valenciana 4 1 5

Extremadura s.d. s.d. s.d.

Galicia 2.876 3.264 6.141

Islas Baleares 6 1 7

La Rioja 24 46 70

Madrid 15 4 18

Murcia 1 0 1

Navarra 171 139 310

País Vasco 355 129 484

ESPAÑA 5.318 5.038 10.357

1.4. Estructura de la pared de las células de los materiales lignocelulósicos

La célula vegetal posee distintas capas que se van formando a lo largo de su

crecimiento y desarrollo. Los materiales sintetizados en el interior de la célula se excretan a

través de la membrana plasmática, de forma que la capa más antigua está localizada en la cara

exterior de la pared celular y la capa más joven se dispone hacia el interior de la misma.

La pared de las células vegetales tiene como funciones fundamentales: i) proteger el

interior de la célula; ii) dar rigidez a la estructura celular y iii) ser mediadora en las relaciones

de la célula con su entorno (absorción, transpiración, translocación, secreción, etc.). Dentro de

la pared celular se distinguen (Greil, 2001):

- Lámina media o sustancia intercelular (LM, 0,2-1,0 μm de espesor). Corresponde al

espacio intercelular y está formada básicamente por sustancias pécticas o, en el caso de


-32-

los materiales leñosos, por lignina. Entre el 70% y el 90% de la lignina total de la madera

se encuentra situada en esta capa.

- Pared primaria (Pared P, 0,1–0,2 μm de espesor). Está formada por microfibrillas de

celulosa entrecruzadas e inmersas en la matriz hemicelulósica. El grado de

polimerización de la celulosa dentro de esta pared varía entre 2.000 y 6.000. Se forma

inmediatamente después de la división celular, antes de que la célula complete su

crecimiento. Normalmente es delgada, aunque puede alcanzar un grosor considerable.

Cuando las paredes son gruesas, pueden mostrar una clara laminación debida a las

variaciones en la composición de los sucesivos incrementos.

- Pared secundaria (Pared S). Sigue a la pared primaria en orden de aparición. Es

fuertemente refringente al microscopio debido a la alta proporción de celulosa. El grado

de polimerización varía menos que en el caso de la pared P, presenta un valor medio de

13.000 y alcanza, en algunos casos, valores de hasta 15.000. Generalmente, consta de

tres capas con características físicas y químicas diferentes que se denominan, de fuera

hacia adentro, S1 (capa externa), S2 (capa medial o central) y S3 (capa interna).

S1 (0,1-0,2 μm de espesor): las microfibrillas están alineadas paralelamente y

empaquetadas formando una estructura densa en forma de hélice.

S2 (1,5 μm de espesor): es la capa más gruesa de la pared celular. Las microfibrillas

se encuentran alineadas en paralelo con respecto al eje celular.

S3 (0,1-0,2 μm de espesor): las microfibrillas se orientan transversalmente con

respecto al eje celular.

La Figura 1.3 presenta la estructura morfológica de los MLCs y de la pared de sus

células (McGinnis y Shafizadeh, 1991; Fan et al., 1987; Sjöström, 1993; Plomion et al., 2001).


-33-

Figura 1.3. Morfología de la pared de la célula vegetal

Atendiendo a la ordenación a nivel submicroscópico, la pared celular puede

considerarse constituida por dos fases con naturaleza fibrilar y amorfa, respectivamente:

- La fase fibrilar está formada por cadenas lineales de celulosa que pueden alcanzar 4

μm de longitud. Las cadenas celulósicas se asocian formando subunidades de

aproximadamente 3×4 nm (fibras elementales o fibrillas) que, a su vez, se unen por

enlaces de hidrógeno intermoleculares formando microfibrillas con un espesor


-34-

aproximado de 25 nm, base de la conformación estructural de la celulosa (Figura

1.4).

Figura 1.4. Composición y organización de la pared celular

En la pared primaria las microfibrillas están entrelazadas y dispuestas

aparentemente al azar, mientras que la diferenciación de la pared secundaria en

capas resulta principalmente de la orientación de las microfibrillas: en la primera

casi horizontal, en la siguiente casi vertical y en la tercera nuevamente casi

horizontal.

- La fase amorfa está formada por hemicelulosas, polisacáridos no celulósicos (como

xilano, glucano, galactano, manano y xiloglucano), pectinas y glucoproteínas. Las

hemicelulosas recubren las microfibrillas de celulosa y actúan como puente de unión

entre ellas y la lignina. Las pectinas son polímeros formados por moléculas de ácidos

urónicos. Las proteínas de la pared celular son ricas en los aminoácidos serina e

hidroxiprolina y están ligadas con azúcares como arabinosa, glucosa y galactosa. Se

cree que dichas glicoproteínas actúan como elementos estructurales porque forman

cadenas que pueden ligar entre sí otros componentes.

Las fibras elementales son las unidades estructurales más pequeñas de la celulosa. En

las fibras elementales las regiones cristalinas se alternan con las regiones amorfas que

presentan longitudes entre 4 y 35 nm (la longitud se determina, en términos generales, como

la distancia entre dos zonas amorfas sucesivas) (Krässig, 1993).


-35-

Las microfibrillas, que son las unidades estructurales más pequeñas que conforman las

fibras, pueden estar constituidas por subunidades no uniformes de varios μm de longitud y

espesores entre 10 y 50 nm dependiendo del origen de la celulosa (Fink et al., 1990). La

morfología de la celulosa se puede entender como una arquitectura organizada de elementos

fibrilares. Las fibras de celulosa son organizaciones de microfibrillas que forman las capas de

las paredes celulares y dan lugar a canales, poros e intersticios.

La forma, volumen y distribución de tamaños de poro, de canales, e intersticios juegan

un papel decisivo en las reacciones heterogéneas de los MLCs al controlar tanto la

accesibilidad de las especies químicas a los lugares reactivos de las cadenas de celulosa como

el transporte de productos de reacción hacia el exterior. El volumen total de poros y la

distribución de tamaños de estos se ven afectados por los procesos de hinchamiento y de

secado de estos materiales.

1.5. Composición de los materiales lignocelulósicos

Los MLCs contienen como promedio 49% de carbono, 44% de oxígeno, 6% de

hidrógeno y cantidades menores de nitrógeno y elementos inorgánicos (como sodio, potasio,

calcio, magnesio y sílice). Todos los MLCs tienen en común la presencia de una estructura en la

que los componentes fundamentales (celulosa, hemicelulosas y lignina) se han formado por

procesos fotosintéticos. La celulosa desempeña una función estructural en la célula vegetal. La

lignina actúa como un adhesivo natural en la pared celular, lo que le confiere rigidez a la

planta, actuando como barrera física contra hongos e insectos y facilitando el transporte de

agua a través del sistema vascular; mientras que las hemicelulosas proporcionan una interfase

para la unión de la celulosa con la lignina (Ten y Vermerris, 2013; Alonso et al., 2012) (Figura

1.5).


-36-

Figura 1.5. Componentes estructurales de los MLCs (Alonso et al., 2012)

Las proporciones relativas de los distintos componentes varían de unos MLCs a otros,

por lo que se encuentran también diferencias significativas dentro de una misma especie

debido a distintos factores como el origen, localización física, edad y condiciones de

crecimiento del espécimen considerado (Hafizoglu y Usta, 2005; Hall et al., 1973; Jeffries,

1994; Pereira y Sardinha, 1984; Wodzicki, 2001).

Al analizar los MLCs los distintos componentes se engloban en dos grupos:

- Componentes estructurales de la pared celular: incluyen la celulosa, hemicelulosas

y lignina que representan en conjunto entre un 80-90% del peso total del material

lignocelulósico.

- Componentes no estructurales: incluyen agua, sustancias extraíbles, cenizas y otros,

que son fracciones minoritarias dentro del material lignocelulósico.


-37-

En la Figura 1.6 se presenta un esquema de los distintos componentes que forman los

MLCs:

Figura 1.6. Componentes estructurales y no estructurales de los MLCs

1.5.1. Componentes estructurales

Los componentes estructurales, de naturaleza polimérica, constituyen la pared celular

de los MLCs. Representan la parte más importante desde el punto de vista cuantitativo y

confieren firmeza y protección a la célula. Estos componentes estructurales de los MLCs se

encuentran interpenetrados y unidos mediante interacciones químicas y físicas (Carpita y

Gibeaut, 1993). Dentro de ellos se pueden distinguir dos tipos: lignina (constituida por

unidades fenilpropano oxigenadas) y polisacáridos (constituidos por unidades de azúcares).

Atendiendo a los azúcares constituyentes de los polisacáridos, podemos diferenciar entre

celulosa (cuya unidad estructural es la glucosa) y hemicelulosas (constituidas por diferentes

monosacáridos) (Alonso et al., 2012). La Tabla 1.3 muestra el contenido de los distintos

componentes estructurales de MLCs de diferentes orígenes, así como las fuentes bibliográficas

empleadas en su elaboración.

Material lignocelulósico

Componentes estructurales Componentes no estructurales

Material orgánico

Material inorgánicoPolisacáridosLignina

Hemicelulosas Extractos Cenizas AguaCelulosa


-38-

Tabla 1.3. Contenido en celulosa, hemicelulosas y lignina de diferentes MLCs (% en peso sobre el total

de material seco)

Materia prima Celulosa Hemicelulosas Lignina Referencia

MADERAS RESINOSAS

Maderas resinosas 40-44 25-29 25-31 Hon, 2000

Pinus pinaster 39,2-42 20,29-17,6 28,53-30,2 Parajó et al., 1993;

González-Muñoz et al., 2013a

Abeto 44 6 27,5 Sassner et al., 2008

Salix 42,5 15,0 26,0 Sassner et al., 2008

MADERAS FRONDOSAS

Maderas frondosas 43-47 25-35 16-24 Hon, 2000

Eucalyptus globulus 46,3 25,8 22,9 Garrote et al., 2007

Acacia dealbata 50,5 19,3 21,9 Muñoz et al., 2007

Alamo 44,0 15,71 20,9 Pan et al., 2006

MATERIALES AGRÍCOLAS

Cascarilla de avena 26,6 30,2 21,4 Claye et al., 1996

Cascarilla de arroz 24,4 31,4 18,4 Claye et al., 1996

Cascarilla de trigo 32,2 31,9 5,2 Claye et al., 1996

Paja de centeno 37,6-44,1 22,2-30,5 19,0-22,9 Fan et al., 1987;

Gullón et al., 2010a

De modo genérico se pueden deducir algunas tendencias generales respecto a las

proporciones de los componentes estructurales en los MLCs:

- Celulosa: maderas de frondosas > maderas de resinosas > materiales agrícolas.

- Hemicelulosas: materiales agrícolas > maderas de frondosas > maderas de

resinosas.

- Lignina: maderas de resinosas > maderas de frondosas > materiales agrícolas.

1.5.1.1. Celulosa

La celulosa es un polímero lineal formado por unidades de glucosa unidas mediante

enlaces β (14). Los enlaces β forman cadenas lineales altamente estables y resistentes a los

tratamientos químicos debido a los puentes de hidrógeno que se forman entre cadenas

vecinas de celulosa (ver Figura 1.7).


-39-

Figura 1.7. Estructura de la celulosa

Cada cadena tiene entre 300-15.000 unidades de glucosa dispuestas linealmente. Las

cadenas se disponen ordenadamente formando estructuras cristalinas unidas por puentes de

hidrógeno inter e intramoleculares.

Una fibrilla elemental contiene en torno a 36 cadenas de celulosa; 20 fibrillas

elementales forman una microfibrilla (como las que se encuentran en la pared primaria de la

célula); 250 microfibrillas forman una fibrilla y, por último, unas 1.500 fibrillas forman una fibra

de celulosa.

La estructura supramolecular determina muchas de las propiedades físicas y químicas

de la celulosa. Las uniones por puentes de hidrógeno entre las cadenas de celulosa hacen que

los polímeros sean rígidos, lo que impide la flexión de las moléculas y dificulta la hidrólisis de

los enlaces glucosídicos.

La celulosa confiere a los MLCs la mayor parte de su resistencia y representa la fracción

mayoritaria con proporciones del 40-50 % para maderas y del 25-40% en materiales agrícolas.

1.5.1.2. Hemicelulosas

Las hemicelulosas son un grupo de heteropolisacáridos constituidos por cadenas

cortas y ramificadas de azúcares (ver Figura 1.8), entre los que destacan pentosas

(generalmente D-xilosa y L-arabinosa), hexosas (como D-galactosa, D-glucosa y D-manosa), así

como ácidos urónicos (ácidos glucurónico, 4-O-metilgalacturónico y galacturónico) y

desoxihexosas (ramnosa y fucosa) (Pérez et al., 2002; Girio et al., 2010). Los grupos hidroxilo

de los azúcares constituyentes pueden estar parcialmente sustituidos por grupos acetilo

(Kenne et al., 1975). La naturaleza ramificada de las hemicelulosas determina su carácter

amorfo, y la facilidad con que transcurren las reacciones de hidrólisis de los polímeros para dar


-40-

lugar a sus azúcares constituyentes. Las hemicelulosas son más fáciles de solubilizar e

hidrolizar que la celulosa (Ebringerová et al., 2005).

Figura 1.8. Estructura química de las unidades estructurales de las hemicelulosas

Dentro de la pared celular las hemicelulosas tienen como función servir de interfase

entre la celulosa y la lignina a través de puentes de hidrógeno entre los grupos –CH2OH de las

cadenas de celulosa y los oxígenos glicosídicos de las hemicelulosas.

Las hemicelulosas representan entre un 10-45% en peso seco de los MLCs. En estado

natural se encuentran en forma amorfa con un grado de polimerización de aproximadamente

200-300. Existen dos tipos principales de hemicelulosas: los xilanos y los glucomananos (Girio

et al., 2010). Los xilanos son las hemicelulosas mayoritarias en las paredes celulares de las

maderas duras y de las plantas herbáceas, y constituyen el 20-30% en peso de los materiales.

Los glucomananos se encuentran mayoritariamente en la pared celular de las maderas

blandas.

De forma genérica, los MLCs se diferencian en el tipo y contenido en polímeros

hemicelulósicos (Wenzl, 1970; Ebringerová et al., 2005; Scheller y Ulvskkov, 2010):


-41-

- En las maderas duras predominan los xilanos, polímeros de unidades β-xilopiranosa

unidas por enlaces β-1,4 que presentan ramificaciones. En los xilanos los grupos

hidroxilo pueden estar sustituidos con grupos 4-O-metilglucurónico unidos por enlaces

α-1,2 y por grupos acetilo unidos a través de enlaces éster en las posiciones 2 y 3 del

anillo de pentosa. Los glucomananos se encuentran en las maderas duras en menores

cantidades en forma de polímeros lineales de glucosa y manosa unidos por enlaces β-

1,4 con predominio de las manosas. No presentan ramificaciones ni grupos

sustituyentes laterales.

- En las maderas blandas el esqueleto de los xilanos es idéntico al de las maderas duras,

presentando sustitución por grupos 4-O-metilglucurónico unidos por enlaces α-1,3. Los

glucomananos de las maderas blandas, que poseen mayor proporción de manosa que

los de las maderas duras, tienen dos tipos de sustituyentes: los grupos acetilo unidos

por enlaces éster a las posiciones 2 y 3 del esqueleto del azúcar, y la galactosa unida

mediante enlaces α-1,6 (Ebringerová et al., 2005).

En la pared celular, las hemicelulosas funcionan como almacén de sustancias de

reserva y realizan funciones reguladoras (la hidrólisis enzimática de las hemicelulosas genera

oligosacáridos que presentan actividad biológica), estructurales y de control de la expansión

celular.

Dado que este tema es uno de los puntos centrales de esta Tesis Doctoral, se

proporciona información más extensa en el Capítulo 3, que se desarrollará particularizándolo

para las hemicelulosas de Pinus pinaster, Eucalyptus globulus y cáscaras de arroz.

1.5.1.3. Lignina

La lignina representa típicamente entre un 10-25% en peso seco de los MLCs. Rodea y

protege a las fibras de celulosa lo que le da una mayor rigidez a las células,

impermeabilizándolas y protegiéndolas de ataques enzimáticos (Ten y Vermerris, 2013).

Se trata de un polímero tridimensional amorfo formado por la polimerización de

unidades de fenilpropano que implica la formación de diferentes tipos de enlaces que se

alternan de manera desordenada. La mayoría de la lignina se encuentra situada en el espacio

intercelular y en la pared primaria de la célula. Se va depositando a lo largo de la vida de la

célula comenzando por el espacio intercelular.


-42-

Los monómeros que forman la lignina son los denominados alcoholes cinamílicos, que

se diferencian entre sí por la diferente sustitución del anillo aromático. Así, el alcohol p-

cumarílico, que da lugar a las unidades de p-hidroxifenilo, no presenta ningún sustituyente; el

alcohol coniferílico, que da lugar a las unidades guayacilo, presenta un grupo metoxilo en la

posición 3 del anillo aromático; mientras que el alcohol sinapílico, que da lugar a las unidades

siringilo, presenta dos grupos metoxilo en posiciones 3 y 5 de dicho anillo. La lignina es el

polímero natural más complejo en relación a su estructura y heterogeneidad por lo que no es

posible adscribirle una estructura definida.

Algunos valores orientativos del contenido en lignina en las células maduras son del 20

al 26% en las maderas de frondosas y del 26 al 32% en las maderas de resinosas (Glasser, 1990;

Holtzapple, 1993). Las maderas duras están constituidas principalmente por unidades de

guayacilo (56%) y siringilo (40%), mientras que las maderas blandas presentan

mayoritariamente unidades de guayacilo (80%) y el p-hidroxifenilo supone un 14 % (Jung y

Fahey, 1983).


-43-

Figura 1.9. Estructura modelo de la lignina de una madera blanda (Laine, 2005)

1.5.2. Componentes no estructurales

Son aquellos componentes de los MLCs que no forman parte de la estructura de la

pared celular. Están presentes en cantidades que pueden llegar al 40% en peso del MLC, pero

normalmente su contenido es del 5-10%. Las fracciones químicas no estructurales comunes a

los MLCs se citan en los siguientes apartados (Fan et al., 1982).


-44-

1.5.2.1. Agua

Procede de los fluidos biológicos de la planta y del carácter higroscópico de los MLCs.

Su proporción depende de las condiciones ambientales.

1.5.2.2. Cenizas

Corresponden a sustancias inorgánicas que se suelen determinar por incineración del

material a 575 - 850˚C. Sus componentes mayoritarios son carbonatos, fosfatos, oxalatos y

silicatos de calcio, potasio y magnesio, así como sílice (Anglès et al., 1997).

El contenido en cenizas varía de una manera sustancial con el MLC considerado: en la

madera es inferior al 1%, mientras que en fibras de herbáceas alcanza mayores valores. Ciertas

pajas de cereales como el trigo y la avena tienen porcentajes superiores al 3% y las cascarillas

de granos llegan incluso a 8-14% (Stewart et al., 1997; Parajó et al., 2004; Vegas et al., 2004;

Palmarola-Adrados et al., 2005).

1.5.2.3. Extractos

Corresponden a fluidos biológicos de las plantas (savia, resina). Se caracterizan por ser

fácilmente separables del MLC por la acción de vapor o de disolventes orgánicos (sin necesidad

de que exista reacción química). Se incluyen dentro de este grupo carbohidratos de bajo peso

molecular, terpenos, ácidos alifáticos y aromáticos, alcoholes, flavonoides, lignanos, taninos,

alcaloides, ceras, etc. Sus funciones en la célula vegetal son de reserva de nutrientes y de

protección frente a agentes externos (Coppen et al., 1993, 1998).

1.5.2.4. Proteínas

Las proteínas se encuentran presentes en los MLCs en pequeñas cantidades y son

inherentes al origen biológico de los MLCs. Están unidas covalentemente a la lignina y a los

polisacáridos que actúan como puente de unión entre ellos.

-47-

2. Biorrefinería.

Fraccionamiento de Materiales Lignocelulósicos

El aprovechamiento de los MLCs puede llevarse a cabo sometiéndolos a etapas de

fraccionamiento para obtener alguno o varios de sus principales constituyentes (celulosa,

hemicelulosas y lignina) en corrientes separadas, de modo que pueda realizarse un

procesamiento individualizado de los mismos. Esta es la idea en la que se basa la «refinería de

biomasa» o «biorrefinería» (Myerly et al., 1981; FitzPatrick et al., 2010; Liu et al., 2012)

Los procesos de fraccionamiento de los MLCs hacen uso de las diferentes propiedades

químicas que presentan sus componentes estructurales. La celulosa y las hemicelulosas son

más difíciles de oxidar que la lignina, pero, a diferencia de ésta, son hidrolizables por ácidos.

Las disoluciones alcalinas a temperaturas moderadas no afectan ni a la lignina ni a la celulosa,

pero provocan la solubilización de las hemicelulosas. A temperaturas más altas se produce la

rotura de los enlaces éter de la lignina y la degradación de la celulosa.

En el fraccionamiento de los MLCs se busca que el proceso sea selectivo. Esto implica

que la separación de un determinado componente se realice afectando lo menos posible a los

demás. El componente de interés debe recuperarse con altos rendimientos, con las mínimas

etapas de proceso, y siempre teniendo en cuenta la viabilidad económica (Bozell et al., 1995;

Liu et al., 2012).


-48-

2.1. Tratamientos para la solubilización de hemicelulosas

La degradación de las hemicelulosas puede lograrse mediante distintos tipos de

tratamientos. En alguno de ellos se obtienen oligómeros, de grado de polimerización variable

con patrones de sustitución que dependen del material de partida y del modo de operación.

Otros posibles productos del procesamiento son monosacáridos y productos de degradación

de éstos. A continuación se resumen los métodos empleados para solubilizar las hemicelulosas

más importantes desde el punto de vista de este estudio.

2.1.1. Tratamientos con agua

2.1.1.1. Autohidrólisis

Este proceso consiste en tratar la biomasa vegetal con agua a temperaturas en el

intervalo 150 - 230˚C. Se pretende lograr una despolimerización selectiva de las hemicelulosas

por la acción catalítica de los iones hidronio procedentes del agua y de los compuestos

generados in situ (tales como ácido acético, ácidos urónicos y ácidos fenólicos), para dar como

principales productos de reacción oligómeros, azúcares, productos de descomposición de

monosacáridos y ácido acético, en proporciones que dependen del material tratado y de las

condiciones de operación empleadas (Garrote et al., 1999 y 2002; Kabel et al., 2002; Gullón et

al., 2012; González Muñoz et al., 2012).

La hidrólisis de los MLCs es un proceso complejo. Entre los factores que influyen en la

reacción se encuentran el tamaño de partícula, la relación sólido/líquido, la temperatura y el

tiempo de reacción (Taherzadeh et al., 1997), así como la configuración y grado de

polimerización de las macromoléculas y su interacción con proteínas y elementos minerales

(Kosaric et al., 1983).

Las uniones éter heterocíclicas de las hemicelulosas son las más susceptibles a este

tipo de reacción. Su rotura conduce a la formación de oligosacáridos de distinto grado de

polimerización. Puede producirse además la hidrólisis de los grupos acetilo presentes en la

fracción hemicelulósica de las materias primas (Lawford y Rousseau, 1993). Esta reacción

libera ácido acético, que aporta iones hidronio (la especie química que cataliza reacción de

hidrólisis de las hemicelulosas) (Carvalheiro et al., 2004, González-Muñoz et al., 2013a). Los

ácidos urónicos pueden también contribuir a la generación de iones hidronio, pero sus efectos

no están bien establecidos (Conner, 1984).


-49-

A lo largo de los tratamientos de autohidrólisis se produce la rotura de las cadenas de

polisacáridos hemicelulósicos en fragmentos de tamaño cada vez menor, lo que conduce a la

formación de oligómeros, luego a la de monosacáridos y finalmente a productos de

degradación de éstos (en condiciones de operación severas). En los medios de reacción

pueden aparecer oligómeros, azúcares, furanos, ácidos carboxílicos y componentes fenólicos

derivados de los extractos y de la lignina (Clark y Mackie, 1984). El furfural y el 5-

hidroximetilfurfural (HMF) son los furanos más importantes, formados por deshidratación de

pentosas y hexosas respectivamente (Liu et al., 2012).

Dentro de los componentes formados a partir de la lignina (Clark y Mackie, 1984;

Larsson et al., 1999; Timilsena et al., 2013) se encuentran ácido vainíllico, ácido 1,4-

hidroxibenzoico, 4-hidroxibenzaldehído, ácido cumárico, siringaldehído, ácido siríngico,

cinamaldehído, alcohol dihidroconiferílico, hidroquinona, catecol y ácido homovaníllico. Otros

compuestos citados en la bibliografía como componentes de los medios de reacción son

formaldehído, maltol, 2-hidroximetilfurano, dihidroxiacetona, gliceraldehído y metilglioxal

(Jönsson et al., 1998).

En presencia de proteínas y aminoácidos, los oligosacáridos y monosacáridos

generados durante los tratamientos de autohidrólisis (que presentan capacidad reductora)

pueden dar lugar a la reacción de Maillard (Dendy, 2001). Entre los productos de la reacción de

Maillard se incluyen compuestos volátiles de bajo peso molecular como alcoholes, cetonas,

aldehídos, éteres, ésteres y componentes heterocíclicos como el furfural (Shibamoto et al.,

1994). También se forman compuestos menos volátiles con peso molecular medio-alto, tales

como polifenoles, polipéptidos y pigmentos (Mastrocola et al., 2000).

2.1.1.2. Explosión con vapor

Se basa en someter al MLC a una inyección directa de vapor saturado a altas

temperaturas durante periodos de tiempo cortos. A continuación se provoca una

despresurización rápida, para que los materiales sufran fuertes alteraciones estructurales

(Romaní et al., 2013).

La despresurización provoca la evaporación de agua condensada en el MLC, creando

fuerzas que provocan la separación de las fibras, principalmente de las zonas más débiles

(celulosa amorfa). Además, se causa la hidrólisis de los grupos acetilos de las hemicelulosas,

formándose ácido acético. Durante el tratamiento se rompen los enlaces lignina-hidratos de


-50-

carbono, y como resultado se consigue un producto fibroso cuya celulosa es accesible a las

enzimas. La fracción hemicelulósica se despolimeriza en mayor o menor medida, dependiendo

de las condiciones del tratamiento. La lignina apenas se altera y puede ser extraída fácilmente

por mezclas de etanol, metanol, acetona y acetato de etilo (Wallis y Wearne, 1985), y utilizada

para diferentes fines.

Entre los factores que influyen sobre el tratamiento de explosión con vapor se

encuentran el tiempo, la temperatura, el tamaño y el contenido en humedad del MLC (Duff y

Murray, 1996). La incorporación de ácido sulfúrico o dióxido de carbono en la explosión con

vapor puede mejorar el proceso de hidrólisis, disminuir los subproductos y lograr una

solubilización eficiente de las hemicelulosas (Morjanoff y Gray, 1987; Fang et al., 2011).

2.1.2. Tratamientos con ácidos

La despolimerización de las hemicelulosas por hidrólisis ácida (prehidrólisis ácida) se

basa en el ataque electrofílico de iones hidronio a los enlaces éter heterocíclicos que unen las

unidades estructurales de los polisacáridos. Habitualmente se usan ácidos como el sulfuroso,

sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, nítrico y fórmico (Galbe y Zacchi, 2002), aunque sólo el

sulfúrico y el clorhídrico se emplean a escala industrial. Puede operarse con ácidos

concentrados, que deben recuperarse después de la hidrólisis para hacer el proceso

económicamente viable (Sivers y Zacchi, 1995), o con ácidos diluidos, que tienen como

principal ventaja un bajo consumo de catalizador, pero que requieren altas temperaturas para

alcanzar rendimientos de conversión aceptables (Menon y Rao, 2012). A pesar de que los

tratamientos con ácidos diluidos mejoran significativamente la hidrólisis, su coste es superior a

procesos como la explosión con vapor.

La prehidrólisis ácida produce la solubilización de azúcares hemicelulósicos, volviendo

la celulosa más susceptible a la hidrólisis a un coste relativamente bajo (Torget et al., 1990).

Por lo general, las hemicelulosas de maderas blandas (compuestas principalmente por

hexosas) son más resistentes a la hidrólisis ácida que las hemicelulosas de maderas duras

(compuestas principalmente por pentosas) (Pereira, 2003). El tratamiento con ácido en

condiciones más severas conduce a la formación de productos de degradación como furfural y

HMF (Hsu, 1996; McMillan, 1994; Taherzadeh y Karimi, 2007).

En presencia de 0,5-1,5% de H2SO4 y a temperaturas entre 120 y 200 ˚C, se solubilizan

entre 80 y 90% de las hemicelulosas de los MLCs convirtiéndolas en sus azúcares


-51-

monoméricos. La despolimerización transcurre según reacciones de primer orden

dependientes de la temperatura y de la concentración de ácido (Bienkowski et al., 1987;

Rafiqul y Sakinah, 2012).

2.1.3. Tratamientos alcalinos

La extracción alcalina es una técnica que se puede emplear para la separación de

hemicelulosas (Gabrielii et al., 2000). Generalmente se emplean disoluciones acuosas de

hidróxido de sodio, potasio, litio, bario, calcio y/o hidróxido amónico. Las más utilizadas son las

de hidróxido de sodio o potasio, ya que proporcionan mayores rendimientos (Lawther et al.,

1996).

Con este tratamiento se produce la solubilización de hemicelulosas, pero también

lignina (Menon y Rao, 2012), además de la saponificación de ésteres (urónicos y acético). La

extracción alcalina conduce al aislamiento de hemicelulosas deacetiladas.

Al contrario que los tratamientos ácidos o hidrotérmicos, los tratamientos alcalinos

son mucho más efectivos para solubilizar lignina, pero menos efectivos para solubilizar

celulosa. El MLC tratado con hidróxido de sodio diluido sufre hinchamiento («swelling»),

provocando un aumento de la superficie interna, una disminución del grado de polimerización

y de la cristalinidad, así como una separación entre la lignina y los polisacáridos (Jackson et al.,

1977).

2.1.4. Tratamientos con hemicelulasas

Las hidrólisis de las hemicelulosas a monómeros u oligómeros puede llevarse a cabo

empleando enzimas (hemicelulasas). Las hemicelulasas se nombran y clasifican según el

sustrato sobre el que actúan, y se emplean comercialmente en campos tales como

alimentación, producción de biocombustibles, de productos químicos con valor añadido, y en

las industrias para la fabricación del papel (Mussatto et al., 2010; Valls et al., 2010; Zhu et al.,

2010). Para los objetivos de este estudio, presentan particular interés las enzimas que se

emplean para la obtención de oligosacáridos. Cuando se ingieren con la dieta, los

oligosacáridos hemicelulósicos causan efectos beneficiosos para la salud, por lo que se han

utilizado como suplementos en alimentación y en aplicaciones farmacéuticas (Xu et al., 2009).

Las hemicelulasas se obtienen a partir de distintas fuentes, incluyendo hongos, bacterias,

levaduras, algas, insectos y semillas (Peng et al., 2012).


-52-

Dentro de las hemicelulasas, las xilanasas actúan sobre los xilanos, que son los

principales componentes de las hemicelulosas en las maderas duras y las plantas herbáceas;

mientras que las mananasas actúan sobre por mananos (glucomananos o

galactoglucomananos) abundantes en las maderas de coníferas. La cinética y el rendimiento de

las reacciones de hidrólisis de hemicelulosas catalizadas por enzimas depende de parámetros

estructurales de los sustratos tales como la longitud de la cadena, la cantidad de

ramificaciones y el patrón de sustitución (Li et al., 2000).

La acción de las enzimas hemicelulásicas sobre la cadena de hemicelulosas es un

proceso complejo que implica efectos sinérgicos y cooperativos entre distintas actividades

(Latha y Muralikrishna, 2009; Polizeli et al., 2005; Peng et al., 2012).

2.1.4.1. Xilanasas

Las xilanasas son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces xilosídicos

presentes en el arabinoxilano, glucuronoxilano y arabinoglucuronoxilano. En base a su acción

catalítica, las D-xilanasas se han clasificado en los siguientes grupos (Gírio et al., 2010; Peng et

al., 2012; Polizeli et al., 2005).

- Endoxilanasas: 1,4-β-D-xilanohidrolasa o endo-1,4-β-xilanasa (EC 3.2.1.8) y endo-

1,3-β-xilanasa (EC 3.2.1.32). Catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-β-D-xilosídicos y

1,3-β-D-xilosídicos, respectivamente, rompiendo los enlaces glicosídicos en la

cadena de xilano de modo que se reduce el grado de polimerización del sustrato.

- Exoxilanasas: exo-1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y exo-1,3-β-xilosidasa (EC 3.2.1.72),.

Catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-β-D y 1,3-β-D de los extremos no reductores de

los xilanos, respectivamente, de modo que se liberan unidades de D-xilosa. Estas β-

xilosidasas actúan preferentemente sobre xilooligosacáridos (XOS) de cadena corta y

xilobiosa. Según Polizeli et al. 2005, la actividad de las exoxilanasas es inversamente

proporcional al grado de polimerización.

Cuando los sustratos presentan ramificaciones, la hidrólisis de las hemicelulosas se ve

favorecida por la presencia de enzimas que catalicen la hidrólisis de las cadenas laterales

(Ryabova et al., 2009; Polizeli et al., 2005). Entre ellas se encuentran:

- α-D-glucuronidasa (EC 3.2.139): hidroliza las uniones entre el ácido glucurónico y

cadena de xilano que se encuentran en sustratos tipo glucuronoxilano.


-53-

- Arabinasas: hidrolizan la arabinosa sustituida en las posiciones 2 y 3 de las unidades

estructurales de la cadena de xilano. Pueden ser de dos tipos: a) exo-α-L-

arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), que actús sobreα-L-arabinofuranosidos,

arabinoxilanos y arabinogalactanos; b) endo-α-L-arabinasa (EC 3.2.1.99), que

hidroliza arabinanos lineales.

- Acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.6): cataliza la hidrólisis de los grupos acetilo unidos a

la cadena de xilano.

- Ácido ferúlico esterasa y ácido p-cumárico esterasa (EC 3.1.1.-): hidrolizan los

enlaces éster en el xilano, liberando los ácidos fenólicos (ácido ferúlico y p-cumárico,

respectivamente), que suelen encontrarse unidos a los residuos arabinofuranósido

(Chávez et al., 2006; Luo, 2006).

Young et al. (2006) evaluaron la acción del concentrado enzimático comercial Rapidase

Pomaliq (obtenido a partir de cultivos de Aspergillus niger y Trichoderma reesei) sobre zuros de

maíz para producir XOS sustituidos con unidades de arabinosa. Gullón et al. (2010b)

emplearon endoxilanasas para reducir el grado de polimerización de los XOS obtenidos a partir

de las cascarillas de arroz, obteniendo oligómeros con grados de polimerización en el intervalo

4 - 7.

Vázquez et al. (2002) evaluaron la hidrólisis enzimática de XOS obtenidos por

autohidrólisis de madera de eucalipto empleando el concentrado enzimático comercial

Hemicellulase 90 (que incluía actividades endoxilanásica, exoxilanásica y acetil xilano esterasa).

Operando en condiciones seleccionadas, la reacción de hidrólisis alcanzó al 98% de los

sustratos, produciéndose xilosa, disacáridos, ácido acético y trisacáridos.

Algunos autores (Barl et al., 1991; Zhu et al., 2006) consideran que la obtención de XOS

a partir de MLC mediante tratamiento enzimático puede emplearse complementariamente a

pretratamientos químicos con ácidos (H2SO4, H3PO4) o bases (NaOH).

2.1.4.2. Mananasas

El azúcar mayoritario de la cadena principal de los mananos (incluyendo el

galactoglucomanano, GaGM) es la D-manosa. Para la rotura de la cadena principal del GaGM

(que presenta también unidades de glucosa) a oligómeros es necesaria la acción de las

siguientes enzimas. (Moreira y Filho, 2008; Chauhan et al., 2012):


-54-

- Endomananasas: la endo-1,4-β-mananasa (EC 3.2.1.78) escinde los enlaces internos

β-1,4- de las cadenas principales, formando nuevas cadenas más pequeñas. La

acción de esta enzima se ve muy influenciada por el patrón de sustitución de la

cadena principal.

- Exomananasas: la β-manosidasa (EC 3.2.1.25) hidroliza las unidades de manosa que

se encuentran ligadas al el extremo no reductor de los oligosacáridos (incluyendo la

manobiosa).

- β-glucosidasa: 1,4-β-D-glucosido glucohidrolasa (EC 3.2.1.21) hidroliza la 1,4-β-

glucopiranosa del extremo no reductor de los oligómeros (Dhawan y Kaur, 2007).

Las enzimas involucradas en la hidrólisis de las ramificaciones de las cadenas

principales de los mananos incluyen (Dhawan y Kaur, 2007; Wyman, 2003):

- α-galactosidasa: la 1,6-α-D-galactósido-galactohidrolasa (EC 3.2.1.22) hidroliza los

enlaces α-1,6- galactopiranosilo que unen las unidades de galactosa a las cadenas

principales de los mananos.

- Acetilmanano esterasa (EC 3.1.1.6): hidroliza los grupos acetilo unidos a las cadenas

de los mananos (Shallom y Shoham, 2003).

Existe una gran variedad de bacterias, actinomicetos, levaduras y hongos que

producen mananasas (Puchart et al., 2004). Parte de las mananasas de origen microbiano se

segregan extracelularmente, y se explotan comercialmente. Las especies productoras más

importantes son Bacillus sp, Streptomyces sp., Caldibacillus cellulovorans, Caldicellulosiruptor

Rt8B y Caldocellum saccharolyticum (Hatada et al., 2005; Morris et al., 1995; Sunna et al.,

2000; Zhang et al., 2006).

Várnai et al. (2011) estudiaron el efecto sinérgico de xilanasas y mananasas en la

hidrólisis de maderas blandas. Stålbrand et al. (2004) trabajaron con β- mananasas y α-

galactosidasas sobre hemicelulosas obtenidas de abeto. En la literatura existen recientes

revisiones bibliográficas sobre la producción, propiedades y aplicaciones de las mananasas

(van Zyl et al., 2010; Chauhan et al., 2012).

2.1.4.3. Inactivación e inhibición

Las enzimas pueden inactivarse por efecto del calor, pH y agitación mecánica. Una

enzima actúa de manera más eficiente cuando la concentración de sustrato está en exceso,


-55-

condiciones en que se obtiene la máxima generación de producto por unidad de enzima

(Wiseman, 1995).

Los iones de metales pesados como mercurio, plata y plomo pueden inhibir la acción

enzimática, así como cationes de calcio, magnesio, cobre, cobalto, sodio, níquel, potasio,

manganeso, hierro y cinc; en tanto que aniones como yoduro, cloruro y bromuro pueden

actuar como activadores en casos específicos (Badui, 2005).

Jung y Deetz (1993) han propuesto tres posibles causas para justificar la limitación de

la hidrólisis enzimática de las hemicelulosas en presencia de lignina: inactivación por

compuestos fenólicos, existencia de enlaces éster entre la lignina y polisacáridos que limitan el

acceso de enzimas a carbohidratos específicos; y presencia de un ambiente hidrófobo creado

por la lignina, que dificulta la acción de las enzimas. Los mismos autores evaluaron cada una de

estas causas considerando que la hidrofobicidad y la inactivación no afectan en gran medida a

la degradación, en tanto que la presencia de enlaces éster es el factor limitante de la

despolimerización de las hemicelulosas.

2.2. Tratamientos de deslignificación

Los procesos de deslignificación tienen como objetivo la despolimerización y

solubilización de la lignina, dejando la celulosa en la fase sólida. Durante estos tratamientos las

hemicelulosas pueden degradarse parcial o totalmente.

2.2.1. Métodos en medio acuoso

Los principales métodos son:

- Método a la sosa: producen una deslignificación menos intensa y selectiva que los

procesos de producción de pasta química al sulfito o al sulfato. Se emplea para

obtener pastas de calidad limitada, pero presenta la ventaja de la ausencia del

azufre en los reactivos, un aspecto positivo desde el punto de vista medioambiental

(Hong et al., 2013).

- Método al sulfito: utiliza SO2 y sales amónicas o cálcicas como reactivos, que

provocan la solubilización de las hemicelulosas y la lignina. Presenta como ventajas

frente al proceso a la sosa el obtener altos rendimientos en pastas de celulosa de


-56-

elevada blancura. Es uno de los métodos comerciales para la producción de pasta

química de celulosa.

- Método al sulfato: también conocido como método kraft, utiliza Na2S y NaOH en

condiciones severas para solubilizar la lignina y las hemicelulosas produciendo unos

licores (denominados «lejías negras») que contienen productos de degradación de

lignina y hemicelulosas. Las lejías negras se concentran y queman para la obtención

de energía y recuperar los reactivos. La pasta de celulosa que se obtiene posee una

alta resistencia mecánica. Es la tecnología más empleada a nivel mundial (Segura et

al., 2012, Vila et al., 2011).

2.2.2. Métodos en medio orgánico («organosolv»)

Su objetivo es la obtención de pasta química de celulosa y se pueden llevar a cabo en

condiciones más suaves que los métodos convencionales. La deslignificación se produce por la

acción de un disolvente (como acetona, etanol, metanol, ácido acético o ácido fórmico) en

presencia o ausencia de catalizadores (como ácidos, antraquinona o sales). Se logra una

deslignificación selectiva y una lignina poco alterada químicamente (Vázquez et al., 1991). En

este tipo de tratamientos la separación de la lignina de los productos de descomposición de las

hemicelulosas se puede realizar con facilidad, simplemente por concentración de los licores y

adición de agua (que provoca la precipitación de la fracción fenólica) (Vila et al., 2003).

Algunos procesos organosolv son: Acetocell, Acetosolv, ALCELL, ASAM, Batelle-Geneva,

Formacell, Milox y Organocell (Parajó et al., 1995; Zhao et al., 2009).

2.3. Tratamientos de hidrólisis de la celulosa

La celulosa es el polisacárido más resistente a la hidrólisis, debido a la presencia de

puentes de hidrógeno intra- e intermoleculares, a su estructura parcialmente cristalina y a su

alto grado de polimerización. La sacarificación de la celulosa puede llevarse a cabo en medios

catalizados con ácidos o enzimas.

2.3.1. Hidrólisis ácida

La fracción celulósica de los MLCs puede llevarse a cabo en presencia de ácidos (como

el H2SO4, HCl o H3PO4) diluidos o concentrados (Orozco et al., 2011). La hidrólisis de celulosa

catalizada con ácidos diluidos tiene la ventaja de utilizar bajas cantidades de catalizador,


-57-

minimizando problemas de corrosión en los equipos y de neutralización para procesos

posteriores (por ejemplo, fermentación). La celulosa consta de dos fracciones (cristalina y

amorfa) que presentan distinta susceptibilidad a la hidrólisis (Goldstein, 1983). La reacción

puede generar productos no hidrolizables a glucosa (denominados celulosa modificada u

oligómeros no hidrolizables) (Bouchard et al., 1989) junto con glucosa y productos de

degradación de ésta, como HMF.

En la hidrólisis de la celulosa catalizada por ácidos concentrados se destruye la

estructura cristalina por la rotura de los puentes de hidrógeno existentes entre las moléculas

que conforman el polímero. Una de las ventajas de este modo de operar es que la

despolimerización se realiza en un tiempo corto a temperaturas moderadas, minimizándose

las reacciones de degradación en comparación con la de los ácidos diluidos.

2.3.2. Hidrólisis enzimática

La hidrólisis enzimática de la celulosa presente en MLC nativos requiere de

pretratamientos para aumentar la susceptibilidad de los sustratos. La reacción necesita de un

«complejo enzimático», en que actúan de forma sinérgica tres tipos de actividades (Griggs et

al., 2011; Griggs et al., 2012a):

- Endoglucanasas: la β-(1,4)-glucano-glucanohidrolasa (EC 3.2.1.4)ataca los enlaces

internos de la celulosa de baja cristalinidad produciendo una rápida reducción del

índice de polimerización promedio (Nidetzky y Steiner, 1993).

- Exoglucanasas: la β-(1,4)-celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) cataliza la rotura de los

enlaces extremos presentes en la celulosa amorfa, en la celulosas cristalina y en

oligosacáridos de glucosa, liberando celobiosa.

- Celobiasa: la β-(1,4)-glucosidasa (EC 3.2.1.21) cataliza la hidrólisis de la celobiosa y

de las unidades de glucosa de los extremos no reductores de los oligosacáridos de

cadena corta para dar glucosa (Carrillo, 2002; Griggs et al., 2012b).

La actividad catalítica de las celulasas depende de su capacidad para adsorberse al

sustrato y formar el complejo activo enzima-sustrato. Este último aspecto está influenciado

por factores que afectan al sustrato, tales como configuración física, morfología, cristalinidad y

estructura química (Focher et al., 1991), por características propias de la proteína enzimática

(Klyosov et al., 1986; Rabinovich et al., 1983), por las concentraciones relativas de sustrato y


-58-

enzima, por la temperatura (Ooshima et al., 1983) y por factores que afectan a la transferencia

de materia en el medio de reacción (Wang et al., 2013).

La hidrólisis de la celulosa mediante celulasas se ve dificultada por la presencia de

lignina, que constituye una barrera física que impide la penetración de las enzimas (Kumar et

al., 2012). Chang y Holtzapple (2000) consideran que el grado de cristalinidad es otro factor

que limita la acción hidrolítica.

Los procesos enzimáticos presentan un importante ahorro de energía y equipamiento

en comparación con la hidrólisis ácida, ya que las reacciones se realizan con especificidad, a

temperaturas moderadas y en medios no corrosivos (Duff y Murray, 1996).

2.3.3. Tratamientos con líquidos iónicos

Los líquidos iónicos están constituidos por iones, y a menudo se definen como sales

fundidas en estado líquido a temperaturas inferiores a 100 °C (en muchos casos, incluso a

temperatura ambiente). Los iones que lo componen tienen un gran volumen, por lo que las

fuerzas atractivas entre ellos son menores que en el caso de las sales iónicas convencionales, y

de ahí sus bajos puntos de fusión. Sin embargo presentan viscosidades elevadas que dificultan

su utilización: por ejemplo, los fenómenos de transporte se ven inhibidos, lo que resulta un

inconveniente en procesos en los que sean importantes la transmisión de calor o la

transferencia de materia (Mäki-Arvela et al., 2010; Gericke et al., 2012; Wang et al., 2012).

Generalmente el catión es de naturaleza orgánica y contiene alguna estructura cíclica

(Da Costa et al., 2013; Mäki-Arvela et al., 2010). Entre los más utilizados se encuentran el

BMIM (1-butil-3-metil imidazolio), EMIM (1-etil-3-metil-imidazolio), AMIM (1-alil-3-

metilimidazolio) y el DMEA (N,N-dimetiletanolamonio). Los aniones utilizados suelen ser más

sencillos: los más comunes son el ión cloruro y el ión acetato, pero también se han empleado

aniones de mayor tamaño (lisinato, glicinato), y otros con estructuras cíclicas

(alquilbencenosulfonato y xylenosulfonato) (Da Costa et al., 2013).

Los líquidos iónicos se presentan como una alternativa a los procesos de

fraccionamiento convencionales. Son capaces de disolver rápidamente los MLCs a temperatura

moderadas. En muchos casos no se logra la disolución total de los sustratos, pero sí su

desestructuración, lo que facilita posteriores tratamientos enzimáticos o químicos (Dadi et al.,

2006; Gírio et al., 2010). Wang et al. (2012) y Da Costa et al. (2013) han publicado extensas


-59-

recopilaciones de datos sobre la disolución de MLCs en líquidos iónicos, analizando la

influencia del tipo de líquido iónico, el tamaño de partícula, temperatura, duración del

tratamiento, material lignocelulósico empleado, y presencia de agua. Una vez disuelto el

material, la adición de un disolvente adecuado permite la precipitación selectiva de las

fracciones constituyentes del material inicial.

Los líquidos iónicos son una alternativa a considerar dentro de los disolventes de

celulosa. Se han publicado estudios sobre aplicaciones en las que actualmente se utilizan otros

disolventes, tales como la obtención de celulosa regenerada en la fabricación de viscosa o de

celofán, o la producción de fibras Lyocell con NNMO (óxido de N metil morfolina).

Adicionalmente, pueden emplearse para obtener derivados de celulosa en medio homogéneo

(Heinze y Liebert, 2001). Por ejemplo, Wu et al. (2004) llevaron a cabo la acetilación en cloruro

de 1-alil-3-metilimidazolio, obteniendo acetatos de celulosa con un amplio rango de grados de

sustitución; mientras que Turner et al. (2004) llevaron a cabo la regeneración de celulosa

disuelta en varios líquidos iónicos para preparar películas conteniendo lacasas. Gericke et al.

(2012) han recopilado información sobre los estudios realizados en la obtención de derivados

de celulosa en medio homogéneo usando líquidos iónicos, y han señalado las dificultades y

desventajas que deberían superarse. Entre éstas citan: la pureza de los líquidos iónicos, cuyas

propiedades son muy sensibles a la presencia de impurezas; la viscosidad, que resulta

demasiado elevada incluso en el caso de aquellos líquidos iónicos más favorables (en los que la

variación con la temperatura no sigue una conducta tipo Arrhenius, lo que dificulta los

procesos de disolución o hilado); su carácter hidrófilo, que contrasta con la naturaleza

hidrófoba de muchos de los reactivos a emplear, que causa incluso problemas de miscibilidad;

su propia reactividad, que puede hacerles participar en las propias reacciones que se llevan a

cabo; la reciclabilidad, que resulta imprescindible debido a los altos precios; y la toxicidad de

alguno de ellos.

-61-

3. Hemicelulosas

3.1. Clasificación de las hemicelulosas

Las hemicelulosas son una clase heterogénea de polímeros, que pueden estar

formados por pentosas (β-D-xilosa, α-L-arabinosa), hexosas (β-D-manosa, β-D-glucosa, α-D-

galactosa) y/o ácidos urónicos (ácidos α-D-glucurónico, α-D-4-O-metilgalactourónico y α-D-

galactourónico). También pueden estar presentes otros azúcares, como la α-ramnosa y la α-L-

fucosa, y los grupos hidroxilo de los azúcares pueden estar parcialmente sustituidos con

grupos acetilo (Gírio et al., 2010). Las hemicelulosas se clasifican según los monómeros que

conforman la cadena principal del polímero y, eventualmente, sus ramificaciones.

Como norma general, los xilanos son los componentes principales de las hemicelulosas

contenidas en las maderas duras y en las plantas herbáceas, mientras que las hemicelulosas

que contienen mananos como componentes mayoritarios (glucomananos o

galactoglucomananos) son típicas de las maderas blandas. En las maderas duras también se

pueden encontrar mananos en pequeñas cantidades. En la Tabla 3.1 se muestran los

principales tipos de polisacáridos presentes en hemicelulosas (Peng et al., 2012; Gírio et al.,

2010), indicando su origen y naturaleza. A continuación se describen con más detalle los

polímeros hemicelulósicos más importantes.


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Tabla 3.1. Principales polisacáridos presentes en las hemicelulosas (Gírio et al., 2010; Peng et al., 2012)

Polisacáridos Origen biológico

Contribución (% peso seco)

Estructura Grado de Polimerización

Cadena principal Enlaces Ramificaciones Enlaces

Arabinogalactano Maderas blandas

1-3,5 D-Galp β-(1-3) β-D-Galp β-(1-6) 100-600

α-L-Araf α-(1-3)

β-L-Arap β-(1-3)

Xiloglucano Maderas duras 2-25 D-Glup y β-(1-4) β-D-Xilp β-(1-4)

Gramíneas D-Xilp β-D-Galp α-(1-3)

α-L-Araf β-(1-2)

α-L-Fucp α-(1-2)

Acetil α-(1-2)

Galactoglucomanano Maderas blandas 10-25 D-Manp y β-(1-4) β-D-Galp α-(1-6) 40-100

D-Glcp Acetil

Glucomanano Maderas blandas 2-5 D-Manp y β-(1-4) 40-70

Maderas duras D-Glup

Galactomanano Semillas de leguminosas D-Manp β-(1-4) β-D-Galp α-(1-6)

Glucuronoxilano Maderas duras 15-30 D-Xilp β-(1-4) 4-O-Me-α-D-GlupA α-(1-2) 100-200

Acetil

Arabinoglucuronoxilano Gramíneas 5-10 D-Xilp β-(1-4) 4-O-Me-α-D-GlupA-β-L-Araf α-(1-2) 50-185

Cereales α-(1-3)

Maderas blandas

Arabinoxilano Cereales 0,15-30 D-Xilp β-(1-4) α-L-ArafFeluloy α-(1-2)

α-(1-3)

Glucuronoarabinoxilano Gramíneas 15-30 D-Xilp β-(1-4) α-L-Araf α-(1-2)

Cereales 4-O-Me-α-D-GlupA α-(1-3)

Acetil

Homoxilano Algas 2-15 D-Xilp β-(1-4) y β-(1-3)

Nomenclatura: Gal: Galactosa; Glu: Glucosa; Xil: Xilosa; Man: Manosa; Ara:Arabinosa; p: configuración piranosa; f: Configuración furanosa; A: ácido


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3.1.1. Glucomananos

Se encuentran en la pared secundaria de las gimnospermas (pino, abeto…), y en menor

medida en las angiospermas. La cadena principal de los glucomananos (GMs) está compuesta

por una secuencia aleatoria de unidades de glucosa y manosa unidas por enlaces β-(1-4)

(Figura 3.1). Entre el 2 y 5% del peso seco de la mayoría de maderas duras corresponde a GMs,

con una proporción manosa:glucosa en el intervalo 1:1-2,3:1 (Timell, 1967; Shimizu, 2001;

Laine, 2005).

Figura 3.1. Estructura del GM en maderas duras (Laine, 2005)

En los GMs de maderas blandas, como el álamo o el abedul, el grado de polimerización

es en torno a 16 (Teleman et al., 2003), y el grado de acetilación, asociado a los carbonos C-2 o

C-3 de la manosa es aproximadamente de 0,3. Ciertos polisacáridos mucilaginosos, como el

obtenido del parénquima de Aloe vera, contienen más del 90% de manosa y cantidades

pequeñas de glucosa y galactosa (Ebringerová et al., 2005).

El glucomanano de konjac (KGM), extraído del tubérculo de la planta Amorphophallus

konjac, es el más conocido. Posee una proporción manosa:glucosa de 1,6:1 (Gao y Nishinari,

2007). Algunos autores (Cescutti et al., 2002) proponen una distribución al azar de las unidades

de glucosa y manosa, mientras otros (Katsuraya et al., 2003) sostienen que la distribución es

compleja, pero no aleatoria. La secuencia GGMMGMMMMMGGM constituye la unidad básica

y repetitiva de la cadena polimérica de este constituyente de las hemicelulosas, donde «G»

representa la D-glucosa y «M» la D-manosa. Existen ramificaciones cada 50-60 unidades de

monosacáridos de la cadena principal, unidas a la misma mediante enlaces β-(1-3) y formadas

por 11-16 monosacáridos (Williams et al., 2000). Asimismo, existe un grupo acetilo cada 9-19

unidades de azúcar (Maekaji, 1974).


-64-

El KGM posee una gran capacidad para retener agua, formando disoluciones muy

viscosas. Se ha demostrado que es muy eficaz en tratamientos antiobesidad por la sensación

de saciedad que produce, como remedio al estreñimiento al aumentar el volumen fecal, como

agente reductor del colesterol interfiriendo en el transporte del colesterol y de los ácidos

biliares, o como agente hipoglicémico e hipoinsulinémico disminuyendo los niveles de glucosa

e insulina. El KGM también tiene aplicación como prebiótico. Se ha demostrado que el

suplemento diario de KGM promueve la fermentación colónica e incrementa la población de

bacterias saludables (Bifidobacteria y Lactobacillus) a nivel intestinal (Al-Ghazzewi et al., 2007;

Chen et al., 2006 y 2008). A sus propiedades beneficiosas se contraponen inconvenientes

como la posibilidad de causar flatulencia y dolor abdominal (González et al., 2004; Chua et al.,

2010).

3.1.2. Galactoglucomananos

El galactoglucomanano (GaGM) es el componente mayoritario dentro de las

hemicelulosas de las maderas blandas (entre un 10 y un 25% del peso de la madera), y es

minoritario en el caso de las maderas duras (Sjöström, 1993; Laine, 2005; Peng et al., 2010).

La cadena principal de GaGMs está formada por una secuencia aleatoria de glucosa y

manosa unidas por enlaces β-(1-4). Las ramificaciones de galactosa se unen a las unidades de

manosa de la cadena principal a través de enlaces β-(1-6) (Tabla 3.1 y Figura 3.2).

El GaGM puede estar parcialmente acetilado (acetilgalactoglucomanano, AcGaGM),

donde los grupos acetilo se unen por enlaces ester a las posiciones 2 y 3 de las unidades de la

cadena principal (Ebringerová et al., 2005; Laine, 2005). Su contenido en grupos acetilo está en

torno a un 6%, lo que supone un promedio de 1 grupo acetilo por cada 3-4 unidades de

hexosas (Alén, 2000). La Figura 3.2 muestra la estructura del GaGM de maderas blandas.


-65-

Figura 3.2. Estructura del GaGM en maderas blandas (Laine, 2005)

El AcGaGM de maderas blandas está dividido principalmente en dos fracciones: una

minoritaria, con una relación aproximada galactosa:glucosa:manosa de 1:1:3, y otra

mayoritaria con un menor grado de sustitución por galactosa (relación aproximada de 0,1:1:4).

El grado de polimerización oscila entre 100 y 150, que se corresponde con una masa molecular

de 16000-24000 Da. En la madera de abeto rojo en torno a un 65% de las unidades de manosa

de su GaGM aparecen acetiladas en las posiciones C-2 y C-3, con una relación de 2,2:1,0

(Willför et al., 2003; Willför et al., 2008). La manosa y algunas unidades de glucosa están

parcialmente sustituidas en el C6 con unidades de galactosa. Lundqvist (2002) determinó

relaciones molares de galactosa:glucosa:manosa de 0,1:1:4 en el GaGM de madera de abeto

(Picea abies), en el que las unidades de manosa pueden encontrarse acetiladas.

Las proporciones de galactosa, glucosa y manosa en los GaGM pueden afectar a la

solubilidad, de modo que cuanto mayor es la abundancia de galactosa y de grupos acetilo

mayor es la solubilidad del GaGM en agua (Timell, 1967; Peng et al., 2012, Jacobs y Dahman

(2001) (Tabla 3.2). La solubilidad en agua del AcGaGM está influenciada por el grado de

acetilación, que impide la formación de enlaces intra- e intermoleculares entre las cadenas

del polisacárido. Existen distintos métodos de extracción y purificación, que influyen en el

rendimiento y en la estructura del AcGaGM resultante. Un interesante método usado a gran

escala es la ultrafiltración de disoluciones de AcGaGM de las aguas de procesado de pasta

mecánica obtenida a partir de madera de abeto rojo (Willför et al., 2008). Además, como se ha


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comentado en el capítulo 2, existen enzimas de acción específica que permiten modificar la

estructura del AcGaGM, y que constituyen valiosas herramientas para estudios de

interrelaciones estructura-función (Dhawan y Kaur, 2007).

Tabla 3.2. Relación molar de los constituyentes de GaGM (Jacobs y Dahman,

2001)

Materia

prima

Modo de

obtención Pureza (%) Relación molar Ga:G:M

Abeto A 35 21:29:100

Abeto B 90 16:24:100

Pino A 29 24:35:100

Pino B 92 9:22:100

Alerce A 44 11:43:100

A) Con disolución acuosa de KOH al 24%

B) Con disolución acuosa de KOH al 24% después de precipitación con Ba(OH)2

Ga (galactosa); G (glucosa); M (manosa)

Se han descrito diversas aplicaciones para los AcGaGMs. Willför et al. (2008) indican

que los AcGaGMs de madera de abeto rojo pueden emplearse en la fabricación de papeles

especiales, en la industria textil (en la fabricación de ropa resistente a la abrasión), o en el

campo de la medicina (en la obtención de vendajes antibacterianos). Hartman et al. (2006) han

obtenido biopelículas resistentes a la grasa, capaces de actuar como barreras frente al oxígeno

y al vapor de agua; así como otros aspectos de interés para su posible uso en el

empaquetamiento de alimentos.

Recientes estudios han confirmado el carácter bioactivo de oligosacáridos obtenidos a

partir de de AcGaGMs o GaGMs (Ebringerová et al., 2008; Polari et al., 2012). En este campo, la

gama de posibles aplicaciones es amplia, incluyendo su uso como prebióticos o productos

farmacéuticos. Faber et al. (2011) emplearon oligosacáridos de GaGMs como suplemento

alimentario para perros, y obtuvieron resultados que confirman sus propiedades nutricionales.

Además, este tipo de compuestos puede emplearse en los sectores cosmético y alimentario,

como estabilizantes y emulsificantes.


-67-

Otro campo de aplicación es el desarrollo de hidrogeles. Söderqvist-Lindblad et al.

(2004) obtuvieron hidrogeles por polimerización controlada en agua de 2-hidroxietil

metracrilato y AcGaGMs modificados químicamente, en una proporción en peso 1:1.

3.1.3. Galactomananos

Los galactomananos (GaMs) se encuentran en el endospermo de las semillas de

algunas leguminosas. Están formados por una cadena de unidades de manosa unidas entre sí

por enlaces β-(1-4), en la mayoría de los casos con ramificaciones formadas por unidades de

galactosa unidas por enlaces β-(1-6) (Dea yMorrison, 1975; Shobha et al., 2005).

Dependiendo del vegetal del que se hayan extraído, los GaMs tienen distinto grado de

ramificación, lo que influye de forma esencial sobre sus propiedades físico-químicas (Moreira y

Filho, 2008). Cuando el grado de ramificación es pequeño, la función más importante es de

carácter estructural, proporcionando dureza y protección (como sucede con las semillas de

palmeras) (Aspinall, 1959). Al aumentar el grado de ramificación, el polisacárido se hace más

soluble, aumentando su participación en funciones de transporte de agua dentro de los tejidos

de la planta (De Lima, 2000). Los casos extremos son los de la goma de la palmera sago

(Metroxylon sagu), que no tiene prácticamente ramificaciones de galactosa, en comparación

con la goma de fenogreco (Trigonella foenum-graecum L.), que tiene ramificaciones en todas

las unidades de manosa.

Entre los GaMs de semillas de leguminosas que se utilizan comercialmente se

encuentra la goma de fenogreco, la goma de tara, la goma de guar (Cyamopsis tetragonolobus)

y la goma de algarroba (Ceretonia siliqua) (Wu et al., 2009). Poseen estructuras semejantes

siendo su principal diferencia el contenido en galactosa, que alcanza los siguientes valores:

goma de algarroba, 4:1: goma de tara, 3:1; goma de guar, 2:1; y goma de fenogreco, 1:1 (Battle

y Tous, 1997; McCleary y Neukom, 1982; Haddarah et al., 2014). Las proporciones relativas

entre las unidades constituyentes afectan también a la reología de sus disoluciones. Las gomas

de algarroba y tara poseen pesos moleculares y viscosidades similares, superiores a las de las

gomas de guar y fenogreco (Dea et al., 1977; Wu et al., 2009).

La gran ventaja de los GaMs es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas a

concentraciones relativamente bajas, con un comportamiento reológico que depende del pH y

la temperatura. Debido a sus propiedades coloidales la goma de tara, la goma de guar y la

goma de algarroba se emplean como espesantes y estabilizantes de alimentos (por ejemplo,


-68-

en postres instantáneos, mermeladas, helados, salsas, productos cárnicos, yogures y masas

congeladas). Debido a su capacidad de retención de agua y de formar interacciones sinérgicas

con los hidratos de carbono o las proteínas, la goma de algarroba se emplea en las industrias

farmacéutica y cosmética como estabilizante y emulsionante (Wu et al., 2012; Rizzo et al.,

2004).

Mestechkina et al. (1991) aislaron GaM de con una masa molar media de 800 kDa a

partir de semillas de regaliz (Glycyrrhiza glabra) que contenía D-manosa (63%) y D-galactosa

(37%). Los GaMs también se pueden encontrar en los granos de café, donde desarrollan

funciones biológicas relacionadas con el desarrollo del grano, particularmente en su etapa de

germinación. Oosterveld et al. (2004) identificaron dos tipos de GaMs en los granos de Coffea

arabica: uno de alta masa molecular (2000 kDa), sustituido con unidades de galactosa (30%) y

grupos acetilo (9%), y otro de baja masa molecular (20 kDa), con menos sustituyentes de

galactosa (11%) y menos grupos acetilo (4%). Bourbon et al. (2010) caracterizaron la reología

de disoluciones de GaM extraído de las semillas de Gleditsia triacanthos y Sophora japónica.

3.1.4. Arabinogalactano

Los arabinogalactanos (ArGas) están ampliamente representados en el reino vegetal.

Se han descrito dos tipos de ArGas:

- Tipo I: presenta una cadena principal lineal formada por unidades de -D-

galactopiranosa unidas por enlaces β-(1-4) (Hori et al., 2007) con sustitución por

cadenas cortas de α-L-Araf, generalmente en posición 3 a través de enlaces (1-5).

Las unidades de α-L-Araf pueden suponer entre un 20-40% de los monosacáridos de

la molécula. Los ArGas tipo I están generalmente asociados a las pectinas de cítricos

y de manzana (Ebringerová et al., 2005).

- Tipo II: conocido como arabino-3,6 galactano, tiene una cadena principal formada

por unidades de D-galactopiranosa unidas mediante enlaces β-(1-3) (Hinz et al.,

2007), sustituidas en la posición 6 por cadenas laterales de mono- y oligosacáridos

formados por unidades de arabinosa y galactosa. Son mucho más frecuentes que los

de tipo I, y generalmente se encuentran asociados a proteínas, formando lo que se

conocen como arabinogalactano-proteínas, ArGaP (Clarke et al., 1979; Fincher y

Stone, 1974; Redgwell y Fisher, 2006). Los polisacáridos se unen por enlaces

covalentes a péptidos formados principalmente por hidroxiprolina (Fincher y Stone,

1974; Redgwell y Fisher, 2006). En gomas de exudados (goma arábiga, tragacanto,


-69-

gatti o karaya) los ArGas pueden contener pequeñas cantidades de grupos urónicos

incorporados en las cadenas laterales (Ebringerová, 2005).

El ArGa de tipo II es el más abundante en el duramen de maderas del género Larix y en

menor medida en maderas blandas. El alerce occidental (Larix occidentalis) contiene hasta un

35% de ArGa, que se halla contenido en el lumen de las traqueidas y por tanto no parte de la

pared celular. Aunque estrictamente no debería ser incluido dentro de las hemicelulosas, suele

clasificarse como tal (Ebringerová, 2005).

La Figura 3.3 muestra la estructura propuesta para el ArGa del alerce occidental, que

contiene sustitución por unidades de ácido D-glucurónico. La arabinosa puede estar presente

en forma de piranosa o furanosa en una relación aproximada de 2:1 (Amado y Neukom, 1985;

Laine, 2005).

Figura 3.3. Estructura del ArGa de Larix occidentalis

El alerce occidental y el alerce de Mongolia (Larix dahurica) son las principales fuentes

comerciales de ArGa (Odonmazig et al., 1994; Shimizu, 2001), de las que se extrae

comercialmente empleando agua caliente. Su utilización ha tenido un auge importante en las

últimas décadas por los estudios que proponen efectos fisiológicos beneficiosos: refuerza el

sistema inmune, ejerce una función de protección del hígado, mejora la acción digestiva, y

tiene propiedades como agente prebiótico, hipolipidémico y gastroprotector (Fitzpatrick et al,

2004; Medvedeva y Aleksandrova, 2003; Medvedeva et al, 2003). Se emplea en la elaboración

de bebidas alimenticias dadas su baja viscosidad y sus propiedades emulsificantes.


-70-

3.1.5. Xilano

El xilano (X) tiene importancia en la resistencia estructural de las paredes celulares

debido a que forma de enlaces covalentes y no-covalentes con otros componentes de la

misma (Thomson, 1993). El X es el polisacárido estructural no celulósico más abundante en las

angiospermas, en las que representa entre el 20 y el 30% del peso seco. Está formado por una

cadena principal de unidades de D-xilopiranosa unidas por enlaces β-(1-4), con ramificaciones

cortas. Estas ramificaciones pueden contener unidades de ácido glucurónico, arabinosa, u

oligosacáridos formados por xilosa, arabinosa, galactosa o glucosa. La distribución de las

cadenas laterales no sigue una secuencia regular (Rodríguez et al., 2004). Además, puede

presentar esterificación por ácidos como el acético, ferúlico (4-hidroxi-3-metoxicinámico) y p-

cumárico (4-hidroxicinámico). La frecuencia y composición de las ramificaciones dependen de

la fuente de X (Aspinall, 1980; Scheller y Ulvskov, 2010; Gullón et al., 2008b y 2010b). Los

ácidos ferúlico y p-cumárico se encuentran generalmente esterificados en la posición C-5 de

las unidades de arabinosa (Wende y Fry, 1997; Saulnier et al., 1995; Timell, 1967). Se ha

publicado la presencia de X no ramificado formado únicamente por unidades de xilosa en

algunas algas. En este caso los enlaces son tanto β-(1-4) como β-(1-3), y se discute si su función

es estructural o como material de reserva (Yamagaki et al., 1997).

3.1.6. Arabinoxilano

Los arabinoxilanos (ArXs) son los polisacáridos hemicelulósicos más abundantes en los

tejidos de gramíneas como trigo, centeno, cebada, arroz, maíz y sorgo; así como de brotes de

bambú y raygrass (Gullón et al., 2010b y c; Ishii, 1991; Foschia et al., 2013). En los granos de

cereales forman parte importante las paredes celulares del endospermo amiláceo y del

salvado. El contenido de los ArXs oscila entre un 0,15% en el endospermo del arroz hasta un

13% en la harinas de cebada y centeno. El contenido puede llegar al 30% en el caso del salvado

de trigo (Tabla 3.1) (Ebringerová y Hromadkova, 1999; Ebringerová et al., 2005). El ArX posee

una cadena principal compuesta por unidades D-xilanopiranosil unidas por enlaces β-(1-4), con

unidades L-arabinofuranosil unidas por enlaces α-(1-2) o α-(1-3) a la cadena principal (Viëtor et

al., 1992). La distribución de las ramificaciones a lo largo de la cadena principal es muy

importante, ya que influye en la conformación del polímero y en su capacidad para

interaccionar con otros polisacáridos (Izydorczyk y Biliaderis, 1995). Los ArXs difieren

ampliamente en cuanto a proporciones de xilosa:arabinosa (indicativas del grado de

ramificación), tamaño molecular y modo de sustitución de la arabinosa. Los ArXs de cebada,


-71-

trigo y centeno se caracterizan por tener un grado de ramificación relativamente bajo

comparado con los del arroz y sorgo (Izydorczyk y Biliaderis, 1995).

La relación xilosa:arabinosa varía también entre los arabinoxilanos de distintos

tejidos:por ejemplo, el ArX aislado a partir del endospermo presenta más arabinosa que el

obtenido de la aleurona. La relación xilosa:arabinosa en ArX de las paredes celulares del

endospermo es 1,0:1,1 (Fincher, 1975), de la aleurona es 1,9:2,2 (Henry, 1988) y delgrano de

cebada entero es 1:3 (Aaman y Hesselman, 1984).

Los ArXs pueden ser neutros o ligeramente ácidos, en función de las ramificaciones de

ácido 4-O-metil-α-D-glucurónico (AMeGo) que presenten. Una característica común de los ArXs

de cebada, trigo y centeno es la presencia de ácido ferúlico o ácido cumárico, que se

encuentran esterificados a unidades de arabinosa (Autio, 1995; Izydorczyk y Biliaderis, 1995;

Ebringerová y Heinze, 2000). El ácido ferúlico participa en reacciones de unión de

macromoléculas en la pared celular (Izydorczyk y Biliaderis, 1995) y tiene un papel importante

en la gelificación oxidativa de ArXs (Autio, 1995).

La Figura 3.4 presenta la estructura química de X de maderas duras y blandas. En el X

de maderas duras el 60-70% de las unidades de xilosa están acetiladas, en tanto que su grado

de polimerización (150-200) es mayor que el de las maderas blandas (70-130). Se diferencian

según las ramificaciones en la cadena principal, formadas por AMeGo y por arabinosa. En

función la abundancia relativa de los sustituyentes, se distingue entre glucuronoxilano,

arabinoglucuronoxilano y glucuronoarabinoxilano (Peng et al., 2012; Gírio et al., 2010

Ebringerová et al., 2005):

- El glucuronoxilano (GoX) es característico de las maderas duras (Tabla 3.1). La

cadena principal está formada por unidades de xilosa unidas mediante enlaces β-(1-

4), presentando ramificaciones de AMeGo unidas mediante enlaces α-(1-2) a la

cadena principal. Como promedio, las ramificaciones aparecen en 1 de cada 10

unidades de xilosa (Figura 3.4.a). La mayoría de las unidades presentan posiciones 2

y 3 sustituidas con grupos acetilo. Al contrario que en las maderas blandas, en este

caso no hay unidades de arabinosa (Laine, 2005).

- El arabinoglucuronoxilano (ArGoX) se encuentra presente en las maderas blandas,

cereales y gramíneas (Tabla 3.1.). Al igual que el caso anterior posee una cadena

principal de unidades de xilosa con ramificaciones formadas por una unidad de

AMeGo, aparecen en una de cada 5-12 unidades de xilosa. Presenta además


-72-

sustituciones por α-L-arabinofuranosa mediante enlace 1-3 (Timell, 1967; Shimizu,

2001). En estos casos no se han observado sustituyentes acetilo (Figura 3.4.b)

(Laine, 2005).

- El glucuronoarabinoxilano (GoArX) se encuentra en cereales (trigo, maíz o salvado

de arroz) y gramíneas (ver Tabla 3.1). Presenta la misma estructura que el ArGoX,

pero en este caso el número de cadenas laterales de α-L-Araf es 10 veces mayor que

las ramificaciones de ácidos urónicos. Existen cadenas laterales de disacáridos, y

algunas unidades de xilosa se encuentran doblemente sustituidas por unidades de

arabinosa (Ebringerová et al., 2005). El grado de sustitución y la estructura de la

cadena depende de la materia prima de la que proceden (Ebringerová y Heinze,

2000).

Figura 3.4. Estructuras químicas de xilanos presentes en (a) maderas duras, y (b) maderas blandas

(Laine, 2005).

b)

a)a)


-73-

La presencia de ácidos urónicos en las cadenas del X afecta a sus propiedades,

incluyendo capacidad de adsorberse a la superficie de la celulosa (Hartler y Lund, 1962), el

comportamiento en disolución y la susceptibilidad a la precipitación (Wikstrom, 1967). La

solubilidad del X en agua es inversamente proporcional al grado de metilación del ácido

galacturónico de la molécula. La distribución de los ácidos urónicos afecta al comportamiento

reológico de disoluciones acuosas de X de haya (Hromádková y Ebringerová, 1991). El

fraccionamiento de X de maderas duras por precipitación secuencial (Wikstrom, 1967;

Glaudemans y Timell, 1958) o extracción secuencial (Dahlman et al., 1997; Sjöström y Enstrom,

1967) permite obtener fracciones con diferentes proporciones de ácidos urónicos. Las maderas

blandas presentan un grado de sustitución más homogéneo (Zinbo y Timell, 1967).

3.1.7. Xiloglucano

Los xiloglucanos (XGs) son polisacáridos hemicelulósicos presentes mayoritariamente

en la pared celular de plantas superiores y en gran número de semillas. Se conocen

vulgarmente como amiloides, ya que se pueden teñir con yodo (Fry, 1989).

Los XGs presentan una estructura helicoidal y una conformación similar a la de la

celulosa. En los tejidos primarios, los XGs están unidos a las microfibrillas de celulosa mediante

puentes de hidrógeno, dificultando su extracción. Los XGs presentes en semillas (como la de

tamarindo) pueden separarse mediante tratamientos con agua caliente. Además de los

puentes de hidrógeno, los enlaces covalentes también ayudan a fijar el XG a la pared celular

(Femenia et al., 1999).

Generalmente los XGs constituyen del 20 al 25% de la pared celular de las

dicotiledóneas (plantas cuyo embrión presenta dos cotiledones, como el Sycamor y el

Arabidopsis thaliana), aproximadamente el 10% de maderas blandas (de Vries y Visser, 2001) y

un 2-5%, del césped (Scheller y Ulvskov, 2010; Gírio et al., 2010; Peng et al., 2012) (Tabla 3.1).

La cadena principal está formada por unidades de glucosa unidas por enlaces β-(1- 4), a la

mayoría de los cuales se unen unidades de xilosa por enlaces α-(1-6). Algunas unidades de

xilosa están a su vez sustituidas por fucosa, por galactosa y ocasionalmente por arabinosa a

través de enlaces (1-2) (Laine, 2005). Las proporciones relativas aproximada de glucosa, xilosa

y galactosa en los XGs son 4:3:1 (Hayashi, 1989).


-74-

Figura 3.5. Estructura química de la cadena de los XGs (Laine, 2005).

Los XGs presentan una alta capacidad de retención de agua con una buena estabilidad

al calor, a los ácidos y a los efectos de cizalla. En la industria alimentaria se emplean como

espesantes, estabilizantes y sustituyentes de grasas o de almidón; así como para mejorar las

propiedades térmicas y reológicas de algunos productos como helados, mayonesa y fideos

(Nishinari et al., 2000).

3.1.8. β-glucanos

Son polímeros de glucosa presentes en los granos de cereales que generalmente

tienen una función estructural (a diferencia de los α-glucanos como el almidón, que cumplen la

función de reserva energética en los vegetales). Su estructura es igual a la de la celulosa, con

unidades de β-glucosa unidas mediante enlaces β-1-4, pero las cadenas poliméricas son de

menor longitud y no forman estructuras de alta cristalinidad. Las hemicelulosas del

endospermo del algodón están compuestas principalmente por β-glucanos (80-90%) y, en

menor grado por pentosanos (10-20%). Los β-glucanos insolubles parecen estar unidos

covalentemente a proteínas (Wainwright, 1990; Peng et al., 2012).

R: unidades de galactosa, arabinosa o fucosa


-75-

3.2. Propiedades fisicoquímicas de las hemicelulosas

3.2.1. Solubilidad

La solubilidad del X, como la de los polisacáridos y sus derivados, está condicionada

por los puentes de hidrógeno intra e intermoleculares. Las regiones del polímero no sustituido

presentan una tendencia a la agregación de cadenas, lo que disminuye su solubilidad. La

solubilidad del X también está afectada por los métodos que se empleen en la extracción

(Ebringerová et al., 2005). El dimetil sulfóxido, que no disuelve la celulosa, es un disolvente

eficaz para los heteroxilanos poco ramificados (Ebringerová et al., 1994). En el X, las uniones

por puentes de hidrógeno condicionan la accesibilidad y reactividad de los grupos funcionales.

La mayoría de los ArXs de los cereales son insolubles en agua debido a que están

unidos a las paredes celulares por uniones tipo éster (Mares y Stone, 1973). Aquellos que no

están unidos a las paredes celulares pueden solubilizarse formando disoluciones muy viscosas,

siendo capaces de absorber una gran cantidad de agua. Según Izydorczyk et al. (1990), la

ausencia de ácido ferúlico en la cadena de ArX permite la formación de un gel que retiene 100

g de agua por cada gramo de polímero. Los ArXs no sólo pueden establecer enlaces covalentes,

también pueden presentar zonas unidas por puentes de hidrógeno intermoleculares en las

regiones no sustituidas (Fincher y Stone, 1996).

Los ArXs de cebada malteada solubles en agua tienen elevada proporción de xilosas

disustituidas (Izydorczyk et al., 1998a), lo que les dificulta la asociación intermolecular y la

interacción con β- glucanos (Izydorczyk et al., 1998b). La solubilidad de las macromoléculas de

ArX aumenta si existe sustitución por arabinosa, que previenen la agregación intermolecular

(Vinkx y Delcour, 1996).

El GaM de sago (Metroxylon amicarum) es totalmente insoluble en agua y no tiene

aplicaciones alimentarias. Las semillas de esta palmera son tan duras que se tallan como

«marfil vegetal». Se considera que los GaM son insolubles en agua cuando contienen menos

del 10% de sustitución en la cadena principal (Dea et al., 1986). Por el contrario, la goma de

alholva es la más soluble de todas, en tanto que la goma de guar es soluble en agua fría, y la

goma de algarroba es soluble en agua sólo a temperaturas del orden de 80 ˚C (Linden y

Lorient, 1996).


-76-

El GM obtenido de Amorphophallus konjac es soluble en agua e insoluble en etanol,

cloroformo y éter. Este polímero tiene una alta capacidad de retener agua, formando

disoluciones muy viscosas.

Fincher y Stone (1996) han indicado que la solubilidad de las hemicelulosas no

solamente viene determinada por el tamaño molecular y por la concentración, sino que

también influye la cantidad y disposición de los sustituyentes, las cargas eléctricas y la forma

en que están unidas a otros componentes de la pared celular. Estos sustituyentes no sólo

afectan a la solubilidad, sino también a las interacciones con los otros componentes

poliméricos de la pared celular, a su degradabilidad por enzimas y a otras propiedades

funcionales.

3.2.1.1. Peso molecular y distribución de pesos moleculares

La determinación del peso molecular del X es difícil, ya que los resultados varían

dependiendo del método empleado. Normalmente, los valores obtenidos por centrifugación

son menores los determinados por filtración en gel, y muchos menores que los obtenidos por

dispersión de luz. Se ha considerado estas variaciones se deben a fenómenos de agregación de

cadenas (en zonas que contienen unidades de xilosa no sustituidas en la cadena principal), así

como a la formación de microgeles en disolución (Schooneveld-Bergmans et al., 1999;

Ebringerová et al., 2005).

La masa molecular del ArX de trigo soluble en agua determinada por precipitación se

encuentra en el intervalo de 6,5·104 a 6,6·104 Da (Andrewartha et al., 1979; Girhammar et al.,

1986). Estos valores son menores que los obtenidos por filtración en gel, para los que se han

determinado 8,0·105-5,0·106 Da (Fincher y Stone, 1996), 7,0·104-1,0·106 Da (Fincher y Stone,

1974) y 2,2·105 Da (Girhammar et al., 1986).

Gruppen et al. (1992), empleando el método de dispersión de luz, determinaron una

masa molecular media de 8,5·105 Da para el ArX de trigo extraído con disolución alcalina. Los

ArXs del endospermo de centeno solubles en agua presentan un mayor peso molecular que los

del trigo. Girhammar y Nair (1992) determinaron el intervalo de masas moleculares de ArX

aislados a partir de centeno empleando cromatografía de permeación de gel. Los resultados

(entre 5,2·105 y 7,7·105 Da) fueron considerablemente mayores que los obtenidos para X

aislado de trigo (2,2·105-2,5·105 Da).


-77-

El ArGa presente en la goma arábiga generalmente forma complejos ArGa-proteína.

Las masas moleculares varían en el intervalo 4,6·104 a 1,0·106 Da (Fauconnier et al., 2000).

Los resultados de pesos moleculares de los productos de la extracción de

hemicelulosas de maderas duras y blandas presentan una marcada variabilidad en función de

los procedimientos empleados (ver Tabla 3.3). Los ArGoXs obtenidos de pino y de abeto

presentan un mayor peso y número molecular (Mw y Mn respectivamente) que los GoXs

obtenidos de abedul y de álamo. Los pesos moleculares de los GaGMs son similares a los de X

de madera blanda. Sin embargo, presentan una mayor polidispersidad (medida por la relación

Mw/Mn) (Jacobs y Dahlman, 2001).

Tabla 3.3. Número, peso molecular e índice de polidispersidad de hemicelulosas

aisladas con distintos procedimientos (Jacobs y Dahlman, 2001)

Origen Modo de obtención Mn Mw Mw/Mn

Maderas duras

Abedul A 15000 16900 1,11

Abedul B 11400 13700 1,19

Álamo B 15600 15600 1,09

Maderas blandas

Abeto B 14600 18400 1,22

Abeto C 16100 19200 1,16

Abeto D 14700 20200 1,33

Pino B 15700 19900 1,24

Pino C 17200 20800 1,18

Pino D 16600 21400 1,26

Alerce B 14000 17400 1,23

Alerce C 14400 17300 1,18

Alerce D 15500 19100 1,22

A) Extracción con KOH 5%

B) Extracción con KOH 24%

C) Extracción con KOH 24%, sobrenadante después de adicionar Ba(OH)2

D) Extracción con KOH 24%, precipitado después de adicionar Ba(OH)2


-78-

3.2.2. Comportamiento reológico

El comportamiento reológico de las disoluciones de polímeros hemicelulósicos

depende de los azúcares constituyentes y de las interacciones intra- e intermoleculares (que

influyen en la conformación y rigidez de la cadena principal); así como de la abundancia y

distribución de las ramificaciones (que condicionan la forma y tamaño de la macromolécula y

las interacciones con el disolvente). Las propiedades viscoelásticas de los geles están

relacionadas con la organización supramolecular (Ebringerová et al., 2005).

En medio acuoso, el GoX tiene un comportamiento pseudoplástico en condiciones

suaves, que pasa a ser plástico cuando se les somete a altos esfuerzos. Esta conducta depende

principalmente del grado de ionización de los ácidos urónicos (Ebringerová et al., 1992).

El ArX de cereales con sustituyentes fenólicos puede formar geles tras oxidación

(Michniewicz et al., 1990), debido a la formación de enlaces entre unidades de ácido ferúlico y

otras cadenas de xilano-proteínas (Girhammar y Nair, 1995). Se ha observado una fuerte

tixotropía para el ArX del salvado de centeno insoluble en agua, en tanto que la fracción

soluble en agua del heteroxilano del zuro de maíz presenta comportamiento tixotrópico a

esfuerzos moderados (Girhammar y Nair, 1995; Michniewicz et al., 1990).

Los GaMs forman disoluciones muy viscosas incluso a bajas concentraciones,

especialmente si se mezclan con xantanos. Dada la ausencia de grupos ionizables, su

comportamiento no depende del pH, siendo estables en el intervalo de 3,5-11,0. Por debajo de

pH 3 pueden degradarse por hidrólisis.

Las disoluciones de goma de guar presentan una viscosidad alta, con comportamiento

pseudoplástico a bajas concentraciones. El GaM obtenido a partir de semillas de mimosa

presenta una alta retención de líquido, atribuida a su elevado grado de sustitución por

galactosa (relacion galactosa:manosa, 1:1) (Ebringerová, 2006). Los GaMs provenientes de

semillas de Ipomoea (Singh et al., 2002) forman geles reversibles con iones borato, y geles no

reversibles con metales de transición, presentando un comportamiento semejante al GaM de

la goma de guar. Las disoluciones de goma de guar son pseudoplásticas y, a igualdad de

concentración, mucho más viscosas que las de la goma de algarroba (Cottrell y Baird, 1998).

La adición de XGs obtenidos de las semillas de tamarindo a la goma gellan produce una

red a dosis muy bajas (Ikeda et al., 2004). Cuando los XGs se mezclan con almidón, la mezcla

presenta una viscosidad alta y el grado de pseudoplasticidad aumenta con la concentración del


-79-

XGs. Al añadir XGs de tamarindo a una disolución de almidón disminuye la formación de

enlaces entre cadenas y la capacidad de retener agua (Prabhanjan y Ali, 1995).

La masa molecular afecta al comportamiento reológico de los XGs en mayor medida

que las características de cadena lateral. En el caso del GaM la proporción y distribución de las

unidades de galactosa tienen una importancia fundamental.

El ArGa de la goma arábiga es un agente emulsificante eficaz, de baja viscosidad, y

presenta capacidad para formar películas protectoras alrededor de las gotas de las emulsiones.

Se emplea en productos alimentarios como bebidas carbonatadas (para mejorar la viscosidad),

helados (para controlar la formación de cristales y prevenir la pérdida de agua) y yogures (a los

que proporciona textura y consistencia). También puede actuar como agente prebiótico,

estimulando el crecimiento de bacterias beneficiosas en el intestino grueso (McLean-Ross,

1983; Michel et al., 1998).

Medidas de viscosidades de mezclas de glucanos han confirmado su capacidad para

formar redes similares a las que aparecen en disoluciones poco concentradas de hemicelulosas

extraídas de cebada (Ebringerová, 2006). En los glucanos de avena, sólo las estructuras de bajo

peso molecular tienen propiedades gelificantes. Las hemicelulosas poco ramificadas son

parcial o totalmente insolubles en agua, dando lugar a dispersiones de partículas. Sin embargo,

debido a las fuertes tendencias de asociación pueden producirse geles, como en el caso de

productos extraídos de madera de haya y zuros de maíz (Ebringerová y Heinze, 2000).

En el intervalo de pH de 7 a 11, las disoluciones de GMs procedentes de

Amorphophallus konjac forman geles elásticos, debido a que la hidrólisis de los grupos acetilo

favorece la formación de puentes de hidrógeno. Una disolución acuosa al 1% de este

compuesto presenta una viscosidad aproximada de 60.000 mPas. Esta capacidad de

gelificación se ha aprovechado en la tecnología culinaria (especialmente en la cocina

japonesa). Además, estos compuestos presentan capacidad para reducir la glucosa y el

colesterol plasmático (Maekaji, 1974; Williams et al., 2000).

3.2.3. Comportamiento térmico

Los Xs son estructuras térmicamente lábiles, en comparación con otros componentes

de la pared celular en las plantas superiores como celulosa y lignina (Goring, 1963; Ebringerová

et al., 2005). El GoX obtenido por fraccionamiento de madera empieza a descomponerse


-80-

alrededor de los 200 ˚C, un valor inferior al observado para la fracción celulósica. Sin embargo,

la despolimerización del GoX empieza aproximadamente a 150 ˚C y transcurre asociada a

reacciones de deshidratación y condensación (Zabotin et al., 1998).

La temperatura de transición vítrea del X se encuentra en el intervalo 167-180 ˚C

(Irvine, 1984). Por medio del análisis termomecánico se han determinado dos temperaturas de

transición para el GoX ( -26 ˚C y 80 ˚C), que disminuyen al aumentar de humedad. Congelando

GoX en agua a -25 ˚C se produce una intensa degradación de la cadena. Algunas hemicelulosas

como el ArX presentan un efecto inhibidor sobre la formación de hielo, a causa del aumento

de viscosidad e interferencias estructurales causadas por la red del gel formada por el

polímero. Esto puede contribuir a la conservación de cereales en invierno (Kindel et al., 1989).

3.2.4. Tensión superficial

Polisacáridos como el glucoxilano, arabinoxilano y el glucoarabinoxilano presentan

propiedades tensioactivas (Ebringerová y Heinze, 2000), emulsificando y estabilizando medios

que contienen proteínas. Estos efectos se observaron en hemicelulosas conteniendo

cantidades pequeñas de compuestos fenólicos (como el ácido ferúlico). La capacidad

tensioactiva del ArX de cereales se ha relacionado con su viscosidad y con sus propiedades

interfaciales (Izydorczyk y Biliarderis, 1995). Sarker et al. (1998) demostraron que el aumento

de la estabilidad de la espuma se debe a cambios en la viscosidad y a efectos de superficie

causados por la unión ArX-proteína en el trigo.

Glicksman (1982) considera que las gomas no son verdaderos emulsificantes, ya que

no actúan según el mecanismo tradicional de unión hidrofílica-lipofílica. Sin embargo, algunas

gomas tienen propiedades surfactantes.

3.3. Hemicelulosas de madera de pino

Las hemicelulosas de madera de pino pueden solubilizarse mediante tratamientos

hidrotérmicos. De esta forma se obtienen sacáridos solubles de naturaleza poli- u oligomérica

(POHs). González-Muñoz et al. (2012 y 2013a) estudiaron la obtención de POHs a partir de

madera de Pinus pinaster mediante autohidrólisis, así como el fraccionamiento de los

productos de reacción por un procedimiento multi etapa con membranas (González-Muñoz et

al., 2013b).


-81-

La composición típica de la madera de Pinus pinaster expresada como porcentaje en

peso en base seca es la siguiente: 39,2% de glucano, 28,5% de lignina de Klason, 24,34% de

hemicelulosas (de las cuales 10,5% son manosa; 4,30% xilosa; 2,39% galactosa; 1,71%

arabinosa, 1,40% de grupos acetilo y un 4,04% deácidos urónicos), 2,84% de extractos solubles

en etanol, 1,35% de proteína y 0,28% de cenizas (González-Muñóz et al., 2013a). La manosa, la

galactosa y parte de la glucosa y de los grupos acetilo provienen del GM, mientras que el resto

de la unidades estructurales proceden de polímeros como XG y ArGoX (Ebringerová et al.

2005).

En los primeros trabajos realizados con pino, se estudiaron procedimientos para la

extracción del GM a partir de Pinus banksiana (Bishop y Cooper, 1960) y Pinus strobus (Gyaw y

Timell, 1960), y se observó como influye el procedimiento de extracción sobre la estructura del

polisacárido aislado. En 1961, Meier estableció el patrón de acetilación para los GMs.

Al igual que en otras maderas blandas, la fracción hemicelulósica de la madera de pino

está formada por fundamentalmente por AcGaGM (véase apartado 3.1.3) (Kenne et al., 1975;

Meier, 1961). Diversos autores observaron que las relaciones molares

galactosa:glucosa:manosa en este tipo de maderas son 1:1:3 (Aspinall, 1963; Puls et al., 1992;

Willför et al., 2005). Brash (1983) obtuvo relaciones galactosa:glucosa:manosa de 1,3:1:4,5

para madera de Pinus radiata, mientras que Hoffman y Timell (1970) observaron una

relaciones de 0,26:1,00:2,35 en el caso demadera de pino rojo (Pinus resinosa). Recientemente

Price et al. (2011) comprobaron la presencia de AcGaGMs en extractos acuosos de Pinus taeda

producidos en la fabricación de tableros, empleando MALDI-TOF, HPSEC, y NMR de 13C y de

protón.

La madera de pino también contiene ArGoX, en proporciones cercanas a a un tercio del

total de hemicelulosas (González-Muñoz et al., 2013b; Ebringerová et al., 2005; Price et al.,

2011)

3.4. Hemicelulosas de madera de Eucalyptus globulus

Se han realizado estudios sobre la solubilización de hemicelulosas de la madera de

Eucalyptus globulus mediante tratamientos hidrotérmicos (Garrote et al., 2003 y 2004), así

como sobre el refinado de los oligómeros obtenidos (Vázquez et al., 2002 y 2007; Gullón et al.,

2008a), la caracterización estructural de éstos y su fermentabilidad in vitro (Gullón et al.,

2011a).


-82-

Como promedio, la madera de Eucalyptus globulus contiene un 46,6% de celulosa,

25,8% de hemicelulosas (de las cuales 16,6% son Xs, 0,54% sustituyentes arabinosilo, 3,54%

grupos acetilo y 5,13 % ácidos urónicos), 22,9% de lignina de Klason, 1,1% de proteína, 0,2% de

cenizas y 3,4% de otros compuestos (Garrote et al., 2004). Las hemicelulosas de la madera de

Eucalyptus globulus están constituidas por heteroxilano ramificado cuya cadena principal

contiene unidades de 1-4-β-D xilopiranosa parcialmente acetiladas, a las que se unen cadenas

laterales de AMeGo (Evtuguin et al., 2003). Ocasionalmente aparece unidades de α-D-

galactopiranosa enlazada O-2 a unidades de AMeGo (Togashi et al., 2009).

3.5. Hemicelulosas de cáscaras de arroz

La cáscara de arroz contiene como promedio un 34,0% en peso de glucano

(procedente de las unidades que conforman la celulosa y el almidón), 20,6% de hemicelulosas

(formadas por 15,9% de Xs 1,8% de sustituyentes arabinosilo; 1,6% de grupos acetilo y 1,3% de

ácidos urónicos), 23,3% de lignina de Klason, 2,5% de proteínas, 11,2% de cenizas y 8,5% de

otros compuestos (Vegas et al., 2008c). Las pentosas son los azúcares constituyentes

predominantes en las hemicelulosas. La pentosa más abundante es la xilosa, seguida de la

arabinosa. Las cáscaras de arroz contienen aproximadamente un 0,4% en peso de lípidos,

mientras que su contenido en minerales depende mucho de las condiciones de cultivo

(especialmente, del tipo de fertilización y de las características del suelo). Además, la

composición depende de la variedad y el clima (Govindarao, 1980; Normand y Ory, 1987). Saha

(2003) propone para las hemicelulosas de cáscara de arroz una estructura formada por una

cadena principal de X con ramificaciones de arabinosa, AMeGo y grupos acetilo.

Las cáscaras de arroz han sido también consideradas como sustratos para el

fraccionamiento hidrotérmico. Vegas et al. (2004) estudiaron los tratamientos de

autohidrólisis y el posterior refinado de los licores hemicelulósicos obtenidos empleando

membranas, enzimas y resinas de intercambio iónico (Vegas et al., 2006 y 2008 a, b y c);

mientras que Gullón et al. (2008b, 2010b y 2011b) caracterizaron y estudiaron la

fermentabilidad de los POHs obtenidos de la fracción hemicelulósica de la cáscara de arroz.

Gullón et al. (2010b) estudiaron las características de estos POHs, incluyendo los espectros de

masas obtenidos por MALDI-TOF, que confirmaron la presencia de oligosacáridos formados

por pentosas en su mayoría sustituidos con uno o más grupos acetilo, y en algunos casos con

sustitución por AMeGo. También se pudieron identificar series de oligómeros de hexosas, con

un DP de entre 3 y 8, no acetiladas. Estudios realizados con HPAEC-PAD y HPSEC mostraron


-83-

que predominantemente se obtienen POHs formados por unidades de xilosa, con un DP menor

que 7.

-85-

4. Productos a Partir de

Hemicelulosas

Como se ha indicado en el Capítulo 2, en el que se comentaban posibles esquemas

para biorrefinerías, las hemicelulosas pueden separarse de los MLCs nativos por diversas

tecnologías, por ejemplo, en base a su mayor susceptibilidad a la hidrólisis respecto a la

fracción celulósica, por solubilización en medios orgánicos (simultáneamente a la

deslignificación) o mediante solubilización en medios alcalinos. Dependiendo de las

condiciones de procesamiento se pueden obtener productos con diferente grado de pureza.

Por ejemplo, en tratamientos acuosos suaves se obtienen disoluciones en las que los

componentes mayoritarios son oligosacáridos, mientras que en medios conteniendo ácidos

minerales puede lograrse la hidrólisis total a los monosacáridos constituyentes. Dependiendo

de las condiciones de operación pueden cobrar importancia reacciones diferentes de la propia

hidrólisis, como deshidratación, isomerización, descomposición o condensación de los

azúcares y/u otros compuestos presentes en el medio.

Algunos oligosacáridos (entre ellos los obtenidos a partir de hemicelulosas) tienen

propiedades prebióticas, lo que ha llevado a postularlos como ingredientes para alimentos

funcionales. Si las hemicelulosas se hidrolizan a los monosacáridos constituyentes, las

disoluciones obtenidas pueden emplearse como medios de fermentación para la obtención de

diferentes productos, entre los que cabe mencionar xilitol, ácido fumárico o etanol (Sakamoto

et al., 2012; Ping et al., 2013; Wen et al., 2013). Alternativamente, las disoluciones de

oligómeros y/o azúcares pueden procesarse por vía química para obtener diferentes productos


-86-

o materiales. Por ejemplo, los tratamientos en medio ácido pueden orientarse hacia la

producción de furanos o ácido levulínico, que se consideran actualmente de gran interés como

compuestos de base («platform chemicals») para obtener productos con aplicaciones en

diferentes campos. Alternativamente las disoluciones de oligómeros pueden emplearse en la

fabricación de películas poliméricas (Hartman et al., 2006; Ruiz et al., 2013).

En este trabajo se ha abordado tanto la obtención de oligosacáridos por tratamientos

de autohidrólisis como la formación de furanos y/o ácido levulínico por tratamientos en medio

ácido de los azúcares hemicelulósicos. En los siguientes apartados se consideran con detalle

estos puntos.

4.1. Oligosacáridos: Potencial como ingredientes para alimentos funcionales

En los últimos años, el concepto clásico de nutrición equilibrada, entendida como

aquella que aporta a través de los alimentos las cantidades adecuadas de los nutrientes

básicos y las calorías suficientes para satisfacer las necesidades orgánicas particulares, tiende a

ser sustituido por el de «nutrición funcional». La nutrición funcional hace referencia no sólo a

la capacidad de nutrir, sino también a la capacidad que tienen algunos alimentos («alimentos

funcionales») para favorecer la salud, mejorando el bienestar y reduciendo el riesgo de

desarrollar ciertas enfermedades (Sarkar, 2013; Diplock et al., 1999). Los alimentos funcionales

contribuyen mejorar la calidad de la dieta, promoviendo la salud y el bienestar del consumidor

(Arvanitoyannis y Houwelingen-Koukaliaroglou, 2005; Siró et al., 2008).

La Unión Europea ha creado una Comisión Europea de Acción Concertada sobre

Bromatología Funcional («Functional Food Science in Europe», FUFOSE), que ha establecido la

siguiente definición de alimentos funcionales: nuevos alimentos obtenidos por diversos

procedimientos, con la característica particular de que alguno de sus componentes, sea o no

nutriente, afecta de manera específica y positiva a funciones específicas del organismo, y

promueve un efecto fisiológico o psicológico más allá de su valor nutritivo tradicional. Según

esta definición, un alimento funcional puede ser:

- un alimento natural,

- un alimento al que se le ha añadido un componente que causa efectos beneficiosos,

- un alimento al que se le ha eliminado un componente perjudicial mediante medios

tecnológicos o biológicos,


-87-

- un alimento en el que se ha modificado la naturaleza de uno o más de sus

componentes,

- un alimento en el que se ha modificado la biodisponibilidad de uno o más de sus

componentes.

La mayoría de alimentos funcionales contienen ingredientes cuyos efectos sobre la

salud son conocidos desde hace tiempo (por ejemplo, prebióticos, probióticos, antioxidantes,

fibras dietéticas o vitaminas). En la medida que impliquen nuevos procesos de obtención,

nuevos nutrientes o proporciones diferentes de los mismos, los alimentos funcionales pueden

considerarse «nuevos alimentos», según la clasificación establecida por la Unión Europea y por

el Comité Científico de la Alimentación Humana.

Los oligosacáridos presentan unas propiedades que los hacen particularmente

interesantes como componentes bioactivos para alimentos funcionales, entre las que cabe

citar:

- Propiedades prebióticas (Saad et al., 2013; Vidová et al., 2013).

- Actividad antioxidante, constituyendo una alternativa a los empleados actualmente.

- Reguladores de los niveles de glucosa en sangre, adecuados para diabéticos.

- Reguladores de los lípidos séricos, adecuados en caso de dislipidemia.

- Mejora del sistema inmunitario.

- Mejora de la biodisponibilidad y de la absorción de minerales.

Cuando se obtienen oligosacáridos por hidrólisis parcial de las hemicelulosas

contenidas en MLCs, las disoluciones crudas contienen también otros compuestos no

deseados, obtenidos a partir de otras fracciones de la madera o generados por reacciones

secundarias. Por ello, las disoluciones crudas deben someterse a etapas de refinado que

permitan alcanzar un grado de pureza suficiente para admitir su empleo en alimentos

funcionales (Patel y Goyal, 2011; Moure et al., 2006).

En esta Tesis Doctoral se estudian las propiedades prebióticas y antioxidantes de

oligosacáridos obtenidos mediante autohidrólisis a partir de diferentes MLCs.


-88-

4.1.1. Potencial prebiótico

Gibson y Roberfroid (1995) definieron prebiótico como «un ingrediente alimentario no

digerible que beneficia al hospedador mediante la estimulación selectiva del crecimiento y/o la

actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon, mejorando así su salud». Esta

definición es muy similar a la propuesta posteriormente por la FAO, que define prebiótico

como «un componente alimentario no digerible que otorga un beneficio a la salud de un

hospedador asociada con la modulación de la microbiota» (Slavin, 2013).

La estrategia que subyace en el concepto de prebiótico es la de proporcionar una

fuente de carbono y energía que resulte selectiva para determinadas bacterias beneficiosas del

colon, de modo que estas dispongan de una ventaja competitiva frente a otras bacterias

presentes en el ecosistema intestinal (Crittenden, 1999). Esta ventaja competitiva producirá

cambios beneficiosos en la composición de la comunidad microbiana.

La eficacia de los prebióticos está ligada a su capacidad de resistir la digestión en el

estómago y en el intestino delgado, sin degradarse por los efectos combinados del pH gástrico

y de las enzimas digestivas. Los prebióticos alcanzan intactos el intestino grueso, donde son

utilizados selectivamente por un restringido grupo de microorganismos (fundamentalmente

bifidobacterias y lactobacilos) que causan efectos saludables. La ingesta de prebióticos

posibilita tanto el número de bacterias beneficiosas como su actividad metabólica (Crittenden,

1999).

La fermentación anaerobia de los prebióticos por la flora colónica produce ácidos

grasos de cadena corta (AGCC) que disminuyen el pH y sirven como fuente de energía para el

hospedador. La fermentación intestinal también conduce a la formación de H2 y CO2. La mayor

parte del H2 se convierte en metano por acción de bacterias.

Para que un ingrediente alimentario sea clasificado como prebiótico debe cumplir los

siguientes requisitos (Collins y Gibson, 1999; Manning y Gibson, 2004):

i. No ser hidrolizado ni absorbido en el tracto gastrointestinal superior.

ii. Actuar como un sustrato selectivo para el crecimiento de una o un número limitado

de bacterias potencialmente beneficiosas del colon, estimulando su crecimiento y/o

metabolismo.

iii. Modificar la composición de la microbiota del colon, promoviendo el desarrollo de

especies beneficiosas.


-89-

iv. Inducir efectos que resulten beneficiosos para la salud del hospedador.

Slavin (2013) y Roberfroid y Slavin (2000) citan una serie de efectos favorables

derivados de la ingesta de prebióticos:

- Alivio del estreñimiento por el efecto del aumento de las deposiciones y,

posiblemente, por los efectos sobre la motilidad intestinal (Kleessen et al., 1997)

- Reducción de la prevalencia y duración de la diarrea infecciosa, probablemente

debido a al efecto inhibidor de las bifidobacterias sobre las bacterias gram-positivas

y gram-negativas (Wang y Gibson, 1993).

- Reducción de la inflamación en síndromes relacionados con las enfermedades

inflamatorias del intestino.

- Prevención del cáncer de colon.

- Mejora de la biodisponibilidad y la absorción de minerales, incluyendo calcio,

magnesio y posiblemente, hierro. La mejor disponibilidad del calcio disminuye el

riesgo de osteoporosis (Roberfroid y Slavin, 2000).

- Reducción de los factores de riesgo para determinadas enfermedades

cardiovasculares (Aarsland et al., 1996).

- Incremento de la sensación de saciedad, facilitando la pérdida de peso y la

prevención de la obesidad.

Van den Broek (1993) y Cummings et al. (1997) clasificaron los oligosacáridos desde un

punto de vista fisiológico en dos categorías: digeribles y no digeribles. Los oligosacáridos no

digeribles (ONDs) poseen un gran potencial como como ingredientes alimentarios prebióticos.

En particular, no se absorben en la parte alta del tracto intestinal ni se hidrolizan por efecto de

las enzimas digestivas humanas, llegando inalterados al colon, donde sirven como sustrato

para las bacterias endógenas (Cardelle, 2009).

La IUB-IUPAC («International Union of Biochemistry-International Union of Pure and

Applied Chemistry») define los oligosacáridos como hidratos de carbono con un grado de

polimerización entre 3 y 10, aunque otros autores amplían este intervalo a 2 - 20 (Manning y

Gibson et al., 2004; Voragen, 1998).

En general, los oligosacáridos presentes en los alimentos no son productos puros, sino

mezclas compuestos con diferentes grados de polimerización (en muchos casos, desde

polisacáridos a disacáridos hasta azúcares monoméricos) (Rastall et al., 2002; Voragen, 1998).

Los ONDs se encuentran como componentes naturales en alimentos como fruta, legumbres,


-90-

leche y miel. Sin embargo, estos alimentos no siempre se ingieren en cantidades suficientes

para que los oligosacáridos que contienen puedan ejercer efectos prebióticos. Por lo tanto,

para obtener los efectos biológicos deseados es necesaria la adición de tipo de compuestos a

la dieta (Cardelle, 2009).

En las últimas dos décadas, la atención prestada a los ONDs como ingredientes

funcionales ha aumentado rápidamente, particularmente en Japón y Europa (Sako et al.,

1999). En 1991 el gobierno japonés incluyó los fructooligosacáridos (FOS),

galactooligosacáridos (GaOS), oligosacáridos procedentes de la soja (SOS) y

palatinosaoligosacáridos entre los alimentos FOSHU («Foods for Specified Health Use»), un

concepto establecido en Japón en que se basó la definición occidental de alimento funcional .

En 1996, la lista de FOSHU incluía un total de 58 alimentos aprobados, de los cuales treinta y

cuatro tenían ONDs como ingredientes funcionales, incluyendo a la lactulosa, lactosucrosa,

xilooligosacáridos (XOS) e isomaltooligosacáridos (IMOS) (Crittenden y Playne, 1996).

La ingesta ideal de ONDs es difícil de establecer. En el caso de los FOS se ha cifrado en

3 - 13 g/día por persona, en función de sus características. En el tracto gastrointestinal, los

ONDs pueden convertirse en nutrientes para el colon, ya que algunas especies bacterianas

intestinales expresan hidrolasas específicas que permiten reducir la longitud de la cadena y la

fermentación de los productos de hidrólisis a ácidos carboxílicos de cadena corta (acetato,

propionato, butirato y lactato) y/o gases derivados de la fermentación (Cummings, 1995). Los

datos experimentales obtenidos in vitro e in vivo en animales, así como datos recientes

obtenidos en seres humanos, han confirmado la influencia de ONDs ingeridos en la dieta sobre

distintos procesos fisiológicos de diferentes tipos de células intestinales (incluyendo

producción de mucinas, división celular, función de las células inmunes y transporte iónico) y

también de células ajenas al tracto gastrointestinal (responsables de procesos como

producción de hormonas, metabolismo de lípidos y carbohidratos).

Los ONDs poseen las mismas propiedades físico-químicas que el resto de

oligosácaridos, lo que favorece su incorporación a los alimentos. Son solubles en agua y

medianamente dulces, con un poder edulcorante normalmente entre 0,3 - 0,6 veces el de la

sacarosa, aunque esta propiedad decrece con la longitud de la cadena (Roberfroid y Slavin,

2000). Son estables, hidrolizándose en medio ácido, por efecto de temperaturas elevadas o

tras un almacenamiento prolongado a temperatura ambiente. Poseen alta capacidad para

retener humedad, por lo que se pueden emplear para disminuir la temperatura de congelación


-91-

y controlar el pardeamiento no enzimático de los alimentos procesados (Nakakuki, 1993;

Crittenden y Playne, 1996).

A los ONDs también se les atribuyen efectos perjudiciales, principalmente relacionados

con una ingesta excesiva, que puede provocar molestias intestinales, diarrea y flatulencia. Por

ejemplo, la ingesta de más de 20 g de GaOS /día puede provocar diarrea (Sako et al., 1999).

Entre los ONDs más empleados se incluyen aquellos que contienen fructosa, xilosa,

galactosa, glucosa y manosa (Gibson, 1998; Otileno y Ahring, 2012). Los ONDs pueden

obtenerse por procedimientos químicos y/o enzimáticos, incluyendo reacciones de síntesis o

de hidrólisis. Dentro del primer tipo cabe citar los que se obtienen a partir de disacáridos

(como la sacarosa o la lactosa) por reacciones enzimáticas de transglicosilación (por ejemplo,

los FOS o los transgalactooligosacáridos) (Crittenden y Playne, 1996; Siró et al., 2008). El

segundo tipo es de especial interés para los fines de este estudio, y se obtienen por hidrólisis

parcial de polisacáridos presentes en materias primas naturales o en fracciones aisladas de

éstas.

En la actualidad los FOS y los GaOS son los ONDs más consumidos, pero también se

comercializan XOS, isomaltooligosacáridos (IMO), o lactulosa. En la bibliografía se recogen

evidencias del efecto prebiótico de otros ONDs comerciales (denominados prebióticos

emergentes), entre los que cabe citar: arabinogalactooligosacáridos, arabinoxilooligosacáridos,

arabinooligosacáridos, galacturonanooligosacáridos, glucooligosacáridos o manooligosacáridos

(Tuohy et al., 2005; Pérez-Conesa et al., 2004). La capacidad prebiótica de estos compuestos

está siendo evaluada, tanto en los aspectos relacionados con su resistencia a la digestión por

las enzimas del intestino delgado humano, como en lo que se refiere a su comportamiento

como sustratos para la fermentación colónica selectiva.

4.1.2. Potencial antioxidante

Se define antioxidante a una sustancia que, actuando a bajas concentraciones, es

capaz de retrasar o impedir la oxidación de un determinado sustrato oxidable (como lípidos,

proteínas o hidratos de carbono) (Halliwell y Gutteridge, 1999; Halliwell, 2002). Los

antioxidantes se utilizan frecuentemente en los sistemas alimentarios (donde su principal

función es inhibir la peroxidación de los lípidos) y biológicos (para proteger los lípidos y las

proteínas, minimizando además los daños en el causados en el ácido desoxirribonucleico

(ADN) por especies reactivas de oxígeno (EROs) y por especies reactivas de nitrógeno (ERNs). A


-92-

pesar de que resulta necesario una cierta concentración de EROs para mantener la regulación

de las funciones celulares (Wang y Yi, 2008), su producción excesiva (y la de otros radicales) se

relaciona con alteraciones de la salud como envejecimiento, diabetes, artritis, SIDA o

degeneración macular; y enfermedades hepáticas, autoinmunes, inflamatorias,

cardiovasculares y neurodegenerativas. Se ha sugerido que los antioxidantes pueden

emplearse como «herramientas terapéuticas» para ciertas enfermedades al mantener las

concentraciones de EROs por debajo de un determinado umbral (Seifried et al., 2007).

Los requerimientos para que una sustancia pueda ser utilizada como agente

antioxidante incluyen:

- carácter no tóxico del agente y de sus productos de degradación

- actividad a concentraciones bajas (0,01-0,02%)

- solubilidad en el producto o sustrato oxidable

- inodoro, insípido y no colorear el producto

- estabilidad en un amplio margen de pH

- compatibilidad con los otros constituyentes del producto

La oxidación transcurre mediante un mecanismo de radicales libres, de modo que los

antioxidantes pueden actuar en las diversas fases del mismo, actuando como:

- Antioxidantes preventivos, impidiendo la formación de EROs o la captación de las

especies responsables del comienzo de la oxidación.

- Antioxidantes que interrumpen la propagación de la reacción en cadena de la

autooxidación, convirtiendo radicales libres reactivos a moléculas estables.

- Supresores de los radicales libres de oxígeno, transformando el oxígeno singlete

(estado excitado del oxígeno molecular) en oxígeno triplete (su estado

fundamental).

- Causantes de efectos sinérgicos, de modo que aumentan la actividad con otros

antioxidantes.

- Agentes reductores, convirtiendo los hidroperóxidos en especies no radicalarias.

- Quelatantes, estabilizando los iones metálicos pro-oxidantes (como los cationes de

hierro o cobre).

- Inhibidores de enzimas oxidativas, especialmente lipoxigenasas.


-93-

Según su actuación en el proceso de oxidación, se distingue entre:

- Antioxidantes primarios: captan radicales libres, por lo que pueden retrasar la

etapa de iniciación o interrumpir la propagación de la autooxidación (Reische et al.,

1998). Estos antioxidantes reaccionan con los lípidos y con los radicales peroxilo

dando productos mucho menos reactivos y, por lo tanto, menos eficaces a la hora

de promover la oxidación.

- Antioxidantes secundarios. Pueden actuar mediante distintos mecanismos, por

ejemplo: unión a iones metálicos, captación de oxígeno, conversión de

hidroperóxidos a especies no radicales, absorción de la radiación UV, y desactivación

del oxígeno singlete (Gordon, 2001). Los antioxidantes secundarios generalmente

actúan una vez que se haya formado el radical. Ejemplos de este grupo son el ácido

cítrico (efectivo únicamente en presencia de iones metálicos) y el ácido ascórbico

(un agente reductor eficaz en presencia de tocoferoles u otros antioxidantes

primarios como la vitamina E, los β-carotenos, el ácido úrico, la bilirrubina y la

albúmina).

Por lo general, los antioxidantes actúan mediante diferentes mecanismos mixtos y

cooperativos. Algunos de estos compuestos pueden comportarse como antioxidantes o como

prooxidantes, dependiendo del entorno químico y de las condiciones de operación. Por

ejemplo los flavonoides o el ácido ascórbico actúan como pro-oxidantes en presencia de iones

metálicos de transición, mientras que los carotenoides muestran actividad pro-oxidante a

elevadas presiones parciales de oxígeno (Galati y O'Brien, 2004).

Los antioxidantes pueden ser sintéticos o naturales. Los antioxidantes sintéticos más

empleados son el butilhidroxianisol (BHA), el butilhidroxitolueno (BHT), y la terc-butil-

hidroquinona (TBHQ), que se emplean en alimentos y nutracéuticos. En los últimos años ha

cobrado interés la posibilidad de sustituir estos compuestos por antioxidantes naturales

(Balasundram et al., 2006).

En particular, el empleo de antioxidantes naturales en alimentos podría inhibir

reacciones de oxidación nocivas en el organismo, de modo que su utilización podría ser

beneficiosa de cara a posibles efectos anticancerígenos. Desde este punto de vista, la

incorporación de determinados antioxidantes naturales a los alimentos podría a la vez

contribuir a la estabilización de éstos y aportar beneficios para la salud. Se han citado las


-94-

siguientes razones para avalar la utilización de antioxidantes naturales como ingredientes de

alimentos funcionales:

- actúan como estabilizantes durante el almacenamiento y cocinado, protegiendo a

los lípidos de posibles oxidaciones (Paiva‐Martins et al., 2007; Pereira de Abreu et

al., 2011),

- su absorción por el cuerpo humano permite obtener efectos beneficiosos (Mukoda

et al., 2001; Madhujith y Shahidi, 2007),

- pueden causar efectos beneficiosos sin necesidad de ser absorbidos, bien sea en el

tracto intestinal (Yin et al., 2008) o en el colon (Lee et al., 2007),

- admiten usos terapéuticos como antiinflamatorios, antiisquémicos o para evitar

trombos (Mukoda et al., 2001; Madhujith y Shahidi, 2007).

Entre los antioxidantes naturales más importantes se encuentran los terpenos, la

vitamina E, pequeños péptidos y proteínas, productos de la reacción de Maillard,

carbohidratos y compuestos fenólicos. La investigación se ha centrado principalmente en los

compuestos fenólicos, debido a su elevada capacidad antioxidante (Robards, 2003; Naczk y

Shahidi, 2006; Leopoldini et al., 2011; Conde et al., 2013). Los compuestos estudiados incluyen

fenoles simples, cumarinas, flavonoides, estilbenos, lignanos, taninos hidrolizables, taninos

condensados y florotaninos.

Los oligosacáridos no digeribles también pueden presentar actividad antioxidante,

aunque la información existente es mucho más limitada. Existen estudios de la propiedades

antioxidantes de XOS del salvado de trigo (Katapodis et al., 2003; Yuan et al., 2005b, Rose e

Inglett, 2010), del salvado de arroz y maíz (Veenashri y Muralikrishna, 2011) y de

arabinoxilooligosacáridos obtenidos por hidrólisis enzimática (Cloetens et al., 2008).

4.1.3. Propiedades de los manooligosacáridos

Existe abundante información en la bibliografía acerca de los efectos biológicos de

poli- y oligomananos aislados a partir de microorganismos. Además, se han confirmado efectos

prebióticos para productos obtenidos por hidrólisis de los mananos de plantas. Al-Ghazzewi et

al. (2007) confirmaron la fermentabilidad de hidrolizados enzimáticos de mananos por cepas

probióticas (lactobacillos y bifidobacterias) y por cultivos bacterianos mixtos, así como la


-95-

incapacidad de determinados patógenos para asimilarlos. La fermentabilidad de los

hidrolizados enzimáticos de mananos depende de los tipos de catalizadores empleadas para

causar la despolimerización, que condicionan la estructura de los productos de reacción (Al-

Ghazzewi y Tester, 2012). Este hecho se ha comprobado en estudios sobre fermentabilidad

oligosacáridos obtenidos a partir del KGM por la microbiota intestinal humana (Albrecht et al.,

2009). Hopkins et al. (2009) han observado una reducción de la microbiota patógena o no

beneficiosa y la producción de AGCC en la fermentación de sacáridos obtenidos de madera.

Se ha comprobado que los oligómeros lineales obtenidos por hidrólisis enzimática de

mananos de granos de café con grados de polimerización entre 2 y 5 son sustratos adecuados

para el crecimiento de bifidobacterias y lactobacilos, pero no para el crecimiento de bacterias

nocivas tales como Clostridium perfringens o Escherichia coli (Asano et al., 2001).

Oligosacáridos con grados de polimerización menores o iguales a 10 obtenidos por hidrólisis

ácida de posos de café se comportan como sustratos viables para bacterias probióticas (Fujii et

al. 2001). En la fermentación in vitro de hidrolizados de KGM con un inóculo de heces humanas

se ha observado un aumento de las poblaciones de bifidobacterias y de los grupos

Lactobacillus-Enterococcus y Atopobium (Connolly et al. 2010).

La introducción de oligosacáridos obtenidos del manano del café en la dieta de ratas

conllevó a un incremento de las concentraciones fecales de bifidobacterias y de AGCC (Asano

et al. 2004). Hidrolizados de KGM obtenidos por la acción de ácidos ejercieron efectos mayores

y más rápidos sobre la microbiota del colon que el manano polimérico. La administración a

ratones de sacáridos de cadena corta incrementó los niveles de acetato y propionato en heces,

y afectó a la microbiota fecal favoreciendo el crecimiento de bifidobacterias y dificultando el

de Clostridium perfringens (Chen et al. 2005).

La fermentación de goma de guar parcialmente hidrolizada en cultivos inoculados con

heces humanas se ha observado la producción de AGCC (principalmente del ácido butírico),

hecho que se asocia a la población de Roseburia/Eubacterium (Ohashi et al. 2012). Para este

sustrato el grado de polimerización influye de forma importante en el perfil de AGCC

generados (Stewart y Slavin, 2006). La administración de hidrolizados de goma de guar a

personas sanas incrementó tanto los recuentos de Bifidobacterium spp. en heces como su

proporción frente a la población bacteriana total (Yoon et al. 2006).

Entre los efectos positivos sobre la salud asociados a la administración de

manooligosacáridos se incluyen la regulación del tránsito intestinal, la limitación de los


-96-

episodios de diarrea en pacientes con intolerancia gastrointestinal, y la resistencia a la

adherencia de patógenos específicos en el epitelio del colon sin afectar negativamente a la

microbiota colónica ni a la adherencia de organismos probióticos (Rhoades et al., 2005). Los

manooligosacáridos del café administrados en una dosis adecuada causan efectos laxantes

suaves, aumentando tanto la frecuencia de defecación como la relación

bifidobacterias/anaerobios totales (Umemura et al. 2004a). Se observaron los mismos efectos

cuando los manooligosacáridos se administraron con bebidas mixtas de café (Umemura et al.,

2004b). Se ha empleado la goma de guar parcialmente hidrolizada para tratar el síndrome del

intestino irritable (Giannini et al., 2006), mostrando su potencial en la formulación de una

nueva terapia para tratar la diarrea aguda en niños (Alam et al., 2000). Su uso en combinación

con inulina tiene efectos protectores sobre la microbiota intestinal de mujeres con

estreñimiento, al disminuir la población de Clostridium (Linetxky et al., 2012).

Se han determinado efectos cardio-protectores de los oligomananos relacionados con

el aumento de la excreción de grasa, con la disminución de la absorción de grasa y con la

disminución de los niveles de colesterol sérico. Los manooligosacáridos del café con grados de

polimerización en el intervalo de 2-10 presentan capacidad para regular la presión arterial

(Takao et al., 2009)

Además, los manooligosacáridos reducen la respuesta postprandial aguda, mejoran la

absorción de minerales, y admiten aplicaciones en el tratamiento de enfermedades

inflamatorias, en la formulación de simbióticos terapéuticos para la profilaxis de la piel

(Sutherland et al., 2008) y en el aumento de la pérdida de tejido adiposo en los hombres con

sobrepeso (St-Onge et al., 2012).

4.1.4. Propiedades de los xilooligosacáridos

Se ha confirmado la utilización selectiva de XOS por bifidobacterias y lactobacilos

(Crittenden et al. 2002) y se ha establecido que los XOS de bajo índice de polimerización

incrementan el número de bifidobacterias al mismo tiempo que frenan el crecimiento de

clostridios (Izumi y Azumi, 2001). Van Laere et al. (2000) confirmaron la capacidad de varias

cepas de Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides y Lactobacillus para utilizar los XOS. En

particular, los esterificados con ácido ferúlico promueven el crecimiento de Bifidobacterium

bifidum (Yuan et al. 2005a). Un estudio sobre el uso de de XOS y arabinoxilooligosacáridos

(ArXOS) comerciales por Bifidobacterium adolescentis y Bifidobacterium longum mostró que B.

adolescentis era capaz de crecer sobre XOS comerciales, mientras que ambas cepas fueron


-97-

capaces de emplear ArXOS. B. adolescentis no consumió la arabinosa liberada en el medio de

reacción, mientras que B. longum mostró capacidad para utilizar sacáridos altamente

sustituido, consumiendo en primer lugar las unidades de arabinosa liberadas a partir de la

cadena principal (Pastell et al. 2009).

La fermentación de XOS obtenidos a partir de cascarilla de arroz en medios inoculados

con heces siguió un patrón notablemente diferente del observado para un prebiótico

comercial usado como referencia, permitiendo aumentar el recuento de Bifidobacterium

(Gullón et al. 2011c). XOS neutros y ácidos producidos a partir de pastas kraft de frondosas por

métodos enzimáticos mostraron diferentes comportamientos en la fermentación. Los XOS

neutros fueron utilizados específicamente por Bifidobacterium, mientras que los XOS ácidos

fueron sólo metabolizados por un reducido número de tipos de bacterias, incluyendo

Bifidobacterium. La incorporación de XOS a la dieta de ratas aumentó significativamente el

recuento de bifidobacterias en el ciego (Van Craeyveld et al. 2008). Cloetens et al. (2008)

postularon la capacidad de ArXOS para modular el metabolismo de las colonias bacterianas

intestinales de humanos sanos. Además de la producción de biomasa microbiana, la

fermentación intestinal generó gases (CO2 e H2), lactato y AGCC (Gullón et al. 2011c). La

estimulación del crecimiento bacteriano y los productos de fermentación produjeron un ligero

efecto laxante, que puede ser de interés para casos de estreñimiento.

Las características estructurales de los XOS (incluyendo el patrón de sustitución y la

distribución de masas moleculares) influyen en su potencial prebiótico. XOS con diferente

estructura (lineal, acetilados, con sustituyentes urónicos o por unidades de arabinosa) fueron

fácilmente fermentados in vitro, acumulándose en el medio sacáridos altamente sustituidos

con grados de polimerización en el intervalo 5-7 (Kabel et al., 2002). La fermentación de

oligómeros ramificados conllevó una mayor producción de ácido butírico, un compuesto para

el que se han descrito efectos positivos sobre la salud (Roberfroid et al. 2010).

La asimilación de XOS de zuro de maíz con grados de polimerización medios y altos

obtenidos por cultivos puros de Bifidobacterium y Lactobacillus fue limitada (Moura et al.,

2007); mientras que Bifidobacterium adolescentis fue capaz de utilizar los XOS del salvado de

trigo, dando lugar principalmente a la generación de acetato (Wang et al., 2010). Se han

comprobado aumentos en el crecimiento de lactobacilos y bifidobacterias junto con

disminución del recuento de bacteroides y clostridios en la fermentación de XOS en cultivos

inoculados con heces mixtas de humano y vacuno. La fermentación de XOS por bacterias

intestinales conduce a la formación de ácidos, particularmente acético, propiónico y butírico.


-98-

La fermentación de XOS de diferente pureza obtenidos a partir de residuos de cebada,

eucalipto o cascarilla de arroz en medios inoculados con heces condujo a la formación de

succinato, lactato, formiato, acetato, propionato y butirato, conllevando una marcada caída

del pH (Gullón et al., 2010b, 2011a y c). La fermentación de XOS de distintos grados de

polimerización en un sistema semi-continuo que simulaba el comportamiento del colon

humano transcurrió con aumentos en el recuento de bifidobacterias y aumentos en la

producción de AGCC (sobre todo butirato y acetato) (Makelainen et al. 2010). En términos

comparativos, en la fermentación de XOS de cascarilla de arroz en medios inoculados con

heces se obtuvieron los ácidos láctico y acético como compuestos mayoritarios (Gullón et al.,

2011c). La fermentación de XOS ácidos o acetilados conlleva una menor producción de lactato

y mayores concentraciones de propionato y de butirato que cuando se utilizan XOS lineales o

con ramificaciones de arabinosa (Kabel et al., 2002). La administración de XOS a ratas aumentó

la producción de acetato y butirato en el colon. El aumento de las concentraciones intestinales

de AGCC se asocia a diversos afectos saludables, incluyendo la síntesis de proteínas, mejoras

en el epitelio del colon y en el sistema inmune, sobre el metabolismo de lípidos, en la

prevención del cáncer o en la absorción de iones metálicos.

Se han empleado ArXOS de trigo para estudiar los efectos de la distribución de pesos

moleculares sobre la fermentabilidad in vitro (Hughes et al., 2007). Otros estudios han partido

de oligosacáridos aislados de zuros de maíz (Moura et al., 2007), cascarilla de arroz o residuos

de cebada (Gullón et al., 2011a y b). En estudios con ratas se ha identificado al grado de

polimerización promedio de los XOS como la variable más influyente sobre la producción de

AGCC y la bifidogénesis (Van Craeyveld et al. 2008).

Se han determinado distintas actividades enzimáticas (β-xilanasa, β-xilosidasa, α-

arabinofuranosidasa, α/β-galactosidasa y acetil esterasa) en medios formulados con XOS de

salvado de trigo y fermentados con Bifidobacterium spp o Lactobacillus spp (Manisseri y

Gudipati 2010). Asimismo se han detectado actividades xilanasa, xilopiranosidasa y

arabinofuranosidasa en cultivos de Bifidobacterium adolescentis en medios conteniendo XOS

(Madhukumar y Muralikrishna, 2009).

Los efectos biológicos descritos anteriormente redundan en una mejor salud intestinal

sin efectos adversos en la salud humana. Por ello, la suplementación de la dieta con XOS se ha

considerado como una herramienta dietética, especialmente para la nutrición de ancianos

(Chung et al., 2007). Entre los efectos sobre la salud intestinal se incluyen la reducción de la

duración de los episodios de diarrea, retraso en el vaciado gástrico y menor incidencia de


-99-

enfermedades intestinales inflamatorias, estreñimiento y gastritis (Rautonen et al., 2004;

Gibson y Beer, 2004; Matsuoka, 2005).

Los XOS presentan actividad antioxidante, particularmente los esterificados con ácidos

fenólicos. Los ensayos empleados para determinar la actividad antioxidante incluyen los

basados en la captación del radical 2,2-difenilo-1-picrilhidrazilo (DFPH), en la inhibición de la

oxidación de lipoproteínas de baja densidad mediada por cobre, en la limitación de la

hemolisis de eritrocitos mediada por radicales peróxido (Yuan et al. 2004a, 2005b), en la

utilización de emulsiones de β-caroteno, y en la reducción del ion férrico (Veenashri y

Muralikrishna, 2011). La capacidad de XOS ácidos para reducir iones hierro depende de la

concentración (Yoshino et al., 2007).

Se han descrito efectos inmunomoduladores para los XOS (Madhukumar et al., 2011),

habiéndose considerado el mecanismo de actuación (Chen et al., 2012) y su utilización en el

tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con el sistema inmune (Stahl et al.,

2005). Moure et al. (2006) han recopilado información sobre otras propiedades biológicas de

los XOS, incluyendo su capacidad para reducir las concentraciones de metabolitos

potencialmente peligrosos, su bajo índice glucémico, sus efectos sobre la absorción de

minerales y su actividad antimicrobiana.

4.1.5. Métodos de purificación y refinado de oligosacáridos

La purificación de las disoluciones de oligosacáridos obtenidos por tratamientos

hidrotérmicos es un problema complejo, ya que en el medio de reacción aparecen otros

compuestos no deseados como monosacáridos, furfural y HMF (procedentes de la degradación

de los monosacáridos), compuestos fenólicos (procedentes de la lignina), ácido acético

(obtenido a partir de los grupos acetilo) y otros compuestos procedentes de los extractos

como esteroles, ceras o ácidos grasos (Ekman y Holmbom, 2000; Jönsson et al., 2013). La

pureza típica de los concentrados de oligosacáridos comerciales se encuentra entre el 75 y el

95% en peso (Moure et al., 2006), superior a la de obtenida por medio de autohidrólisis,

siendo necesario recurrir a tecnologías que permitan su purificación.

La bibliografía recoge diferentes estrategias para purificar los licores crudos de

autohidrólisis, incluyendo la posibilidad de separar oligosacáridos de un intervalo definido de

masas moleculares (Egüés et al., 2012; González-Muñoz et al., 2013b). En función del grado de


-100-

pureza deseado, puede resultar necesario aplicar distintos tratamientos físicoquímicos de

forma consecutiva.

El desarrollo de nuevas aplicaciones para los oligosacáridos derivados de las

hemicelulosas requiere un buen conocimiento de su composición química y de cómo afectan

las condiciones de procesamiento a la estructura, pureza y distribución de masas moleculares

de los productos. En este apartado se resume la información disponible sobre los procesos de

purificación y refinado de oligosacáridos.

4.1.5.1. Extracción con disolventes orgánicos

La extracción con disolventes orgánicos permite eliminar parte de los compuestos no-

sacáridos presentes en los licores de autohidrólisis. Se suelen utilizar disolventes de bajo punto

de ebullición, para facilitar su recuperación (Vegas et al., 2004 y 2005); pero hay que prever

posibles problemas derivados de su presencia en el producto final.

Algunos de los disolventes orgánicos empleados en la bibliografía han sido acetato de

etilo, benceno, cloroformo, dietil éter o hexano. Estos disolventes se han empleado también

para eliminar selectivamente inhibidores del crecimiento microbiano presentes en los

hidrolizados cuando estos se orientan a la transformación de los azúcares mediante procesos

fermentativos (Frazer y McCaskey, 1989). En la etapa de recuperación de los disolventes se

obtienen simultáneamente los compuestos extraídos, que pueden presentar posibilidades de

aplicación basadas en su capacidad antioxidante (Cruz et al., 1999; Cantarella et al., 2004;

Conde et al., 2011).

Cruz et al. (2000) han empleado acetato de etilo para extraer furfural, ácido acético y

determinados compuestos fenólicos (como ácido p-hidroxibenzoico y vainillina) de

hidrolizados de salvado de cebada obtenidos por catálisis ácida.

4.1.5.2. Precipitación

La separación por precipitación es una técnica sencilla, de bajo coste y aplicable a

grandes volúmenes de producción. Sin embargo conlleva desventajas como la lentitud, su baja

selectividad y la frecuente dificultad de separar los precipitados (Valcárcel y Gómez, 1988).

Se han utilizado ácidos orgánicos (fórmico, acético o propiónico) para refinar los

productos de hidrólisis parcial del X. En este tipo de tratamientos debe limitarse la proporción


-101-

de agua para conseguir una separación selectiva (Vázquez et al., 2000). También se han

empleado otros disolventes orgánicos (como etanol y acetona) para recuperar los productos

de hidrólisis de las hemicelulosas (Vegas et al., 2004 y 2005; Vázquez et al., 2005).

Los alcoholes son el tipo de compuestos más empleados para la precipitación selectiva

de sacáridos. Se ha empleado metanol para la precipitación de fragmentos de amilopectina de

maíz de alto peso molecular obtenidos por tratamientos con α-amilasa de Bacillus subtilis

(Bertoft y Spoof, 1989). Defloor et al. (1998) emplearon etanol para conseguir la precipitación

fraccionada de maltodextrinas, y Li et al. (2005) emplearon el mismo compuesto para

precipitar oligosacáridos de Brassica juncea, de forma que se eliminaban pigmentos y

compuestos grasos.

Se ha empleado también etanol para precipitar GaGMs de madera de abeto (Song et

al., 2013), y para precipitar sacáridos hemicelulósicos presentes en un subproducto de la

industria de fabricación de tableros con madera de Pinus taeda (Price et al., 2011). Xue et al.

(2012) fraccionaron las hemicelulosas obtenidas por extracción con KOH/H3BO3 de madera de

Pinus yunnanensis por precipitación con disoluciones de etanol de diferentes concentraciones

(15, 60 y 90%). En el precipitado obtenido con una disolución al 15% de etanol predominó la

xilosa, mientras que la manosa fue el azúcar mayoritario en las fracciones obtenidas con

disoluciones de etanol al 60% o 90% en peso. Las hemicelulosas precipitadas con disoluciones

de bajo contenido en etanol presentaron mayor peso molecular que las obtenidas empleando

mayores concentraciones.

4.1.5.3. Adsorción con carbón activo

La adsorción es una técnica por la cual uno o más de los compuestos de una disolución

(adsorbatos) se unen físicamente a una fase sólida (adsorbente). Uno de los adsorbentes más

comunes es el carbón activo, que se ha empleado reducir las cantidades de ácido acético,

furfural, HMF y, muy especialmente, de compuestos fenólicos derivados de la lignina en

hidrolizados, mejorando su fermentabilidad (Rivas et al., 2002).

Se ha utilizado carbón activo para purificar xilitol obtenido por fermentación de

hidrolizados de zuros de maíz (Rivas et al., 2002; Rivas et al., 2009), para recuperar el ácido

ferúlico presente en hidrolizados de pulpa de remolacha (Couteau et al., 1997, 1998), para

separar maltopentosas de otros maltooligosacáridos y para decolorar disoluciones de azúcares

(Ahmedna et al., 2000) y de XOS (Yuan et al., 2004b). Montané et al. (2006) refinaron con


-102-

carbón activo disoluciones de XOS obtenidos por autohidrólisis de cáscaras de almendra,

consiguiendo separar un 64% de los productos derivados de la lignina junto con un 21% de

sacáridos, encontrando que parte de los productos fenólicos separados se encontraban unidos

a XOS. Lai et al. (2006) publicaron que XOS (principalmente xilobiosa) obtenidos por hidrólisis

enzimática del X de zuros de maíz y espiga de avena se adsorben en carbón activo. Kuhn y Filho

(2010) consideraron la purificación de fructooligosacáridos empleando carbón activo en

columnas de lecho fijo.

4.1.5.4. Separación con membranas

Las membranas actúan como barreras que separan dos fases, permitiendo la

transferencia de materia entre ellas de manera selectiva. Según la corriente que contenga los

productos de interés (permeado, retenido o ambos), los tratamientos con membranas

pemiten recuperaciones selectivas por concentración, purificación o fraccionamiento

(Montgomery, 1985). La separación por membranas presenta ventajas como: bajo consumo de

energía, fácil modificación de las variables de operación (presión, temperatura o caudal de

alimentación) y posibilidad de escalado (Bottino et al., 2009; Pinelo et al., 2009).

El funcionamiento de una membrana viene determinado por su carácter hidrófobo o

hidrófilo, junto con el tamaño y las características de los poros. La naturaleza química de la

superficie y la microestructura de la membrana condicionan aspectos tales como la

permeabilidad, selectividad o la resistencia al ensuciamiento (Scott, 1995; Bottino et al., 2009).

Las membranas de acetato de celulosa son hidrófilas y tienen poca tendencia a la adsorción.

Resisten mal las altas temperaturas y pH extremos, así como la acción de los microorganismos.

Las membranas de poli (m-fenileno isolfalamida) presentan mejor estabilidad térmica y

química que las de acetato de celulosa. Las membranas a base de polisulfonas son hidrófobas,

no biodegradables, estables a pH extremos y pueden operar a altas temperaturas. Las

membranas cerámicas presentan mayor estabilidad química, mecánica y térmica que las

anteriores, pero son frágiles y de mayor coste.

Además de las características propias de las membranas, la eficiencia de la separación

depende de las características del fluido a tratar, incluyendo:

i. Concentración de la alimentación. Si aumenta la concentración de sólidos en la

corriente de alimentación, su densidad y viscosidad también aumentan, con lo que

disminuye el flujo de permeado (Cheryan y Chiang, 1984).


-103-

ii. Temperatura. Un aumento de temperatura provoca un aumento en el flujo de

permeado, debido a la disminución de la viscosidad del fluido y al aumento de las

difusividades. No obstante, una temperatura demasiado alta puede afectar a la

membrana y causar degradación de determinados solutos.

iii. pH. En medios que contengan proteínas conviene operar a pH alejados del punto

isoeléctrico para evitar su precipitación y adherencia a la superficie de la membrana.

iv. Velocidad de circulación. Operando a velocidades superiores a 2 m/s a lo largo del

sistema de filtración se limita el ensuciamiento de la membrana.

v. Presión transmembrana (PTM). El flujo de permeado aumenta con la PTM hasta un

valor que depende de las propiedades físicas de la suspensión. La relación entre

PTM y el flujo es lineal cuando se opera con agua pura; pero el flujo de permeado

disminuye cuando se retienen selectivamente solutos presentes en la alimentación

(Cassano y Drioli, 1998).

Un problema que se presenta en la tecnología de membranas y que afecta a los flujos

de permeado es el ensuciamiento. Cartwright (2004) describe varios tipos de ensuciamiento.,

que se podrían reducir si se seleccionan adecuadamente las condiciones de operación.

Los sistemas de separación por membranas se emplean en el tratamiento de agua para

consumo humano (cumpliendo funciones de desinfección y desalinización), en la industria

alimentaria y en procesos biotecnológicos (para separar microorganismos y enzimas) (Bottino

et al., 2009). Las tecnologías de membrana permiten purificar disoluciones de oligosacáridos

(Cano y Palet, 2007), recuperar enzimas de medios fermentativos u otros de sistemas de

transformación biotecnológica y fraccionar compuestos en función de sus masas moleculares

de modo competitivo a nivel industrial (Pinelo et al., 2009).

Gullón et al (2008a y 2011a) y González-Muñoz y Parajó (2010) emplearon membranas

de ultrafiltración y nanofiltración para la purificación las productos de hidrólisis de

hemicelulosas de Eucalyptus globulus. También se han empleado la tecnología de membrana

para purificar sacáridos solubles derivados de las hemicelulosas de las cáscaras de arroz (Vegas

et al., 2006 y 2008b; Gullón et al., 2008b, 2010b). Gullón et al. (2010b) recuperaron un 88% de

los sacáridos hemicelulósicos presentes en hidrolizados de cáscaras de arroz utilizando

membranas de nanofiltración y ultrafiltración, operando en modo concentración y en modo

diafiltración.


-104-

González-Muñoz et al. (2011 y 2013b) estudiaron la purificación y fraccionamiento de

oligosacáridos obtenidos a partir de hemicelulosas de Pinus pinaster empleando membranas

con distinto tamaño de corte en modos concentración y diafiltración. Andersson et al. (2007) y

Persson et al. (2010) han publicado estudios sobre la purificación de productos derivados de

GaGM y GM, respectivamente por tecnologías de membrana.

Shi y Lai (2005) purificaron oligosacáridos presentes en aguas de lavado de soja

mediante ultrafiltración (para eliminar proteínas) y y nanofiltración (para eliminar sales),

obteniendo un concentrado que contenía un 30% de oligosacáridos de soja (mayoritariamente

estaquiosa y rafinosa). Operando en condiciones adecuadas, las tecnologías de membrana

también permite recuperar fenoles con potencial actividad antioxidante y ácidos carboxílicos a

partir de disoluciones multicomponente (Arsuaga et al., 2006).

4.1.5.5. Evaporación y deshidratación

La evaporación a vacío puede ser la primera etapa en el proceso de refinado de

disoluciones de oligosacáridos obtenidas mediante un tratamiento hidrotérmico. Además de

aumentar la concentración de oligosacáridos, la evaporación permite la eliminación

compuestos volátiles como el ácido fórmico, el ácido acético y aromas (o sus precursores), que

podrían proporcionar olores característicos a los concentrados (Eden et al., 1998). En la

producción de concentrados de oligosacáridos se han empleado procesos como el secado por

atomización y la liofilización (Gabrielii et al., 2000; Palm y Zacchi, 2004).

4.1.5.6. Intercambio iónico

El intercambio iónico permite eliminar iones de naturaleza orgánica o inorgánica

presentes en los hidrolizados de MLCs. La principal ventaja del intercambio iónico respecto a

otros procesos de separación reside en que permite cambiar la composición iónica de una

disolución sin introducir sustancias indeseables. Además, la técnica es de fácil ejecución, lo que

proporciona otra ventaja comparativa.

En ocasiones, este tipo de técnicas permite alcanzar no sólo cambios de composición

basados en intercambio iónico, sino también derivados de la adsorción de solutos en la matriz

polimérica de la propia resina (De Mancilha y Karim, 2003).

El intercambio iónico se emplea en la industria alimentaria para desmineralizar

líquidos azucarados y jarabes, controlar la acidez, el olor, el color y el sabor y aislar o purificar


-105-

un aditivo o un componente de un determinado alimento. La resina D392 se ha utilizado para

decolorar el jarabe de soja (Zhong et al., 2006), mientras que la Lewatit S-5328-A se ha

empleado para decolorar vinagre, ya que posee gran afinidad por el ácido hidroxicinámico

(que puede eliminar hasta en un 99% del total) y el ácido gálico (Achaerandio et al., 2007).

Vegas et al. (2004) y Gullón et al. (2010c) han empleado resinas de intercambio iónico

para purificar licores de autohidrólisis obtenidos a partir de residuos agrícolas, que contenían

sacáridos solubles derivados de Xs. Asimismo, se ha utilizado intercambio iónico para aislar

oligosacáridos esterificados con ácido ferúlico producidos por hidrólisis enzimática a partir de

ArXs de salvado de trigo (Yuan et al., 2004b), así como XOS con sustituyentes urónicos (Izumi

et al., 2004).

El empleo etapas consecutivas de intercambio iónico con resinas de distinto tipo

(aniónicas fuertes, aniónicas débiles, catiónicas fuertes y catiónicas débiles) ha permitido

mejorar los resultados obtenidos operando con un único tipo de resinas de intercambio iónico.

Vegas et al. (2006) utilizaron dos etapas de cambio iónico con distintas resinas (la aniónica

Amberlite IRA-96 y la catiónica Amberlite 200) para purificar XOS obtenidos a partir de cáscara

de arroz, y Yuan et al. (2004b) emplearon también dos etapas consecutivas con distintas

resinas (la catiónica 732 y la aniónica D202) para purificar XOS obtenidos a partir de zuros de

maíz, operando a escala piloto.

La bibliografía ha considerado también la posibilidad de emplear múltiples etapas de

diferente naturaleza para eliminar compuestos no deseados. Por ejemplo, las técnicas de

membrana se han combinado con la utilización de resinas de intercambio iónico (Gullón et al.,

2010b y 2011a).

4.1.5.7. Cromatografía

La cromatografía permite separar mezclas de oligosacáridos, obteniéndose fracciones

que difieren entre sí en propiedades tales como carga, tamaño, tipo y distribución de

sustituyentes y grado de sustitución. Estas fracciones son de utilidad, por ejemplo, para

realizar estudios de las interrelaciones estructura-función. La cromatografía de filtración en gel

se ha aplicado a la separación de oligosacáridos, en donde la fase móvil se mueve a través de

una fase estacionaria (García et al., 1996) con naturaleza de gel, formado por gránulos de un

material esponjoso hidratado con poros de diámetro adecuado para llevar a cabo la separación

que se persigue. Esta técnica se ha empleado para la separar componentes oligoméricos de


-106-

mezclas de sacáridos (Yu et al., 2010) empleando fases estacionarias como Bio-Gel (Al-Tamimi

et al., 2006; Van Laere et al., 2000; Renard et al., 1998) y Sephadex (Yu et al., 2010). Van Laere

et al. (2000) utilizaron Bio-Gel P2 para separar arabinogalactooligosacáridos con grados de

polimerización hasta 9 y arabinooligosacáridos con grados de polimerización hasta 5. La misma

técnica se ha empleado para separar mezclas de manooligosacáridos empleando Bio-Gel P-4

(Young et al., 1998) y Bio-Gel P-2 (Simões et al., 2011).

4.1.6. Análisis estructural de oligosacáridos

Los recientes progresos alcanzados en la elucidación de la estructura química de los

oligosacáridos han sido posibles gracias al uso simultáneo de distintas técnicas experimentales.

Los oligosacáridos pueden separarse por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC),

por ejemplo usando columnas de fase reversa, columnas amino-gel de sílice o resinas de

intercambio iónico sulfonadas conteniendo iones calcio, plomo o plata. El empleo de

cromatografía por exclusión de tamaño molecular (HPSEC), la cromatografía de permeación de

gel (GPC), la cromatografía de intercambio aniónico (HPAEC) con detección amperométrica

pulsada (PAD), la electroforesis capilar (CE) o la espectrometría de masas (MS) permiten la

separación e identificación de la estructura de los oligosacáridos y proporcionan información

sobre la distribución de pesos moleculares.

Corradini et al. (2013) han recopilado datos sobre las distintas técnicas analíticas

empleadas para analizar oligosacáridos con propiedades prebióticas. Entre ellas, la

desorción/ionización mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo y

espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS) y la HPAEC-PAD aportan valiosa infomración sobre

el tipo de unidades estructurales y la distribución de tamaños de las cadenas de poli- y

oligosacáridos. La HPAEC ofrece alta resolución y sensibilidad en el estudio de sacáridos

oligoméricos y poliméricos (Larew y Johnson, 1988). McPherson y Jane (1999) emplearon

HPAEC-PAD en el análisis de hidrolizados enzimáticos de almidón, identificando

maltooligosacáridos hasta un grado de polimerización de 85.

MALDI-TOF-MS es una técnica que proporciona información sobre la longitud de las

cadenas y sobre el tipo de unidades estructurales presentes en sacáridos solubles de naturaliza

polimérica u oligomérica derivados de hemicelulosas. Se considera una herramienta eficaz,

que ofrece resultados precisos, versatilidad analítica y muy alta sensibilidad (Harvey, 1999).

Nabarlatz et al. (2007) emplearon MALDI-TOF-MS para caracterizar los XOS obtenidos a partir


-107-

de la autohidrólisis de la cáscara de almedra, confirmando la presencia de XOS neutros y

ácidos, estos últimos derivados del GoX.

La resonancia magnética nuclear (NMR) se emplea en la determinación de la

estructura de los oligosacáridos (Bock et al., 1984). En particular, la NMR bidimensional se ha

empleado para la determinación de la posición y configuración de las uniones glicosídicas

(Rutherford y Homans, 1995).

La mayoría de la información estructural sobre oligosacáridos se ha obtenido

combinando las técnicas citadas anteriormente (Eggleston y Côté, 2003). Cada una de ellas

aporta una información que a modo de «puzzle» que permite complementar la información

estructural y la distribución de masas moleculares de las mezclas de oligosacáridos. Gullón et

al. (2010b y 2011a) han caracterizado las estructuras de sacáridos derivados de las

hemicelulosas de cáscaras de arroz y de madera de Eucalyptus globulus empleando HPLC,

HPAEC, MALDI-TOF-MS, NMR y HPSEC. Price et al. (2011) estudiaron la composición y

estructura de compuestos derivados del GaGM de madera de pino empleando MALDI-TOF-MS,

NMR, HPSEC y HPLC. González-Muñoz et al. (2013b) obtuvieron distintas fracciones purificadas

de sacáridos hemicelulósicos derivados de madera de Pinus pinaster empleando membranas,

que caracterizaron mediante MALDI-TOF-MS, HPSEC y HPLC.

La electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE) es una tecnología que

también se ha empleado para detectar y separar oligosacáridos, particularmente los

glicoconjugados (Jackson, 1994). A pesar de que esta tecnología es simple y fiable, su uso

todavía no está extendido, debido a la falta de información. La separación de oligosacáridos en

mezclas complejas se ha llevado a cabo empleando cromatografía planar automatizada

(Vaccari et al., 2001), basada en la cromatografía de capa fina (TLC), y que incorpora un

desarrollo automatizado de los cromatogramas. Esta técnica permite una separación

reproducible de oligosacáridos individuales presentes en mezclas complejas. Además, la

cromatografía de gases (GC) también se emplea para el análisis de oligosacáridos,

particularmente en estudios estructurales.

4.1.7. Determinación del potencial prebiótico

Cuando los ONDs alcanzan el colon son metabolizados por especies bacterianas

intestinales, produciendo AGCC, lactato y/o gases (Macfarlane y Macfarlane, 2003). La

producción de AGCC viene determinada por varios factores, incluyendo el número y tipo de


-108-

microorganismos presentes en el colon (Roberfroid, 2005), el tipo y características del sustrato

(Cook y Sellin, 1998), y el tiempo de tránsito intestinal.

4.1.7.1. Determinación de ácidos grasos de cadena corta (AGCC)

Los AGCC son ácidos orgánicos que contienen hasta 6 átomos de carbono, y

corresponden a los principales productos resultantes de la fermentación bacteriana. La

fermentación intestinal de carbohidratos da lugar principalmente a acetato, propionato y

butirato (Cummings, 1995), siendo el acetato el mayoritario (en torno al 60% del total). Los

ácidos valérico, hexanoico, isobutírico e isovalérico también se forman en el colon en menores

proporciones (5-10% del total). El ácido láctico es un producto intermedio de la fermentación

de los carbohidratos, que se acumula en medio el medio cuando el pH desciende por debajo

de 5,5, condiciones en que se inhibe la producción fermentativa de otros ácidos (Soergel,

1994). Los AGCC se absorben rápidamente en el ciego y en el colon, excretándose sólo un 5 -

10% del total.

Xie et al. (2013) han sistematizado información sobre las técnicas empleadas para el

análisis de AGCC, así como sus respectivas ventajas e inconvenientes. Las técnicas más

empleadas son HPLC y CG. Gullón et al. (2010b y 2011a) y Gómez et al. (2010). emplearon

HPLC con columnas de exclusión iónica y detección por índice de refracción (IR) para este fin,

mientras Harrison (2010) y Cuervo et al. (2013) utilizaron GC-MS. En matrices biológicas

complejas se utilizan otras alternativas para aumentar la sensibilidad, como técnicas de

extracción en espacio de cabezas con CG. Se ha empleado NMR y GC-MS tras derivar las

muestras biológicas con cloroformato de etilo (Gao et al., 2009).

4.1.7.2. Dinámica de poblaciones bacterianas de la microbiota intestinal

Para estudiar la actividad de la microbiota intestinal resulta útil disponer de métodos

fiables para medir el crecimiento de las poblaciones bacterianas (incluyendo las especies

beneficiosas y las perjudiciales).

El estudio del potencial prebiótico de los oligosacáridos se ha llevado a cabo durante

muchos años empleando técnicas de recuento en cultivos. Sin embargo, hoy en día se acepta

que muchos de los microorganismos implicados no pueden cuantificarse adecuadamente por

estos medios. Para llevar a cabo la identificación de las diferentes poblaciones bacterianas que

forman parte del tracto gastrointestinal resultan preferibles otras técnicas basadas en Biología


-109-

Molecular, entre las que cabe citar el ribotipado, la secuenciación de ADN ribosomial, la

electroforesis en gel en presencia de campos electrónicos reorientados o el empleo de sondas

genéticas (McCartney y Gibson, 1998).

La técnica FISH (Hibridación in situ con fluorescencia) emplea sondas de ácidos

nucleicos marcadas con grupos fluorescentes para la detección de grupos microbianos

específicos, permitiendo no sólo conocer la filogenia de las bacterias, sino también su

morfología, localización, abundancia y actividad. Las dianas de las sondas son las regiones 16S

del ARNr de las bacterias. Utilizando sondas específicas puede determinarse la especie, el

género, la familia y el dominio. Durante los últimos quince años se han desarrollado cientos de

sondas de oligonucleótidos marcadoras de ARNr específicas para células procariotas, y se ha

sistematizado la información en bases de datos que pueden consultarse online

(http://www.microbial-ecology.net/probebase). Los marcadores fluorescentes se visualizan

mediante microscopia de fluorescencia o microscopía confocal de barrido láser. La fiabilidad

de la técnica aumenta cuando se utiliza más de una sonda para la detección de un

determinado microorganismo. Resulta factible emplear varias sondas conteniendo distintos

grupos marcadores fluorescentes en un único experimento de hibridación (Mandalari et al.,

2007; Beards et al., 2010).

4.1.8. Medida de la actividad antioxidante

Huang et al. (2005) han mencionado la diversidad de la nomenclatura empleada en la

bibliografía para referirse a la acción de un compuesto antioxidante: eficiencia, poder,

parámetro, potencial, potencia, capacidad o actividad antioxidante. En todos los casos estos

valores carecerían de sentido sin indicar las condiciones en las que se determinaron

(temperatura, medio de reacción, etc.). Dado que la medida obtenida en un ensayo concreto

indica la reactividad química en las condiciones específicas del mismo, es inapropiado y

engañoso generalizar los datos como indicadores de «actividad antioxidante total».

Durante los últimos años se han desarrollado diversos métodos para determinar la

actividad antioxidante, pero hasta el día de hoy ninguno de ellos está aceptado como estándar

único. Se han usado diferentes sustratos, diferentes medios de reacción, y diferentes técnicas

analíticas para evaluar la efectividad de los antioxidantes. Por ello los resultados obtenidos por

distintos investigadores son a menudo difíciles de interpretar y comparar. La Tabla 4.1 muestra

los ensayos in vitro utilizados para la evaluación de la actividad antioxidante.


-110-

Diversas revisiones bibliográficas han abordado los problemas asociados a la

determinación de la actividad antioxidante (Andrade et al., 2008; Singh y Singh, 2008; Moon y

Shibamoto, 2009). La actividad antioxidante depende de diversos factores, incluyendo el tipo

de sustrato, el medio, la presencia de iniciadores, las condiciones de oxidación, el reparto de

los compuestos activos entre las fases acuosa y lipídica, y el método experimental utilizado.

Deben tenerse en cuenta tanto los resultados que se obtienen para niveles bajos de oxidación

como la posible modificación del mecanismo de reacción en condiciones de oxidación

acelerada (Antolovich et al., 2002; Decker et al., 2005; Frankel y Finley, 2008).

Para una mejor caracterización y cuantificación de la actividad antioxidante deben

utilizarse varios métodos, ya que los resultados obtenidos en sólo uno de ellos pueden ser

poco representativos. A la hora de determinar la actividad antioxidante in vitro deben

considerarse los siguientes aspectos:

Tabla 4.1. Métodos in vitro utilizados habitualmente para determinar la actividad

antioxidante de extractos y compuestos puros

Captación de peróxido de hidrógeno

Capacidad de captación del radical hidroxilo

Captación de ácido hipocloroso

Capacidad de absorción de radicales de oxígeno

Captación del radical peroxilo

Captación de peroxinitrito

Captación de radical superóxido

Capacidad total de captación de oxidantes

Captación total de radicales

Capacidad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC)

Capacidad de captación del radical DFPH

Atenuación del radical α-tocoferoxilo

Reactividad antioxidante total

Método de fosfomolibdeno

Capacidad reductora del ión cobre

Reducción del radical de Fremy

Decoloración del β-caroteno

Trolox: ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico

DFPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo


-111-

- la identificación y determinación de los compuestos activos,

- la evaluación de la protección contra la oxidación en modelos alimentarios y/o

fisiológicos con condiciones químicas, físicas y ambientales semejantes a las que

existen en los sistemas reales que se pretende proteger,

- la comprensión detallada de los mecanismos de oxidación,

- la determinación de los productos iniciales y secundarios,

- la utilización de concentraciones de reactivos a niveles fisiológicamente relevantes.

Los distintos métodos suelen clasificarse en base a los mecanismos por los que actúan.

Dependiendo de las reacciones involucradas se distingue entre dos tipos de ensayos: los que

implican la transferencia de un átomo de hidrógeno (HAT) con la captación de radicales libres, y los

que implican la transferencia de un electrón (ET) (Huang et al., 2005)

Los métodos HAT miden la capacidad de captación de radicales libres por donación de un

hidrógeno. Generalmente estos ensayos se basan en un esquema de reacciones competitivas entre

el antioxidante y el sustrato por los radicales peroxilo a través de la descomposición de

azocompuestos y están asociadas a la peroxidación lipídica (Moon y Shibamoto, 2009). El pH y el

disolvente afectan a las reacciones de estos antioxidantes, que son generalmente muy rápidas.

Entre los métodos de este tipo se pueden citar el de inhibición de la autooxidación inducida de

lipoproteínas de baja densidad (LDL), capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC) o el de

captación total de radicales (TRAP).

Los métodos de transferencia de electrones (ET) o reductores miden la capacidad de un

antioxidante en la reducción de un oxidante, que cambia de color en el proceso. Dado que los

ensayos ET se basan en la desprotonación y en el potencial de ionización del grupo funcional

reactivo, estos ensayos dependen del pH al que se realizan. Entre los ensayos de este grupo citar el

de los fenoles por reactivo Folin‐Ciocalteu (FCR), la capacidad antioxidante en equivalentes Trolox

(TEAC), el poder antioxidante del ion férrico (FRAP), el ensayo de oxidación del xilenol (FOX), el

ensayo con tiocianato férrico (FTC), el método aldehído/ácido carboxílico (ACA), el potencial

antioxidante total por complejos de Cu(II), o el de capacidad antioxidante por captación del radical

DFPH.

Dado que los sistemas in vivo son múltiples y muy heterogéneos, los resultados obtenidos en

ensayos in vitro pueden ser difíciles de extrapolar a los primeros (Haenen et al., 2006). En sistemas

reales la posible acción de los antioxidantes sobre los tejidos se ve afectada también por


-112-

fenómenos de absorción y distribución, así como por el metabolismo. Se ha propuesto la

utilización de modelos animales para evaluar la el daño oxidativo y medir la protección

antioxidante, como paso previo para determinar los efectos antioxidantes in vivo.

4.2. Productos de reacción de los azúcares hemicelulósicos

Las hexosas sufren reacciones de deshidratación en medio ácido, generando HMF, que

puede reaccionar en el mismo medio para dar ácido levulínico y ácido fórmico en proporciones

equimoleculares. De forma análoga, las pentosas en medio ácido pueden deshidratarse a

furfural. La cinética es compleja, ya que existen otras reacciones que transcurren

simultáneamente, entre las que tienen particular importancia las que conducen a la formación

de sustancias húmicas insolubles. La Figura 4.1 presenta un esquema simplificado de las

reacciones de las principales fracciones de un material lignocelulósico en medio ácido. Los

furanos (HMF y furfural) y el ácido levulínico se han considerado como una alternativa de

interés para la valorización de los MLCs (Chheda et al., 2007a; Zhang y Weitz 2012; Lange et

al., 2012; Rackemann y Doherty 2011).

Figura 4.1. Descomposición de los MLCs catalizada por ácidos (Rackemann y Doherty, 2011)

4.2.1. Reacciones de degradación de hexosas

La deshidratación de hexosas empleando catalizadores ácidos es una de las tecnologías

más estudiadas para la obtención de HMF y/o ácido levulínico. En una primera etapa las


-113-

hexosas se deshidratan para producir HMF, perdiendo tres moléculas de agua. El HMF actúa

como un intermedio de reacción, ya que una posterior rehidratación, lleva a la formación de

ácido levulínico y ácido fórmico (Figura 4.2.) (Rackemann y Doherty, 2011). Otras reacciones

simultáneas llevan a la formación de nuevos compuestos, principalmente sustancias insolubles

(mayoritariamente huminas). La formación de estas sustancias y del ácido fórmico reduce los

rendimientos de ácido levulínico.

Figura 4.2. Esquema simplificado de la descomposición de la glucosa catalizada por ácidos: (1) glucosa;

(2) HMF; (3) ácido levulínico; (4) ácido fórmico.

Numerosos trabajos han empleado la glucosa y la fructosa como sustratos para la

síntesis de HMF. Para el caso de las cetosas (fructosa) se propone una reacción directa, lo que

explica los mayores rendimientos que se obtienen al emplear este azúcar (Rackemann y

Doherty, 2011). Sin embargo, la formación de HMF a partir de aldosas (glucosa, galactosa o

manosa) transcurre a través de la formación de un enediol como intermedio, que

posteriormente se transforma a HMF.

Los mecanismos cinéticos propuestos para la deshidratación de hexosas a HMF en

medio acuoso con catálisis ácida incluyen dos posibilidades. La primera asume reacciones a

través de intermediarios acíclicos partiendo del enediol, mientras que la otra acepta la

formación de intermedios cíclicos formados a partir de la fructosa (Kuster, 1990). La ruta

acíclica es la más aceptada generalmente en base a los estudios cinéticos realizados con

glucosa (Hayes et al., 2006; Rackeman et al., 2011).

Los reactivos y los intermedios de reacción pueden participar en reacciones adicionales

(isomerización, fragmentación o deshidratación de los azúcares, polimerización de

intermedios, etc.), cuya importancia depende de las condiciones experimentales. Por ejemplo,

Lü y Saka (2012) estudiaron la isomerización de glucosa a manosa y viceversa, o de galactosa a

tagatosa o talosa. Moliner et al. (2010) emplearon catalizadores sólidos (zeolitas) en medio

acuoso para tratar disoluciones de glucosa al 10% en peso. Tras 12 min de tratamiento a 140


-114-

°C un 46% de la glucosa no reaccionó, mientras un 31% y un 9% en peso se convirtieron en

fructosa y manosa, respectivamente. La isomerización de glucosa a fructosa puede ser un paso

clave en la mejora de los rendimientos en la conversión a HMF.

En medio acuoso, el HMF puede rehidratarse para convertirse en ácido levulínico y

ácido fórmico. El HMF es así un producto intermedio, cuya concentración alcanzará un valor

máximo que dependerá de las condiciones experimentales. Sin embargo, los estudios

realizados muestran que las reacciones de descomposición del HMF son más rápidas que las

de formación, con lo que las concentraciones de HMF son bajas (Girisuta et al., 2007; Shen y

Wyman, 2012; Girisuta y col., 2013). En un reciente estudio realizado con fructosa, Zhang y

Weitz (2012) indican que la rehidratación del HMF transcurre de modo que los C-1 y C-6 del

HMF pasan a formar parte de la cadena de carbono del ácido fórmico y del metilo (C-5) del

ácido levulínico, respectivamente.

Girisuta et al. (2006) han estudiado la cinética de descomposición del HMF en

disolución acuosa catalizada por ácido sulfúrico (0,05-1,0 M) a distintas temperaturas (98, 141

y 181 °C) operando con distintas concentraciones iniciales de HMF (0,10-1,0 M). El modelo

cinético propuesto incluía las reacciones de formación de ácido levulínico y ácido fórmico, así

como la formación de sustancias húmicas. Los resultados mostraron que los rendimientos en

ácido levulínico eran superiores trabajando con concentraciones altas de catalizador y

concentraciones bajas de HMF, con una influencia mínima de la temperatura. En todos los

casos la reacción más favorecida era la de formación de ácido levulínico, alcanzándose

rendimientos superiores al 90%. Patil y Lund (2011) hicieron un estudio sobre la formación de

huminas a partir de HMF en medios catalizados por ácidos, concluyendo que estas derivan del

HMF (conservando su anillo furánico y su grupo hidroximetil, pero no su grupo carbonilo), sin

participación ni del ácido levulínico ni del ácido fórmico, ambos estables en medio ácido

(Girisuta et al., 2007).

Un factor a tener en cuenta en este tipo de sistema es la participación de reacciones

adicionales a las que conducen a ácido fórmico y ácido levulínico o a sustancias húmicas, y que

pueden llevar a la formación de otros compuestos, por ejemplo de naturaleza furánica

(furfural, dímeros de HMF…), aromática (1,2,4-trihidroxibenzeno, materiales poliméricos), u

otros ácidos orgánicos (como láctico o glicólico) (Verendel et al., 2011). La descomposición de

glucosa o fructosa en agua sub- o supercrítica ha conducido a la formación de eritrosa,

piruvaldehído, gliceraldehído, dihidroxiacetona, o glicoaldehído en bajas concentraciones

(Kabyemela et al., 1999; Srokol et al., 2004). La formación de estos compuestos depende de las


-115-

materias primas de las que se parte y de las condiciones de operación, y resultan importantes

sobre todo porque su presencia afecta a las etapas de purificación del producto final.

4.2.2. Reacciones de degradación de pentosas

En medio ácido, las pentosas se deshidratan a furfural, perdiendo tres moléculas de

agua por cada molécula de pentosa (ver Figura 4.3). Algunos autores citan la posterior

formación de ácido fórmico a partir del furfural, mientras otros trabajos indican que esta ruta

no ha sido detectada o que la conversión es mínima. En términos comparativos, el furfural es

un compuesto mucho más estable en medio ácido que el HMF, siendo sus reacciones de

descomposición más lentas que las de formación. Ello implica que pueden alcanzarse mayores

concentraciones y rendimientos que en el caso del HMF. Al igual que en el caso del HMF hay

reacciones que reducen el rendimiento en furfural, dando lugar a la formación productos

solubles y huminas (Enslow y Bell, 2012).

Figura 4.3. Esquema simplificado para la transformación de hemicelulosas formadas por homoxilano a furfural con catálisis ácida (Enslow y Bell, 2012)

La deshidratación de xilosa a furfural en medio ácido acuoso suele llevarse a cabo en el

intervalo de temperaturas 150 - 220 °C, alcanzando unos rendimientos en furfural en torno al

50-70% del máximo teórico (Zeitsch, 2000). Antal et al. (1991) estudiaron el mecanismo de

deshidratación de la xilosa a furfural, concluyendo que la catálisis ácida transcurre vía

formación de 2,5-anhidroxilosa. Confirmaron además la formación de pequeñas cantidades de

gliceraldehído, piruvaldehído, ácido láctico, glicoaldehído y ácido fórmico.

HuminasProductos de degradación

XilosaHemicelulosa

Xilobiosa(o otros con DP)

Furfural


-116-

Lü y Saka (2012) han estudiado las reacciones de isomerización de los monosacáridos

mayoritarios en las hemicelulosas en medio acuoso a temperaturas hasta 250 °C. En el caso de

las pentosas, observaron que la arabinosa se isomerizaba a ribulosa y ribosa, mientras que la

xilosa se isomerizaba a xilulosa y lixosa. Además, confirmaron la formación de HMF a partir de

pentosas, para lo que proponen la formación de un intermedio cíclico con una posterior

condensación aldólica

4.2.3. Tecnologías de producción

Existen varias revisiones bibliográficas en que se recogen las diferentes tecnologías de

producción de HMF, furfural o ácido levulínico, donde se discutenlas ventajas e inconvenientes

de cada una de ellas (van Putten et al., 2013; Rackemann y Doherty, 2011). El empleo de

catalizadores ácidos en disolución, catalizadores sólidos, líquidos iónicos o los medios líquidos

bifásicos son los ejemplos más significativos. Corma et al. (2007) han sistematizado

información sobre los catalizadores y disolventes empleados en los tratamientos de biomasa o

la conversión de los azúcares solubilizados. La elección de una determinada tecnología

condiciona, entre otros factores, el producto final a obtener.

4.2.3.1. Tecnologías que emplean catalizadores ácidos en disolución

En muchas de las investigaciones realizadas para la obtención de ácido levulínico y

compuestos furánicos a partir de azúcares sintéticos, celulosa y biomasa se han empleado

diversos ácidos minerales (en particular, ácidos de Brönsted) en disolución acuosa. Las

variables más influyentes (respecto a las que se suele optimizar la reacción) son:

i. Concentración de ácido. Si las demás variables permanecen constantes, la cinética

de la reacción se hace más rápida al aumentar la concentración de ácido.

Condiciones severas en presencia de concentraciones de ácido elevadas favorecen

las reacciones secundarias y la repolimerización de productos e intermedios,

además de aumentar la corrosión de los equipos.

ii. Temperatura. En muchos casos, la dependencia de las reacciones individuales con la

temperatura se ha modelizado a través de la ecuación de Arrhenius.

iii. Relación líquido-sólido (RLS). La cantidad relativa de disolución y sólido afectan a la

mezcla y a transferencia de materia entre fases (Runge y Zang, 2012; Fang y Hanna,

2002).


-117-

iv. Tiempo de reacción. Cuando la temperatura, la concentración de ácido y la RLS

están fijadas, el rendimiento óptimo corresponde a un tiempo de tratamiento

definido (Tabla 4.7).

Se han empleado también sales ácidas de Lewis (AlCl3, SnCl4, VCl3, InCl3, GaCl3, LaCl3,

YbCl3…) como catalizadores, generalmente en combinación con ácidos de Brönsted (Pagán-

Torres et al., 2012; Choudhary et al., 2013). Estos catalizadores favorecen la isomerización de

glucosa a fructosa, con lo que se pueden lograr mayores rendimientos en HMF o en ácido

levulínico. Pueden emplearse en combinación con otra fase líquida inmiscible, a la que se

transfieren selectivamente los productos de reacción, limitando su descomposición.

El flúor es el elemento más electronegativo de la tabla periódica, lo que hace de los

compuestos fluorados poderosos disolventes o catalizadores. El compuesto más comúnmente

utilizado como catalizador para el procesamiento de sacáridos es el ácido trifluoroacético

(TFA). Heeres et al. (2009) obtuvieron un rendimiento del 57% en base molar (tan solo un 2%

menor que el mejor resultado usando ácido sulfúrico) operando con concentraciones de TFA

en el rango 0,1-1,0 M a 180 °C. El principal inconveniente que presenta el TFA es la formación

de un azeótropo en presencia de agua cuando se alcanzan los 105˚C, lo que dificulta la etapa

de recuperación (Rackemann y Doherty, 2011). La alternativa pasa por emplear como

catalizadores otros compuestos derivados del TFA, por ejemplo el ácido

heptadecafluorononanoico, junto con otro disolvente (perfluorohexano). De esta forma se

facilita la recuperación y la reutilización de los catalizadores, reduciéndose así los costes de

proceso (Heeres et al., 2009).

Los fluidos supercríticos pueden exhibir tanto propiedades ácidas como básicas, y

pueden emplearse para mejorar la selectividad. Aunque los experimentos con agua en

condiciones tanto sub- como supercríticas para la producción de HMF conlleva rendimientos

bajos (Boisen et al., 2009). Bicker et al. (2003) obtuvieron un rendimiento de fructosa en HMF

del 75% empleando acetona supercrítica.

Los fluidos supercríticos se han empleado también para la extracción de furfural del

medio de reacción. De esta forma Sangarunlert et al. (2007) consiguieron alcanzar

rendimientos en torno al 90% empleando CO2 supercrítico. Sin embargo, el proceso requiere

elevadas presiones, y los costes de los equipos son elevados (Rackemann y Doherty, 2011).


-118-

4.2.3.2. Tecnologías que emplean catalizadores sólidos

Un catalizador sólido es típicamente un material poroso, con un área superficial

elevada en la que tienen lugar las reacciones. La catálisis heterogénea representa una

alternativa a la catálisis homogénea con ventajas derivadas de la fácil separación y reutilización

del catalizador y de la menor corrosión de los equipos (Lin et al., 2009). Entre estos

catalizadores se emplean resinas poliméricas, zeolitas, arcillas naturales y óxidos (Al2O3, TiO2,

SiO2, etc.) o formas iónicas de Pt, Ni, Cu, Co o Pd (García, 2005). Como se ha comentado

previamente, la inclusión de ácidos de Lewis en estos catalizadores (generalmente en zeolitas)

es un campo en que se investiga actualmente (Roman-Leshkov et al., 2010; Bermejo-Deval et

al., 2012).

4.2.3.3. Sistemas líquidos bifásicos

Están formados por dos fases líquidas inmiscibles. Una de ellas presenta una alta

afinidad por los azúcares y el catalizador ácido, mientras que la otra presenta una mayor

afinidad por los furanos. La deshidratación de los azúcares produce la aparición de los furanos

correspondientes, que se transfieren a la otra fase, de modo que se minimizan las reacciones

de descomposición y se reduce la formación de subproductos no deseados. Así, cuando se

procesan hexosas, la utilización de una fase líquida que retire el HMF evita la posterior

generación de ácido levulínico. Las dos fases se pueden separar fácilmente por decantación,

facilitando la recuperación del producto y del catalizador.

La fase rica en catalizador puede ser un disolvente orgánico polar, agua, un compuesto

fluorado o un líquido iónico. Algunos ejemplos de los disolventes empleados para la extracción

de furanos son el tetrahidrofurano, 2-sec butilfenol y metil-isobutil-cetona (MIBK) (Pagán-

Torres et al., 2012; Weingarten et al., 2010). La fase acuosa puede modificarse con la inclusión

de otros disolventes solubles en la misma, como acetona, dimetilsulfóxido (DMSO) o

polietilenglicol (PEG), con la intención de reducir el porcentaje de agua y con ello limitar las

reacciones de rehidratación del HMF (Biosen et al., 2009). En la práctica, las reacciones

secundarias siguen ocurriendo, aunque en menor medida. La formación de sustancias húmicas,

la solubilidad parcial de las dos fases líquidas y el reparto entre ambas fases de determinados

productos (como el ácido levulínico y el ácido fórmico) dificultan y complican las etapas de

separación y reutilización de las fases (Amiri et al., 2010; Chheda y Dumesic, 2007; West et al.,

2008).

http://es.wikipedia.org/wiki/Decantaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Cat%C3%A1lisis

http://es.wikipedia.org/wiki/Fl%C3%BAor

http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADquido_i%C3%B3nico


-119-

4.2.3.4. Líquidos iónicos

Los líquidos iónicos, según los iones que los constituyen, pueden actuar como

disolventes o como catalizadores. Dadas sus limitadas presiones de vapor, baja inflamabilidad

y buena estabilidad térmica pueden separarse fácilmente del medio de reacción y ser

reutilizados. El proceso de reacción puede llevarse a cabo a temperaturas relativamente bajas

(en torno a 100 °C) (Moreau et al., 2006). Para la producción de compuestos furánicos suelen

emplearse ácidos de Lewis como catalizadores (Zhang et al, 2013; Zhang y Zhao, 2010). El

principal inconveniente es su elevado precio, y en los procesos que se emplean multi-

catalizadores/disolventes se complican mucho las etapas de recuperación y purificación.

4.2.4. Furfural

El nombre furfural deriva de la palabra latina «furfur», que significa «salvado», ya que

este ha sido una de las primeras materias primas que se emplearon en su obtención. El furfural

ofrece una amplia gama de productos derivados, que pueden ser empleados como

componentes de biocombustibles, polímeros o resinas.

El furfural ha sido identificado como uno de los productos químicos «verdes» que

pueden obtenerse a partir de MLCs siguiendo esquemas de procesamiento típicos de

biorrefinerías. Un estudio desarrollado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos

incluyó al furfural dentro de los 30 compuestos químicos más prometedores que pueden

obtenerse a partir de biomasa (Werpy et al., 2004).

El furfural fue descubierto en 1821 por Johan Wolfang Döbereiner, aunque las

primeras publicaciones oficiales son de 1832. En 1840 John Stenhouse descubrió que el

furfural puede obtenerse a partir de cultivos alimentarios, como maíz o avena, por

procesamiento en condiciones ácidas. En 1922, Quaker Oats Company comenzó a producir

furfural a partir de cascarilla de avena en un proceso discontinuo utilizando ácido sulfúrico

concentrado como catalizador. Hoy en día la mayor parte del furfural en el mercado mundial

(alrededor de 280 millones de toneladas/año) se produce en China (Win, 2005). Otras plantas

de producción a gran escala se encuentran en la República Dominicana y Sudáfrica. La

tecnología empleada en China es poco eficiente (se alcanza en torno al 50% del rendimiento

teórico). Esto significa que hay un gran potencial de mejora, con lo que el furfural podría llegar

a competir con el petróleo como fuente de una diversidad de productos químicos (De Jong y

Marcotulio, 2010).


-120-

4.2.4.1. Propiedades físico-químicas

El furfural (furfuraldehído o furan-2-carboxaldehído) es un aldehído heterocíclico, de

fórmula C5H4O2. (Figura 4.4)

Figura 4.4. Estructura del furfural

En estado puro es un líquido aceitoso incoloro con olor a almendras, que en contacto

con el aire pasa a amarillo. La Tabla 4.2 muestra algunas de las propiedades físico-químicas del

furfural.

Tabla 4.2. Propiedades físico-químicas del furfural

Fórmula empírica C5H4O2

Peso molecular (g/mol) 96,09

Densidad a 25˚C (g/cm3) 1,16

Punto de fusión (˚C) -37

Punto de ebullición (˚C) 162

Punto de inflamación (˚C) 60

Solubilidad en agua a 20 ˚C (g/100 mL) 8,3

4.2.4.2. Aplicaciones

El furfural se usa principalmente en la producción de resinas (a través de la síntesis de

alcohol furfurílico), como aceite lubricante, o como nematicida. Se prevén importantes

aplicaciones en el campo de los combustibles verdes. Partiendo de furfural puede obtenerse el

2-metiltetrahidrofurano (MTHF), que participa en las mezclas conocidas como «P-series»

(MTHF, etanol y pentanos), con aplicación como como combustible para vehículos, bien

directamente o en mezclas con gasolina. También se considera que puede convertirse en un

producto químico de base en un futuro cercano (De Jong y Marcotulio, 2010).

Lange et al. (2012) han publicado una revisión bibliográfica sobre la producción del

furfural, prestando especial atención a las aplicaciones de los derivados del furfural, y

principalmente a su potencial en el campo de los biocombustibles. Los autores complementan


-121-

la información con datos obtenidos en los laboratorios de Shell a partir de 2003. Los derivados

furánicos requieren desoxigenación para incrementar la densidad de energía y la miscibilidad

en los combustibles hidrocarbonados. Por otro lado se discute la influencia de la longitud de la

cadena sobre el punto de ebullición, un aspecto importante para su uso como biodiesel. Entre

los procesos considerados para lograr estos fines se plantean la hidrogenación, la conversión a

ésteres de levulinato, o la condensación de furanos. La Figura 4.5 muestra las diferentes

alternativas planteadas.

Figura 4.5. El furfural como compuesto químico base o precursor de combustibles (Lange et al., 2012)

Aunque la producción de furfural a partir de biomasa posee un gran potencial para la

producción de biocombustibles, su implementación a gran escala exige abaratar los costes de

fabricación e incrementar los rendimientos.

4.2.4.3. Obtención

El furfural se produce por tratamiento de pentosas en medios catalizados por ácidos.

Las pentosas más empleadas son xilosa y arabinosa, que forman parte del esqueleto de la

fracción hemicelulósica de los MLCs (Ebringerová et al., 2005).

La xilosa está presente principalmente en forma de GoX o XGs en las maderas duras, y

en forma de GoArX en gramíneas. Este último polímero también aparece como componente

minoritario en las hemicelulosas de las maderas blandas. El arabinano se encentra en menor


-122-

cantidad formando parte de cadenas laterales en los XGs, GoArXs y ArGas (Scheller y Ulvskov,

2010). En la Tabla 4.3 se listan algunos trabajos en los que se ha partido de MLCs como

materias primas para la obtención de furfural, empleando distintas tecnologías de producción.

Hoy en día, la producción industrial de furfural se realiza tanto en discontinuo como en

continuo, empleando ácidos de Brönsted como catalizadores. En los tratamientos se emplea

vapor a altas presiones, eliminando continuamente el furfural del medio de reacción.

Empleando etapas de deshidratación y condensación se consigue purificar el producto final,

pudiendo recuperarse el agua condensada para recircularla de nuevo al proceso (Weingarten

et al., 2010). Una de las tecnologías más prometedoras que combina la producción de ácido

levulínico y furfural a partir de MLCs es el proceso Biofine (Fitzpatrick, 1990; Hayes et al.,

2006). De Jong y Marcotullio (2010) ha llevado a cabo una revisión de las distintas técnicas

empleadas en la producción del furfural utilizando catálisis ácida homogénea (hasta el

momento la alternativa más económica), haciendo énfasis en nuevas iniciativas para mejorar

la producción. Biofine (Fitzpatrick, 1990), Vedernikovs (Verdernikovs, 1996), Suprayield

(Zeitsch, 2000) o CIMV (Delmas, 2008) son algunos de los procesos descritos en esta revisión.

Estos procesos se basan en la conversión de las hemicelulosas de la biomasa vegetal,

obteniéndose unos rendimientos en torno al 10% en peso respecto al material de partida (que

suponen conversiones en torno al 50% del valor teórico).

Riansa-Ngawong y Prasertsan (2011) trabajaron con hemicelulosas extraídas de fibra

de palma prensada y deslignificada. En primer lugar hidrolizaron la fibra de palma para obtener

una disolución conteniendo xilosa, y en una etapa posterior procesaron esta disolución con

catalizadores ácidos en medio homogéneo, optimizando las condiciones para la producción de

furfural.

Tabla 4.3. Producción de furfural: materias primas, tecnologías y rendimientos

Materia prima Catalizador Tecnología Conversión1 Referencia

Biomasa H2SO4 Proceso Bofine 70 Fitzpatrick, 1990;

Girisuta, 2007

Césped [BMIM]Cl/AlCl3 Microondas 31,4 Zhang et al., 2013

Fibra de lino HCl Microondas 72,1 Yemis y Mazza, 2011

Tallos de maíz [C4MIM]Cl/CrCl3·6H2O Microondas 23 Zhang y Zhao, 2010

Paja de arroz [C4MIM]Cl/CrCl3·6H2O Microondas 25 Zhang y Zhao, 2010


-123-

Madera de pino [C4MIM]Cl/CrCl3·6H2O Microondas 31 Zhang y Zhao, 2010

Madera de Pino [BMIM]Cl /AlCl3 Microondas 33,6 Zhang et al., 2013

Paja de trigo HCl Microondas 48,4 Yemis y Mazza, 2011

Paja de trigo HCl Microondas 66,3 Yemis y Mazza, 2011

Paja de triticale HCl Microondas 45,7 Yemis y Mazza, 2011

Xilano [BMIM]Cl/AlCl3 Microondas 84,8 Zhang et al., 2013

Xilosa SBA-15 Calent. Conv. 2

/bifásico

68-70 Shi et al., 2011

Xilosa H-mordenitas/H-

faujasitas

Calent. Conv. 2

/bifásico

50-60 Moreau et al., 1998

Xilosa ZSM-5 zeolita Calent. conv. 2

46 O´Neill et al., 2009

Xilosa HCl Microondas 30 Weingarten et al.,

2010

Xilosa HCl Microondas

/bifásico

85 Weingarten et al.,

2010

Xilosa 1-(4-acido sulfónico)

butil-3-metilimidazolio

hidrógeno fosfato

Calent. Conv.2 91,45 Tao et al., 2010

Xilosa [BMIM]Cl /AlCl3 Microondas 82,2 Zhang et al., 2013

Xilosa H2SO4-KCl/KI Calent. Conv. 2

87,5 Marcotullio y de Jong,

2011

Zuros de maíz HCl Microondas 37,6 Sánchez et al., 2013

Zuros de maíz [BMIM]Cl/AlCl3 Microondas 19,1 Zhang et al., 2013

1 Conversion: (% respecto valor teórico)

2 Calent. Conv: Calentamiento convencional

Weingarten et al. (2010) estudiaron la deshidratación de xilosa, planteando un modelo

cinético que incluye dos reacciones por las que se descompone el furfural formado: (1)

formación de productos de degradación a partir de furfural; (2) reacción del furfural con xilosa

para pasar a formar productos de degradación. O´Neill et al. (2009) emplearon zeolitas para la

deshidratación de xilosa, considerando en su modelo cinético reacciones de isomerización de

xilosa a lixosa, deshidratación de ambos a furfural, fragmentación a ácidos orgánicos de

cadena corta y reacciones de condensación que llevan a la formación de oligómeros y sólidos

insolubles.


-124-

Para reducir la participación de reacciones secundarias se han empleado sistemas

bifásicos. Weingarten et al. (2010) estudiaron la deshidratación de xilosa comparando el

calentamiento convencional y por microondas, en presencia o ausencia de MIBK. Los

rendimientos de furfural para un sistema de una fase fueron del 30%, frente al 85% que se

obtiene en presencia de MIBK, lo que muestra el gran potencial de esta tecnología (ver Tabla

4.3). El furfural disuelto en el medio orgánico puede recuperarse por destilación (Mamman et

al., 2008). Se ha planteado el uso de otras tecnologías para recuperación de furfural de una

disolución acuosa, por ejemplo con CO2 supercrítico (Games et al., 1997) o mediante adsorción

en polímeros (Jerabek et al., 1994).

Moreau et al. (1998) obtuvieron altos rendimientos en furfural empleando

catalizadores sólidos ácidos (faujasitas y mordenitas) en un medio con dos fases líquidas, en el

cual la fase orgánica fue MIBK o tolueno. Shi et al. (2011) emplearon un catalizador sólido

conteniendo grupos sulfónicos funcionales (SBA-15) para la deshidratación de xilosa,

obteniendo rendimientos de 68-70% respecto al máximo teórico. La desactivación del

catalizador parece no deberse a un cambio de la estructura, sino a una acumulación de

subproductos, siendo fácil su regeneración.

Los líquidos iónicos también se han empleado en la conversión de pentosas a furfural.

Tao et al., (2010) emplearon el hidrógeno fosfato de 1-(4-acido sulfónico) butil-3-

metilimidazolio para la conversión de xilosa (ver Tabla 4.3). Zhang et al. 2013 estudiaron la

conversión de X, zuros de maíz, césped y madera de pino a furfural utilizando cloruro de 1-

butil-3-metilimidazolio y AlCl3, en un sistema con calefacción mediante microondas. Zhang y

Zhao (2010) estudiaron la formación conjunta de HMF y furfural a partir de tallos de maíz, paja

de arroz y madera de pino empleando líquidos iónicos en presencia de CrCl3 con calefacción

por microondas. Los rendimientos obtenidos para HMF y furfural estuvieron entre 45–52% y

23–31% de los valores máximos teóricos, respectivamente (ver Tabla 4.3).

El furfural también se forma como subproducto de la deshidratación de las hexosas,

aunque en concentraciones muy bajas. Este compuesto se ha detectado principalmente en

experimentos con fluidos supercríticos. Se desconoce si se forma directamente a partir de

azúcares, del HMF o a partir de algún otro intermedio. Moreau et al. (1996) trabajando con

catalizadores sólidos y empleando fructosa como sustrato confirmaron la formación de furfural

en una reacción con respecto a la que producía HMF. Por otro lado, Zhang y Weitz (2012)

observaron que el C-1 de la fructosa se convierte en el grupo carbonilo tanto del HMF como

del furfural.


-125-

4.2.5. Hidroximetilfurfural

El hidroximetilfurfural (también denominado 5-hidroximetil-2-furaldehído o 5-

(hydroximetil)-2-furancarboxaldehído, según la terminología IUPAC) se sintetizó a finales del

siglo XIX a partir de inulina empleando ácido oxálico como catalizador. En la misma época se

tiene referencia de la síntesis de HMF a partir de caña de azúcar (Rosatella et al., 2011). Ya en

el año 1951 existen referencias bibliográficas de trabajos sobre la síntesis de HMF empleando

catálisis homogénea y heterogénea (Newth, 1951). La revisión bibliográfica de Moye (1964)

describe métodos de preparación y las aplicaciones industriales del HMF en la época. Durante

la segunda mitad del siglo XX han aparecido multitud de revisiones bibliográficas relacionadas

con la química y obtención del HMF. Desde entonces, el interés por este tipo de compuestos

ha llevado a un gran número de avances en el conocimiento de sus propiedades, síntesis y

aplicaciones. El número de artículos científicos relacionados con estos temas publicados en los

últimos años dan buena prueba de ello (Kuster, 1990; Lewkowski, 2001; Binder y Raines, 2009;

van Putten et al., 2013).


El HMF es un sólido amarillo con bajo punto de fusión y altamente soluble en agua.

Presenta un olor que recuerda a las flores de camomila. La molécula de HMF consiste en un

anillo de furano, que contiene un grupo funcional aldehído unido a la posición 2 del anillo y un

grupo radical hidroximetil unido a la posición 5 (Figura 4.6). Es soluble en agua, metanol,

etanol, acetona, o acetato de etilo. La Tabla 4.4 lista alguna de sus propiedades físico-químicas

más importantes.

Figura 4.6. Estructura del HMF

Tabla 4.4. Propiedades físico-químicas del HMF

Fórmula Empírica C6H6O3



Punto de fusión (˚C) 30-34

Punto de ebullición a 1 mbar (˚C) 114-116 *


-126-


La Figura 4.7 muestra las principales vías de aprovechamiento que se han propuesto

para el HMF, cuyo papel como producto químico de base se ha mencionado con anterioridad.

El HMF es inestable en medio ácido, reaccionando para dar ácido levulínico

(compuesto sobre el que se proporciona información en el apartado 4.2.6). El HMF puede

convertirse en biocombustibles como el 2-metilfurano y 2,5-dimetilfurano en medios acuosos

catalizados; o bien ser oxidado a monómeros bifuncionales, como el 2,5- furandicarbaldehído

o el ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA), con aplicaciones en la fabricación de polímeros a

través de reacciones de policondensación. El FDCA puede reemplazar al ácido tereftálico en la

fabricación de polímeros de gran consumo (por ejemplo, poliésteres para envases) (Chheda et

al., 2007a; Zhang y Weitz, 2012; Lange et al., 2012). La caprolactona (véase Figura 4.7) se

emplea en la síntesis de la policaprolactona (un polímero biodegradable de mercado creciente)

por mecanismos de apertura de anillo.

Figura 4.7. El HMF como compuesto químico de base para la síntesis de productos de interés comercial

(van Putten et al., 2013).


-127-

4.2.5.3. Obtención

El HMF puede obtenerse a partir de hexosas, disacáridos, oligosacáridos y

polisacáridos. Por lo tanto, sustratos como sacarosa, celobiosa, inulina, almidón, celulosa y

hemicelulosas son sustratos viables.

La catálisis ácida de las hexosas es la tecnología más implantada para la obtención de

HMF, aunque en la bibliografía también se citan otras alternativas. Por ejemplo, se forma HMF

en las reacciones de Maillard entre sacáridos y compuestos nitrogenados (aminoácidos,

péptidos, proteínas o aminas). Una tercera alternativa es la condensación aldólica de

moléculas formadas por tres átomos de carbono (van Putten et al., 2013).

Dentro de la producción de HMF a partir de hexosas, los sustratos más empleados son

la glucosa y la fructosa, mientras que algunos estudios han empleado galactosa o manosa

(Chheda et al. 2007b). Como se ha comentado anteriormente, los mejores rendimientos en

HMF se obtienen empleando fructosa como sustrato (o bien inulina, un polímero formado por

unidades de fructosa). Binder et al. (2010) estudiaron la deshidratación de galactosa y manosa

empleando sales de cromo, obteniendo una conversión eficiente en el caso de la manosa, con

rendimientos en HMF equivalentes al 69% del valor teórico, y mucho menores para la

galactosa (por debajo del 33%). Para justificar este comportamiento proponen que la manosa y

glucosa se isomerizan a fructosa, mientras la galactosa se isomeriza a una hexulosa, lo que

conlleva una conversión a HMF mucho menor. Hu et al. (2013) han estudiado la interrelación

entre la estructura de los azúcares y los tipos de mecanismos y compuestos intermedios a que

pueden dar lugar, concluyendo que la calidad como sustratos para la producción de HMF sigue

el orden: fructosa > glucosa > levoglucosano > galactosa.

Las primeras investigaciones sobre la formación de HMF empleaban medios acuosos

conteniendo ácidos solubles como catalizadores. Con esta tecnología se obtenían

rendimientos en HMF relativamente bajos, lo que llevó a estudiar su síntesis en disolventes

como DMSO, dimetil formamida, dimetil acetamida, acetona, ácido acético o metanol. En una

reciente revisión bibliográfica, van Putten et al. (2013) han recopilado información sobre los

rendimientos obtenidos a partir de distintos sustratos, empleando diversos catalizadores y

tecnologías. Rackemann y Doherty (2011) han sistematizado información sobre trabajos

realizados con líquidos iónicos empleando diferentes sustratos. Los mejores rendimientos (84-

99% del máximo teórico) se han obtenido empleando fructosa como sustrato. Los

rendimientos obtenidos para glucosa (67 - 91%) celulosa (61 - 48%) y madera (52-35%) son


-128-

menores, aunque resultan interesantes por el menor coste de los materiales de partida. Para

el mismo fin se ha considerado el uso de fluidos supercríticos, campo en el que Bicker et al.

(2003) consiguieron un rendimiento en HMF superior al 75% del teórico a partir de fructosa

empleando acetona supercrítica.

La producción de HMF también se ha llevado a cabo empleando catalizadores sólidos,

ya que la catálisis heterogénea suele ofrecer buena selectividad, y además los catalizadores

sólidos son fáciles de separar de los productos de reacción. Los catalizadores empleados

incluyen mordenitas (Moreau et al., 1996), zeolitas (Carlini et al., 1999), o resinas de

intercambio catiónico (Qi et al., 2008), que se han ensayado tanto en medios acuosos como en

presencia de disolventes orgánicos. Sin embargo, los rendimientos en HMF son pobres, ya que

se facilitan tanto su rehidratación a los ácidos fórmico y levulínico, como la formación de

polímeros solubles o huminas insolubles (Benvenuti et al., 2000).

Otra de las tecnologías estudiadas es el empleo de sistemas con dos fases líquidas, en

que la reacción se realiza en una de ellas (acuosa), y la otra (orgánica) acumula de modo

selectivo los productos de reacción. Este modo de operar se ha llevado a cabo empleando

disolventes orgánicos como tetrahidrofurano, MIBK o DMSO. Este último ha sido propuesto

por el grupo de James A. Dumesic (Román-Leshkov et al., 2006; Chheda et al., 2007b; Pagán-

Torres et al., 2012; Román-Leshkov et al., 2006), y permite alcanzar rendimientos en HMF

hasta del 75% respecto al valor teórico cuando se parte de fructosa y se opera con HCl como

catalizador. Además, la fase acuosa puede modificarse añadiendo otros disolventes miscibles

que limiten las reacciones de deshidratación-rehidratación responsables del consumo de HMF.

Chheda et al. (2007b) han utilizado para este fin DMSO y/o polivinil-2-pirrolidona,

consiguiendo un 87% de conversión de fructosa en HMF. Sin embargo estos rendimientos son

significativamente menores cuando se emplean otros sustratos como glucosa (30% de

conversión), sacarosa (51%), almidón y celobiosa (38%). Los rendimientos mucho más elevados

en el caso de la fructosa pueden justificarse en base a la diferente estructura molecular de los

azúcares, que parece influir en el mecanismo de reacción seguido para la obtención de HMF.

Las cetosas (como la fructosa) adquieren una estructura tipo furanosa (similar a la del HMF),

mientras que las aldohexosas (glucosa, galactosa o manosa) adquieren una estructura tipo

piranosa.

Shimizu y Satsuma (2011) han resumido la información existente sobre el empleo de

catalizadores ácidos sólidos, resaltando la importancia de los ácidos de Lewis en las tecnologías

de conversión de biomasa. Pagán-Torres et al. (2012) emplearon AlCl3 como catalizador,


-129-

obteniendo rendimientos en HMF del 62%, en comparación con el 30% obtenido en ausencia

del mismo. Choudhary et al. (2013) emplearon CrCl3 y HCl para la transformación de glucosa,

alcanzando un rendimiento del 46% en la transformación de ácido levulínico, mientras que el

HMF fue el producto mayoritario (con un rendimiento del 59%) cuando se empleó un medio

bifásico.

4.2.6. Ácido levulínico

El ácido levulínico o 4-oxopentanoico es un cetoácido altamente polar, que puede

obtenerse a partir de hexosas empleando catálisis ácida, aunque actualmente se produce a

partir de compuestos derivados del petróleo. El Departamento de Energía de los EEUU lo ha

identificado como uno de los 12 principales productos químicos con mayor valor añadido que

se pueden obtener a partir de biomasa (Manzer, 2006).

Los primeros estudios sobre la producción de ácido levulínico datan de la década de

1950. Rackemann y Doherty (2011) citan las siguientes razones que han impedido un mayor

éxito comercial:

i. Los costes de los sustratos (anhídrido maleico o alcohol furfurílico) empleados para

su producción industrial, que se obtienen a partir del petróleo.

ii. Bajos rendimientos, en parte debidos a la baja selectividad de los catalizadores

empleados.

iii. Costes elevados del reactor y de la planta de recuperación, debido al tipo de

materiales necesarios.

iv. Las altas temperaturas que se necesitan para convertir las materias primas, lo que

implica un elevado gasto energético.

v. Los altos costes de operación asociados a la eliminación de residuos y a la

recuperación del catalizador.

La primera planta comercial de producción de ácido levulínico a partir de biomasa

lignocelulósica fue construida en Caserta (Italia) por la empresa «Le Calorie» aplicando la

tecnología Biofine (Biofine Renewables, Waltham, Massachusetts, EEUU). Estuvo en fase de

explotación entre 2001 y 2005 comenzando con una capacidad de tratamiento de 50 toneladas

de materias primas /día y una capacidad de producción de 5.000 toneladas de ácido levulínico

http://es.wikipedia.org/wiki/Ceto%C3%A1cido


-130-

/año. La planta producía además furfural, ácido fórmico y un sólido carbonoso, e integraba la

transformación de ácido levulínico en levulinato de etilo (empleado como aditivo de

combustibles) (Girisuta et al., 2006; Hayes et al., 2008). A partir del año 2006 comenzó a

funcionar una planta en Gorham, Maine (EEUU), con una capacidad de proceso de 2

toneladas/día (Weingarten, 2012).


El ácido levulínico (Figura 4.8) es un compuesto blanco, cristalino, soluble en agua y

disolventes orgánicos polares. La Tabla 4.5 muestra algunas de sus principales propiedades

fisicoquímicas.

Figura 4.8. Estructura química del ácido levulínico

Tabla 4.5. Propiedades físico-químicas del ácido levulínico

Fórmula empírica C5H8O3



Punto de fusión (˚C) 37

Punto de ebullición (˚C) 246

Calor de vaporización a 150˚C (kJ/mol) 0,58

Calor de fusión (kJ/mol) 79,8

pKa 4,59


El ácido levulínico posee una alta reactividad, que le permite actuar intermedio o

precursor de otros compuestos a través de reacciones de esterificación, hidrogenación,

condensación, oxidación o halogenación (Wang et al., 2013). Por ejemplo, a partir del ácido

levulínico se puede producir ácido succínico, resinas, polímeros, herbicidas, productos


-131-

farmacéuticos, compuestos aromatizantes, plastificantes, disolventes, agentes anticongelantes

o aditivos para combustibles (Hayes et al., 2006; Carpenter et al., 2011; Bozell et al., 2000). La

Figura 4.9 recoge algunas de estas posibilidades. Por ejemplo, dentro del campo de los

combustibles, los derivados de interés son el MTHF o la γ–valerolactona, que actúan como

antidetonantes y facilitan la combustión. El MTHF puede mezclarse con la gasolina al 15 - 55%

en volumen sin que se observen efectos negativos sobre los rendimientos de los motores de

combustión convencionales (Departamento de Energía, USA, 1999). Estos combustibles se

consideran como respetuosos con el medio ambiente, debido al elevado contenido en un

aditivo que puede obtenerse a partir de biomasa. Dentro del campo de los biocombustibles, la

γ–valerolactona puede convertirse en ésteres de pentenoato, o hidrogenarse a ácido

pentanoico, que forma alcanos o alcoholes (dependiendo del catalizador empleado) tras

cetonación e hidrogenación. Los alcoholes pueden deshidratarse a alquenos, que por posterior

oligomerización forman hidrocarburos conteniendo entre 6 y 27 carbonos. Alternativamente,

la desoxigenación térmica del ácido levulínico conduce a la formación de productos aromáticos

y cíclicos, que pueden ser fácilmente convertidos a combustibles (Rackemann y Doherty,

2011).

Figura 4.9. El ácido levulínico como compuesto químico base para la síntesis de otros compuestos

químicos o combustibles (Rackemann y Doherty, 2011).


-132-

En la conversión de hexosas a ácido levulínico se produce además ácido fórmico, otro

compuesto considerado como plataforma para ser transformado en productos de interés

comercial, como formaldehído, caucho, plastificantes, productos farmacéuticos y textiles. Se

ha contemplado la también la posibilidad de emplearse en la hidrogenación del ácido

levulínico.

4.2.6.3. Obtención

La producción comercial actual de ácido levulínico se realiza a partir de anhídrido

maleico (Rackemann y Doherty, 2011), una tecnología cuyos inconvenientes de han citado con

anterioridad. Sus aplicaciones actuales están centradas en determinados nichos de mercado.

La hidrólisis ácida de las hexosas es una vía atractiva para la producción de ácido

levulínico, dada la facilidad de operación y el precio de las materias primas (el coste de los

MLCs supone menos del 5% del coste de la cantidad equivalente de anhídrido maleico). Otras

ventajas incluyen el número de etapas necesarias para la obtención del producto, y el coste y

disponibilidad del resto de los reactivos. Esta es la idea subyacente en el proceso Biofine citado

con anterioridad, que recibió el premio Presidential Green Chemistry Award en 1999. El precio

del ácido levulínico oscila actualmente entre los 6 y los 9 €/kg, y su producción asciende a 450

toneladas. Los ensayos a escala piloto empleando el proceso Biofine han supuesto una

reducción de costes dejan el precio del producto final en torno a 0,15 €/kg (sin incluir la

recuperación de los costes de capital) (Rackemann y Doherty, 2011), un hecho favorable de

cara al empleo del ácido levulínico como un producto químico de base.

Alternativamente, el ácido levulínico puede obtenerse a partir de furfural (Chalid,

2012), ya que el furfural puede reducirse a alcohol furfurílico, y la hidrólisis ácida de este

último en medios formados por disolventes cetónicos conduce al ácido levulínico (Zeitsch,

2000). Otra tecnología factible consiste en la hidroximetilación del furfural con formaldehído

en medio orgánico para producir HMF, y la posterior conversión de este a ácido levulínico vía

rehidratación (Lecomte et al., 1999). Otros métodos citados en la literatura son la síntesis a

partir de γ-butirolactona empleando un reactivo de Grignard (Fuentes y Larson, 1982), o la

carbonilación de la 4-hidroxi-2-butanona (Timokhin et al., 1999).

La producción de ácido levulínico empleando ácidos minerales (H3PO4; HCl, H2SO4…)

como catalizadores ha sido el objeto de numerosas investigaciones en los últimos años. Los

estudios parten de hexosas puras, celulosa purificada o MLCs. En la Tabla 4.6 se recogen datos


-133-

obtenidos con hexosas comerciales y celulosa microcristalina (Runge y Zang, 2012;

Dautzenberg et al., 2011). Debido a las diferentes formas de expresar las producciones y

rendimientos que recoge la bibliografía, los datos de la Tabla 4.6 se han sistematizado en

función de dos parámetros: la conversión (expresada como porcentaje de la cantidad máxima

alcanzable) y el rendimiento términos de masa (es decir, basado en la cantidad inicial de

sustrato). En términos másicos, el rendimiento máximo en ácido levulínico cuando se parte de

hexosas es de 64,5%, debido a la formación una cantidad estequiométrica de ácido fórmico.

Habitualmente los rendimientos alcanzados suelen estar en torno a los dos tercios (o incluso

menos) de este valor máximo, debido a las reacciones secundarias (principalmente, las que

conducen a la formación de huminas) (Girisuta, 2007). Cabe destacar la conversión del 80%

obtenida a partir de glucosa por Chang et al. (2006).

Tabla 4.6. Producción de ácido levulínico a partir de hexosas comerciales y celulosa microcristalina en medios

catalizados con ácidos inorgánicos

Materia prima Ácido Conc. ácido

(%) T (˚C) t (min)

%

Conver-

sion.

Rendim.

(% masa) Referencia

Glucosa HCl 0,67 149 500 68 43,82 Weingarten et al., 2012

Celulosa

microcristalina HCl 1,25 180-200 0-50 60 43,0 Shen y Wyman, 2012

Celulosa H2SO4 3 250 120 35,2 25,2 Efremov et al., 1997

Celulosa HCl 3 250 120 40,2 28,8 Efremov et al., 1997

Celulosa HBr 3 250 120 37,56 26,9 Efremov et al., 1997

Glucosa H2SO4 5 170 n.a. 80,7 57,5 Chang et al., 2006

Fructosa HCl 3,6-7,2 95 1440 81 58,0 Kuster y van der Baan,

1977

% Conversión: (Masa de ácido levulínico) · 100/(Masa de ácido levulínico estequiométrica)

Rendimiento: (masa de ácido levulínico) · 100/(masa de sustrato)


-134-

La Tabla 4.7 recoge los resultados obtenidos con distintos MLCs. Cabe destacar la

conversión del 82,7% obtenida por Yan et al. (2008) a partir de bagazo, y del 82,5% obtenida

por Galletti et al. (2012) a partir de residuos de tabaco. Las variables más influyentes en la

reacción son la concentración de catalizador, el tiempo de reacción, la temperatura y la

relación líquido sólido. Para esta última variable, varios autores indican un valor óptimo de 10

g/g (Runge y Zang, 2012; Fang y Hanna, 2002).


-135-

Tabla 4.7. Resultados obtenidos en la producción de ácido levulínico a partir de diferentes sustratos lignocelulósicos en pesencia de ácidos inorgánicos

Materia prima % de celulosa Ácido Conc. ácido (%) T (˚C) t (min) %Conversion Rendim (% masa) Referencia

Madera de álamo 40,6 H2SO4 5 190 50 61,2 17,8 Runge y Zang, 2012

Madera de álamo 45,7 H2SO4 5 200 240 47,4 15,5 Efremov et al., 1997

Madera de álamo 45,7 HCl 5 250 120 37,9 12,4 Efremov et al., 1997

Madera de álamo 45,7 HBr 5 200 240 39,7 13 Efremov et al., 1997

Paja de trigo 40,4 H2SO4 3,5 210 37,6 68,8 19,9 Chang et al., 2007

Almidón de maíz 70,0 H2SO4 5 200 n.a. 66,4 33,25 Cha y Hanna, 2002

Sorgo 73,8 H2SO4 8 200 n.a. 45,6 24,1 Fang y Hanna, 2002

Paja de algodón 42,55 H2SO4 2 180 60 31,1 9,53 Yang et al., 2013

Bagazo de caña 43,3 H2SO4 6 150 n.a. 62,6 19,4 Girisuta et al., 2013

Biomasa (Biofine process)

(Dos etapas consecutivas) 50,0 H2SO4 1,5-5 210-220 0,1-0,42 Fitzpatrick, 1990; Fitzpatrick, 1997

195-215 15-30 70 25

Planta del jacinto de agua 23,67 H2SO4 9,5 175 30 53 9 Girisuta et al., 2008

Paja de trigo 40,3 H2SO4 3 210 42,4 57,66 16,64 Chang et al., 2009

Bagazo 40,0 HCl 4,5 220 45 82,7 23,7 Yan et al., 2008

Paja de arroz 40,0 HCl 4,5 220 45 79,6 22,8 Yan et al., 2008

Podas de olivo 39,4 HCl 1,6 200 15 71,3 20,1 Raspolli Galletti et al., 2012

Serrín de álamo 57,6 HCl 1,6 200 60 71,3 29,3 Raspolli Galletti et al., 2012

Lodos de papel 57,1 HCl 1,6 200 15 77,6 31,7 Raspolli Galletti et al., 2012

Paja de trigo 39,2 HCl 1,6 200 60 77,4 21,7 Raspolli Galletti et al., 2012

Residuos de tabaco

(Dos etapas consecutivas) 25,0 HCl 1.6 120 120 Raspolli Galletti et al., 2012

200 30 82,5 15

%Conversión: (Masa de ácido levulínico)· 100/(Masa ácido levulínico estequiométrica)

Rendimiento: (masa de ácido levulínico) · 100/(masa de sustrato)


-136-

La producción de ácido levulínico a partir de MLCs mediante otras tecnologías (como

catalizadores sólidos, líquidos iónicos o medios líquidos bifásicos) ha sido resumida en varias

revisiones bibliográficas, en las que se recogen los resultados obtenidos y se discuten ventajas

e inconvenientes de cada uno de ellas (Corma et al.,2007; Rackemann y Doherty, 2011). La

Tabla 4.8 recoge algunos de los trabajos en los que se han empleado catalizadores sólidos para

convertir distintos sustratos (monosacáridos, un disacáridos, un polímero y HMF). La cinética

de reacción obliga a incrementar la duración de los tratamientos para lograr cantidades

razonables de ácido levulínico. Un claro ejemplo es el trabajo de Jow et al. (1987) en el que

partiendo de fructosa y empleando una zeolita como catalizador, se obtuvo una conversión del

43,2% tras 15 horas (otras condiciones de operación: relación másica catalizador:sustrato =

1:1; T = 140 °C). En base a los resultados que se citan en la literatura usando hexosas puras

(glucosa o fructosa) o celulosa (celulosa microcristalina o celulosa purificada) cabe deducir que

los rendimientos serán bajos cuando se utilicen MLCs como materias primas. Por ello, resulta

necesario desarrollar catalizadores más selectivos y eficientes.

Tabla 4.8. Producción de ácido levulínico en sistemas catálisis heterogénea (Rackemann y Doherty, 2011)

Sustrato Catalizador Concentración

(% peso) Tª (˚C) t (min)

% Conversión

Referencia

Fructosa Amberlita IR-120 19 25 1620 23,5 Redmon, 1956

LZY-zeolita 50 140 900 43,2 Jow et al., 1987

Glucosa Amberlita IR-120 19 25 7200 5,8 Redmon, 1956

Arcilla 3 150 1440 12 Lourvanij, 1995

HY-zeolita 3 150 1440 6 Lourvanij, 1995

Sacarosa Amberlita IR-120 19 25 984 15,6 Redmon, 1956

Resina (Dowex) 6,25 100 1440 24 Schraufnagel y Rase, 1975

Celulosa Nafion SAC-13 3 190 1440 9 Hegner et al., 2010

HMF ZSM-5 5 116 120 70 Girisuta, 2007

La bibliografía recoge varios trabajos en los que se emplean compuestos fluorados

como catalizadores (Gladysz y Curran, 2002; Horvat y Rabai, 1994). Heeres et al. (2009)

emplearon ácido trifluoroacético para convertir hexosas en ácido levulínico, alcanzando un

57% de conversión a 180 ˚C tras una hora de reacción.

Se han desarrollado tecnologías multi-etapa (basadas en el empleo de sistemas

bifásicos, de fluidos supercríticos o de líquidos iónicos), que primero llevan a cabo la


-137-

deshidratación de hexosas a HMF, y luego convierten este en ácido levulínico. El apartado

4.2.5.3 proporciona más información sobre este tema.

III. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

-141-

5. Objetivos Generales y

Específicos

El trabajo que se recoge en esta Memoria se enmarca dentro de una de las líneas de

investigación que el grupo EQ-2 del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de

Vigo desarrolla en el Campus de Ourense, y que está orientada al desarrollo de procesos

químico-biotecnológicos para el aprovechamiento de biomasa vegetal.

Más concretamente, este trabajo se realizó en el marco de dos Proyectos de

Investigación financiados por el Plan Nacional de Investigación, titulados «Propiedades de

nuevos ingredientes alimentarios prebióticos derivados de hemicelulosas» (referencia

AGL2008-02072/ALI) y «Desarrollo y evaluación de métodos de procesamiento para

biorrefinerías» (referencia CTQ2011-22972).

El tema genérico de este estudio puede resumirse como la obtención de productos de

interés comercial a partir de las hemicelulosas presentes en materias primas lignocelulósicas, e

implica aspectos tales como el estudio de compuestos con actividad biológica y la producción

de furanos. Más concretamente, se plantearon los siguientes objetivos generales:

Objetivos y plan de trabajo

-142-

I. Evaluación de la actividad prebiótica de poli- y oligo- sacáridos obtenidos a partir de

las hemicelulosas de madera de Pinus pinaster, a través de reacciones de

autohidrólisis.

II. Obtención, evaluación y comparación de la actividad antioxidante de oligosacáridos

con distintos niveles de pureza obtenidos a partir de las hemicelulosas de cáscaras

de arroz, madera de Eucalyptus globulus y madera de Pinus pinaster a través de

reacciones de autohidrólisis.

III. Estudio de las reacciones de sacáridos hemicelulósicos presentes en los

autohidrolizados de Pinus pinaster en medios acuosos conteniendo un ácido

mineral, contemplando la producción de ácido levulínico como producto

fundamental.

IV. Estudio de sistemas líquidos bifásicos para la obtención de furanos (furfural y HMF)

a partir de sacáridos hemicelulósicos presentes en disoluciones obtenidas por

autohidrólisis de madera de Pinus pinaster.

A partir de estos objetivos generales se definieron los siguientes objetivos específicos:

i. Caracterización química de las materias primas empleadas en el desarrollo

experimental.

ii. Evaluación experimental de la autohidrólisis de la madera de Pinus pinaster.

iii. Desarrollo de procesos multietapa para el refinado y fraccionamiento de los

sacáridos hemicelulósicos presentes en licores de autohidrólisis de madera de Pinus

pinaster.

iv. Estudio de la composición, estructura y distribución de pesos moleculares de las

fracciones de sacáridos purificados a que alude el punto anterior.

v. Evaluación del potencial prebiótico de sacáridos hemicelulósicos purificados de

madera de Pinus pinaster.

vi. Caracterización de los productos solubles de reacción por autohidrólisis de cáscaras

de arroz y madera de Eucalyptus globulus, operando en condiciones prefijadas.

vii. Desarrollo de procesos multietapa para la purficación de sacáridos hemicelulósicos

obtenidos por autohidrólisis de Pinus pinaster, cáscaras de arroz y madera de

Eucalyptus globulus.


-143-

viii. Estudio de la composición, estructura y distribución de pesos moleculares de los

sacáridos hemicelulósicos presentes las fracciones purificadas a que se alude en el

punto anterior.

ix. Evaluación del potencial antioxidante de las diferentes fracciones mencionadas en el

punto vii.

x. Determinación experimental de la influencia de la concentración de ácido sulfúrico

en la cinética de degradación de sacáridos hemicelulósicos de maderas de Pinus

pinaster, operando en autoclave.

xi. Modelización cinética de los datos obtenidos en el punto anterior.

xii. Estudio de las reacciones que sufren los sacáridos hemicelulósicos de madera de

Pinus pinaster en medio ácido operando en un reactor agitado a temperaturas hasta

250 ˚C.

xiii. Modelización cinética de los datos obtenidos en el punto anterior y determinación

de las condiciones óptimas para la obtención de ácido levulínico.

xiv. Estudio de las reacciones que sufren los sacáridos hemicelulósicos de Pinus pinaster

en sistemas con dos fases líquidas.

xv. Optimización de las condiciones de reacción del sistema con dos fases líquidas

respecto la producción de furanos.

xvi. Evaluación experimental de los rendimientos en furanos cuando al sistema

reaccionante descrito en el punto anterior se le añaden modificadores de fase.

-145-

6. Plan de Trabajo

Para conseguir los objetivos expuestos en el capítulo anterior, se ha llevado a cabo el

plan de trabajo que se detalla a continuación.

6.1. Acondicionamiento y caracterización química de la madera de Pinus pinaster

- Acondicionamiento: Implica la obtención de lotes homogeneizados que permitan

realizar experimentos con muestras de idéntica composición; así como el secado al

aire y el almacenamiento en condiciones que permitan su conservación.

- Caracterización química: A realizar aplicando de métodos normalizados para la

determinación extractos, glucano, xilano, galactano, arabano, manano, grupos

acetilo, lignina, proteína y cenizas.

6.2. Solubilización de la fracción hemicelulósica de Pinus pinaster mediante

extracción con agua caliente seguida de autohidrólisis

- Realización de un pretratamiento en condiciones preestablecidas (González Muñoz

et al., 2012) para eliminar los extractos solubles en agua.

- Autohidrólisis en condiciones pre-establecidas (González Muñoz et al., 2012) para

optimizar la recuperación de sacáridos hemiceulósicos solubles.


-146-

- Determinación de la composición de las fases líquidas de los correspondientes

medios de reacción, con cuantificación de componentes volátiles (CV) y los

componentes no volátiles (CNV), incluyendo sacáridos hemicelulósicos de

naturaleza polimérica u oligomérica, monosacáridos, y otros componentes no

volátiles (OCNV). Dado que se trata de una madera resinosa, los monosacáridos y

unidades estructurales a determinar incluyen hexosas (Glu, Gal, Man) y pentosas (Xil

y Ara). Las unidades constituyentes de los sacáridos oligoméricos o poliméricos se

determinan mediante una post-hidrólisis de los licores y cuantificación de los

monómeros resultantes. Se determinan además ácido acético (proveniente de los

grupos acetilo de las hemicelulosas), y productos de reacciones secundarias (ácidos

fórmico, láctico, y glicólico, furfural y HMF). Dadas las características de los

compuestos a determinar es necesario emplear HPLC con columnas con base H+ y

Pb+2 y cromatografía iónica. Se determinan adicionalmente los sustituyentes

urónicos mediante un método espectrofotométrico.

6.3. Desarrollo de procesos multietapa para el refinado y fraccionamiento de los

licores de autohidrólisis de madera de Pinus pinaster

- Recopilación y evaluación crítica de la bibliografía existente sobre el empleo de

tecnología de membranas para la purificación de disoluciones de oligosacáridos.

- Selección de las condiciones de operación para el fraccionamiento y purificación de

los licores de autohidrólisis. Se analiza la influencia del tamaño de corte de la

membrana (1 y 5 kDa) y la PTM (en el intervalo 1-4 bar) empleando membranas

planas de celulosa regenerada.

- Desarrollo de secuencias de etapas empleando ultra- y nano- filtración, operando

tanto en modo diafiltración discontinua como concentración.

6.4. Estudio de la composición de las fracciones purificadas, y de la estructura y

distribución de pesos moleculares de los sacáridos hemicelulósicos

- Recopilación y evaluación crítica de la bibliografía existente sobre las técnicas

disponibles para determinación estructural y distribución de pesos moleculares de

sacáridos hemicelulósicos.


-147-

- Determinación de la composición química de las fracciones obtenidas tras el

tratamiento con membranas, con determinación de la distribución de los

componentes entre permeado y retenido.

- Elucidación de la estructura de los principales componentes empleando HPAEC-PAD

y MALDI-TOF. Determinación de la distribución de pesos moleculares mediante

HPSEC.

6.5. Evaluación del potencial prebiótico de las fracciones obtenidas

- Evaluación del efecto prebiótico de las fracciones obtenidas en los tratamientos de

membranas, con sacáridos hemicelulósicos de diferente composición y distribución

de pesos moleculares, mediante estudios de fermentabilidad in vitro con inóculos

fecales humanos.

- Estudio de la dinámica de las poblacionales microbianas durante las fermentaciones

in vitro empleando FISH.

6.6. Acondicionamiento y caracterización química de cáscaras de arroz y madera

de Eucalyptus globulus

- Acondicionamiento. La cáscara de arroz fue suministrada por «Procesadora Gallega

de Alimentos» (Lalín, Pontevedra) y la madera de Eucalyptus globulus por ENCE

(factoría situada en la ciudad de Pontevedra). Tras su molienda y secado al aire, los

lotes se almacenan en condiciones que permitían su conservación.

- Caracterización química: Se obtuvieron los datos experimentales aplicando métodos

normalizados para la determinación de la composición de las materias primas:

extractos, glucano, xilano, galactano, arabano, manano, grupos acetilo, lignina,

proteína, cenizas.

6.7. Obtención de los licores hemicelulósicos de las distintas materias primas y

estudio de su composición

- Realización de pretratamiento de madera de Eucalyptus globulus en condiciones

preestablecidas (Gullón et al., 2011a), para eliminar extractos solubles en agua.


-148-

- Tratamiento de autohidrólisis empleando como sustrato el sólido obtenido en el

punto anterior, operando en condiciones previamente optimizadas (Gullón et al.,

2011a).

- Autohidrólisis de las cáscaras de arroz en condiciones optimizadas (Gullón et al.,

2010b) para obtener recuperaciones máximas de sacáridos hemicelulósicos

solubles.

- Determinación de la composición de los licores obtenidos, siguiendo el

procedimiento ya descrito para caracterización de los licores de autohidrólisis de

Pinus pinaster (apartado 6.2).

6.8. Desarrollo de procesos multietapa para la obtención de fracciones de

sacáridos hemicelulósicos

a. Cáscaras de arroz

- Realización de autohidrólisis en condiciones descritas previamente por Gullón et al.

(2010b).

- Evaluación experimental de etapas consecutivas de nanofiltración, operando en

modos de concentración y diafiltración discontinua, utilizando una membrana

cerámica.

- Reducción del grado de polimerización de los productos mediante hidrólisis

enzimática con endoxilanasas.

- Purificación de las fracciones de los licores procesados mediante intercambio iónico.

b. Madera de Eucalyptus globulus

- Realización de autohidrólisis en condiciones descritas previamente por Gullón et al.

(2011a).

- Evaluación experimental de etapas consecutivas de nanofiltración, operando en

modo de concentración y diafiltración discontinua, utilizando una membrana

cerámica.

- Purificación de las fracciones de los licores procesados mediante intercambio iónico.


-149-

c. Madera de Pinus pinaster

- Selección de las condiciones de operación para el fraccionamiento de licores de

autohidrólisis, empleando membranas espirales de celulosa regenerada.

- Evaluación de secuencias de etapas de nanofiltración, operando en modo

concentración y diafiltración discontinua.

- Revisión bibliográfica y evaluación preliminar de las condiciones de operación en

etapas basadas en el empleo de endomananasas y de resinas de intercambio iónico.

- Tratamiento con endo-1,4-β-mananasas del retenido obtenido en los tratamientos

con membranas. Determinación de las condiciones óptimas.

- Purificación disoluciones de sacáridos hemicelulósicos mediante intercambio iónico.

6.9. Estudio de la composición de las fracciones purificadas, y de la estructura y

distribución de pesos moleculares de los sacáridos hemicelulósicos solubles

- Determinación de la composición de permeados y retenidos en las distintas etapas

de membrana, así como de la corriente inicial de alimentación mediante HPLC, con

cuantificación y distribución de los componentes entre permeado y retenido.

- Elucidación de la estructura química de compuestos representativos mediante

HPAEC-PAD y MALDI-TOF, y determinación de la distribución de pesos moleculares

por HPSEC.

6.10. Evaluación del potencial antioxidante de sacáridos hemicelulósicos

purificados

- Determinación espectrofotométrica del contenido total en compuestos fenólicos.

- Extracción y determinación de fenoles libres.

- Análisis de los compuestos fenólicos unidos a oligómeros, según la metodología

descrita por Veenashri y Muralikrishna (2011).

- Determinación de la actividad antioxidante de las distintas fracciones empleando los

siguientes protocolos: capacidad de captación del radical DFPH (von Gadow et al.,

1997), método ABTS/TEAC (Re et al., 1999); método FRAP (Benzie y Strain, 1996) y

método del β-caroteno (Miller, 1971).


-150-

6.11. Determinación de la influencia de la concentración de ácido en la cinética

de degradación de sacáridos solubilizados en los licores de autohidrósisis

de madera de Pinus pinaster a bajas temperaturas

- Recopilación y evaluación crítica de la bibliografía existente sobre la descomposición

de hexosas y pentosas en medio ácido, así como del procesamiento de celulosa y

MLCs, incluyendo tanto la formación de productos de degradación como las técnicas

de análisis aplicables.

- Estudio de las reacciones que sufren los sacáridos hemicelulósicos de madera de

Pinus pinaster en medio ácido, operando en autoclave a temperaturas hasta 135 ˚C.

6.12. Modelización cinética de los resultados experimentales obtenidos en el

apartado anterior

- Análisis cinético de datos según mecanismos de reacción basados en las siguientes

etapas: i) hidrólisis de poli- y oligo- sacáridos a monosacáridos; ii) generación de

productos de degradación a partir de los monosacáridos ( HMF a partir de hexosas y

furfural a partir de pentosas); iii) formación de ácido levulínico y ácido fórmico a

partir del HMF; iv) formación de ácido fórmico a partir de furfural; v) formación de

huminas a partir de hexosas, HMF, pentosas y furfural.

- Determinación de los coeficientes cinéticos de las reacciones implicadas en el

modelo cinético seleccionado y generalización de los mismos en función de la

concentración de catalizador.

6.13. Estudio de la descomposición de sacáridos hemicelulósicos obtenidos a

partir de madera de Pinus pinaster en medio ácido a altas temperaturas

- Evaluación experimental de la influencia de la temperatura de operación (hasta

250˚C) sobre la descomposición de sacáridos hemicelulósicos de madera de Pinus

pinaster en presencia de ácido sulfúrico.


-151-

6.14. Modelización cinética de los resultados experimentales obtenidos en el

apartado anterior

- Desarrollo de un modelo cinético a partir de los datos experimentales.

- Determinación de los factores pre-exponenciales y energías de activación de las

diferentes reacciones.

- Utilización del modelo para predecir condiciones de operación conducentes a

máximas concentraciones y/o rendimientos en ácido levulínico, HMF o furfural.

6.15. Estudio de la descomposición de sacáridos solubles derivados de

hemicelulosas de madera de Pinus pinaster en presencia de dos fases

líquidas

- Recopilación y evaluación crítica de la bibliografía existente sobre el empleo de

sistemas con dos fases líquidas para la obtención de compuestos furánicos a partir

de azúcares.

- Estudio experimental de la degradación de los sacáridos hemicelulósicos de madera

de Pinus pinaster en medios conteniendo ácido, agua y MIBK empleando diseños de

experimentos.

6.16. Optimización de las condiciones conducentes a máximos rendimientos de

compuestos furánicos

- Modelización empírica de los resultados experimentales, con determinación de

superficies de respuesta.

- Identificación de las condiciones de operación conducentes a los valores máximos

de rendimiento de HMF, furfural y ácido levulínico.

6.17. Efecto de la adición de modificadores a los sistemas con dos fases líquidas

- Revisión bibliográfica sobre modificación de las fases por adición de otros

disolventes, y de sus efectos sobre los rendimientos en compuestos furánicos.

- Evaluación experimental de los efectos causados por la adición de los modificadores

DMSO y 1-butanol.


-152-

- Análisis comparativo de los resultados obtenidos en presencia y ausencia de

modificadores.

IV. RESULTS, DISCUSSION AND

CONCLUSIONS/RESULTADOS,

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

-157-

7. Results, Discussion and

Conclusions

7.1. Prebiotic potential of hemicellulosic saccharides from Pinus pinaster wood

Pinus pinaster wood was subjected to an aqueous pretreatment at 130˚C for removing

hot water-soluble extractives. The extracted solid was subjected to an autohydrolysis stage at

175˚C for 26 minutes in order to solubilize the hemicellulosic fraction. These operational

conditions led to maximum concentrations of poly- and oligosaccharides derived from

hemicellulose (POHs) in liquors, resulting from extensive hemicellulose solubilization, and low

conversion ratios into monosaccharides and degradation products. Autohydrolysis liquors

were treated with ultra- and nanofiltration membranes to obtain purified fractions with

reduced contents of monosaccharides and other non-desired compounds. Two purified

fractions (P1 and P2) with different average molar mass distribution and high POHs contents

were used as carbon sources for proliferation of colonic microbiota. Substrate consumption

and concentration profiles of short chain fatty acids (SCFA) were determined in selected

fermentation experiments using human inocula. Additionally, the increase in bifidobacteria

population was measured by FISH. The prebiotic potential of both concentrates was confirmed

based on their capacity to support SCFA and lactate production, as well as on their bifidogenic

ability.

The experimental work carried out on this topic corresponds to the tasks 6.1, 6.2 (Raw

material characterization and production of autohydrolysis liquors), 6.3, 6.4 and 6.5 (Refining

and evaluation of prebiotic capacity of POHs fractions). The methodology, the experimental

Results, discussion and conclusions/ Resultados, discusión y conclusiones

-158-

results and the discussion of results are included in the article «Manufacture and properties of

bifidogenic saccharides derived from wood mannan», published in the Journal of Agricultural

and Food Chemistry (vol. 60, 4296-4305, 2012), that is presented in ANNEX I.

On the other hand, the exploitation rights were reserved by a national patent

application entitled «Procedimiento para la obtención de sacáridos bifidogénicos a partir de

hemicelulosas de Pinus pinaster», registered on January 23rd, 2012 with the number

201200058, presented in ANNEX II.

7.2. Evaluation of the antioxidant potential of saccharides obtained from rice

husks, Eucalyptus globulus wood and Pinus pinaster wood

Autohydrolysis liquors from the above cited raw materials were obtained operating

under experimental conditions leading to solutions of high POHs contents. These solutions

were subjected to multistep processing to obtaining purified fractions of different purity.

Different operational modes were considered, all of them based on consecutive stages of

membrane processing and ion exchange. Characterization of selected samples by MALDI-TOF-

MS showed that POHs derived from glucomannan corresponded to acetylated oligomers with

degrees of polymerization (DP) in the range 3-14, while the POHs made up of pentoses

(derived from xylan) presented a DP range 5-7. The DP of these concentrates was reduced

using enzymes with endomannanase and endoxylanase activities, in order to obtain

compounds with more favorable average molar masses for utilization as ingredients in

functional foods.

The various refining treatments removed the undesired fractions (including

monosaccharides and non-saccharide compounds), leading to concentrates of increased POHs

content. After the ion exchange step, the sample contents of phenolic compounds and

antioxidant activity dropped markedly. Purified concentrates obtained from the various raw

materials using similar refining stages presented in vitro antioxidant properties that followed

closely related performance. Concentrates presented a dose dependent reducing power, free

radical scavenging capacity and protection against oxidation in emulsion. Raw hydrolyzates

showed a reducing power comparable to that of the reference compound BHT, but lower than

the one of BHA. Membrane processing hardly affected the TEAC values of concentrates, which

were significantly reduced by ion exchange treatments. FRAP and TEAC assays showed similar

experimental trends. Concentrates presented a comparatively limited capacity to protect β-


-159-

carotene against oxidation in-linolenic acid emulsion, with poor performance in comparison

with BHA and BHT. The experimental results confirmed the antioxidant and prebiotic activities

of refined hemicellulose concentrates.

The experimental work carried out in this section corresponds to the tasks 6.1, 6.2, 6.6,

6.7 (Raw material characterization and production of autohydrolysis liquors), 6.8, 6.9 and 6.10

(Refining of autohydrolysis liquors and evaluation of antioxidant activity of fractions with

different POHs purity grade). The methodology, the experimental results and their discussion

are included in the article «Characterization, refining and antioxidant activity of saccharides

derived from hemicelluloses of wood and rice husks», published in Food Chemistry (vol. 141,

495-502, 2013), that is presented in ANNEX III.

7.3. Influence of sulfuric acid concentration on the degradation kinetics of

hemicellulosic saccharides present in Pinus pinaster autohydrolysis liquors

Pinus pinaster wood autohydrolysis liquors were subjected to treatments in aqueous

media containing sulfuric acid at concentrations in the range 0.5 – 10 wt% operating in

autoclave at 120, 130 or 135˚C. The degradation kinetics of hemicellulosic saccharides and the

generation of levulinic acid and furans were determined. The results were interpreted on the

basis of a kinetic mechanism including the following reactions: conversion of poly- and oligo-

saccharides into monosaccharides; conversion of pentoses into furfural, furfural conversion

into formic acid; conversion of hexoses into HMF, HMF conversion into levulinic and formic

acids; and formation of humins. The kinetic coefficients involved in the various reactions were

determined and correlated with the sulfuric acid concentration. Under the best conditions, the

levulinic acid yield accounted for 66% of the one corresponding to stoichiometric conversion.

The experimental work carried out in this section corresponds to the tasks 6.1, 6.2

(Raw material characterization and production of autohydrolysis liquors), 6.11 and 6.12

(Degradation kinetics of POHs from pine wood in acidic media). The methodology, the

experimental results and their discussion are included in the article «Manufacture of levulinic

acid from pine wood hemicelluloses: A kinetic assessment», published in the journal Industrial

& Engineering Chemistry Research (vol. 52, 3951-3957, 2013), that is presented in ANNEX IV.


-160-

7.4. Decomposition of hemicellulosic saccharides from Pinus pinaster wood in

acidic media at high temperatures

Sulfuric acid was added to Pinus pinaster wood autohydrolysis at a concentration of 1

wt%. The resulting solutions were heated up to reach temperatures in the range 130 - 250˚C,

and the concentration profiles of the substrates and target reaction products were measured.

The experimental results were interpreted on the basis of a kinetic mechanism including the

following reactions: POHs hydrolysis into their constituent monomers, hexoses dehydration to

HMF, HMF rehydration to yield levulinic and formic acids, dehydration of pentoses into

furfural, and generation of decomposition products by parasitic reactions. The values of the

kinetic parameters were calculated for the various individual reactions, and the major

experimental trends were identified. High temperatures favored furan generation respect to

decomposition reactions, enabling furfural yields close to 80% of the theoretical value. Under

the same conditions, the conversion of hexoses into HMF preceded at yields around 20% of

the theoretical value. The highest levulinic acid yields were obtained at low temperatures

operating for prolonged periods of time. No satisfactory compromise conditions for the

simultaneous production of levulinic acid and furfural could be identified, owing to their very

different kinetic behavior.


(Raw material characterization and production of autohydrolysis liquors), 6.13 and 6.14 (Study

of the degradation kinetics of POHs from pine wood at high temperatures). The methodology,

the experimental results and their discussion are presented in the article «Acidic processing

of hemicellulosic saccharides from pine wood: product distribution and kinetic modeling»,

which is currently being considered for publication in the Chemical Engineering Journal, and is

presented in ANNEX V.

7.5. Production of furans from Pinus pinaster hemicellulosic saccharides using

biphasic liquid systems

Pinus pinaster wood autohydrolysis liquors were subjected to heating in acidic media

(1 wt % sulfuric acid) together with an organic phase able to selectively extract the target

compounds. The effects of selected operational variables (volume ratio between organic and

aqueous phases, temperature and reaction time) on the conversion of hemicellulosic

saccharides into furans (HMF and furfural) and levulinic acid were assessed. The set of


-161-

experiments followed an incomplete, factorial design at three levels. By means of empirical

modelling, response surfaces defining the interrelationships between operational and

dependent variables were defined, and used to determine the optimal experimental

conditions. Furfural was mainly present in the organic phase, and reached 71.4% of the

stoichiometric yield operating under the following conditions: temperature, 165˚C; organic to

aqueous phase volume ratio, 2; reaction time, 68,5 minutes. HMF and levulinic acid presented

a lower migration tendency to the organic phase, and reached lower maximum conversions

(around 40% and 30%, respectively). Additional experiments were carried out under conditions

selected from the above results. DMSO and 1-butanol were added to modify the properties of

both organic and aqueous phases. Lower HMF decomposition into levulinic and formic acids

was observed in the presence of DMSO, enabling comparatively high yields of both furfural

and HMF.


(Raw material characterization and production of autohydrolysis liquors), 6.15, 6.16 and 6.17

(Use of liquid biphasic systems to obtain furanic compounds). The methodology, the

experimental results and their discussion are presented in the article «Production of furans

from hemicellulosic saccharides in biphasic reaction systems», published in Holzforschung (vol.

67, number 8, 923-929, 2013), that is presented in ANNEX VI.

-163-

7. Resultados, Discusión y

Conclusiones

7.1. Evaluación del potencial prebiótico de los sacáridos hemicelulósicos de

madera de Pinus pinaster

Se ha extraído la madera de Pinus pinaster en medio acuoso a 130˚C para eliminar los

extractos solubles en agua, y se ha realizado una posterior etapa de autohidrólisis al sólido

resultante, operando a 175˚C durante 26 minutos, para solubilizar la fracción hemicelulósica.

Este procedimiento ha permitido obtener licores de autohidrólisis con elevadas

concentraciones de sacáridos hemicelulósicos, resultantes de solubilizar un alto porcentaje de

la fracción hemicelulósica, y mantener una baja tasa de generación de monómeros y productos

de degradación. Los licores de autohidrólisis se sometieron a tratamientos con membranas de

ultra- y nanofiltración, para obtener fracciones purificadas con bajos contenidos en

monosacáridos y otros compuestos no volátiles. Se seleccionaron dos fracciones (P1 y P2) de

elevado contenido en sacáridos hemicelulósicos, pero con distintos pesos moleculares

promedio. Ambas fracciones se emplearon como fuentes de carbono para el metabolismo de

la microbiota intestinal. Se midieron tanto el consumo de sustratos como la formación de

ácidos grasos de cadena corta. Adicionalmente, se estudió el incremento de la población de

bifidobacterias empleando la técnica FISH. El potencial prebiótico de ambos concentrados se

ha confirmado midiendo su capacidad de actuar como sustratos para la producción de ácidos

grasos de cadena corta y lactato en los medios de fermentación, así como su capacidad

bifidogénica.


-164-

La labor experimental realizada en este apartado corresponde a las tareas 6.1, 6.2

(Caracterización de la materia prima y obtención de licores de autohidrólisis), y 6.3, 6.4 y 6.5

(Refinado y evaluación prebiótica de las fracciones de POHs). La metodología, los resultados

experimentales y la discusión de los datos obtenidos se recogen en el artículo titulado

“Manufacture and properties of bifidogenic saccharides derived from wood mannan”,

publicado en la revista Journal of Agricultural and Food Chemistry (vol. 60, págs. 4296-4305,

2012) que se presenta como ANEXO I.

Por otra parte, los derechos de explotación de este proceso están en trámite de

reserva a través de la solicitud de la patente a nivel nacional titulada “Procedimiento para la

obtención de sacáridos bifidogénicos a partir de hemicelulosas de Pinus pinaster”, con fecha

de registro 23/01/12 y número 201200058, que se presenta como ANEXO II.

7.2. Evaluación del potencial antioxidante de sacáridos de cáscaras de arroz y de

maderas de Eucalyptus globulus y Pinus pinaster

Se han obtenido licores de autohidrólisis a partir de las materias primas que se citan en

el encabezamiento, operando en condiciones experimentales conducentes a disoluciones con

elevados contenidos de sacáridos hemicelulósicos. Partiendo de éstos, se han aplicado

tratamientos multietapa para la obtención de fracciones de distinta pureza. Se han planteado

distintos modos de operación, consistentes en etapas consecutivas de purificación con

membranas y con resinas de intercambio iónico. La caracterización mediante MALDI-TOF-MS

de fracciones seleccionadas indica que los sacáridos hemicelulósicos procedentes del

glucomanano corresponden a oligómeros acetilados con grados de polimerización en el

intervalo 3-14, mientras que los grados de polimerización de los sacáridos hemicelulósicos

constituidos por pentosas (que derivan del xilano) se encuentran en el intervalo 5-7. El grado

de polimerización de estos concentrados se redujo empleando enzimas con actividades

endomananasa y endoxilanasa, obteniéndose compuestos con pesos moleculares promedio

más favorables para su uso como ingrediente de alimentos funcionales.

Los distintos tratamientos de refinado propuestos han conseguido reducir el contenido

en monosacáridos e impurezas, incrementando el contenido relativo de sacáridos

hemicelulósicos. Tras la etapa de intercambio iónico se observó una marcada disminución del

contenido en compuestos fenólicos y de la actividad antioxidante. Diferentes muestras de

sacáridos hemicelulósicos obtenidos a partir de distintas materias primas sometidas a


-165-

procedimientos de refinado del mismo tipo mostraron patrones de variación similares para las

propiedades antioxidantes in vitro. Los concentrados mostraron un poder reductor

dependiente de la dosis, así como capacidad de captación de radicales libres y capacidad para

proteger contra la oxidación en emulsión. Los hidrolizados crudos mostraron un poder

reductor comparable al del compuesto de referencia BHT, pero más bajo que el del BHA. Los

concentrados procesados con membranas mostraron escasas variaciones en los valores de

TEAC, que disminuyeron significativamente tras tratamientos con resinas de intercambio

iónico. Los ensayos FRAP y TEAC condujeron a datos que mostraron patrones de variación

similares. Los concentrados obtenidos en este trabajo presentaron una capacidad

comparativamente limitada para proteger contra la oxidación del β-caroteno en emulsión con

ácido linoleico, proporcionando unos coeficientes de actividad antioxidante menos favorables

que los del BHA y el BHT.

La labor experimental realizada en este apartado corresponde a las tareas 6.1, 6.2, 6.6,

6.7 (Caracterización de las materias primas y obtención de licores de autohidrólisis), 6.8, 6.9 y

6.10 (Refinado y evaluación de la actividad antioxidante de las fracciones con distintos grados

de pureza de los POHs). La metodología, los resultados experimentales y la discusión de los

datos obtenidos se recogen en el artículo titulado “Characterization, refining and antioxidant

activity of saccharides derived from hemicelluloses of wood and rice husks”, publicado en la

revista Food Chemistry (vol. 141, págs. 495-502, 2013) que se presenta como ANEXO III.

7.3. Determinación de la influencia de la concentración de ácido sulfúrico en la

cinética de degradación de sacáridos hemicelulósicos presentes en licores

de autohidrólisis de madera de Pinus pinaster

Los licores de autohidrólisis de madera de Pinus pinaster se han sometido a

tratamientos en medios acuosos conteniendo diferentes concentraciones de ácido sulfúrico

(0,5 - 10%) operando en autoclave a 120, 130 y 135˚C. Se han determinado las cinéticas de

degradación de los azúcares hemicelulósicos, así como de formación de ácido levulínico y de

compuestos furánicos. La interpretación de los resultados se ha llevado a cabo considerando

un mecanismo cinético basado en las siguientes reacciones: conversión de poli- y oligo-

sacáridos en monosacáridos; conversión de pentosas en furfural, y de este último en ácido

fórmico; conversión de hexosas en HMF con posterior conversión de éste en ácido fórmico y

ácido levulínico; y formación de huminas. Se determinaron los coeficientes cinéticos que rigen

las distintas reacciones, y se generalizaron los valores de éstos en función de la concentración


-166-

de ácido sulfúrico. En las mejores condiciones ensayadas se obtuvieron rendimientos de ácido

levulínico correspondientes al 66% del valor estequiométrico.

El trabajo realizado en este apartado corresponde a las tareas 6.1, 6.2 (Caracterización

de las materias primas y obtención de los licores de autohidrólisis), 6.11 y 6.12 (Estudio de las

cinéticas de degradación de los POHs de pino en condiciones ácidas). La metodología, los

resultados experimentales y la discusión de los resultados obtenidos se recogen en el artículo

titulado “Manufacture of levulinic acid from pine wood hemicelluloses: A kinetic assessment”,

publicado en la revista Industrial & Engineering Chemistry Research (vol. 52, págs. 3951-3957,

2013) que se presenta como ANEXO IV.

7.4. Estudio de la descomposición de sacáridos hemicelulósicos obtenidos a

partir de madera de Pinus pinaster en medio ácido a altas temperaturas

Se formularon medios reacción por mezcla de licores de autohidrólisis de la madera de

Pinus pinaster con ácido sulfúrico (hasta alcanzar una concentración del 1% en peso). Las

disoluciones resultantes se calentaron hasta alcanzar temperaturas en el intervalo 130 - 250˚C,

y se determinaron experimentalmente los perfiles de concentración de los diferentes

compuestos de interés. La interpretación de los resultados experimentales se ha llevado a

cabo a través de un mecanismo que incluye las siguientes etapas de reacción: hidrólisis de los

polimeros y oligómeros hemicelulósicos a los correspondientes monómeros, deshidratación de

las hexosas a HMF con posterior rehidratación de éste a ácido levulínico, deshidratación de las

pentosas a furfural, y generación de productos de descomposición por reacciones secundarias.

Se han calculado los parámetros cinéticos que rigen cada una de las reacciones individuales, y

se han evaluado las principales tendencias experimentales. Las temperaturas altas favorecen

las reacciones de formación de furanos frente a las de descomposición de los mismos, lo que

permite obtener conversiones de pentosas en furfural cercanas al 80% del valor teórico

operando en condiciones seleccionadas. En esas mismas condiciones, la conversión de hexosas

a HMF transcurre con conversiones en torno al 20%. Se ha observado que los mejores

rendimientos en ácido levulínico se obtienen a bajas temperaturas operando durante tiempos

de reacción prolongados. No existen condiciones de compromiso satisfactorias que permitan

la producción conjunta de ácido levulínico y furfural, debido a su diferente comportamiento

cinético.


-167-

El trabajo realizado en este apartado corresponde a las tareas 6.1, 6.2 (Caracterización

de las materias primas y obtención de licores de autohidrólisis), 6.13 y 6.14 (Estudio de las

cinéticas de degradación de los POHs de pino a alta temperatura). La metodología analítica,

los resultados obtenidos y la correspondiente discusión se recogen en el artículo titulado

“Acidic processing of hemicellulosic saccharides from pine wood: product distribution and

kinetic modeling”, que ha sido enviado para publicación a la revista Chemical Engineering

Journal, y figura en el ANEXO V de esta memoria.

7.5. Producción de furanos a partir de sacáridos de hemicelulosas de Pinus

pinaster empleando sistemas líquidos bifásicos

Los licores de autohidrólisis de la madera de Pinus pinaster se sometieron a

tratamiento ácido (en medios conteniendo 1% de ácido sulfúrico), en presencia de una fase

orgánica capaz de extraer selectivamente los compuestos objetivo. Se estudiaron los efectos

de la relación de volúmenes entre las fases orgánica y acuosa, la temperatura y el tiempo de

reacción sobre la conversión de los sacáridos hemicelulósicos en furanos (HMF y furfural) y

ácido levulínico. La experimentación se llevó a cabo siguiendo un diseño experimental factorial

incompleto a tres niveles. La modelización empírica de los resultados permitió calcular las

superficies de respuesta que rigen el comportamiento del sistema, y a partir de ellas,

determinar las condiciones óptimas de operación. El furfural se distribuyó preferentemente en

la fase orgánica, alcanzándose una conversión máxima del 71,4% en las siguientes condiciones:

temperatura, 165˚C; relación de volúmenes entre fase orgánica y acuosa, 2; tiempo de

reacción, 68,5 minutos. En el caso del HMF y del ácido levulínico la tendencia a la migración a

la fase orgánica es mucho menor, y también lo fueron las conversiones máximas alcanzadas

(en torno a 40% y 30%, respectivamente). Se realizaron experimentos adicionales operando en

las condiciones óptimas establecidas en base a la información anterior, empleando DMSO y 1-

butanol para como modificadores de fases. En los experimentos en los que se añadió DMSO se

observó una reducción de la descomposición de HMF a ácidos levulínico y fórmico,

permitiendo conseguir simultáneamente conversiones altas en furfural e HMF.

El trabajo realizado en este apartado se corresponde con las tareas 6.1, 6.2

(Caracterización de las materias primas y obtención de licores hemicelulósicos), 6.15, 6.16 y

6.17 (Estudio del empleo de sistemas líquidos bifásicos en la obtención de compuestos

furánicos). La metodología analítica, los resultados obtenidos y la correspondiente discusión

se recogen en el artículo titulado “Production of furans from hemicellulosic saccharides in


-168-

biphasic reaction systems”, publicado en la revista Holzforschung (vol. 67, número 8, págs.

923-929, 2013) que se presenta como ANEXO VI.

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http://www.microbial-ecology.net/probebase

VI. INFORMACIÓN Y CRITERIOS DE

CALIDAD DE LAS PUBLICACIONES

-229-

Información y criterios de calidad de las

publicaciones

En la «Normativa Interna de la Universidade de Vigo sobre Tesis Doctorales formadas

por compendio de artículos», se indica que para la admisión de la Tesis se debe incluir una

descripción del factor de impacto u otros criterios de calidad de las revistas en las que han sido

publicados los artículos que forman parte de la memoria. Deben quedar claramente explícitos

los nombres de todos los autores y su orden, su filiación, el nombre de la publicación, la

editorial y el ISSN o ISBN. Si alguno de los trabajos incluidos es de varios autores, ha de quedar

claramente de manifiesto cuál ha sido la aportación de cada autor.

A continuación se da la información requerida de cada una de las publicaciones,

incluyendo factores de impacto y las posiciones relativas dentro de los epígrafes en los que se

encuentra.

Anexo I

- Título: Manufacture and properties of bifidogenic saccharides derived from wood

mannan

- Autores: Sandra Rivas, Beatriz Gullón, Patricia Gullón, José Luís Alonso, Juan Carlos

Parajó

- Revista: Journal of Agricultural and Food Chemistry

- Editorial: American Chemical Society

- ISSN: 0021-8561

Información y criterios de calidad de las publicaciones

-230-

- Epígrafe: FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY

- Factor de impacto en el año de la publicación (2012): 2.906

- Posición relativa de la revista en el epígrafe en el año de la publicación (2012):15/124

- D.O.I: 10.1021/jf300524s

- Datos de publicación: año 2012, volumen 60 (número 17): páginas 4296-4305

Anexo II

- Título: Procedimiento para la obtención de sacáridos bifidogénicos a partir de las

hemicelulosas de madera de Pinus pinaster

- Autores: Sandra Rivas Siota, Patricia Gullón Estévez, Beatriz Gullón Estévez, José Luis

Alonso González, Juan Carlos Parajó Liñares

- Patente:

Anexo III

- Título: Characterization, refining and antioxidant activity of saccharides derived from

hemicelluloses of wood and rice husks

- Autores: Sandra Rivas, Enma Conde, Andrés Moure, Herminia Domínguez, Juan Carlos

Parajó

- Revista: Food Chemistry

- Editorial: Elsevier LTD

- ISSN: 0308-8146

- Epígrafe: FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY

- Factor de impacto en el año 2012: 3.334

- Posición relativa de la revista en el epígrafe en el año 2012: 10/124

- D.O.I: 10.1016/j.foodchem.2013.03.008

- Datos de publicación: año 2013, volumen 141: páginas 495-502

Anexo IV

- Título: Manufacture of levulinic acid from Pine wood hemicelluloses: A kinetic

assessment

- Autores: Sandra Rivas, María Jesús González-Muñoz, Carlos Vila, Valentín Santos, Juan

Carlos Parajó

- Revista: Industrial and Engineering Chemistry Research

- Editorial: American Chemical Society


-231-

- ISSN: 0888-5885

- Epígrafe: ENGINEERING, CHEMICAL



- D.O.I: 10.1021/ie3018725

- Datos de publicación: año 2013, volumen 52: páginas 3951-3957

Anexo V

- Título: Acidic processing of hemicellulosic saccharides from pine wood: product

distribution and kinetic modeling

- Autores: Sandra Rivas, María Jesús González-Muñoz, Valentín Santos, Juan Carlos

Parajó

- Revista: Chemical Engineering Journal

- Editorial: Elsevier LTD

- ISSN: 1385-8947

- Epígrafe:



- D.O.I:

- Datos de publicación: Enviado para publicación

Anexo VI

- Título: Production of furans from hemicellulosic saccharides in biphasic reaction

systems

- Autores: Sandra Rivas, María Jesús González-Muñoz, Valentín Santos, Juan Carlos

Parajó

- Revista: Holzforschung

- Editorial: Walter de Gruyter GmbH & Co

- ISSN: 0018-3830

- Epígrafe: MATERIALS SCIENCE, PAPER & WOOD



- D.O.I: 10.1515/hf-2013-0017

- Datos de publicación: año 2013, volumen 67 (número 8): páginas 923-929

http://dx.doi.org/10.1515/hf-2013-0017


-232-

La contribución de los distintos autores ha sido:

- La candidata, que figura como primera autora en todas las aportaciones recogidas en

los anexos, ha sido responsable de la obtención de todos los datos experimentales, de

las labores relacionadas con las búsquedas bibliográficas y de la elaboración de

borradores de artículos.

- Los directores de la Tesis que se presentan, Profs. Drs. Parajó Liñares y Santos Reyes y

Dra. González-Muñoz, que han ejercido las labores de definición de objetivos y planes

de trabajo, orientación, apoyo y coordinación de las labores experimentales, así como

la corrección y gestiones de publicación de los artículos que se incluyen en los anexos.

- El Prof. Dr. José Luis Alonso y las Dras. B. Gullón y P. Gullón, que han adiestrado a la

candidata en la evaluación de capacidades prebióticas, y han evaluado críticamente los

resultados obtenidos, contribuyendo a la readacción de dos de los artículos incluidos

en los anexos.

- La Profa. Dra. Domínguez González y los Dres. E. Conde y A. Moure, que han

adiestrado a la candidata en la evaluación de actividades antioxidantes, y han evaluado

críticamente los resultados por ella obtenidos, contribuyendo a la redacción de uno de

los artículos que se anexan.

- El Dr. C. Vila, que ha formado a la candidata en la modelización cinética y en la

resolución de ecuaciones diferenciales, contribuyendo a la redacción de uno de los

artículos que se anexan.

VII. ANEXOS

ANEXO I: Manufacture and properties of

bifidogenic saccharides derived from Wood

mannan

Manufacture and Properties of Bifidogenic Saccharides Derived fromWood MannanSandra Rivas,†,‡ Beatriz Gullon,†,‡ Patricia Gullon,†,‡ Jose Luis Alonso,†,‡ and Juan Carlos Parajo*,†,‡

†Department of Chemical Engineering, Faculty of Science, University of Vigo (Campus Ourense), As Lagoas, 32004 Ourense, Spain‡CITI-Tecnopole, San Ciprian de Vinas, 32901 Ourense, Spain

ABSTRACT: Pinus pinaster wood samples were subjected to double hydrothermal processing. The liquors coming from thesecond stage, containing soluble saccharides of polymeric or oligomeric nature from hemicelluloses (POHs), were subjected tomembrane processing (operating in discontinuous diafiltration) for refining and fractionation. Refined POH fractions werecharacterized by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry and chromatographic techniques.The most complex POH component was made up of 14 hexoses and contained 4 acetyl groups. The fermentability of purifiedPOHs by human fecal inocula was assessed by measuring both carbon source consumption and formation of short-chain fattyacids. The bifidogenic ability of POHs was confirmed by fluorescence in situ hybridization. The stimulatory effects on thebifidobacterial population reached by POHs were of the same order as those obtained with commercial fructooligosaccharides.

KEYWORDS: autohydrolysis, FISH, fractionation, glucomannans, Pinus pinaster, prebiotics, refining, structure

INTRODUCTIONThe importance of human intestinal microbiota in maintaininghost health is well-known. In the past few decades, theconsumer’s awareness for healthier foods has increased,boosting the interest in new prebiotics. A dietary prebiotic isa selectively fermented ingredient that results in specificchanges in the composition and/or activity of the gastro-intestinal microbiota, thus conferring benefit(s) upon hosthealth.1 Nondigestible, fermentable carbohydrates have at-tracted increasing attention as prebiotics, derived from theirability to improve the bowel health of both humans andanimals. These carbohydrates must resist hydrolytic digestionwhile being susceptible to fermentation in the large bowel,yielding short-chain fatty acids (SCFAs) and increasing thepopulations of beneficial bacteria (such as bifidobacteria andlactobacilli).Nondigestible oligosaccharides (NDOs) have been the focus

of interest in the development of new prebiotic ingredientsfrom traditional and nontraditional sources, including wood.Whereas the prebiotic potential of hardwood-derived xylooli-gosaccharides has been assessed in depth, the prebioticproperties of saccharides derived from softwood hemicelluloses(mainly made up of glucomannans) remain almost unexploredin the scientific literature.Pinus pinaster is the most widespread conifer species in Spain.

The hemicellulosic fraction of P. pinaster wood is made up of anumber of polysaccharides, glucomannans substituted withacetyl and galactosyl moieties being the major component.Among other polysaccharides, the presence of arabinoglucur-onoxylans in pine hemicelluloses has been reported.2 Thebackbone of pine mannans [including glucomannans (GMs)and galactoglucomannans (GGMs), which differ in theabundance of galactosyl substituents] is made up of randomlydistributed D-glucose and D-mannose structural units linked byβ (1 → 4) glycosidic bonds, which can be substituted withirregularly distributed acetyl groups.3

In pioneering works, GMs were isolated from Pinusbanksiana4 and Pinus strobus,5 and the dependence of thepolymer structure on the isolation procedure was pointed out.Partial hydrolysis of the polymers with formic acid led to anumber of oligosaccharides keeping the general structure of thepolymer.5 Additionally, the acetylation pattern of pine GMs wasestablished.6

Recently, the structure of an industrial byproduct from thefiberboad industry containing soluble products derived fromloblolly pine GGMs was converted into oligomeric compoundsby partial hydrolysis with trifluoracetic acid and purified byethanol precipitation. The composition of the resultingproducts was characterized by a number of chromatographic,spectrometric, and spectroscopic techniques. The refinedproduct (“temulose brown sugar”) contained GGM-derivedsaccharides made up of a β-1,4-linked backbone of mannoseand glucose residues, with occasional α-1,6-branching by singlegalactosyl units and possible mono- or disubstitution by acetylgroups.7 It can be noted that the biological activity of otherprebiotic oligosaccharides (for example, acetylated xylooligo-saccharides from Eucalyptus globulus wood) lies in the presenceof β (1 → 4) glycosidic bonds linking the structural units,which are responsible for their nondigestible character.According to the literature, soluble saccharides of polymeric

or oligomeric nature from pine hemicelluloses (which accountfor fragments of the various hemicellulosic polymers, includingmannans and heteroxylan) can be produced by treatments withsteam or compressed water. Hot water extraction has beenemployed in the isolation of pine glucomannan for structuralstudies and proposed as a processing stage prior to kraf tpulping in a biorefinery approach.8 In a recent study, the

Received: February 7, 2012Revised: March 30, 2012Accepted: April 10, 2012Published: April 11, 2012

Article

pubs.acs.org/JAFC

© 2012 American Chemical Society 4296 dx.doi.org/10.1021/jf300524s | J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 4296−4305

pubs.acs.org/JAFC

optimal conditions for producing soluble saccharides from P.pinaster wood hemicelluloses by processing with hot, com-pressed water (autohydrolysis or hydrothermal treatments)were identified.9 Under suitable conditions, soluble saccharideswere obtained at high yield and then saccharified withexternally added acid to yield a mixture of hemicellulosicsugars. According to the kinetic principles governing thehydrolytic breakdown of hemicelluloses, and as has beenreported for xylan-containing materials,10,11 both the molarmass distribution and the substitution pattern of solubleproducts derived from hemicelluloses depend on the severity ofthe hydrothermal processing. Besides hemicellulose-derivedpoly- and oligosaccharides, the reaction liquor from hydro-thermal processing contains monosaccharides and nonsacchar-ide compounds, which should be removed (at least in part) toimprove the purity of the target compounds, particularly whenfood applications are envisaged. This goal can be reached bymembrane processing: ultrafiltration (UF) allows the separa-tion of suspended particles and high molar mass compounds,whereas nanofiltration (NF) can be useful for the simultaneousconcentration, fractionation, and refining of the target products,particularly by removing undesired compounds of lowmolecular mass.12

The applications of mannans in the food industry are wellknown, and their description is out of the scope of this study.Focusing on the potential of wood-derived saccharides ofpolymeric or oligomeric nature from hemicelluloses (POHs;mainly made up of GGM-derived saccharides) as foodadditives, prebiotic properties of this type of product havebeen claimed in a recent patent13 and assayed as a dietarysupplement for dogs.14 Additionally, results on the fermenta-tion of the same products with dog feces have been reported.15

In this work, POHs (including soluble saccharides frommannans and xylans) were manufactured by autohydrolysis ofP. pinaster wood and refined using membranes. The purificationeffects reached by treatments were measured, and refinedPOHs were assayed for prebiotic properties (includinggeneration of SCFAs and bifidogenic potential) by in vitrofermentations.

MATERIALS AND METHODSRaw Materials. P. pinaster wood samples (kindly provided by

Orember-Finsa, Ourense, Spain) were air-dried, milled in a 40 kW mill(ATI, La Coruna, Spain) to pass an 8 mm screen, and homogenized ina single lot.

Autohydrolysis Conditions. Milled wood was subjected to twosequential aqueous treatments (Figure 1). In the first one, performedto remove water-soluble extractives, P. pinaster wood was mixed withdistilled water (at a liquid to solid mass ratio of 8 g of water/g of oven-dried wood) in a stirred, stainless steel reactor (Parr Instrument Co.).The reactor was heated to 130 °C (time needed for heating startingfrom 60 °C, 15.4 min), and then it was immediately cooled to 40 °Cby internal refigeration. Solids were separated by filtration, washed, air-dried, and subjected to a second aqueous treatment (in the samereactor using the same liquid to solid ratio) at 175 °C for 26 min.9

Once the reaction time had elapsed, the reactor was cooled, and theliquor was recovered by filtration, analyzed, and processed.

Processing of Autohydrolysis Liquors: Membrane Process-ing. The autohydrolysis liquor was treated in a stirred Amicon cell(Millipore). Ultrafiltration and nanofiltration were carried out usingregenerated cellulose membranes of 5 and 1 kDa cutoff (Millipore)with a filtration area of 41.8 × 10−4 m2. The operating pressure wasfixed at 4 bar, as enhanced oligosaccharide retention under theseconditions was observed in preliminary experiments (data not shown).Pressure was provided by a compressed nitrogen gas cylinder,measured using a gauge attached to the nitrogen line, and controlledby a regulator. The solution was stirred continuously with a magneticbar at about 110 rpm, avoiding the formation of a deep vortex. Allexperiments were carried out at room temperature.16

The processing scheme followed in this work is shown in Figure 1.The autohydrolysis liquor (stream A) was filtered using a 5 kDa cutoffmembrane operating in concentration mode to achieve the desiredvolume reduction to separate the high molecular fraction as aretentate. For further purification, water was added to the retentate torestore the initial volume, and the resulting solution was concentrated(discontinuous diafiltration) using the same membrane. The refinedretentate, containing POHs of higher molecular mass (stream E),yielded concentrate P1 after freeze-drying. The two permeates weremixed (to yield stream B + D) and subjected to concentration with the1 kDa membrane to remove undesired low molecular masscompounds. The retentate from this stage was supplemented withwater (up to the initial volume) and filtered through the same

Figure 1. Scheme of the process employed for obtaining concentrates P1 and P2.

Journal of Agricultural and Food Chemistry Article

dx.doi.org/10.1021/jf300524s | J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 4296−43054297

membrane to reach the desired concentration degree to obtain aretentate rich in POHs of lower molecular mass (stream H, whichyielded concentrate P2 after freeze-drying). The different streams wereassayed for composition. Concentrates P1 and P2 were used assubstrates for in vitro fermentations.Fermentation of POH Concentrates. Fecal Inocula. Fecal

samples were obtained from three healthy human volunteers,who usually ingested a normal diet, presented no digestivediseases, and did not receive antibiotics for at least 3 months.Feces were collected in sterile vials, kept in an anaerobiccabinet, and used within a maximum of 2 h after collection.Fecal inocula (FI) were prepared by dilution in a reducedphysiological salt solution (RPS; cysteine−HCl, 0.5 g/L, andNaCl, 8.5 g/L) at 100 g of feces/L of RPS and pH 6.8,following the methodology described elsewhere.16

Fermentation Media. The nutrient base medium used infermentations was modified according to Jaskari et al.:17 a solutioncontaining 5.0 g/L trypticase soya broth (TSB) without dextrose(BBL, Lockeysville, MD), 5.0 g/L bactopeptone (Amersham,Buckinghamshire, U.K.), 5.0 g/L yeast nitrogen base (YNB; Difco,Detroit, MI), 0.5 g/L cysteine hydrochloride (Merck, Darmstadt,Germany), 1.0% (v/v) salt solution A (100.0 g/L NH4Cl, 10.0 g/LMgCl2·6H2O, 10.0 g/L CaCl2·2H2O), trace mineral solution, 0.2% (v/v) salt solution B (200.0 g/L K2HPO4·3H2O), and 0.2% (v/v) 0.5 g/Lresazurin solution was prepared in distilled water. The final pH of themedium was adjusted to 6.8. After deoxygenation, 8.0 mL aliquotswere dispensed into airtight anaerobic culture tubes, which were sealedwith aluminum caps before autoclave sterilization. Stock solutions ofYNB, POH concentrates, and glucose (Sigma, St. Louis, MO) weresterilized through 0.2 μm Chromafils filters (Macherey-Nagel, Duren,Germany) into sterile airtight serum bottles. All additions andinoculations were carried out inside an anaerobic cabinet (5% H2,10% CO2, and 85% N2).Before inoculation, both YNB and carbohydrate solutions were

aseptically added to the anaerobic culture tubes with nutrient basemedium (using syringes and needles under anaerobic conditions in ananaerobic cabinet), to achieve final concentrations of 5 and 10.0 g/L,respectively. The tubes with the fermentation media were inoculatedwith 0.2 mL of fecal slurry dilution (2%, v/v) prepared in duplicate asdescribed above and incubated at 37 °C for 48 h without shaking. Cellswere harvested from samples by centrifugation, and supernatants werefiltered for HPLC analysis. The pH of the tube contents was measuredwith a standard pH meter.Quantitation of Bifidobacteria in Batch Cultures by

Fluorescent in Situ Hybridization (FISH). Quantitation ofbifidobacteria in fecal batch fermentations was performed by FISH16

using Bif164 probes targeting specific regions of the 16S rRNA genelabeled with fluorescent dye Cy3 (Sigma).At fixed fermentation times, samples were centrifuged at 15000g for

2 min to separate particulate matter and fixed overnight inparaformaldehyde (4 g of paraformaldehyde/100 g of solution) at 4°C (volume ratio of sample to paraformaldehyde solution, 1:3). Cellswere washed with phosphate-buffered saline (0.1 M, pH 7.0),resuspended in 150 μL of phosphate-buffered saline plus 150 μL ofethanol, and stored at −20 °C for at least 1 h before furtherprocessing. In 1.5 mL microcentrifuge tubes, 200 μL of filteredhybridization buffer (40 mmol/L Tris−HCl, pH 7.2, 1.8 mol/L NaCl,and a 20 mL/L solution containing 100 g of sodium dodecyl sulfate/L), 64 μL of deionized distilled water, and 16 μL of the fixed cells wereadded. In a 0.5 mL microcentrifuge tube, 5 μL of the probe (50 ng/μL) was mixed with 45 μL of the above hybridization solution, and themixture was shaken and incubated overnight at 50 °C.In a 10 mL centrifuge tube, 5.0 mL of prewarmed hybridization

buffer (20 mmol/L Tris−HCl, pH 7.2, 0.9 mol/L NaCl) and 20 μL of4′,6-diamidino-2-phenylindole (500 ng/mL) were added. The mixturewas returned to the oven at the adequate temperature for 30 min. Thewashing mixture was filtered through a 0.20 μm NucleporePolicarbonate filter (Whatman, Kent, U.K.) under vacuum. Afteraddition of 5 μL of poly(vinyl alcohol) mounting medium with 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane antifade reagent (Sigma), the filters were

placed on slides and covered with a coverslip. The slides were stored inthe dark at 4 °C for a maximum of 3 days and were examined duringthis period using an epifluorescence microscope (Olympus BX41)equipped with Fluor 100 lenses. FISH counts were made in duplicate.

Analytical Methods. Samples of liquors were filtered through 0.45μm cellulose acetate membranes, neutralized with barium carbonate,and assayed by HPLC for glucose, xylose, mannose, galactose, andarabinose using a 1100 series Hewlett-Packard chromatograph fittedwith a refractive index detector operated at 50 °C and a 300 × 7.8 mmCARBOsep CHO 682 column (Transgenomic, Glasgow, U.K.)operating at 80 °C. Distilled water was used as the mobile phase(flow rate 0.4 mL/min). Acetic acid was determined by HPLC using a300 × 7.8 mm Aminex HPX-87H column (BioRad, Hercules, CA)operated at 60 °C (mobile phase 0.003 M H2SO4, flow rate 0.6 mL/min).

The concentrations of POHs and linked acetyl groups weredetermined from the concentrations of monosaccharides and aceticacid present in liquors previously subjected to a quantitativeposthydrolysis (treatment with 4% sulfuric acid at 121 °C for 20min). Before analysis on a CARBOsep CHO 682 column,posthydrolysis samples were neutralized with barium carbonate.Uronyl substituents were determined by a previous method18 usinggalacturonic acid as a standard for quantitation. All analyses were madein triplicate. The content of nonvolatile compounds (NVCs) in theliquors was measured by oven-drying at 105 °C until constant masswas achieved.

Supernatants from the anaerobic culture tubes inoculated with FIwere filtered through 0.20 μm cellulose acetate membranes. Aliquotsof the filtered samples were assayed for organic acids (lactic, acetic,formic, propionic, and butyric acids) by HPLC-RI using an AminexHPX-87H column (BioRad) using the method described above.Monosaccharides and total oligosaccharides were determined byHPLC using a CARBOsep CHO 682 column (Transgenomic) usingthe method described above.

High-Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC).The molecular mass distribution of the target products was determinedby HPSEC using two 300 × 7.8 mm TSKGel G3000PWXL columnsin series (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany), in combination witha 40 × 6 mm PWX-guard column, operating at 30 °C with a refractiveindex detector. The mobile phase was distilled water (flow rate 0.6mL/min). Dextrans (1000−80000 g/mol) from Fluka (parentcompany of Sigma-Aldrich) were used as calibration standards.

High-Performance Anion Exchange Chromatography withPulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD). Samples wereanalyzed by HPAEC-PAD using an ICS3000 chromatographic system(Dionex, Sunnyvale, CA), equipped with a 250 × 2 mm CarboPac PA-1 column in combination with a 25 × 2 mm CarboPac PA guardcolumn and an ISC3000 PAD detector. A flow rate of 1 mL/min wasused with mobile phases A (distilled water), B (0.2 M NaOH), and C(2 M NaOAc in 0.2 NaOH). Elution was done with the followingprogram: 88% A/12% B isocratic for 20 min, then to 50% A/50% B in5 min (concave gradient), then to 50% A/48% B/2% C in 25 min(concave gradient), then to 50% A/45.5% B/4.5% C in 10 min(concave gradient), then to 50% A/43% B/7% C in 25 min (lineargradient), and then to 50% A/50% C in 10 min (linear gradient).Before the next analysis, the column was equilibrated with the initialmobile phase concentration for 20 min. Galactomannan-derived andmannan-derived oligosaccharides (degree of polymerization (DP)from 2 to 6) from Megazyme (Wicklow, Ireland) were used asstandards.

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of FlightMass Spectrometry (MALDI-TOF-MS). MALDI- TOF analyseswere performed using an Ultraflex workstation (Bruker Daltonics)equipped with a 337 nm nitrogen laser. Measurements were performedin the positive mode. After a delayed extraction time of 150 ns, ionswere accelerated with a 25 kV voltage. Data were collected from 100laser shots using the lowest energy necessary to obtain sufficientspectral intensity. The mass spectrometer was calibrated with amixture of galactomannan-derived and mannan-derived oligosacchar-ides (DP = 2−6) from Megazyme.



For sample preparation, 1 μL of sample solution (1 mg/mL) wasmixed with 1 μL of matrix (10 mg/mL 2,5-dihydroxybenzoic acid fromBruker Daltonics, Bremen, Germany) in 30% acetonitrile (v/v),directly applied on the MS target plate, and dried under a stream ofwarm air.

RESULTS AND DISCUSSIONAutohydrolysis of P. pinaster wood. P. pinaster wood

contains water-soluble extractives, which are transferred to theliquid phase along the autohydrolysis process. As this type ofextractable material hinders the subsequent POH purificationand fractionation, wood was first subjected to an aqueousextraction under mild conditions to leave hemicellulosesunaltered in the solid phase, and the resulting solids wereemployed as a substrate for autohydrolysis (performed underconditions leading to hemicellulose solubilization). Accordingto the literature,9 aqueous extraction was carried out innonisothermal mode up to 130 °C, whereas autohydrolysis wasperformed at 175 °C for 26 min (conditions that allowed a highyield of POHs with minimal generation of sugars and sugar-degradation compounds such as furfural and hydroxymethyl-furfural). The reaction liquors contained water, volatilecompounds (VCs) generated from the feedstock (mainly aceticacid), and NVCs, including POHs, sugars, and nonsaccharidecompounds. Table 1 shows the composition of autohydrolysis

liquors: POHs accounted for 0.776 g/g of NVCs, whereasmonosaccharides accounted for 0.180 g/g of NVCs. POHsincluded compounds made up of glucosyl units, xylosyl units,galactosyl units, arabinosyl units, and mannosyl units, withuronic acid and acetyl group substituents (see footnote a ofTable 1 for nomenclature). On the other hand, the limitedconcentrations of monosaccharides and the high conversion ofhemicelluloses into POHs (89.6%) confirmed the suitability ofthe autohydrolysis conditions for the purposes of this study.

The fraction denoted as ONVCs (other nonvolatile com-pounds; mass fraction 0.044 g/g of NVCs) accounted forundesired, nonsaccharide compounds.

Membrane Processing of Autohydrolysis Liquors.Membranes are potentially suitable for POH refining, operatingin ultra- and/or nanofiltration. Components with a molecularsize larger than that of the membrane pore can be separatedfrom other components that can permeate the membrane,enabling the fractionation of components. The application ofmembrane technology for processing autohydrolysis liquorsfrom a number of raw materials has been considered in theliterature.11,19

Figure 1 shows the processing scheme followed in this work,which was carried out with a dead-end filtration deviceoperating in ultra- and nanofiltration in discontinuousdiafiltration with reduction of volume (DDRV). Using thisapproach (also named “intermittent feed diafiltration”), thesample is first concentrated to a predetermined volume andthen diluted back to its original volume with water. Finally, apostconcentration step is applied to achieve the final volume.The first DDRV was carried out using a membrane with a 5

kDa cutoff and intended the removal of sugars and lowmolecular mass ONVCs, which are unwanted for prebioticapplications. The degree of concentration achieved in eachstage was measured in terms of the volume concentration ratio(VCR), defined as

= =−

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

⎛⎝⎜⎜

⎞⎠⎟⎟

VV

VV V

VCR f

r

f

f p

where Vf is the volume of the feed, Vr is the volume of theretentate, and Vp is the volume of the permeate. The firstDDRV included two stages, which were performed to achieveVCR = 9. The retentate, containing POHs of higher DP, wasfreeze-dried (to yield concentrate P1), whereas the permeateswere mixed and processed in a second DDVR step (performedwith the 1 kDa membrane) to remove low molecular mass,undesired compounds (particularly sugars). The second DDRVagain included two stages, which were performed to reachVCRs of 9 and 7.65, respectively. The retained solution wasfreeze-dried to yield concentrate P2, which is expected to havea composition closely related to that of P1, except for the lowerDP distribution.

First Discontinuous Diafiltration with Reduction Volume.The autohydrolysis liquors (stream A) (Figure 1) weresubjected to ultrafiltration in concentration mode through a 5kDa membrane to yield the retentante C, which was dilutedwith water and concentrated again under the same conditions.The resulting permeates (streams B and D) (Figure 1) weremixed to yield the stream denoted B + C, whereas concentrateE (which yielded P1 after freeze-drying) presented thecomposition listed in Table 1.In comparison with stream A, stream E was almost free from

monosaccharides (with about 99% removal), whereas therecoveries of POH components (denoted as shown in footnotea of Table 1) were 26.1% for GlPOHs, 5.06% for XyPOHs,18.2% for GaPOHs, 6.7% for ArPOHs, 27.8% for MaPOHs,23.6% for AcPOHs, and 7.81% for UAPOHs. Overall, therecovery of the target compounds in stream E was 21.7% of theamount present in stream A, yielding concentrate P1 of highpurity (with 0.97 g of target compounds/g of NVCs).

Second Discontinuous Diafiltration with ReductionVolume. The second DDRV involved the processing of the B

Table 1. Composition of Streams A, E, and H in Figure 1a

component concn (kg of component/kg of NVCs)

component stream A stream E stream H

glucose 0.006 0.000 0.002xylose 0.064 0.002 0.003galactose 0.026 0.001 0.002arabinose 0.070 0.004 0.006mannose 0.014 0.000 0.001acetic acid 0.012 0.001 0.001GlPOHs (as glucose) 0.092 0.137 0.135XyPOHs (as xylose) 0.113 0.033 0.100GaPOHs (as galactose) 0.103 0.107 0.145ArPOHs (as arabinose) 0.007 0.003 0.005MaPOHs (as mannose) 0.376 0.600 0.560AcPOHs (as acetic acid) 0.055 0.075 0.075UAPOHs (as galacturonic acid) 0.030 0.013 0.023ONVCs (by difference) 0.044 0.026 0.000

aNomenclature: AcPOHs, acetyl group substituents in hemicellulose-derived products; ArPOHs, arabinosyl units in hemicellulose-derivedproducts; GaPOHs, galactosyl units in hemicellulose-derived products;GlPOHs, glucosyl units in hemicellulose-derived products; MaPOHs,mannosyl units in hemicellulose-derived products; UAPOHs, uronicacid groups in hemicellulose-derived products; XyPOHs, xylosyl unitsin hemicellulose-derived products. Volumetric concentrations ofNVCs in streams A, E, and H were 23.7, 39.0, and 29.7 g/L,respectively.



+ D stream with the 1 kDa cutoff membrane (Figure 1),following the same sequence concentration−diafiltrationdescribed in the previous section. With respect to stream A,the mixed B + D stream contained 89.5% of the totalmonosaccharides, 64.9% of GlPOHs, 100% of XyPOHs, 83.1%of GaPOHs, 88.0% of ArPOHs, 74.1% of MaPOHs, 65.1% ofAcPOHs, and 87.2% of UAPOHs, whereas the recovery ofONVCs was close to 100%. Overall, the percentage of targetcompounds recovered in streams B + D (including GlPOHs,XyPOHs, GaPOHs, ArPOHs, MaPOHs, AcPOHs, andUAPOHs) accounted for 77.6% of the amount present instream A. The second DDVR yielded retentate H andpermeates G and I. Concentrate P2 was obtained by freeze-drying stream H.The composition of stream H (Table 1) enabled the

calculation of the following recoveries with respect to stream A:2.1% for total monosaccharides, 40.8% for GlPOHs, 24.6% forXyPOHs, 39.1% for GaPOHs, 19.1% for ArPOHs, 41.2% forMaPOHs, 37.8% for AcPOHs, and 21.8% for UAPOHs. Theoverall recovery of target compounds (including GlPOHs,XyPOHs, GaPOHs, ArPOHs, MaPOHs, AcPOHs, andUAPOHs) in stream H accounted for 37.3% of the amount

present in stream A, yielding concentrate P2 of high purity,with nearly 1 g of target compounds/g of NVCs.The above results confirm that the scheme depicted in Figure

1 allowed the manufacture of refined products of high purities(which compare favorably with the reported purities forcommercial oligosaccharides3) at high yield: if the two fractionsP1 and P2 were combined, 59% of the target compoundspresent in stream A were recovered, whereas the rest (togetherwith monosaccharides and nonsaccharide compounds) appearin the waste stream G + I. This latter solution could besubjected to further processing to recover other products (suchas monosaccharides and/or extractive-derived compounds).

Chemical Characterization of POHs. The elucidation of thestructural features of soluble saccharides is essential tounderstand their biological properties (including the potentialprebiotic effect).20 In this work, the type and relativeproportions of structural units and substituents making partof the POHs are shown in Table 1. Looking for additionalinformation on the molar mass distribution and structuralfeatures of POH, additional experimental work was carried outusing HPSEC, HPAEC-PAD, and MALDI-TOF-MS.

Figure 2. Elution profiles of streams A, P1, and P2: (A) HPSEC, (B) HPAEC-PAD.



Figure 2A shows the HPSEC chromatograms determined forstreams A, P1, and P2. Although the elution profiles arecomplex (owing to the multiple saccharides in solution, whichinclude backbones made up of hexoses or pentoses withdifferent substitution patterns), the elution profiles showed therefining effects caused by the membrane processing. Forexample, the removal of monosaccharides and nonsaccharidecompounds from stream A can be observed in the profilesdetermined for P1 and P2 through the different sizes of peakseluted after 29 min and in the range of 17−20 min, respectively.On the other hand, the effects of the fractionation by the 5 and1 kDa membranes can be seen from the fairly symmetricalelution chromatograms determined for the retentates, with ahigher average DP for P1 than for P2.HPAEC-PAD analysis of the samples (Figure 2B) showed

the presence of linear oligosaccharides (up to DP 5) and somecomplex substituted oligomers. Again, the differences amongthe chromatograms obtained for the raw liquor and for purifiedproducts confirmed the refining effects caused by membraneprocessing, as well as the different DP distributions of P1 andP2. It can be noted that no conclusions on acetylation can bedrawn from HPAEC-PAD data, as the samples are saponifiedby the alkaline mobile phase.A deeper insight into the structure of POHs with medium to

high DP was obtained from MALDI-TOF-MS data. Althoughcompounds with m/z below 600 could not be analyzed (due tointerference with matrix peaks), it can be noted that thepresence of these compounds was already confirmed byHPAEC. The MALDI-TOF-MS spectra of the sodium adductsdetermined for concentrate P1 confirmed the presence of awide range of POH components. The data of Table 1 suggestthat hexoses correspond mainly to mannose. POH componentsmade up of hexoses, mainly from GM or GGM breakdown,were substituted with one or more acetyl groups, giving a seriesof neutral (acetylated) oligomers [HnAcm] with DP in the rangeof 3−14. The most complex POH components were a DP = 13saccharide bearing five acetyl groups and a DP = 14 saccharidebearing four acetyl groups. Other POH components are madeup of pentoses, and (according to the compositional data inTable 1 and literature information) they come fromheteroxylan (with a backbone made up of xylose units).POHs derived from xylan included a homologous series ofcompounds with DP = 5−7 and an O-methylglucuronylatedDP = 3 oligomer. The general findings from the MALDI-TOFdata are in agreement with reported data.7

Assessment of the Prebiotic Potential of POHConcentrates P1 and P2. In the past few decades, increasing

interest has been paid to the prebiotic effect of variousnondigestible oligosaccharides, including xylooligosacchar-ides,11 pectooligosaccharides,17 and mannooligosaccharides.7

In several cases, the studies were based on in vitrofermentations with animal or human fecal inocula. However,scarce data have been reported on the in vitro fermentation ofsoluble saccharides derived from GMs or GGMs using humanfecal bacteria. Albrecht et al.20 studied the influence ofstructural characteristics of konjac glucomannan oligosacchar-ides on their in vitro fermentability by human gut microbiota.Previously, Matsuura et al.21 found that konjac glucomannanwas almost completely degraded by the simultaneous action ofenzymes and intestinal anaerobic bacteria present in humanfeces, producing formic acid, acetic acid, propionic acid, and 1-butyric acid. The fermentation of soluble saccharides derivedfrom pine wood hemicelluloses has been consideredrecently.14,15 In this work, concentrates P1 and P2 (containingPOHs derived from GGMs, GMs, and xylan) were tested forprebiotic potential by in vitro fermentation. On the basis of thepredominance of mannan-derived saccharides, the contributionof xylan-derived saccharides to the prebiotic properties ofconcentrates P1 and P2 is considered of minor importance.Experiments were performed using human inocula from

three healthy donors according to the methods reported in theliterature. For comparative purposes, additional results weredetermined for media containing for fructooligosaccharides(FOS) (selective control, selected as model NDOs due to theirwell-established prebiotic properties22) and for media without acarbon source (negative control).The prebiotic potential of POHs was studied on the basis of

the substrate assimilation, SCFA and lactate accumulation, pHshifts, and evolution of the bifidobacterial population alongfermentation experiments.

Consumption of POHs in Fecal Cultures. The dataconcerning the consumption of P1 and P2 along fermentationsare listed in Table 2. Both concentrates were extensivelymetabolized by the bacteria present in the intestinal microbiota,but differences in the degradation pattern between individualswere observed. The dynamics of POH consumption along theincubation time was in good agreement with the SCFAconcentration profiles. During the first 7 h of incubation,saccharides consisting of XyPOHs and GaPOHs werepreferentially consumed by cultures from the three donors,although the degrees of consumption were different: about 80%of the cited POH components were assimilated in experimentsfrom donors 2 and 3, whereas slightly lower results wereachieved in media from donor 1. The consumption of glucosyl

Table 2. Degree of Consumption (%) of POHs along in Vitro Fermentations Using Fecal Inocula from Three Human Donorsa

donor 1 donor 2 donor 3

time (h) GlPOHs XyPOHs GaPOHs MaPOHs GlPOHs XyPOHs GaPOHs MaPOHs GlPOHs XyPOHs GaPOHs MaPOHs

Degree of Consumption of Fraction P17 17.5 62.8 59.8 24.7 36.9 87.2 76.5 36.4 37.4 83.2 88.3 27.011 55.6 70.3 76.0 79.2 67.2 93.7 81.2 78.8 81.0 85.9 92.8 77.829 87.8 79.3 86.5 94.3 100.0 100.0 89.5 100.0 100.0 100.0 100.0 100.045 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

Degree of Consumption of Fraction P27 19.9 77.8 73.5 17.6 22.0 76.4 82.8 11.7 23.0 79.6 69.8 7.611 47.2 83.6 85.0 73.6 82.0 93.0 93.4 87.2 84.4 89.8 92.2 78.629 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.045 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

aNomenclature as in Table 1.



Table

3.Con

centration

s(m

M)of

theThree

Major

SCFA

sandLactateandpH

Valuesof

FecalCulturesa

donor1

donor2

donor3

carbon

source

time(h)

pHL

AP

BSC

FAs

pHL

AP

BSC

FAs

pHL

AP

BSC

FAs

control

06.8

0.0

0.0

0.1

0.0

0.1

7.7

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

6.8

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

46.8

0.1

0.0

2.3

0.4

2.7

7.7

0.0

2.8

0.8

0.3

3.9

6.8

0.0

0.0

0.5

0.0

0.5

76.7

0.0

5.4

2.5

1.4

9.3

7.5

0.0

7.7

1.7

1.3

10.7

6.7

0.0

0.2

0.5

1.1

1.8

116.7

0.0

12.2

1.8

3.4

17.3

6.5

0.0

17.3

3.9

4.0

25.2

6.7

0.0

9.7

0.0

2.9

12.7

216.8

0.0

18.8

3.5

4.8

27.2

6.8

0.0

27.0

5.9

4.9

37.8

6.6

0.0

13.7

0.6

4.7

18.9

296.7

0.0

22.4

3.8

5.9

32.2

6.5

0.0

31.1

8.7

5.0

44.8

6.7

0.0

13.9

1.2

5.5

20.6

456.6

0.0

32.5

4.3

6.6

43.5

6.5

0.0

34.0

8.0

5.6

47.7

6.6

0.0

21.9

1.5

5.2

28.6

P10

6.8

0.0

0.0

0.1

0.0

0.1

7.7

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

6.8

0.0

0.2

0.0

0.0

0.0

46.6

0.4

4.8

0.5

0.6

5.9

7.3

0.6

12.0

3.5

0.0

15.5

6.5

0.0

9.0

2.7

0.0

11.8

76.2

0.1

23.4

1.4

3.6

28.4

6.0

0.0

31.6

10.0

4.1

45.7

6.3

0.7

33.7

8.8

3.9

46.5

115.2

3.1

45.8

2.1

11.2

59.1

5.2

0.3

56.2

19.2

10.9

86.4

5.1

0.0

61.3

19.3

10.8

91.4

214.8

3.6

51.8

4.2

19.3

75.3

4.7

0.0

66.5

22.9

16.6

106.1

4.9

0.3

63.0

21.2

14.8

99.0

294.8

0.0

57.1

7.3

25.5

89.9

4.7

0.0

68.9

23.4

17.9

110.2

4.9

0.0

62.7

19.0

14.2

95.9

454.8

0.0

59.2

10.9

28.6

98.8

4.7

0.0

69.4

23.2

18.3

111.0

4.8

0.0

73.2

21.7

17.0

111.9

P20

6.8

0.0

0.0

0.1

0.0

0.1

7.7

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

6.8

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

46.6

0.4

0.0

0.2

0.0

0.2

7.2

2.1

11.9

0.7

1.2

13.8

6.4

3.6

13.5

1.0

1.1

15.6

76.1

0.6

25.3

1.8

3.7

30.8

6.0

0.3

33.3

3.4

4.4

41.1

6.2

3.2

31.1

2.6

3.5

37.2

115.4

1.0

50.0

3.5

12.0

65.5

5.2

0.0

59.7

9.9

13.0

82.6

5.1

0.0

63.7

8.3

16.0

87.9

215.0

0.0

59.8

6.2

18.5

84.6

4.8

0.0

67.2

13.7

18.3

99.3

5.0

0.0

64.2

9.5

18.1

91.7

295.0

0.0

59.7

8.0

18.4

86.2

4.6

0.0

61.3

13.0

18.1

92.4

5.0

0.0

65.7

9.9

18.7

94.3

455.0

0.0

64.4

11.5

20.1

95.9

4.7

0.0

72.1

15.7

22.7

110.4

5.0

0.0

75.8

10.5

21.1

107.3

FOS

06.8

0.0

0.0

0.1

0.0

0.1

7.7

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

6.8

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

46.8

1.0

3.7

0.7

0.6

5.0

7.7

1.0

8.2

2.8

0.0

10.9

6.8

1.6

11.1

0.7

1.2

13.0

76.6

8.7

22.1

1.6

6.4

30.0

7.3

6.1

30.2

6.8

5.0

41.9

6.5

7.8

42.5

2.8

5.5

50.9

116.0

25.9

33.5

2.4

17.2

53.1

5.6

8.4

43.8

10.3

12.7

66.8

5.8

7.8

65.8

3.9

16.8

86.5

214.8

21.6

30.2

1.2

17.9

49.3

4.6

0.0

62.7

12.8

23.1

98.6

5.0

0.0

60.3

4.4

26.2

90.9

294.8

0.0

29.9

3.3

20.9

54.1

4.6

0.0

62.7

14.1

22.9

99.7

5.0

0.0

62.6

4.2

24.7

91.6

454.9

0.0

30.6

7.3

29.0

66.9

4.6

0.0

54.4

11.6

23.0

89.0

5.2

0.0

65.0

4.8

27.4

97.2

aDataobtained

formedia

containing

concentrates

(P1or

P2)or

FOSas

thecarbon

source.Nom

enclature:

L,lactate;

A,acetate;

P,propionate;B,butyrate.Valuesareexpressedas

themeanof

independentduplicateassays.



and mannosyl units in POHs occurred principally in the periodfrom 7 to 11 h for experiments from donors 1 and 3 using P1 asthe carbon source, whereas in the fermentation using P2 as thesubstrate, the cultures from donors 2 and 3 resulted in thehighest consumption of POHs made up of glucosyl andmannosyl units. In the fermentation using P1 as the carbonsource and inocula from donor 2, consumption of glucosyl andmannosyl POHs took place mainly in the first 11 h. For donor1 and fraction P2, a preferential assimilation of mannosyl unitsoccurred in the period from 7 to 11 h. From the experimentaldata, it can be concluded that the major utilization of POHcomponents took place during the first 11 h of incubation,causing a correspondent increase in the production of SCFAs(see below). Total consumption of the substrate was observedafter 29 h of fermentation, except in the experiment using P1 asthe carbon source and inocula from donors 1 and 2 (whichneeded 45 h to reach complete and incomplete substrateconversion, respectively). The experimental data did not showsignificant effects associated with the differences in molecularmass distribution between P1 and P2, as the expected influenceon the assimilation kinetics was overcome by individualdifferences among donors and by the experimental error.SCFA and Lactate Production in Fecal Cultures. Table 3

shows the concentrations of SCFAs and lactate alongfermentations and the pH shifts resulting from the generationof acids. The type of metabolic products confirmed that POHswere metabolized by the various species present in the fecalmicrobiota.23

Both increases in SCFA concentration and pH drops alongincubation were considerably more pronounced in samplescontaining carbohydrates than in negative control cultures. Itcan be noted that SCFA generation in cultures lacking a carbonsource is due to degradation of protein by putrefactive bacteriapresent in the intestinal microbiota. Consequently, low SCFAgeneration in blanks is expected.24

Two stages can be distinguished in POH fermentations: inthe first one (lasting about 11 h), pH dropped significantly dueto the growth and/or metabolic activity of intestinal bacteriaand then remained fairly constant to the end of the experiments(see Table 3).In agreement with literature reports,11 the SCFA concen-

tration profiles were markedly different in either experimentusing the same carbon source and inocula from differentindividuals or in cultures with different carbon sourcesinoculated with samples from the same donor (see Table 3).After 45 h of fermentation, the total SCFA concentrations incultures from the three donors were similar in media made upof either P1 or P2, achieving concentrations higher than thosedetermined in media containing FOS. At the same fermentationtime, the concentrations of total SCFAs achieved in mediacontaining P1 or P2 were higher in cultures inoculated withinocula from donors 2 and 3 than from donor 1.Lactic acid, a typical metabolic product of bifidobacteria and

lactic bacteria, was more abundant in cultures from individual 1using P1 and FOS as carbon sources, whereas in experimentsmade with P2, the highest lactic acid production correspondedto cultures with inocula from individuals 2 and 3. In all cases,lactic acid reached low concentrations at the beginning of thefermentations and disappeared rapidly.Acetic acid was the major SCFA found in media from all

individuals with all substrates. The highest acetate concen-trations were achieved in media containing P2 as the carbonsource, followed by the media made with P1 and FOS. Among

donors, donor 3 achieved the highest acetate concentration forall substrates, followed by donor 2 and donor 1. Increasedacetic acid production was directly related to increasedbifidobacteria counts. The predominant formation of aceticacid is in agreement with the results reported by Bruck et al.25

for the fecal fermentation of beet fiber. The acetogenicpotential of commercial xylooligosaccharides has been con-firmed by Smiricky-Tjardes et al.26 using in vitro fermentationswith pig feces and in vivo experiments with rats. Acetate largelybypasses colonic and liver metabolism and is metabolized byperipheral tissues.27

Butyrate was produced at a higher concentration thanpropionate in experiments with samples from all donors andthe two types of substrates (see Table 3). Butyrate is the mainsource of energy for colonocytes, and its increased productionby gut bacteria has been linked to a reduced incidence of coloncancer.28 Propionate is utilized primarily by the liver, and itsrole as a potential modulator of cholesterol synthesis has beenproposed.27 Enhanced generation of acids in intestinalfermentation might be desirable because acidic environmentscan inhibit the growth of potentially pathogenic micro-organisms and putrefactive bacteria.22

Dynamics of the Bifidobacterium Population. FISH wasused for evaluating the bifidogenic effect of the purified POHconcentrates. As a reference for comparison, culturescontaining FOS as the carbon source and blanks were alsoanalyzed (Figure 3). As expected, the increases in bifidobacteriacounts were higher for media containing POH concentratesand FOS than in negative controls, confirming the suitability ofthese substrates as carbon sources for the metabolism ofbifidobacteria. The increase in growth depended on the carbonsource, even though important differences among donors werealso noticed. After 11 h of incubation, the increases inbifidobacteria counts determined for media contaning P1 or P2were slightly less pronounced than those observed in culturescontaining FOS. However, the bifidobacterial populationincreased after 29 h for the various donors and substratesranked as follows: for donors 1 and 2, P2 > FOS > P1, and fordonor 3, P1 > FOS > P2. In overall terms, it can be seen thatthe POH fractions obtained in this work caused stimulatoryeffects in the bifidobacterial population which were similar tothose obtained with commercial FOS. Furthermore, theincrease observed was greater than 1 log-fold (Figure 3),revealing modifications in the intestinal microbiota.29 Theexperimental results achieved in this work are in agreementwith literature reported for other NDOs. Faber et al.14

investigated the prebiotic characteristics of molasses composedof mannoligosaccharides, xylooligosaccharides, and glucooligo-saccharides using a canine fecal inoculum and concluded thatthese substrates were able to modify the Bifidobacteriumpopulation compared to a proven prebiotic such as FOS.Yoon et al.30 reported on the effects of partially hydrolyzedgalactomannan (guar gum) on the fecal microbiota of ninehealthy human volunteers administered at a dose of 7 g ofproduct/volunteer/day for 14 days and concluded that both theBifidobacterium spp. counts and percentage of these specieswith respect to the total counts increased significantly after theadministration period.In summary, autohydrolysis of P. pinaster wood under the

conditions employed in this work resulted in extensivehemicellulose solubilization, leading to a liquor containinghemicellulose-derived saccharides. The process depicted inFigure 1 enabled the selective removal of monosaccharides and



nonsaccharide compounds, leading to concentrates (P1 andP2) of high purity and different molar mass distributions. Invitro fermentation experiments confirmed the ability of P1 andP2 to support the growth of bifidobacteria. The prebioticpotential of both concentrates was confirmed by the productionof SCFAs and lactate in the fermentation media, as well as bytheir bifidogenic capacity.

AUTHOR INFORMATIONCorresponding Author*Phone: +34988387033. Fax.: +34988387001. E-mail:[email protected] are grateful to the Spanish Ministry of Science andInnovation for supporting this study in the framework of the

research project “Properties of new prebiotic food ingredientsderived from hemicelluloses” (reference AGL2008-02072),which was partially funded by the FEDER program of theEuropean Union. S.R. thanks the Spanish Ministry of Scienceand Innovation for her “Formacion del Personal Investigador”(FPI) research grant.

NotesThe authors declare no competing financial interest.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Dr. Marıa Jesus Gonzalez-Munoz for her advice andsupport in membrane processing.

ABBREVIATIONS

DDRV, discontinuous diafiltration with reduction of volume;DP, degree of polymerization; FISH, fluorescence in situhybridization; HPAEC-PAD, high-performance anionic ex-change chromatography with pulsed amperometric detection;HPLC-RI, high-performance liquid chromatography withrefraction index detection; HPSEC, high-performance sizeexclusion chromatography; MALDI-TOF-MS, matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry;VCR, volume concentration ratio

REFERENCES(1) ISAPP 6th Meeting of the International Scientific Association ofProbiotics and Prebiotics, London, Ontario, Nov 9−11, 2008. http://www.isapp.net/docs/2008_Meeting_Report.pdf (accessed March 28,2012).(2) Ebringerova, A.; Hromadkova, Z.; Heinze, T. Hemicellulose. Adv.Polym. Sci. 2005, 186, 1−67.(3) Kenne, L.; Rosell, K. G.; Svensson, S. Studies on the distributionof the O-acetyl groups in pine glucomannan. Carbohydr. Res. 1975, 44,69−76.(4) Bishop, C. T.; Cooper, F. P. Constitution of a glucomannan fromjack pine. Can. J. Chem. 1960, 38, 793−804.(5) Gyaw, M. O.; Timell, T. E. Constitution of a glucomannan fromthe wood of eastern white pine. Can. J. Chem. 1960, 38, 1957−1966.(6) Meier, H. Characterisation of an acetylated glucomannan frompine (Pinus sylvestris L.). Acta Chem. Scand. 1961, 15, 1381−1385.(7) Price, N. P. J; Hartman, T. M.; Faber, T. A.; Vermillion, K. E.;Fahey, G. C. Galactoglucomannan oligosaccharides (GGMO) from amolasses byproduct of pine (Pinus taeda) fiberboard production. J.Agric. Food Chem. 2011, 59, 1854−1861.(8) Yoon, S.-H.; Macewan, K.; Van Heiningen, A. Hot-water pre-extraction from loblolly pine (Pinus taeda) in an integrated forestproducts biorefinery. Tappi J. 2008, 7 (6), 27−32.(9) Gonzalez-Munoz, M. J.; Alvarez, R.; Santos, V.; Parajo, J. C.Production of hemicellulosic sugars from Pinus pinaster wood bysequential steps of aqueous extraction and acid hydrolysis. Wood Sci.Technol. 2012, 46, 271−285.(10) Gullon, P.; Romaní, A.; Vila, C.; Garrote, G.; Parajo, J. C.Potential of hydrothermal treatments in lignocellulose biorefineries.Biofuels, Bioprod. Bioref. 2012, 6, 219−232.(11) Gullon, P.; Salazar, N.; Gonzalez-Munoz, M. J.; Gueimonde, M.;Ru as-Madiedo, P.; de los Reyes-Gavilan, C. G.; Parajo , J. C.Assessment on the fermentability of xylooligosaccharides from ricehusks. BioResources 2011, 6 (3), 3096−3114.(12) Vegas, R.; Moure, A.; Domínguez, H.; Parajo, J. C.; Alvarez, J.R.; Luque, S. Evaluation of ultra- and nanofiltration for refining solubleproducts from rice husk xylan. Bioresour. Technol. 2008, 99, 5341−5351.(13) Hopkins, A. C.; Thomas, A. L.; Matthew, W. L.; Xuerong, W.;Wilton, H. K. Prebiotic composition and methods of making and usingthe same. U.S. Patent Application No. 20090304852, 2009.

Figure 3. Increase (with respect to time 0 h) of Bifidobacterium countsdetermined by FISH in fecal cultures from three donors using P1, P2,or FOS as the carbon source. Controls did not contain addedcarbohydrates. Initial Bifidobacterium counts: 7.72 ± 0.13 log cells/mLfor donor 1, 7.45 ± 0.11 log cells/mL for donor 2, and 7.44 ± 0.09 logcells/mL for donor 3. Error bars indicate standard deviations.



mailto:[email protected]

http://www.isapp.net/docs/2008_Meeting_Report.pdf

http://www.isapp.net/docs/2008_Meeting_Report.pdf

(14) Faber, T. A.; Hopkins, A. C.; Middelbos, I. S.; Price, N. P.;Fahey, G. C., Jr. Galactoglucomannan oligosaccharide supplementa-tion affects nutrient digestibility, fermentation end-product produc-tion, and large bowel microbiota of the dog. J. Anim. Sci. 2011a, 89 (1),103−112.(15) Faber, T. A.; Bauer, L. L.; Price, N. P.; Hopkins, A. C.; Fahey, G.C., Jr. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulosemolasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulosefractions using canine fecal inoculum. J. Agric. Food Chem. 2011, 59(5), 1847−1853.(16) Gullon, B.; Gullon, P.; Sanz, Y.; Alonso, J. L.; Parajo, J. C.Prebiotic potential of a refined product containing pectic oligosac-charides. Food Sci. Technol. (London) 2011, 44 (8), 1687−1696.(17) Jaskari, J.; Kontula, P.; Siitonen, A.; Jousimies-Somer, H.;Mattila-Sandholm, T.; Poutanen, K. Oat-glucan and xylan hydrolysatesas selective substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains.Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 49, 175−181.(18) Blumenkrantz, N.; Asboe-Hansen, G. New method forquantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem. 1973, 54,484−489.(19) Vegas, R.; Alonso, J. L.; Domínguez, H.; Parajo, J. C.Manufacture and refining of oligosaccharides from industrial solidwastes. Ind. Eng. Chem. Res. 2005, 44, 614−620.(20) Albrecht, S.; Van Muiswinkel, G. C. J.; Schols, H. A.; Voragen,A. G. J.; Gruppen, H. Introducing capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (CE-LIF) for the characterization ofkonjac glucomannan oligosaccharides and their in vitro fermentationbehavior. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3867−3876.(21) Matsuura, Y. Degradation of konjac glucomannan by enzymes inhuman feces and formation of short-chain fatty acids by intestinalanaerobic bacteria. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1998, 44, 423−436.(22) Rossi, M.; Corradini, C.; Amaretti, A.; Nicolini, M.; Pompei, A.;Zanoni, S. Fermentation of fructooligosaccharides and inulin bybifidobacteria: a comparative study of pure faecal cultures. Appl.Environ. Microbiol. 2005, 71, 6150−6158.(23) Rycroft, C. E.; Jones, M. R.; Gibson, G. R.; Rastall, R. A. Acomparative in vitro evaluation of the fermentation properties ofprebiotic oligosaccharides. J. Appl. Microbiol. 2001, 91, 878−887.(24) Hartemink, R.; Schoustra, S. E.; Rombouts, F. M. Degradationof guar gum by intestinal bacteria. Biosci. Microflora 1999, 18, 17−25.(25) Bruck, W. M.; Graverholt, G.; Gibson, G. R. A two-stagecontinuous culture system to study the effect of supplemental alpha-lactalbumin and glycomacropeptide on mixed cultures of human gutbacteria challenged with enteropathogenic Escherichia coli andSalmonella serotype Typhimurium. J. Appl. Microbiol. 2003, 95, 44−53.(26) Smiricky-Tjardes, M. R.; Flickinger, E. A.; Grieshop, C. M.;Bauer, L. L.; Murphy, M. R.; Fahey, G. C. In vitro fermentationcharacteristics of selected oligosaccharides by swine fecal microflora. J.Anim. Sci. 2003, 81, 2505−2514.(27) Bourquin, L. D.; Titgemeyer, E. C.; Garleb, K. A.; George, C.;Fahey, J. R. Short-chain fatty acid production and fiber degradation byhuman colonic bacteria: effects of substrate and cell wall fractionationprocedures. J. Nutr. 1992, 122, 1508−1520.(28) Connolly, M. L.; Lovegrove, J. A.; Tuohy, K. M. Konjacglucomannan hydrolysate beneficially modulates bacterial compositionand activity within the faecal microbiota. J. Funct. Foods 2010, 2 (3),219−224.(29) Roberfroid, M. Prebiotics: the concept revisited. J. Nutr. 2007,137, 830−837.(30) Yoon, S.-J.; Chu, D.-C.; Juneja, L. R. Physiological functions ofpartially hydrolyzed guar gum. J. Clin. Biochem. Nutr. 2006, 39 (3),134−144.



ANEXO II: Procedimiento para la obtención de

sacáridos bifidogénicos a partir de las

hemicelulosas de madera de Pinus pinaster

ANEXO III: Characterization, refining and

antioxidant activity of saccharides derived from

hemicelluloses of Wood and rice husks

Food Chemistry 141 (2013) 495–502

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Food Chemistry

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Characterization, refining and antioxidant activity of saccharides derivedfrom hemicelluloses of wood and rice husks

0308-8146/$ - see front matter 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.03.008

⇑ Corresponding author. Tel.: +34 988368892; fax: +34 988387001.E-mail address: [email protected] (A. Moure).

Sandra Rivas, Enma Conde, Andrés Moure ⇑, Herminia Domínguez, Juan Carlos ParajóChemical Engineering Department, Polytechnical Building, University of Vigo (Campus Ourense), As Lagoas, 32004 Ourense, SpainCITI-Tecnopole San Ciprián de Viñas, 32901 Ourense, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history:Received 29 October 2012Received in revised form 28 February 2013Accepted 2 March 2013Available online 15 March 2013

Keywords:Antioxidant activityHemicellulosesOligosaccharidesRice husksWood

Samples of rice husks, Eucalyptus globulus wood and Pinus pinaster wood (containing arabinoxylan, acet-ylated glucuronoxylan and acetylated glucomannan as major hemicellulose components, respectively)were subjected to autohydrolysis. The resulting liquid phases, containing mainly hemicellulose-derivedsaccharides, were refined by physicochemical methods to reduce their contents of monosaccharidesand non-saccharide compounds. Raw autohydrolysis liquors and refined concentrates coming from aque-ous treatments were assayed for antioxidant activity using the following assays: reducing power (FRAP),DPPH and ABTS radical scavenging activity and protection of b-carotene-linoleic emulsions from oxida-tion. The reducing power and radical scavenging capacity of the non refined fractions were comparableto the ones determined for the reference compound butylhydroxytoluene. Hemicellulose concentratedfrom the different feedstocks and refining protocols showed a dose dependent antioxidant activity inthe range of concentrations evaluated. The in vitro antioxidant activity of concentrates correlated withtheir phenolic content.

2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

The interest in non-digestible oligosaccharides has increasedsince their prebiotic properties have been confirmed. Additionally,their multifunctional character, based on multiple biological activ-ities (including immunity enhancement, facilitation of mineralabsorption, antioxidant activity, antibiotic alternative, regulatorsof blood glucose in diabetics and serum lipids in hyperlipidemics)contribute to the interest of the field (Moure, Gullón, Domínguez, &Parajó, 2006; Patel & Goyal, 2011).

Heteroxylan (for example, arabinoxylan or glucuronoxylan withdifferent substitution patterns) is the predominant hemicellulosicpolymer in brans, hardwoods and common agricultural materials,whereas mannans (glucomannan and galactoglucomannan) arethe major hemicellulose components of softwoods (Ebringerová,Hromádková, & Heinze, 2005). Antioxidant activities (regardingthe ability for scavenging free radicals) have been reported forcell-wall polysaccharides (including xylan, 4-O-methyl-D-glucur-ono-D-xylan, galactomannan and galactoglucomannan) from avariety of sources (Ebringerová, Hromádková, Kostalova, & Sasink-ova, 2008; Ebringerová, Hromádková, Hribalova et al., 2008;Hromádková, Ebringerová, & Malovikova, 2006; Hromádková,Hirsch, & Ebringerová, 2010; Hromádková, Kostalova, & Ebringe-

rová, 2008; Melo-Silveira et al., 2012; Pristov, Mitrovic, & Spasoj-evic, 2011).

Hemicelluloses can be partially hydrolyzed and solubilized byaqueous processing in the presence of enzymes or acids. These lat-ter can be generated in situ or added externally, according to theautohydrolysis or prehydrolysis methods, respectively. Partialhydrolysis has been employed to produce soluble hemicellulose-derived oligosaccharides and low-molecular weight polymers fromhardwoods, softwoods, seeds and agricultural materials (Carvalhe-iro, Esteves, Parajó, Pereira, & Gírio, 2004; Garrote, Domínguez, &Parajó, 2002; González-Muñoz, Alvarez, Santos, & Parajó, 2012;Gullón, González-Muñoz, van Gool, et al., 2011; Gullón et al.,2010), and other raw materials, such as xylan (Katapodis & Chri-stakopoulos, 2005), wheat flour arabinoxylans (Katapodis et al.,2003), xylan isolated from guarana powder (Dalonso & Petkowicz,2012), and wheat bran (Yuan, Wang, & Yao, 2005; Yuan, Wang,Yao, & Chen, 2005).

Although the non-digestible oligosaccharides obtained by par-tial hydrolysis of hemicelluloses are known as potential prebiotics(Gullón, González-Muñoz, & Parajó, 2011; Gullón, Salazar, Gon-zález-Muñoz et al, 2011; Moure et al., 2006; Rivas, Gullón, Gullón,Alonso, & Parajó, 2012), limited information on their antioxidantactivity is available.

Xylooligosaccharides (XOS) containing sterified ferulic acid, ob-tained by enzymatic processing of wheat flour or wheat bran(Katapodis et al., 2003; Yuan, Wang, Yao, & Chen, 2005), showed

http://crossmark.dyndns.org/dialog/?doi=10.1016/j.foodchem.2013.03.008&domain=pdf

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.03.008


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ability for scavenging the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)radical, for inhibiting the copper-mediated oxidation of low den-sity lipoprotein (LDL), and to limit the erythrocyte hemolysis med-iated by peroxyl free radicals generated from 2,2’-azobis-2-amidinopropane dihydrochloride (AAPH). The same type of com-pounds was produced by hydrothermal processing of wheat bran,and their antioxidant activity was reported in terms of Troloxequivalents (Rose & Inglett, 2010a). Polysaccharides from rice, ragi,wheat and maize brans were processed with xylanases to yieldXOS, and assayed for antioxidant activity using the DPPH, b-caro-tene emulsion and ferric reducing anti-oxidant power (FRAP)methods (Veenashri & Muralikrishna, 2011). Enzymatic processingof plant material led to antioxidant xylo- and arabinoxylo-oligo-saccharides with intermediate degree of polymerization and par-tial substitution with hydroxycinnamic acids, which wereclaimed to find application in foods, beverages, and nutritionalsupplements (Broekaert, Courtin, & Delcour, 2009). Acidic xylooli-gosaccharides showed concentration-dependent iron-reducingactivity (Yoshino, Higashi, & Koga, 2007). To our knowledge, noinformation has been reported on the in vitro antioxidant activityof oligosaccharides derived from softwood mannan, even thoughrelated studies have been reported for the parent polymers gluco-mannan and galactoglucomannan (Ebringerová, Hromádková, Hri-balova et al., 2008).

This work provides an experimental assessment on the manu-facture, refining and antioxidant activity of three types of solublehemicellulosic saccharides (derived from rice husks, E. globuluswood and P. pinaster wood). The experimental data allowed a com-parative evaluation of their antioxidant activities, including reduc-ing power, ability to scavenge free radicals and protection fromoxidation in model emulsions. This information is of primaryimportance for the further development of commercial productscombining prebiotic and antioxidant properties.

2. Materials and methods

2.1. Raw materials

Pinus pinaster wood samples (kindly provided by Orember-Fin-sa, Ourense, Spain), and Eucalyptus globulus wood samples (kindlyprovided by ENCE, Pontevedra, Spain) were air-dried, milled in an40 kW mill (ATI, A Coruña, Spain) to pass a 8 mm screen, andhomogenised in a single lot. Rice husks were obtained from a localsupplier (Pontevedra, Spain).

2.2. Autohydrolysis conditions

Lignocellulosic materials were subjected to one or two process-ing stages in aqueous media in a stirred, stainless steel reactor(Parr Instrument Company, Illinois, USA). All treatments were per-formed using 8 g water/g oven dried substrate. Rice husks autohy-drolysis was carried out in a single step at 185 C for 20 min(Gullón et al., 2010); whereas E. globulus and P. pinaster woodswere preextracted under non-isothermal conditions until 130 Cto remove water soluble extractives (Gullón, González-Muñoz,van Gool et al., 2011; González-Muñoz, Santos, & Parajó, 2011),and then subjected to autohydrolysis (operating for 9 min at175 C in the case of E. globulus and for 26 min at 175 C in the caseof P. pinaster) to cause hemicellulose solubilization (González-Muñoz et al., 2012; Gullón, González-Muñoz, van Gool et al.,2011). At the end of treatments, the reactor was cooled by flowingwater through the refrigeration coil, and the liquor was recoveredby filtration, analysed and processed as described in the next sec-tions. For each substrate, liquid phases from 8 individual samples

were mixed to obtain the stock solutions employed inexperiments.

2.3. Processing of autohydrolysis liquors

2.3.1. Membrane processingAutohydrolysis liquors from the three raw materials considered

in this work were subjected to membrane processing for purifica-tion and concentration. Operation corresponded to consecutivestages of Discontinuos Diafiltration with Volume Reduction(DDVR), which were carried out under specific conditions for li-quors from the various raw materials. The liquid phase from ricehusks autohydrolysis was processed according to Gullón et al.(2010), under the following conditions: ceramic membrane,1 kDa molecular weight cut-off; transmembrane pressure, 8 bar;diavolumes in diafiltration, 4; overall retentate to feed volume ra-tio, 1/4. The liquid phase from the second E. globulus wood treat-ment was subjected to DDVR with the same membrane using 5.5diavolumes of water and an overall retentate to feed volume ratioof 1/5.5 (Gullón, González-Muñoz, van Gool et al., 2011). The liquidphase from the second P. pinaster wood treatment was subjected toDDVR using a method modified from Rivas et al. (2012): a regener-ated cellulose spiral membrane (molecular weight cut-off, 1 kDa)was operated at a transmembrane pressure of 4 bar using 4 diavo-lumes of water and an overall retentate to feed volume ratio of 1/4.

2.3.2. Enzymatic processingFor prebiotic applications, low molecular weight oligomers are

usually preferred (Vegas, Kabel, Schols, Alonso, & Parajó, 2008).Depending on the considered substrate, autohydrolysis may ormay not lead to this type of compounds, which are the targets ofthis study. In the case of E. globulus wood, the high acetyl groupcontent results in increased concentration of acetic acid in thereaction medium (and so, in increased concentration of hydroniumions, the catalytic species), leading to the formation of low molec-ular weight oligomers. Oppositely, autohydrolysis of P. pinasterwood and rice husks leads to the formation of higher saccharides.Because of this, enzymatic treatments (with mannanases andxylanases, respectively) have been performed to reduce the aver-age molecular weight of the saccharides to the desired level. Re-fined rice husks autohydrolysis liquors coming from membraneprocessing were subjected to enzymatic hydrolysis using a com-mercial xylanase concentrate (Pulpzyme, kindly provided by Novo-zymes-Spain, Madrid, Spain, containing 1714 xylanase units/mL),operating at 55 C and pH 7 for 48 h at an enzyme charge of 685xylanase units/kg liquor (Gullón et al., 2010). For the same pur-pose, refined saccharides from P. pinaster wood were treated witha commercial endo-1,4 b-mannanase from Aspergillus niger (sup-plied by Megazyme, Ireland, with an activity of 350 mannanaseunits/mL), operating under the following conditions: enzymecharge, 300 mannanase units /kg liquor, 40 C, pH 4.5.

2.3.3. Ion exchange processing of liquorsMembrane-refined, low molecular weight saccharides were

subjected to ion exchange using the anionic resin IRA-96. Basedon preliminary experiments (data not shown), the liquor to resinratios employed were 15, 10 and 25 kg liquor/kg resin for concen-trated samples from rice husks, E. globulus and P. pinaster,respectively.

2.4. Analytical methods

Samples of raw and processed liquors were filtered through0.45 lm cellulose acetate membranes, neutralised with bariumcarbonate and assayed by HPLC for glucose, xylose, mannose, gal-actose and arabinose using a 1100 series Hewlett Packard chro-

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matograph fitted with a refractive index detector operated at 50 C,and a 300 7.8 mm CARBOsep CHO 682 column (Transgenomic,Glasgow, UK) operating at 80 C. Distilled water was used as a mo-bile phase (flow rate: 0.4 mL/min). Acetic acid was determined byHPLC using a 300 7.8 mm Aminex HPX-87H column (BioRad,Hercules, CA) operated at 60 C (mobile phase, 0.003 M sulfuricacid; flow rate, 0.6 mL/min). Hemicellulose-derived saccharidesand acetyl groups were determined from the concentrations ofmonosaccharides and acetic acid present in liquors previously sub-jected to a quantitative posthydrolysis (performed with 4% sulphu-ric acid at 121 C for 20 min). Before analysis, posthydrolysissamples were neutralised with barium carbonate. Uronyl substitu-ents were assayed by the method of Blumenkrantz and Asboe-Han-sen (1973) using galacturonic acid as a standard for quantitation.All analyses were made in triplicate. The content of nonvolatilecompounds (NVC) in liquors was measured by oven-drying at105 C until constant weight.

2.4.1. High performance size exclusion chromatography (HPSEC)The molar mass distribution of saccharides in raw and purified

liquors was determined by HPSEC using two 300 7.8 mm TSKGelG3000PWXL columns in series (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Ger-many), in combination with a 40 6 mm PWX-guard column,operating at 30 C with distilled water as a mobile phase (flow rate:0.6 mL/min). Mannooligosaccharides (DP2 to DP6 from Megazyme,Ireland) were used as calibration standards.

2.4.2. High performance anion exchange chromatography with pulsedamperometric detection (HPAEC-PAD)

Hemicellulosic saccharides were analysed by HPAEC-PAD usingan ICS3000 chromatographic system (Dionex, Sunnyvale, USA),equipped with a 250 2 mm CarboPac PA-1 column in combina-tion with a 25 2 mm CarboPac PA guard column and anISC3000 PAD detector, using the standard provided by the supplier.

2.4.3. Analysis of phenolicsThe total phenolic content of concentrates was measured by the

Folin method (Singleton & Rossi, 1965). Free phenolics were ex-tracted with ethyl acetate (Garrote, Cruz, Domínguez, & Parajó,2008), and determined by HPLC-DAD (Conde, Moure, Domínguez,& Parajó 2011). Bound phenolics in concentrates were quantitatedas described by Veenashri and Muralikrishna (2011).

Table 1Composition of raw autohydrolysis liquors, membrane-refined concentrates and purifiedhusks and E. globulus wood) and from softwood mannan (P. pinaster wood). Data expresse

Component RH_RAW RH_MEM RH_ION EW_RAW E

Glucose 0.016 ± 0.000 0.004 ± 0.000 0.005 ± 0.000 0.003 ± 0.000 0Xylose 0.036 ± 0.001 0.008 ± 0.000 0.004 ± 0.000 0.061 ± 0.000 0Arabinose 0.032 ± 0.000 0.006 ± 0.000 0.007 ± 0.000 0.017 ± 0.001 0Galactose N/D N/D N/D N/DMannose N/D N/D N/D N/DGlOPS 0.067 ± 0.002 0.121 ± 0.004 0.126 ± 0.004 0.018 ± 0.000 0XyOPS 0.445 ± 0.001 0.613 ± 0.008 0.671 ± 0.018 0.549 ± 0.007 0ArOPS 0.032 ± 0.001 0.037 ± 0.001 0.037 ± 0.002 0.006 ± 0.001 0GaOPS N/D N/D N/D N/DMaOPS N/D N/D N/D N/DAcOPS 0.027 ± 0.004 0.042 ± 0.002 0.033 ± 0.001 0.107 ± 0.007 0UAOPS 0.031 ± 0.000 0.044 ± 0.001 0.053 ± 0.000 0.108 ± 0.008 0ONVC 0.315 ± 0.005 0.126 ± 0.012 0.065 ± 0.013 0.131 ± 0.020 0

Nomenclature. GlOPS: glucose units in oligomeric and polymeric saccharides, XyOPS:oligomeric and polymeric saccharides, GaOPS: galactose units in oligomeric and polymAcOPS: acetyl groups in oligomeric and polymeric saccharides, UAOPS: uronyl groups innot detected.

2.4.4. Antioxidant activitiesThe methods selected for measuring the antioxidant activities

of concentrates and the references describing the correspondingexperimental protocols are as follows: DPPH assay (von Gadow,Joubert, & Hansmann, 1997), ABTS/TEAC method (Re et al., 1999),FRAP antoxidant power (Benzie & Strain, 1996), b-carotene method(Miller, 1971). All determinations were done in triplicate.

3. Results and Discussion

3.1. Composition of samples

Nine samples were considered in this study:

Raw autohydrolysis liquors (denoted RH_RAW, EW_RAW andPW_RAW for samples coming from treatments of rice husks,eucalypt wood and pine wood, respectively) Low molecular weight oligomers refined by membrane process-

ing obtained from rice husks, eucalypt wood and pine wood,denoted as RH_MEM, EW_MEM and PW_MEM, respectively),and Fully purified liquors resulting from the ion exchange treatment

of the above samples, denoted RH_ION, EW_ION, and PW_ION,respectively.

The data in Table 1 show the composition of the various sam-ples. The major components in autohydrolysis liquors from xy-lan-containing raw materials (rice husks and E. globulus wood)were xylooligosaccharides and low molecular xylan fragmentswith a substitution pattern defined by the presence of uronyl, acet-yl and arabinosyl groups. The composition of media was defined interms of the mass fractions (measured respect to the non-volatilecompounds present in samples) of monosaccharides (glucose, xy-lose and arabinose), oligomeric and polymeric saccharides (definedas follows: GlOPS, glucose units in oligomeric and polymeric sac-charides; XyOPS, xylose units in oligomeric and polymeric saccha-rides; ArOPS, arabinose units in oligomeric and polymericsaccharides), acetyl groups in oligomeric and polymeric saccha-rides (AcOPS) and uronyl groups in oligomeric and polymeric sac-charides (UAOPS). The composition of liquors, and particularly thehigh uronyl content of Eucalyptus-derived samples, are in agree-ment with the nature of the parent polymers (arabinoxylan inthe case of rice husks, and glucuronoxylan in the case of E. globuluswood). The successive refining steps by membranes and ion ex-change resulted in concentrates with decreased contents of mono-

samples subjected to ion exchange obtained from xylan-containing substrates (riced as g component/g nonvolatile compounds.

W_MEM EW_ION PW_RAW PW_MEM PW_ION

.001 ± 0.000 0.000 ± 0.000 0.009 ± 0.000 0.001 ± 0.000 0.003 ± 0.000

.017 ± 0.000 0.026 ± 0.001 0.063 ± 0.000 0.009 ± 0.000 0.010 ± 0.000

.004 ± 0.000 0.007 ± 0.000 0.073 ± 0.000 0.010 ± 0.000 0.009 ± 0.000N/D N/D 0.026 ± 0.000 0.004 ± 0.000 0.004 ± 0.000N/D N/D 0.014 ± 0.000 0.002 ± 0.000 0.037 ± 0.004

.031 ± 0.000 0.052 ± 0.001 0.081 ± 0.005 0.138 ± 0.005 0.144 ± 0.003

.614 ± 0.019 0.695 ± 0.005 0.116 ± 0.005 0.066 ± 0.002 0.076 ± 0.001

.011 ± 0.000 0.019 ± 0.000 0.001 ± 0.000 0.002 ± 0.000 0.004 ± 0.000N/D N/D 0.096 ± 0.001 0.125 ± 0.006 0.130 ± 0.001N/D N/D 0.366 ± 0.003 0.509 ± 0.017 0.489 ± 0.010

.136 ± 0.002 0.138 ± 0.004 0.043 ± 0.004 0.068 ± 0.004 0.068 ± 0.001

.113 ± 0.004 0.064 ± 0.002 0.038 ± 0.001 0.033 ± 0.001 0.027 ± 0.000

.077 ± 0.025 0.000 ± 0.001 0.073 ± 0.014 0.033 ± 0.026 0.000 ± 0.007

xylose units in oligomeric and polymeric saccharides, ArOPS: arabinose units ineric saccharides, MaOPS: mannose units in oligomeric and polymeric saccharides,oligomeric and polymeric saccharides, ONVC: other non-volatile components, N/D:


saccharides and non-saccharide compounds (measured by the‘‘other non-volatile components’’ fraction), and in increased pro-portions of oligomeric and polymeric saccharides and neutral sub-stituents. Ion exchange of the membrane-refined Eucalyptussolutions decreased the proportion of uronyl substituents, owingto the ability of the resin to bond anions even at acidic pH.

Since both mannan and xylan make part of pine wood hemicel-luloses, galactose and mannose appeared both as free monosaccha-rides and as structural units of oligomeric and polymericsaccharides in the corresponding liquor (see Table 1). Rivas et al.(2012) reported on the MALDI TOF–MS characterization of hemi-cellulose-derived saccharides in autohydrolysis media obtainedunder the same experimental conditions employed in this work.Saccharides made up of hexoses (derived from glucomannan) cor-responded to acetylated oligomers with DP (Degree of Polymeriza-tion) in the range 3–14; whereas the DP of saccharides made up ofpentoses (derived from xylan) fell in the range 5–7. As the averagedegree of mannan-derived saccharides was higher than that pre-ferred for prebiotic applications, a mannanase stage was carriedout before ion exchange processing. Fig. 1 shows the HPSEC pro-files and the HPAEC chromatograms determined for samples beforeand after enzymatic hydrolysis. It can be noted that the mannanasetreatment resulted in the production of low-DP oligosaccharides,

Fig. 1. Elution profiles determined for samples prepared from P. pinaster w

the target products of this work. On the basis of the compositionaldata, it can be seen that the whole refining method (consecutivesteps of membrane processing, mannanase hydrolysis and anionexchange) resulted in general effects closely related to the ones al-ready described for xylan-containing raw materials (includingreduction of the relative amounts of monosaccharides and non-saccharide compounds, increase of the mass fractions of oligo-and polysaccharides and their neutral substituents, and drop inthe content of uronyl groups).

In order to get a deeper insight on the composition of raw auto-hydrolysis liquors and concentrates, analyses of total and individ-ual phenolics (which contribute to the antioxidant activity) werecarried out. In autohydrolysis liquors obtained from a single treat-ment of a lignocellulosic raw material (as it is the case of E. globuluswood in this work), the media contain free phenolic compoundsfrom extractives and from cleavage of hemicellulose esters (Conde,Moure, Domínguez, & Parajó 2011), whereas some esterified phe-nolic acids remain bound to oligosaccharides. The same situationhas been described for cereal husks (Garrote et al., 2008) and forpine wood (Moure, Domínguez, & Parajó, 2005). However, in thiswork both E. globulus wood and P. pinaster wood were subjectedto an aqueous extraction before autohydrolysis to remove extrac-tives. As some lignin decomposition and solubilization occurs

ood (PW_RAW, PW_MEM and PW_ION) by: a) HPSEC, and b) HPAEC.


along autohydrolysis, the liquors are expected to have an increasedphenolic content and improved antioxidant activity. According tothe compositional data, the sample EW_RAW presented a highertotal phenolic content (5.33 g of equivalent gallic acid/100 g nonvolatile components, NVC) than samples RH_RAW and PW_RAW(which contained 5.0 and 3.30 g of equivalent gallic acid/100 gNVC, respectively). The major free phenolic compound in EW-RAW was syringaldehide (0.568 g/100 g NVC), followed by gallicacid, vanillin and syringic acid (concentrations: 0.196, 0.175 and0.149 g/100 g NVC, respectively); with minor amounts of vanillicacid, p-coumaric acid and 3,4 dihydroxybenzaldehyde. The freephenolics in the sample RH_RAW were p-coumaric acid, syringicacid, vanillin, vanillic acid and ferulic acid (concentrations: 1.10,0.924, 0.375, 0.224 and 0.155 g/100 g NVC); whereas the samplePW-RAW contained just four free phenolics at concentrations inthe range 0.174–0.041 g/100 g NVC (in order of decreasing abun-dance: vanillin, p-coumaric acid, vanillic acid and syringic acid).Membrane processing of autohydrolysis liquors resulted in 40 –42% removal of free phenolics in the case of products from E. glob-ulus wood and rice husks, and 65% phenolics removal in the case ofproducts from P. pinaster wood. Fully purified samples (RH_ION,EW_ION and PW_ION) contained limited amounts of free phenolics(17, 20 and 7% of the amounts present in raw liquors, respectively),with no defined retention pattern for different individual pheno-lics. Rice husk hydrolyzates presented esterified ferulic acid andp-coumaric acid, in amounts similar (or lower) than the free phen-olics. Some concentration effects were observed for these com-pounds during membrane processing. According to the resultsreported in related studies, the content of soluble phenolics is usu-ally low in comparison with the fraction esterified to the cell wall.Thai rice husks present ferulic acid as the major soluble phenolicacid, with a 2:1 mass ratio respect to p-coumaric acid. Bound phe-nolic acids are ester-linked to the cell wall polysaccharides and lig-nin. In rice husks, the most abundant is p-coumaric acid, followedby ferulic acid and traces of syringic, vanillic, and p-hydroxybenzo-ic acids (Butsat, Weerapreeyakul, & Siriamornpun, 2009), whereasthe presence of p-coumaric, ferulic and syringic acids has been re-ported in rice xylooligosaccharides (Veenashri & Muralikrishna,2011), and ferulic acid and p-coumaric acid appear in corn fibreand wheat bran (Bauer, Harbaum-Piayda, & Schwarz, 2012). Ingrains, hydroxycinnamic acids may exist in free form, but mostof them are bound to cell wall macromolecules by ester and etherlinkages. Since cell wall materials are difficult to digest, they mayresist gastrointestinal alteration and are digested in the colon,where the substituents can be released. Bound phenolics are themajor contributors to the total antioxidant activity in grains (Adom& Liu, 2002). Heteroxylans extracted from wheat bran by ultra-sound treatment at room temperature yielded a product contain-ing 3% total phenolics (Hromádková et al., 2008).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 5 10 15 20 25 30

FRAP

(mM

FeSO

4. 7H

2O)

Concentration of NVC (g/L)

RH_RAW RH_MEM RH_ION

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 2 4

FRAP

(mM

FeSO

4. 7

H2O

)

Concentratio

EW_RAW

Fig. 2. Effects of concentration on the FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) forautohydrolysis liquors (RAW), samples refined with membranes (MEM) and membranconcentrates obtained for samples from rice husks (RH), E. globulus wood (EW) and P. p

Concerning hemicellulose hydrolysis products, the productionof feruloylated oligosaccharides was achieved by mild acid hydro-lysis of corn fibre (Bauer et al., 2012) or maize bran (Lin, Ou, & Wen,2012), whereas two-stage hydrothermal processing of wheat branled to feruloylated arabinoxylooligosaccharides (AXOS). The maxi-mal concentrations of esterified ferulate and soluble AXOS oc-curred at the same temperature, at which 70% of the insolublearabinoxylan and more than 30% of the esterified ferulic were re-leased, yielding a purified product with 4.8% esterified ferulate(Rose & Inglett, 2010a). Highly feruloylated AXOS (containing upto 8 g of esterified ferulate/100 g of AXOS) were produced at 50%yield by microwave irradiation of maize bran (Rose & Inglett,2010b).

3.1.1. Antioxidant activityThe reducing abilities of the samples considered in this study

are shown in Fig. 2. A steady increase of FRAP (ferric reducing anti-oxidant power) with the product concentration was observed. Asimilar behaviour has been reported for other oligosaccharides,for example from cereal and millet brans (Lin et al., 2012; Veenash-ri & Muralikrishna, 2011). As a general trend, the raw hydrolyzates(RAW) were the most active reducing and scavenging agents fromthe three raw materials, followed by ones processed with mem-branes (MEM) and by fully refined samples (ION). This generalbehaviour was found to be related to the phenolic content of thestreams. In literature, the antioxidant activities of soluble andbound phenolic acids in rice husk extracts have been reported topresent a marked correlation with the levels of soluble ferulic, gal-lic, and p-coumaric acids (Butsat et al., 2009); whereas the activityexhibited by the XOS mixture from ragi has been justified by thecontents of ferulic and syringic acids (Veenashri & Muralikrishna,2011). In comparison, xylan from corn cobs did not show reducingactivity up to 2 g/L (Melo-Silveira et al., 2012).

The results obtained in this work with the raw hydrolyzates arecomparable to those reported for phenolic fractions obtained byautohydrolysis of lignocellulosic materials under harsh conditions(220–240 C) (Conde, Moure, Domínguez, & Parajó 2011) and fur-ther refined with polymeric resins (Conde, Moure, Domínguez,Gordon, & Parajó, 2011). The raw hydrolyzates showed a reducingpower comparable to the reference compound butylhydroxytolu-ene (BHT) at 0.1 g/L (0.13 mM FeSO47H2O), but lower than butyl-hydroxyanisol (BHA) at the same concentration (1.9 mMFeSO47H2O) (data not shown). A similar behaviour was observedfor xylo-oligosaccharides derived from cereal and millet brans(Veenashri & Muralikrishna, 2011), since the reducing power at-tained with ferulic acid or with BHA at 10 ppm was comparableto the one determined for XyOPS from maize at ten times higherconcentration. In comparison, lower values were determined forXOS from ragi, rice and wheat bran.

6 8 10 12n of NVC (g/L)

EW_MEM EW_ION

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 10 20 30 40 50

FRAP

(mM

FeSO

4. 7

H2O

)


PW_RAW PW_MEM PW_ION

solutions containing the various types of samples considered in this study: rawe-refined samples subjected ion exchange (ION). Separate figures are provided forinaster wood (PW).

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

0102030405060708090100

0 10 20 30 40

TEAC

(mM

Trol

ox)

ABTS

, PI(%

)



0.0

0.5

0.9

1.4

1.9

2.3

2.8

0102030405060708090100

0 20 40 60 80

TEAC

(mM

Trol

ox)

ABTS

, PI(%

)

Concentration of NVC(g/L)

EW_RAW EW_MEM EW_ION

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2.8

0102030405060708090100

0 10 20 30 40 50

TEAC

(mM

Trol

ox)

ABTS

, PI(%

)

Concentration of NVC (gL)


Fig. 3. Effects of concentration on the ABTS radical scavenging activity, expressed as percentage of inhibition (%) and as TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Activity, mMTrolox) for solutions containing the various types of samples considered in this study: raw autohydrolysis liquors (RAW), samples refined with membranes (MEM) andmembrane-refined samples subjected ion exchange (ION). Separate figures are provided for concentrates obtained for samples from rice husks (RH), E. globulus wood (EW)and P. pinaster wood (PW).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40

DPPH

, PI(%

)



0

10

20

30

40

50

60

70

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90

100

0 5 10 15 20 25 30 35

DPP

H, P

I(%)



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50

DPP

H, P

I(%)



Fig. 4. Effects of concentration on the DPPH radical scavenging activity, expressed as percentage of inhibition (%) for solutions containing the various types of samplesconsidered in this study: raw autohydrolysis liquors (RAW), samples refined with membranes (MEM) and membrane-refined samples subjected ion exchange (ION). Separatefigures are provided for concentrates obtained for samples from rice husks (RH), E. globulus wood (EW) and P. pinaster wood (PW).


Experimental data concerning the scavenging capacities of thevarious products assayed in this work are shown in Figs. 3 and 4for ABTS+ and DPPH, respectively. The TEAC values for raw andfor membrane processed streams were not significantly different,despite their different phenolic content. This finding can be as-cribed to the increased acetyl and uronyl groups in oligomericand polymeric saccharides and to the degree of polymerization,which are influential on the activity (Rao & Muralikrishna, 2006;Veenashri & Muralikrishna, 2011). The role of uronic acids in theantioxidant activity of feruloyl arabinoxylans has been confirmed.The effects of the molar mass distribution have been confirmed inprevious studies. For example, feruloyl arabinoxylans present inwater soluble fibres from rice and ragi exhibited higher antioxidantactivity than expected, a fact justified on the basis of the content ofbound ferulic acid and differences in molecular weight (Rao &Muralikrishna, 2006). The DPPH radical scavenging and FRAP activ-ities were stronger than the ones corresponding to the correspond-ing amounts of free ferulic acid, and the activity increased with thenumber of sugar moieties. In a related study, xylan and pectin frac-tions containing two or more specific functional groups with me-tal-binding activity (for example, –COOH and –OH) were themost efficient inhibitors of hydroxyl radical (Pristov et al., 2011).

Related variation patterns observed for FRAP and TEAC assays,as it could be inferred considering the electron transfer-basedmechanism underlying both assays (even though the pH is neutralfor TEAC and acidic for FRAP). Correlations between phenolic con-tents and activities measured using different assays have been re-ported, including the content of gallic acid in the husk extractswith DPPH and ABTS+ scavenging activities, ferulic acid with ABTS+

and FRAP results, p-coumaric acid with DPPH data, and total phen-olics with DPPH, ABTS, and FRAP results (Butsat et al., 2009).

A comparison between the DPPH radical scavenging activity ofthe most favourable samples obtained in this work and the ones ofcommercial antioxidants can be established on the basis of theEC50 (equivalent concentration) values: the results determinedfor samples EW_RAW and EWMEM were below 5 g/L, in compari-son with 2.8 g/L determined for BHT and 0.35 g/L measured for afree phenolic enriched fraction (Conde, Moure, Domínguez, & Para-jó, 2011; Conde, Moure, Domínguez, Gordon et al., 2011). In a re-lated study, EC50 in the range 0.04–1 g/L have been reported forXyOPS from cereal brans (Veenashri & Muralikrishna, 2011). Feru-loylated arabinoxylooligosaccharides obtained by two-stagehydrothermal processing of wheat bran followed by ethyl acetateextraction, vacuum concentration, and ion exchange resulted in afraction (containing 4.8% esterified ferulate) with a DPPH radicalscavenging capacity of 29.7 lmol Trolox equiv/g dm, which was3–6 times higher than the ones of water and alcohol-soluble ex-tracts from other cereal grains (Rose & Inglett, 2010a). In compar-ison, ferulic acid exhibited higher DPPH scavenging activity thanferuloylated oligosaccharides from wheat flour arabinoxylan (Kata-podis et al., 2003) and than XyOPS from cereal and millet brans(Veenashri & Muralikrishna, 2011). The phenolic-xylan complexesfrom almond shells and wheat bran were less active than querce-tin, but more potent than galactoglucomannans (Ebringerová,Hromádková, Hribalova et al., 2008). These authors found thatthe phenolic content correlated with the DPPH radical scavengingcapacity, a behaviour similar to the one observed for some frac-tions from almond shell authohydrolysis (Ebringerová, Hromád-ková, Kostalova et al., 2008). The DPPH radical scavengingcapacity of heteroxylans obtained by aqueous extraction of wheatbran in the presence of ultrasounds also increased with the pheno-lic content (Hromádková et al., 2008).

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40

AAC



0

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0 20 40 60 80

AAC



0

100

200

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400

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600

0 10 20 30 40 50

AAC



Fig. 5. Effects of concentration on the b-carotene bleaching ability of solutions containing the various types of samples considered in this study: raw autohydrolysis liquors(RAW), samples refined with membranes (MEM) and membrane-refined samples subjected ion exchange (ION). Separate figures are provided for concentrates obtained forsamples from rice husks (RH), E. globulus wood (EW) and P. pinaster wood (PW).


The ability of liquors and concentrates for protecting againstoxidation in a b-carotene-linoleic acid emulsion was also measured(see Fig. 5). As a general trend, the raw liquors provided a limitedprotection, although the MEM samples were efficient at concentra-tions higher than 5 g/L. Below this threshold, similar activitieswere determined for RAW and MEM samples, whereas the concen-trates coming from ion exchange gave poorer results. In the stud-ied range, the effects of the concentration were different fromraw liquors and processed streams, which showed dissimilartrends, including steady increases with concentration, plateausand optimal values. The antioxidant activity coefficients (AAC)were lower than those found for BHA (AAC100 ppm = 887) and BHT(AAC500 ppm = 854) at lower concentrations. A related behaviourwas reported for rice, ragi, wheat and maize oligosaccharides (Vee-nashri & Muralikrishna, 2011). The antioxidant activities measuredby the emulsion assays were higher for synthetic antioxidants(BHA, BHT) and ferulic acid than for water-soluble feruloyl arabin-oxylans from rice and ragi (Rao & Muralikrishna, 2006). For thesame purpose, BHA was more efficient than XOS derived from cer-eal and millet brans (Veenashri & Muralikrishna, 2011). The AACvalues were also lower than those reported for a lignocellulosefraction enriched in phenolic compounds assayed at lower concen-trations (Conde, Moure, Domínguez, & Parajó, 2011; Conde, Moure,Domínguez, Gordon et al., 2011). Membrane refined fractionsshowed comparatively high contents of ferulic and coumaric acids,providing a possible justification for their enhanced antioxidantactivity. Some contradictory results found with the protection ofoxidation in emulsion were reported (Bauer et al., 2012). Esterifica-tion by ferulic acid enhances the antioxidative potential respect tofree ferulic acid in some systems, but the higher hydrophilicity ofthe feruloylated oligosaccharides respect to the monomer may hin-der contact to the oil–water interface in emulsions, limiting theprotection.

In conclusion, the proposed refining methods reduced themonosaccharides and non-saccharide content of samples, and in-creased the oligo- and polysaccharide content. However, a markeddecrease in both phenolic content and activity was observed afterion-exchange processing. A similar variation pattern in the in vitroantioxidant properties of hemicellulose-derived saccharides fromthe different sources studies was observed for the various samplessubjected to the same refining stages. The hemicellulose-derivedsaccharides produced in this work showed dose-dependent reduc-ing power, radical scavenging capacity and protection against oxi-dation in emulsion. The raw hydrolyzates showed a reducingpower comparable to that of the reference compound BHT, butlower than the one of BHA. Membrane processing hardly affectedthe TEAC of the concentrates, which were significantly reducedby ion exchange treatments. FRAP and TEAC assays (driven by elec-tron transfer-based mechanisms) showed related variation pat-

terns. The DPPH radical scavenging activity assays provided EC50

below 5 g/L for samples EW_RAW and EW_MEM. The various con-centrates employed in this work presented a comparatively limitedability to protect against oxidation under the conditions of the b-carotene-linoleic acid emulsion, providing non favourable antioxi-dant activity coefficients compared to BHA and BHT. The potentialof these compounds as functional ingredients with prebiotic andantioxidant activity was confirmed.

Acknowledgment

Authors are grateful to the Spanish ‘‘Ministry of Science andInnovation’’ and ‘‘Ministry of Economy and Competivity’’ for sup-porting this study, in the framework of the research Projects ‘‘Prop-erties of new prebiotic food ingredients derived fromhemicelluloses’’ (reference AGL2008-02072) and ‘‘Developmentand evaluation of processing methods for biorefineries’’ (referenceCTQ2011-22972), which were partially funded by the FEDER Pro-gram of the European Union. Ms. Sandra Rivas thanks the SpanishMinistry of Science and Innovation for her ‘‘Formación del PersonalInvestigador’’ (FPI) research grant. Authors also thank ‘‘Xunta deGalicia and FEDER (EU) for funding ‘‘INBIOMED, unha maneira defacer Europa’’

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http://dx.doi.org/10.1007/s13197-012-0643-x

























































ANEXO IV: Manufacture of levulinic acid from Pine

wood hemicelluloses: A kinetic assessment

Manufacture of Levulinic Acid from Pine Wood Hemicelluloses: AKinetic AssessmentSandra Rivas,†,‡ María Jesus Gonzalez-Munoz,†,‡ Carlos Vila,†,‡ Valentín Santos,*,†,‡

and Juan Carlos Parajo †,‡

†Department of Chemical Engineering, Faculty of Science, University of Vigo (Campus Ourense), As Lagoas, 32004 Ourense, Spain‡CITI (Centro de Investigacion, Transferencia e Innovacion), University of Vigo, Tecnopole, San Cibrao das Vinas, 32900 Ourense,Spain

*S Supporting Information

ABSTRACT: Pinus pinaster wood samples were subjected to two consecutive treatments with hot, compressed water, in order toremove water-solubles in the first step and to cause hemicellulose solubilization in the second. The liquid phase from the secondstage, containing hemicellulose-derived saccharides (mainly of oligomeric nature), was mixed with sulfuric acid and heated toconvert the saccharides into levulinic acid. Experiments were carried out at different acid concentrations, temperatures, andreaction times. The concentration profiles were interpreted using a model involving the following major steps: conversion ofoligomers into monosaccharides, conversion of hexoses into hydroxymethyl furfural, decomposition of this latter into levulinicand formic acids, dehydration of pentoses into furfural, and conversion of this latter into formic acid. Parasitic reactions limitedthe theoretical yields in the target products. The kinetic coefficients governing the various reactions were determined by analysisof data. Under the best conditions assayed, the yield in levulinic acid accounted for 66% of the stoichiometric value.

INTRODUCTION

A wide range of technologies have been proposed in the lastyears for producing chemicals, materials, or goods fromrenewable sources following the biorefinery concept. Biorefi-neries follow a principle analogous to oil refineries: the rawmaterial is fractionated into a number of components that canbe used for obtaining a variety of fuels, chemicals, and/orbiobased-materials,1−3 including levulinic acid.Levulinic acid (4-oxopentanoic acid, denoted LevA) is a low-

molecular weight carboxylic acid considered as a new platformchemical, owing to its possible conversion into a number ofcommercial compounds, including solvents, food flavoringagents, monomers for synthesis of resins or polymers,plasticizers, herbicides, and antifreeze and pharmaceuticalagents.4 As it is well-known, LevA can be produced fromsugars in acidic media.Softwoods are the dominant source of lignocellulosic

materials in the Northern hemisphere,5 and present hemi-celluloses containing hexoses and pentoses. Schemes forsoftwood fractionation may include the separation of hemi-celluloses as a first processing stage.6,7

Pinus pinaster wood hemicelluloses are mainly made up ofglucomannans substituted with acetyl and galactosyl moieties.8

The backbone of pine mannans [which include glucomannans(GM) or galactoglucomannans (GGM), depending on theabundance of galactosyl substituents] is made up of randomlydistributed D-glucose and D-mannose structural units linked byβ (1→4) glycosidic bonds, which can be substituted withirregularly distributed acetyl groups.9,10

Soluble saccharides of polymeric or oligomeric nature can beobtained from pine wood hemicelluloses by treatment withcompressed water under selected conditions, leading toreaction media that also contain monosacharides, acetic acid

(coming from acetyl groups linked to hemicelluloses), andsmall quantities of furfural and hydroxymethylfurfural (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF).11

Hexose decomposition in acidic media leads to the formationof formic acid (FA) and LevA, through a mechanism in whichHMF participates as an intermediate, which is formed byhexose dehydration. In the case of fructose, a direct route wasproposed,4 explaining the superior HMF yields obtained whenusing this sugar.12 Oppositely, glucose and other hexoses areconverted into HMF by formation of the enediol, which isfurther transformed to HMF via additional intermediates.13

The LevA yield is decreased by parasitic reactions leading to theformation of dark, colored solids usually referred to ashumins.14,15 Patil and Lund16 studied the formation of huminsby acid-catalyzed conversion of HMF, and proposed that huminpolymers are derived from HMF but not from LevA or FA.Girisuta et al.14 evaluated the effects reached by different acids(H3PO4, oxalic acid, HCl, H2SO4, and HI) on the conversion ofHMF into LevA, finding that H3PO4 and oxalic acid providedlimited conversions, HI enabled high HMF conversion (but notinto LevA), and that HCl and H2SO4 provided the best HMFconversions and LevA yields. LevA has also been produced byacidic processing of biomass containing cellulose, starch orsucrose.4,17−20

Following a related mechanism, dehydration of pentoses inacid-catalyzed media leads to the formation of furfural, which inturn can be converted into FA,4 again with the participation ofside reactions. Similarly, the processing of substrates containing

Received: July 14, 2012Revised: February 7, 2013Accepted: February 24, 2013Published: February 24, 2013

Article

pubs.acs.org/IECR

© 2013 American Chemical Society 3951 dx.doi.org/10.1021/ie3018725 | Ind. Eng. Chem. Res. 2013, 52, 3951−3957

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polysaccharides made up of pentoses in acidic media leads tothe formation of furfural after a first stage of polysaccharidehydrolysis. Riansa-ngawong and Prasertsan21 optimized theconditions for furfural production by acid hydrolysis of palmfiber hemicelluloses (mainly made up of xylose), obtaining amaximum furfural concentration (8.67 g/L) in a treatmentperformed at 140 °C for 90 min. Furfural production from D-xylose has been recently assayed in dilute aqueous acidicsolutions containing halides,22 whereas the processing of xylosein sub- and supercritical water yielded furfural, D-xylulose,glyceraldehyde, glycoaldehyde, dihydroxyacetone, pyruvalde-hyde, lactic acid, and formaldehyde.23

This work provides an assessment on the production of LevAfrom hemicellulose- derived saccharides (including hexoses,pentoses and poly- and oligo-saccharides made up of thesesugars) obtained by hydrothermal processing of Pinus pinaster.These products were treated with dilute sulfuric acid atdifferent temperatures for preset reaction times, and theconcentration profiles of hemicellulosic saccharides, furans,FA, and LevA were determined. The results were interpretedon the basis of a kinetic model suitable for optimization andpreliminary design calculations. To our knowledge, noinformation has been reported before on the manufacture ofLevA from wood hemicelluloses.

MATERIALS AND METHODSMaterials. Pinus pinaster wood chips were kindly provided

by Orember-Finsa, Ourense (Spain). Samples were air-dried,milled to a particle size below 8 mm, homogenized in a singlelot to avoid compositional differences among samples andstored until use.Experimental Methods. Analysis of the Raw Material.

Samples from the homogenized lot were subjected to moisturedetermination (TAPPI T-264-om-88 m method) and toquantitative acid hydrolysis with 72% sulfuric acid (T-249-om-85 method). The solid residue after acid hydrolysis wasrecovered by filtration and considered as Klason lignin.Monosaccharides and acetic acid in hydrolyzates were assayedby HPLC using the method described below. Uronic acids weredetermined by the m-phenylphenol method.24

Aqueous Extraction and Autohydrolysis. Pinus pinasterwood samples were subjected to two sequential watertreatments, both at a liquor to solid ratio of 8:1 kg/kg, in astainless steel reactor (Parr Company) with temperature andagitation controls. First, the medium was heated up to reach130 °C to remove water-soluble extractives and cooledimmediately. The extracted solids were separated by filtrationand washed with water. Then, additional water was added, thesystem was heated to 175 °C, kept at this temperature for 26min, and cooled. These experimental conditions are known tobe optimal for converting hemicelluloses into poly- and oligo-saccharides (denoted POS).11,25

Acid-Hydrolysis Treatments. Sulfuric acid was added to theliquid phases coming from autohydrolysis treatments to reachconcentrations in the range 0.5−10 wt % H2SO4, and theresulting solutions were treated in an autoclave at 120, 130, or135 °C for the desired reaction time (up to 10 h). The reactiontime indicates the duration of the isothermal reaction stage (i.e.,experiments at time = 0 h correspond to heating up to reachthe target temperature and immediate cooling). The reactionmedia were filtered through glass crucibles (nominal maximumpore size, 10 μm). Liquors were analyzed for residual substrateand reaction products by HPLC (see the following section).

Analytical Methods. The compositions of both autohy-drolysis liquors and solutions obtained in acid hydrolysistreatments were determined by HPLC using an Agilent 1100instrument fitted with a refractive index detector. Samples werefiltered through 0.45 μm cellulose acetate membranes beforeanalysis. Monosaccharides (glucose, xylose, galactose, arabi-nose, and mannose) were analyzed using a CARBOsep CHO682 column with a guard column (Transgenomic) kept at 80°C, employing distilled water as a mobile phase (flow rate, 0.4mL/min). Before analysis in the CARBOsep CHO 682 column,posthydrolysis samples and liquors from acid hydrolysis werediluted, neutralized with BaCO3, centrifuged, and filtered.Furfural, HMF, FA, acetic acid, and LevA were determinedusing an Aminex HPX-87H column (BioRad, Life ScienceGroup Hercules, CA), using the following conditions: mobilephase, 0.006 N H2SO4; flow rate, 0.6 mL/min; and temper-ature, 60 °C. Concentrations of oligosaccharides (OS) andbound acetyl groups were determined on the basis of theincreases in the concentrations of monosaccharides and aceticacid after a quantitative posthydrolysis (performed with 4%H2SO4 for 20 min). Concerning the experimental error, linearrelationships between detector responses and concentrationswere found at concentrations up to 1 g/L for all determinedcompounds. In some experiments, the concentrations of one orseveral target compounds were below 1 mmol/L. To ensure thereliability of the analytical method under these conditions, thereproducibility of the analytical methods under these conditionswas confirmed in additional experiments. Calibration curveswere determined using five different concentrations evenlydistributed along the considered concentration range, and thefitting calculations led to regression coefficients ≥0.995 for allthe considered compounds. Replicates of samples with typicalconcentrations of glucose, xylose, arabinose, levulinic acid, andfurfural (0.8 mmol/L) presented standard deviations <3% ofthe average value. Similar assays for samples containing HMF,galactose or mannose led to standard deviations <1% of theaverage value, and <1.7% for formic acid. The content ofnonvolatile compounds (NVC) of liquors was determined byoven-drying aliquots at 105 °C until constant weight.

Calculation of Kinetic Parameters. The differentialequations involved in the kinetic models were solvednumerically using the fourth order Runge−Kutta method.The kinetic parameters were calculated by minimizing the sumof the squares of deviations between experimental andcalculated data, using commercial software (Microsoft Excel,Microsoft) with a built-in optimization routine based on theNewton’s method (Solver). Optimization was carried outfollowing the philosophy described in Garrote et al.26

RESULTS AND DISCUSSIONComposition of the Raw Material. The results

determined for the composition of Pinus pinaster wood(expressed as weight percent, o.d. basis) were as follows:glucan (including glucosyl units present in cellulose andhemicelluloses), 36.7%; xylan, 4.7%; galactan, 3.2%; arabinan,1.3%; mannan, 9.4%; acetyl groups, 1.2%; Klason lignin, 34.1%;uronic acids, 3.9%; extracts, 4.7%; ashes, 0.3%, and others (bydifference), 0.5%. These values are in the range reported forsoftwoods.

Aqueous Processing of Wood. Pinus pinaster woodcontains water-soluble extractives, which were removed by anaqueous extraction carried out under nonisothermal conditionsup to a reach 130 °C. In this stage, hemicelluloses were not

Industrial & Engineering Chemistry Research Article

dx.doi.org/10.1021/ie3018725 | Ind. Eng. Chem. Res. 2013, 52, 3951−39573952

significantly dissolved. In the second treatment (autohydrol-ysis), hemicelluloses were solubilized at high yield to obtainPOS, which were employed as substrates for LevA production.The operational conditions employed in this stage were thesame reported as optimal for POS production from pinewood.11,25 The composition of autohydrolysis liquors (inmmol/L) was as follows: glucose (G), 1.05; xylose (X), 7.82;galactose (Ga), 3.15; arabinose (Ar), 10.74; mannose (Mn),1.84; acetic acid 4.14; glucosyl units in POS (GOS), 10.57;xylosyl units in POS (XOS), 19.22; galactosyl units in POS(GaOS), 13.00; arabinosyl units in POS (ArOS), 1.31;mannosyl units in POS (MnOS), 46.57; acetyl groups inoligosaccharides (AcOS), 16.21; uronic acids (UA), 4.04. Theidentified compounds accounts for about 95 wt % of the totalnonvolatile compounds NVC.Acidic Processing of POS. Sulfuric acid was added to

autohydrolysis liquors to reach preset concentrations (up to10%) and heated for obtaining the target product (LevA) andvaluable coproducts (acetic acid and FA). Additional replicateexperiments were carried to assess the experimental error.Standard deviations ≤0.3 mmol/L were obtained in more than94% of cases, and ≤0.2 mmol/L in 80% of cases. The behaviorof the major saccharide components are discussed below.Oligosaccharide and Monosaccharide Hydrolysis.

Conversion of oligosaccharides into monosaccharides pro-ceeded rapidly under all the assayed conditions. In experimentsperformed under harsh conditions, oligosaccharides weredepleted during the heating period. As a representativeexample, Figure 1A presents the experimental results obtainedin the treatment carried out at 120 °C with 0.5% sulfuric acid,

the mildest conditions assayed. In this case, limitedoligosaccharide concentrations were observed after the firsthour of reaction, except in the case of MnOS. A slower kineticswas observed for monosaccharides, which presented limitedchanges in concentration even at prolonged reaction times(except in the case of mannose and xylose, this latter being aC5 of comparatively higher susceptibility to degradation). Thisinformation confirms the possibility of achieving oligosacchar-ide hydrolysis without causing significant monosaccharidedegradation. As a representative example, Figure 1B showsthe dependence of MnOS concentration on the catalystconcentration and on the reaction time for experiments carriedout at 120 °C. Oligosaccharide depletion was achieved in thefirst minutes of operation in media containing acid concen-trations above 3%.Hexoses were converted into HMF and coproducts under

harsh conditions. Figure 2 presents the concentration profiles

determined for mannose operating at 135 °C with theconsidered sulfuric acid concentrations. Mannose was slowlydecomposed in the experiment performed with 0.5% sulfuricacid, but complete depletion was observed in experimentsperformed with higher catalyst concentrations. Similar trendswere found in experiments carried out at 120 or 130 °C, withthe expected differences caused by temperature. In experimentsperformed at 120 °C, mannose was present even in allexperiments. In the assay performed at the highest sulfuric acidconcentration, 73.3% of the initial mannose was consumed.Related trends were found for the rest of the monosaccharides.Among them, xylose was preferently consumed owing to itshigher liability.The concentration of acetic acid (data not shown) increased

along the first stages associated to oligosacharide hydrolysis.The generation of acetic acid was ascribed to the fact that theacetyl groups making part of the oligomeric compounds aresplit in acidic media. The liability of acetyl groups enabled aslight concentration increase in the first reaction stages to reacha plateau (at 20 mmol/L or 1.2 g/L). This concentration is inconcordance with the value calculated assuming a quantitativehydrolysis of acetyl groups into acetic acid.

Generation of HMF, Levulinic Acid, Furfural, andFormic Acid. As a representative example, Figure 3 presentsthe results obtained for the experiments carried out at 130 °C.HMF and furfural behaved as typical reaction intermediates,with an initial increase of their concentrations and a further

Figure 1. Concentration profiles determined in experiments carriedout at 120 °C: (A) oligo- and monosaccharides; (B) manno-oligosaccharides (MnOS).

Figure 2. Mannose concentration profiles determined in experimentsperformed at 135 °C.



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decrease (more marked in the case of furfural). HMFconcentrations were low in all cases (maximum value, 1.6mmol/L or 0.2 g/L), whereas the concentrations of furfuralwere comparatively higher (up to eight times higher under theconditions leading to maximum concentrations).LevA and FA presented related variation patterns, reaching

higher concentrations under conditions defined by higherseverities. In the set of experiments performed at the highestsulfuric acid concentration, both LevA and FA presented anasymptotic variation, in accordance with the depletion ofmonosaccharides.For given operational conditions, the levulinic acid selectivity

were calculated with respect to the consumed C6 saccharides,which were measured as the difference between theconcentrations of potential hexoses (including the ones presentin oligosaccharides) and the unconverted ones. The molarratios (LevA produced)/(potential hexoses consumed) reachedvalues in the range 0.62−0.66 for experiments with significanthexose conversion, without a defined dependence on theoperational variables. The yields obtained in this work were inthe range reported for studies dealing with the processing ofglucose or cellulosic substrates.17,27,28

Kinetic Modeling. As explained before, pine woodautohydrolysis liquors contained POS made up of hexosesand pentoses (derived from GM and heteroxylan, respectively)as major components. POS processing in acidic media led tothe formation of monosaccharides, and the further decom-position reactions depend on their nature of hexoses or

pentoses. In acidic media, glucose, galactose, and mannose reactto form enediols, which are transformed into HMF following areaction pathway involving dehydration and cyclation, with 3,4-dideoxyglucosulosene and dienediol as intermediates.13 In turn,HMF decomposes to give LevA and FA. Since pentoses react ina similar way (forming furfural, which yields FA in a furtherstep), it has to be taken into account that the FA generated inmedia containing both pentoses and hexoses (as it is the case ofthis work) can come from both types of monosaccharides. Onthe other hand, parasitic reactions leading to decompositionproducts have to be also considered in the overall mechanismto justify the differences with respect to the stoichiometricyields. Both LevA and FA were found to be stable under theassayed conditions, in agreement with Girisuta et al.27

On the basis of these ideas, the reaction scheme presented inFigure 4 was employed for kinetic modeling. All reactions wereassumed to follow a first order kinetics. Individual kineticcoefficients (denoted k1i for hexoses, where i stands for glucose,

Figure 3. Concentration profiles determined in experiments carried out at 130 °C for (A) furfural; (B) HMF; (C) levulinic acid (LevA); (D) formicacid (FA).

Figure 4. Kinetic model employed for data interpretation.




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galactose, or mannose; and k5j for pentoses, where j stands forxylose or arabinose) are considered for every oligomerconstituent. In the same way, the experimental data enabledthe calculation of the corresponding kinetic coefficientsmeasuring the decomposition of the various sugars into furans.These assumptions are in agreement with the general ideasreported for the behavior of glucose and galactose in acidicmedia.28 The differential equations derived from the proposedmechanism are listed in Table S1 (Supporting Information).The kinetic coefficients k1i involved in the hydrolysis of C6

oligomers into hexoses could be accurately estimated just formild conditions (low temperature and acid concentration), asin harsh experiments the substrates were completely hydrolyzedduring the heating up period (see Figure 2). Owing to theirhigher reactivity, the transformation of C5 oligomers intopentoses proceeded rapidly, hindering the calculation of thekinetic coefficients k5j measuring the decomposition of thesesubstrates. However, it has to be taken into account that bothaspects are of minor importance for the purposes of this work,since the calculation of the concentrations of the targetproducts can be carried out considering instantaneous oligomerhydrolysis under the conditions in which the kinetic coefficientscould not be estimated. Table 1 presents the values calculatedfor k1i in experiments performed at 120 °C and at low sulfuricacid concentrations.

The first order kinetics assumed for monosaccharidedecomposition predicts a linear dependence of the logarithmsof the substrate concentration on the reaction time, where theslopes of lines measure the values of the correspondingparameters (k2i or k6j). The experimental data followed thisvariation pattern fairly. As a representative example, SupportingInformation, Figure S1 shows the experimental variationpatterns determined for data obtained at 135 °C and 3.5%sulfuric acid; whereas Supporting Information, Table S2includes the determined kinetic coefficients k2i and k6j andthe corresponding r2 values (see Supporting Information)The kinetic coefficients measuring the decomposition of all

sugars showed a linear dependence on the sulfuric acidconcentration. As a representative example, Figure 5 showsthis dependence for kinetic coefficients obtained at 135 °C inexperiments performed at different acid concentrations.According to this, for a fixed temperature, the followingequations can be written:

− =C t k Cd( )/d [SA][ ]i i i2M

(1)

− =C t k Cd( )/d [SA][ ]j j j6M

(2)

where Ci and Cj stand for the concentration of the consideredhexose or pentose along isothermal reaction, [SA] is thesulfuric acid concentration (in mol/L), and k2i

M and k6jM are the

coefficients measuring the decomposition kinetics in a mediumcontaining 1 M sulfuric acid. Table 2 lists the set of coefficientsdetermined at the various temperatures, which reached similarvalues for the three hexoses and reached higher values forpentoses. The corresponding r2 values are included inSupporting Information, Table S3.Concerning the generation and decomposition of furans, a

preliminary analysis of data showed that the hexosedecomposition could be interpreted by a simplified model, inwhich the influence of intermediates from hexoses could beneglected. The maximum concentrations of HMF in the mediawere low, and appeared at short reaction times, confirming thatdecomposition was faster than generation. This finding isconsistent with literature reported on the acid hydrolysis ofglucose14,15,29 and cellulose.27 Girisuta et al.14 studied thedecomposition of HMF into LevA in media containing 0.05−1M H2SO4, finding a suitable correlation of data when theconcentrations of HMF and sulfuric acid were affected byexponents in the range 0.88−1.38. These assumptions were notsatisfactory for interpreting the results obtained in this work,possibly due to the differences in the operational conditions(related not only to the presence of polymeric and oligomericsaccharides in the media, but also to the concentrations of acid,substrates, and products, as well as to the presence ofnonsaccharide compounds from autohydrolysis). In summary,the experimental trends indicated that the formation ofdecomposition products was more important in the case ofthis study, and that the observed differences were higher whenthe acid concentration increased. Figure 6 shows the agreementbetween experimental and calculated concentrations of HMFand LevA using the mechanism and kinetic parameter proposedin this work.Concerning the decomposition of pentoses, the interpreta-

tion of data was more complicated, as the participation of anintermediate and its further decomposition by two parallel ways(leading to the formation of furfural and decompositionproducts, respectively) was necessary for data interpretation.As we had the evidence that the analytical problem would bealmost impossible to solve, and considering that the multipleintermediates could originate from a number of differentcompounds, we put our focus in developing a reaction

Table 1. Values Determined for the Kinetic Coefficients k1i(h−1) at 120 °C

k1i

sulfuric acid concentration (%) i = glucose i = galactose i = mannose

0.50 3.0 2.4 1.41.25 3.2 3.0 2.12.00 4.0 7.1 5.02.75 5.1 5.5 6.13.50 5.6 7.9 8.14.25 8.2 13 9.05.00 10 15 12

Figure 5. Dependence of the kinetic parameters (k2i and k6j, measuringthe decomposition of sugars) on the concentration of sulfuric acid(temperature, 135 °C).




mechanism suitable for describing just the behavior of thetarget compounds of this study. Since the concentrations of theintermediate I were not measured, the individual kineticcoefficients governing its decomposition, k7 and k8, could notbe calculated. However, the experimental data allowed thecalculation of the ratio between these coefficients, and thisallowed the modeling of the concentration profiles of the targetproducts. About half of pentoses were transformed into furfuralunder the experimental conditions assayed. Furfural reachedmaximum values higher than the ones observed for HMF, butits further conversion into FA was negligible in most of thecases. FA generation from furfural decomposition was onlyslightly significant under harsher conditions.The kinetic coefficients measuring the decomposition of

furans (k3 and k4 in the case of HMF and k9 and k10 in the caseof furfural) presented a linear dependence on the sulfuric acidconcentration, leading to a situation similar to the onedescribed in eq 1 and eq 2, and enabling the calculation ofthe generalized kinetic coefficients k3

M, k4M, k9

M, and k10M (see

values listed in Table 3). The corresponding r2 values are

included in Table S4 (see Supporting Information). It can benoted that the ratio k3

M/k4M increased with temperature,

suggesting a way to increase the LevA yields.

CONCLUSIONSThe production of levulinic and formic acids from Pinus pinasterwood hemicelluloses was carried out by consecutive stages of

autohydrolysis (to obtain a liquid phase containing oligomericand monomeric hemicellulosic saccharides) and further heatingin the presence of sulfuric acid. The kinetics of the variousreactions involved (conversion of oligomers into monosachar-ides, conversion of hexoses into hydroxymethylfurfural,decomposition of this latter into levulinic and formic acids,dehydration of pentoses into furfural, conversion of this latterinto formic acid, and formation of decomposition products)was studied at various temperatures and reaction times. Theexperimental concentration profiles were well interpreted bythe proposed model. Under the best conditions assayed, theyield in levulinic acid accounted for 66% of the stoichiometricvalue.

ASSOCIATED CONTENT

*S Supporting InformationTable S1 lists the differential equations derived from the kineticmodel shown in Figure 4. Figure S1 show a first order kineticplot for decomposition of monosacharides (operating at 130 °Cin media containing 3.5% sulfuric acid). Table S2 shows thefirst order kinetic parameters describing the monosacharidedecomposition, as well as the corresponding regressioncoefficients. Tables S3 and S4 show the r2 values obtained inthe correlations of kinetic coefficients with the sulfuric acidconcentration. This material is available free of charge via theInternet at http://pubs.acs.org.

AUTHOR INFORMATION

Corresponding Author*Tel.: +988387047. Fax +988387001. E-mail: [email protected].

NotesThe authors declare no competing financial interest.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are grateful to the Spanish “Ministry of Scienceand Innovation” for supporting this study, in the framework ofthe research Project “Development and evaluation ofprocessing methods for biorefineries” (reference CTQ2011-22972), partially funded by the FEDER program of theEuropean Union). Ms. Sandra Rivas thanks the Ministry for herpredoctoral grant.

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Table 2. Values Determined for the Generalized Kinetic Coefficients Measuring the Decomposition of Hexoses and Pentoses

k2iM or k6j

M (L mol−1 h−1)

T (°C) i = glucose i = galactose i = mannose j = xylose j = arabinose

120 0.094 0.127 0.125 0.468 0.208130 0.202 0.245 0.281 0.855 0.454135 0.379 0.437 0.518 1.52 0.825

Figure 6. Experimental and calculated values of HMF, furfural,levulinic acid (LevA), and formic acid (FA). Data obtained at 135 °Cin media containing 4.5% sulfuric acid.

Table 3. Values of the Generalized Kinetic CoefficientsMeasuring the Decomposition of HMF and Furfural

T(°C)

k3M

(L mol−1 h−1)k4M



(L mol−1 h−1)

120 5.66 2.83 0.08 0.18130 10.6 4.07 0.16 0.28135 16.9 5.59 0.33 0.32



http://pubs.acs.org




(4) Rackemann, D. W.; Doherty, W. O. The conversion oflignocellulosics to levulinic acid. Biofuels, Bioprod. Biorefin. 2011, 5,198−214.(5) Galbe, M.; Zacchi, G. A review of the production of ethanol fromsoftwood. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 59, 618−628.(6) Carvalheiro, F.; Duarte, L.; Gírio, F. Hemicellulose biorefineries:A review on biomass pretreatments. J. Sci. Ind. Res. 2008, 67, 849−864.(7) Willfor, S.; Sundberg, K.; Tenkanen, M.; Holmbom, B. Spruce-derived mannans. A potential raw material for hydrocolloids and noveladvanced natural materials. Carbohydr. Polym. 2008, 72, 197−210.(8) Ebringerova, A.; Hromadkova, Z.; Heinze, T. Hemicellulose. Adv.Polym. Sci. 2005, 186, 1−67.(9) Kenne, L.; Rosell, K.-G.; Svensson, S. Studies on the distributionof the O-acetyl groups in pine glucomannan. Carbohydr. Res. 1975, 44,69−76.(10) Price, N. P. J.; Hartman, T. M.; Faber, T. A.; Vermillion, K. E.;Fahey, G. C. Galactoglucomannan Oligosaccharides (GGMO) from amolasses byproduct of pine (Pinus taeda) fiberboard production. J.Agric. Food Chem. 2011, 59, 1854−1861.(11) Gonzalez-Munoz, M.; Alvarez, R.; Santos, V.; Parajo, J.Production of hemicellulosic sugars from Pinus pinaster wood bysequential steps of aqueous extraction and acid hydrolysis. Wood Sci.Technol. 2012, 46, 271−285.(12) Asghari, F.; Yoshida, H. Kinetics of the decomposition offructose catalyzed by hydrochloric acid in subcritical water: Formationof 5-hydroxymethylfurfural, levulinic, and formic acids. Ind. Eng. Chem.Res. 2007, 46, 7703−7710.(13) Hayes, D. J.; Fitzpatrick, S.; Hayes, M. H. B.; Ross, J. R. H. InBiorefineries-Industrial Processes and Products; Kamm, B., Gruber, P.,Kamm, M., Eds.; Wiley-VCH Verlag GmbH: Weinheim, Germany,2008; Vol. 1; Chapter The Biofine Process-Production of Levulinicacid, Furfural, and Formic acid from Lignocellulosic Feedstocks, pp139−164.(14) Girisuta, B.; Janssen, L. P. B. M.; Heeres, H. J. A kinetic study onthe decomposition of 5-hydroxymethylfurfural into levulinic acid.Green Chem. 2006, 8, 701−709.(15) Girisuta, B.; Janssen, L. P. B. M.; Heeres, H. J. Green chemicals:A kinetic study on the conversion of glucose to levulinic acid. Chem.Eng. Res. Des. 2006, 84, 339−349.(16) Patil, S. K. R.; Lund, C. R. F. Formation and growth of huminsvia aldol addition and condensation during acid-catalyzed conversionof 5-hydroxymethylfurfural. Energy Fuels 2011, 25, 4745−4755.(17) Chang, C.; Cen, P.; Ma, X. Levulinic acid production fromwheat straw. Bioresour. Technol. 2007, 98, 1448−1453.(18) Yan, L.; Yang, N.; Pang, H.; Liao, B. Production of levulinic acidfrom bagasse and paddy straw by liquefaction in the presence ofhydrochloride acid. Clean: Soil, Air, Water 2008, 36, 158−163.(19) Fang, Q.; Hanna, M. Experimental studies for levulinic acidproduction from whole kernel grain sorghum. Bioresour. Technol. 2002,81, 187−192.(20) Cha, J.; Hanna, M. Levulinic acid production based on extrusionand pressurized batch reaction. Ind. Crops Prod. 2002, 16, 109−118.(21) Riansa-ngawong, W.; Prasertsan, P. Optimization of furfuralproduction from hemicellulose extracted from delignified palm pressedfiber using a two-stage process. Carbohydr. Res. 2011, 346, 103−110.(22) Marcotullio, G.; de Jong, W. Furfural dormation from D-xylose:The use of different halides in dilute aqueous acidic solutions allowsfor exceptionally high yields. Carbohydr. Res. 2011, 346, 1291−1293.(23) Aida, T.; Shiraishi, N.; Kubo, M.; Watanabe, M.; Smith, R., Jr.Reaction kinetics of D-xylose in sub- and supercritical water. J.Supercrit. Fluids 2010, 55, 208−216.(24) Blumenkrantz, N.; Asboe Hansen, G. New method forquantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem. 1973, 54,484−489.(25) Gonzalez-Munoz, M.; Santos, V.; Parajo, J. Purification ofoligosaccharides obtained from Pinus pinaster hemicelluloses bydiafiltration. Desalin. Water Treat. 2011, 27, 48−53.(26) Garrote, G.; Domínguez, H.; Parajo, J. Kinetic modelling ofcorncob autohydrolysis. Proc. Biochem. 2001, 36, 571−578.

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ANEXO V: Acidic processing of hemicellulosic

saccharides from pine wood: product distribution

and kinetic modeling

Elsevier Editorial System(tm) for Chemical Engineering Journal Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Acidic processing of hemicellulosic saccharides from pine wood: product distribution and kinetic modeling Article Type: Original Article Section/Category: Chemical Reaction Engineering Keywords: Pinus pinaster; kinetic model; levulinic acid; HMF; furfural. Corresponding Author: Dr. Valentin Santos, Corresponding Author's Institution: University of Vigo First Author: Sandra Rivas Order of Authors: Sandra Rivas; Maria J González-Muñoz; Valentin Santos; Juan C Parajó Abstract: Soluble saccharides from Pinus pinaster wood hemicelluloses can be employed to obtain platform chemicals, including levulinic acid and furans. Soluble hemicellulosic saccharides were manufactured from pine wood by two-step aqueous processing: first, water soluble compounds were removed in a mild extraction stage, and the extractive-free wood was employed as a substrate in the second stage (performed under harsher conditions) to convert hemicelluloses into soluble saccharides. Under selected conditions, hemicelluloses were extensively removed from solid phase, and broken down into oligomeric saccharides and monosaccharides. Acetic acid and small amounts of furfural and 5 - hydroxymethylfurfural (HMF) were obtained as reaction co-products. The resulting liquid phase was acidified with sulfuric acid and heated up to reach temperatures in the range 130 - 250 ºC. The concentration profiles of the major compounds involved in the reactions taking place in the media were interpreted assuming the following reactions: conversion of poly- and oligosaccharides into monosaccharides (including hexoses and pentoses), conversion of hexoses into HMF, decomposition of this latter into levulinic and formic acids, dehydration of pentoses into furfural and parasitic reactions leading to the formation of degradation products. Increased temperatures promoted the reactions leading to the formation of furans. The kinetic model predicted a maximum conversion of pentoses into furfural near 80% under conditions leading to 24% conversion of hexoses into HMF. The production of levulinic acid was improved operating at low temperatures for prolonged times. Suggested Reviewers: Florbela Carvalheiro Unidade de Bioenergia, LNEG [email protected] Expertise in biomas treatments and kinetic modeling Troy Runge Department of Biological System Engineering, University of Wisconsin-Madison [email protected]

Knowledge on levulinic acid production from carbohydrates Taku Michael Aida Graduate School of Environmental Studies, Tohoku University [email protected] Kinetic modelling of biomass based transformations Opposed Reviewers:

COVER LETTER

Dear Editor,

We would like to submit our work entitled

Acidic processing of hemicellulosic saccharides from pine

wood: product distribution and kinetic modeling

We would like this article to be considered for publication in Chemical Engineering

Journal.

According to the journal´s guidelines:

(1) Authors have consulted the Guide for Authors in preparing the manuscript.

(2) The manuscript was written in compliance with the Ethics in Publishing Policy

described in the Guide for Authors.

(3) This is the first time the manuscript is submitted.

(4) Suggested reviewers are included: Florbela Carvalheiro, Troy Runge and Taku

Michael Aida. In an attached file additional contact information is included.

(5) Keywords are provided and the manuscript was prepared according to the format

characteristics related in the guidelines.

(6) The article deals with a biorefinery-based utilization of Pinus pinaster. Wood

samples were subjected to consecutive treatments with hot, compressed water, in order

to remove water-solubles in the first step and to cause hemicellulose solubilization in

the second. The obtained liquor after this second step, containing hemicellulose-derived

oligo- and monosaccharides, was reacted in the presence of sulfuric acid at

temperatures up to 250 ºC to convert them into levulinic acid. Concentration profiles

were interpreted by a kinetic model. This model was suitable for estimating the yield of

target products on a quantitative basis.

We hope that this article is of interest for the readers of Chemical Engineering Journal.

Yours sincerely,

Valentín Santos Reyes

Chemical Engineering Department

Faculty of Sciences

Polytechnical Building

Campus As Lagoas. 32004 Ourense

Spain

E-mail: [email protected]

Phone number: +32 988 387047. Fax number: +32 988 387000

*Cover Letter


Florbela Carvalheiro

[email protected]

Laboratório Nacional de Energia e Geologia, I.P. (LNEG), Unidade de Bioenergia, Estrada do Paço do Lumiar, 22, Ed. K2, 1649-038 Lisboa, Portugal Tel: +351 21 0924713; mobile: +351 93 6883692; Fax: +351 21 7163636

Troy Runge

[email protected]

Department of Biological System Engineering, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin 53706, United States

Taku Michael Aida

[email protected]

Graduate School of Environmental Studies, Tohoku University, Aramaki Aza Aoba 6-6-11, Aoba-ku, Sendai 980-8579, Japan Tel.: +81 22 795 5863; fax: +81 22 795 5863

*List of Suggested Reviewers



Highlights

Autohydolysis liquors from Pinus pinaster were subjected to acidic processing.

Treatments were carried out with 1 wt % sulfuric acid at temperatures up to 250 ºC.

Concentration profiles of potential substrates, furans and organic acids were determined.

Data were employed to develop a generalized kinetic model.

The model was suitable for estimating the yield of the target products on a quantitative basis.

*Highlights (for review)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Acidic processing of hemicellulosic

saccharides from pine wood: product

distribution and kinetic modeling

Sandra Rivas,1,2 María Jesús González-Muñoz,1,2 Valentín Santos,1,2* Juan Carlos Parajó1,2

1Chemical Engineering Department, Polytechnical Building, University of Vigo. (Campus

Ourense), As Lagoas, 32004 Ourense, Spain 2CITI-University of Vigo. Tecnopole, San Cibrao das Viñas, 32901 Ourense, Spain

E-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]

Abstract

Soluble saccharides from Pinus pinaster wood hemicelluloses can be employed to obtain

platform chemicals, including levulinic acid and furans. Soluble hemicellulosic saccharides were

manufactured from pine wood by two-step aqueous processing: first, water soluble

compounds were removed in a mild extraction stage, and the extractive-free wood was

employed as a substrate in the second stage (performed under harsher conditions) to convert

hemicelluloses into soluble saccharides. Under selected conditions, hemicelluloses were

extensively removed from solid phase, and broken down into oligomeric saccharides and

monosaccharides. Acetic acid and small amounts of furfural and 5 - hydroxymethylfurfural

(HMF) were obtained as reaction co-products.

The resulting liquid phase was acidified with sulfuric acid and heated up to reach temperatures

in the range 130 - 250 ºC. The concentration profiles of the major compounds involved in the

reactions taking place in the media were interpreted assuming the following reactions:

conversion of poly- and oligosaccharides into monosaccharides (including hexoses and

pentoses), conversion of hexoses into HMF, decomposition of this latter into levulinic and

formic acids, dehydration of pentoses into furfural and parasitic reactions leading to the

formation of degradation products. Increased temperatures promoted the reactions leading to

the formation of furans. The kinetic model predicted a maximum conversion of pentoses into

furfural near 80% under conditions leading to 24% conversion of hexoses into HMF. The

production of levulinic acid was improved operating at low temperatures for prolonged times.

*ManuscriptClick here to view linked References

http://ees.elsevier.com/cej/viewRCResults.aspx?pdf=1&docID=26573&rev=0&fileID=832364&msid=763E0621-2EA6-4711-9386-59B2CE5369EC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Keywords: Pinus pinaster, kinetic model, levulinic acid, HMF, furfural.

*Corresponding author.

Valentín Santos Reyes

[email protected]

Chemical Engineering Department. Polytechnical Building. University of Vigo-Campus Ourense.

As Lagoas. 32004, Ourense. Spain. Phone: +34 988387047


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

1. Introduction

The interest in manufacturing chemicals and fuels from renewable feedstock is increased by

sustainability issues involving the utilization of fossil resources. Nowadays, just about 5% of

chemicals are produced from renewable resources. Among them, lignocellulosic biomass is

largely available, widespread, and would allow a reliable supply. Particular economic

advantages could be obtained when cheap raw materials, such as agricultural wastes or forest

residues are employed as substrates [1]. In this context, the development of cost-effective

applications for lignocellulosic biomass is a crucial aspect. FitzPatrick et al. [2] reviewed the

treatments applicable to lignocellulosic materials for manufacturing various value-added

products from a biorefinery perspective, and discussed the existing biorefinery schemes.

Forests are important sources of lignocellulosic biomass, and softwoods are the dominant type

of trees in the Northern hemisphere [3]. Multistep processing of wood may result in the

separation of the structural components (cellulose, hemicellulose and lignin), enabling their

separate utilization. Some schemes proposed for softwood fractionation involve the

separation of hemicelluloses in a preliminary process stage [4, 5].

Softwood hemicelluloses are made up of a number of structural units, including hexoses and

pentoses. Pinus pinaster wood hemicelluloses include several polysaccharides, among which

glucomannans substituted with acetyl and galactosyl moieties are predominant, whereas the

presence of arabinoglucuronoxylans was also reported [6]. Pine mannans, including

glucomannans (GM) and/or galactoglucomannans (GGM) possess backbones made up of

randomly distributed D-glucose and D-mannose structural units linked by β (1 → 4) glycosidic

bonds, which can be substituted with irregularly distributed acetyl groups [7].

González-Muñoz et al. [8] considered the solubilization of Pinus pinaster wood hemicelluloses

by hot, compressed water (autohydrolysis or hydrothermal processing). Under selected

conditions, hemicellulose-derived oligosaccharides were obtained at high yield, together with

monosaccharides, acetic acid (coming from acetyl groups linked to hemicelluloses) and small

quantities of furans (furfural and hydroxymethylfurfural, denoted HMF, from pentoses and

hexoses, respectively).

Levulinic acid (LevA) is a versatile platform chemical that has been considered a basic chemical

raw material for decades due to its reactivity, which make it suitable as an starting compound

for the manufacture of high-volume organic chemicals employed as solvents, food flavoring

agents, monomers for polymer synthesis, plasticizers, herbicides, and antifreeze and

pharmaceutical agents [9-11]. LevA production from lignocellulosic biomass has been

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

considered in literature [12-14]. The US Department of Energy identified LevA as one of the

“12 top value-added chemicals from biomass” [15].

The current LevA market is limited by a number of causes, including: a) the cost of raw

materials, b) the equipment costs (including reactor and recovery facilities), c) the high

temperatures required, d) issues related to waste disposal and catalyst recovery, and e) low

yields, due to the co-production of formic acid and the formation of dark-colored solids

(humins) by parasitic reactions [11, 16]. Even though high purity LevA is commercially

produced from maleic anhydride, the comparatively lower cost of lignocellulosic materials

(typically, less than 5 % of the one of maleic anhydride) makes the production of LevA from

biomass interesting [11].

LevA can be obtained by acidic processing of biomass [17-20]. Recent studies in this field deal

with the improvement in yields and selectivity. Rackeman and Doherty [11] reviewed the

technologies for LevA manufacture from lignocellulosics, including the utilization of

homogeneous acid catalysts, ionic liquids, biphasic media or heterogeneous catalysts.

However, little information has been reported before on the manufacture of LevA from wood

hemicelluloses. In a previous study from our research group, LevA was obtained from pine

wood operating in aqueous media at temperatures in the range 120 - 135 ºC. Under selected

conditions, LevA was produced at 66% of the stoichiometric amount [21].

Processing of sugars in acidic media leads to the formation of LevA through a complex

mechanism involving hexose dehydration to yield HMF, rehydration of HMF leading to the

formation of LevA and formic acid (FA), and parasitic reactions leading to the formation of

humins [11]. In this field, Girisuta et al. [16] reported a deep study on the acid-catalyzed

decomposition of HMF in a batch reactor; whereas Patil and Lund [22] considered the

formation of humins from HMF, and reported that humins were derived from HMF and not

from LevA or FA. Recently, Van Putten et al. [23] reviewed the role of HMF as a versatile and

renewable platform chemical, as well as on process technology and underlying chemistry and

applications.

Yang et al. [20] studied the two step hydrolysis of cotton straw in acidic media: the first stage

was optimized for hemicellulosic sugar production, whereas the solid residues were treated

with dilute acid in the second step to convert cellulose into levulinic and formic acids. LevA

yield was 31.1 mol% of the theoretical when working at 180 ºC and 0.2 M of sulfuric acid for 20

min. Chang et al. [24] obtained LevA from the cellulose present in wheat straw at 68.8%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

conversion respect to the theoretical value, operating in media containing 3.5% sulfuric acid at

210 ºC for 37.6 min.

In a related way, in acidic media pentoses can be dehydrated to furfural, which in turn can be

converted into FA and other compounds generated from side reactions. Pentoses can be

obtained from C5 hemicellulosic polymers in biomass by catalyzed hydrolysis reactions,

providing a potential substrate for furfural production. For example, delignified palm fiber

(containing xylan) was hydrolyzed in acidic media to yield xylose, which was converted into

furfural in a subsequent step [25]. O´Neill et al. [26] studied the kinetics of xylose dehydration

into furfural in aqueous media catalyzed by zeolites, and proposed a reaction scheme based on

dehydration of xylose into furfural, fragmentation of furfural into organic acids,

oligomerization of furfural yielding bi- and tridimensional furylic species, and complete

dehydration of organic acids to chars. Yemis and Mazza [27] provided information suitable for

understanding the effect of operational parameters on furfural production from biomass using

microwave heating.

This work provides an experimental assessment on the acidic processing of hemicellulose-

derived saccharides under harsh conditions (temperatures up to 250 ºC), and a kinetic

interpretation of data. The reactions considered include hydrolysis of poly- and

oligosaccharides into sugars (including hexoses and pentoses), decomposition of sugars into

furans, and conversion of these latter in a number of compounds (including LevA and FA).

2. Materials and methods

2.1 Materials

Pinus pinaster wood chips were kindly provided by Orember-Finsa, Ourense (Spain). Samples

were air-dried, milled to a particle size below 8 mm, homogenized in a single lot to avoid

compositional differences among samples and stored until use.

2.2 Experimental methods

2.2.1. Aqueous processing

Pinus pinaster wood samples were subjected to two sequential water treatments. In the first

one, performed to remove extractives, samples were mixed with distilled water at a liquid to

solid mass ratio of 8:1 g/g (oven dry basis) in a 3.75 L stainless steel reactor (Parr Instrument

Company, Moline, Illinois). The reactor was heated up to 130 ºC, and then the medium was

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

cooled immediately and filtered. Solids from this treatment were washed, air dried and

subjected to a second aqueous treatment (in the same reactor, using the same liquid to solid

ratio) at 175 ºC for 26 minutes, and cooled. These experimental conditions are known to be

optimal for converting hemicelluloses into soluble poly- and oligosaccharides (here denoted

POS) (González-Muñoz et al., 2011 and 2012). POS were employed as reaction substrates in

further experiments.

2.2.2 Acid-hydrolysis treatments

Sulfuric acid was added to POS-containing liquors at 1 wt%, and the resulting solutions were

heated in a 0.6 L stainless steel reactor (Parr Instrument Company, Moline, Illinois).

Temperature was monitored using an inner thermocouple and controlled by a proportional

integral derivative module. The media were heated following the standard temperature profile

of the reactor (shown in Figure 1) up to reach the target temperature (in the range 130-250ºC),

and cooled immediately. Experiments were denoted according to the maximal temperature

achieved. Isothermal treatments at 135 ºC were carried out as per Rivas et al. (2013). Sulfuric

acid was added to POS-containing liquors at 1 wt% and treated in autoclave. The reaction time

indicates duration of the isothermal regime (time zero was set when temperature reached 135

ºC).

Samples from the various reaction media were assayed for composition by HPLC (see below).

[Figure 1]

2.2.3 Analytical methods

Samples of autohydrolysis liquors (before or after quantitative posthydrolysis to convert POS

into monosaccharides, see below) and solutions obtained in acid hydrolysis treatments were

neutralized with BaCO3, filtered through 0.45 µm acetate membranes, and assayed by HPLC for

glucose, xylose, mannose, galactose, and arabinose using an Agilent 1100 instrument fitted

with a Refractive Index Detector and a 300x7.8 mm CARBOsep CHO 682 column with a guard

column (Transgenomic, Glasgow, U.K.) operating at 80 ºC. Distilled water was used as the

mobile phase (flow rate, 0.4 mL/min). Furfural, HMF, FA, acetic acid and LevA were

determined using an Aminex HPX-87H column (BioRad, Life Science Group Hercules, CA) and

the following conditions: mobile phase, 0.006 N H2SO4; flow rate, 0.6 mL/min; and

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

temperature, 60 ºC. Concentrations of POS and bound acetyl groups were determined on the

basis of the increases in the concentrations of monosaccharides and acetic acid after a

quantitative posthydrolysis (performed with 4% H2SO4 at 121 ºC for 20 min, in triplicate).

Uronic acids were determined spectrophotometrically by the method of Blumenkrantz and

Asboe-Hansen [28]. The content of non-volatile compounds (NVC) of liquors was determined

by oven-drying aliquots at 105 ºC until constant weight.

2.2.4 Calculation of kinetic parameters

The differential equations defining the kinetic model were solved numerically using the fourth

order Runge–Kutta method. The kinetic parameters were calculated by minimizing the sum of

the squares of deviations between experimental and calculated data, using commercial

software (Microsoft Excel, Microsoft) with a built-in optimization routine (Solver) based on the

Newton’s method.

3. Results and discussion

3.1 Composition of pine wood and autohydrolysis liquors

The compositional results determined for Pinus pinaster wood (expressed as weight percent,

o.d. basis) were as follows: glucosyl units present in cellulose and hemicelluloses, 36.7%;

xylosyl units, 4.7%; galactosyl units, 3.2%; arabinosyl units, 1.3%; mannosyl units, 9.4%; acetyl

groups, 1.2%; Klason lignin, 34.1%; uronyl units, 3.9%; extracts, 4.7%; ashes, 0.3%, and other

fractions (by difference), 0.5%. These values are in the range reported for softwoods.

Pinus pinaster wood contains water-soluble extractives, which were removed by aqueous

extraction at 130 °C. In this stage, hemicelluloses were not significantly dissolved. In the

second step (autohydrolysis, using extractive-free wood as a substrate), hemicelluloses were

extensively solubilized to yield POS, which were further employed as substrates for acidic

processing.

The autohydrolysis operational conditions were the same reported as optimal for POS

production from pine wood [8, 29]. The composition of autohydrolysis liquors (in mmol/L) was

as follows: glucose (G), 1.05; xylose (X), 7.82; galactose (Ga), 3.15; arabinose (Ar), 10.74;

mannose (Mn), 1.84; acetic acid (AcH), 4.14; glucosyl units in POS (GOS), 10.57; xylosyl units in

POS (XOS), 19.22; galactosyl units in POS (GaOS), 13.00; arabinosyl units in POS (ArOS), 1.31;

mannosyl units in POS (MnOS), 46.57; acetyl groups in POS (AcOS), 16.21; uronic acids (UA),

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

4.04; furfural (Fur), 1.35; FA, 7.17; HMF, 0.32. The identified compounds accounted for about

95 wt% of the total non-volatile compounds (NVC).

3.2 POS processing in acidic media

POS were rapidly converted into monosaccharides upon non-isothermal acidic processing,

being depleted when the reaction media reached 170 ºC. Monosaccharides behaved as

reaction intermediates, reaching maximum concentrations under conditions of intermediate

severity. Depletion of arabinose, glucose and galactose was observed when the media reached

230 ºC, while xylose and mannose presented a slightly higher lability, reaching complete

conversion at 210-220 ºC. At 205 ºC, the HMF concentration was 1.70 g/L (13.5 mmol/L,

corresponding to 17.7% of the stoichiometric value, calculated on the basis of the initial

amounts of hexose units in POS and free hexoses). The LevA concentration increased rapidly

from 180 to 230 ºC, and then reached a plateau. HMF was totally consumed under the best

conditions for LevA production, suggesting that LevA was stable even under the harshest

conditions used in this study (defined by a temperature of 250 ºC). This finding is in agreement

with reported results [21, 30]. The highest experimental LevA concentration accounted for

46% of the stoichiometric value, confirming the existence of parasitic decomposition reactions.

The LevA conversion was lower than the best result (62%) reported for operation at

temperatures in the range 120-135 ºC in media containing 0.5-10% sulfuric acid [21],

confirming that increased temperatures promoted the conversion into products different from

LevA.

The furfural concentration increased markedly when temperature increased from 170 to 215

ºC, and decreased under more severe conditions with a slower kinetics than the one observed

for HMF decomposition. The comparatively higher stability of furfural in acidic media in

comparison with HMF was already reported for temperatures in the range 120 - 135 ºC [21]. In

this work, the maximum furfural concentration (2.4 g/L or 25.0 mmol/L, obtained at 215 ºC)

corresponded to 60.5% conversion of the potential substrates (pentose units in POS and

pentoses) into furfural.

The concentration profile of FA was closely related to the one described for LevA, beyond the

differences in the respective initial concentrations (it can be noted that formic acid is already

present in the autohydrolysis liquors, due to the hydrolysis of formyl groups).

Acetic acid was produced from the acetyl groups present in hemicelluloses and POS, with

increasing concentrations up to 160 ºC, and reaching then a plateau.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

3.3 Kinetic modeling

Pine wood autohydrolysis liquors contained POS made up of hexoses and pentoses (derived

from GM, GGM and arabinoxylan, respectively) as major components. The experimental data

showed that POS processing in acidic media led first to the formation of the corresponding

monosaccharides, which undergo decomposition reactions (different for hexoses or pentoses).

Hexoses dehydrated in acidic media leading to the formation of HMF, which is further

decomposed. On the basis of the results reported by Girisuta et al. [16], who found that more

than 90% selectivity of HMF conversion into LevA could be reached even at high temperatures

operating with small HMF concentrations, humin formation from HMF was not considered in

this work.

Following a related mechanism, pentoses yielded furfural and other products. Parasitic

reactions led to the formation of insoluble humic substances from furans, limiting the yields of

the target products. Even though FA formation from furfural has been reported in some cases,

recent studies [14, 21] confirmed a minimal participation of this reaction. Based on the close

interrelationship between the concentration profiles of LevA and FA, FA formation from

furfural was not considered in this work. The decreased furfural concentrations observed

under harsh conditions were ascribed to parasitic reactions leading to other decomposition

products.

Figure 2 shows the kinetic model employed in this work. Individual reactions were assumed to

follow first-order kinetics with an Arrhenius-type dependence on temperature.

[Figure 2]

The above hypotheses lead to the following set of differential equations:

Eq. 1

Eq. 2

Eq. 3

Eq. 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Eq. 5

Eq. 6

Eq. 7

Eq. 8

Eq. 9

Eq. 10

Eq. 11

Eq. 12

Eq. 13

The set of equations was solved on the basis of the temperature profile shown in Figure 1. The

iterative calculations involved in the determination of the kinetic coefficients yielded different

pairs of values (activation energies/preexponential factors) for given reactions that provided

similar goodness of fitting. In order to improve the reliability of calculations, an additional

experiment was performed under isothermal conditions at 135 ºC, and the corresponding

experimental data were employed (together with the ones obtained in non-isothermal

experiments) for kinetic calculations. Figure 3 shows the agreement between experimental

and predicted data obtained in the isothermal experiment, characterized by low HMF

concentrations that confirmed its comparatively fast decomposition into LevA.

The experimental and predicted data obtained in non-isothermal treatments are shown in

Figure 4. In comparison with Figure 3, higher HMF concentrations were achieved, indicating

that temperature caused more marked effects on HMF production from hexoses than on the

reactions involving HMF decomposition. As a consequence, higher temperatures improved the

HMF yield.

[Figure 3]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

[Figure 4]

Table 1 lists the values calculated for the activation energies and pre-exponential factors of the

reactions involved in the degradation of hexose units in POS and hexoses. Under the

conditions of the isothermal experiment, the kinetic coefficients calculated for POS hydrolysis

at 135 ºC (k1GOS= 10.6 h-1, k1GaOS= 26.4 h-1 and k1MnOS= 21.5 h-1) were significantly higher than the

ones governing the decomposition of hexoses into HMF (k2GOS= 0.0214 h-1, k2GaOS= 0.0322 h-1

and k3MnOS= 0.0382 h-1). Higher temperatures resulted in a very fast decomposition of POS

(governed by coefficients k1i and k1j for hexose and pentose structural units, respectively).

Concerning the formation and decomposition of HMF, the relative values of the activation

energies of coefficients k2i (measuring the HMF formation from hexoses) and k3i (measuring

the formation of degradation products from hexoses) justifies the preferential formation of

this latter type of products at high temperatures. For example, the ratio k2i /k3i reached values

in the range 2.08 - 2.55 at 120 ºC, in comparison with 0.30 - 0.97 at 250 ºC. As the formation of

HMF depends on several kinetic parameters (see Figure 2), the temperature dependence of

each of them plays a role on the HMF yield. In overall terms, the most influential effect is the

comparatively higher increase in the rate of HMF formation with temperature, in a way that

higher temperatures increase the optimal HMF yields (which are always limited due to the

participation of the rest of reactions).

[Table 1]

The kinetic model can also be used to assess the effects of time and temperature on the

production of LevA. Starting from a media with the same composition than the autohydrolysis

liquors, the maximum molar conversions achievable at temperatures in the range 130 - 250 ºC

at different reaction times can be directly calculated. As an example, Figure 5 shows the results

predicted for isothermal treatments when the reaction time was fixed in the value leading to

99.9% hexose conversion. The time needed to achieve almost complete hexose conversion

decreased almost exponentially with temperature, whereas the conversion into LevA

decreased with temperature in a fairly linear way. The highest conversion (66.7% after 235

hours) was predicted for the lowest temperature considered (130 ºC), in agreement with the

findings reported in a previous study [21]. In experiments performed under mild conditions,

the time needed to reach the maximum LevA conversion at a given temperature can be

shortened by increasing the sulfuric acid concentration, even though this would increase the

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

corrosion problems [21]. A compromise solution based on an intermediate duration of

treatments (5 hours) and an intermediate temperature (170 ºC) would result in about 53%

LevA conversion.

[Figure 5]

Similarly, the production of HMF from autohydrolysis liquors can be assessed by model

calculations. Operating at 250 ºC under isothermal conditions (see Figure 6b), the reaction

proceeded fast and resulted in a limited optimal HMF conversion (24.3 % after 5 sec).

Isothermal operation at 150 ºC was less favourable for HMF production (see Figure 6a),

confirming the temperature variation pattern commented above.

[Figure 6]

Concerning the decomposition of pentoses, Figure 7 shows the experimental and predicted

data for the isothermal processing of autohydrolysis liquors at 135 ºC. Pentoses presented a

faster decomposition rate than hexoses, and the formation of the corresponding furan

(furfural) proceeded at a higher yield. Table 2 lists the values of the kinetic parameters,

whereas Figure 8 shows the experimental and calculated concentration profiles determined

for pentose units in POS, pentoses and furfural in non-isothermal experiments. Furfural

decomposition was important just at temperatures above 210 ºC. The values of the kinetic

parameters governing the decomposition of AraOS and XOS could not be calculated accurately

due to the low concentration (in the case of AraOS) and to the fast decomposition (in both

cases). The kinetic coefficient involved in XOS decomposition showed values 5-10 times higher

than the ones governing the decomposition of hexose oligomers. For example, k1XOS was

125.2 h-1 at 135 ºC. As the activation energies were higher for k2j than for k3j, the former was

more sensitive to temperature. The values of the k2j/k3j ratio varied from 0.59 h-1 (at 120 ºC) up

to 5.39 h-1 (at 250 ºC) in the case of xylose, and from 0.62 h-1 to 4.12 h-1 in the case of

arabinose at the same temperatures. In comparison, a lower activation energy was

determined for furfural decomposition, in agreement with the limited furfural degradation

observed even at high temperatures. As an overall trend, high temperatures improved the

achievable furfural yield.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

[Figure 7]

[Figure 8]

[Table 2]

Based on the values of the kinetic parameters listed in Table 2, the effects of temperature and

reaction time on the maximum achievable furfural concentration can be assessed on a

quantitative basis. Figure 9 shows the temperature dependence of the maximum molar

conversion of potential substrates (pentoses in POS and pentoses). The maximum furfural

conversion increased with temperature from 18.2% at 130 ºC up to 78.2% at 250 ºC, whereas

the time needed to reach the maximum furfural concentration dropped exponentially with

temperature (from 14.2 hours at 130 ºC to 0.005 hours at 250 ºC), and the proportion of

unreacted substrates under the same conditions decreased steadily with temperature.

[Figure 9]

As model cases for mild and harsh conditions, Figures 10a and 10b show the concentration

profiles calculated for isothermal operation at 150 and 230 ºC, respectively. In the experiment

at 150 ºC, the maximum furfural concentration was limited, in part because an important part

of substrates remained unreacted at this time; whereas longer reaction times resulted in

important furfural degradation as well as in increased conversion of substrates. Operating at

230 ºC, the furfural concentration reached higher values, and almost total substrate

consumption was observed when the maximum furfural concentration was achieved. In

comparison, arabinose presented a slower conversion rate than xylose.

[Figure 10]

Figure 11 shows the experimental concentrations of acetyl groups linked to POS (AcOS) and

acetic acid (AcH). A close relationship between both concentration profiles can be observed, as

the increase in acetic acid concentration is caused by AcOS hydrolysis. Complete AcOS

conversion was achieved under conditions of intermediate severity, and the acetic

concentration remained fairly constant after achieving its maximum value. The acetic acid

generation was modeled using a simple first order reaction:

AcOS AcH Eq. 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Fitting of data provided values of the activation energy (104.8 kJ/mol) and Ln k0 (34.8, when k0

is expressed in h-1).

[Figure 11]

4. Conclusions

Pinus pinaster wood samples were subjected to water extraction to remove extractives, and

the extractive-free wood was used as a substrate for hydrothermal processing. The resulting

liquid phase contained a mixture of POS, pentoses and hexoses coming from the hydrolytic

breakdown of hemicelluloses. Sulfuric acid (1% w/w) was added to the solution, and the media

were heated up to 250 ºC. The concentrations of oligomers, monomers, HMF, furfural, LevA,

acetic acid and FA were determined, and the concentration profiles were interpreted by a

kinetic model assuming the hydrolysis of oligomers into monomers, the conversion of hexoses

into HMF (which decomposed into LevA and FA upon rehydration), the conversion of pentoses

into furfural, and parasitic reactions leading to the formation of decomposition products from

sugars and furfural.

The LevA yield decreased with temperature. Higher temperatures favored preferentially the

decomposition of hexoses into humins respect to HMF formation. Operating at 130 ºC, the

maximum molar conversion of hexoses into LevA (66.7 %) was obtained at a very prolonged

reaction time (235 hours) according to the model. A lower LevA conversion (53.0 %) can be

achieved after 5 hours operating at 170 ºC. Oppositely, the furfural yield was favored by

temperature, with 78.2% conversion of potential substrates into furfural at 250 ºC. No

satisfactory compromise between the production of LevA and furfural could be achieved,

owing to the very different kinetic behavior. A modest HMF conversion (24.3 %) can be

achieved at 250 ºC at a very short time. Operating at temperatures leading to high furfural

yields, HMF conversions around 20% could be achieved.

5. Acknowledgement

Authors are grateful to the Spanish “Ministry of Science and Innovation” for supporting this

study, in the framework of the research Project “Development and evaluation of processing

methods for biorefineries” (reference CTQ2011-22972), partially funded by the FEDER program

of the European Union). Ms. Sandra Rivas thanks the Ministry for her pre-doctoral grant.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

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Table 1. Kinetic parameters calculated for

reactions involving hexoses and HMF

ln k0 (k0 in h-1

) EA (kJ/mol)

k1GOS 35.7 113.1

k1GaOS 33.5 103.1

k1MnOS 32.7 99.8

k2G 36.8 137.9

k2Ga 42.8 156.3

k2Mn 40.2 148.0

k3G 44.5 166.3

k3Ga 49.0 179.6

k3Mn 42.5 158.0

k4 21.7 72.3

Table(s)

Table 2. Kinetic parameters calculated for reactions involving pentoses and furfural

Ln k0 (k0 en h-1) EA (kJ/mol)

k1XOS 27.9 78.4

k1AraOS - -

k2X 36.8 158.0

k2Ara 42.8 141.3

k3X 44.5 128.9

k3Ara 49.0 116.4

k5 20.6 79.0

Figure Captions

Figure 1. Heating profile for non-isothermal experiments.

Figure 2. Kinetic model employed for data interpretation.

Figure 3. Experimental and calculated concentrations of hexoses, HMF and LevA

operating under isothermal conditions at 135 ºC.

Figure 4. Experimental and calculated concentrations of hexoses in POS, hexoses,

HMF and LevA operating under non-isothermal conditions.

Figure 5. Influence of temperature on the molar conversion of the potential substrates

into LevA, and time needed to achieve 99.9% substrate conversion.

Figure 6. Calculated concentration profiles of potential substrates for LevA production

and derived products in isothermal operation at a) 150 ºC, and b) 250 ºC.

Figure 7. Experimental and calculated concentrations of pentoses and furfural in

isothermal operation at 135 ºC.

Figure 8. Experimental and calculated concentrations of pentoses in POS, pentoses

and furfural in experiments carried under non-isothermal conditions.

Figure 9. Maximum molar conversion of potential substrates into furfural predicted for

isothermal treatments, and reaction time and substrate conversion under the same

conditions.

Figure 10. Calculated concentration profiles of potential substrates for furfural

production and obtained furfural in isothermal operation at a) 150 ºC, and b) 230 ºC.

Figure 11. Experimental and calculated concentration profiles of AcOS and AcH in non-

isothermal treatments.

Figure(s)

Figure 1

50

100

150

200

250

300

0 0.1 0.2 0.3 0.4

Tem

pe

ratu

re (º

C)

Time (h)

Figure(s)

Figure 2

C6 Oligomersk1i k2i

Hexoses HMF LevA + FAk4

Decompostion products

k3i

k2jPentoses Furfural

k5

C5 Oligomers

k1j

(i: Glucose, Galactose or Mannose)

(j: Xylose or Arabinose)

k3j

Figure 3

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10 12

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

)

Time (hours)

Man exp Man calc

Gal exp Gal calc

G exp G calc

HMF HMF calc

LevA LevA calc

Figure 4

0

10

20

30

40

50

60

130 150 170 190 210 230 250

Co

nc

en

tra

tio

n (m

mo

l/L

)

Temperature (ºC)

MnOS exp MnOS calc

GaOS exp GaOS calc

GOS exp GOS calc

Mn exp Mn calc

Ga exp Ga calc

G exp G calc

HMF exp HMF calc

LevA exp LevA calc

Figure 5

25

35

45

55

65

75

85

95

0

50

100

150

200

250

120 140 160 180 200 220 240 260M

ola

r co

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to L

evA

(%

)

Tim

e (

ho

urs

)

Temperature (ºC)

Time

Molar conversion

20

30

40

50

60

70

0

1

2

3

4

5

170 190 210 230 250

Mo

lar

con

vers

ion

into

Le

vA (

%)

Tim

e (

ho

urs

)

Temperature (ºC)

Figure 6

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

Time, hours

G Mn

Ga HMF

LevA

a Temperature= 150 ºC

0

10

20

30

40

50

60

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

Time, hours

G Mn

Ga HMF

LevA

b Temperature= 250 ºC

Figure 7

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

Time (hours)

X exp X calc

Ar exp Ar calc

Furf exp Furf calc

Figure 8

0

5

10

15

20

25

30

35

40

130 150 170 190 210 230 250

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

Temperature (ºC)

X exp X calc

XOS exp XOS calc

Ar exp Ar calc

ArOS exp ArOS calc

Furf exp Furf calc

Figure 9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

2

4

6

8

10

12

14

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120 140 160 180 200 220 240 260

Mo

lar

con

vers

ion

of

pe

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rfu

ral (

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ose

(m

mo

l)

Temperature (ºC)

Time

Residual xylose

Residual arabinose

Molar conversion to furfural

Figure 10

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10 12 14

Co

ncen

trati

on

, m

mo

l/L

Time (hours))

Xylose

Arabinose

Furfural

a Temperature= 150 ºC

0

5

10

15

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35

0.000 0.010 0.020 0.030

Co

ncen

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on

, m

mo

l/L

Time (hours))

Xylose

Arabinose

Furfural

b Temperature= 230 ºC

Figure 11

0

5

10

15

20

25

30

120 140 160 180 200 220 240 260

Co

nc

en

trati

on

(m

mo

l/L

)

Temperature (ºC)

AcOS exp

AcOS calc

AcH exp

AcH calc

ANEXO VI: Production of furans from

hemicellulosic saccharides in biphasic reaction

systems

DOI 10.1515/hf-2013-0017 Holzforschung 2013; 67(8): 923–929

Sandra Rivas, María Jesús González-Muñoz, Valentín Santos and Juan Carlos Parajó*

Production of furans from hemicellulosic saccharides in biphasic reaction systems

Abstract: Furans (furfural and hydroxymethylfurfural) are the results of dehydration of monosaccharides, which can be obtained by acid hydrolysis of wood or other lig-nocellulosic materials. In this work, Pinus pinaster wood was subjected to aqueous autohydrolysis processing to obtain dissolved hemicellulose-derived polymeric or oligomeric saccharides made up of mannosyl, glucosyl, galactosyl, xylosyl, and arabinosyl structural units. The aqueous liquors were then heated in the presence of sul-furic acid and methyl isobutyl ketone to obtain furans. The effects of selected operational variables, such as the ratio of organic to aqueous phase, temperature, and reaction time, were assessed by empirical modeling in terms of the conversion into furans and levulinic acid. The maximum furfural conversion (71.4%) was predicted to occur operating at 165°C and a ratio of organic to aque-ous phase of 2 for 68.5 min. In additional experiments, dimethyl sulfoxide and/or 1-butanol were added to the aqueous phase and the change in furan conversion rates was observed.

Keywords: autohydrolysis, biphasic system, furfural, hemicelluloses, hydroxymethylfurfural (HMF), pinewood

*Corresponding author: Juan Carlos Parajó, Chemical Engineering Department, Polytechnical Building, Campus Ourense, University of Vigo, 32004 Ourense, Spain, e-mail: [email protected] Rivas, María Jesús González-Muñoz and Valentín Santos: Chemical Engineering Department, Polytechnical Building, Campus Ourense, University of Vigo, 32004 Ourense, Spain; and CITI, Avda. Galicia, n° 2, Tecnopole, San Cibrao das Viñas, 32900 Ourense, Spain Juan Carlos Parajó: CITI, Avda. Galicia, n° 2, Tecnopole, San Cibrao das Viñas, 32900 Ourense, Spain

IntroductionThe limited availability of fossil fuels and their increas-ing price are the motives for the search of alternative bio-based materials for the manufacture of fuels, chemi-cals, and materials. The worldwide biomass increment is estimated to be approximately 170 billion tons year-1,

of which only 3% to 4% is used for food and nonfood purposes (Corma et al. 2007). It is generally accepted that food crops are undesirable feedstock for chemical industry, because their extensive utilization leads to food shortage. On the contrary, lignocellulosic materials (including wood) are abundant, cheap, and widespread with a high potential for manufacturing biofuels, value-added chemicals, and materials. An integrated utiliza-tion of wood can be achieved by multistep processing, which enables the simultaneous manufacture of market-able products from cellulose, hemicelluloses, and lignin as its structural components. These ambitious efforts, some of them in the context of pulping, are described as biorefinery.

Softwoods are the dominant source of pulp industries in the Northern Hemisphere (Galbe and Zacchi 2002). The process can be improved by the separation of a part of hemicelluloses before pulping (Carvalheiro et al. 2008; Leschinsky et al. 2008a,b; Willför et al. 2008; Mendes et al. 2009; Hörhammer et al. 2011; Song et al. 2011; Rodríguez-López et al. 2012; Saukkonen et al. 2012). The hemicelluloses of softwoods are made up of a number of polysaccharides, among which glucomannans substi-tuted with acetyl and galactosyl moieties are predomi-nant followed by arabinoglucuronoxylans (Ebringerová et al. 2005). The backbone of pine mannans is made up of randomly distributed D-glucose and D-mannose struc-tural units linked by β(1→4) glycosidic bonds, substituted with irregularly distributed acetyl groups (Kenne et al. 1975).

González-Muñoz et al. (2012) studied the optimal conditions for producing soluble saccharides from Pinus pinaster hemicelluloses by processing with hot and com-pressed water (autohydrolysis). Under the best opera-tional conditions, soluble saccharides were obtained at high yield, together with monosaccharides, acetic acid, and small quantities of furfural (F) and 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (HMF), generated by dehydration of pen-toses and hexoses, respectively.

Furans (including F and HMF) have a multitude of applications for the manufacture of fine chemicals and plastics (Chheda et al. 2007a; Rackemann and Doherty 2011; Lange et al. 2012; Zhang et al. 2012). In aqueous

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924 S. Rivas et al.: Furans from pine hemicelluloses

media catalyzed by acids, the rehydration of F leads to formic acid (FA) and that of HMF results in the formation of levulinic acid (LevA) and FA.

The yields of F and HMF from pentoses and hexoses are limited not only by reactions leading to FA and LevA but also to insoluble compounds known as humins (Girisuta et al. 2006a,b). Lü and Shaka (2012) found isomerization between glucose and mannose in hot compressed water treatments, whereas galactose was isomerized to taga-tose and talose, and small amounts of F were produced from hexoses by fragmentation reactions. The fundamen-tal chemistry underlying the catalytic transformations of biomass-derived oxygenated feedstocks (including sugars and sugar alcohols) into value-added chemicals and fuels has been revised by Chheda et al. (2007a).

Biphasic systems show potential for minimizing side reactions and improving the yields of the target products. The solvents employed for extraction of furans and furan derivatives include tetrahydrofuran, 2-sec-butylphenol, and methyl isobutyl ketone (MIBK) (Román-Leshkov et al. 2006; Weingarten et al. 2010; Pagán-Torres et al. 2012). Modification of the organic and/or aqueous phases may result in improved yields and/or selectivities. Dimethyl sulfoxide (DMSO) and 1-butanol (ButOH) have been employed to limit the rehy-dration reactions (Román-Leshkov et al. 2006; Chheda et al. 2007b; Pagán-Torres et al. 2012) or to improve the extraction selectivity. Román-Leshkov et al. (2006) obtained high HMF selectivity operating with fructose in a two-phase reactor containing DMSO and/or poly(vinyl-2-pyrrolidione) in the aqueous phase, whereas the organic phase was made up of MIBK and ButOH. The same solvents were employed by Chheda et al. (2007b) in experiments with a number of carbohydrates. In a related work, Weingarten et al. (2010) reported a kinetic model for the dehydration of xylose to F in a biphasic batch reactor under microwave heating.

The aim of this work was to optimize the production of furans (F and HMF) and/or LevA from hemicellulose-derived saccharides obtained by aqueous processing of P. pinaster wood. In a first set of experiments, the conversion of saccharides into the target products was carried out in a two-phase reactor containing autohy-drolysis liquors, sulfuric acid, and MIBK. The influence of selected variables – the ratio of organic to aqueous phase (OAR), temperature (T), and reaction time (t) – on the composition of the resulting products. For the empir-ical modeling, the response surface methodology (RSM) was applied. In additional experiments, DMSO and ButOH were used as cosolvents to explore their effects on furan conversions.

Materials and methods

Raw materialPinus pinaster wood chips were kindly provided by Orember-Finsa (Ourense, Spain). Samples were air-dried at room temperature until achieving constant moisture, milled to a particle size below 8 mm, and homogenized in a single lot to avoid compositional differences among samples.

Aqueous extraction and autohydrolysisPinus pinaster samples were first subjected to aqueous extraction. Samples (equivalent to 220 g oven-dried wood) were mixed with dis-tilled water at a liquid to solid mass ratio of 8:1 (g/g, oven dry basis) in a 3.75 l stainless steel reactor (Parr Instrument Co., Moline, IL, USA). The reactor was heated up to 130°C (heating time of 15.2 min starting at 60°C). Once the target temperature was reached, the medium was immediately cooled and filtered. Water-extracted solids were exten-sively washed with hot water, air dried, and subjected to a second aqueous treatment (autohydrolysis) in the same reactor (using same liquid-to-solid ratio) at 175°C for 26 min. These experimental condi-tions are optimal for converting hemicelluloses into saccharides, including polysaccharides, oligosaccharides, and monosaccharides (González-Muñoz et al. 2011, 2012).

Experiments with autohydrolysis liquors, sulfuric acid, and MIBKBiphasic experiments were carried out in a 0.6 l stainless steel reac-tor (Parr Instrument Co.), fitted with two six-blade turbine impellers working at 380 rpm. Sulfuric acid was added to achieve 1% concen-tration, and then MIBK was poured at the desired volume ratio. The catalyst concentration was chosen as the minimum one leading to a satisfactory conversion of substrates under the reaction conditions. Samples were heated up to the target temperature, which was kept for the preset reaction time. At the end of the reaction, the reactor was cooled and the phases were separated in a separatory funnel.

Experimental designThe RSM approach was employed. The set of experiments followed a centered, incomplete, second-order factorial experimental design. Temperature (T; 150–170°C), reaction time (t; 20–80 min), and OAR (1–3 v/v) were considered as independent variables (Table 1). The op-erational conditions are defined in terms of both dimensional vari-ables (T, t, and OAR) and dimensionless, normalized independent variables. These latter variables (x1, x2, and x3), with variation ranges (-1, 1), were linearly related to the correspondent dimensional vari-ables (T, t, and OAR, respectively).

Experiments with phase modifiersThe effects of cosolvents (DMSO for the aqueous phase and/or Bu-tOH for the organic phase) were tested. In experiments with DMSO,



S. Rivas et al.: Furans from pine hemicelluloses 925

liquors were concentrated in a rotary evaporator to the ratio needed to balance the dilution effects caused by DMSO addition.

Analytical methodsTotal monosaccharides, FA, acetic acid, LevA, MIBK, and ButOH (when applicable) in aqueous phases were determined by separa-tion in an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, Life Science Group, Hercules, CA, USA) under the following conditions: mobile phase, 0.006 N H2SO4; flow rate, 0.6 ml min-1; 60°C. The concentrations of polysaccharides and oligosaccharides and bound acetyl groups were measured based on the concentration increments of mono-saccharides and acetic acid resulting from a quantitative posthy-drolysis (performed with 4% H2SO4 at 121°C for 20 min). Uronic acids were determined spectrophotometrically by the method of Blumenkrantz and Asboe Hansen (1973). The liquor content of nonvolatile compounds was measured by oven drying of liquor aliquots at 105°C until constant weight. Samples of autohydrolysis liquors, posthydrolysis liquors, and aqueous phases from the reac-tion media were analyzed for individual monosaccharides. Instru-ment: Agilent 1100 equipped with a RI detector and a 300 × 7.8 mm CARBOsep CHO 682 column with a guard column (Transgenomic, Glasgow, UK) operating at 80°C. Water served as mobile phase (0.4 ml min-1). Samples were diluted, neutralized with BaCO3, fil-tered through 0.45 μm acetate membranes, and assayed for glu-cose, xylose, mannose, galactose, and arabinose (and eventually for F and HMF). Selected samples were also assayed for F and HMF by high-performance liquid chromatography [Agilent 1100 instru-ment equipped with a Waters Spherisorb ODS-2 column (5 μm, 250 × 4.6 mm) operating at 30°C and a diode array detector (280 nm)] according to Conde et al. (2011).

Table 1 Operational conditions selected for processing the media containing autohydrolysis liquors, sulfuric acid, and MIBK.

Experiment

Dimensionless normalized variables

Other variables

x1 x2 x3 T (°C) t (min) OAR (v/v)

1 -1 0 -1 150 50 12 -1 -1 0 150 20 23 -1 1 0 150 80 24 -1 0 1 150 50 35 0 -1 -1 160 20 16 0 1 -1 160 80 17 0 0 0 160 50 28 0 0 0 160 50 29 0 0 0 160 50 2

10 0 -1 1 160 20 311 0 1 1 160 80 312 1 0 -1 170 50 113 1 -1 0 170 20 214 1 1 0 170 80 215 1 0 1 170 50 3

The operational conditions are expressed in terms of the dimen-sional (T, t, and OAR) and dimensionless (x1, x2, and x3) variables.

Results and discussion

Composition of P. pinaster autohydrolysis liquors

The composition of autohydrolysis liquors (in mmol l-1) was glucose 0.77, xylose 7.28, galactose 3.40, arabinose 9.89, mannose 1.28, FA 4.75, acetic acid 4.98, HMF 0.41, F 1.26, glucosyl units 10.59, xylosyl units 20.08, galactosyl units 14.94, arabinosyl units 0.07, mannosyl units 41.56, acetyl groups 18.89, and uronic acid substituents 4.02. The identified compounds accounted for approximately 92.4% of nonvolatile compounds. The other components are not relevant in this study.

Experiments with autohydrolysis liquors, sulfuric acid, and MIBK

Table 2 shows the compositional data for the aqueous and organic phases obtained in the set of assays listed in Table 1. No sugars were found in the organic phase, whereas a complete saccharide consumption was observed in the aqueous phase under harsh conditions. In compari-son, F was preferentially distributed in the organic phase, whereas HMF reached similar concentrations in both phases. In this context, the extraction ratio Ri, defined as the ratio between the concentrations of compound i in the organic and aqueous phases, is relevant. The RF values (Table 3) varied in the range of 6.15 to 11.8, and those of RHMF varied in the range of 1.17 to 1.36. The distribution of furans between the phases can be observed from the data listed in Table 2.

More than 95% of F was recovered in the organic phase in assays performed at OAR 3, whereas 91% recov-ery was achieved operating at OAR 1. In accordance with the extraction ratios, the HMF recovery in organic phase was approximately 54% operating at OAR 1, 70% in assays with OAR 2, and approximately 78% in experiments per-formed at OAR 3.

Expectedly, the majority of organic acids (FA, acetic acid, and LevA) were found in the aqueous phase. The consumption of pentoses, hexoses, and oligomeric and polymeric saccharides and their conversions into the target products are the key variables in this study. The dependent variables (y1, y2, and y3) measure the conver-sion of the potential substrates into F and HMF and LevA. The calculations were based on the following assump-tions: (a) F and F-degradation products are produced from pentoses and pentose units in polysaccharides and




Table 2 Compositional data concerning the aqueous and organic phases from the experiments listed in Table 1.

Experiment

Compounds in aqueous phase (mmol l-1) Compounds in organic phase (mmol l-1)

Glc Xyl Gal Ara Man FA AcA LevA HMF F FA AcA LevA HMF F

1 14.6 8.85 11.0 5.10 19.8 7.86 14.2 1.97 4.24 1.35 2.47 8.35 1.25 4.95 13.72 16.9 15.0 14.6 7.76 28.6 6.04 9.38 0.00 1.43 0.64 1.80 5.76 0.10 1.80 3.943 13.0 2.64 7.13 3.73 11.3 7.85 11.2 1.63 5.28 1.16 3.54 6.28 0.93 6.28 10.44 20.2 4.02 8.48 4.46 14.3 5.98 8.26 0.40 3.19 0.63 2.77 4.96 0.33 3.80 6.235 23.8 6.43 10.2 5.41 16.7 7.60 14.2 1.67 3.31 1.43 3.64 8.31 1.11 4.30 14.66 11.4 0.00 2.32 1.11 2.61 16.5 16.2 9.74 7.12 2.50 6.23 8.92 5.36 8.82 23.97 12.1 0.89 4.70 2.76 6.26 10.2 11.7 3.10 5.11 1.34 4.71 5.55 1.71 6.86 12.38 14.7 0.92 5.59 3.03 9.25 9.74 11.7 3.22 5.74 1.44 4.55 6.42 1.96 6.82 12.09 12.2 0.89 5.31 3.05 8.11 9.39 12.3 3.43 5.43 1.36 4.48 6.25 1.95 6.83 12.5

10 20.1 4.06 9.53 4.89 15.8 6.46 9.20 0.60 2.73 0.87 2.19 4.60 0.32 3.72 6.4011 2.34 0.00 0.60 0.45 0.00 7.78 9.87 2.48 6.07 0.93 3.39 4.61 1.14 7.16 8.6312 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 21.1 16.3 13.7 5.85 2.71 8.25 8.27 7.31 7.12 24.013 8.86 1.06 6.57 4.11 10.6 7.81 12.1 3.32 3.78 1.07 4.15 6.19 1.65 4.68 10.814 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 15.5 12.4 7.98 5.27 1.06 6.41 6.38 4.17 6.23 12.615 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 9.10 9.82 4.17 4.33 0.93 4.66 4.88 2.26 5.23 8.04

Glc, glucose; Xyl, xylose; Gal, galactose; Ara, arabinose; Man, mannose; AcA, acetic acid.

Table 3 Results achieved for the extraction ratios RF and RHMF, for the recoveries of furan in each phase, and for the dependent variables involved in this study.

Experiment

Experimental values Dependent variables

RF RHMF F organic phase (%) HMF organic phase (%) y1 (%) y2 (%) y3 (%)

1 10.1 1.17 91.0 53.8 40.2 12.7 4.402 6.15 1.26 92.5 71.5 22.8 6.90 0.323 8.98 1.19 94.7 70.2 58.5 24.6 4.814 9.87 1.19 96.7 78.1 51.8 20.1 1.925 10.2 1.30 90.7 55.5 42.3 10.5 3.856 9.53 1.24 90.3 54.8 70.1 21.9 20.97 9.17 1.34 94.7 72.3 68.9 25.9 9.018 8.33 1.19 94.2 69.8 67.8 26.7 9.909 9.13 1.26 94.7 71.3 70.1 26.3 10.1

10 7.40 1.36 95.6 79.9 53.5 19.1 2.2011 9.27 1.18 96.5 77.7 71.4 39.4 6.4512 8.83 1.22 89.5 54.1 70.6 17.8 29.113 10.1 1.24 95.2 70.6 60.4 18.1 9.2214 11.8 1.18 95.8 69.8 69.8 24.4 22.615 8.61 1.21 96.2 78.2 67.0 27.6 15.1

oligosaccharides (denoted as C5HDS); (b) HMF and LevA are produced from hexoses and hexose units in polysac-charides and oligosaccharides (denoted as C6HDS); and (c) the production of F from C6HDS, a possibility mentioned in the literature, is negligible under the conditions observed in this work.

Table 3 lists the values of y1 (C5HDS→F, mol F/100 mol stoichiometric F), y2 (C6HDS→HMF, mol HMF/100 mol stoi-chiometric HMF), and y3 (C6HDS→LevA, mol HMF/100 mol stoichiometric LevA) corresponding to experiments 1 to 15 in Table 1.

C5HDS are more reactive than C6HDS, because they were consumed to a greater extent under low- or medium-severity conditions. Total substrate consumption was observed in harsh treatments. Material balances con-firmed some mannose isomerization into glucose. This was checked by additional experiments with pure mannose (data not shown). Values of y1 approximately 70% were obtained when total conversion of C5HDS was observed. Oppositely, y2 reached a maximum of 39.4%, as part of HMF was converted into LevA (29.1% of its stoi-chiometric value in the best case).




RSM assessmentThe basic empirical equation employed in the RSM was

yj = b0j+∑ibijxi+∑i∑kbikjxixk (1)

where yj (j = 1–3) are the dependent variables, xi or xk (i or k = 1–3, k ≥ i) are the independent, dimensionless variables, and b0j,…,bikj are the regression coefficients, calculated from the experimental data by multiple regression (least-squares method).

Table 4 lists the values calculated for the regres-sion coefficients involved in the equations describing the behavior of the dependent variables as well as their statistical significance based on a Student’s t-test. The statistical parameters measuring the correlation (R2) and the statistical significance of the models (based on the Fisher’s F-test) are also presented. Based on this, the quantitative interrelationships between the dependent and the independent variables are reliable.

Variable y1 (conversion into F) was mainly dependent on T and t, whereas OAR caused limited effects (Table 3). Figure 1 a shows the calculated dependence of y1 on T and t for treatments at OAR 2. Parameter t caused effects of decreasing importance close to Tmax, conditions under which the predicted F conversions are approximately 70%. The highest F conversion (74.9%) was found at 165°C for 68.5 min and at OAR 2. Under these conditions, the predicted conversions into HMF and LevA (measured by variables y2 and y3) were 17.6% and 28.1%, respectively. Experiment 11 led to the maximum experimental y1 (71%), conditions under which the model prediction was 70.7%.

Table 4 Regression coefficients (b0j,…,b33j) and statistical param-eters measuring the correlation and significance of models.

Parameter

Variables

y1 y2 y3

b0j 68.95a 26.31a 9.670a

b1j 11.81a 2.956a 8.064a

b2j 11.34a 6.790a 4.903a

b3j 2.568a 5.417a -4.077a

b12j -6.586a -2.832b 2.208c

b13j -3.793a 0.577 -2.851b

b23j -2.489a 2.194c -3.203b

b11j -8.988a -5.487a 1.925b22j -7.067a -2.311c -2.379c

b33j -2.574a -1.262 1.033R2 0.998 0.980 0.982F exp. 242.7 26.8 31.0Significance > 99% > 99% > 99%

a,b,cCoefficients significant at the confidence levels of 99%, 95%, and 90%, respectively.

OAR

a

b

c

OAR

Temp. (°C)

y1

80

70

60

50

40

30

2010

80

50

20170

165155

150160

65

35

35

25

15

5

03

120

35

6580

30

25

15

5

0150

160165170

3

2

1

2.5

1.5

155

10

20

502.5

1.52

20

10

40

30

y2

y3

OAR

OAR

Reacti

on tim

e

(min)

Reaction tim

e

(min)

Temp. (°C)

Figure 1 Calculated dependencies of the variables (a) y1 (C5HDS→F) on T and t at OAR 2. (b) y2 (C6HDS→HMF) on t and OAR at 160°C. (c) y3 (C6HDS→LevA) on T and OAR at 50 min t.

Interestingly, the model predicted HMF conversions above 70% for T near 166°C and t approximately 70.8 min, operating at OAR 1.

The coefficients for variable y2 (C6HDS→HMF) revealed that the major effects are due to OAR. Figure 1b shows the response surface calculated for y2 as a function of OAR and




Table 5 Values of variables y1, y2, and y3 (conversions of substrates into F, HMF, and LevA) in media containing cosolvents.

Experiment

Operational conditions Experimental results

°C/min/OAR Cosolvent(s) y1 (%) y2 (%) y3 (%)

16 166/70.8/1 None 70.7 17.5 28.517 166/70.8/1 DMSO 66.8 39.7 10.718 166/70.8/1 ButOH 63.2 24.7 15.919 166/70.8/1 DMSO+ButOH 60.9 37.2 11.120 165/68.5/2 None 71.3 39.2 8.421 165/68.5/2 DMSO 58.7 31.7 13.222 165/68.5/2 ButOH 64.6 38.8 10.923 165/68.5/2 DMSO+ButOH 63.7 35.7 10.024 160/80/3 None 71.4 39.4 6.425 160/80/3 DMSO 55.8 30.2 13.126 160/80/3 ButOH 56.4 37.9 1.527 160/80/3 DMSO+ButOH 61.0 28.7 16.4

t, operating at 160°C. The highest value predicted for the HMF conversion (37.3%) corresponds to 160°C, t 80 min, and OAR 3 (experiment 11, in which y1 reached a high value).

Figure 1c shows the dependence of variable y3 (C6HDS→LevA) on T and OAR for experiments lasting 50 min. The response surface showed a predominant influence of T, as expected based on the corresponding regression parameters. In comparative terms, the effects of limited importance were ascribed to t and OAR. An increased OAR resulted in decreased y3 values, owing to the higher affinity of LevA for the aqueous phase. The production of LevA was favored by harsh operational conditions, under which the decomposition of F and HMF was promoted.

Experiments with cosolvents

Phase modification by specific chemicals may affect the overall performance of the reacting system, for example, by slowing the kinetics of furan decomposition (when the cosolvent remains in aqueous phase, as it is the case of DMSO) or by promoting the transfer of the target products to the organic phase (when the cosolvent is kept in the organic phase, as it is the case of ButOH).

The experiments were performed in media made up of mixtures “water-sulfuric acid-MIBK-DMSO”, “water-sulfuric acid-MIBK-ButOH”, and “water-sulfuric acid-MIBK-DMSO-ButOH”. The operational variables t, T, and OAR in this set of assays were selected as follows: (a) T and t were fixed in the optimal values identified for F con-version in “water-sulfuric acid-MIBK”; (b) T and t were fixed in the optimal values identified for HMF conver-sion in “water-sulfuric acid-MIBK”; and (c) T and t were fixed as in point (a), but OAR was fixed to be 1 instead of 2. The relative amounts of cosolvents were fixed based on the information reported by Chheda et al. (2007a,b). This latter point was addressed as follows: in experiments with media containing DMSO, the autohydrolysis liquors were concentrated by evaporation, and DMSO was added at a volume ratio of 4:6 respect to the concentrated liquors, in a way that the concentration balanced the dilution effect caused by solvent addition (i.e., the saccharide concen-tration was the same in autohydrolysis liquors and in the mixture concentrated liquors – DMSO). In experiments with ButOH, its volume ratio with respect to MIBK was fixed to 3:7. The operational conditions employed in this set of experiments and the corresponding experimental results are summarized in Table 5.

The data obtained in the presence of cosolvents oper-ating at OAR of 2 or 3 (experiments 21–23 and 25–27 in

Table 5) did not result in improved F production compared with the control system (“water-sulfuric acid-MIBK”) at the same OAR (experiments 20 and 24), even if complete substrate conversion was achieved. On the contrary, the production of HMF operating at OAR 1 in the presence of one or two cosolvents improved with respect to the control medium. Particularly interesting results were achieved in experiment 17 (in a medium containing DMSO), for which the HMF conversion increased up to 39.7%, in comparison with 17.5% in the absence of cosolvent, whereas the F con-version decreased just slightly from 70.7% to 66.8%. The increased production of HMF is due to the lower incidence of HMF decomposition reactions, because the conversion into LevA reached just 10.7% (in comparison with 28.5% in the absence of cosolvent).

ConclusionThe soluble hemicellulose-derived saccharides obtained by aqueous processing of P. pinaster wood are suitable substrates for the production of furans (F and HMF) and LevA in biphasic systems containing water, MIBK, and sulfuric acid. A study based on the RSM enabled the identification of optimal conditions for F or HMF production, whereas LevA also appeared in the media as a byproduct. The optimal operational conditions were identified for F production (∼70% conversion) and HMF production (∼40% conversion). Experiment 11 in Table 3 shows a satisfactory opera-tional compromise, because it led to high conversion rates of both F and HMF. The presence of DMSO as a




cosolvent improved the HMF conversion by limiting its decomposition into LevA.

Acknowledgements: The authors are grateful to the Spanish “Ministry of Science and Innovation” for sup-porting this study, in the framework of the research project “Development and Evaluation of Processing Methods for Biorefineries” (reference CTQ2011-22972),

and to Xunta de Galicia (INBIOMED project) for the addi-tional financial support. Both projects were partially funded by the FEDER Program of the European Union (“Unha maneira de facer Europa”). Ms. Sandra Rivas thanks the “Ministry of Science and Innovation” for her predoctoral grant.

Received January 23, 2013; accepted March 19, 2013; previously published online April 11, 2013

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valorizaciÓn de hemicelulosas de biomasa vegetal

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