valutazione di reperto bioptico tramite indagine ... · oppure di metalli quali l’oro e il...
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NANODIAGNOSTICS srl Rapporto n°20/2013
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RAPPORTO
N° 20/2013
VALUTAZIONE DI REPERTO BIOPTICO TRAMITE INDAGINE
NANODIAGNOSTICA DI MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE E
MICROANALISI A RAGGI X.
Committente : xx
Materiale in esame : biopsia di linfonodo
Responsabile: Dott.ssa Antonietta Gatti
Firma:
Data: 09 luglio 2013
Il presente rapporto si compone di 41 (quarantuno) pagine eccetto la copertina.
Nota: I risultati sono da riferirsi solo al materiale esaminato e per il tipo di applicazione richiesta. In caso di riproduzione del presente documento, il Committente s’impegna a farlo solo in modo integrale. Un’eventuale riproduzione parziale deve essere autorizzata per iscritto da Nanodiagnostics srl.
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INDICE
1. Introduzione .................................................................................................................. 3
2. Materiali ......................................................................................................................... 4
3. Preparazione dei campioni ............................................................................................ 5
4. Tipi di analisi eseguite ................................................................................................... 5
5. Risultati ......................................................................................................................... 5
Biopsia n. xx. .................................................................................................................... 6
6. Conclusioni .................................................................................................................. 34
7. Legenda ...................................................................................................................... 35
8. Riferimenti bibliografici ................................................................................................ 35
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1. Introduzione
Nanodiagnostics srl è un’azienda di consulenze scientifiche nei settori della
medicina, dell’industria e dell’ecologia. L’attività principale è il rilevamento tramite una
tecnica innovativa di microscopia elettronica ambientale di micro- e nanoparticelle
inorganiche in qualsiasi mezzo (tessuti biologici, alimenti, farmaci, cosmetici, campioni
ambientali, ecc.).
L’indagine si avvale principalmente di un FEG - ESEM (Field Emission Gun -
Environmental Scanning Electron Microscope, FEI Company, Olanda), cioè un
microscopio elettronico a scansione ambientale a emissione di campo, opportunamente
modificato.
Con opportuni presidi da aggiungere allo strumento base si possono poi analizzare
campioni biologici in “wet mode”, vale a dire in condizioni di normale idratazione, a
pressione atmosferica, oppure campioni oleosi. Questo tipo di analisi sono possibili solo
con la presente strumentazione. Con normali microscopi elettronici vi è la necessità di
essiccare i campioni e di renderli elettroconduttivi tramite una ricopertura di carbone
oppure di metalli quali l’oro e il palladio. Applicando protocolli idonei ad ogni tipo di
materiale si possono esaminare campioni biologici, comprese cellule vive, senza
intaccarne l’integrità, e di ripetere l’osservazione ogni volta lo si desideri.
Il principale obiettivo dell’indagine, l’individuazione di micro- e nano-particolato inorganico
contenuto nell’esemplare in studio preesistente all’espianto del campione.
Ognuno dei preparati viene osservato in tutta la sua estensione sotto il microscopio
in diverse modalità: SED (elettroni secondari) e BSE (elettroni retrodiffusi), in basso vuoto
(0,98 Torr), a 25-30 KV e con spot vari, a seconda dell’ingrandimento (da 6 a 4), con una
distanza di 10 mm.
Sul particolato rilevato si punta la sonda microanalitica a raggi X per determinarne
la composizione chimica. Una microanalisi a raggi X a dispersione d’energia (EDS, cioè
Energy Dispersive Spectroscopy, EDAX, USA), misurando l’energia caratteristica che i
vari elementi costituenti il campione restituiscono sotto forma di radiazioni X dopo essere
stati colpiti dal fascio elettronico emesso dalla sorgente, fornisce la composizione chimica
elementare del particolato rinvenuto. Ogni reperto è stato debitamente fotografato ed
archiviato insieme con lo spettro degli elementi individuati.
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L’indagine può essere svolta su campioni di origine biologica come biopsie,
autopsie, liquidi organici o alimenti, ma è eseguibile anche su molti altri tipi di materiali
quali, ad esempio, campioni ambientali, farmaci o cosmetici. Essendo l’oggetto principale
dell’indagine di natura inorganica non biodegradabile, non ci sono difficoltà nell’individuare
particolato del genere sia in campioni freschi sia in campioni d’archivio.
2. Materiali
E’ pervenuto al laboratorio un blocchetto in paraffina n. xx con biopsia di linfonodo
del polo inferiore della parotide destra della paziente xxxxx nata il xxx
La diagnosi indicata sul referto è di linfoma di Hodgkin.
Il campione proviene dal laboratorio di xxx
Il campione è stato ricodificato presso il nostro laboratorio.
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3. Preparazione dei campioni
Dal blocchetto in paraffina pervenuto in laboratorio sono state tagliate mediante
microtomo Leitz (Germania) alcune sezioni istologiche da 12 micron di spessore ciascuna.
Le sezioni sono state poi depositate su supporti di acetato puliti e si è proceduto alla loro
deparaffinizzazione sotto cappa a flusso laminare mediante dissoluzione con xilolo.
Successivamente le sezioni sono state montate su supporto (stub) per mezzo di un disco
biadesivo di Carbonio e coperte in un contenitore sono state messe in stufa a 40 °C per 6
ore per eliminare vapori, sono poi state osservate al microscopio elettronico.
4. Tipi di analisi eseguite
Le sezioni dopo essere state montate su supporto di alluminio idoneo per la tecnica
sono state inserite nella camera di osservazione di un microscopio elettronico a scansione
ambientale (FEG – ESEM Quanta 200, FEI, Olanda) per verificare l’eventuale presenza di
corpi estranei, supportato da valutazioni di microanalisi a raggi X (EDS, EDAX, USA) per
valutarne la composizione chimica come descritto al paragrafo 1. Dopo l’esclusione della
paraffina dal campione, nessun processamento è stato eseguito sul reperto che è stato,
quindi, esaminato tal quale. Analisi della sezione così descritta non distrugge il campione
che può essere così riesaminato se occorre.
Per informazioni ulteriori sulla metodica risultato del progetto comunitario europeo
QLRT-2002-147 (Nanopathology), si acclude una bibliografia a supporto. (1- 31).
5. Risultati
Le analisi di microscopia elettronica hanno messo in evidenza la presenza di
particolato con composizione chimica diversa (vedi Tabella).
I risultati morfologici e chimici del campione sono mostrati nelle immagini
successive. I picchi dello spettro che non riportano indicazioni dell’elemento a cui si
riferiscono sono picchi secondari di un elemento già segnalato in coincidenza del picco
principale.
Nota: l’elenco degli elementi nelle tabelle osserva il criterio di maggior rappresentatività
dell’elemento nello spettro EDS. La successione degli elementi inizia da quelli con il picco
EDS più alto.
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Biopsia n. xx con linfonodo del polo inferiore della parotide destra e diagnosi di
linfoma di Hodgkin.
La tabella riassume tutte le analisi più significative eseguite sul campione.
Analisi EDS del reperto.
N. analisi Descrizione Elementi presenti
1 linfonodo parotide immagine morfologica 63x
2 linfonodo parotide 120x - segnale tessuto: C,O,Cl,P,S,Na
3 aggregato detriti nanometrici C,O,Ca,Cl,Si,P,Al,S,Na,Mg
4 detriti 3 e 4 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Si,Na
5 sferula 0,3 µm C,O,Ti,P,S,Cl,Na,S,Fe
detriti 0,05-0,4 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Si,Na
6 detrito 0,1 µm C,Fe,O,P,Cr,S,Cl,Na,Ni
7 detriti 0,3-2 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Na
particolare
8 detrito 0,4 µm C,O,Cr,Mn,Cl,Ti,P,Al,Fe,Na
9 detrito 1,5 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Si,Na
10 detriti 0,5-3 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Na
11 detriti 0,2-4 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Na
12 detrito 2,5 µm C,Ca,O,Cl,P,S,Na
13 aggregato 7 µm C,O,Ca,S,Cl,Si,P,Al,Na,Mg,K,Fe
14 detrito 1,8 µm detrito a sx: C,O,Ca,Mg,Cl,P,S,Na
detrito 2 µm detrito a dx: C,Cl,Na,O,K
15 detrito 7 µm C,Fe,O,Cr,Ni,Cl,P,Si,Na
16 detriti 5-70 µm P,Ca,O,C,Cl
17 detriti 1-5 µm Fe,C,O,Cr,Ni,Cl,S,Si,Na
18 aggregato detriti 0,05 µm C,O,Fe,Cl,P,Na
19 aggregato detriti nanometrici C,O,Fe,P,Si,Cl,Na,Ca,S,Cr,Zn
20 aggregati detriti nanometrici C,O,Fe,Cl,P,Na
21 detriti 0,3-3,5 µm C,O,Si,Al,Na,Mg,Cl,K,Fe,Zn,P,S
22 detrito 0,4 µm C,O,Cl,Fe,Ti,P,Cr,S,Na,Ni
23 detrito 5 µm C,O,Al,Si,Na,Cl,P,Ca,S
24 detrito 3 µm C,Cl,O,Na,K,P,S
25 detrito 0,05 µm C,O,Bi,Cl,P,Si,Na
26 detrito 5 µm C,Fe,O,Cr,Cl,P,S,Si,Na,Ca,Al
27 detrito 2,5 µm C,Si,O,Cl,P,Na
28 detrito 3,5 µm C,O,Si,Al,Ca,Cl,P,S,Na
29 sferula 0,8 µm C,Bi,P,O,Ca,Na
particolare
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Analisi 1 e 2 della tabella. Le figure mostrano due aree della sezione a bassi
ingrandimenti (62x – 120x). L’analisi chimica evidenzia la composizione del segnale
emesso dal tessuto biologico naturale in un’area priva di detriti: Carbonio, Ossigeno,
Cloro, Fosforo, Zolfo e Sodio.
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Analisi 3 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui è visibile un aggregato di detriti nanometrici. L’analisi EDS
mostra che essi sono composti da Carbonio, Ossigeno, Calcio, Cloro, Silicio, Fosforo,
Alluminio, Zolfo, Sodio e Magnesio. Sono composti a base di Calcio di natura esogena.
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Analisi 4 e 9 della tabella. . Le figure mostrano due zone della sezione ad alti
ingrandimenti (8.000x e 60.000x) in cui sono visibili alcuni detriti di dimensioni comprese
tra 1,5 e 4 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Carbonio, Ferro,
Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Fosforo, Silicio e Sodio. Si tratta di polveri di acciaio.
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Analisi 5 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (31.500x – Fig. A) in cui sono visibili alcuni detriti. Le analisi EDS mostrano
che la sferula da 0,3 micron è composta da Carbonio, Ossigeno, Titanio, Fosforo, Zolfo,
Cloro, Sodio e Ferro (Fig. B) mentre i restanti detriti di dimensioni comprese tra 0,05 e 0,4
micron sono composti da Carbonio, Ferro, Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Fosforo, Silicio
e Sodio (Fig. C). Si tratta di nanoparticelle d’acciaio.
B
A
C
B
C
C
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Analisi 6 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (60.000x) in cui è visibile una sferula di acciaio da 0,1 micron cioè
100nanometri. L’analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Ferro, Ossigeno,
Fosforo, Cromo, Zolfo, Cloro, Sodio e Nichel.
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Analisi 7 della tabella. Le figure mostrano un’area della sezione a due diversi
ingrandimenti (2.000x e 30.000x) (Figg. A e B - vedi scala) in cui sono visibili ulteriori detriti
d’acciaio di dimensioni comprese tra 0,3 e 2 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono
composti da Carbonio, Ferro, Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Fosforo e Sodio (Fig. C).
B A
C
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Analisi 8 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad altissimo
ingrandimento (120.000x) in cui è visibile un detrito da 0,4 micron. L’analisi EDS mostra
che esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Cromo, Manganese, Cloro, Titanio, Fosforo,
Alluminio, Ferro e Sodio.
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Analisi 10 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui sono visibili alcuni detriti di acciaio di dimensioni comprese
tra 0,5 e 3 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono composti Carbonio, Ferro,
Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Fosforo e Sodio.
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Analisi 11 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui sono visibili numerosi detriti di acciaio di dimensioni
comprese tra 0,2 e 4 micron. Come per quelli di analisi 10, l’analisi EDS mostra che
anch’essi sono composti da Carbonio, Ferro, Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Fosforo e
Sodio.
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Analisi 12 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (8.000x) in cui è visibile un detrito a base di Calcio da 2,5 micron. L’analisi
EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Calcio, Ossigeno, Cloro, Fosforo, Zolfo e
Sodio.
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Analisi 13 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (8.000x) in cui è visibile un aggregato di detriti da 7 micron. L’analisi EDS
mostra che essi sono composti da Carbonio, Ossigeno, Calcio, Zolfo, Cloro, Silicio,
Fosforo, Alluminio, Sodio, Magnesio, Potassio e Ferro.
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Analisi 14 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (8.000x – Fig. A) in cui sono visibili due detriti. Le analisi EDS mostrano che
il detrito da 1,8 micron è composto da Carbonio, Ossigeno, Calcio, Magnesio, Cloro,
Fosforo, Zolfo e Sodio (Fig. B) mentre il detrito da 2 micron è composto da Carbonio,
Cloro, Sodio, Ossigeno e Potassio (Fig. C).
B
A
C
C
B
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Analisi 15 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (15.000x) in cui è visibile un detrito di acciaio da 7 micron. L’analisi EDS
mostra che esso è composto da Carbonio, Ferro, Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro,
Fosforo, Silicio e Sodio.
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Analisi 16 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (1.000x) in cui è visibile un accumulo di detriti di dimensioni comprese tra 5
e 70 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Fosforo, Calcio, Ossigeno,
Carbonio e Cloro. Si tratta di una calcificazione endogena come risposta infiammatoria.
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Analisi 17 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (1.000x) in cui sono visibili alcuni detriti di acciaio di dimensioni comprese
tra 1 e 5 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Ferro, Carbonio,
Ossigeno, Cromo, Nichel, Cloro, Zolfo, Silicio e Sodio.
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Analisi 18 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (60.000x) in cui è visibile un aggregato di detriti nanometrici da circa 50
nanometri (0,05 micron). L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Carbonio,
Ossigeno, Ferro, Cloro, Fosforo e Sodio.
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Analisi 19 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (30.000x) in cui è visibile un aggregato di detriti nanometrici. L’analisi EDS
mostra che essi sono composti da Carbonio, Ossigeno, Ferro, Fosforo, Silicio, Cloro,
Sodio, Calcio, Zolfo, Cromo e Zinco.
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Analisi 20 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (8.000x) in cui sono visibili tra i globuli rossi alcuni aggregati di detriti
nanometrici. L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Carbonio, Ossigeno, Ferro,
Cloro, Fosforo e Sodio.
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Analisi 21 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (30.000x) in cui sono visibili alcuni detriti di dimensioni comprese tra 0,3 e
3,5 micron. L’analisi EDS mostra che essi sono composti da Carbonio, Ossigeno, Silicio,
Alluminio, Sodio, Magnesio, Cloro, Potassio, Ferro, Zinco, Fosforo e Zolfo.
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Analisi 22 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (16.000x) in cui è visibile un detrito da 0,4 micron. L’analisi EDS mostra che
esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Cloro, Ferro, Titanio, Fosforo, Cromo, Zolfo,
Sodio e Nichel.
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Analisi 23 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui è visibile un detrito da 5 micron. L’analisi EDS mostra che
esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Alluminio, Silicio, Sodio, Cloro, Fosforo, Calcio e
Zolfo.
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Analisi 24 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui è visibile un detrito da 3 micron. L’analisi EDS mostra che
esso è composto da Carbonio, Cloro, Ossigeno, Sodio, Potassio, Fosforo e Zolfo.
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Analisi 25 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad altissimo
ingrandimento (120.000x) in cui è visibile un detrito a base di Bismuto da 50 nanometri
(0,05 micron). L’analisi EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Ossigeno,
Bismuto, Cloro, Fosforo, Silicio e Sodio.
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Analisi 26 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (4.000x) in cui è visibile un detrito di acciaio da 5 micron. L’analisi EDS
mostra che esso è composto da Carbonio, Ferro, Ossigeno, Cromo, Cloro, Fosforo, Zolfo,
Silicio, Sodio, Calcio e Alluminio.
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Analisi 27 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (8.000x) in cui è visibile un detrito a base di Silicio da 2,5 micron. L’analisi
EDS mostra che esso è composto da Carbonio, Silicio, Ossigeno, Cloro, Fosforo e Sodio.
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Analisi 28 della tabella. La figura mostra una zona della sezione ad alto
ingrandimento (30.000x) in cui è visibile un detrito da 3,5 micron. L’analisi EDS mostra che
esso è composto da Carbonio, Ossigeno, Silicio, Alluminio, Calcio, Cloro, Fosforo, Zolfo e
Sodio.
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Analisi 29 della tabella. Le figure mostrano un’area della sezione a due diversi
ingrandimenti (2.000x e 16.000x) (Figg. A e B - vedi scala) in cui è visibile una sferula a
base di Bismuto da 0,8 micron. L’analisi EDS mostra che essa è composta da Carbonio,
Bismuto, Fosforo, Ossigeno, Calcio e Sodio (Fig. C).
B A
C
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6. Conclusioni
Le analisi eseguite sulla biopsia di linfonodo del polo inferiore della parotide destra
affetto da linfoma hanno messo in evidenza la sistematica presenza di detriti micro- e
nanodimensionati di acciaio, cioè particelle fondamentalmente di Ferro-Cromo-Nichel.
Si sono identificati anche altri detriti metallici a base di Ferro, di Ferro-Manganese o a
base di Titanio, di Bismuto e Bismuto-Fosforo.
Nel reperto sono stati identificate anche polveri ceramiche come quelle a base di Silicio e
di Calcio di sicura origine esogena. L’esame di particelle di Calcio necessita di un’analisi
accurata poiché potrebbero anche trattarsi di Calcio endogeno da calcificazione a seguito
di infiammazioni generate dalla presenza di corpi estranei (Analisi 12-16)..
Quando in uno spettro contenente Calcio coesistono i picchi di Silicio da solo e di
Alluminio con Silicio, la particella è di sicura origine ambientale. (Analisi 3-13)
La presenza nel reperto biologico soprattutto delle particelle di acciaio anche in
forma sferica, tipica della formazione ad alta temperatura, e di dimensioni ridotte nel
linfonodo testimoniano l’esposizione che il paziente ha subito ad un inquinamento
ambientale causato da lavorazioni dell’acciaio ad alta temperatura.
In effetti la paziente viveva poco distante da un’acciaieria.
Polveri dovute a queste attività sono sicuramente state emesse nell’ambiente e
respirate e/o ingerite da chi vive nella zona. La loro dispersione nell’ambiente ha
verosimilmente raggiunto orti e colture inquinando vegetali e frutti di cui la paziente può
essersi nutrita. Non solo, ma chi ha mangiato carni, latticini e altri derivati di animali che, a
loro volta, si sono cibati del foraggio e dei prodotti vegetali inquinati da polveri d’acciaio, ha
subito un’esposizione indiretta a tale inquinamento.
Le particelle inquinanti, per la loro ridotta dimensione, hanno superato con facilità le
barriere fisiologiche e sono finite nel torrente circolatorio, come dimostrato dagli studi di
Nemmar et al. (32). Tali particelle insieme con i componenti del sangue raggiungono in
potenza tutti gli organi interni. Dunque fegato, reni, pancreas, cuore, ecc. In questo caso si
è verificato un loro accumulo nei linfonodi dove hanno dato luogo ad una reattività
biologica poi manifestatasi nella patologia lamentata.
Le polveri identificate non sono biocompatibili e sono percepite dall’organismo
come corpi estranei. Per la loro ridotta dimensione possono entrare nelle cellule e avere
interazioni dirette col DNA ( 33-48)
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L’acciaio esercita, inoltre, un’ulteriore azione tossica nei riguardi dell’organismo. In
un ambiente come quello fisiologico, infatti, la corrosione dell’acciaio è possibile, come
dimostrano le rotture di placche e viti inserite nel corpo umano per comuni pratiche
ortopediche (48-50).
La corrosione delle polveri d’acciaio induce il rilascio di ioni Ferro, Cromo, Nichel e,
comunque, di tutti gli elementi di cui quella particolare lega è formata. La tossicità degli
ioni Cromo e Nichel è ben nota e riportata con dovizia dalla letteratura mondiale (48-50).
La presenza di questi elementi nel tessuto biologico può indurre modificazioni nel DNA e/o
morte cellulare.
La patologia lamentata dalla paziente è da intendersi come correlata all’esposizione
che essa ha subito per anni con un conseguente interessamento dei suoi organi.
7. Legenda
Al = Alluminio
Bi = Bismuto
C = Carbonio
Ca = Calcio
Cl = Cloro
Cr = Cromo
Fe = Ferro
K = Potassio
Mg = Magnesio
Mn = Manganese
Na = Sodio
Ni = Nichel
O = Ossigeno
P = Fosforo
S = Zolfo
Si = Silicio
Ti = Titanio
Zn = Zinco
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