vías de la información genética transcripción
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Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín
Año 2o19Sección Bioquí[email protected]
Módulo III:Vías de la información
genética
Transcripción
ADN ARN PROTEINAS
Transcripción Traducción
Replicación
retrotranscripción
ARNs
ARNm (ARN mensajero)ARNt (ARN de transferencia)ARNr (ARN ribosomal)Otros…snRNAs, siRNAs, miRNAs
Funciones: informativas y catalíticas
¿QUÉ, DÓNDE, CÓMO, CUÁNDO y CUÁNTO se transcribe cada secuencia?
● ¿Qué región del ADN transcribir? ¿cómo se identifica el sitio de iniciación y el de terminación de la transcripción?
Qué es un Gen?
● ARN ribosomales bacterianos 5S 16S y 23S enmascaraban al ARNm
S: unidades Svedberg. Se refiere a la
velocidad de sedimentación en la centrifugación
ARNARNm (ARN mensajero) 1- 3 % del ARN total celularARNt (ARN de transferencia)ARNr (ARN ribosomal)
Dificultad para mostrar la existencia del ARNm
ARNm es muy inestable
Transcripción: síntesis del ARN, ADN dependiente
5’ 3’Siempre
Requiere un molde de ADN
ADN hebra codificante o sentido (+)idéntica secuencia que el ARN (U x T) ADN hebra molde o antisentido (-)complementaria al ARN
Transcripción en procariotas
● Una única ARN polimerasa ● Todos los promotores son reconocidos
por la misma enzima● Los ARNm tienen:
– Extremo 5’: ppp (tri fosfato) (pppG o A)– Extremo 3’ : estructura de un terminador o
nada en particular– Principal modificación post transcripcional de
los ARNm: su propia degradación (vida media 2-3 min)
● Inicialmente se identificó una enzima capaz de polimerizar ARN in vitro, pero sin molde!!
● Mas adelante se encontró la ARN polimerasa ADN dependiente:Mg++(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi
La reacción de polimerización
Tres etapas:- Iniciación- Elongación- Terminación
Etapas de la Transcripción
Transcripción
Estructura de la ARN polimerasa de E. coli
ARNm ARNtARNr
Sintetiza los diferentes tipos de ARNs
2α, β, β’, σ, ω
Holoenzima
α: regulador β: se une al moldeβ´: une NTPs y forma enlaces fosfodiésterσ : reconoce el promotor
PM (kDa)
@ 500
core
ARN Pol Core
Inhibidor de la ARN polimerasa de E. coli
RIFAMPICINA
Iniciación de la transcripciónRequiere:
Reconocimiento de la señal específica en el ADN que indique el inicio. Formación del complejo “cerrado”
Selección de la hebra molde
Separación de las hebras, (formación del complejo abierto)
Inicio de la síntesis del ARN
Promotor:
● Es una secuencia de ADN de cadena doble
● Que no se transcribe● Forma un complejo estable con la ARN
pol ● Contiene la información necesaria para
que la ARN pol inicie la síntesis del ARN y la definición del extremo 5’ del ARN
● Promotores fuertes y débiles, según cuántos ARN se sintetice a partir de ellos.
● Constitutivos o inducibles por “activadores”
Promotor: señal de iniciación de la transcripción en el ADN
¿Cómo identificar y aislar los promotores?
ADN purificado + ARN polimerasa + ADNasa (endonucleasa)
Fingerprint o “huella”
Huella (Footprinting)
La localización de los sitios de unión de proteínas en el ADN puede ser ubicada con precisión.
∓ Proteína de unión al ADN
*
*
Análisis comparativo de la secuencia de los promotores aislados
(@ 2000, ∼ 80 pb)
● No hay una homología de secuencia significativa entre ellas en su totalidad
● Solo hay 2 pequeñas regiones mas conservadas (consenso) :
Situadas en - 10 y - 35
- 35 - 10 +1 ►
4 elementos comunes identificados en promotores de E. coli :
+1: una purina, G o A
En – 10 : T80 A95 T45 A60 A50 T96
En – 35: T82 T84 G78 A65 C54 A45
Separación entre ambos sitios: 17 ∓ 1
Efecto de mutaciones
Reconocimiento del promotor:subunidad σ de la ARN pol
● Aumenta la afinidad de la holoenzima en 10.000x
● Reconoce ADN doble hebra
● KM (holoenz.) = 1010 M-1 s-1
● Varias σs: σ70, σ32 (HS), σ54, etc.
∀ σ se libera después de la formación del primer enlace fosfodiéster
Etapa limitante de la reacción de Iniciación de la Transcripción
● Transición del complejo promotor cerrado (ARN pol en -35, ADN en doble hebra) a complejo promotor abierto (ARN pol en -35 y -10, ADN SE-)
►
ββ´
α
Mg++
Elongación: “Burbuja” de la transcripción
Sobre la terminación de la transcripción:
Hay dos formas de terminación: ρ − independiente ρ − dependiente
No es tan exacta como la iniciación
Terminadores independientes
del factor ρ
Se caracterizan por :
-la presencia de una región rica en AU / AT y - la formación de una estructura en horquilla, en el ARN recién sintetizado
Terminación de la transcripción
ρ -dependiente
Fidelidad…• corrección de prueba1. Edición pirofosforolítica2. Edición hidrolítica
• 1 error / 104-5 nucleótidos
Célula procariota / célula eucariota
La membrana nuclear en eucariotas hace necesaria la existencia de un intermediario núcleo-citosol
ARN pols de Procariotas y Eucariotas: Similitudes y Diferencias
(CTD)
3 ARN polimerasas que dan diferentes productos:
• ARN pol I : ARN r • ARN pol II : ARNm• ARN pol III : ARN pequeños: ARNr 5S y
ARNt
Con diferente sensibilidad a la α-amanitinaImportante procesamiento de los transcriptos: modificaciones post transcripcionales
Transcripción en células eucariotas
% Trxn Nº subs. Dónde? Transcritos Sens. α-amanitina
70 14 Nucleolo ARNr 5.8, 18 y 28S -
20 12 Nucleoplasma ARNhn (-> ARNm), ARNsn
++
10 17 Nucleoplasma ARNt, ARNr 5S, SINEs
+ (altas concs.)
I
II
III
Transcripción en células eucariotas, ARN pols I, II y III
α-amanitina: inhibidor diferencial de ARN
polimerasas eucariotas
amanita
Otros inhibidores de la transcripción
Cordicepina
►
Iniciación: promotores eucariotas reconocidos por la ARNpol II
● Síntesis de ARNm y algunos snRNAs● Las 12 subunidades de la ARNpol II
son insuficientes para iniciar la transcripción
● Se necesitan al menos 5 factores adicionales para iniciar :TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (expresión basal)
● Participan otros factores para regular la transcripción
Complejo mínimo de iniciación de la transcripción y elongación en eucariotas (pol II, expresión basal)
Iniciación de la transcripción por la ARN pol II en eucariotas
TBP+TAF=TFIID
CTD: dominio Ctl de una subunidad de la ARN polII
CTD es fosforilado
Estructura de un promotor eucariota (pol II)
+1CAAT
-30-80GC-100¿?
Potenciador
Aparato Básico de Trxn:TFII D, A, B, F + ARN pol II, E, H
*
*
Las ARN pols I y III reconocen diferentes promotores, utilizan diferentes conjuntos de FTs, pero igual requieren TBP
4 Principales modificaciones postranscripcionales en el ARNm de células Eucariotas
En el extremo 5’: CAP o CasqueteEn el extremo 3’: Cola poli AEliminación de intrones Edición
Modificación del extremo 5’ del ARNm en eucariotas
Modificación del extremo 3’ del ARNm en eucariotas
AATAAATTATTT
AAUAAA
ADN
ARNm
AAUAAA
AAUAAA AAAAAAAAAAAA....A
(endonucleasa)
(poliA-polimerasa)
5’ 3’
Poliadenilación y Terminación de la Trxn
El ~1% del genoma de E. coli codifica para estos ARNs, pero constituyen el 99% del ARN total de la bacteria
Procesamiento de ARNr y ARNt
Ambos se transcriben como transcriptos largos (pre-ARNr)
Modificaciones post-transcripcionales● ARNrs Procariotas
Estructura de un transcripto pre-ARNr
en E. coli
RNasa III libera los ARNr 16S y 23 S
Procesamiento de ARN ribosomal en eucariotas
Modificaciones post-transcripcionales• ARNrs Eucariotas
Modificaciones post-transcripcionales• ARNts Proca y Eucariotas
Procesamiento postranscripcional del ARNt Tyr
Ribonucleasa P : una ribozima
Crea el extremo 5’ de los tRNAsSu estructura consiste en:
– Una molécula de ARN de 377 nt– Una cadena polipeptídica de 20 kDa
Ambos componentes son necesarios para una actividad catalítica completa
En condiciones no fisiológicas el ARN puede cortar esas secuencias con precisión.
Algunas de las Bases ModificadasPostranscripcionalmente en ARNs r y t
Ovoalbúmina de polloproteína: 386 aa gen: 7700 pb
Desnaturalización / Hibridación : proceso reversible de los ácidos nucleicos.
Propiedad muy utilizada para identificar secuencias complejas de A. N.:ADN / ADNADN / ARNARN / ARN
Experimentos de hibridación ADN / ARNm analizados por microscopía electrónica
Intrones y exones de la β hemoglobina
¿Cómo se eliminan los intrones sin alterar las secuencias codificantes?
● ¿Cuáles son las señales en los ácidos nucleicos, en el ARN, que indican los límites de los intrones?
● ¿cuál es el mecanismo que lo asegura?
Grupo I
Grupo I
Grupo II
SR, proteínas reguladoras de splicing
● Proteinas SR (ricas en Ser y Arg)● Se unen a elementos reguladores de
splicing, en los exones (ESE, exonic splicing enhancer)
● Son esenciales en el empalme constitutivo y regulan el empalme alternativo, tejido específico
“Corte y empalme” alternativoSub-grupo de exones es conservado en la maduración del ARNm, los otros son procesados como si fueran intrones.
7 formas de la α-tropomiosina (rata)
(sistema contráctil de diversos tipos celulares)
RESUMENModificaciones en los ARNm eucariotas:
Síntesis y maduración de los miRNA
Los ARNs como replicadoresReplicación autoalimentada de una enzima de ARN
cADN
Interacciones ADN-proteína
Motivos de unión al DNA
Represor Lac y trp CRP
Receptor de Glucocorticoides
Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada
Demostración de la existencia de ARNm. Experimentos de “marcado por pulsos” y sedimentación.
ApoB-100
CAA
UAA STOP
ApoB-48