P. 1  

 

 

 

 

 

Vegetable vs. Vegetables ‐ Detection of Heavy Metal Ions in Plants by Natural Pigments  

Chan Sin Kan   

Chiu Chun Yin 

Lee Long Hei 

Lee Po Lung 

Liu Wan Ling 

P. 2  

Content  

1. Introduction 

1.1 Objectives                                                                     P. 3 

1.2 What is anthocyanin?                                                   P. 5 

1.3 Design of experiment                                                    P. 6 

2. Experimental                                            P. 8 

3. Results and discussions 

3.1 Absorption spectrum of different vegetables or fruit 

extracts                                                                             P. 10 

3.2 Response of anthocyanin to different metal ions      P. 12 

3.3 Detection limit of Pb2+, Cu2+ and Fe3+ by blueberry 

extract and purple cabbage extracts                                P. 15 

3.4 Absorbance spectrum of purple cabbage extract with 

different concentrations of Pb2+, Cu2+ and Fe3+                P. 17 

3.5 Growth of Rohdea Japonica                                    P. 19 

3.6 Using anthocyanin as a probe to find out the metal ions 

absorbed in the plant                    P. 21 

4. Conclusion                        P. 22 

5. References                                                P. 23 

P. 3  

1. Introduction 

1.1 Objectives

Vegetable  is  our  important  diet,  but  do  you  know  whether  the 

vegetables  entering  our  body  are  non‐polluted?  Polluted  vegetable  is 

one  of  the major  concerns  of  HK  citizen.  These  vegetables  are  usual 

polluted by different metal  ions which coming from  industrial discharge 

in  some  areas  in China.  Fig. 1  shows  the  result of  a  survey done by  a 

press media on the content of lead in imported vegetables.   

 Fig.1 A newspaper cutting of vegetables polluted by lead. 

 

From the survey, although the lead content of vegetables is lower than 

the standard of HK, it is still higher than the level of standard of Australia 

and European Union.   

 

 

P. 4  

Heavy metals  do  no  good  but  harm  to  humans.  They  can  disturb 

important  biochemical  processes,  constituting  an  important 

threat  for  the  health  of humans. The accumulation of  these heavy 

metals  can  cause  serious  health  conditions,  such  as  autism,  infertility, 

dementia,  thyroid  problems,  pathologicalevents,  chronic 

inflammatory  disease,  immune  system  disorders,  cardiovascular 

diseases,  and  even  cancer.  Other  effects  from  heavy  metal  toxicity 

include birth defects, constipation, anemia,  liver disease, hypertension, 

seizures,  and  insomnia.  In other words—heavy metal  toxicity  is  a  very 

serious concern. 

Although  metal  ions  have  significant  impact  on  our  health,  their 

detection  is  time  consuming  and  requires  sophisticated  instruments. 

Therefore  in  this project, we  are  going  to use  anthocyanin, which  is  a 

common pigment  in vegetables, as a  simple probe  for  the presence of 

metal  ions  in  vegetable.  We  also  hope  this  cheap  and  easy  method 

allows all consumers to test whether vegetables they are going to eat are 

heavily polluted with metal ions or not. 

 

 

 

 

 

 

P. 5  

1.2 What is anthocyanin?

Anthocyanin(Fig.2) can be easily find in fruit like blackberry, eggplant 

peel, black rice, Concord grape, red cabbages, and violet petals. 

 Fig.2 Structure of Anthocyanin 

 

Fruit containing anthocyanin gives an attractive skin to attract animals, 

which  may  eat  the  fruits  and  disperse  the  seeds.  In  photosynthetic 

tissues. Anthocyanin has been shown to act as a "sunscreen", protecting 

cells  from  high‐light  damage  by  absorbing  blue‐green  and  ultraviolet 

light,  thereby protecting  the  tissues  from photoinhibition, or high‐light 

stress. 

Anthocyanin is also known for different color at different pH. It usually 

appears as pink  in color when acidic, purple  in color when neutral and 

greenish yellow when alkaline.   

 

P. 6  

 Fig.3 The binding between anthocyanin and metal ions. 

 

Anthocyanin  changes  color  too  when  adding  on  different 

concentration of metal  ions.  It forms dative bond with metal  ion  (Fig.3) 

and changes the structure of anthocyanin, this cause the change of color 

of anthocyanin. 

 

1.3 Design of experiment

  We choose vegetables and  fruits  such as beetroot, purple cabbage 

and blueberry as a source of anthocyanin.  In each extraction, 50 grams 

of vegetable or  fruits are crushed and then extracted with alcohol. The 

alcohol extracts are filtered and stored in dark to prevent decomposition 

of anthocyanin by light.   

  The  amount  of  anthocyanin  is  determined  by  spectrometer. 

Anthocyanins show an absorption maxima  in the range of 500‐600 nm. 

By  Beer’s  Law,  the  concentration  of  anthocyanin  in  the  extracts  is 

proportional  to absorbance.  It would be  the best  if we  can obtain  the 

spectra  with  pure  anthocyanins.  However,  they  are  not  commercially 

available.  Therefore,  instead  of  determining  the  concentration  of 

anthocyanin, we fix the absorbance of absorption peak to certain value, 

P. 7  

say, 0.2, by proper dilution, so that the concentration of anthocyanins in 

different extracts are comparable. 

  We selected seven metal ions (Ni2+,Pb2+,Zn2+,Cu2+,Fe3+,Cd2+ and Co2+) 

to  investigate  the  response of  anthocyanins  towards  these metal  ions. 

For extracts with drastic color change, we will  investigate the detection 

limit of these metal ions. 

  Finally, we use Rohdea  japonica  to mimic  the  vegetables or plants 

irrigated  with  industrial  waste‐contaminated  water. We  would  like  to 

investigate the  feasibility of using anthocyanin as a probe to detect the 

metal ions in the vegetables. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P. 8  

2. Experimental 

 

Preparation of solution 

0.5M metal  ion  solutions  Fe3+,  Pb2+,  Cu2+,  Zn2+,  Cd2+,  Co2+,  Ni2+ are 

prepared  by  dissolving  suitable  amount  of  FeCl3,  Pb(NO3)2,  CuSO4, 

ZnCl2,CdCl2, CoCl2 and NiSO4 in 100cm3 distilled water. 

 

 

Extraction of anthocyanin 

50g vegetables are cut into pieces. Then they are mixed with alcohol 

and  crushed  in a mortar. Extract  is  filtered and  then  kept  in dark. The 

extract is freshly prepared every 3 to 5 days. 

 

 

Action of different metal ions on anthocyanin 

We  use  spectrometer  to  find  out  the  absorption  maxima  of  the 

anthocyanin.  The  absorbance  of  peak  is  fixed  to  0.1  to  0.2  by  proper 

dilution. 1cm3 0.5M Fe3+, Pb2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Co2+, Ni2+  solutions and 

water  are  added  to  each  well  of  a  24‐well  plate.  1cm3  anthocyanin 

extract  is added  to each metal  ion  solution. For  control, 1cm3 water  is 

used instead of anthocyanin extract. 

 

 

 

P. 9  

Detection  the  limitation  of  Pb2+,  Fe3+  and  Cu2+  by 

anthocyanin 

0.5M, 0.05M, 5mM, 0.5mM, 0.05mM, 0.005mM of 1cm3 metal  ion 

solutions (Pb2+, Fe3+, Cu2+) and water are added to each well of the plate. 

1cm3 anthocyanin with an absorbance of 0.2 is added to each metal ion 

solution  and water.  1  cm3 water  is  also  used  instead  of metal  ions  in 

control. For spectrometric analysis, mixtures are prepared by  the same 

method and their spectra are recorded by PASCO PS‐2600 Spectrometer.   

 

Cultivation of plants in metal salt solution 

3 Rohdea Japonica are immersed in 500cm3 metal  ion solution(Fe3+, 

Pb2+,  Cu2+)  of  2mM.  Same  amount  of  Rohdea  Japonica  are  planted  in 

distilled water  as  control. Metal  ion  solutions  and water  are  changed 

every 2 days. 

 

Test the presence of metal ions in Rohdea Japonica 

Each Rohdea Japonica is washed under running water. Leaf and roof 

of Rohdea Japonica are cut into pieces and burned to ash. 0.17g of ash is 

mixed with 3ml extract with purple cabbage extract with absorbance of 

0.15. The mixture  is filtered and 1 ml of the filtrated  is added each well 

of a 24 well‐plate. 

 

 

 

P. 10  

3. Results and discussions 

3.1 Absorption spectrum of different vegetables or fruit

extracts

 Fig.4: Absorption spectra of purple cabbage extract in alcohol. 

 Fig.5: Absorption spectra of beet root extract in alcohol 

P. 11  

 Fig.6: Absorption spectra of blueberry extract in alcohol. 

 

From Fig. 4 to Fig. 6, all extracts show an absorption peak between 

500‐600 nm. We can see  that  the absorption peak of beet root extract 

and  blueberry  extract  are  both  sharp  and  their  absorption maximum 

position are comparable (575nm and 578nm, respectively). However, the 

absorption peak of purple cabbage extract is boarder and it is positioned 

545nm. 

 

 

 

 

 

 

P. 12  

3.2 Response of anthocyanin to different metal ions

Fig.7: Color change of beetroot extract in 0.25M metal salt 

From Fig7, we can see that the color of beetroot extract only change 

slightly after adding metal ions except Ni2+, Cu2+ and Fe3+ turn to brown, 

green and deep yellow, respectively.   

0.25M metal 

solution+water 

0.25M metal 

solution+beetroot 

extract 

P. 13  

  

 

Fig.8: Color change of blueberry extract in 0.25M metal salt 

From Fig. 8, we can see  that  the color change of blueberry extract 

after is more significant compare with that of beet root extract after the 

addition of metal ion. We can see that only Zn2+, Cd2+ and Cu2+ turn to red 

or pink color. Ni2+ and Fe3+ turn to brown color. Pb2+ and Cu2+ turn to dark 

purple color. 

0.25M metal 

solution+water 

0.25M metal 

solution+blueberry 

extract 

3 

P. 14  

 Fig.9: Color change of purple cabbage extract in 0.25M metal salt 

 

The color change of purple cabbage extract  is even more significant 

as shown  in Fig. 9. Zn2+ Cd2+ and Cu2+ turn  to purple color. Ni2+  turns  to 

brown color. Pb2+, Cu2+ and Fe3+ turn to deep purple color. 

 

As  both  blueberry  and  purple  cabbage  extract  shows  the  most 

drastic color changes after the addition of metal ions, these two extracts 

are chosen to study their detection limits on Pb2+, Cu2+ and Fe3+. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.25M metal 

solution+water 

0.25M metal 

solution+purple 

cabbage extract 

3 

P. 15  

3.3 Detection limit of Pb2+, Cu2+ and Fe3+ by blueberry

and purple cabbage extracts (a) 

 

(b) 

 Fig.10: Mixture of (a) blueberry and (b) purple cabbage extract and Pb2+, Cu2+ and 

Fe3+ at different concentrations 

Cu2+ 

 

Fe3+ 

 

 

Pb2+ 

0.25M      0.025M        25mM      2.5mM      0.25mM    0.025mM 

Fe3+ 

 

 

Pb2+ 

 

0.25M      0.025M    25mM    2.5mM    0.25mM    0.025mM 

water 

water 

Cu2+ 

P. 16  

From Fig. 10 (a) and (b), we can see that both blueberry and purple 

cabbage extract have significant color change when the concentration of 

metal  ion  solution down  to 25mM. It  seems  that  the anthocyanines  in 

both blueberry and purple cabbage bind to iron(III) ion strongly as shown 

by their intense color at 25mM compare with other two metal ions.   

Although  both  blueberry  and  purple  cabbage  extract  have 

comparable detection limits, purple cabbage gives a bigger contrast than 

that of blueberry extract. Therefore, we  investigate the action between 

we use Pb2+ Cu2+ and Fe3+ and purple cabbage by spectroscopic method. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P. 17  

3.4 Absorption spectrum of purple cabbage extract

with different concentration of Pb2+ Cu2+ and Fe3+ (a)                  (b) 

 (c) 

 

Fig.11 Absorbance spectrum of purple cabbage extract with (a) lead(II), (b)copper(II) 

and (c) iron(III) ion           

 

As shown in Fig. 11(a), a new peak at 583nm appears gradually as the 

concentration of lead(II) ion increases. This may responsible for the deep 

purple color of the cabbage.   

On the other hand, an absorption peak 538nm appears when copper(II) 

ion  is  added  to  the  extract.  In  addition,  there  is  a new broad peak  at 

789nm, which  is absent  in  lead(II) complex.  In addition, the absorbance 

increases drastically when the concentration reaches 25mM. 

0.25M 

0.025M 

25mM 

2.5mM 

0.25mM 

0.025mM

538 583.7

789 

0.25M 

0.025M 

25mM 

2.5mM 

0.25mM 

0.025mM

585 

0.25M 

0.025M 

25mM 

2.5mM 

0.25mM 

0.025mM 

 

P. 18  

The absorbance of purple cabbage with  iron(III)  ion has no significant   

changes. When  the  concentration  of  iron(III)  ion  reaches  25 mM,  its 

absorption  spectrum  changes  abruptly  together  with  emergence  of  a   

new,  intense  absorption  peak  at  585  nm.  It  seems  that  the 

iron(III)‐anthocyanine  complex  is  not  formed  until  iron(III)  ion 

concentration  reaches  to  a  certain  value, which  is  very  different  from 

that  of  other  two metal  ions.  This  also  explains why  anthocyanine  in 

purple  cabbage  extract  gives  more  intense  color  in  the  presence  of 

25mM  iron(III)  solution  when  compare  with  that  with  copper(II)  and 

lead(II) ions in Fig. 10(b).   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P. 19  

3.5 Growth of Rohdea Japonica in different metal ion

solutions Day 1                  Day 3 

 

Day 6                  Day 8 

   Day 10                  Day 10 (whole plant) 

 

Fig. 12 Growth of Rohdea Japonica in Cu2+, Fe3+, water and Pb2+ (from left to right. 

Metal ion concentration = 2mM.   

 

In order to find out the feasibility of using purple cabbage extract as 

a  probe  for  detecting  heavy metal  ions  in  vegetables, we  use  Rohdea 

Japonica as a model plant. Fig. 12 shows its growth in different metal ion 

solutions with water as a control. All the plants looked healthy on day 1 

and day 3. Nonetheless, the  leaves of the plants cultivated  in metal  ion 

P. 20  

solutions  seemed  stop  to  grow  starting  from day 6. Among  these,  the 

plant  cultured  with  copper(II)  ion  began  to  turn  yellow.  The  growth 

difference is more significant on day 10, and the leaves of the plant with 

copper(II) salt start to wilt. Also we can see that the roots of plants which 

planted  in metal  ion  solutions  turned  brown  to  different  extents.  This 

show these metals ions exhibit different toxicity to Rhodea Japonica.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P. 21  

3.6 Using anthocyanin as a probe for the presence of

metal ions in plant.

The Rohdea Japonica are washed under running water to wash away 

any metal salts adsorbed on  the surface of  the plant. The  roots, stems 

and  leaves are  cut  into  separately and burnt  in order  to  release metal 

ions from the plant tissue. However, the stems cannot be burnt into ash 

with  Bunsen  burner  flame  even  with  10  minutes  of  direct  burning. 

Therefore only root and leaves are collected for further studies.   

After  burning,  the  ash of  the  plants  are weighted  and mixed with 

3ml of purple cabbage extracts. 1ml of filtered mixture  is added to a 24 

well plate as shown in Fig. 13.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig.13 Different parts of plant absorbed with metal ions solution burned and mixed 

with purple cabbage extract 

 

 

 

Extract 

only Water      Pb2+            Cu2+        Fe3+ 

Root

 

Leaf 

P. 22  

The  color of extract of  the ashes  from Rohdea  Japonica which has 

been planted  in water  turned  from purple  to  green.  It may be due  to 

change of pH by  the ash. The  color of extract  changes  to deep brown 

with  the ashes of both  root and  leaves  from  the plant which has been 

cultivated in Cu2+ salt. The color is similar to the mixture between extract 

and pure metal salt. Although  the color change  for  lead(II) and  iron(III) 

salts are not significant, there may be some other reason behind such as 

the difference in uptake of metal ions by the plant.   

 

4. Conclusion 

We have demonstrated that anthocyanines  in many vegetables and 

fruits  can bind with different metal  ions  to give  intense  colors. Among 

these, anthocyanine  from purple cabbage gives significant color change 

in the presence of copper(II), lead(II) and iron(III) ions with concentration 

down to 25 mM. We have seen that purple cabbage extract can detect 

the  copper(II)  ion  absorbed  in  root  and  leaves  of  Rhodea  Japonica. 

Although different plants may have different uptakes on the same metal 

ion, our work  successfully demonstrates  the possibility of using purple 

cabbage extract  to detect  the presence of metal  ions  in plants.  In our 

future  works,  we  will  explore  different  ways  to  optimize  the  testing 

process, especially the treatment of the plant. For example, we may use 

blender to obtain Rohdea Japonica extract instead of burning into ash, or 

even blend it with purple cabbage to observe any color change.   

 

 

P. 23  

5. References http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=785410 

 

https://www.engg.ksu.edu/CHSR/outreach/resources/docs/15HumanHe

althEffectsofHeavyMetals.pdf 

 

http://www.academia.edu/543847/Effect_of_Toxic_Metals_on_Human_

Health 

 

http://www.doctorshealthpress.com/general‐health/heavy‐metals‐the‐h

idden‐harmful‐ingredient‐even‐in‐healthy‐foods 

 

http://en.wikipedia.org/wiki/Anthocyanin 

 

http://en.wikipedia.org/wiki/Beer%E2%80%93Lambert_law 

 

http://en.wikipedia.org/wiki/Spectrometer 

 

http://en.wikipedia.org/wiki/Absorbance