*DE102007048134A120090409*

(19)Bundesrepublik Deutschland Deutsches Patent- und Markenamt

(10) DE 10 2007 048 134 A1 2009.04.09

(12) Offenlegungsschrift

(21) Aktenzeichen: 10 2007 048 134.0(22) Anmeldetag: 05.10.2007(43) Offenlegungstag: 09.04.2009

(51) Int Cl.8: C12N 15/63 (2006.01)C12N 15/66 (2006.01)

Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen

Prüfungsantrag gemäß § 44 PatG ist gestellt.

(54) Bezeichnung: Verfahren und Gen-Kassetten zur Klonierung, Integration und Expression mehrerer Gene eines Genclusters

(57) Zusammenfassung: Die Erfindung betrifft ein Verfah-ren zur Klonierung, Integration und Expression meherer Gene mindestens eines Genclusters sowie mindestens eine Gen-Kassette zur Durchführung des Verfahrens. Die Gen-Kassetten sind aus verschiedenen Einzelkomponen-ten zusammengesetzt. Beide Kassetten enthalten jeweils einen Selektionsmarker (die Antibiotika-Resistenzgene für Tc und Gm), ein Reportergen (promotorlose Gene, die für das gelb fluoreszierende Protein (YEP) sowie für die Kana-mycin-Resistenz (KmR) kodieren), einen T7-Promotor und Transpositions-Elemente (OE-L, OE-R). Eine der beiden Gen-Kassetten enthält zusätzlich ein Transposase-Gen. In einer der beiden Gen-Kassetten ist ferner zusätzlich ein ori-gin of replication (oriT) und in der anderen Gen-Kassette ein lac-Operator integriert.

(71) Anmelder: evocatal GmbH, 40225 Düsseldorf, DE

(74) Vertreter: Remus, A., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 40470 Düsseldorf

(72) Erfinder: Drepper, Thomas, 44225 Dortmund, DE; Wilhelm, Susanne, 45139 Essen, DE; Rosenau, Frank, 40880 Ratingen, DE; Markert, Annette, 40221 Düsseldorf, DE; Jaeger, Karl-Erich, 45479 Mülheim, DE

(56) Für die Beurteilung der Patentfähigkeit in Betracht gezogene Druckschriften:DE 41 13 385 A1 WO 98/40 510 A1 WO 01/83 786 A2 Herrero, M. [u.a.]: A T7 RNA polymerase-based syst em for the construction of Pseudomonas strains wit h phenotypes dependent on TOL-meta pathway effecto rs, In: Gene, 1993, Vol. 134, S. 103-106;

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Beschreibung

[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung, Integration und Expression mehrerer Gene mindes-tens eines Genclusters sowie mindestens eine Gen-Kassette zur Durchführung des Verfahrens.

Hintergrund der Erfindung

[0002] Mikroorganismen produzieren eine große Anzahl von wissenschaftlich, biotechnologisch und medizi-nisch bedeutenden Substanzen. Beinahe täglich werden durch genome mining, oder aufwendige Metagenom- und Screeningverfahren neue Gene identifiziert, die für die Synthese ungewöhnlicher Stoffwechselprodukte mit biomedizinischem Potential verantwortlich sind. Dabei zeigt sich, dass für die Synthese solcher Stoffwech-selprodukte (in der Regel Sekundärmetabolite) häufig eine größere Anzahl verschiedener Enzyme benötigt wird, die gemeinsam einen Enzymkomplex oder metabolic pathway bilden. Interessanterweise sind die Gene, die für solche Enzymsysteme codieren und somit funktionell miteinander gekoppelt sind, zumeist gemeinsam in großen funktionellen Clustern auf einem Chromosom organisiert. Zu den bekanntesten Beispielen biotech-nologisch und medizinisch relevanter Verbindungen, die durch komplexe Enzymsysteme erzeugt werden, ge-hören die so genannten Polyketide und nicht-ribosomalen Peptide. Sie werden durch Polyketid-Synthasen (PKS) und nicht-ribosomale Peptidsynthasen (NRPS) in multimodularen Assemblierungsschritten synthetisiert (Wenzel & Müller, 2005), deren Gene in großen Clustern von mindesten 40 kb Länge lokalisiert sind. Viele der neuen bioaktiven Verbindungen stammen jedoch aus einzelligen Organismen, die ein sehr langsames Wachs-tum aufweisen oder gar nicht kultivierbar sind (wie z. B. Symbionten von marinen Schwämmen oder Korallen). Somit ist die heterologe Synthese solcher Verbindungen in etablierten bakteriellen Produktionsstämmen oft die einzige Möglichkeit ein neues Stoffwechselprodukt in großen Mengen zur Verfügung zu stellen.

[0003] Um jedoch eine heterologe Synthese von Sekundärmetaboliten in einem fremden Organismus zu er-möglichen, müssen grundsätzlich zwei Vorraussetzungen erfüllt werden. Zum einen muss das gesamte Gen-cluster vom Ursprungsorganismus in den bakteriellen Produktionsstamm übertragen werden und zum anderen müssen im mikrobiellen Produktionsstamm die genetischen Voraussetzungen geschaffen werden, um die wirtsfremden Gene funktionell exprimieren zu können. Die damit verbundenen Probleme und die in der Litera-tur beschriebenen Lösungsansätze werden im Folgenden an einigen Beispielen erläutert.

1.1 Die heterologe Expression von Enzymkomplexen und biosynthetic pathways

[0004] Die funktionelle Expression eines Enzyms in einem biotechnologisch gut handhabbaren Mikroorganis-mus wie z. B. Escherichia coli ist in der Regel durch verschiedene Faktoren limitiert:

Der Codongebrauch

[0005] Verschiedene Mikroorganismen weisen sehr unterschiedliche Präferenzen in ihrem Codon-Gebrauch auf. Wenn der Codon-Gebrauch zwischen Urspungs- und Wirtsorganismus zu stark voneinander abweicht, kann es zu einer erheblichen Beeinträchtigung der Translation der heterologen Zielgene kommen (Gustaffson et al., 2004).

Wirtsspezifische DNA-Elemente

[0006] Häufig werden fremde genetische Elemente, wie Promotoren oder regulatorische Regionen im Wirts-organismus nicht oder nur unzulänglich erkannt, wodurch die Transkription der Zielgene beeinträchtig wird oder gar nicht initiiert werden kann (Lambalot et al., 1996).

Biosynthetic background

[0007] Sowohl die Expression wirtsfremder Biokatalysatoren als auch die Synthese neuer Stoffwechselpro-dukte (z. B. Sekundärmetabolite) stellen z. T. sehr spezifische Anforderungen an den Stoffwechselhintergrund des Wirtsorganismus. So müssen z. B. für die heterologe Synthese von Proteinen, welche Kofaktoren oder prosthetische Gruppen benötigen (wie etwa Redoxenzyme), diese Kofaktoren im Expressionswirt in ausrei-chenden Mengen bereitgestellt und in das wirtsfremde Protein einbauen (Drepper et al., 2005) oder alle Ko-faktorsynthesegene des Ursprungsorganismus im heterologen System coexprimiert werden. Ähnlich verhält es sich mit Proteinen, die ein großes Fehlfaltungspotential aufweisen; hier erfordert die funktionelle Expression eine leistungsstarke Proteinfaltungsmaschinerie (sog. Chaperone) (de Marco et al., 2007). Hinzu kommen be-sondere Erfordernisse an die Stoffwechselleistung der Wirtszelle: Diese spielt zum einen eine bedeutende Rol-

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le, wenn für die Produktion einer Verbindung eine ungewöhnliche Vorstufe bereitgestellt werden muss. Zum anderen konnte jedoch auch beobachtet werden, dass je nach individueller Stoffwechselleistung des mikrobi-ellen Produktionsstamms, völlig neue Verbindungen mit hohem biotechnologischem Potential erzeugt werden konnten (Wenzel et al., 2005).

[0008] In den letzen Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die dargestellten Probleme bei der heterologen Expression komplexer Enzymsysteme systematisch zu umgehen. Dabei beruhen alle be-schrieben Methoden grundsätzlich auf zwei unterschiedlichen Prinzipien:

1) Die heterologe Genexpression in verwandten Wirtsorganismen

[0009] Besteht zwischen dem Ursprungsorganismus und dem ausgewählten Produktionsstamm eine nahe Verwandtschaft, ähneln sich häufig codon-usage und Promotorstrukturen, sodass die heterologen Gene recht einfach exprimiert werden können. So konnte z. B. das dpt-Gencluster aus Streptomyces roseosporus, wel-ches für das Antibiotikum Daptomycin codiert, erfolgreich in Streptomyces lividans exprimiert werden (Miao et al., 2005). Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch grundsätzlich darin, dass für die funktionelle Expression eines komplexen Enzymsystems ein verwandter und gut handhabbarer Expressionsstamm zur Verfügung ste-hen muss. Darüber hinaus ist die Expression der Zielgene nicht oder nur schlecht steuerbar und führt in der Regel lediglich zu geringen Protein- und Produkt-Ausbeuten.

2) Die heterologe Genexpression mit etablierten Expressionssystemen

[0010] Die Expression vieler Gene eines Genclusters kann alternativ in gut etablierten Expressionsystemen durchgeführt werden (Kao et al., 1994). Obwohl die sukzessive und zielgerichtete Umklonierung geclusterter Gene in entsprechende Expressionsplasmide sehr zeitaufwendig ist, bietet diese Methode einen entscheiden-den Vorteil: Die heterologe Expression der Clustergene kann so auch in nicht-verwandten Expressionswirten durchgeführt werden, da die Zielgene in den verwendeten Expressionsvektoren unter der Kontrolle wirtsspe-zifischer Promotoren gestellt werden können. Dies ermöglicht in der Regel zudem eine kontrollierte Überpro-duktion der gewünschten Biokatalysatoren oder Metabolite in dem rekombinanten mikrobiellen Produktions-stamm.

[0011] Mit diesem Verfahren konnte z. B. das Siderophor Yersiniabactin aus Yersinia pestis erfolgreich in E. coli hergestellt werden (Pfeifer et al., 2001; Pfeifer et al., 2003). Für die Synthese von Yersiniabactin musste ein 22 kb großes Gencluster in den E. coli Wirtsstamm übertragen werden. Auch Epothilone D, ein natürliches Polyketid aus Sorangium cellulosum, dessen Synthese-Gencluster 56 kb umfasst, konnte so heterolog in My-xococcus xanthum exprimiert werden (Julien & Shah, 2002; Lau et al., 2002).

1.2 Konstruktion rekombinanter Plasmide zur Expression geclusterter Gene mittels gentechnologischer Ver-fahren

[0012] Funktionell gekoppelte Gene eines großen Clusters liegen meist nicht in gleicher Transkriptionsrich-tung vor und weisen in der Regel mehr als einen Promotor und einen Transkriptionsterminator auf. Eine solche Genanordnung macht daher den sukzessiven Einbau der einzelnen Gene in entsprechende Expressionsvek-toren für die kombinierte Transkription unumgänglich. Grundsätzlich sind jedoch kommerziell erhältliche Ex-pressionssyteme lediglich für die Klonierung und Expression eines Gens oder einer aus wenigen Genen be-stehenden Transkriptionseinheit ausgelegt. Um geeignete rekombinante Expressionsvektoren zu erzeugen, werden in den meisten Fällen die Ausgangsvektoren und die Zielgene-tragenden DNA-Fragmente mithilfe de-finierter TypII-Restriktionsendonukleasen hydrolysiert und anschließend die kompatiblen Enden der dabei ent-standenen DNA-Fragmente mit DNA-Ligasen miteinander verknüpft. Die Größe der handhabbaren DNA-Frag-mente ist dabei jedoch aufgrund der Eigenschaften der Restriktionsendonukleasen auf ca. 10 kb limitiert: Re-striktionsenzyme erkennen spezifisch eine palindromische Nukleotidabfolge von sechs Basen, wodurch statis-tisch jedes DNA-Fragment mit einer beliebigen Sequenz für jede Restriktionsendonuklease nach ca. 4000 bp eine Erkennungsstelle aufweist. Somit ist die Umklonierung großer DNA-Fragmente in einem Schritt mit her-kömmlichen gentechnologischen Verfahren nicht möglich.

[0013] In der Literatur werden bislang zwei grundsätzliche Methoden beschrieben, verschiedenen Gene zu klonieren um sie anschließend im geeigneten Wirt zu exprimieren:

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1) Komplexe Abfolge forcierter Klonierungen

[0014] Mit Hilfe von PCR werden zunächst die einzelnen Gene des zu exprimierenden Genclusters amplifi-ziert. Durch den Einsatz von geeigneten Primern, die neben den homologen Sequenzen auch Erkennungsstel-len für Restriktionsendonukleasen beinhalten, können die einzelnen Sequenzen nach der PCR in Vektoren klo-niert werden. In weiteren Klonierungsschritten werden die einzelnen Komponenten des Clusters sukzessive wieder zusammengefügt.

[0015] Aufgrund der zahlreichen Klonierungsschritte und der erforderlichen komplexen Klonierungsstrategie ist diese Methode allerdings sehr zeitaufwendig (Wenzel et al., 2004). Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass aufgrund der vielen PCRs Mutationen in den Genen eingebaut werden können.

2) Red/ET cloning technology

[0016] Das Red/ET cloning technology Verfahren beruht auf dem Prinzip der homologen Rekombination (Zhang et al., 1998), die unter Verwendung der isolierten Proteine RecE und RecT bzw. den homologen Pro-teinen Red⎕ und Red⎕ in vitro durchgeführt werden kann. Mit Hilfe dieser Methode konnte ein Gencluster aus dem Myxobakterium Stigmatella aurantiaca, das für Myxochromid S kodiert, kloniert und anschließend hetero-log in Pseudomonas putida exprimiert werden (Wenzel et al., 2005). Vor dem vollständigen mch Gencluster, das für Myxochromid S kodiert, wurde durch homologe Rekombination ein origin of transfer (oriT) inseriert, der die Übertragung des Genclusters nach P. putida ermöglichte. Außerdem wurde ein wirtsspezifischer Promotor integriert, der im Gegensatz zu dem natürlichen Promotor des Genclusters von P. putida erkannt wurde.

[0017] Obwohl durch die beschriebenen Methoden im Einzelfall die Erzeugung eines mikrobiellen Produkti-onsstamms grundsätzlich möglich ist, bleiben einige Probleme, insbesondere bei der Expression großer Gen-cluster, bestehen. So sind große Genregionen, wie bereits erwähnt, häufig von Transkriptionsterminatoren un-terbrochen und die Integration eines wirtsspezifischen Promotors nach jeder Transkriptionstermination ist tech-nisch sehr aufwendig. Die Gene eines Clusters sind zudem oft nicht in einer Orientierung angeordnet, sodass bislang weitere Klonierungsschritte notwendig sind, um die Gene in einer Orientierung anzuordnen und eine vollständige Transkription aller Gene eines Clusters zu erreichen. Hinzu kommt, dass die Etablierung eines Genclusters auf einem extrachromosomalen DNA-Element, wie einem Plasmid, Cosmid oder BAC, in einem heterologen Wirt in der Regel nicht stabil erfolgt.

Zusammenfassung der Erfindung

[0018] Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die koordinierte funktionelle Expression komplexer Enzymsysteme, Gencluster aus Metagenom- und cDNA-Banken sowie ganzer Biosyn-thesewege in verschiedenen Gram-negativen Bakterien ermöglicht.

[0019] Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, das fol-gende Schritte umfasst: – Bereitstellen von mindestens zwei Gen-Kassetten, die Sequenzen aufweisen, welche die Übertragung und Integration eines flankierten Nukleinsäuremoleküls sowie die Expression aller Gene des flankierten Nu-kleinsäuremoleküls vermitteln;– Erzeugung eines rekombinanten Transposons durch Verknüpfung der Gen-Kassetten mit einem Nuklein-säuremolekül, das mindestens ein Gencluster umfasst, wobei mindestens eine erste Gen-Kassette strom-aufwärts des Genclusters und mindestens eine zweite Gen-Kassette stromabwärts des Genclusters ange-hängt wird;– Einbringen des Transposons in eine Rezipientenzelle, wobei sich das Transposon selbstständig in das Genom der Rezipientenzelle integriert; und– Koordinierte Expression aller Gene des Genclusters in der Rezipientenzelle.

[0020] Zur Überwindung der genannten Probleme bei den bekannten Verfahren wird erfindungsgemäß ein vorteilhaftes Verfahren für die Klonierung, Integration und Expression großer Gencluster in biotechnologisch handhabbaren Expressionswirten zur Verfügung gestellt, das (i) die Restriktionsendonuklease-unabhängige Einschrittklonierung großer Gencluster ermöglicht, (ii) die stabile Etablierung der rekombinanten Expressions-kassette in beliebigen Gram-negativen Bakterien erlaubt und (iii) eine vollständige Expression aller Zielgene unabhängig von den ursprünglichen Promotoren und Transkriptionsterminatoren gestattet. Die zielgerichtete oder randomisierte Expression wirtsfremder Gencluster in bakteriellen Wirtsstämmen mit breit gefächerten Stoffwechselleistungen (das so genannte „pathway engineering") ermöglicht dabei die Synthese neuer, bio-

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technolgisch relevanter Substanzen. Hierdurch können neue bakterielle Expressions- und Produktionsstämme für den Einsatz in der weißen Biotechnologie erzeugt werden.

[0021] In besonders vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Expression aller Gene des Genclusters in der Rezipientenzelle mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase erfolgt.

[0022] Die Verknüpfung der Gen-Kassetten kann beispielsweise durch homologe Rekombination erfolgen. Al-ternativ können aber auch andere gentechnologische in vitro Verfahren zur Intergration der Gen-Kassetten in die Zielnukleinsäure angewendet werden.

[0023] Das Einbringen des rekombinanten Transposons in die Rezipientenzellen kann beispielsweise durch Konjugation erfolgen. Es können aber alternativ auch andere Transformationsverfahren eingesetzt werden.

[0024] Die genannte Aufgabe wird ferner durch die Bereitstellung mindestens einer Gen-Kassette zur Klonie-rung mindestens eines Genclusters gelöst, wobei die Gen-Kassette die folgenden Elemente umfasst: – mindestens eine Promotor-Sequenz; und– mindestens ein Transpositionselement.

[0025] Die erfindungsgemäße Gen-Kassette ist Bestandteil eines universellen Expressionssystems, das die kombinierte Expression vieler Zielgene in unterschiedlichen bakteriellen Expressionswirten erlaubt und insbe-sondere für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Die Gen-Kassette erlaubt die gezielte Induktion und kontrollierte Überexpression geclusterter Zielgene und ermöglicht die unkomplizierte und zeiteffiziente Klonierung großer DNA-Fragmente durch sequenzspezifische Rekombinationsprozesse. Ferner ermöglicht die erfindungsgemäße Gen-Kassette eine schnelle Erzeugung geeigneter bakterieller Ex-pressionsstämme durch die zielgerichtete Übertragung eines rekombinanten Transposons und dessen eigen-ständige Integration in das Wirtschromosom.

[0026] In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Gen-Kassette umfasst die Promotor-Sequenz die Erken-nungs- und Bindungsstelle für die T7-RNA-Polymerase. Ferner kann die Gen-Kassette zusätzlich mindestens ein Transposase-Gen, vorzugsweise das tnp-Gen, umfassen. Das Transpositionselement kann in besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ein OE-L- oder ein OE-R-Element sein. Die erfindungsgemäße Gen-Kassette kann in vorteilhafter Weise auch zusätzlich mindestens ein Reportergen und/oder mindestens einen Selektionsmarker umfassen.

[0027] In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Gen-Kassette ein Antibiotika-Re-sistenzgen mit eigenem Promotor, ein Reportergen ohne eigenen Promotor, ein Transpositionselement und ei-nen Promotor für eine nicht-bakterielle RNA-Polymerase, vorzugsweise die T7-RNA-Polymerase.

[0028] Alternativ kann die Gen-Kassette ein Antibiotika-Resistenzgen mit eigenem Promotor, ein Reportergen ohne eigenen Promotor, ein für eine Transposase kodierendes Gen, ein Transpositionselement und einen Pro-motor für eine nicht-bakterielle RNA-Polymerase umfassen.

[0029] Innerhalb der erfindungsgemäßen Gen-Kassette kann das Antibiotika-Resistenzgen beispielsweise ein Gen für die Tetracyclin-Resistenz (TcR) oder für die Gentamycin-Resistenz (GmR) sein. Das Reportergen kann in vorteilhafter Weise ein Gen für die Kanamycin-Resistenz (KmR) oder ein für ein fluoreszierendes Pro-tein kodierendes Gen sein.

[0030] Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Gen-Kassette auch mindestens einen Replikationsursprung (oriT) und/oder mindestens eine Operator-Sequenz, vorzugsweise den lac-Operator, umfassen.

[0031] Besonders vorteilhaft und erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Zusammensetzung zur Klonierung, In-tegration und Expression mindestens eines Genclusters, die mindestens zwei erfindungsgemäße Gen-Kasset-ten der oben beschriebenen Art umfasst. Die Gen-Kassetten sind dabei derart konstruiert, dass sie sich in ihrer Funktion gegenseitig ergänzen und gemeinsam eine koordinierte und vollständige Expression des Genclusters ermöglichen. Die Gen-Kassetten können an beiden Seiten des zu exprimierenden Genclusters angehängt wer-den, so dass sie dieses flankieren und insgesamt ein rekombinantes Transposon bilden, das in eine geeignete Rezipientenzelle eingebracht werden kann.

[0032] Sind in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zwei Gen-Kassetten enthalten, so umfassen diese jeweils mindestens eine Promotor-Sequenz und jeweils mindestens ein Transpositionselement. In besonders

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vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfasst jede Promotor-Sequenz dabei die Erkennungs- und Bin-dungsstelle für die T7-RNA-Polymerase. Eine der beiden Gen-Kassetten umfasst zusätzlich mindestens ein Transposase-Gen, vorzugsweise das tnp-Gen. Bei den Transpositionselementen kann es in besonders vorteil-hafter Ausgestaltung der Erfindung um OE-L- und/oder ein OE-R-Elemente handeln. Jede Gen-Kassette um-fasst in vorteilhafter Weise zusätzlich mindestens ein Reportergen und/oder mindestens einen Selektionsmar-ker. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung umfassen beide Gen-Kassetten jeweils ein Antibi-otika-Resistenzgen mit eigenem Promotor, ein Reportergen ohne eigenen Promotor, ein Transpositionsele-ment und einen Promotor für eine nicht-bakterielle RNA-Polymerase, vorzugsweise die T7-RNA-Polymerase. In diesem Fall umfasst eine der beiden Gen-Kassette zusätzlich noch ein für eine Transposase kodierendes Gen. Innerhalb der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit zwei Gen-Kassetten kann das jeweilige Anti-biotika-Resistenzgen beispielsweise ein Gen für die Tetracyclin-Resistenz (TcR) oder für die Gentamycin-Re-sistenz (GmR) sein. Das jeweilige Reportergen kann in vorteilhafter Weise ein Gen für die Kanamycin-Resis-tenz (KmR) oder ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen sein. Zusätzlich kann eine der beiden Gen-Kassetten auch mindestens einen Replikationsursprung (oriT) und/oder mindestens eine Operator-Se-quenz, vorzugsweise den lac-Operator, umfassen. Auf diese Weise entsteht eine Zusammensetzung, in der sich die beiden Gen-Kassetten auf optimale Weise ergänzen und die eine effizient Durchführung des erfin-dungsgemäßen Verfahrens ermöglicht.

[0033] Erfindungsgemäß wird ferner ein Vektor zur Klonierung, Integration und Expression mindestens eines Genclusters bereitgestellt, wobei der Vektor mindestens eine erfindungsgemäße Gen-Kassette umfasst. Der Vektor kann in vorteilhafter Weise aber auch zwei oder mehr Gen-Kassetten umfassen.

[0034] Die genannte Aufgabe wird auch durch die Bereitstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gelöst, das mindestens eine Nukleotidsequenz zur Synthese mindestens eines Polypeptids umfasst, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleotidsequenz, welche die Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst;b) Nukleotidsequenz, welche zwei Gen-Kassetten nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst;c) Nukleotidsequenz, welche den Vektor nach Anspruch 18 oder 19 umfasst;d) Nukleotidsequenz, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NR. 13 und/oder 14 umfasst;e) Nukleotidsequenz, welche sich von der Nukleotidsequenz gemäß a), b), c) oder d) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet;f) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotid-sequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisiert;g) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 85%, vorzugsweise 90%, insbesondere 95%, mit der Nukleo-tidsequenz gemäß a), b), c) oder d) identisch ist;h) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotid-sequenzen gemäß a) bis g) ent-spricht.

[0035] Erfindungsgemäß wird ferner ein Kit zur Klonierung, Integration und Expression mindestens eines Genclusters bereitgestellt, welcher mindestens eine erfindungsgemäße Gen-Kassette umfasst. Bevorzugt um-fasst der Kit zwei oder mehr Gen-Kassetten.

[0036] Die Erfindung umfasst auch Zellen, welche mindestens eine erfindungsgemäße Gen-Kassette, den er-findungsgemäßen Vektor und/oder das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthalten sowie Zellkulturen, welche diese Zellen umfasst.

[0037] Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Bespiele und Abbildungen beispielhaft näher erläutert.

Kurze Beschreibung der Figuren

[0038] Fig. 1: Schematischer Aufbau der L- und R-IVAC-Kassetten. Beide Kassetten besitzen je einen Selek-tionsmarker mit einem eigenem Promotor (L-IVAC: die Tetracyclin-Resistenz, TcR; R-IVAC: die Gentamy-cin-Resistenz, GmR) sowie ein promotorloses Reportergen (L-IVAC: die Kanamycin-Resistenz, KmR; R-IVAC: das yellow fluorescent Protein, YFP). Zusätzlich enthalten beide IVAC-Kassetten je einen T7-Promotor und Transpositions-Elemente (die DNA-Elemente OE-L und OE-R sowie das für die Transposase kodierende Gen tnp (Tnp)). Der T7-Promotor der R-IVAC-Kassette steht unter der Kontrolle eines lac-Operators. Die L-IVAC-Kassette besitzt zusätzlich einen origin of transfer (oriT). Flankiert werden die IVAC-Kassetten durch die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen Scal bzw. Smal. In den IVAC-Kassetten sind außer-dem Erkennungssequenzen der Homing-Endonukleasen I-SceI und I-CeuI integriert.

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[0039] Fig. 2: Schematische Darstellung des IVAC-Systems. Im ersten Schritt werden die beiden IVAC-Kas-setten (weiße Rechtecke) neben einem Gencluster (graue Pfeile) durch homologe Rekombination integriert. Die homologen Bereiche sind durch die gestreiften Quadrate symbolisiert (Schritt 1). Im zweiten Schritt wird das markierte Gencluster durch Konjugation in einen Rezipienten transferiert. In der Rezipientenzelle wird das Gencluster zusammen mit den IVAC-Kassetten (weiße Quadrate) aus dem Ursprungsvektor (z. B. ein BAC) in die chromosomale DNA des Rezipienten übertragen (Schritt 3) und exprimiert (Schritt 4).

[0040] Fig. 3: Konstruktion der L-IVAC-Kassette. (A) Schematischer Aufbau der L-IVAC-Kassette. (B) Sche-matische Darstellung der Konstruktion der L-IVAC-Kassette. Durch eine PCR wurden die Gene, die für die An-tibiotikaresistenzen und den oriT kodieren, amplifiziert und anschließend in die Vektoren pUC18 bzw. pUCPSK kloniert (Schritt 1). Das Oligonukleotid, das die Insertionssequenz OE-L sowie die Schnittstelle für das Enzym I-CeuI enthält, wurde in das rekombinante Plasmid pL-IVAC1 kloniert (Schritt 2). Der entstandene Vektor wurde als pL-IVAC2 bezeichnet. Die L-IVAC-Kassette wurde durch die Klonierung des oriT und des Gens tetR in den Vektor pL-IVAC2 vervollständigt (Schritt 3).

[0041] Fig. 4 Konstruktion der R-IVAC-Kassette. (A) Schematischer Aufbau der R-IVAC-Kassette. (B) Sche-matische Darstellung der Konstruktion der R-IVAC-Kassette. Die PCR-Produkte wurden in die Vektoren pUC19 bzw. pSVB10 kloniert und anschließend durch Funktionstests und Sequenzierungen analysiert. Durch die Hydrolyse der Vektoren mit BamHI und BclI bzw BglII wurden zwei Komponenten der R-IVAC-Kassette (das Gen YFP und das Gentamycin-Resistenzgen) aus ihren Vektoren wieder isoliert und sukzessive in den Vektor pR-IVAC1 eingefügt.

[0042] Fig. 5: RT-PCR zum Nachweis des gfp-Transkripts in E. coli BL21(DE3) mit den Plasmiden R-IVAC>GFP bzw. L-IVAC>GFP. Die Expression der T7-Polymerase wurde in E. coli mit 1mM IPTG induziert. Zum Nachweis der T7-Polymerase abhängigen Transkription von gfp, wurde als Kontrolle E. coli mit den ent-sprechenden Plasmiden auch ohne Zugabe von IPTG angezogen. Als Positivikontrolle und interner Standard wurde das Gentamycin-Resistenzgen (GmR) verwendet.

[0043] Fig. 6: IVAC-abhängige Expression des Fluoreszenzmarkers GFP in E. coli BL21(DE3). (A) L-IVAC- vermittelte GFP Expression. (B) L-IVAC- vermittelte GFP Expression. In den jeweiligen E. coli-Stämmen wurde durch Zugabe von 1mM IPTG die Expression des GFP spezifisch induziert.

[0044] Fig. 7: RT-PCR zum Nachweis der Transkription des lac-Operons in R. capsulatus mit dem Transpo-son R>lacZYA. Die Transkripte der Gene lacZ, lacY und lacA konnten in R. capsulatus nach der Induktion der Transktiption mit Fruktose mittels RT-PCR nachgewiesen werden.

[0045] Fig. 8: RT-PCR zum Nachweis der Transkription des lac-Operons in P. putida mit dem Transposon R>lacZYA. Die Transkripte der Gene lacZ, lacY und lacA konnten in P. putida nach der Induktion der Transk-tiption mit IPTG mittels RT-PCR nachgewiesen werden.

[0046] Fig. 9: RT-PCR zum Nachweis der antisense mRNA-Synthese in R. capsulatus mit dem Transposon R>lacZYA. Die komplementären Transkripte der Gene lacZ, lacY und lacA konnten in R. capsulatus nach der Induktion der Transktiption mit Fruktose mittels RT-PCR nachgewiesen werden.

[0047] Fig. 10: RT-PCR zum Nachweis der antisense mRNA-Synthese in P. putida mit dem Transposon R>lacZYA. Die komplementären Transkripte der Gene lacZ, lacY und lacA konnten in P. putida nach der Induk-tion der Transktiption mit IPTG mittels RT-PCR nachgewiesen werden.

[0048] Fig. 11: Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität in R. capsulatus. Die Aktivitäten der β-Galaktosidase sind in Miller-Units angegeben. Es ist die Aktivität im R. capsulatus-Wildtyp (WT) dargestellt sowie in den he-terologen Wirtsstämmen ohne T7-Polymerase (–pML5-Pfru-T7) bzw. mit T7-Polymerase (+pML5-Pfru-T7).

[0049] Fig. 12: Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität in P. putida. Die Aktivitäten der β-Galaktosidase sind in Miller-Units angegeben. Es ist die Aktivität im P. putida-Wildtyp (WT) dargestellt sowie in den heterologen Wirtsstämmen ohne T7-Polymerase (–pML5-T7) bzw. mit T7-Polymerase (+pML5-T7).

[0050] Fig. 13: Plasmidkarte des Plasmids pIC20HRL.

[0051] Fig. 14: Plasmidkarte des Plasmids pR-IVAC>GFP.

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[0052] Fig. 15: Plasmidkarte des Plasmids pL-IVAC>GFP.

[0053] Fig. 16: Plasmidkarte des Plasmids pL>lacZYA.

[0054] Fig. 17: Plasmidkarte des Plasmids pR>lacZYA.

Verschiedene und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

[0055] Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine neue Zusammensetzung, das so genannte „In vivo auto cloning and expression" – System (IVAC), zur universellen heterologen Expression ge-clusterter Gene geschaffen. Das IVAC-System weist folgende Eigenschaften auf:

1) Das IVAC-System ist ein universelles Expressionssystem, das die kombinierte Expression vieler Zielge-ne in unterschiedlichen bakteriellen Expressionswirten erlaubt.2) Es erlaubt die gezielte Induktion und kontrollierte Überexpression geclusterter Zielgene.3) Es ermöglicht die unkomplizierte und zeiteffiziente Klonierung großer DNA-Fragmente durch sequenz-spezifische Rekombinationsprozesse.4) Die Verwendung des IVAC-Systems erlaubt eine schnelle Erzeugung geeigneter bakterieller Expressi-onsstämme durch die zielgerichtete Übertragung des rekombinanten Transposons und dessen eigenstän-dige Integration in das Wirtschromosom.

Übersicht über den Aufbau der erfindungsgemäßen Zusammensetzung (IVAC-System)

[0056] Das IVAC-System basiert auf zwei Kassetten, der L-IVAC- und der R-IVAC-Kassette. Der Aufbau der Kassetten ist in Fig. 1 schematisch dargestellt. Die IVAC-Kassetten sind aus verschiedenen Einzelkomponen-ten zusammengesetzt. Beide Kassetten enthalten je einen Selektionsmarker (die Antibiotika-Resistenzgene für Tc und Gm), ein Reportergen (promotorlose Gene die für das gelb fluoreszierende Protein (YFP) sowie für die Kanamycin-Resistenz (KmR) kodieren), einen T7-Promotor und Transpositions-Elemente (OE-L, OE-R und ein Transposase-Gen). In der L-IVAC-Kassette ist zusätzlich ein origin of replication (oriT), in der R-IVAC-Kas-sette ein lac-Operator integriert.

Überblick über die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Zusammensetzung

[0057] Die beiden IVAC-Kassetten werden durch homologe Rekombination stromaufwärts und stromabwärts eines Ziel-Genclusters, das vorzugsweise bereits auf einem geeigneten Vektor (z. B. einem BAC) liegt, inte-griert (Fig. 2, Schritt 1). Mit Hilfe des IVAC-Systems wird in den folgenden Schritten die Übertragung des so markierten Genclusters in einen bakteriellen Expressionsstamm mittels Konjugation möglich. Durch die spezi-fische Anordnung der beiden IVAC-Kassetten und des Genclusters entsteht überraschender weise ein funkti-onsfähiges rekombinantes Transposon, welches sich nach der Übertragung selbständig in das Chromosom des Rezipientenstammes integriert (Fig. 2, Schritt 2 und 3). Nach der Integration können die Gene des Ziel-clusters durch die T7 RNA-Polymerase transkribiert werden (Fig. 2, Schritt 4). Der Vorteil der T7 RNA-Polyme-rase gegenüber bakteriellen Polymerasen ist, dass sie bakterielle Transkriptionsterminatoren nicht erkennt und so die vollständige Transkription aller Gene eines Clusters unabhängig von Transkriptionsterminatoren mög-lich wird (Macdonald et al., 1992). Unerwarteter weise können über die gegensätzlich angeordneten T7-Pro-motoren der IVAC-Kassetten alle Gene eines Genclusters von beiden Seiten und somit unabhängig von ihrer Orientierung exprimiert werden (Fig. 2, Schritt 4).

Konstruktion der IVAC-Kassetten

[0058] Die L-IVAC-Kassette besteht insgesamt aus sechs, die R-IVAC-Kassette aus acht funktionellen gene-tischen Elementen. Aufgrund des komplexen Aufbaus der IVAC-Kassetten war eine spezielle Klonierungsstra-tegie zur Konstruktion der Kassetten notwendig. Die DNA-Fragmente, die die einzelnen Elemente umfassen, wurden teilweise durch eine PCR amplifiziert, teilweise waren sie Bestandteile synthetisierter Oligonukleotide. Für die Klonierung der einzelnen Komponenten der IVAC-Kassetten mussten diese folgende Eigenschaften besitzen: – Sie durften keine Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen aufweisen, die bei späteren Klo-nierungsschritten stören könnten.– Sie mussten von den kompatiblen Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen BamHI, BclI oder BglII flankiert werden.

[0059] Durch eine Kombination dieser zueinander kompatiblen Schnittstellen konnten die einzelnen Kompo-

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nenten der IVAC-Kassetten zusammengeführt und gleichzeitig die zwischen ihnen liegenden Erkennungsse-quenzen deletiert werden. Die hierbei zugrundeliegenden Klonierungsstrategien sind in den Fig. 3 (Konstruk-tion der L-IVAC-Kassette) und 4 (Konstruktion des R-IVACs) dargestellt.

Nachweis der Aktivität der in den IVAC-Kassetten integrierten T7-Promotoren

[0060] Zur Überprüfung, ob die in den IVAC-Kassetten lokalisierten T7-Promotoren funktionell sind, wurden die einzelnen IVAC-Kassetten stromaufwärts eines promotorlosen gfp Gens kloniert. Die so entstandenen GFP-Expressionsplasmide werden im Folgenden als pL-IVAC>GFP und pR-IVAC>GFP bezeichnet (Fig. 14und Fig. 15). Um zu überprüfen, ob das GFP-Gen ausgehend von den IVAC-T7-Promotoren exprimiert werden kann, wurde der E. coli T7-Expressionsstamm BL21(DE3) mit den erzeugten Plasmiden transformiert und die Expression des Reporterproteins mittels RT-PCR (Fig. 5) und GFP-Fluoreszenzmessungen (Fig. 6) nachge-wiesen. Dazu wurden die erzeugten Expressionsstämme bis zur frühlogarithmischen Wuchsphase angezo-gen, und die T7-Polymerase-abhängige Expression des GFP-Reportergens mit IPTG induziert (+IPTG). Als Kontrolle dienten identische Kulturen, bei denen die GFP-Expression nicht induziert wurde (–IPTG). Die Ergeb-nisse der RT-PCR sind in der Abb. 5 dargestellt und können wie folgt zusammengefasst werden:

(1) Die Anwesenheit des T7-Promotors führte unabhängig von der verwendeten IVAC-Kassette nach Zuga-be von IPTG in den E. coli Expressionsstämmen zu einer signifikanten Transkription des GFP-Gens. In bei-den Fällen (Fig. 5: R-IVAC>GFP +IPTG und L-IVAC>GFP +IPTG) konnte bereits nach acht Zyklen das ent-sprechende Transkript nachgewiesen werden.(2) Unter uninduzierten Bedingungen (Fig. 5: R-IVAC>GFP –IPTG und L-IVAC>GFP –IPTG) war in den ent-sprechenden Expressionsstämmen eine deutlich verminderte Transkription des Reportergens zu verzeich-nen. Im Vergleich zur induzierten Expression liegt in diesem Fall nur 2–3% des gfp Transkripts vor.(3) Um ausschließen zu können, dass die Synthese der detektierten GFP PCR-Produkte auf eine Verunrei-nigungen der isolierten mRNA mit Plasmid-DNA zurückzuführen ist, wurde die aus den E. coli-Stämmen isolierte RNA, die nicht mittels reverser Transkriptase in ihre cDNA umgeschrieben wurde, direkt als Tem-plate in der RT-PCR eingesetzt. Sogar nach 30 PCR-Zyklen konnte in diesen Kontrollproben kein PCR-Pro-dukt nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Somit konnte eine Kontamination der isolierten RNA durch Plasmid-DNA ausgeschlossen werden.

[0061] Um zeigen zu können, dass unter der Verwendung der IVAC-Expressionskassetten GFP in E. coli funktionell exprimiert werden kann, wurde anschließend in Proteinextrakten der entsprechenden Expressions-stämme die GFP-spezifische Fluoreszenz quantifiziert. Die Ergebnisse dieser Fluoreszenzmessung sind in Abb. 6 dargestellt. In den E. coli Expressionsstämmen, die das Plasmid pL-IVAC>GFP (Fig. 6A) oder pR-IVAC>GFP (Fig. 6B) trugen, konnte nur nach Induktion der GFP-Expression (+IPTG) eine Fluoreszenz bei einer spezifischen Wellenlänge von 410 nm detektiert werden. In Abwesenheit des Induktors (–IPTG) war kei-ne GFP-Fluoreszenz nachweisbar. Anhand dieses Beispiels konnte somit gezeigt werden, dass die T7-Promo-toren der beiden IVAC-Kassetten funktionell sind und eine T7-Polymerase-abhängige Überexpression mit den erzeugten IVAC-Kassetten möglich ist.

Die IVAC-vermittelte Integration und heterologe Expression eines Genclusters in Pseudomonas putida und Rhodobacter capsulatus am Beispiel des E. coli lac-Operons

[0062] Anhand der Transkriptionsfusionen mit dem Gen gfp konnte gezeigt werden, dass mit den IVAC-Kas-setten eine T7-Polymerase abhängige Expression von Genen erzielt werden kann. Im Folgenden wurde über-prüft, ob es mit Hilfe der IVAC-Kassetten auch möglich ist, ein Suizid-Plasmid mit einem zu exprimierenden Gencluster durch Konjugation in einen heterologen Wirtsstamm zu übertragen, das Cluster durch Transpositi-on in das Genom des Wirtes zu transferieren und anschließend mit Hilfe der T7-Polymerase zu exprimieren.

[0063] Zur Überprüfung dieser Eigenschaften des IVAC-Systems sollte das promotorlose lac-Operon aus E. coli heterolog in Rhodobacter capsulatus und Pseudomonas putida exprimiert werden. Es wurden dazu zwei Plasmide konstruiert, die im Weiteren als pL>lacZYA und pR>lacZYA bezeichnet werden (Fig. 16 und Fig. 17). Beide Plasmide enthalten sowohl das lac-Operon aus E. coli als auch beide IVAC-Kassetten. Sie unterschei-den sich nur in der Anordnung der IVAC-Kassetten. Im Plasmid pL>lacZYA sind die IVAC-Kassetten so ange-ordnet, dass die T7-Polymerase vom T7-Promotor der L-IVAC-Kassette aus das lac-Operon transkribiert, im Plasmid pR>lacZYA transkribiert die T7-Polymerase ausgehend vom Promotor der R-IVAC-Kassette das Ope-ron. Da R. capsulatus und P. putida kein T7-Polymerase-Gen besitzen, wird dieses nach der IVAC-Transposi-tion über Derivate des replikativen broad host range Plasmids pML5 in den Stämmen etabliert. Das Plasmid pMI5T7 trägt das Gen für die T7-Polymerase unter der Kontrolle des lac-Promotors und wurde in P. putida ver-wendet. Im Plasmid pML5-Pfru-T7 steht das Polymerasegen unter der Kontrolle des Rhodobacter-spezifischen

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Fruktose-Promotors.

Übertragung des lac-Operons in die heterologen Wirtsstämme

[0064] Um zu überprüfen, ob die Übertragung und Etablierung eines Genclusters mittels Konjugation und Transposition unter Verwendung des neuen IVAC-Systems erzielt werden kann, wurden die Plasmide pL>lac-ZYA und pR>lacZYA zunächst in den für Konjugation optimierten Donorstamm E. coli S17-1 transformiert. Als Rezipienten dienten die Gramnegativen Bakterien R. capsulatus und P. putida. Konjugation und Transposition wurden wie im Anhang beschrieben durchgeführt. Da die zu transferierenden Plasmide ein Gentamycin-Re-sistenzgen besitzen, konnten die Rezipientenstämme, die durch Konjugation ein Plasmid aufgenommen und durch Transposition in ihr Genom integriert hatten, von dem jeweiligen Wildtyp-Stamm durch Selektion auf das Antibiotikum unterschieden werden.

[0065] Die Versuche zeigten, dass die Konjugation und Transposition der Plasmide mit Hilfe der IVAC-Kas-setten in beide heterologen Wirtsstämme vermittelt werden konnten. Überraschender weise wich die Transpo-sitionsrate der rekombinanten Transposons (L>lacZYA und R>lacZYA in R. capsulatus: 2 × 10–6 und in P. pu-tida: 7 × 10–5) nicht nennenswert von der Transpositionsrate des natürlichen Tn5-Transposons (Transpositions-rate: ca. 6,5 × 10–5 (Naumann & Reznikoff, 2002)) ab. Der Vergleich mit dem natürlichen Transposon Tn5 zeigt somit, dass sich die rekombinanten IVAC-Transposons problemlos auf die ausgewählten Wirtsstämme über-tragen und in ihre Chromosomen integrieren ließen.

Nachweis der T7-Polymerase abhängigen Transkription des lac-Operons in den heterologen Wirtsstämmen.

[0066] Nach der erfolgreichen Integration des lac-Operons und der IVAC-Kassetten im Genom der heterolo-gen Wirte R. capsulatus und P. putida wurde die T7-Polymerase abhängige Transkription des lac-Operons mit-tels RT-PCR überprüft. In den heterologen Wirtsstämmen wurde die Expression der T7-Polymerase und somit der lac-Gene durch Zugabe von Fruktose (R. capsulatus) bzw. IPTG (P. putida) induziert. Anschließend wurde die mRNA dieser Stämme isoliert. In der darauffolgenden reversen Transkription wurden Primer zum Nachweis der Transkripte von lacZ, lacY und lacA eingesetzt und die so entstandene cDNA als Template in einer RT-PCR verwendet. Die Ergebnisse der RT-PCR sind in den Fig. 7 (R. capsulatus) und 8 (P. putida) dargestellt. Als Transkript-Kontrolle wurde auch in diesem Fall die isolierte mRNA aus R. capsulatus bzw. P. putida direkt (also ohne vorherige cDNA-Synthese) als Template für die RT-PCR eingesetzt.

[0067] Wie in Fig. 7 deutlich zu sehen ist, konnte eine vollständige Transkription des lac-Operons in R. cap-sulatus mit dem Transposon R>lacZYA mittels RT-PCR nachgewiesen werden. In diesem Fall ist ein spezifi-sches PCR-Produkt nach Zyklus 15 (lacZ), 17 (lacA) und 18 (lacY) nachweisbar. Es ist somit Transkript von allen Genen des Operons vorhanden. Auch mit dem L>lacZYA-Transposon sind alle lac-Transkripte in ver-gleichbaren Mengen nachweisbar (ohne Abbildung). Die Negativkontrolle, der Stamm mit integriertem Trans-poson aber ohne das die T7-Polymerase tragende Plasmid pMl5-PFruT7, weist kein Transkript auf (ohne Abbil-dung).

[0068] Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der RT-PCR mit R>lacZYA in P. putida. Die Signale der lacZ-, lacY- und lacA- Transkripte sind im 15., 17. und 18. Zyklus deutlich detektierbar. Wie bereits für R. capsulatus gezeigt wurde, war auch in P. putida mit dem entsprechenden L>lacZYA Konstrukt eine vollständige Expression der übertragenen lac-Gene erreichbar (ohne Abbildung). Die P. putida-Stämme ohne das Plasmid pMI5T7 aber mit integriertem Transposon weisen im Gegensatz zu R. capsultus Transkript der Gene lacZ, Y, A in geringer Kon-zentration auf (ohne Abbildung). Durch Zugabe der T7-Polymerase wird jedoch die Transkriptmenge der Gene deutlich gesteigert. In P. putida können Pseudomonas-Promotoren, die stromaufwärts des IVAC-lac-ZYA-Transposons auf dem Wirtschromosom liegen, die geringe Expression der Testgene herbeiführen kön-nen.

Nachweis der Antisense-Transkripte in R. capsulatus und P. putida

[0069] Anhand des Beispiels des lac-Operons aus E. coli konnte bislang nachgewiesen werden, dass ein durch die IVAC-Kassetten „markiertes" Gencluster mittels Konjugation und Transposition erfolgreich in bakte-riellen Wirtsstämmen etabliert werden kann. Nach der Induktion der T7-Polymerase Expression konnten zudem in beiden getesteten Expressionswirten die lac-Gene des Testgenclusters transkribiert werden. Da die Gene komplexer Gencluster jedoch im Gegensatz zum lac-Operon häufig nicht in einer Orientierung vorliegen, muss grundsätzlich die Transkription der Gene, die von den beiden IVAC-Kassetten flankiert werden, auch in die ent-gegengesetzte Leserichtung erfolgen. Daher sollte im Folgenden mittels RT-PCR untersucht werden, inwieweit

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antisense Transkripte des lac-Genclusters in den mit der IVAC-Technologie erzeugten Expressionsstämmen, synthetisiert werden.

[0070] In den Fig. 9 und Fig. 10 sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen dargestellt. Erstaunlicher weise konnte sowohl im R. capsulatus (Fig. 9) als auch im P. putida (Fig. 10) T7-Expressionstamm nach der Etablie-rung des R>lacZYA Transposons signifikante Mengen der jeweiligen antisense Transkripte nachgewiesen wer-den. Auch in diesem Fall ist die Synthese der RNA unabhängig von der Anordnung der IVAC-Kassetten (ohne Abbildung). Zur Überprüfung, ob die Synthese der antisense-RNA abhängig von der T7-Polymerase ist, wurden die Bakterienstämme mit integriertem Transposon aber ohne T7-Polymerase in der RT-PCR eingesetzt. Sie weisen kein Transkript (R. capsulatus) bzw. gering konzentrierte Transkriptmengen (P. putida) auf (ohne Abbil-dung). Um nachweisen zu können, dass auch bei diesen Versuchen ausschließlich die von den Transkripten erzeugte cDNA und nicht etwa die chromosomale DNA die Signale in der RT-PCR lieferten, wurden entspre-chende Kontrollen (RNA-Proben ohne reverser Transkriptase) eingesetzt. Wie erwartet, konnte in diesen Fäl-len kein Amplifikat erzeugt werden.

[0071] Mittels des IVAC-Expressionssystems wird sowohl die Sense- wie Antisense-RNA des zu exprimieren-den Genclusters in den getesteten bakteriellen Wirtsstämmen gebildet. Die Gene eines Genclusters können somit erstaunlicher weise mittels des IVAC-Systems unabhängig von ihrer Orientierung und ohne eine gegen-seitige Behinderung der entgegengesetzt arbeitenden Polymerasen transkribiert werden.

Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität in den heterologen Wirtsstämmen R. capsulatus und P. putida

[0072] Nachdem erfolgreich die sense-Transkripte und antisense-Transkripte der lac-Gene in den heterolo-gen Wirten R. capsulatus und P. putida detektiert werden konnte, stellte sich nun die Frage, inwiefern eine mög-liche Hybridisierung der zueinander komplementären mRNA-Moleküle die Translation inhibieren kann. Um die Synthese der β-Galaktosidase in allen verwendeten Expressionsstämmen nachzuweisen, wurde zu diesem Zweck ein Enzymaktivitätstest mit dem Substrat O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) durchgeführt. Fig. 11 zeigt die Aktivität der exprimierten β-Galaktosidase in R. capsulatus (L>lacZYA, pML5-PfruT7) und R. capsulatus (R>lacZYA, pML5-PfruT7). In beiden Fällen konnte unerwarteter weise eine starke β-Galaktosida-se-Aktivität von max. 700 Miller-Units nachgewiesen werden. In den P. putida Expressionsstämmen wurde so-gar Enzymaktivitäten von max. 900 Miller-Units erreicht (Fig. 12). Da weder der R. capsulatus noch der P. pu-tida Wildtyp-Stamm eine aktive β-Galaktosidase synthetisieren kann, konnte erwartungsgemäß in den Wild-typkontrollen (WT) keine entsprechende Enzymaktivität nachgewiesen werden (Fig. 11 und Fig. 12). Durch die Bestimmung der Enzymaktivitäten in den L>lacZYA und R>lacZYA-Stämmen, denen das T7-Polymerase co-dierende Plasmid fehlte, konnte zudem untersucht werden, ob Rhodobacter oder Pseudomonas-Promotoren, die stromaufwärts des IVAC-lacZYA-Transposons auf dem Wirtschromosom liegen, die Expression der Test-gene herbeiführen können. Eine solche Promotoraktivität war jedoch in R. capsultus nicht und im P. putida-Ex-pressionsstamm nur im geringen Ausmaß zu beobachten.

[0073] Da in den IVAC-tragenden Expressionsstämmen eindeutig eine β-Galaktosidase-Aktivität nachzuwei-sen war, kann überraschender Weise ausgeschlossen werden, dass die Synthese der RNA in sense und an-tisense Richtung zu einer Inhibierung der Translation führt.

[0074] Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Zusammensetzung ermöglichen folglich die einfache Markierung eines heterologen Genclusters. Durch die Einschritt-Übertragung und Integration des rekombinanten IVAC-Transposons in das Chromosom eines bakteriellen Wirtsstamms wird ein Expressions-stamm erzeugt, der die gezielte Expression aller Gene des übertragenen Clusters ermöglicht.

Anhang/Medien

Anzucht von E. coli und P. putida

MedienLB-Flüssigmedium (Sambrook et al., 1989):

Trypton 10gNaCl 10 gHefextrakt 5 gA. dest. ad 1000 ml

LB-Agar: Agar 15 gLB-Medium ad 1000 ml

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[0075] Die Anzucht der Bakterien erfolgte, wenn nicht anders angegeben, bei 37°C (E. coli) bzw. 30°C (P. pu-tida). Übernachtkulturen (ÜK) wurden für mindestens 16 h inkubiert. Kulturen mit einem Volumen bis zu 5 ml wurden im Reagenzglas auf einem Brutroller, größere Kulturen im Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen: max. 1/5–1/10 des Gefäßvolumens) auf einem Rundschüttler bei 200 UpM bebrütet. Vorkulturen wurden in LB-Me-dium angelegt und entweder mit einer Einzelkolonie oder mit 1/100 Volumen aus einer Gefrierkultur inokuliert. Hauptkulturen wurden auf eine Zelldichte, die einer O.D.580nm von 0,05 entsprach, angeimpft. Die Zelldichten von Kulturen wurden durch Trübungsmessungen in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 580 nm gegen das entsprechende Medium als Referenz ermittelt. Eine O.D.580nm von 1 entspricht einer Zellzahl von etwa 2 × 109 pro ml Kultur. Für Gefrierkulturen wurden 1,8 ml einer ÜK mit 138 μl DMSO vermischt und bei –80°C gelagert.

Phototrophe Anzucht von R. capsulatus unter Starklichtbedingungen

[0076] R. capsulatus wurde vorzugsweise anaerob im Licht (photoheterotroph) angezogen. Die anaerobe An-zucht erfolgte als Einzelkolonieausstrich auf Festmedium oder im Flüssigmedium in EPGs (bis 1,5 ml) in einem speziellen Anaerob-Inkubationstopf unter Verwendung des Gas-Pack Anaerobic-Systems (BBL). Größere Kul-turvolumina wurden in gasdicht verschließbaren Röhrchen (Hungates) oder Schott-Flaschen, die mit Hilfe ei-nes im Deckel befindlichen Septums mit Argon bzw. N2 begast wurden, angezogen. Unter diesen Wuchsbe-dingungen wurde R. capsulatus für drei Tage im Starklicht (sechs Glühbirnen a 60 W; entspricht 2500 lux) in-kubiert.

Anzucht von R. capsulatus

MedienPY-Vollmedium A dest ad 1000 ml

Beato Peptone ad 10,0 gHefeextrakt 0,5 gAgar 15 g1M MgCl2 2 mlPY-Medium ad 1000 ml1M MgCl2 2 ml0,5% FeSO4 2,4 ml

PY-Agar Agar 15 gPY-Medium ad 1000 ml

RCV-Minimalmedium: 10% DL-Malat 40,0 ml20% MgSO4 1,0 ml7,5% CaCl2 1,0 ml1% EDTA 2,0 ml0,5% FeSO4 2,4 ml0,1% Thiamin 1,0 mlSpurenelementlösung 1,0 ml1 M Phosphat-Puffer 9,6 mlA. dest ad 1000 mlpH 6,8

RCV + N: 10% (NH4)2SO4 10,0 mlRCV ad 1000 ml

Spurenelementlösung für RCV:MnSO4(x1H2O) 0,4 gH3BO3 0,7 gCu(NO3)2(x3H2O) 0,01 gZnSO4(x7H2O) 0,06 gNaMoO4(x2H2O) 0,02 gA. dest ad 1000 ml

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Aerobe Anzucht von R. capsulus im Dunkeln

[0077] Die Inkubation von R. capsulatus Einzelkolonieausstrichen konnte außerdem unter aeroben Bedin-gungen im Brutschrank (bei Dunkelheit) erfolgen.

[0078] Mit Zellmaterial von anaerob angezogenen Plattenkulturen konnte R. capsulatus aerob in Flüssigme-dium kultiviert werden. Dabei erfolgte die Inkubation in einem Reagenzglas üN im Dunkeln auf einem Brutroller.

Standard-Mini-Präparation

[0079] Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli und P. aeruginosa erfolgte modifiziert nach der von Birn-boim & Doly (1979) entwickelten, auf dem Prinzip der alkalischen Lyse beruhenden Methode.

[0080] Bakterienzellen aus 2 ml einer unter Selektionsdruck angezogenen ÜK (2.6.3) wurden durch Zentrifu-gation (3 min, 13000 UpM, EZ, RT) geerntet. Nach vollständigem Entfernen des Kulturüberstands wurden die Sedimente in 300 μl Mix I resuspendiert und für 1 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 300 μl Mix II hin-zugegeben und mit den Proben vermischt. Nach Zugabe von 300 μl Mix III und 10 min Inkubation auf Eis wur-den die entstandenen Protein-SDS-Präzipitate, die gefällte chromosomale DNA sowie Zelttrümmer durch Zen-trifugation (15 min, 13000 UpM, EZ, RT) sedimentiert. Der klare, die Plasmid-DNA enthaltene Überstand wurde abgenommen, mit 10 μl Ribonuklease A (2 mg/ml) versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert. Nach anschließen-der Ethanolfällung oder Isopropanolfällung wurde die Plasmid-DNA in 30–50 μl 0,1 × TE-Puffer aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.

Hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

[0081] Die hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen in den jeweils optimalen Reaktionspuffern. Die hier verwendeten Typ II-Restrikti-onsendonukleasen binden an eine kurze Folge von Nukleotiden und spalten DNA-Moleküle innerhalb dieser Erkennungssequenz. Pro μg DNA wurden 5 bis 10 U des entsprechenden Enzyms eingesetzt und der Restrik-tionsansatz 1–2 h bei 37°C inkubiert. Die Restriktionsendonukleasen wurden vor Ligationen durch Hitzebe-handlung inaktiviert, dafür wurden die Ansätze 20 min bei 65°C inkubiert.

Ligation von DNA-Fragmenten

[0082] Zur Ligation von DNA-Fragmenten wurde die T4-Ligase in dem vom Hersteller mitgelieferten Reakti-onspuffer verwendet. Die T4-Ligase katalysiert die ATP-abhängige Bildung von Phosphodiesterbindungen zwi-schen benachbarten 3'-Hydroxy- und 5'-Phosphatenden sowohl zwischen zwei kompatiblen, überhängenden („sticky end") als auch zwischen zwei glatten Enden („blunt end"). In einem Reaktionsvolumen von 10–20 μl wurde die Fragment-DNA mit der Vektor-DNA in einem molaren Verhältnis von mindestens 3:1 sowie mit 1 U T4-Polymerase gemischt und entweder für 2 h bei RT oder üN bei 11°C inkubiert. Bei der Ligation von glatten Enden wurde den Reaktionsansätzen zusätzlich PEG 4000 (Fermentas) in einer Endkonzentration von 5% zu-gegeben. Für nachfolgende Transformationen wurden die Ligationsansätze im Verhältnis 1:4 mit TMF-Puffer verdünnt.

Mix I (pH 8.0): 50 mM Glucose50 mM Tris-HCl10 mM EDTA

Mix II: 200 mM NaOH1% (w/v) SDS

Mix III(pH 4.8): 3 M Kaliumacetat1,8 M Formiat

TE-Puffer (pH 8.0): 10 mM Tris-HCl1 mM EDTA

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[0083] In einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben wurden 20 ml LB-Medium mit 0,4 ml Mg2+-Mix gemischt und mit der Menge einer E. coli-Übernachtkultur inokuliert, dass die Zelldichte einer O.D.580nm von 0,05 ent-sprach. Diese Kultur wurde auf einem Schüttler (200 UpM) bei 37°C bebrütet, bis sie sich in der logarithmi-schen Wuchsphase befand (D.D.580nm = 0,5–0,8). Anschließend wurde die Kultur in 2 ml Ansätze aliquotiert, die Zellen wurden durch Zentrifugation (2 min, 8000 UpM, EZ, 4°C) sedimentiert. Das Pellet wurde in 1 ml eiskal-tem Transformationspuffer (TMF-Puffer) resuspendiert und die Ansätze 1 h auf Eis inkubiert. Nach anschlie-ßender Zentrifugation (2 min, 8000 UpM, EZ, 4°C) wurden die Pellets jeweils in 200 μl eiskaltem TMF-Puffer aufgenommen. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Ansätze auf Eis oder nach Zugabe von Glycerol in einer Endkonzentration von 20% (v/v) bei –80°C gelagert.

Transformation von E. coli

[0084] Zur Transformation wurden 200 μl transformationskompetente Zellen mit 20 μl eines Ligationsansat-zes oder ca. 100 ng präparierter Plasmid-DNA vermischt, mindestens 30 min auf Eis inkubiert und anschlie-ßend für 90 s einem Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt. Nach Zugabe von 700 μl LB-Medium folgte die phäni-sche Expression, falls nicht anders angegeben, bei 37°C auf dem Brutroller, die je nach Antibiotikaresistenz 1–3 h dauerte. 100 μl dieses Ansatzes wurden auf entsprechendem Selektivagar ausplattiert, der restliche An-satz wurde zentrifugiert (2 min, 8000 UpM, EZ, RT), das Pellet in 100 μl LB-Medium aufgenommen und eben-falls auf Selektivagar ausplattiert. Als Negativkontrolle diente ein Ansatz transformationskompetenter Zellen, dem keine Plasmid-DNA bzw. kein Ligationsansatz zugegeben wurde.

Übertragung von Plasmid-DNA durch Konjugation und Transposition

[0085] Zum konjugativen Transfer von mobilisierbaren Plasmiden wurde die Methode des „biparentalen ma-tings" genutzt. Der als Donor angewendete E. coli-Stamm S17-1 trägt die tra-Gene des RP4-Plasmids (Simon et al., 1986) stabil im Genom integriert. Die Transposition des Plasmids in das Genom des Rezipienten wird durch das Enzym Transposase katalysiert.

Konjugation und Transposition von Plasmiden von E. coli nach P. putida

[0086] Als Rezipient diente einer der P. putida-Stämme KT2440. Die Anzucht der zu konjugierenden P. putida- und E. coli-Stämme erfolgte in LB-Medium unter entsprechendem Selektionsdruck üN bei 30°C (P. putida) bzw. 37°C (E. coli).

[0087] Je 0,5 ml der Rezipientenkultur und der Donorkultur wurden in einem EPG gemischt und zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet mit 1 ml LB-Medium gewaschen, um die Zellen von den entsprechenden Anti-biotika zu befreien. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert (8000 UpM, EZ, RT), in ihrem Restüberstand resus-pendiert und auf einen Filter auf LB-Medium gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden bei 30°C wurde der Filter in ein EPG mit LB-Medium gegeben, die Zellen wurden durch vortexen von dem Filter gelöst. Es wurde eine Verdünnungsreihe dieser Zellen angelegt und auf entsprechendem Selektivagar ausplattiert. Zur Kontraselektion des E. coli-Donorstammswurde Irgasan (Ciba Geigy, Basel) in einer Endkonzentration von 25 μg/ml eingesetzt.

Konjugation und Transposition von Plasmiden von E. coli nach R. capsulatus

[0088] Der Rezipient wurde von einer frischen anaeroben Stammplatte in 5 ml Minimalmedium (RCV + N) auf-genommen und üN bei 30°C auf dem Brutroller resuspendiert. Der plasmidtragende E. coli S17-1 Donor wurde üN bei 37°C selektiv auf einer LB-Agarplatte angezogen. Von der Donorplatte wurden Einzelkolonien der log-arithmischen Wachstumsphase geerntet und in 1 ml PY-Fe resuspendiert. Jeweils 1 ml der Rezipientenkultur wurde mit 0,5 ml der Donorkultur vermischt und in einem Eppendorfgefäß zentrifugiert (5 min; 13.000 Upm,

Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA

Herstellung transformationskompetenter Zellen

Transformationspuffer: 100 mM CaCl250 mM RbCl240 mM MnCl2

Mg2+-Mix: 1 M MgCl21 M MgSO4

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RT). Das Sediment wurde vorsichtig im Rücklauf resuspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend auf Nitrozellulose-Filter übertragen und üN bei 30°C auf PY-Agarplatten inkubiert. Die Filter wurden in 1 ml Mini-malmedium (RCV + N) resuspendiert. Von der Bakterienkultur wurde eine Verdünnungsreihe angelegt und ver-schiedene Volumina wurden auf Selektivmedium ausgestrichen. Es folgte eine 3-tägige Inkubation im Brut-schrank bei 30°C.

Polymerasekettenreaktion (PCR)

(Mullis & Fallona, 1987)

[0089] Die Polymerasekettenreaktion wurde zur Amplifizierung von Genen angewendet. Durch die Wahl ent-sprechender Oligonukleotide als Startermoleküle wurden stromaufwärts und stromabwärts der Gene Erken-nungssequenzen für Restriktionsendonukleasen angefügt, die zur gezielten Klonierung der amplifizierten Fragmente in Klonierungsvektoren dienten. Die Amplifizierung erfolgte mit Hilfe der thermostabilen DNA-ab-hängigen DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus.

[0090] Das Volumen eines Reaktionansatzes betrug 50 μl. Die PCR-Reaktionen wurde in dem PCR-Automat „Mastercycler Gradient" der Fa. Eppendorf durchgeführt.

Fluoreszenzmessungen

PBS-Puffer (pH 7,0)

4 mM KH2PO4; 16 mM Na2HPO4; 115 mM NaCl

[0091] Fluoreszenzmessungen ganzer Zellen wurden in PBS-Puffer durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden O.D.580 = 1 entsprechende Aliquots den jeweiligen Expressionskulturen entnommen, pelletiert und mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml PBS-Puffer aufgenommen. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden als Stammlösungen für die folgenden Fluoreszenzmessungen verwendet. Die Flu-oreszenz der Proben wurde mit einem Fluoreszenzphotometer (Luminescence SSpectrometer LS 506, Perkin Elmer, Boston, USA) gemessen.

Tab. 2.5: Konzentrationen der Reaktionskomponenten bei PCR-Reaktionen mit der Turbo-Pfu-DNA-Polymera-se und Pfu-DNA-Polymerase

Reaktionskomponente Konzentration

Oligonukleotid I 5–10 pmol

Oligonukleotid II 5–10 pmol

Pfu-Polymerase-Puffer 1 × Pfu-Puffer

dNTP-Mix 0,25 mM

DNA-Polymerase 1–2,5 U

DMSO 5 mM

Matrizen-DNA 50 ng

Nachweis der β-Galaktosidase-Aktivität

4 × Z-Puffer21,36 g Na2HPO4

11,04 g NaH2PO2

1,49 g KCL0,49 g MgSO4

ad 1 L

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ONPG-Lösung

0,8 mg/ml ONPG; 14 μl/ml β-Mercaptoethanol; in 1 × Z-Puffer

Stopp-Puffer

1 M Na2CO3

[0092] Die Enzymaktivität der β-Galaktosidase wurde mit dem ONPG-Test untersucht. Beim ONPG-Test er-setzt das synthetische Galactosid O-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid das natürliche Substrat der β-Galakto-sidase. Es wird wie Laktose durch die Galactosid-Permease in die Zelle hineingebracht und durch die β-Ga-lactosidase hydrolysiert. Hierbei entstehen die beiden Reaktionsprodukte Galaktose und o-Nitrophenol. Letz-teres verursacht eine Gelbfärbung, die photometrisch gemessen werden kann. Zunächst wurden die Zelldich-ten der einzelnen Kulturen bestimmt. Je 400 μl der Proben wurden mit 25 μl Chloroform und 25 μl des Zellauf-schluss-Puffers versetzt, resuspendiert und 5 min bei RT inkubiert. Nach der Zugabe von 400 μl ONPG-Lösung wurde die Zeit bis zur Gelbfärbung der Proben gemessen. Durch die Zugabe des Stopp-Puffers konnte die Re-aktion beendet und die Gelbfärbung der Proben photometrisch gemessen werden.

mRNA-Quantifizierung mittels Real-time RT-PCR

[0093] Zur Isolierung bakterieller Gesamt-RNA wurde ein Aliquot der Bakterienkultur in der exponentiellen Wachstumsphase (OD580 = 0.9) geerntet (4000 Upm, 4°C, 5 min). Das Zellpellet wurde dann entweder direkt weiterverarbeitet oder bis zurweiteren Verwendung bei –80°C gelagert (Berstein et al., 2002; Khodursky et al., 2003). Frisch abzentrifugierte oder gefrorene Pelletswurden wurden mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) weiterverarbeitet. Dazu wurden die Zellen in 350 μL des RNeasy-RLT-Puffers resuspendiert. Nach Zentrifuga-tion (2 min, 13000 Upm) wurde der Überstand (maximal 700 μl) zur Isolierung der Gesamt-RNA auf die RNe-asy-Säulchen aufgetragen (Qiagen, Hilden). Die auf Silica-Gel basierenden Membranen der Säulchen binden in Anwesenheit von absolutem Ethanol (250 μl) und einer spezifischen Salzpufferkonzentration selektiv einzel-strängige RNA-Moleküle. Es folgten zwei weitere Waschschritte bevor die RNA mit zweimal 50 μl RNase freiem Wasser vom Säulchen eluiert wurde. Die präparierte RNA wurde einem DNase-Verdau unterzogen. Dazu wur-den die Probe mit 5 μl 10 × DNase-Puffer und 30 U RNase freier DNase (Promega) für 20 min bei 37°C inku-biert. Auf die Zugabe des Stopp-Puffers folgte die Inaktivierung des Enzyms für 10 min bei 70°C. Die Lagerung präparierter RNA erfolgte bei –20°C.

Synthese der cDNA

[0094] Die Synthese der cDNA erfolgte ausgehend von 500 ng Gesamt-RNA, die durch reverse Transkription mit reverser Transkriptase (Omniscript Reverse Transkriptase, Qiagen, Hilden) in cDNA umgeschrieben wur-de. Die RNA wurde vor der Synthese für 5 min bei 68°C inkubiert und dann 5 min auf Eis abgekühlt. Anschlie-ßend wurde der vorbereitete Mastermix aus Reaktionspuffer, Nukleotiden und reverser Transkriptase zugege-ben. Die Synthese erfolgte für 1 h bei 37°C. Die synthetisierte cDNA wurde ohne weitere Aufreinigung als tem-plate in der Real-time PCR eingesetzt.

RealTime PCR

[0095] Die Real-time PCR wurde mit dem LightCycler realplex (Eppendorf) durchgeführt. Als Reagenzien dienten die Bestandteile Quantitect SYBR Green I Kit (Qiagen, Hilden). Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I (Invitrogen, Karlsruhe) bindet doppelsträngige DNA und hat ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 521 nm. In der unten stehenden Tabelle ist der Ablauf der RealTime PCR sowie der Schmelzkurve aufge-listet.

Zellaufschluss-Puffer

1 ml 4 × Z-Puffer14 μl β-Mercaptoethanol7,5 μl 20%SDS

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Literatur

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

95°C 2 min Denaturierung95°C 15 sek55°C 30 sek 40 Zyklen68°C 30 sek95°C 15 sek Schmelzkurve60–95°C 20 min

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Klonierung, Integration und Expression mehrerer Gene mindestens eines Genclusters, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Bereitstellen von mindestens zwei Gen-Kassetten, die Sequenzen aufweisen, welche die Übertragung und Integration eines flankierten Nukleinsäuremoleküls sowie die Expression aller Gene des flankierten Nuklein-säuremoleküls vermitteln; – Erzeugung eines rekombinanten Transposons durch Verknüpfung der Gen-Kassetten mit einem Nukleinsäu-remolekül, das mindestens ein Gencluster umfasst, wobei mindestens eine erste Gen-Kassette stromaufwärts des Genclusters und mindestens eine zweite Gen-Kassette stromabwärts des Genclusters angehängt wird; – Einbringen des Transposons in eine Rezipientenzelle, wobei sich das Transposon selbstständig in das Ge-nom der Rezipientenzelle integriert; und – Koordinierte Expression aller Gene des Genclusters in der Rezipientenzelle.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression aller Gene des Genclusters in der Rezipientenzelle mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung der Gen-Kassetten durch homologe Rekombination erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Einbringen des rekom-binanten Transposons in die Rezipientenzellen durch Konjugation erfolgt.

5. Gen-Kassette zur Klonierung mindestens eines Genclusters, wobei die Gen-Kassette die folgenden Ele-mente umfasst: – mindestens eine Promotor-Sequenz; und – mindestens ein Transpositionselement.

6. Gen-Kassette nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotor-Sequenz die Erkennungs- und Bindungsstelle für die T7-RNA-Polymerase umfasst.

7. Gen-Kassette nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette zusätzlich min-destens ein Transposase-Gen, vorzugsweise das tnp-Gen, umfasst.

8. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die das Transpositi-onselement ein OE-L- oder ein OE-R-Element ist.

9. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette zu-sätzlich mindestens ein Reportergen umfasst.

10. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette zu-sätzlich mindestens einen Selektionsmarker umfasst.

11. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette ein Antibiotika-Resistenzgen mit eigenem Promotor, ein Reportergen ohne eigenen Promotor, ein Transpositi-onselement und einen Promotor für eine nicht-bakterielle RNA-Polymerase, vorzugsweise die T7-RNA-Poly-merase, umfasst.

12. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette ein Antibiotika-Resistenzgen mit eigenem Promotor, ein Reportergen ohne eigenen Promotor, ein für eine Transposase kodierendes Gen, ein Transpositionselement und einen Promotor für eine nicht-bakterielle RNA-Polymerase umfasst.

13. Gen-Kassette nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotika-Resistenzgen ein Gen für die Tetracyclin-Resistenz (TcR) oder für die Gentamycin-Resistenz (GmR) ist.

14. Gen-Kassette nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportergen ein Gen für die Kanamycin-Resistenz (KmR) oder ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen ist.

15. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette

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zusätzlich mindestens einen Replikationsursprung (oriT) umfasst.

16. Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Gen-Kassette zusätzlich mindestens eine Operator-Sequenz, vorzugsweise den lac-Operator, umfasst.

17. Zusammensetzung zur Klonierung, Integration und Expression mindestens eines Genclusters, wobei die Zusammensetzung mindestens zwei Gen-Kassetten nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst.

18. Vektor zur Klonierung, Integration und Expression mindestens eines Genclusters, wobei der Vektor mindestens eine Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst.

19. Vektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zwei oder mehr Gen-Kassetten nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst.

20. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Nukleotidsequenz zur Synthese mindes-tens eines Polypeptids umfasst, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleotidsequenz, welche die Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst; b) Nukleotidsequenz, welche zwei Gen-Kassetten nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst; c) Nukleotidsequenz, welche den Vektor nach Anspruch 18 oder 19 umfasst; d) Nukleotidsequenz, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NR. 13 und/oder 14 umfasst; e) Nukleotidsequenz, welche sich von der Nukleotidsequenz gemäß a), b), c) oder d) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet; f) Nukleotidsequenz, deren komplementärer Strang mit den Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c) oder d) hy-bridisiert; g) Nukleotidsequenz, welche zu mindestens 85%, vorzugsweise 90%, insbesondere 95%, mit der Nukleotid-sequenz gemäß a), b), c) oder d) identisch ist; h) Nukleotidsequenz, welche dem komplementären Strang der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis g) ent-spricht.

21. Kit zur Klonierung, Integration und Expression mindestens eines Genclusters, welcher mindestens eine Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 16 umfasst.

22. Kit nach Anspruch 21, welcher zwei oder mehr Gen-Kassetten nach einem der Ansprüche 5 bis 16 um-fasst.

23. Zelle, welche mindestens eine Gen-Kassette nach einem der Ansprüche 5 bis 16, den Vektor nach An-spruch 18 oder 19 und/oder das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 20 enthält.

24. Zellkultur, welche Zellen nach Anspruch 23 umfasst.

Es folgen 13 Blatt Zeichnungen

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Anhängende Zeichnungen

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