verhalten von antibiotikaresistenzen in abwasser und gewässern262e0778-c012-4f31-a385... ·...
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Eawag: Das Wasserforschungs-Institut des ETH-Bereichs
Nachweis und Verhalten von Antibiotikaresistenzen im Abwasser und in Behandlungsanlagen
Dr. Helmut Bürgmann
«Keime, Antibiotikaresistenz und Desinfektion in Wassersystemen» - Basel.Area Swiss 7. «Wassertechnologie» Veranstaltung, 24.10.2016 Basel
Konsum, Kontakt
Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma-Industrie
Boden
GülleapplikationTrinkwasser
Sickerungund Erosion
Klärwerke
Gewässer
Aquifer
Bewässerung
Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen
Figure modifiied from Kim and Aga , 2007 J. Toxicol. Environ. Health, Pt. B Crit. Rev. vol. 10, and Baran et al., 2011 . Hazard. Mater. Vol. 196 2
Selektionsdruck: Mutationen die Resistenz vermitteln
Lagasse, E., Cancer stem cells with genetic instability: the best vehicle with the best engine for cancer. Gene Ther 2007, 15, (2), 136-142
Konsum, Kontakt
Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma-Industrie
Boden
GülleapplikationTrinkwasser
Sickerungund Erosion
Klärwerke
Gewässer
Aquifer
Bewässerung
Kreuzselektion durch andere Verunreinigungen, z.B. Schwermetalle, Biozide
Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen
26.10.2016 3
Selektionsdruck → Mutationen die Resistenz vermitteln
Kläranlagen: hohe Zelldichten, Schadstoffe gute Bedingungen für Selektion, HGT, Resistenzen
Fuller & Braverman, National Science Foundation
= Horizontaler Gentransfer
Untersuchungen an Schweizer ARAs
3
Pharma-Industrie
Birs ProRheno AG Basel
Brusio
Ozonung / UF
Wädenswil
Neugut
Uerikon
Krankenhäuser
Erlach Davos
Bühler
Sévery
Colombier
Romont
Messen
Kernenried
Dürnten
Herisau
Rothenthurm
Niederdorf
Hornussen
Buttisholz
Beprobung Vorfluter
Hochdorf
< 100’000
50’001 - 100’000
10’001 - 50’000
2’001 - 10’000
C C P C P NH4+ C P NH4+ F C P NH4+ N2 C P NH4+ N2 F C P NH4+ N2 F ++
Capacity
Treatment
Catchment
ARA eliminieren Bakterien und resistente Keime…
Untersuchungen an Schweizer ARAs
o Reduktion von (multi)resistenten Bakterien um 90-99% C
zeka
lski
et a
l. 20
12; C
zeka
lski
, unp
ublis
hed
data
26.10.2016 5
N/C resistent
1 2
CFU
[mL-1
]
1e-1
1e+0
1e+1
1e+2
1e+3
1e+4
1e+5
1e+6
1e+7
1e+8
S/T/T resistent
1 2
CFU
[mL-1
]
1e-1
1e+0
1e+1
1e+2
1e+3
1e+4
1e+5
1e+6
1e+7
1e+8
Gesamt LKZ
1 2
CFU
[mL-1
]
1e-1
1e+0
1e+1
1e+2
1e+3
1e+4
1e+5
1e+6
1e+7
1e+8
Zulauf Ablauf Zulauf Ablauf Zulauf Ablauf
Basel Ind.
Brusio
Uerikon
Bühler
Bühler
Brusio
Basel Ind. Buttisholz
Brusio Brusio
Untersuchungen an Schweizer ARAs
Identifikation von resistenten Bakterien im Ablauf:
• ARA-Abläufe entlassen multiresistente Bakterien mit transferierbaren Resistenzgenen in die Umwelt
• Einige dieser Arten sind in der Umwelt überlebensfähig
Norfolxycin/Ceftazidim (N/C): Microbacterium Acetobacter
Sulfonamid/Trimethoprim/Tetrazyklin (S/T/T): Chryseobacterium Stenotrophomonas Afipia (Link Klinik-Trinkwasser?) Escherichia/Shigella Enterococcus Fäkalkeime
opportunistisch pathogen
Harmlose Kommensalen
26.10.2016 6
Auswirkungen auf die Gewässer
Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern
o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend.
26.10.2016 7
sul1
tet(W)
Auswirkungen auf die Gewässer
Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern
1 2 3 4
sul1
,tet(W
) / 1
6S G
enko
pien
1e-9
1e-8
1e-7
1e-6
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
WTP in WTP out upstream downstream
o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend: Relative Abundanz steigt ebenfalls: Selektion auch im Vorfluter?
26.10.2016 8
sul1
tet(W)
Auswirkungen auf die Gewässer
Sufonamidresistenz (abs) Sufonamidresistenz (rel)
Quecksilber (Hg)
Cze
kals
ki e
t al.
2014
, IS
ME
J
Belastung des Sediments im Genfersee
o Abwassereinleitung erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter
26.10.2016 9
Zusammenfassung: Antibiotika - Resistenzen in Schweizer ARAs und Oberflächengewässern
o Elimination von Bakterien / Resistenzen in konventionellen ARA > 90%
o Resistenzlast in geklärtem Abwasser dennoch deutlich über natürlichem Hintergrund
o Multiresistente Bakterien: harmlose Kommensalen aber auch potentielle Krankheiterreger sind Resistenzträger
o Abwasser erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter in Wasser und Sediment
Was bringen die neuen Technologien zur Mikroschadstoffelimination?
26.10.2016 10
Zusätzliche Reinigungsstufen
II Pulveraktivkohlel (PAK)
I Ozonung
Verfahrenstechnik zur Entfernung von Mikroverunreinigungen
«Strategie MicroPoll»
11
Austritt von freier DNA aus der Zelle
Desinfektion und Resistenzelimination mit Ozon
Zerstörung der Zellwand Zerstörung der DNA
12
O3
Schädigung der Basen (Mutationen)
Doppelstrangbruch
Einzelstrangbrüche
O3
www.thescienceinscifi.files.wordpress.com
o Ozonung eliminiert verbleibende (multiresistente) Bakterien aus gereinigtem Abwasser und zerstört die DNA (mit den Resistenzgenen)
o Während der biologischen Nachbehandlung kommt es zu einer erneuten Besiedelung mit Bakterien, aber mit reduzierter Resistenz
Arbeitshypothesen:
Zusätzliche Reinigungsstufen: Ozonung
O3-Reaktor (QT)
NKB Sandfilter (SF)
CFU
/mL
13
VKB Ablauf ARA
Cze
kals
ki e
t al.
2016
, ES
&T
Prozess und Kinetik? (Modellsystem)
Ozonungsexperimente: Dosisabhängig: Batchversuche, Kontaktzeit = ∞
Abfluss NK (Bakterien, Flocken) 0 - 0.8 gO3 g DOC-1
E. coli + steriler Abfluss Nachklärbecken (SE) 0 – 1.72 gO3 g DOC-1
E. coli + Puffer (kein DOC)
0 - 0.2 mgO3 L-1
O3
Ozonexposition: 𝐶𝐶𝐶𝐶 = ∫ 𝑂𝑂3 𝛿𝛿𝛿𝛿
Kinetik: Quench-flow
14
http://www.bio-logic.info/ WWTP
0.2 mgO3 L-1 0 - 5 s
0.45 gO3 g DOC-1 0 - 2 s
0.57 gO3 g DOC-1
0-2 s
O3 O3
Quantification of ozone-induced damage in bacteria
15
1. Viability (Culturability)
4. Intracellular Gene disruption (quantitative PCR)
0 0.06 0.11 0.17 0.23 0.29 0.34 0.40 0.46 0.57 0.69 0.92 1.72 [gO3 g-1 DOC]
intact
O3 O3
3. DNA damage (Total cell counts TCC)
sul1
16S rRNA
2. Viability (Membrane integrity (ICC))
Green Fluorescence
Red
Flu
ores
cenc
e
E. coli in sterilisiertem geklärtem Abwasser
DOC = 4.27 mg L-1
16
Dosisabhängig
[mg O3 L-1]
[g O3 g DOC-1] 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 1 2 3 4 5
Log(
N/N
0)
contact time = ∞ WWTP
Kultivierbarkeit
Membranintegrität
DNA-Stabilität (TCC)
16S rRNA (qPCR)
sul1 (qPCR)
sul1
16S rRNA
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 1 2 3 4 5
Log(
N/N
0)
contact time = ∞ WWTP
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 1 2 3 4 5
Log(
N/N
0)
WWTP
O3
N0 = 2 × 106 Zellen mL-1
-5
-4
-3
-2
-1
0
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2
Log(
N/N
0)
CT [mg s L-1]
16S rRNA?
E. coli in sterilisiertem Abwasser (Nachklärung)
2.2 mgO3 L-1 / 0.45 gO3 g DOC-1
17
Viability (Culturability) Viability (Membrane Integrity ICC) sul1 (qPCR) 16S rRNA (qPCR) DNA stability (TCC)
CTlag k
Ozone exposure [mg s L-1] for
inactivation of [mg s L-1] [L mg-1 s-1] 2-log 4-log
Culturability n.d. 32 (±2.1) 0.13 0.28 Membrane integrity 0.22 (± 0.08) 12 (±1.6) 0.61 1.01 sul1 0.76 (±0.49) 2 (±0.4) 2.98 5.15 16S 1.43 (±1.05) 1 (±0.6) 5.50 9.35
Kinetik ICC
sul1
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-4
-3
-2
-1
0
0 1 2 3 4 5
Log
(N/N
0)
contact time = ∞
14.03.2016 Nadine Czekalski 18
Kultivierbarkeit Sulfamethoxazol/Trimetoprim/Tetracyclin Norfloxacin/Ceftatzidim Membranintegrität DNA Stabilität (TCC) 16S rRNA (qPCR), N0 = 6.8 106
sul1 (qPCR), N0 = 3.7 106
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5
Log(
N)
10 µm filtered, contact time = ∞
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5
Log(
N)
Presence of flocs, contact time = ∞
Natürliche Abwasserbakterien (Nachklärung) DOC = 5.0 mg L-1
[mg O3 L-1] [g O3 g DOC-1]
[mg O3 L-1] [g O3 g DOC-1]
O3
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-4
-3
-2
-1
0
0 1 2 3 4 5
Log
(N/N
0)
contact time = ∞
1.E+4
1.E+5
1.E+6
1.E+7
1.E+8
SE OR1 OR2 SF
even
ts [m
l-1]
TCC ICC
Ozonung WWTP Neugut 0.55 gO3 g DOC-1, 20-30 mins, n=3
19
1.E+0
1.E+2
1.E+4
1.E+6
1.E+8
SE OR1 OR2 SF
gene
cop
ies
[mL-
1 ]
16S_457 bp sul1_827 bp
SE
OR1
OR2
SF
1.E+0
1.E+2
1.E+4
1.E+6
1.E+8
SE OR1 OR2 SF
CFU
[mL-
1 ]
Total S/T/T N/C
1.E+4
1.E+5
1.E+6
1.E+7
1.E+8
SE OR1 OR2 SF
even
ts [m
l-1]
TCC ICC
Zusammenfassung: Wirkung der Ozonung auf Antibiotikaresistenz im Abwasser
o Elimination der Antibiotika (Spurenschadstoffe) leistet einen positiven Beitrag o Ozonung wie in der untersuchten Anlage zur Spurenstoffelimination angewandt:
o Tötet resistente Keime weitgehend ab o Eliminiert die DNA / Resistenzgene nicht o Erlaubt überleben einiger Keime in Partikeln / Flocken
o Ermittelte kinetische Parameter bieten Möglichkeit zur gezielten Verbesserung der Entkeimung und DNA-Inaktivierung
o Wiederaufwuchs von resistenten Bakterien in der biologischen Nachbehandlung o Verbesserungen sollten erforscht und entwickelt werden
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Danke!!
Nadine Czekalski Urs v. Gunten Karin Beck Karolin Schweichler Marjan Veljkovic José Santos S. Imminger F. Hammes E. Salhi H.R. Sigrist J. Fleiner C. McArdell H. Singer C. Stamm ARAs (Neugut)
21
Literatur:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.est.6b02640