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Verso il futuro con l’ingegneria genetica
5bio3
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1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti, prima dell’aggiunta del DNA plasmidico.
Per ogni trasformazione batterica usare 50μl di cellule competenti.
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2. Aggiungere 50 ng di DNA plasmidico (pGEX-KT con resistenza all’ampicillina) alle cellule e incubare in ghiaccio per 30min. Effettuare un controllo negativo senza aggiungere DNA plasmidico ai 50 μl di cellule.
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3. Incubare le cellule a 42 °C per 40sec (shock termico) per far in modo di dilatare i pori della membrana e facilitare l’entrata del DNA plasmidico nella cellula batterica.
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4. Incubare le cellule in ghiaccio per 2min in modo tale da richiudere i pori della membrana.
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5. Aggiungere alle cellule batteriche 250 μl di LB fresco(senza antibiotico) e incubare in agitazione a 37 °C per 40min. Si fanno crescere le cellule su un terreno normale. Si effettua l’incubazione a 37 °C per 40min perché serve alle cellule per riprendersi dopo lo shock termico, iniziare un ciclo di replicazione e permettere l’espressione del gene per la resistenza all’ampicillina
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6. Allestire delle piastre con il terreno LB agarizzato contenente
50g/mL di ampicillina.
Mettere in piastra di LBagar+AMP volumidifferenti di sospensione cellulare e cioè:- 5 μl di cellule trasformate- 10 μl di cellule trasformate - 50 μl di cellule trasformate - 100 μl di cellule trasformatePiastrare anche:- 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su
piastre LBagar+AMP(controllo negativo) - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su
piastre LB agar (controllo positivo: in assenza di ampicillina si verifica la crescita di E.coli e si valuta la qualità delle cellule competenti.
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7. Distribuire le cellule sulla superficie del terreno usando una spatola sterile ad L.
8. Incubare a 37°C per 24 ore. 9. Osservare le piastre delle cellule
trasformate seminate in LB agar + Amp e contare le colonie per poter calcolare l’efficienza di trasformazione. Osservare le piastre dei controlli.