verträglichkeit von leukozytapheresen bei patienten mit · konzentrat zeigte eine gute...
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Verträglichkeit von Leukozytapheresen bei Patienten mit Malignem Melanom
Aus der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung in der
Chirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Leiter: Prof. Dr. med. Reinhold Eckstein
Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von Lena Johanna Born aus Ostercappeln
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter: Prof. Dr. E. Strasser
Gutachter: Prof. Dr. R. Eckstein
Tag der mündlichen Prüfung:
05. November 2014
1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................. 1
Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 4
Tabellenverzeichnis ....................................................................................................... 4
1. Zusammenfassung ................................................................................................ 6
1.1 Deutschsprachige Zusammenfassung ...................................................................... 6
1.1.1 Hintergrund und Ziele ........................................................................................... 6
1.1.2 Methodik ............................................................................................................. 6
1.1.3 Ergebnis .............................................................................................................. 6
1.1.4 Schlussfolgerung .................................................................................................. 7
1.2 English Summary ................................................................................................. 8
1.2.1 Background ......................................................................................................... 8
1.2.2 Methods .............................................................................................................. 8
1.2.3 Results ................................................................................................................ 8
1.2.4 Conclusions ......................................................................................................... 9
2 Einführung ....................................................................................................... 10
2.1 Das Maligne Melanom ........................................................................................ 10
2.2 Vakzinationstherapie .......................................................................................... 12
2.2.1 Ralph Steinman und die Entdeckung der dendritischen Zellen ................................. 12
2.2.2 Prinzip der Vakzinationstherapie .......................................................................... 13
2.2.3 Aktueller Forschungsstand und Sipuleucel ............................................................ 13
2.3 Gewinnung von dendritischen Zellen .................................................................... 14
2.3.1 Das Aphereseverfahren ....................................................................................... 14
2.3.2 Zellseparator und Sammelprinzip ......................................................................... 15
2.3.3 Nebenwirkungen einer Apherese .......................................................................... 16
2.4 Fragestellung der Arbeit ...................................................................................... 17
3 Material und Methoden .................................................................................... 18
3.1 Studienprofil ...................................................................................................... 18
3.2 Patientenkollektiv ............................................................................................... 18
3.3 Auswahl der Prüfvariablen .................................................................................. 18
3.4 Sonstige klinische Angaben ................................................................................. 19
3.5 Die Leukozytapherese ......................................................................................... 19
3.5.1 Antikoagulation ................................................................................................. 20
3.5.2 Das Aphereseset zur Leukozytensammlung ........................................................... 21
3.6 Geräte für die Zellanalyse .................................................................................... 22
3.6.1 Die durchflusszytometrische Analyse ................................................................... 23
3.7 Ablauf der Spende .............................................................................................. 24
3.8 Berechnungen und Formeln ................................................................................. 25
2
3.9 Die statistische Datenauswertung ......................................................................... 27
3.9.1 Vorgehensweise bei der statistischen Auswertung der Daten ................................... 28
4. Ergebnisse ........................................................................................................ 30
4.1 Beschreibung der Patientengruppe ........................................................................ 30
4.1.1 Daten zur Melanomerkrankung der Patienten ......................................................... 32
4.1.2 Apheresespezifische Daten der Patienten bei Erstapherese ....................................... 34
4.2 Beschreibung der Daten zur Produktqualität bei Erstapherese .................................. 37
4.2.1 Daten zur Geräteeinstellung der COBE Spectra ...................................................... 37
4.2.2 Darstellung der Spendenergebnisse ....................................................................... 37
4.3 Beschreibung der Nebenwirkungen ...................................................................... 39
4.4 Medikamente während der Erstapherese ................................................................ 41
4.4.1 Calcium-Gabe .................................................................................................... 41
4.4.2 Andere Medikamente .......................................................................................... 41
4.5 Einflussfaktoren auf die Sammeleffizienz der Monozyten ....................................... 42
4.5.1 Korrelation der Sammeleffizienz mit allgemeinen Patientendaten ............................. 43
4.5.2 Melanomspezifische Patienten-Daten und Sammeleffizienz ..................................... 45
4.5.3 Vorbehandlungen der Patienten und Einfluss auf die Sammeleffizienz ...................... 47
4.5.4 Einflüsse von apheresespezifischen Daten auf die Sammeleffizienz .......................... 51
4.6 Untersuchungen zum Monozytengehalt im Apheresat ............................................. 53
4.6.1 Einflüsse von Patientendaten auf den Monozytengehalt .......................................... 53
4.6.2 Einflüsse von melanomspezifischen Patienten-Daten auf den Monozytengehalt ......... 55
4.6.3 Einflüsse von apheresespezifischen Daten auf den Monozytengehalt ........................ 56
4.7 Einflussfaktoren auf den Monozyten-Rekrutierungsfaktor ....................................... 59
4.7.1 Allgemeine Patientendaten und der Monozyten-Rekrutierungsfaktor ........................ 59
4.7.2 Melanomspezifische Patienten-Daten und der Rekrutierungsfaktor ........................... 60
4.7.3 Vorbehandlungen der Patienten und der Rekrutierungsfaktor ................................... 60
4.7.4 Der Einfluss von apheresespezifischen Daten auf die Sammeleffizienz ..................... 61
4.8 Ergebnisse bei Patienten mit zwei Apheresen ......................................................... 62
4.9 Ergebnisse bei Patienten mit drei Apheresen .......................................................... 66
4.10 Uni- und multivariate Analysen zu Sammeleffizienz, Monozytengehalt und Rekrutierungsfaktor ............................................................................................ 70
5 Diskussion ........................................................................................................ 74
5.1 Charakterisierung der Patientengruppe .................................................................. 75
5.2 Nebenwirkungen bei Erst- und Mehrfachapherese .................................................. 77
5.3 Produktqualität der Leukozytapheresen bei Patienten .............................................. 79
5.4 Leistungsdaten über die Monozytensammlung bei Mehrfachapherese ....................... 80
5.6 Einflüsse von Vorbehandlungen auf die Apherese .................................................. 82
6. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 85
7. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 90
3
8. Anhang ............................................................................................................ 91
Danksagung ................................................................................................................ 95
4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: COBE Spectra (Hinweis: Die Abbildung wurde mit Genehmigung der Firma TermumoBCT aus dem Gerätehandbuch entnommen) ............................................ 20
Abbildung 2: Streulicht-Dot-Plot ..................................................................................... 24
Abbildung 3: Deskriptive Analyse ................................................................................... 28
Abbildung 4: Explorative Analyse ................................................................................... 29
Abbildung 5: Vorgehensweise bei Vorbehandlungen ......................................................... 29
Abbildung 6: Anzahl durchgeführter Apheresen (N=100) ................................................... 30
Abbildung 7:Altersverteilung der Patienten (N=100) ......................................................... 31
Abbildung 8: Zeiträume zu Melanom-Daten (N=82) .......................................................... 32
Abbildung 9: Häufigkeiten der einzelnen Melanomtypen (N=99) ........................................ 33
Abbildung 10: Zellrekrutierungsfaktoren bei Erstapherese (N=45) ...................................... 36
Abbildung 11: Nebenwirkungen während der Erstapherese (N=100) ................................... 40
Abbildung 12: Sammeleffizienz bei weiblichen und männlichen Patienten ........................... 42
Abbildung 13: Leukozytenkonzentration vor Apherese in Altersgruppen ............................. 44
Abbildung 14: Leukozytenkonzentration in Abhängigkeit einer Chemotherapie .................... 48
Abbildung 15: Monozyten-Sammeleffizienz in Abhängigkeit vom Trennfaktor .................... 52
Abbildung 16: Monozytengehalt und Monozytenkonzentration vor Apherese ....................... 55
Abbildung 17: Monozytengehalt in Abhängigkeit von LDH und Geschlecht ........................ 56
Abbildung 18: Auswirkungen einer Zitratreaktion auf den Monozytengehalt ........................ 57
Abbildung 19: Monozytengehalt ..................................................................................... 58
Abbildung 20: Rekrutierungsfaktor und TBV in ml bei männlichen Patienten (N=53) ........... 59
Abbildung 21: Monozyten-Sammeleffizienz bei erster und zweiter Apherese (N=35) ............ 63
Abbildung 22: Monozytengehalt bei erster und zweiter Apherese (N=35) ............................ 64
Abbildung 23: Rekrutierungsfaktor bei erster und zweiter Apherese (N=35) ......................... 65
Abbildung 24: Monozyten-Sammeleffizienz bei dreimaliger Apherese (N=14) ..................... 67
Abbildung 25: Monozytengehalt bei dreimaliger Apherese (N=14) ..................................... 68
Abbildung 26: Rekrutierungsfaktor bei erster, zweiter und dritter Apherese (N=14) .............. 69
Abbildung 27: Rekrutierungsfaktor in Abhängigkeit von Chemotherapie ............................. 72
Abbildung 28: Sammeleffizienz in Abhängigkeit von einer LDH-Erhöhung ......................... 73
Abbildung 29: Auswirkungen von Bestrahlung auf die Sammeleffizienz .............................. 93
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stadien des Malignen Melanoms ...................................................................... 11
Tabelle 2: Vorbehandlungen der Patienten vor Erstapherese (N=82) ................................... 34
Tabelle 3: Blutbilder der Patienten vor und nach Erstapherese ............................................ 35
Tabelle 4: Zellrekrutierungsfaktoren während der Erstpherese ............................................ 37
Tabelle 5: Vergleich Blutbild vor Apherese und Konzentrat ............................................... 38
Tabelle 6: Zellgehalt im Konzentrat bei Erstapherese ......................................................... 39
Tabelle 7: Sammeleffizienz bei Erstapherese .................................................................... 39
Tabelle 8: Korrelation der Sammeleffizienz mit Alter, BMI und TBV ................................. 43
Tabelle 9: Korrelation der Sammeleffizienz mit Elektrolyt-Werten ...................................... 45
Tabelle 10: Einflüsse von Tumormarkern auf die Sammeleffizienz ..................................... 46
5
Tabelle 11: Korrelation Zellkonzentrationen vor Apherese ................................................. 46
Tabelle 12: Zellkonzentrationen in Abhängigkeit von Chemotherapie .................................. 47
Tabelle 13: Einflüsse von Chemotherapie auf Zellkonzentrationen ...................................... 49
Tabelle 14: Einflüsse von Bestrahlung auf Zellkonzentrationen vor Apherese ....................... 50
Tabelle 15: Korrelation mit Zellkonzentration vor Apherese und Sammeleffizienz ................ 51
Tabelle 16 : Korrelation der Monozyten-Sammeleffizienz mit Apheresedaten ...................... 51
Tabelle 17: Korrelation der Zellgehalte mit Zellkonzentrationen vor Apherese ..................... 54
Tabelle 18: Auswirkungen auf den Rekrutierungsfaktor durch Chemotherapie ...................... 61
Tabelle 19: Korrelation des Rekrutierungsfaktors mit Apheresedaten .................................. 62
Tabelle 20: Nebenwirkungen während erster und zweiter Apherese (N=35) ......................... 66
Tabelle 21: Nebenwirkungen bei dreimaliger Apherese (N=14) .......................................... 70
Tabelle 22: Häufigkeiten von Geschlecht, Zitratreaktion und LDH-Erhöhung ....................... 71
Tabelle 23: Kategorisierung der klinischen Angaben ......................................................... 91
Tabelle 24: Zellverlust der Patienten ................................................................................ 92
Tabelle 25: Zellzahlen der Patienten vor und nach Apherese ............................................... 92
Tabelle 26: Geräteeinstellungen während Erstapherese ...................................................... 93
Tabelle 27: Korrelation des Monozytengehalts mit Alter, BMI und TBV ............................. 94
6
1. Zusammenfassung
1.1 Deutschsprachige Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele
Das Maligne Melanom ist ein stark zunehmender Tumor, dem eine besonders schlechte
Prognose zugeschrieben wird. Es gilt daher, neue und wirksame Therapiestrategien zu entwi-
ckeln. Ein möglicher Ansatz, der in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen hat,
ist die Tumorvakzination mit dendritischen Zellen. Als Goldstandard für die Gewinnung von
Monozyten als Vorstufe der dendritischen Zellen gilt die Leukozytapherese. Die Apherese von
Leukozyten wird mit speziellen Zellseparatoren durchgeführt und kann auch bei schwerkranken
Patienten eingesetzt werden. Ziel dieser Arbeit ist es, die Verträglichkeit der Apherese bei Pati-
enten und Einflüsse auf die Produktqualität zu analysieren.
1.1.2 Methodik
In dieser retrospektiven Studie erfolgte die Datensammlung anhand der Herstellungsproto-
kolle von Spenden und der durchgeführten Untersuchungen zur Überprüfung der Produktquali-
tät. Zudem wurden klinische Daten zu den Patienten in der Dermatologischen Klinik des Uni-
versitätsklinikums Erlangen erhoben. Alle Blutproben wurden mit dem Blutbild-Gerät Sysmex
K4000 und dem Durchflusszytometer FACS Calibur analysiert. Die statistischen Auswertungen
wurden mit dem Statistikprogramm SPSS, Version 19.0, durchgeführt.
1.1.3 Ergebnis
Die Zitratreaktion war die häufigste Nebenwirkung einer Apherese und trat mehr als dop-
pelt so häufig bei weiblichen im Vergleich zu männlichen Patienten auf. Bei Mehrfachaphe-
resen wurden eine Abnahme von Zitratreaktionen und eine nicht signifikante Zunahme von
Monozytengehalt und Monozyten-Rekrutierungsfaktor festgestellt. Der Rekrutierungsfaktor war
am höchsten bei Monozyten und Lymphozyten. Auch die Sammeleffizienz nahm bei der zwei-
ten Apherese zu, fiel jedoch bei der dritten Monozytenspende ab. Es wurden keine signifikanten
Zusammenhänge zwischen Monozytengehalt und Alter, BMI, Tumorstadium und Protein S100
festgestellt. Männliche Patienten mit einer Chemotherapie einen Monat vor Apherese wiesen
eine nicht signifikant höhere Leukozytenkonzentration im Blut vor Apherese auf. Es zeigte sich
außerdem, dass männliche Probanden mit einer Chemotherapie einen Monat vor Apherese einen
höheren Monozyten-Rekrutierungsfaktor aufwiesen. Eine signifikant höhere Monozyten-
Sammeleffizienz wurde bei ebendiesen Patienten mit einer Bestrahlung ein halbes Jahr vor A-
pherese festgestellt. Als mögliche Folge der Vorbehandlungen war auch eine erhöhte LDH bei
7
Männern mit einem höheren Monozytengehalt im Produkt verbunden. Ein niedrigerer Trennfak-
tor als Geräteeinstellung führte zu einer niedrigeren Monozyten-Sammeleffizienz. Der Korrela-
tionskoeffizient zwischen der Monozyten-Konzentration im Patientenblut vor Apherese und im
Konzentrat zeigte eine gute signifikante Korrelation.
1.1.4 Schlussfolgerung
Während einer Leukozytapherese sollte bei den Patienten frühzeitig eine Calcium-
Prophylaxe verabreicht werden, da die Zitratreaktion die häufigste Nebenwirkung von Aphe-
resen ist. Bei Mehrfachapheresen wird möglicherweise eine bessere Produktqualität dadurch
erreicht, dass die Häufigkeit von Zitratreaktionen durch die Calcium-Prophylaxe gesenkt wird.
Es gilt geschlechtsspezifische Unterschiede zu beachten, wie ein häufigeres Auftreten von Zit-
ratreaktionen bei Frauen. Zusätzlich zeigten sich unterschiedliche geschlechtsspezifische Wir-
kungen einer Chemotherapie oder einer Bestrahlung vor Apherese und einer LDH-Erhöhung auf
die Leukozytenkonzentration im Patientenblut und die Produktqualität. Andere Faktoren, wie
BMI, Alter und Protein S100, scheinen keine relevanten Einflüsse auf die Produktqualität zu
haben. Ein hoher Trennfaktor führt zu einer höheren Monozyten-Sammeleffizienz. Die Mo-
nozytenkonzentration im Patientenblut vor Apherese ist ein brauchbarer Parameter für die Mo-
nozytenkonzentration im Produkt. Außerdem sind die inter- und intraindividuellen Unterschiede
bei der Zellrekrutierung im Hinblick auf die Produktqualität zu beachten.
8
1.2 English Summary
1.2.1 Background
The Malignant Melanoma is an increasingly frequent tumor, which has an especially poor
prognosis. For this reason it is necessary to develop new and effective therapy strategies. A
possible idea, which has become more important in the last few years, is tumor vakzination with
dendritic cells. The leukocytapheresis is proved to be the goldstandard for collecting monocytes
as a progenitor of the dendritic cells. There are special cell separators for leukocytapheresis
which can be also used with critically ill patients. The aim of this work. is analysing the compat-
ibility of apheresis on patients and the effects on the product quality
1.2.2 Methods
In this retrospective study the data were collected from the collection protocols and the per-
formed analysis about the product quality. In addition, the clinical data of the patients were col-
lected in the dermatological clinic of the universitiy hospital Erlangen. Every blood sample was
analized by the blood counter Sysmex K4000 und the flow cytometrie device FACS Calibur.
The statistical analysis was performed with the statistic programm SPSS, version 19.0.
1.2.3 Results
The citrate reaction is the most frequent side effect of an apheresis and occured twice as
much on female compared to male patients. Looking at multiple apheresis procedures there was
a decrease of citrate reactions and a not significant increase of monocyte yield and monocyte
collection efficiency. The highest recruitment factors were found in monocytes and lympho-
cytes. The collection efficiency increased during the second apheresis, but diminished during
the third collection procedure. There were no significant relations between the monocyte yield
and age, BMI, tumor stage und Protein S100. Male patients with a chemotherapy one month
before apheresis had a not significantly higher leukocyte concentration before apheresis. In ad-
dition, male subjects with a chemotherapy one month before apheresis showed a higher mono-
cyte recruitment factor. A significantly higher monocyte collection efficiency was found on
male patients who had radiation therapy during half a year before apheresis. An increased LDH
as a possible consequence of the pretreatments on men was associated with a higher monocyte
yield. A lower separation factor as instrument setting led to a lower monocyte collection effi-
9
ciency. The correlation coefficient between the monocyte concentration in the patient‘s blood
before apheresis and in the product showed highly significant correlations.
1.2.4 Conclusions
During leukocytapheresis patients should get an early calcium prophylaxis, since the
citrate reaction ist the most frequent side effect of an apheresis. As to multiple apheresis a
better product quality is probably achieved by decreasing the citrate reaction with calcium
prophylaxis. Gender-specific differences like a more frequent incidence of citrate reactions
on women have to be considered. In addition, there are different gender-specific effects of
chemotherapy or radiation before apheresis and a LDH-increase to the leukocyte concentra-
tion in the blood of the patients and the product quality. Other factors, like BMI, age and
Protein S100, seem to have no relevant influence on the product quality. A high separation
factor was associated to a higher monocyte collection efficiency. The monocyte concentra-
tion in the blood of the patients is a useful parameter for the monocyte concentration in the
product. Besides, inter-and intraindividual differences of cell recruitment on the product
quality have to be considered.
10
2 Einführung
2.1 Das Maligne Melanom
Das Maligne Melanom ist einer der bösartigsten Tumoren von Haut und Schleimhaut [8].
Obwohl er zu den eher seltenen Hauttumore gehört, verursacht das Maligne Melanom 80 Pro-
zent der Todesfälle aller Hauttumoren [45]. Innerhalb der weißen Bevölkerung erfolgte beson-
ders in den letzten 40 Jahren eine starke Zunahme der Inzidenz [19]. Lag diese 1970 in Mittel-
europa noch bei 3 bis 4 pro 100.000 Einwohner, so erkrankten Anfang 2000 bereits 10 bis 15
Personen pro 100.000 Einwohner an einem Malignen Melanom [19].
Beim Malignen Melanom lassen sich vier unterschiedliche Formen und vier weitere Sonder-
formen unterscheiden [50]. Zu den vier Formen gehören das superfiziell spreitende Melanom,
das noduläre Melanom, das Lentigo-maligna Melanom und das akrolentiginöse Melanom [50].
Die Unterscheidung erfolgt anhand von klinischen und histologischen Kriterien [50]. Das ame-
lanotische Maligne Melanom, das Aderhautmelanom, das Schleimhautmelanom und das unklas-
sifizierbare Maligne Melanom werden unter den Sonderformen zusammengefasst, die insgesamt
nur fünf Prozent aller Melanome ausmachen [50]. 1 bis 8 Prozent sind zudem Melanome unbe-
kannten Ursprungs [52].
Bei dem Verdacht auf ein Malignes Melanom erfolgt durch Auflichtmikroskopie eine Beur-
teilung der verdächtigen Läsion nach der ABCD-Regel, bei der Asymmetrie, Begrenzung, Far-
be, Durchmesser und Erhabenheit beurteilt werden [66]. Bleibt der Befund weiterhin suspekt,
erfolgt eine Exzisionsbiopsie inklusive einer histologischen Beurteilung, mit der die Diagnose
Malignes Melanom gesichert wird [50]. Außerdem sollte in der histologischen Untersuchung
die Tumordicke nach Breslow, das Invasionslevel nach Clark und das Vorhandensein einer Ul-
zeration bestimmt werden [66]. Bei einem invasiven Melanom von über einem Millimeter er-
folgt eine Ausbreitungsdiagnostik [65]. Hierzu gehören eine Lymphknotensonografie des regio-
nären Abflussgebietes, eine Röntgen-Thoraxaufnahme, eine Abdomensonografie und eine
Wächterlymphknoten- Biopsie [65]. Es sollte ebenfalls eine Labordiagnostik durchgeführt wer-
den, bei der neben Blutsenkungsgeschwindigkeit, alkalischer Phosphatase und einem Blutbild
auch LDH und Protein S100 bestimmt werden [66]. Während die Bestimmung von LDH eher
zum Staging und zur Einschätzung der Prognose dient, ist Protein S100 ein Marker für die Ver-
laufsbeobachtung und für Rezidive [74]. Ein zusätzlicher Einsatz von CT-, MRT- oder PET-
Untersuchungen ist möglich [50].
Anhand der diagnostizierten Befunde erfolgt eine Stadieneinteilung, die in Tabelle 1 darge-
stellt wird [21].
11
Tabelle 1: Stadien des Malignen Melanoms
Stadium Primärtumor Lymknoten-
Metastasen
Fernmetastasen
0 In-situ-
Melanom
- -
I ≤ 2 mm, ohne
Ulzerationen
- -
II ≤ 2 mm mit
Ulzeration oder
> 2 mm
- -
III beliebige Tu-
mordicke
Mikro- oder Makro-
metastasen
-
IV M1a: Haut oder Lymphknoten
M1b: Lunge
M1c: andere Fernmetastasen oder
jegliche Fernmetastasen mit erhöh-
tem LDH
Die Therapie des Malignen Melanoms erfolgt abhängig vom jeweiligen Stadium des Patien-
ten. Während in frühen Stadien die kurative Behandlung das Therapieziel ist, steht in fortge-
schrittenen Stadien eher die palliative Medizin im Vordergrund [56]. Die Exzision des Primär-
tumors ist dabei die wichtigste Therapiemöglichkeit [8]. Der Sicherheitsabstand dieser Exzision
wird abhängig von der Tumordicke nach Breslow gewählt [21]. Bei metastasierten Stadien wird
ebenfalls als erste Therapieoption die Operation durchgeführt, sofern diese möglich ist [50].
Als adjuvante Therapie wird ab Stadium II eine Behandlung mit Interferon-alpha nach der
Operation empfohlen, da Interferon in prospektiven Studien einen Vorteil bezüglich der Re-
zidivfreiheit gezeigt hat [21]. Abhängig vom Metastasierungsrisiko erfolgt eine Dosisanpas-
sung, sodass es Therapieschemata mit niedrigdosiertem und hochdosiertem Interferon gibt [21].
Mit Hilfe der prophylaktischen, adjuvanten Chemotherapie konnte bisher keine Prognosever-
besserung nachgewiesen werden [8].
Bei regionären Metastasen, die nicht chirurgisch entfernt werden können, kann eine alleini-
ge Bestrahlung oder die isolierte hypertherme Zytostatikaperfusion mit eventuell zusätzlichem
TNF in Betracht kommen [20, 50, 61]. Indikationen für eine Chemotherapie sind neben inope-
12
rablen Rezidivtumoren und inoperablen regionären Metastasen auch Fernmetastasen [21].
Grundsätzlich gilt hierbei allerdings, dass das Maligne Melanom zu den unempfindlichsten Tu-
moren gegenüber Chemotherapie gehört [22]. Da zusätzlich bei Patienten mit diffus metastasier-
tem Melanom eine sehr schlechte Prognose besteht und diese Patientengruppe eine mittlere
Überlebenszeit von 6-8 Monaten hat, wurde in den letzten Jahren verstärkt nach neuen Ansatz-
möglichkeiten geforscht [18, 56, 61]. Bei vielen dieser Therapieoptionen, wie zum Bespiel einer
unspezifischen, adjuvanten Immuntherapie mit Bacille Calmette Guerin und Corynebacterium
parvum, Interferon-gamma oder Interleukin-2, konnte keine Prognoseverbesserung nachgewie-
sen werden [20]. Auch Polychemoimmuntherapien konnten das Gesamtüberleben der Patienten
nicht verbessern [20]. Der Antikörper Ipilimumab (Anti-CTLA-4) wurde jedoch im Juli 2011 in
Europa zugelassen, weil in Studien ein Überlebensvorteil von 3 Monaten gesichert werden
konnte [78]. Zusätzlich wurden Arzneimittel wie Vemurafenib entwickelt, das als BRAF-
Inhibitor ein bekanntes Onkogen hemmt [33]. Ein weiterer vielversprechender Ansatz ist die
Tumorvakzination, die in den letzten Jahren im Mittelpunkt intensiver Forschungsarbeit stand
und im nachfolgenden Abschnitt näher erläutert wird [17].
2.2 Vakzinationstherapie
2.2.1 Ralph Steinman und die Entdeckung der dendritischen Zellen
1973 wurden durch Ralph Steinman die dendritischen Zellen entdeckt, die nach wie vor als
die entscheidenden Antigen-präsentierenden Zellen angesehen werden und damit zwischen dem
angeborenen und dem erworbenen Immunsystem vermitteln [60]. Das Nobelpreiskomitee ent-
schied 2011, dass Steinman neben Jules Hoffmann und Bruce Beutler für diese Entdeckung
einen Nobelpreis erhalten sollte [41, 49]. Da Steinman nur drei Tage vor Bekanntgabe verstor-
ben war, wurde ihm dieser Preis auch posthum überreicht. Seine Entdeckung habe innerhalb der
letzten 40 Jahre zu einer verstärkten Forschung und dementsprechend neuen, wichtigen Er-
kenntnissen in der Immunologie geführt [41, 49].
Heute weiß man, dass unreife dendritische Zellen über Phagozytose und Endozytose extra-
zelluläre Bestandteile aufnehmen, diese intrazellulär in Peptide zerlegen und an MHC-Moleküle
gebunden auf ihrer Zelloberfläche präsentieren können [3, 44]. Durch die Antigenaufnahme
erfolgt die Reifung der dendritischen Zellen, bei der die Kapazität zur Antigenaufnahme sinkt
und nun die Funktion als antigenpräsentierende Zelle im Vordergrund steht [5]. Anschließend
kann eine dendritische Zelle mit unterschiedlichen Lymphozytenpopulationen interagieren, von
denen besonders die CD8-T-Lymphozyten eine zentrale Rolle spielen. Diese entwickeln sich
nach Kontakt mit den dendritischen Zellen zu zytotoxischen T-Zellen, die mit ihrem Rezeptor
13
Zellen erkennen und eliminieren können. Eine Interaktion mit den CD4-T-Zellen als Vorläufer
der Helferzellen ist ebenfalls möglich [44].
Eine dendritische Zelle kann abhängig von ihrem Aktivierungsstatus bei Kontakt mit Lym-
phozyten eine Immunantwort oder eine Toleranzentwicklung induzieren [44]. Erreicht eine
dendritische Zelle aus einem intakten Gewebe einen Lymphknoten in nichtaktiviertem Zustand,
kann eine Toleranz gegenüber dem präsentierten Antigen ausgelöst werden [44]. Werden dend-
ritische Zellen jedoch beispielsweise durch Entzündungsmediatoren aktiviert, wird eine Immun-
antwort ausgelöst [72].
2.2.2 Prinzip der Vakzinationstherapie
Mit diesen Erkenntnissen wurde die Theorie entwickelt, dass durch die Gabe von bestimm-
ten Tumorantigenen in einem immunstimulatorischen Kontext eine Immunantwort des Körpers
gegen Tumore ausgelöst werden kann [73]. Angewendet wurde diese Theorie bereits bei vielen
verschiedenen Tumorarten, am häufigsten jedoch beim Malignen Melanom, dem Prostata- und
dem Nieren-Karzinom [18]. Neben den unterschiedlichen Tumorarten gibt es viele verschiedene
Methoden, mit denen diese Theorie umgesetzt wird. Eine dieser Methode ist die Vakzination
mit dendritischen Zellen, die seit 1996 in über 100 Studien näher erforscht wurde [3, 29]. Dabei
werden autologe dendritische Zellen ex vivo mit Antigenen beladen und anschließend dem Pati-
enten als Vakzine verabreicht [18]. Ein Vorteil dieser Methode gegenüber Vakzinationen mit
ganzen Tumorzellen ist, dass man damit die meist ineffiziente In-Vivo-Antigenprozesssierung
umgehen kann [73]. Außerdem wird nicht nur eine begrenzte Anzahl von dendritischen Zellen
an der Injektionsstelle erreicht wie bei Vakzinationen mit Peptiden oder DNS-Partikeln [73].
Zusätzlich kann bei der Vakzination mit dendritischen Zellen der Charakter der Immunantwort
leichter kontrolliert werden, da die gewünschte Zelllinie und die Reifungssignale ausgesucht
werden können [73].
2.2.3 Aktueller Forschungsstand und Sipuleucel
Grundsätzlich konnte in Studien bewiesen werden, dass die Therapie mit dendritischen Zel-
len bei Patienten mit fortgeschrittenem Malignen Melanom Immunogenität auslösen kann [18].
Bis jetzt konnte jedoch noch keine Verlängerung des Überlebens bei diesen Patienten nachge-
wiesen werden [20]. Dafür wurde im Juli 2010 Sipuleucel zur Behandlung des fortgeschrittenen
Prostatakarzinoms zugelassen [30]. Kantoff und Mitarbeiter konnten in einer Studie eine Zu-
14
nahme des Gesamtüberlebens von 4,1 Monaten bei Patienten mit fortgeschrittenem, kastrations-
resistentem Prostatakarzinom belegen, wenn diese mit Sipuleucel behandelt wurden [34].
Sipuleucel ist ein Vakzin, das aus dendritischen Zellen besteht, die durch patienteneigenen
Monozyten hergestellt wurden [34]. Diese Zellen werden ex vivo mit einem rekombinanten
Fusionsprotein aus einem Prostata-Antigen zusammen mit dem Zytokin GM-CSF aktiviert [34].
Das Therapieschema besteht aus drei intravenösen Infusionen, die alle zwei Wochen verabreicht
werden. Der Ablauf dieser Therapie ist damit innerhalb nur eines Monats abgeschlossen [42].
Es besteht damit zu Recht die Hoffnung, Tumore oder Infektionen mit einer Vakzinationsthera-
pie erfolgreich behandeln zu können [41].
2.3 Gewinnung von dendritischen Zellen
Für die Herstellung von Vakzinen werden große Mengen an funktionsfähigen dendritischen
Zellen benötigt [67, 69]. Da dendritische Zellen nur in sehr geringer Zahl im Blut vorkommen,
wurden verschiedene Ansätze entwickelt, mit denen eine Sammlung und Vermehrung möglich
ist [27]. Durch Wachstumsfaktoren kann beispielsweise direkt die Anzahl von dendritischen
Zellen im Blut erhöht werden [44]. Außerdem können dendritische Zellen aus CD34+-
hämatopoetischen Stammzellen erzeugt werden [44]. Der Großteil von dendritischen Zellen
wird aber aus Monozyten mithilfe von Wachstumsfaktoren in einer In-vitro-Kultur hergestellt,
weswegen die Leukozytapherese als Goldstandard zur Gewinnung von Monozyten zur Generie-
rung dendritischer Zellen angesehen wird [3, 44, 67, 69, 71].
2.3.1 Das Aphereseverfahren
Die Leukozytapherese gehört zu den Hämapheresen, die sich mit der präparativen Auftren-
nung des Blutes in dessen plasmatische und zelluläre Bestandteile befassen [28]. Das Ziel einer
Apherese ist die Sammlung bestimmter Blutkomponenten [28]. Die Mehrheit aller Apheresen
wird mithilfe der Differentialzentrifugation durchgeführt, mit der anhand der Dichte der einzel-
nen Blutbestandteile Zelltrennungen von Plasma möglich ist [28, 47]. Das Filtrationsverfahren
als zweite Variante wird lediglich zur Plasmatrennung verwendet und stellt ein Verfahren der
therapeutischen, nicht der präparativen Apherese dar.[28].
Die ersten Erfahrungen mit therapeutischen Leukozytapheresen wurden bereits in den 60er
Jahren bei Patienten mit chronischer Leukämie gesammelt [69]. Mittlerweile werden Leuko-
zytapheresen neben der Sammlung von Monozyten zur Vakzinationstherapie durch die präpara-
15
tive Apherese auch zur Behandlung der Colitis ulcerosa oder des Morbus Crohn eingesetzt [28].
Anforderungen an eine erfolgreiche Apherese sind vor allem eine effiziente Auftrennung und
Absammlung, da für die Vakzinationstherapie über eine Milliarde an Monozyten benötigt wird
[69]. Zum Schutz des Patienten muss ein geschlossenes System verwendet werden, um Infekti-
onen zu vermeiden [69]. Außerdem sollte der Verlust von Thrombozyten und Erythrozyten
durch das Aphereseverfahren möglichst gering gehalten werden [69].
Ein Nachteil der Leukozytapherese ist, dass die unterschiedlichen Subpopulationen der mo-
nonukleären Zellen aufgrund ihrer ähnlichen Dichte nicht weiter aufgetrennt werden können
[69]. Außerdem kommt es trotz sorgfältiger Einstellungen zu einer Restzell-Kontamination im
Produkt, weswegen nach der Apherese kostenintensive Arbeitsschritte zur Aufreinigung der
Monozyten durchgeführt werden müssen [69]. Obwohl die Leukozytapherese bereits als Gold-
standard gilt, sollte deswegen weiter an einer Optimierung der Sammelergebnisse gearbeitet
werden [69, 70].
2.3.2 Zellseparator und Sammelprinzip
In der vorliegenden Studie wurden alle Leukozytapheresen mit dem Apheresegerät COBE
Spectra (Caridian BCT, Denver Colorado) durchgeführt. Da dieser Zellseprator erstmals 1984
auf den Markt gebracht wurde, besteht eine dreißigjährige Erfahrung mit dessen Handhabung
[69]. Neben Leukozyten kann die COBE auch für die Sammlung anderer Blutkomponenten, wie
zum Beispiel Thrombozyten oder Granulozyten, verwendet werden [12]. Um den Blutfluss in-
nerhalb des Apheresegerätes aufrecht zu erhalten, erfolgte bei allen Apheresen eine Antikoagu-
lation mit Natriumzitrat (ACD-A) [40].
Die Auftrennung der einzelnen Blutkomponenten wurde mithilfe der Differentialzentrifuga-
tion durchgeführt. Antikoaguliertes Blut fließt dabei über eine Zuleitung in die Zentrifuge, die
der Auftrennung des Blutes durch Differentialzentrifugation dient. Bestandteile mit einer hohen
Dichte wie Erythrozyten sammeln sich dabei an die Außenseite der Zentrifuge. Plasma mit der
geringsten Dichte sammelt sich dementsprechend an der Innenseite. Dazwischen befinden sich
die Thrombozyten und die Leukozyten, die über eine Sammelleitung abgesammelt werden kön-
nen [12]. Der Sammelerfolg von Leukozyten hängt entscheidend von der Überwachung der
Sammelleitung ab, die vom Operator überprüft wird. Die Farbe dieser Leitung hängt vom Hä-
matokrit des abgesammelten Zellprodukts ab. Mit einer dazugehörigen Farbkarte kann der Häm-
tokrit dieser Leitung überprüft und damit der Sammelprozess optimiert werden [12, 69]. Jestice
und Mitarbeiter konnten in ihrer Studie nachweisen, dass die optimale Sammlung von Monozy-
ten einen Hämatokrit von 1-3 Prozent erfordert [31]. Nguyen und Mitarbeiter konnten 2002
16
zeigen, dass eine einzige Apherese mit der COBE Spectra für die Produktion von 5-10 Vakzina-
tionen ausreicht [54].
2.3.3 Nebenwirkungen einer Apherese
Die häufigste Nebenwirkung einer Leukozytapherese ist die Zitratreaktion, die durch das
Antikoagulanz Zitrat ausgelöst wird [77]. Die Antikoagulation während einer Apherese ist un-
vermeidbar, da es sonst zu einer Aktivierung der Blutgerinnung mit Gerinnselbildung innerhalb
des Apheresesets im Zellseparator kommen würde [1]. Zitrat, das seit 1914 verwendet wird,
hemmt die Blutgerinnung, indem es Komplexe mit Calcium-Ionen bildet [1, 51]. Im Gegensatz
zu Heparin, das ebenfalls als Antikoagulanz während einer Apherese verwendet werden kann,
führt Zitrat nicht zu einer systemischen Antikoagulation [10]. Während Zitrat bei Patienten ohne
Leberzirrhose lediglich eine Halbwertszeit von 36 Minuten hat, kann die Wirkung von Heparin
für einige Stunden anhalten [39, 53]. Weitere Vorteile von Zitrat sind die niedrigen Kosten und
die relativ sichere Anwendung [40].
Durch die Komplexbildung von Zitrat mit Calcium-Ionen kommt es im Blut zu einer Ab-
nahme an ionisierten Calcium-Ionen [7]. Die daraus entstandene Hypocalcämie kann zu einer
Zitratreaktion führen [77]. Zu den Symptomen einer Hypocalcämie und damit einer leichten
Zitratreaktion gehören periorale oder akrale Parästhesien, Niesen, Benommenheit, Schüttelfrost
und Kopfschmerzen [40]. Bei einer moderaten Zitratreaktion kann es zu Übelkeit und Erbre-
chen, Nervosität, abdominellen Krämpfen, Muskelzuckungen mit Karpopedalspasmen und Te-
tanie, Tremor und Hypotension kommen [40]. Epileptische Anfälle und kardiale Arrhythmien
zählen zu den Symptomen einer schweren Zitratreaktion [40]. Eine weitere, wesentlich seltenere
Nebenwirkung von Zitrat ist die metabolische Alkalose, die nur bei Patienten mit eingeschränk-
ter Nierenfunktion aufgrund von verminderter Bikarbonat-Ausscheidung auftritt [35]. Außer-
dem kann eine Hypotension vorkommen, die jedoch meist multifaktoriell durch beispielsweise
Hypovolämie, eine vasovagale Reaktion oder eine Zitratreaktion ausgelöst werden kann [77].
Weitere mögliche Nebenwirkungen sind eine Thrombozytopenie und eine Luftembolie, deren
Auftreten allerdings als sehr selten eingestuft wird [77].
17
2.4 Fragestellung der Arbeit
Die vorliegende Arbeit untersucht Leukozytapheresen von Patienten mit fortgeschrittenem
Malignem Melanom. Das Ziel dieser Art von Apheresen ist, zum einen ausreichend Monozyten
für eine Vakzinationstherapie zu sammeln. Gleichzeitig sollte die Apherese möglichst gut ver-
träglich für den Patienten sein, der diese Spende mit dem Hintergrund leistet, dass es sich bei
der vorliegenden Patientenkohorte um teilweise schwerkranke Menschen handelt. Eine weitere
Besonderheit dieser Apheresen ist, dass keine Voruntersuchung auf Spendertauglichkeit durch-
geführt wurde, die bei gesunden Blutspendern vorgeschrieben ist [11]. Eine Zulassung der Me-
lanompatienten zur Spende erfolgt allein auf Basis der Studienprotokolle zur Vakzinationsthe-
rapie. Im Einzelnen wurden in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen untersucht:
1. Veränderungen von Blutbild und Elektrolytwerten bei Patienten während der Erstaphe-
rese.
2. Beschreibung der Nebenwirkungen bei Erst- und Mehrfachapheresen.
3. Einflüsse der Blutwerte der Patienten vor Erstapherese auf die Produktqualität.
4. Verhalten der Monozyten-Sammeleffizienz, des Monozytengehaltes und Monozyten-
Rekrutierungsfaktors bei Patienten mit zwei und drei Leukozytapheresen.
5. Untersuchung der Einflussgrößen allgemeine Patientendaten, melanom- und apherese-
spezifische Patientendaten auf die Monozyten-Sammeleffizienz, den Monozytengehalt
und den Monozyten-Rekrutierungsfaktor.
6. Einflüsse von Vorbehandlungen auf die Monozyten-Sammeleffizienz, den Monozyten-
gehalt und den Monozyten-Rekrutierungsfaktor.
18
3 Material und Methoden
3.1 Studienprofil
Die Datenerhebung zur vorliegenden Studie wurde retrospektiv durchgeführt. Die Auswahl der
Patienten erfolgte anhand der verfügbaren Aphereseprotokolle aus der Transfusionsmedizini-
schen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen der Universität Erlangen-Nürnberg. Es
wurden Leukozytapheresen bei Patienten in den Zeiträumen zwischen 11/1997 bis 12/2000 und
von 01/2007 bis 06/2010 analysiert. Bei Patienten, die sich bereits vor 01/2007 einer Monozy-
tenapherese unterzogen und danach erneut kamen, konnten in der Analyse auch ältere Spenden
berücksichtigt werden. Zusätzlich erfolgte eine Erhebung klinischer Daten in der Dermatologie
des Universitätsklinikums Erlangen.
Zur besseren Vergleichbarkeit der Daten wurden außerdem Rahmenbedingungen festgelegt.
Dazu gehört, dass lediglich Apheresen ausgewertet wurden, die mit dem Apherese-Gerät COBE
Spectra durchgeführt wurden. Außerdem wurden nur Apheresen ausgewählt, die nicht länger als
300 ± 30 Minuten dauerten. Mit Ausnahme der Abschnitte zum Thema Mehrfachapheresen
wurden nur Daten aus Erstapheresen verwendet.
3.2 Patientenkollektiv
Die Studie umfasst die Daten von insgesamt 41 weiblichen und 59 männlichen Patienten. Da
bei einigen Patienten bis zu sieben Apheresen durchgeführt wurden, konnten bei diesem Patien-
tenkollektiv insgesamt Daten von 211 Apheresen erhoben werden, die alle mit dem Apheresege-
rät COBE Spectra vollzogen wurden. Die Zeitabstände zwischen den einzelnen Apheresen wa-
ren abhängig vom Bedarf an Monozyten für die Herstellung der DC Vakzinen und folgten kei-
nen festen Zeitabständen. Das Durchschnittsalter bei Erstapherese betrug 52 ± 15 Jahren mit
einem Minimum von 16 Jahren und einem Maximum von 80 Jahren. Bei allen Patienten wurde
die Monozytenapherese aufgrund eines fortgeschrittenen Malignen Melanoms durchgeführt.
3.3 Auswahl der Prüfvariablen
Neben dem Spendedatum wurde das Geburtsdatum, die Größe und das Gewicht des Patien-
ten und zusätzlich die Vitalparameter Blutdruck, Puls und Temperatur vor und nach der Aphere-
se erfasst. Vor und nach der Monozytenapherese erfolgte bei den Patienten eine Abnahme von
Blutproben. Diese beiden Proben und eine weitere aus dem Monozytenkonzentrat wurden auf
19
verschiedene Parameter untersucht, die in Kapitel 3.6 genauer beschrieben werden. Bezüglich
der Geräteeinstellungen konnten die Daten von Blutfluss, Trennfaktor, Zentrifugendrehzahl und
Plasmaflussrate erfasst werden. Spendendauer, Separationsvolumen, prozessiertes Blutvolumen
(PBV), Natriumzitrat-Verbrauch, Produktvolumen und Plasmavolumen wurden ebenfalls für
jeden Patienten in die statistische Auswertung aufgenommen.
Probleme oder Nebenwirkungen während der Apherese wurden auf dem Herstellungsproto-
koll vermerkt. Zu den Nebenwirkungen einer Apherese zählen Beschwerden wie Übelkeit, Erb-
rechen, Kopfschmerzen, Kreislaufprobleme, Sauerstoffsättigungsabfälle und Zitratreaktionen.
Außerdem kann es zu technischen Problemen, zu niedrigen Flussgeschwindigkeiten und Para-
vasaten kommen. Medikamente, die aufgrund von Nebenwirkungen oder zur Prophylaxe verab-
reicht wurden, wurden aus den Protokollen übernommen.
Die Daten eines Anamnesebogens, den jeder Patient vor der Leukozytapherese ausfüllen
musste, wurden ebenfalls in die statistische Auswertung aufgenommen. Hierbei wurden sowohl
aktuelle Erkrankungen wie Erkältungen, Durchfall oder Erbrechen als auch chronische Erkran-
kungen des Herzens, des Kreislaufs, der Gefäße, der Lungen und Atemwege, des Stoffwechsels
und des Blutes und zusätzliche Informationen, wie Alkoholkonsum, Allergien und Rauchen
erfasst.
3.4 Sonstige klinische Angaben
In der Dermatologischen Klinik wurden folgende anamnestische Angaben kodiert und in die
statistische Tabelle aufgenommen. Es wurden Monat und Jahr der Erstdiagnose des Malignen
Melanoms, der Melanomtyp, die Tumordicke und Ulzerationen analysiert. Zusätzlich wurde zur
Einschätzung der Schwere der Erkrankung das Tumorstadium und eine eventuelle Erhöhung der
beiden Tumormarker Protein S100 und LDH aufgenommen. Da in dieser Arbeit untersucht
werden sollte, ob bestimmte Vorbehandlungen Einfluss auf den Monozytengehalt haben, wur-
den darüber hinaus auch Chemotherapien, Bestrahlungen und Operationen erfasst. Hier wurden
jedoch nur diejenigen Behandlungen aufgenommen, die bis zu einem Monat oder bis zu einem
halben Jahr vor der Apherese stattgefunden hatten. Eine genaue Kodierung der aufgenommenen
Parameter befindet sich in Tabelle 23 im Anhang.
3.5 Die Leukozytapherese
Zur folgenden Darstellung des Zellseparators Cobe Spectra (Caridian BCT, Denver Colora-
do) wurde unterstützend das Gerätehandbuch verwendet.
20
Abbildung 1: COBE Spectra (Hinweis: Die Abbildung wurde mit Genehmigung der Firma
TermumoBCT aus dem Gerätehandbuch entnommen)
Das Cobe Spectra-Gerät wird vor der Apherese mit einem Einwegeset bestückt. Die Separa-
tionskammer dieses Sets wird in den Zentrifugenteller eingelegt, der variabler Bestandteil des
Zellseparators ist. Bei allen Apheresen wurde das WBK Set zur Sammlung von Monozyten
verwendet. Dieses besteht aus dem WBK-Schlauch, einem Schlauchsystem, welches das Blut
durch das Gerät leitet, und dem Einphasen-WBK-Kanal, der in den Zentrifugenteller eingelegt
wird. Das extrakorporale Blutvolumen wird dabei auf eine Höchstmenge von 280 ml be-
schränkt. Eine effiziente Antikoagulation und ein geregelter Flüssigkeitsfluss sind Vorausset-
zung für eine komplikationslose Apherese und einen möglichst hohen Gewinn an Monozyten.
3.5.1 Antikoagulation
Das Blut des Patienten muss während der Apherese im extrakorporalen Kreislauf antikoagu-
liert sein, damit es zu keiner Aktivierung der Gerinnung kommt. Die Antikoagulation hemmt
die Aktivierung des Gerinnungssystems und der zellulären Bestandteile, vor allem der Throm-
bozyten [37]. Das Antikoagulanz verhindert dadurch Thrombenbildung, in deren Folge eine
21
Verstopfung des Schlauchsystems oder Embolien bei Patienten auftreten können. Alle in diese
Arbeit aufgenommenen Apheresen wurden mit Natriumzitrat (ACD-A) durchgeführt.
ACD-A hemmt die Gerinnung im Apheresesystem, indem es freie Calciumionen bindet, die
für eine Aktivierung der Blutgerinnung unerlässlich sind [53]. Gleichzeitig kann es dabei zu
Hypokalzämien bei Patienten kommen. Diese können bis hin zu schwerwiegenden Herzrhyth-
musstörungen führen [40].
Zur Ermittlung einer effizienten ACD-A-Dosis wurde die Formel nach Nadler und Allen für
die Berechnung des Gesamtblutvolumens verwendet. Hierbei mussten Geschlecht, Größe und
Gewicht des Spenders herangezogen werden. Anhand der zu Beginn der Apherese eingestellten
AK-Infusionsrate, die 0,8 ml pro Minute beträgt, wird die Menge an ACD-A festgelegt, die der
Patient während der Apherese erhält.
3.5.2 Das Aphereseset zur Leukozytensammlung
Das WBK-Schlauchsystem wird vor Apheresebeginn über die NaCl-Zuflussleitung mit
Natriumchlorid-Lösung vorgefüllt und dadurch entlüftet. Diese Vorfülllösung wird anschlie-
ßend über die Verwurfableitungen in den Verwurfbeutel geleitet. Das Blut des Patienten fließt
über die Zuflussnadel, die am Apherese-Einmal-Set hängt. Durch Beimengung einer definierten
Menge an ADC-A, das im Verhältnis von 1:10 dem Blut zugesetzt wird, erfolgt die suffiziente
Antikoagulation während der Apherese. Von dort wird das antikoagulierte Vollblut weiter über
die Einlassleitung in die Zentrifuge befördert, in die zuvor der Einphasen-WBK-Kanal eingelegt
wird. Zur Auftrennung nutzt man die unterschiedlichen Dichten der Hauptkomponenten des
Blutes Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten und Plasma. Bei rotierender Zentrifuge sam-
meln sich die roten Blutkörperchen, die von allen Blutzellbestandteilen die höchste Dichte ha-
ben, an der äußeren Wand der Zentrifuge. Das Plasma und die Thrombozyten haben die nied-
rigste Dichte und reichern sich damit an der inneren Wand an. Die Leukozyten, zu denen auch
die Monozyten gehören, befinden sich aufgrund ihrer im Vergleich zu Plasma und Erythrozyten
mittleren Dichte zwischen diesen beiden Komponenten.
Zum Ausleiten aus der Zentrifuge liegt ein Schlauch zum Sammeln des Plasmas und der
Thrombozyten an der inneren Wand der Zentrifuge. An der äußeren Wand befindet sich der
Schlauch für die roten Blutkörperchen. Dazwischen liegen der Sammelschlauch für die Leuko-
zyten und der Schnittstellenkontrollschlauch. Dieser reguliert gemeinsam mit dem Flussraten-
verhältnis der Erythrozyten und des Plasmas den Spiegel der Erythrozyten-/Plasma-Schnittstelle
und ermöglicht damit die Sammlung von Leukozyten, die über die Sammelleitung in den Sam-
melbeutel geleitet werden. Die RBK-/Plasmaleitung transportiert rote Blutkörperchen und nicht
benötigtes Plasma aus der Zentrifuge über den Patientenrückfluss zurück zum Patienten.
22
3.5.3 Die Regulation des Aphereseablaufs
Während des Apheresevorgangs kontrollieren vier Pumpen, fünf Ventile und sechs Sicher-
heitsensoren die Flussgeschwindigkeit des Blutes innerhalb der COBE Spectra. Dies erfolgt
abhängig von dem venösen Blutfluss des Patienten und der Infusionsrate des Antikoagulanz. Zu
Beginn der Apherese leitet das Abflussleitventil und der RBK-Detektor mit Hilfe des RBK-
Plasma-Ventils Luft und Natriumchlorid-Lösung in den Verwurfbeutel. Die AK-Pumpe führt
dem Patientenblut die voreingestellte Rate an Natriumzitrat konstant zu. Anschließend kontrol-
liert die Einlass-Pumpe den Fluss des antikoagulierten Vollbluts in die Zentrifuge. Von dort
steuert die Plasma-RBK-Pumpe gemeinsam mit dem Plasma-RBK-Ventil den Zusammenfluss
von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasma, um diese anschließend zurück zum Patienten zu
leiten. Die gesammelten Leukozyten werden durch die Sammel-Ersatz-Pumpe in den Sammel-
beutel transportiert. Kommt es während des Apheresevorgangs zu einem Stromausfall oder an-
deren Alarmsituationen, schließt sich das Rückfluss-Ventil.
Die beiden Sicherheitssensoren für den Zufluss- und den Rückflussdruck messen konstant
den Druck und halten die Pumpen an, falls dieser den Sicherheitsbereich übersteigt. Befindet
sich Luft in der Einlass- oder Rückflussluftkammer, verriegeln die Einlass- und die Rückfluss-
luftdetektoren das Rückfluss-Ventil und halten ebenfalls die Pumpen an. Der AK-Spiegel-
Detektor gibt Alarm, wenn das Antikoagulanz aufgebraucht ist.
3.6 Geräte für die Zellanalyse
Jedem Patienten wurden vor und nach Leukozytapherese peripher venöse Blutproben (je-
weils 2 ml Vollblut, mit EDTA antikoaguliert) entnommen. Aus dem gesammelten Monozyten-
konzentrat wurden 2 Milliliter für die Analysen verwendet. Sämtliche Proben wurden mit dem
Blutbild-Gerät Sysmex K4000 (Siemens Diagnostics, Deutschland) auf folgende Parameter
untersucht: Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentration in Zellen pro Mikroli-
ter, Hämoglobinkonzentration in Gramm pro Deziliter, Hämatokrit in Prozent, mittleres korpus-
kuläres Volumen in Femtoliter, mittleres korpuskuläres Hämaglobin in Pikogramm und Lym-
phozyten und Granulozyten in Prozent.
Der Gehalt an Monozyten wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Analysen wur-
den mit dem Gerät mit FACS Calibur (BD, USA) durchgeführt. Zur folgenden genaueren Be-
schreibung dieses Arbeitsablaufs diente eine interne Arbeitsanweisung der Transfusionsmedizi-
nischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen.
Es wurden jeweils 50 Mikroliter aus den Blutproben des Patienten und der Probe des Kon-
zentrats entnommen. Diese wurden zusammen mit 10 Mikroliter Mouse Anti-Human CD45
23
Fluoreszin-Isocyanat, einem grünfluoreszierenden Antikörper gegen CD45, und 10 Mikroliter
Mouse Anti-Human CD 14 Phycoerythrin, ein gelbrotfluoreszierender Antikörper gegen CD 14,
für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 1000 Mikroliter BD Pharm Lyse
hinzugefügt, um die Erythrozyten zu lysieren. Die durchflusszytometrische Zellanalyse erfolgte
nach einer erneuten Inkubationszeit von 5 Minuten.
3.6.1 Die durchflusszytometrische Analyse
Die Durchflusszytometrie dient der quantitativen Unterscheidung von Zellen und ihren Sub-
populationen mit Hilfe eines Laserstrahls. Die Zellen passieren nacheinander den Laserstrahl,
der in Abhängigkeit von verschiedenen physikalischen Faktoren oder fluoreszierenden Antikör-
pern in verschiedene Richtungen gestreut wird [57]. Gleichzeitig erfolgt eine Messung des
Vorwärtsstreulichts (forward scattering) und des Seitwärtsstreulichts (side scattering), die in
ihrer Kombination charakteristisch für die Identifikation der einzelnen Zellen sind [59].
Relevante physikalische Faktoren für die Durchflusszytometrie sind Größe und Granularität
einzelner Zellen, anhand derer Leukozyten, Monozyten und Granulozyten unterschieden werden
können. Der Anteil des gemessenen Vorwärtsstreulichts hängt dabei von der Größe der Zelle ab.
Je größer die Zelle, desto mehr forward scattering kann gemessen werden. Das Seitwärtsstreu-
licht dagegen wird vom Ausmaß der Granularität beeinflusst [57]. Um die Ergebnisse zu veran-
schaulichen, können die gemessenen Signale graphisch in einem sogenannten Streulicht-Dot-
Plot dargestellt werden.
24
Abbildung 2: Streulicht-Dot-Plot
CD45 Fluoreszin-Isocyanat und CD 14 Phycoerythrin wurden bei den vorliegenden Mes-
sungen als floureszenzmarkierte Antikörper verwendet. Trifft der Laserstrahl auf Antikörper-
beladene Zellen, fluoreszieren diese in ihrer charakteristischen Emissionswellenlänge und er-
möglichen dadurch eine Darstellung in einzelne Zellpopulationen [57]. Eine Darstellung im
Streulicht-Dot-Plot ist ebenfalls möglich.
Bei allen durchflusszytometrischen Untersuchungen wurden beide Verfahren zur gegensei-
tigen Kontrolle verwendet. Nach erfolgter Analyse wurde der prozentuale Anteil der Monozyten
abgeglichen.
3.7 Ablauf der Spende
Als Voraussetzung für eine Monozytenapherese wurden die Patienten in eine Melanom-
Studie der dermatologischen Klinik der Universität Erlangen-Nürnberg aufgenommen. Zu Be-
ginn erfolgte eine Aufklärung über den Ablauf und mögliche Komplikationen. Alle Patienten
mussten eine schriftliche Einwilligung abgeben. Zusätzlich wurde ein Fragebogen zu aktuellen
und chronischen Erkrankungen, regelmäßigen Medikamenteneinnahmen, Rauchen und Alko-
holkonsum von jedem Patienten ausgefüllt.
Vor Apheresebeginn wurden Blutproben abgenommen und die Vitalparameter Blutdruck,
Puls und Temperatur überprüft. Bei Patienten mit einem erhöhten Risiko für Zitratreaktionen
wurde bis Januar 2010 eine orale Calcium-Prophylaxe in Form von Brausetabletten mit 500 mg
Calcium (Zusammensetzung: 2940 mg Calcium-D-gluconat -Calciumlactat (2:3) 2 H2O und
25
300 mg Calciumcarbonat) durchgeführt. Nach Januar 2010 erfolgte eine intravenöse Prophylaxe
mit 10 Milliliter zehnprozentiger Calciumchlorid-Lösung über 8-10 Milliliter pro Stunde. Ab-
hängig von den peripheren Venenverhältnissen wurden die Apheresen mit einem zentralen oder
peripheren Venenkatheter durchgeführt. Ein peripher venöser Zugang wurde hierbei aufgrund
der geringeren Komplikationsrate bei Anlage bevorzugt. Der Entscheidung darüber lag eine
Begutachtung der Venen durch den Apheresearzt vor Apheresebeginn zugrunde.
Die Grundeinstellungen an dem Apheresegerät COBE Spectra orientierten sich an Veröffent-
lichungen von Glaser aus dem Jahr 2001 und Strasser 2003. Der Blutfluss wurde auf 50 ml/min
eingestellt. Aus dem Blutfluss und einem Trennfaktor von 250 ergab sich eine Zentrifugendreh-
zahl von 646 Umdrehungen pro Minute. Die Dauer der Spende wurde auf 300 Minuten ± 30
Minuten festgelegt.
Während der Apherese war den Patienten Essen und Trinken erlaubt. Die Vitalparameter
wurden regelmäßig überprüft, um frühzeitig Nebenwirkungen zu erkennen und diese zu behan-
deln. Alle verabreichten Medikamente und aufgetretene Nebenwirkungen wurden in den Aphe-
reseprotokollen festgehalten. Eine weitere Überprüfung der Vitalparamter sowie eine erneute
Blutabnahme erfolgten nach der Leukozytapherese. Das entstandene Monozytenkonzentrat
wurde mit einem sterilen Schweißgerät vom Zellseparator abgeschweißt und ohne weitere Auf-
bereitung an die Dermatologie weitergegeben. Bei deutlicher Zellaggregatbildung wurde das
Produkt vorher für zehn Minuten auf den Thrombozyten-Agitator gelegt.
3.8 Berechnungen und Formeln
Die aus den Aphereseprotokollen aufgenommenen Parameter dienten der Berechnung fol-
gender Zielvariablen:
Die Zellkonzentrationen von Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten vor und nach der
Spende und im Konzentrat konnten aus der Leukozytenkonzentration und den jeweiligen Pro-
zentangaben berechnet werden:
(1) Zellkonzentration (Zellen /µl) = Zellen im Blut (%) x Leukozyten (Zellen/µl) / 100
Der Zellverlust von Leukozyten, Thrombozyten, Lymphozyten, Granulozyten und Monozy-
ten wurde wie folgt errechnet:
(2) Zellverlust (%) = (1- (Zellkonzentration im Blut nach der Spende (Zellen/µl) / Zell-
konzentration im Blut vor der Spende (Zellen/ µl)) x (-100)
26
Zusätzlich wurden die Zellzahlen im Körper der Patienten von Leukozyten, Erythrozyten,
Thrombozyten, Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten anhand des totalen Blutvolumens
(TBV) vor und nach der Spende berechnet.
(3) Zellzahl im Körper = Zellkonzentration im Blut (Zellen/L) x TBV (L)
Bezüglich des Konzentrats wurden der Zellgehalt (Yield) von Leukozyten, Erythrozyten,
Thrombozyten, Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten und der Quotient von Thrombozy-
tengehalt zu Erythrozytengehalt berechnet.
(4) Zellgehalt (Yield) = Zellkonzentration im Produkt(Zellen/ml) * Produktvolumen (ml)
(5) Ratio Thrombozyten/Erythrozyten = Thrombozytengehalt / Erythrozytengehalt
Um den Zellgehalt in Bezug zur Spendedauer und zur separierten Blutmenge (PBV) zu set-
zen, wurden folgende Parameter von Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten,
Lymphozyten und Monozyten berechnet:
(6) Zellgehalt pro Minute (Zellen/min) = Yield / Spendedauer
(7) Zellgehalt pro Liter prozessiertes Blut (Zellen/L) = Yield / PBV (L)
(8) Prozessiertes Blutvolumen (L) = Separiertes Volumen – Natriumzitrat-Verbrauch
Zusammenhänge zwischen den Werten im Patientenblut und im Konzentrat wurden mit
dem Rekrutierungsfaktor und der Sammeleffizienz der Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozy-
ten, Granulozyten, Lymphozyten und der Monozyten hergestellt.
(9) Rekrutierungsfaktor = (Zellzahl im Blut nach der Spende + Zellgehalt im Produkt) /
Zellzahl im Blut vor der Spende
(10) Sammeleffizienz (%) = (Zellgehalt * 100 (%)) / PBV (ml) * 0,5 * (Zellkonzentra-
tion im Blut vor der Spende (Zellen/µl) + Zellkonzentration im Blut nach der Spende
(Zellen/ µl))
27
Außerdem wurde aus den Parametern Größe und Gewicht eines Patienten der Body-Mass-
Index (BMI) berechnet.
(11) BMI (kg/m²) = Gewicht (kg) / Größe (m)²
Die Berechnung des Gesamtblutvolumens erfolgte mit der Formel von Nadler und Allen:
(12) Frauen: GBV in ml = 183 + [356 x Körpergröße³ (Meter)] + [33,1 x Körperge-
wicht (kg)]
(13) Männer: GBV in ml = 604 + [367 x Körpergröße³ (Meter)] + [32,2 x Körperge-
wicht (kg)]
3.9 Die statistische Datenauswertung
Alle gesammelten Daten wurden in das Statistikprogramm SPSS, Version 19.0, (SPSS Inc.,
Chicago, Illinois, USA) übertragen und ausgewertet.
Für die deskriptive Statistik wurden die jeweiligen Mittelwerte und ihre Standardabweichun-
gen, Minimum, Maximum und Spannweite berechnet. Um die Normalverteilung zu prüfen,
wurden der Kolmogorov-Smirnov-Test bei Gruppengrößen von über 50 Fällen oder der Shapi-
ro-Wilk-Test bei kleineren Kohorten verwendet. Bei einer Normalverteilung wurde ein T-Test
für ungepaarte Stichproben durchgeführt, um die Signifikanz der errechneten Ergebnisse zu
überprüfen. Der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test (U-Test) wurde eingesetzt, wenn die Ergebnisse
nicht normalverteilt waren. Wenn mehrere Faktoren und ihre Interaktionen untereinander
gleichzeitig untersucht werden sollten, wurde eine univariate, multifaktorielle ANOVA benutzt.
Wenn neben mehreren Einflussfaktoren auch mehrere Zielvariablen ausgewählt waren, wurde
eine multivariate, multifaktorielle ANOVA durchgeführt. Anschließend wurden Post-Hoc-Tests
mit einer Adjustierung der Signifikanz durch Tukey berechnet, wenn eine Einflussvariable aus
mehreren Untergruppen bestand und sich als signifikant erwies.
Die Ergebnisse wurden als signifikant eingestuft, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit bei 5%
und darunter lag (p ≤ 0,05). Wurde ein p-Wert von 0,01 oder kleiner berechnet, wurde dies als
hochsignifikantes Ergebnis eingestuft.
Um zusätzlich Korrelationen zwischen einzelnen Variablen berechnen und darstellen zu kön-
nen, wurden abhängig von der Normalverteilung der Pearson- oder der Spearman-
28
Korrelationskoeffizient und Streu-Punkt-Diagramme benutzt. Zudem wurden Kreuztabellen
berechnet, um kategoriale Variablen untereinander besser darstellen zu können.
Zur graphischen Veranschaulichung der berechneten Ergebnisse wurden Box-Whisker-Plots
(Boxplots), Balkendiagramme und Interaktionsplots verwendet.
3.9.1 Vorgehensweise bei der statistischen Auswertung der Daten
Die Abschnitte 4.1 bis 4.4 des Ergebnisteils enthalten hierbei weitgehend eine rein deskrip-
tive Darstellung der Ergebnisse, die in Abbildung 3 detailliert vorgestellt wird.
Abbildung 3: Deskriptive Analyse
Die Bearbeitung der explorativen Statistik wird den Abschnitten 4.5 bis 4.10 dargestellt.
Zielvariablen waren die Monozyten-Sammeleffizienz, der Monozytengehalt und der Monozy-
ten-Rekrutierungsfaktor. Eine Gliederung zu der explorativen Datenanalyse befindet sich in
Abbildung 4. Die Untersuchungen zu Patienten mit Mehrfachapheresen wurden nicht nach den
drei Zielvariablen gegliedert, sondern befinden sich in den Abschnitten 4.8 und 4.9.
29
Abbildung 4: Explorative Analyse
Bezüglich den Vorbehandlungen Chemotherapie und Bestrahlung wurde unterschieden, ob
diese einen Monat oder innerhalb eines halben Jahres vor Apherese stattfanden. Außerdem wur-
den nicht direkt die Einflüsse der Vorbehandlung auf die Sammeleffizienz untersucht, da hier zu
viele mögliche Einflussfaktoren wie der Rekrutierungsfaktor oder schwerwiegende Nebenwir-
kungen das Ergebnis hätten beeinflussen können. Stattdessen erfolgte ein Vorgehen wie in Ab-
bildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: Vorgehensweise bei Vorbehandlungen
30
4. Ergebnisse
4.1 Beschreibung der Patientengruppe
Insgesamt wurden die Daten von 100 Patienten in die Auswertung aufgenommen. In dieser
Stichprobe waren 41 Personen weiblich und 59 männlich. Die Patienten wurden von der Der-
matologischen Klinik in die Studie nach Studienprotokollen aufgenommen. Die Anzahl der bei
den einzelnen Patienten durchgeführten Apheresen hing von der Indikationsstellung der Thera-
pie mit DC-Vakzinen ab. Eine Übersicht der Patientengruppen sortiert nach der Anzahl der
Apheresen befindet sich in Abbildung 6.
Abbildung 6: Anzahl durchgeführter Apheresen (N=100)
Bei der Mehrzahl der Patienten wurden nur eine (n=49) oder zwei (n=24) Apheresen durch-
geführt. Sieben Apheresen unterzogen sich nur zwei Patienten.
31
Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei 52 ± 15 Jahren. Der jüngste Patient war bei
Erstapherese 16 Jahre und der älteste 80 Jahre alt, woraus sich die große Spannweite von 64
Jahren ergibt. Es erfolgte eine Aufteilung in Altersgruppen von 10-Jahres-Schritten, um eine
bessere Übersicht über die Altersverteilung der Patienten zu gewinnen (Abbildung 7).
Abbildung 7:Altersverteilung der Patienten (N=100)
Die durchschnittliche Größe der Spender lag bei 1,72 ± 0,1 m und das durchschnittliche Ge-
wicht 75,3 ± 15,8 kg. Aus den vorliegenden Daten wurde ein Mittelwert des Body-Mass-Index
(BMI) von 24,9 ± 3,5 kg/m2 berechnet werden. Anhand des BMI erfolgte eine Einteilung in die
Gruppen Untergewicht (<18,5 kg/m2, n= 2), Normalgewicht (18,5-24,9 kg/m2, n=50), Präadipo-
sitas (25,0-29,9 kg/m2, n= 34) und Adipositas (>30,0 kg/m2, n=14). Das Gesamtblutvolumen,
das ebenfalls aus Größe und Gewicht des Patienten berechnet wurde, lag bei 4748 ± 926 ml.
Bezüglich der Vorerkrankungen gaben 17 Patienten eine Herzerkrankung an. 25 Patienten
nannten in der Eigenanamnese eine hypertensive Kreislauferkrankung. Eine hypotensive Kreis-
lauferkrankung wurde dagegen nur von neun Patienten angegeben. Bei 17 Patienten lag eine
Gefäßerkrankung vor. 14 Patienten litten an einer Stoffwechselerkrankung. Allergien, die sich
nicht lokale Reaktionen beschränken, wurden von 21 Personen angegeben. Lediglich vier Pati-
enten waren an den Atemwegen erkrankt und ein Patient litt an einer nicht näher spezifizierten
Erkrankung des Blutes.
32
4.1.1 Daten zur Melanomerkrankung der Patienten
Alle Patienten waren bei Erstapherese an einem Malignen Melanom im Stadium III oder IV
erkrankt, wobei nur drei Personen ein Malignes Melanom im Stadium IIIb und fünf Personen im
Stadium IIIc hatten. Bei 92 Patienten lag das Tumorstadium IV vor. Das Stadium IV M1a mit
Metastasen in Kutis, Subkutis oder nicht regionären Lymphknoten wurde bei 18 Patienten dia-
gnostiziert. 23 Patienten traten mit dem Stadium IV M1b in die Studie ein und 47 Patienten mit
dem Stadium IV M1c. Bei vier Patienten konnte keine genauere Differenzierung getroffen wer-
den.
Die Zeiträume zwischen Erstdiagnose, Eintritt in Stadium IV und Erstapherese variierten
stark (Abbildung 8). Der kürzeste Zeitraum mit 20 ± 20 Monaten lag zwischen Eintritt in Stadi-
um IV und Erstapherese.
Abbildung 8: Zeiträume zu Melanom-Daten (N=82)
Nach Exzision wurde durchschnittlich eine Tumordicke des Primarius von 3,2 ± 2,6 mm
gemessen und in 20 Fällen wurde eine Ulzeration beschrieben. Abbildung 9 zeigt den Mela-
nomtyp der Patienten bei Erstdiagnose. Am häufigsten wurde ein noduläres Melanom (n=32)
und ein superfiziell spreitendes Melanom (n=26) in der histologischen Untersuchung diagnosti-
33
ziert. Bei acht Patienten konnte keine genauere Differenzierung getroffen werden, da kein Pri-
marius gefunden wurde.
Abbildung 9: Häufigkeiten der einzelnen Melanomtypen (N=99)
Der Tumormarker Protein S100 war bei 40 Patienten zum Zeitpunkt der Erstapherese erhöht.
Eine LDH-Erhöhung als unspezifischer Metastasenmarker wurde bei 23 Patienten gemessen.
Außerdem hatten 17 Patienten Lebermetastasen. Bei 15 Patienten fand sich eine GOT- und
GPT-Erhöhung.
Tabelle 2 fasst die Vorbehandlungen und mögliche Kombinationen zusammen. Am häufigs-
ten wurde mit 19 Patienten eine Chemotherapie als Vorbehandlung einen Monat vor Erstaphe-
rese durchgeführt. Der Großteil der Patienten (n=46) bekam einen Monat vor der Apherese we-
der eine Chemotherapie, eine Bestrahlung noch eine Operation. Innerhalb eines halben Jahres
wurden nur zwei Patienten nicht vorbehandelt. Viele Patienten unterzogen sich in diesem Zeit-
raum einer Operation als alleinige Vorbehandlung (n=22) oder wurden zusätzlich zur Chemo-
therapie operiert (n=17).
34
Tabelle 2: Vorbehandlungen der Patienten vor Erstapherese (N=82)
4.1.2 Apheresespezifische Daten der Patienten bei Erstapherese
Bei einem Vergleich der Vitalparameter Blutdruck und Puls konnten signifikante Unter-
schiede zwischen den Werten vor und nach Erstapherese berechnet werden. Der systolische
Blutdruck der Patienten lag vor der Apherese durchschnittlich bei 130 ± 17,1 mmHg und nach
der Apherese bei 123,9 ± 18,5 mmHg (p=0,001). Der diastolische Blutdruck fiel von 78,4 ±
12,1 mmHg auf 76,1 ± 13,7 mmHg (p=0,019). Der Puls nahm im Mittel um vier Schläge pro
Minute von 84 Schlägen pro Minute auf 80 Schläge pro Minute ab (p<0,001). Die Körpertem-
peratur der Patienten lag durchschnittlich bei 36,4 ± 0,5 °C. Die Sauerstoffsättigung betrug vor
und nach der Erstapherese jeweils 97 %.
Die Blutbilder der Patienten vor und nach Erstapherese wurden ebenfalls auf Unterschiede
untersucht. Dabei konnte nur bei den Lymphozyten keine signifikante Abnahme nachgewiesen
werden. Die Leukozytenkonzentration sank von 5,7 ± 1,8 x 103 Zellen pro Mikroliter vor der
Apherese auf 5,0 ± 1,8 x 103 Zellen pro Mikroliter (p<0,001). Die Monozyten fielen während
der Apherese von 0,4 ± 0,2 Zellen x 10³ Zellen pro Mikroliter auf 0,3 ± 0,2 Zellen x 10³ pro
Mikroliter (p<0,001), woraus sich der prozentual höchste Abfall mit einem Monozytenverlust
von -17,2 ± 26,6 % berechnen ließ. In Bezug auf die Thrombozyten wurde eine Abnahme von -
74,9 ± 50,6 Zellen x 10³ pro Mikroliter dokumentiert. Eine Übersicht über die Blutbilder der
Patienten vor und nach Apherese ist in Tabelle 3 zu finden. Eine Zusammenfassung der aus den
Chemotherapie Bestrahlung Operation Anzahl der Patienten
einen Monat vor Aphere-
se
Anzahl der Pa-tienten bis zu einem halben
Jahr vor Aphe-rese
Ja Ja
Ja
Nein
0
2
5
5
Nein Ja
Nein
0
19
17
19
Nein Ja Ja
Nein
2
5
8
4
Nein Ja
Nein
8
46
22
2
35
Blutbildern berechneten Zellverluste und der Zellzahlen im Körper des Patienten wurde im An-
hang in Tabelle 24 und in Tabelle 25 dargestellt.
Tabelle 3: Blutbilder der Patienten vor und nach Erstapherese
N=99 Blutbild vor Apherese
Blutbild nach Apherese
Differenz P-Wert
Leukozyten (Zellen * 10³/µl)
5,7 ± 1,8 5,0 ± 1,6 -0,7 ± 1,2 < 0,001†
Erythrozyten (Zellen * 106/µl)
4,1 ± 0,6 3,7 ± 0,6 -0,3 ± 0,2 < 0,001‡
Hämoglobin (g/dl)
12,7 ± 1,7 11,5 ± 1,8 -1,2 ± 0,6 <0,001†
Hämatokrit (%) 36,9 ± 4,6 33,7 ± 5,1 -3,2 ± 1,8 < 0,001† MCV (fl) 91 ± 6,1 91,3 ± 6,2 -------------- ----------- MCH (pg) 31,3 ± 2,4 31,1 ± 2,3 -------------- -----------
Thrombozyten (Zellen * 10³/ µl)
238,8 ± 82,5 163,9 ± 66,2 -74,9±50,6 < 0,001†
Lymphozyten (Zellen * 10³/µl)
1,1 ± 0,5 1,1 ± 0,5 -0,03 ± 0,2 0,377 ‡
Granulozyten (Zellen * 10³/µl)
4 ± 1,6 3,6 ± 1,5 -0,5 ± 1,3 < 0,001‡
Monozyten (Zellen * 10³/µl)
0,4 ± 0,3 0,3 ± 0,2 -0,1 ± 0,1 < 0,001‡
†= T-Test; ‡ = U-Test
Die Analyse der Elektrolytparameter Natrium, Kalium und Calcium zeigte bei den drei un-
tersuchten Parametern signifikante Veränderungen. Die Natriumkonzentration im Blut der Pati-
enten stieg von 138,7 ± 2,6 mmol/l vor der Apherese auf 141,1 ± 2,7 mmol/l nach der Apherese
(p<0,001). Die Kaliumkonzentration mit 3,9 ± 0,3 mmol/l und die Calciumkonzentration von
2,30 ± 0,1 mmol/l fielen während der Apherese auf Werte von 3,3 ± 0,3 mmol/l (p<0,001) und
2,28 ± 0,2 mmol/l (p=0,044).
Bei der Berechnung des Rekrutierungsfaktors für die einzelnen Blutzellkomponenten erfolg-
te zunächst eine graphische Darstellung in Form von Boxplots, um die unterschiedlichen Lage-
und Verteilungscharakteristika der einzelnen Zellreihen besser verdeutlichen zu können. Abbil-
dung 10 zeigt, dass mit einem durchschnittlich höheren Rekrutierungsfaktor auch gleichzeitig
ein größerer Interquartilsabstand als Streuungsmaß verbunden ist. Die geringste Streubreite
wurde bei den Erythrozyten und den Thrombozyten berechnet, die größte Streubreite bei den
Monozyten.
36
Abbildung 10: Zellrekrutierungsfaktoren bei Erstapherese (N=45)
Tabelle 4 zeigt zusätzlich eine genauere Darstellung der Rekrutierungsfaktoren. Es zeigte
sich, dass der Rekrutierungsfaktor der Lymphozyten mit 2,9 ± 0,6 am höchsten war. Der durch-
schnittliche Rekrutierungsfaktor der Monozyten lag mit 2,7 ± 0,7 zusätzlich über dem Durch-
schnitt der restlichen Blutzellbestandteile. Das Minimum von 1,5 und das Maximum des Mono-
zytenrekrutierungsfaktors von 4,5 zeigten eine große Spannweite zwischen den einzelnen Spen-
dern.
37
Tabelle 4: Zellrekrutierungsfaktoren während der Erstpherese
N=45 Mittelwert Minimum Maximum
Rekrutierungsfaktor Leukozyten 1,5 +/- 0,3 1,0 2,4
Rekrutierungsfaktor Erythrozyten 0,9 +/- 0,1 0,8 1,2
Rekrutierungsfaktor Thrombozyten 1,1 +/- 0,2 0,7 1,6
Rekrutierungsfaktor Lymphozyten 2,9 +/- 0,6 2,0 4,6
Rekrutierungsfaktor Granulozyten 1,1 +/- 0,5 0,6 3,3
Rekrutierungsfaktor Monozyten 2,7 +/- 0,7 1,5 4,5
4.2 Beschreibung der Daten zur Produktqualität bei Erstapherese
Die durchschnittliche Spendezeit betrug 290 ± 14 Minuten mit einem Minimum von 270
Minuten und einem Maximum von 323 Minuten. Innerhalb dieses Zeitraums wurde ein Blutvo-
lumen von 12892 ± 1380 ml aufgetrennt. Das totale Blutvolumen wurde 2,8 ± 0,5 Mal separiert.
Der Verbrauch von Natriumzitrat lag bei 1212 ± 206 ml. Es wurden 277,9 ± 22,4 ml Monozy-
tenkonzentrat und 134,6 ± 39,6 ml Plasma gesammelt.
4.2.1 Daten zur Geräteeinstellung der COBE Spectra
Aus einem durchschnittlichen Blutfluss von 49,7 ± 3,4 ml pro Minute und einem Trennfak-
tor von 415,3 ± 215,3 während der Monozytenapherese resultierte eine Drehzahl von 812 Um-
drehungen pro Minute. Die Plasmaflussrate betrug 22,7 ml pro Minute. Eine genauere Darstel-
lung der Geräteeinstellungen befindet sich in Tabelle 26 im Anhang.
4.2.2 Darstellung der Spendenergebnisse
Tabelle 5 stellt die berechneten Korrelationen zwischen dem Blutbild des Monozytenkon-
zentrats und das Blutbild der Patienten vor der Erstapherese dar. Die höchsten Korrelationskoef-
fizienten wurde bei der Lymphozytenkonzentration mit 0,775 (p<0,001) und bei der Monozy-
tenkonzentration mit 0,568 (p<0,001) berechnet. Bei der Betrachtung der Korrelationskoeffi-
zienten des Hämatokrits mit 0,291 (p=0,003) und des Koeffizienten der Thrombozytenkonzent-
ration mit 0,322 (p=0,001) zeigten sich nur niedrige positive Korrelationen.
38
Tabelle 5: Vergleich Blutbild vor Apherese und Konzentrat
N=98 Konzentrat Blutbild vor Apherese
Korrelations-koeffizient
Leukozyten
(Zellen * 10³/µl)
59 +/- 27,6 5,7 +/- 1,8 0,509 (p< 0,001) †
Erythrozyten
(Zellen * 106/µl)
0,4 +/- 0,2 4,1 +/- 0,6 0,355 (p< 0,001) †
Hämoglobin (g/dl) 0,9 +/- 0,7 12,7 +/- 1,7 0,127 (p= 0,209) †
Hämatokrit (%) 3,1 +/- 2,1 36,9 +/- 4,6 0,291 (p= 0,003) †
MCV (fl) 87,6 +/- 13,1 91 +/- 6,1 --------------
MCH (pg) 24,9 +/- 8,3 31,3 +/- 2,4 --------------
Thrombozyten
(Zellen *103/µl)
1464,5 +/- 1262,8
238,1 +/- 82,4 0,322 (p= 0,001) †
Lymphozyten
(Zellen * 103/µl)
35 +/- 11,7 1,1 +/- 0,5 0,775 (p< 0,001) †
Granulozyten
(Zellen *103/µl)
18,3 +/- 17,6 4 +/- 1,6 0,361 (p= 0,008) †
Monozyten
(Zellen *103/µl)
11,4 +/- 4,7 0,4 +/- 0,2 0,568 (p< 0,001) †
†= Korrelationskoeffizient nach Spearman; ‡= Korrelationskoeffizient nach Pearson
Bezüglich der Korrelationskoeffizienten konnte zwischen den Lymphozyten im Patientenblut
vor der Apherese und den Werten im Konzentrat mit 0,775 (p<0,001) der höchste Korrelations-
koeffizient berechnet werden. Bei den Monozyten wurde ein Koeffizient von 0,568 (p<0,001)
und bei den Granulozyten ein Koeffizient von 0,361 (p=0,017) erstellt.
Aus den Zellkonzentrationen im Monozytenkonzentrat wurde der jeweilige Zellgehalt im
Produkt und der der gesammelte Zellgehalt pro Minute berechnet. Der Monozytengehalt lag
dabei durchschnittlich bei 315,6 ± 135,8 * 107 Zellen im Konzentrat. Es wurden 1,1 ± 0,4 * 107
Monozyten pro Spendenminute gesammelt. Der Leukozytengehalt betrug 1600,3 ± 683,7 * 107
Zellen, das einem Leukozytengehalt von 3,3 ± 1,1 * 107 Zellen pro Minute entspricht. In Tabel-
le 6 werden die berechneten Zellgehalte dargestellt.
39
Tabelle 6: Zellgehalt im Konzentrat bei Erstapherese
Zellgehalt (N=53) Gehalt im Produkt
Leukozyten (Zellen * 107) 1600,3 ± 683,7
Erythrozyten (Zellen * 107) 10202 ± 6070,6
Thrombozyten (Zellen * 107) 38213 ± 30311,1
Lymphozyten Zellen * 107) 969,3 ± 318,9
Granulozyten (Zellen * 107) 538,9 ± 537,5
Monozyten (Zellen * 107) 315,6 ± 135,8
Die durchschnittliche Sammeleffizienz der Monozyten lag mit 77,1 ± 24,4 Prozent am
höchsten. Mit einem Minimum von 35,92 Prozent und einem Maximum von 154,05 Prozent
zeigte sich bei den Monozyten zusätzlich die größte Spannweite. Eine der niedrigsten Sammel-
effizienzen mit 17,1 ± 15,5 Prozent wurde bei den Thrombozyten berechnet. Alle Sammeleffizi-
enzen wurden in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: Sammeleffizienz bei Erstapherese
Sammeleffizienz (n=46) Mittelwert Minimum Maximum
Leukozyten (%) 23,6 ± 7,4 7,89 41,78
Thrombozyten (%) 17,1 ± 15,5 2,97 60,92
Granulozyten (%) 9,7 ± 8,8 0,31 33,36
Lymphozyten (%) 69,2 ± 12,8 41,03 108,39
Monozyten (%) 77,1 ± 24,4 35,92 154,05
4.3 Beschreibung der Nebenwirkungen
Zur besseren Vergleichbarkeit wurden nur die Nebenwirkungen der Erstapheresen ausge-
wertet. Bei Männern (N=11) und Frauen (N=18) traten am häufigsten Zitratreaktionen auf, wo-
bei der prozentuale Anteile mit 43,9 Prozent bei den Frauen wesentlich höher lag als bei den
Männern mit 18,6 Prozent. Ebenso kam es bei Frauen (N=7 bzw. 17,1 %) häufiger als bei Män-
nern (N=2 bzw. 3,4 %) zu Übelkeit als möglicher Hinweis auf eine vasovagale Reaktion. Bei
den Männern (N= 9 bzw. 15,3%) traten dagegen vermehrt Flussprobleme auf. Diese waren defi-
40
niert als Probleme, die nicht eindeutig zu den Kategorien „Paravasat“ oder „technische Proble-
me“ zuzuordnen waren. Bei den Männern (N=5 bzw. 8,5%) trat ebenfalls häufiger als bei den
Frauen (n=1 bzw. 2,4 %) ein Paravasat auf. Eine genaue Häufigkeitsdarstellung der Nebenwir-
kungen findet sich in Abbildung 11.
Abbildung 11: Nebenwirkungen während der Erstapherese (N=100)
41
4.4 Medikamente während der Erstapherese
Zur besseren Vergleichbarkeit beschränkte sich die Auswertung der verabreichten Medika-
mente auf die Erstapheresen.
4.4.1 Calcium-Gabe
Es wurde bei 58 Patienten (63%) eine orale oder eine intravenöse Calcium-Prophylaxe ver-
abreicht. 66 Personen (71,7%) erhielten Calcium oral als Brausetablette. 21 Patienten (22,8%)
bekamen nur eine Brausetablette mit 500 mg Calcium während der gesamten Apherese. Bei 27
Patienten (29,3%) wurden zwei Tabletten über die gesamte Spendezeit verabreicht und bei 14
Patienten (15,2%) wurden jeweils drei Tabletten substituiert. Drei Patienten (3,3%) erhielten
vier und nur ein Patient fünf Brausetabletten.
Neun Patienten (9,8%) erhielten eine Kombination aus intravenösem Calcium und Brause-
tabletten. 14 Patienten (15,2%) wurde dagegen nur intravenös Calcium verabreicht. Von den
insgesamt 23 Patienten (25%) mit intravenös verabreichtem Calcium bekamen 14 Patienten
(15,2%) zwei Ampullen und sechs Patienten (6,5%) vier Ampullen Calcium. In Ausnahmefällen
wurden drei Ampullen (zwei Patienten) und eine Ampulle (ein Patient) substituiert. Bei 12 Per-
sonen (13%) wurde keine Calcium-Substitution durchgeführt.
In allen Fällen wurde bezüglich der Volumensubstitution 0,9 prozentige Natriumchlorid-
Lösung verabreicht. Bei 19 Patienten (20,7%) wurden 500 ml substituiert und bei drei Patienten
(3,3%) 100 ml. Jeweils ein Patient erhielt 300 ml und einer 600 ml.
4.4.2 Andere Medikamente
Bei 19 Patienten (20,7%) wurden weitere Medikamente während der Erstapherese gegeben.
Am häufigsten wurde ein Antiemetikum (n=6 bzw. 6,5%) und ein Benzodiazepin (n=3 bzw.
3,3%) aufgrund von generalisierten epileptischen Anfällen verabreicht. Bei jeweils zwei Patien-
ten wurden Paracetamol, Ibuprofen, Magnesium oder Heparin eingesetzt. Atropin und Effortil
wurden bei nur einem Patienten verwendet.
42
4.5 Einflussfaktoren auf die Sammeleffizienz der Monozyten
In ungepaarten Vergleichen wurden mögliche Einflüsse des Geschlechts auf die Sammelef-
fizienz und die Blutwerte vor der Apherese untersucht. Bei der durchschnittlichen Leukozyten-
konzentration mit 5,4 ± 1,5 x 103 Zellen pro Mikroliter bei männlichen Patienten und 6,1 ± 2,1 x
103 Zellen pro Mikroliter bei weiblichen Patienten wurden keine statistisch signifikanten Unter-
schiede errechnet (p=0,121). Auch die Monozytenkonzentration unterschied sich nicht statis-
tisch signifikant (weiblich: 0,34 ± 0,1 x 103 Zellen pro Mikroliter; männlich: 0,37 ± 0,2 x 103
Zellen pro Mikroliter; p=0,375). Bezüglich der Sammeleffizienz der Monozyten wurden nur
geringe Unterschiede mit Werten von 77,3 ± 23,3 Prozent bei den Frauen und 77,0 ± 25,4 Pro-
zent bei den Männern dargestellt. Im T-Test konnten keine statistisch signifikanten Unterschie-
de aufgezeigt werden (p=0,955). In Abbildung 12 wurde die Verteilung der Sammeleffizienz
bei männlichen und weiblichen Patienten in Form von Boxplots dargestellt.
Abbildung 12: Sammeleffizienz bei weiblichen und männlichen Patienten
43
4.5.1 Korrelation der Sammeleffizienz mit allgemeinen Patientendaten
Hinsichtlich der allgemeinen patientenspezifischen Daten wurden die Einflüsse von Alter,
Body-Mass-Index, totalem Blutvolumen und der vor Apherese gemessenen Natrium-, Kalium-
und Calcium-Konzentration im Blut untersucht und ausgewertet.
Die Korrelationskoeffizienten der Sammeleffizienz mit Alter, BMI und dem totalen Blutvo-
lumen der Patienten sind in Tabelle 8 dargestellt. Alle berechneten Koeffizienten außer dem
Alters-Koeffizienten bei weiblichen Patienten zeigten nur schwach positive Zusammenhänge
und keine Korrelation zwischen der Sammeleffizienz der Monozyten und den ausgewählten
Variablen konnte als statistisch signifikant belegt werden.
Tabelle 8: Korrelation der Sammeleffizienz mit Alter, BMI und TBV
w: N=40
m: N=51
Alter (Jahre) BMI (kg/m 2) TBV (ml)
W M W m w M
Koeffizent - 0,019
p=0,908 †
0,003
p=0,985 ‡
0,016
p=0,703 ‡
0,176
p=0,217 †
0,091
p=0,578 ‡
0,055
p=0,696 ‡
w= weiblich, m= männlich; †= Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡= Korrelationskoeffi-
zient nach Spearman
Die Leukozytenkonzentrationen vor der Apherese wurden in den zuvor gebildeten Alters-
gruppen betrachtet, um mögliche Zusammenhänge zwischen der Monozyten-Sammeleffizienz
und dem Patientenalter genauer zu untersuchen. Die Altersgruppen 1 (<20 Jahre) und 2 (20-29
Jahre) mussten bei diesen Untersuchungen aufgrund der zu kleinen Gruppengrößen von n=2
und n=6 ausgeschlossen werden. Mit 6,3 ± 1,8 x 103 Zellen pro Mikroliter war die durchschnitt-
liche Leukozytenkonzentration in Gruppe 3 (30-39 Jahre) am höchsten. Die niedrigsten Werte
lagen in Gruppe 6 (60-69 Jahre) mit 5,0 ± 1,5 x 103 Zellen pro Mikroliter. In Gruppe 7 (> 69
Jahre) konnte im Vergleich zu Gruppe 6 eine höhere Leukozytenkonzentration von 5,8 ± 1,8 x
103 Zellen pro Mikroliter gemessen werden. Die berechneten Unterschiede erwiesen sich als
nicht statistisch signifikant (p=0,143). Abbildung 13 zeigt die Verteilung der Leukozytenkon-
zentrationen in den einzelnen Altersgruppen.
44
Abbildung 13: Leukozytenkonzentration vor Apherese in Altersgruppen
Die Sammeleffizienz der Monozyten variierte in den einzelnen Altersgruppen zwischen 73
und 79 Prozent. Es konnten keine signifikanten Unterschiede mittels T- und U-Test ermittelt
werden.
Neben der Korrelation der Monozyten-Sammeleffizienz mit dem Body-Mass-Index erfolgte
zusätzlich eine statistische Analyse mit den einzelnen BMI-Klassen. Die Gruppe mit Unterge-
wicht konnte aufgrund der niedrigen Fallzahl von n=2 nicht mit in die Untersuchungen einbezo-
gen werden. Die durchschnittliche Sammeleffizienz in der Gruppe mit Normalgewicht betrug
77,1 ± 25 Prozent. In der Gruppe mit Präadipositas wurden Werte von 77,4 ± 24,5 Prozent ge-
messen und in der Gruppe mit Adipositas 78,0 ± 25,3 Prozent. Die berechneten Unterschiede
erwiesen sich jedoch nicht als statistisch signifikant.
In Tabelle 9 sind die Korrelationskoeffizienten der Monozyten-Sammeleffizienz mit den
Serumwerten der Patienten von Natrium, Kalium und Calcium vor der Apherese dargestellt. Da
eine standardisierte Messung der oben genannten Elektrolytwerte erst ab August 2008 erfolgte,
konnten nur die Daten von 19 weiblichen und 23 männlichen Patienten ausgewertet werden.
45
Tabelle 9: Korrelation der Sammeleffizienz mit Elektrolyt-Werten
w: N=19
m: N=23
Natrium in mmol/l Kalium in mmol/l Calcium in mmol/ l
W m W m w M
Koeffizient -0,044
p=0,861‡
0,169
p=0,440†
-0,323
p=0,178 †
0,160
p=0,465‡
0,445
p=0,074†
0,613
p=0,003‡
w= weiblich, m= männlich; †=Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡=Korrelationskoeffizient
nach Spearman
Die Korrelationskoeffizienten der Sammeleffizienz mit Natrium und Kalium zeigten bei den
weiblichen Patienten jeweils schwach negative und bei den männlichen Patienten schwach posi-
tive Zusammenhänge. Es konnten keine statistisch signifikanten Ergebnisse für diese Korrelati-
onskoeffizienten ermittelt werden. Bei männlichen Patienten korrelierte die Sammeleffizienz
dagegen hochsignifikant mit den Calcium-Werten (r = 0,613; p = 0,003).
4.5.2 Melanomspezifische Patienten-Daten und Sammeleffizienz
Hinsichtlich der melanomspezifischen Daten wurden die möglichen Einflüsse Melanom-
Stadium, Tumormarker und Zeiträume zwischen Erstdiagnose oder Eintritt in Stadium IV bis
zur Apherese in Bezug auf die Monozyten-Sammeleffizienz untersucht. Die Stadien III b und III
c wurden in der Analyse zusammengefasst, da ihre Fallzahlen mit n=3 und n=5 einzeln zu ge-
ring waren. Im Stadium III und IV M1b wurden mit 80,2 ± 21,4 Prozent und 79,7 ± 25,0 Pro-
zent die höchsten Sammeleffizienzen gemessen. Für das Stadium IV M1a wurde die niedrigste
Sammeleffizienz mit 73,3 ± 24,7 Prozent ermittelt. Die Patienten mit dem am weitesten fortge-
schrittenen Tumorleiden im Stadium IV M1c hatten eine durchschnittliche Sammeleffizienz von
76,7 ± 25,6 Prozent. Es wurde keine statistisch relevante Signifikanz nachgewiesen.
Die Sammeleffizienz bei Patienten mit erhöhtem Protein S100 lag mit 79,8 ± 24,2 Prozent
über den berechneten Werten von Patienten mit normwertigem Protein S100 (74,0 ± 24,3 Pro-
zent). In Bezug auf LDH wurden höhere Sammeleffizienz-Werte mit normwertigem LDH bei
den Patienten gemessen. Die berechneten Mittelwerte und ihre Standardabweichungen sind in
Tabelle 10 dargestellt.
46
Tabelle 10: Einflüsse von Tumormarkern auf die Sammeleffizienz
Sammeleffizienz Protein S100 erhöht LDH erhöht
ja (N=38) nein (N=47) ja (N=23) nein (N=62)
Monozyten (%) 74,2 ± 24,3 79,8 ± 24,2 82,8 ± 23,3 75,2 ± 24,5
Signifikanz 0,273 ‡ 0,206 †
† = T-Test; ‡ = U-Test
Tabelle 11 fasst die berechneten Korrelationskoeffizienten zwischen Leukozyten- und Mono-
zytenkonzentration vor Apherese und den Zeiträumen zwischen Erstapherese und Erstdiagnose,
beziehungsweise Eintritt in Stadium IV zusammen. Die Koeffizienten der Leukozytenkonzent-
ration vor der Apherese zeigten schwach positive Korrelationen, die sich als nicht statistisch
signifikant erwiesen. Die Korrelationskoeffizienten der Monozytenkonzentration konnten eben-
falls nicht als statistisch signifikant belegt werden.
Tabelle 11: Korrelation Zellkonzentrationen vor Apherese
w: N=34 m: N=51
Zeitraum zwischen Erstdiagnose Melanom und Apherese in Mona-
ten
Zeitraum zwischen Eintritt in Stadium IV und Apherese
in Monaten w M w M
Korrelationskoeffi-zient Leukozyten (Zellen x 103/µl)
0,069 p=0,685 ‡
0,142 p=0,302 ‡
0,027 p=0,881 ‡
0,026 p=0,859 ‡
Korrelationskoeffi-zient Monozyten (Zellenx 103/µl)
0,233 p=0,165 ‡
-0,048 p=0,724 ‡
0,290 p=0,096 ‡
-0,152 p=0,277 ‡
w= weiblich, m= männlich; †=Korrelationskoeffizient nach Pearson;
‡=Korrelationskoeffizient nach Spearman
47
4.5.3 Vorbehandlungen der Patienten und Einfluss auf die Sammeleffizienz
Die beiden Therapieverfahren Chemotherapie und Bestrahlung wurden als Vorbehandlun-
gen ausgewählt. Es erfolgte die Einteilung, ob die Therapie einen Monat oder innerhalb eines
halben Jahres vor der Apherese stattfand. Die Zielvariablen waren die Präwerte der Leukozyten-
und der Monozytenkonzentration im Patientenblut. Anschließend wurden Korrelationskoeffi-
zienten der Zellkonzentrationen mit der Sammeleffizienz der Leukozyten und der Monozyten
erstellt.
In Tabelle 12 sind die berechneten Mittelwerte mit Standardabweichungen und Signifikan-
zen der Leukozyten- und Monozytenkonzentration in Abhängigkeit von einer Chemotherapie
einen Monat vor Apherese dargestellt. Zusätzlich wurde bei den Analysen zwischen männlichen
und weiblichen Patienten unterschieden. Die Korrelationskoeffizienten zwischen der Zellkon-
zentration im Blut und der jeweiligen Sammeleffizienz befinden sich am Ende dieses Kapitels.
Tabelle 12: Zellkonzentrationen in Abhängigkeit von Chemotherapie
Chemotherapie einen Monat vor Apherese
P Ja Nein
Leukozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese
W 5,4 ± 2,5 (N=10) 6,3 ± 2,0 (N=30) 0, 560 §
M 5,9 ± 1,6 (N=14) 5,2 ± 1,4 (N=43)
Monozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese
W 0,30 ± 0,1 (N=10) 0,35 ± 0,1 (N=30) 0,291 †
M 0,32 ± 0,1 (N=14) 0,38 ± 0,2 (N=43) 0,932 ‡
†= T-Test, ‡= U-Test, §= ANOVA
In den oben dargestellten Analysen zeigte sich, dass bei den weiblichen Patienten durch-
schnittlich höhere Leukozytenkonzentrationen vor der Apherese gemessen wurden, wenn vorher
keine Chemotherapie durchgeführt wurde. Männliche Patienten wiesen dagegen höhere Leuko-
zytenkonzentrationen auf, wenn sie einen Monat vor Apherese eine Chemotherapie hatten. Ab-
bildung 14 zeigt dieses entgegengesetzte Verhalten, eine sogenannte disordinale Interaktion,
zwischen Geschlecht und Chemotherapie einen Monat vor Apherese in Bezug auf die Leukozy-
tenkonzentration. In der Varianzanalyse zur Leukozytenkonzentration wurde für diese Interakti-
on eine grenzwertige Signifikanz (p=0,054) ermittelt. Bei der Analyse der Monozytenkonzent-
ration wurden bei weiblichen und männlichen Patienten höhere Konzentrationen gemessen,
48
wenn keine Chemotherapie durchgeführt wurde. Keiner dieser Unterschiede war statistisch sig-
nifikant.
Abbildung 14: Leukozytenkonzentration in Abhängigkeit einer Chemotherapie
Ein analoges Vorgehen erfolgte bei den Analysen, bei denen die Patienten innerhalb eines
halben Jahres vor Apherese einer Chemotherapie bekamen. Auch hier zeigten sich mit einer
geringeren Differenz durchschnittlich höhere, nicht signifikante Leukozytenkonzentrationen bei
weiblichen Patienten ohne Chemotherapie und bei männlichen Patienten mit Chemotherapie.
Die Wechselwirkung zwischen Geschlecht und Chemotherapie erwies sich ebenfalls als nicht
signifikant (p=0,299). Auch bezüglich der Wirkung einer Chemotherapie innerhalb eines halben
Jahres vor Apherese auf die Monozytenkonzentration konnten nur begrenzte, nicht signifikante
Unterschiede festgestellt werden (p=0,309, p=0,636). Die Monozytenkonzentration unterschied
sich hier nur, wenn vor der Apherese eine Chemotherapie durchgeführt wurde. Männliche und
weibliche Patienten ohne Chemotherapie wiesen nahezu gleiche Monozytenkonzentrationen
auf.
49
Tabelle 13: Einflüsse von Chemotherapie auf Zellkonzentrationen
Chemotherapie innerhalb eines halben Jahres vor der Apherese
P Ja Nein
Leukozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese
w 5,8 ± 2,2 (N=22) 6,4 ± 2,1 (N=18) 0,438 §
m 5,4 ± 1,6 (N=31) 5,3 ± 1,3 (N=26)
Monozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese
w 0,32 ± 0,1 (N=22) 0,36 ± 1,5 (N=18) 0,309 †
m 0,39 ± 0,2 (N=33) 0,36 ± 0,1 (N=26) 0,636 ‡
†= T-Test, ‡= U-Test, §= ANOVA
Im gesamten Patientenkollektiv von 100 Patienten litten 16 Patienten an einer Leukopenie
(<4,0 x 103 Zellen pro Mikroliter) vor der Apherese. 81,2 Prozent dieser Patienten hatten inner-
halb eines halben Jahres eine Chemotherapie vor der Apherese. Eine Chemotherapie ohne Leu-
kopenie wurde nur bei 49,4 Prozent von insgesamt 81 Patienten dokumentiert (p=0,039). Patien-
ten, die ihre Apherese unter einer Leukopenie hatten, wiesen mit 86,1 ± 24 Prozent eine deutlich
höhere Monozyten-Sammeleffizienz auf als Patienten ohne Leukopenie mit 76,0 ± 24,1 Prozent.
Es konnte keine statistische Signifikanz hierfür ermittelt werden (p= 0,142).
Es konnten aufgrund von zu kleiner Gruppengrößen keine Analysen über mögliche Einflüsse
einer Bestrahlung vor der Erstapherese bei weiblichen Patienten berechnet werden. Die Bestrah-
lung einen Monat vor Apherese hatte bei männlichen Patienten keinen statistisch signifikanten
Effekt auf die Zellkonzentrationen im Blut und lieferte ähnliche Leukozyten- und Monozyten-
konzentrationen bei Patienten mit und ohne Bestrahlung.
Die Konzentrationen der Leukozyten und der Monozyten bei männlichen Patienten mit einer
Bestrahlung waren ebenfalls nur geringfügig und nicht statistisch signifikant niedriger, wenn die
Bestrahlung innerhalb eines halben Jahres stattgefunden hatte (p=0,528, p=0,222). Die durch-
schnittliche Monozyten-Sammeleffizienz lag jedoch mit 72,1 ± 19,6 Prozent signifikant niedri-
ger im Vergleich zu 85,6 ± 29,2 Prozent, wenn vor der Apherese keine Bestrahlung stattgefun-
den hatte (p=0,047). Bezüglich des Rekrutierungsfaktors der Monozyten konnten keine signifi-
kanten Unterschiede als mögliche Erklärung für höhere Sammeleffizienz nachgewiesen werden
(Tabelle 14). In Abbildung 29 im Anhang befindet sich eine graphische Darstellung der oben
beschriebenen Zusammenhänge.
50
Tabelle 14: Einflüsse von Bestrahlung auf Zellkonzentrationen vor Apherese
Bestrahlung einen Monat vor Apherese
p Ja (N=7) Nein(N=48)
Leukozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese m 5,2 ± 1,2 5,3 ± 1,6 0,969 ‡
Monozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese m 0,37 ± 0,1 0,37 ± 0,1 0,661 †
Sammeleffizienz Monozyten in % m 84,7 ± 38,1 74,6 ± 20,2 0,472 †
Rekrutierungsfaktor Monozyten m 2,8 ± 0,8 2,6 ± 0,7 0,376 ‡
Bestrahlung innerhalb eines halben Jahres vor
Apherese
Ja (N=15)
Nein (N=40)
Leukozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese m 5,1 ± 1,4 5,4 ± 1,6 0,528 †
Monozyten in Zellen x 103 /µl vor Apherese m 0,34 ± 0,1 0,38 ± 0,1 0,222 †
Sammeleffizienz Monozyten in % m 85,6 ± 29,2 72,1 ± 19,6 0,047 †
Rekrutierungsfaktor Monozyten m 2,8 ± 0,6 2,5 ± 0,7 0,170 ‡
m = männlich, † = T-Test, ‡ = U-Test, § = ANOVA
Die berechneten Korrelationskoeffizienten zwischen dem Präwert der Leukozytenkonzent-
ration und der Leukozyten-Sammeleffizienz erwiesen sich als gering negativ und nicht statis-
tisch signifikant (Tabelle 15). Die Monozyten-Sammeleffizienz als eine der ausgewählten Ziel-
variablen korrelierte invers bei weiblichen Patienten mit -0,386 und bei männlichen Patienten
mit -0,449 mit dem Präwert der Monozytenkonzentration, wobei diese Korrelation statistisch
signifikant war (p=0,014, p=0,001).
51
Tabelle 15: Korrelation mit Zellkonzentration vor Apherese und Sammeleffizienz
w: N= 40
m: N= 53
Leukozyten Monozyten
w M w M
Korrelations-koeffizient
-0,114 p=0,479 †
-0,104 p=0,446 ‡
- 0,386 p=0,014 †
- 0,449 p=0,001 ‡
w= weiblich, m= männlich; †=Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡=Korrelationskoeffizient
nach Spearman
4.5.4 Einflüsse von apheresespezifischen Daten auf die Sammeleffizienz
Als Auswahl an apheresespezifischen Daten wurden das separierte Blutvolumen, die Anzahl
der separierten TBVs, der Trennfaktor, Zitratreaktionen und die Anzahl der Apheresen ausge-
wählt.
Die Koeffizienten der Monozyten-Sammeleffizienz mit dem separierten Blutvolumen und
der Anzahl der separierten TBVs zeigten bei den weiblichen Patienten negative Korrelationen
und bei den männlichen Patienten leicht positive Zusammenhänge (Tabelle 16).
Tabelle 16 : Korrelation der Monozyten-Sammeleffizienz mit Apheresedaten
Separiertes Blutvolumen Anzahl TBV
W M w M
Korrelations-koeffizient
- 0,226 p=0,160 ‡
0,022 p=0,874 ‡
- 0,158 p=0,329 †
0,014 p=0,924 ‡
w= weiblich, m= männlich; †=Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡=Korrelationskoeffizient
nach Spearman
Es wurden zwei Subgruppen bezüglich des Trennfaktors gebildet, wobei ein höherer Trenn-
faktor (N=30) mit 85,7 ± 20,9 Prozent zu einer signifikant höheren Sammeleffizienz führte im
Vergleich zum niedrigeren Trennfaktor (N=54) mit 74,5 ± 26,0 Prozent (p=0,008, Abbildung
15). Bei höherem Trennfaktor zeigte sich außerdem eine geringere Streuung der Ergebnisse.
Drei Patienten erhielten Apheresen mit anderen Trennfaktoren.
52
Abbildung 15: Monozyten-Sammeleffizienz in Abhängigkeit vom Trennfaktor
Es wurden keine Unterschiede bei dem totalen Blutvolumen berechnet (Trennfaktor 250:
4799,2 ± 823,2 ml; Trennfaktor 700: 4800,4 ± 1115,7 ml; p=0,996). Bei der Menge an ver-
brauchtem Natriumzitrat dagegen konnten signifikante Unterschiede nachgewiesen werden: In
der Gruppe mit dem Trennfaktor 250 (N=57) wurden durchschnittlich 1234,8 ± 206,3 ml Natri-
umzitrat verbraucht. Bei der Gruppe mit dem Trennfaktor 700 (N=33) konnte dagegen mit
1144,5 ± 156,6 ml ein deutlich niedrigerer Verbrauch berechnet werden (p=0,035). Bei einer
Apherese mit dem Trennfaktor 700 wurde außerdem nur bei 18,1 Prozent (6 Patienten) eine
Zitratreaktion nachgewiesen im Gegensatz zu 33,3 Prozent (19 Personen) bei Apheresen mit
dem Trennfaktor 250. Eine statistische Signifikanz konnte hierzu nicht nachgewiesen werden
(p=0,193).
In den Untersuchungen bezüglich der Auswirkungen von Zitratreaktionen auf die Monozy-
ten-Sammeleffizienz zeigte sich, dass Patienten mit einer Zitratreaktion niedrigere Sammeleffi-
zienz-Werte aufwiesen als Patienten ohne Zitratreaktion. Bei den männlichen Patienten wurde
eine Abnahme der Sammeleffizienz von 78,7 ± 25,7 Prozent ohne Zitratreaktion (N=42) auf
70,3 ± 23,9 Prozent mit Zitratreaktion (N=11) berechnet (p= 0,174). Die Sammeleffizienz bei
53
weiblichen Patienten betrug durchschnittlich 78,0 ± 27,7 Prozent ohne Zitratreaktion (N=18)
und 76,3 ± 17,2 Prozent mit Zitratreaktion (N=22; p=0,817).
Zusätzlich wurde die Variable Blutflussänderung mit in die Untersuchungen einbezogen
unter der Annahme, dass die Zitratreaktion dann besonders schwer gewesen sei, wenn eine Blut-
flussreduzierung während der Apherese erfolgte. Bei Patienten mit einer Zitratreaktion und ei-
ner Blutflussänderung (N=7) konnte eine Monozyten-Sammeleffizienz von 76,7 ± 20,6 Prozent
berechnet werden. Patienten ohne Zitratreaktion und ohne Blutflussänderung wiesen dagegen
eine durchschnittlich höhere Sammeleffizienz von 80,0 ± 26,0 Prozent auf (p=0,735).
4.6 Untersuchungen zum Monozytengehalt im Apheresat
Es wurde ein durchschnittlicher Monozytengehalt von 2,8 ± 1,1 x 109 Zellen im Monozy-
tenkonzentrat weiblicher Patienten (N=41) berechnet. Bei männlichen Patienten (N=58) lag der
Zellgehalt mit 3,4 ± 1,5 x 109 Zellen deutlich höher (p=0,044).
4.6.1 Einflüsse von Patientendaten auf den Monozytengehalt
Der Monozytengehalt korrelierte nur gering und nicht statistisch signifikant mit Alter, BMI
und TBV. Als einzige Ausnahme korrelierte der Monozytengehalt mit dem totalen Blutvolumen
bei weiblichen Patienten (r=0,32; p=0,041). Eine Tabelle mit den berechneten Koeffizienten
befindet sich im Anhang (Tabelle 27).
Die Korrelationskoeffizienten des Monozytengehalts mit der Natrium-, Kalium- und Calci-
um-Konzentrationen im Patientenblut vor der Apherese zeigten nur geringe, nicht statistisch
signifikante Zusammenhänge. Im Gegensatz zur Sammeleffizienz konnte auch kein signifikan-
tes Ergebnis zwischen Monozytengehalt und Calcium-Konzentration bei männlichen Patienten
erzielt werden (r=0,248, p=0,255).
Die Korrelationskoeffizienten des Leukozyten-, Thrombozyten-, Lymphozyten- und des
Monozytengehalts mit ihren jeweiligen Zellkonzentrationen im Patientenblut vor der Apherese
sind in Tabelle 17 dargestellt.
54
Tabelle 17: Korrelation der Zellgehalte mit Zellkonzentrationen vor Apherese
w: N=40
m: N=54
Korrelationskoeffizient
w M
Leukozyten 0,576 (p<0,001) † 0,566 (p<0,001) ‡
Thrombozyten 0,502 (p=0,001) ‡ 0,234 (p=0,077) ‡
Lymphozyten 0,823 (p<0,001) † 0,792 (p<0,001) †
Monozyten 0,589 (p<0,001) † 0,615 (p<0,001) ‡
w=weiblich, m=männlich; †= Korrelationskoeffizient nach Pearson, ‡=Korrelationskoeffizient
nach Spearman
Die Korrelationskoeffizienten zeigten meist hochsignifikante Zusammenhänge zwischen der
Zellkonzentration vor Apherese und dem Zellgehalt im Produkt. Nur die Korrelation zwischen
dem Thrombozytengehalt und der Thrombozytenkonzentration bei männlichen Patienten erwies
sich nur als niedrig positiv und nicht signifikant. Bei weiblichen Patienten dagegen konnte ein
hochsignifikanter Koeffizient von 0,502 (p=0,001) berechnet werden. Die höchsten Werte konn-
ten mit 0,823 (p<0,001) bei weiblichen Patienten und mit 0,792 (p<0,001) bei männlichen Pati-
enten zwischen dem Lymphozytengehalt und der Lymphozytenkonzentration vor Apherese
ermittelt werden. Bezüglich des Monozytengehalts und der Monozytenkonzentration konnten
ebenfalls gute Korrelationen bei weiblichen (r=0,589, p=<0,001) und männlichen Patienten
(r=0,615, p<0,001) bestimmt werden (Abbildung 16). Die Korrelationskoeffizienten des Leuko-
zytengehalts mit der Leukozytenkonzentration vor Apherese sowohl bei weiblichen Patienten
mit 0,576 (p<0,001), als auch bei männlichen Patienten mit 0,566 (p<0,001), zeigten ebenfalls
hochsignifikante Zusammenhänge.
55
Abbildung 16: Monozytengehalt und Monozytenkonzentration vor Apherese
4.6.2 Einflüsse von melanomspezifischen Patienten-Daten auf den Monozytengehalt
In einer univariaten Varianzanalyse wurden die Einflüsse von Geschlecht und einer LDH-
Erhöhung auf den Monozytengehalt im Produkt untersucht. Weibliche Patienten ohne eine Er-
höhung der LDH (N=37) wiesen hierbei mit 2,8 ± 1,0 x 109 Zellen einen durchschnittlich höhe-
ren Monozytengehalt im Produkt auf als Patientinnen mit LDH-Erhöhung (N=14; 2,5 ± 1,6 x
109 Zellen). Bei männlichen Patienten konnte im Gegensatz dazu mit 4,4 ± 1,6 x 109 Zellen mit
LDH-Erhöhung (N=16) und 2,8 ± 1,0 x 109 Zellen ohne Erhöhung (N=52) ein noch deutlicherer
Unterschied berechnet werden. Die Variable Geschlecht (p<0,001) und die Interaktion Ge-
schlecht mit LDH-Erhöhung (p=0,003) konnten als statistisch signifikant belegt werden. Abbil-
dung 17 zeigt, dass die Wirkung einer LDH-Erhöhung vom Geschlecht abhängt: Patienten ohne
eine Erhöhung der LDH zeigten keine geschlechtsspezifischen Unterschiede bezüglich des
Monozytengehalts.
56
Abbildung 17: Monozytengehalt in Abhängigkeit von LDH und Geschlecht
4.6.3 Einflüsse von apheresespezifischen Daten auf den Monozytengehalt
Die Daten des Monozytengehalts mit dem separierten Blutvolumen und der Anzahl der se-
parierten TBVs korrelierten nur geringfügig und erwiesen sich als nicht statistisch signifikant.
Bei den Untersuchungen bezüglich der Wirkung des Trennfaktors auf den Monozytengehalt
konnten nahezu keine Unterschiede im Gegensatz zur Monozyten-Sammeleffizienz gefunden
werden. In Gruppe 1 mit einem Trennfaktor von 250 (N=70) wurde im Mittel ein Monozyten-
gehalt von 3,0 ± 1,5 x 109 Zellen gemessen und in Gruppe 2 mit einem Trennfaktor von 700
(N=37) ein Gehalt von 3,1 ± 1,0 x 109 Zellen (p=0,826).
In den Analysen über mögliche Auswirkungen einer Zitratreaktion auf den Monozytengehalt
konnten keine signifikanten Ergebnisse für eine Abhängigkeit des Monozytengehalts von der
Zitratreaktion (p=0,632) nachgewiesen werden. Die Wechselwirkungen zwischen dem Ge-
schlecht des Patienten und einer Zitratreaktion konnten jedoch als statistisch signifikant belegt
werden (p=0,038). Hierbei zeigte sich, dass männliche Patienten mit einer Zitratreaktion wäh-
57
rend der Apherese einen niedrigeren Monozytengehalt (2,7 ± 0,8 x 109 Zellen) aufwiesen als
ohne eine Zitratreaktion (3,4 ± 1,5 x 109 Zellen). Bei weiblichen Patienten konnte dagegen ein
höherer Monozytengehalt gemessen werden, wenn während der Apherese eine Zitratreaktion
auftrat (3,0 ± 1,2 x 109 Zellen, 2,6 ± 1,2 x 109 Zellen). Insgesamt konnten größere geschlechts-
spezifische Unterschiede nachgewiesen werden, wenn keine Zitratreaktion während der Aphere-
se auftrat (Abbildung 18).
Abbildung 18: Auswirkungen einer Zitratreaktion auf den Monozytengehalt
Der Monozytengehalt wurde zusätzlich mengenmäßig in Untergruppen aufgeteilt, um fest-
zustellen, wie viele Männer und Frauen den Zielbereich bei einer Leukozytapherese mit über 3
x 109 Zellen erreichten (Abbildung 19). Es zeigte sich, dass mit 32 Personen im Vergleich zu 19
und 7 Patienten die meisten männlichen Personen diesen Zielbereich erreichten. Bei den Frauen
lagen mit jeweils 16 Patienten genauso viele Frauen im Zielbereich mit 2-3 x 109 Monozyten
wie knapp unter dem Zielbereich. Außerdem wurde in diesen Gruppen die Häufigkeit von Zi-
tratreaktionen untersucht. In Gruppe 1 mit einem Monozytengehalt von weniger als 2 x 109 Zel-
len traten bei fün von insgesamt 16 Patienten (31,2 Prozent) Zitratreaktionen auf. Bei Gruppe 2
58
(2-3 x 109 Zellen) wurden bei 12 von 35 Patienten (34,3 Prozent) Zitratreaktionen dokumentiert.
In Gruppe 3, die mit über 3 x 109 Zellen den eigentlichen Zielbereich einer Leukozytapherese
am besten traf, trat dagegen bei nur 25 Prozent aller Patienten (12 von insgesamt 48 Patienten)
eine Zitratreaktion auf.
Abbildung 19: Monozytengehalt
59
4.7 Einflussfaktoren auf den Monozyten-Rekrutierungsfaktor
Der Monozyten-Rekrutierungsfaktor betrug bei weiblichen Patienten 2,9 ± 0,7 und bei
männlichen Patienten 2,6 ± 0,7. Diese Werte unterschieden sich nicht statistisch signifikant
(p=0,070).
4.7.1 Allgemeine Patientendaten und der Monozyten-Rekrutierungsfaktor
Die Korrelationskoeffizienten zwischen dem Alter der Patienten und dem Monozyten-
Rekrutierungsfaktor wiesen sowohl bei weiblichen Personen (N=38) mit -0,075, als auch bei
männlichen Personen (N=53) mit -0,006, nur niedrige Korrelationen auf, für die keine statisti-
sche Signifikanz berechnet werden konnte (p=0,655 bzw. p=0,968). In Bezug auf den BMI und
den Monozyten-Rekrutierungsfaktor konnten ebenfalls keine statistisch signifikanten Ergebnis-
se bei weiblichen (r=-0,117; p=0,486) und männlichen Patienten (r=0,038; p=0,792) dargestellt
werden. Bei männlichen Patienten konnte im Gegensatz zu weiblichen Patienten (r=0,083,
p=0,620) ein negativer Zusammenhang mit einem Korrelationskoeffizient von -0,357 (p=0,009)
zwischen dem TBV und dem Rekrutierungsfaktor festgestellt werden (Abbildung 20).
Abbildung 20: Rekrutierungsfaktor und TBV in ml bei männlichen Patienten (N=53)
60
Zusätzlich wurde der Monozyten-Rekrutierungsfaktor auf mögliche Unterschiede in einzel-
nen Altersgruppen getestet. Die Altersgruppen 1 mit Patienten jünger als 20 Jahre (N=2) und 2
mit Patienten zwischen 20 und 29 Jahren (N=6) konnten wegen zu kleiner Gruppengrößen nicht
mit eingeschlossen werden. Die durchschnittlich niedrigsten Monozyten-Rekrutierungsfaktoren
wurden in Gruppe 5 (50-59 Jahre; N=21) mit 2,5 ± 0,8 und in Gruppe 3 (30-39 Jahre; N=14) mit
2,6 ± 0,5 berechnet. Gruppe 4 (40-49 Jahre; N=15) mit 2,8 ± 0,7 und Gruppe 7 (>69 Jahre;
N=13) mit 2,8 ± 0,7 wiesen die höchsten Monozyten-Rekrutierungsfaktoren auf. Gruppe 6 (60-
69 Jahre; N=22) lag mit einem durchschnittlichen Rekrutierungsfaktor von 2,7 ± 0,8 im mittle-
ren Bereich. Diese Subgruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander.
4.7.2 Melanomspezifische Patienten-Daten und der Rekrutierungsfaktor
In den Analysen zum Tumorstadium und dem Monozyten-Rekrutierungsfaktor wurden Sta-
dium III b (N=3) und III c (N=5) zusammengefasst. Für beide Stadien wurde ein durchschnittli-
cher Monozyten-Rekrutierungsfaktor von 2,6 ± 0,4 berechnet. Ähnliche Werte wurden für das
Stadium IV M1c mit 2,6 ± 0,6 bestimmt. In Stadium IV M1b wurden die durchschnittlich
höchsten Monozyten-Rekrutierungsfaktoren mit 2,9 ± 0,8 erzielt. Der Monozyten-
Rekrutierungsfaktor in Stadium IV M1a betrug 2,7 ± 1,0, wobei die Unterschiede zwischen
beiden Gruppen nicht signifikant waren.
4.7.3 Vorbehandlungen der Patienten und der Rekrutierungsfaktor
Die ermittelten Werte des Monozyten-Rekrutierungsfaktors von männlichen und weiblichen
Patienten mit und ohne Chemotherapie befinden sich in Tabelle 18. Die Auswirkungen einer
Chemotherapie auf die Leukozyten- und die Monozytenkonzentration im Blut der Patienten
wurden bereits im Kapitel 4.5 untersucht. Hierbei konnten keine signifikanten Unterschiede
nachgewiesen werden.
61
Tabelle 18: Auswirkungen auf den Rekrutierungsfaktor durch Chemotherapie
Chemotherapie einen Monat vor Apherese
p Ja
w: N=9
m:N=13
Nein
w: N=28
m: N=40
Rekrutierungsfaktor Monozyten w 3,0 ± 1,0 2,8 ± 0,6 0,638 ‡
m 2,9 ± 0,8 2,5 ± 0,6 0,037 †
Chemotherapie innerhalb eines halben Jahres vor
Apherese
Ja
w: N=20
m:N=28
Nein
w:N=17
m:N=25
Rekrutierungsfaktor Monozyten w 2,9 ± 0,8 2,9 ± 0,7 0,887 †
m 2,7 ± 0,8 2,6 ± 0,6 0,680 †
w = weiblich, m = männlich, † = T-Test, ‡ = U-Test, § = ANOVA
Bei männlichen Patienten mit einer Chemotherapie einen Monat vor Apherese wurde ein
höherer Monozyten-Rekrutierungsfaktor von 2,9 ± 0,8 gemessen im Vergleich zu männlichen
Patienten ohne Chemotherapie mit 2,5 ± 0,6 (p=0,037). In Abschnitt 4.5.3 wurde bereits darge-
stellt, dass sich die Leukozyten- und die Monozytenkonzentrationen im Patientenblut vor der
Apherese nicht signifikant unterschieden. Bei weiblichen Patienten konnten diese Ergebnisse
nicht bestätigt werden.
In Abschnitt 4.5.3 wurde ebenfalls bereits dargestellt, dass keine statistisch signifikanten Un-
terschiede bezüglich des Monozyten-Rekrutierungsfaktors durch eine Bestrahlung vor der
Apherese nachgewiesen werden konnten.
Patienten mit einer Leukopenie von unter 4,0 x 103 pro Mikroliter vor der Apherese (N=14)
wiesen zudem keinen statistisch signifikant unterschiedlichen Rekrutierungsfaktor (2,7 ± 0,6 vs.
2,7 ± 0,7; p=0,860) auf als Patienten ohne eine Leukopenie (N=77).
4.7.4 Der Einfluss von apheresespezifischen Daten auf die Sammeleffizienz
Die Korrelationskoeffizienten zwischen dem Monozyten-Rekrutierungsfaktor und dem se-
parierten Blutvolumen erwiesen sich nicht als statistisch signifikant (Tabelle 19). Der zwischen
dem Rekrutierungsfaktor und der Anzahl der separierten TBVs berechnete Koeffizient zeigte
62
bei männlichen Patienten mit 0,337 positiv lineare Zusammenhänge (p=0,015), was eine Zu-
nahme des Monozyten-Rekrutierungsfaktors mit steigender Anzahl von TBVs bedeutet.
Tabelle 19: Korrelation des Rekrutierungsfaktors mit Apheresedaten
w:N=38
m:N=52
Separiertes Blutvolumen Anzahl TBV
W m w m
Korrelationskoeffizient
Monozyten
-0,099
p=0,554 ‡
0,010
p=0,942 ‡
0,002
p=0,992 †
0,337
p=0,015 †
w= weiblich, m= männlich; †=Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡=Korrelationskoeffizient nach
Spearman
4.8 Ergebnisse bei Patienten mit zwei Apheresen
Um Unterschiede bei Patienten mit mehreren Apheresen zu ermitteln, konnten 35 Patienten
ausgewählt werden, bei denen die ersten beiden Apheresen in der vorgegebenen Spendezeit
durchgeführt wurden. Vor der ersten Apherese betrug die durchschnittliche Leukozytenkonzent-
ration im Blut der Patienten 5,5 ± 1,8 x 103 Zellen und unterschied sich mit 5,5 ± 1,4 x 103 Zel-
len nicht von der Leukozytenkonzentration vor der zweiten Apherese (p=0,868). Auch bei der
Monozytenkonzentration, die 0,3 ± 0,1 x 103 Zellen vor der ersten Apherese und 0,3 ± 0,1 x 103
Zellen vor der zweiten Apherese betrug, konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede
ermittelt werden (p=0,771).
Die Sammeleffizienz der Monozyten wurde mit 81,7 ± 33,9 Prozent bei der ersten Apherese
nur gering niedriger berechnet im Vergleich zur zweiten Apherese mit 84,5 ± 41,8 Prozent
(p=0,806). Abbildung 21 zeigt in Form von Boxplots die Monozyten-Sammeleffizienz bei bei-
den Apheresen.
63
Abbildung 21: Monozyten-Sammeleffizienz bei erster und zweiter Apherese (N=35)
Bezüglich des Monozytengehalts konnten ebenfalls nur geringfügige Unterschiede ermittelt
werden. Während der ersten Apherese wurde ein Monozytengehalt von 2,8 ± 1,0 x 109 Zellen
gesammelt. Der Monozytengehalt der zweiten Apherese lag mit 3,0 ± 1,2 x 109 Zellen nur we-
nig über dem Wert der ersten Apherese. Es konnte keine statistische Signifikanz hierfür berech-
net werden (p=0,219). Abbildung 22 zeigt, dass in Bezug auf den Median mit 2,6 x 109 Zellen
bei der ersten Apherese und 2,9 x 109 Zellen bei der zweiten Apherese größere Unterschiede
bestanden als bei der Berechnung des Mittelwertes.
64
Abbildung 22: Monozytengehalt bei erster und zweiter Apherese (N=35)
Ähnlich wie bei der Monozyten-Sammeleffizienz und dem Monozytengehalt konnten auch
für den Rekrutierungsfaktor der Monozyten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwi-
schen erster und zweiter Apherese ermittelt werden. Der durchschnittliche Monozyten-
Rekrutierungsfaktor während der ersten Apherese betrug 3,1 ± 1,5. Bei der zweiten Apherese
wurde ein Rekrutierungsfaktor von 3,4 ± 2,4 berechnet (p=0,413), der damit nur wenig höher im
Vergleich zur ersten Apherese lag. Abbildung 23 zeigt, dass Streubreite und Median während
erster und zweiter ähnlich Apherese ähnlich verteilt lagen.
65
Abbildung 23: Rekrutierungsfaktor bei erster und zweiter Apherese (N=35)
Bei der Betrachtung der Nebenwirkungen während erster und zweiter Apherese fiel auf, dass
bei vielen Kategorien die Häufigkeit des Auftretens während der zweiten Apherese im Ver-
gleich zur ersten abnahm (Tabelle 20). Während bei sechs Patienten (17,1 Prozent) Flussprob-
leme in ihrer Erstapherese auftraten, wurden während der zweiten Apherese nur bei zwei Patien-
ten (5,7 Prozent) Flussprobleme dokumentiert. Ebenso verringerte sich die Anzahl der Patienten
mit Paravasat von drei Patienten (8,6 Prozent) bei der ersten Apherese auf einen Patienten (2,9
Prozent) bei der zweiten Apherese. Bei den Kategorien „Übelkeit“, „Erbrechen“ und „Kreis-
laufbeschwerden“ konnte ebenfalls ein geringeres Auftreten festgestellt werden. Technische
Probleme und ein Spendenabbruch traten weder bei der ersten noch bei der zweiten Apherese
auf. Bezüglich der Zitratreaktion, die als häufigste Nebenwirkung auftrat, konnte nur eine ge-
ringe Abnahme beobachtet werden. Während der Erstapherese trat bei zehn Patienten (28,6
Prozent) eine Zitratreaktion auf und während der zweiten Apherese bei neun Patienten (25,7
Prozent).
66
Tabelle 20: Nebenwirkungen während erster und zweiter Apherese (N=35)
Nebenwirkung 1. Apherese 2. Apherese
Kopfschmerzen 1 (2,9%) 1 (2,9%)
Übelkeit 2 (5,7 %) 1 (2,9 %)
Erbrechen 2 (5,7 %) 0
Kreislaufbeschwerden 2 (5,7 %) 0
Flussprobleme 6 (17,1 %) 2 (5,7 %)
Paravasat 3 (8,6 %) 1 (2,9 %)
Technische Probleme 0 0
Zitratreaktion 10 (28,6 %) 9 (25,7 %)
Spendenabbruch 0 0
4.9 Ergebnisse bei Patienten mit drei Apheresen
Um Unterschiede bei Patienten mit drei Apheresen zu ermitteln, konnten 14 Patienten aus-
wählt werden, bei denen ihre ersten drei Apheresen innerhalb der vorgegebenen Spendezeit
durchgeführt wurden. Bezüglich der Leukozytenkonzentrationen zeigten sich keine statistisch
signifikanten Unterschiede zwischen der ersten Apherese mit einer Leukozytenkonzentration
von 5,2 ± 1,2 x 103 Zellen pro Mikroliter, der zweiten Apherese mit 5,4 ± 1,1 x 103 Leukozyten
pro Mikroliter und der dritten Apherese mit 5,5 ± 2,1 x 103 Zellen pro Mikroliter (p=0,397;
p=0,486; p=0,806). Bei der Monozytenkonzentration konnten ebenfalls keine signifikanten Un-
terschiede zwischen erster Apherese (0,32 ± 0,1 x 103 Zellen pro Mikroliter), zweiter Apherese
(0,33 ± 0,1 x 103 Zellen pro Mikroliter) und dritter Apherese (0,36 ± 0,2 x 103 Zellen pro Mik-
roliter) nachgewiesen werden. Hinsichtlich der Monozyten-Sammeleffizienz wurden größere
Differenzen ermittelt: Während der ersten Apherese lag die durchschnittliche Sammeleffizienz
bei 69,7 ± 18,6 Prozent. Im Vergleich dazu wurde bei der zweiten Apherese eine deutlich höhe-
re Sammeleffizienz von 81,6 ± 49,2 Prozent gemessen, die sich jedoch nur von der dritten A-
pherese mit 60,9 ± 19,2 Prozent statistisch signifikant abgrenzen ließ (p=0,048). Abbildung 24
stellt diese Ergebnisse in Form von Boxplots dar.
67
Abbildung 24: Monozyten-Sammeleffizienz bei dreimaliger Apherese (N=14)
Bei der Betrachtung des Monozytengehalts konnten nur geringfügige Unterschiede ermittelt
werden: In der ersten Apherese wurde ein durchschnittlicher Monozytengehalt von 2,6 ± 0,7 x
109 Zellen gesammelt. Während der zweiten Apherese konnte ein Gehalt von 2,8 ± 1,1 x 109
Zellen erzielt werden. Der Monozytengehalt während der dritten Apherese betrug 2,6 ± 1,3 x
109 Zellen und unterschied sich nicht signifikant von dem Sammelergebnis der anderen beiden
Leukapheresen.. Obwohl in den Analysen zur Monozyten-Sammeleffizienz ein statistisch signi-
fikanter Unterschied zwischen den Werten der zweiten und der dritten Apherese mit einer Diffe-
renz von über 20 Prozent im Mittel nachgewiesen wurde, unterschieden sich die Ergebnisse des
Monozytengehalts nicht signifikant (p=0,220, p=0,965, p=0,487). Abbildung 25 zeigt eine zu-
nehmende Streuung zwischen erster und dritter Apherese.
68
Abbildung 25: Monozytengehalt bei dreimaliger Apherese (N=14)
Bei dem Vergleich des Monozyten-Rekrutierungsfaktors wurde für die erste Apherese ein
durchschnittlicher Monozyten-Rekrutierungsfaktor von 2,7 ± 0,7 berechnet. Während der zwei-
ten Apherese lag mit 2,9 ± 1,0 ein höherer Rekrutierungsfaktor vor. In der dritten Apherese
wurde der niedrigste Rekrutierungsfaktor mit 2,3 ± 0,4 berechnet (Abbildung 26). Diese Unter-
schiede erwiesen sich als nicht statistisch signifikant (p=0,528, p=0,090, p=0,082).
69
Abbildung 26: Rekrutierungsfaktor bei erster, zweiter und dritter Apherese (N=14)
Hinsichtlich der Nebenwirkungen während erster, zweiter und dritter Apherese traten außer
bei den beiden Kategorien „Flussprobleme“ und „Zitratreaktion“ selten Nebenwirkungen auf.
Bei den anderen Kategorien zeigte sich mit zunehmender Anzahl der Apheresen eine abneh-
mende Häufigkeit dieser beiden Nebenwirkungen. Während der ersten Apherese wurden bei
sechs Patienten (42,9 Prozent) Zitratreaktionen dokumentiert. In der zweiten Apherese trat bei
drei Patienten (21,4 Prozent) eine Zitratreaktion auf und während der dritten Apherese bei nur
einem Patienten (7,1 Prozent). Eine Übersicht der Nebenwirkungen befindet sich in Tabelle 21.
70
Tabelle 21: Nebenwirkungen bei dreimaliger Apherese (N=14)
Nebenwirkung 1. Apherese 2. Apherese 3. Apherese
Kopfschmerzen 0 0 1 (7,1 %)
Übelkeit 1 (7,1 %) 1 (7,1 %) 1 (7,1%)
Erbrechen 1 (7,1 %) 0 0
Kreislaufbeschwerden 1 (7,1 %) 0 2 (14,3 %)
Flussprobleme 3 (21,4 %) 2 (14,3 %) 1 (7,1 %)
Paravasat 1 (7,1 %) 1 (7,1 %) 0
Technische Probleme 0 0 0
Zitratreaktion 6 (42,9 %) 3 (21,4 %) 1 (7,1 %)
Spendenabbruch 0 0 1 (7,1 %)
4.10 Uni- und multivariate Analysen zu Sammeleffizienz, Monozytengehalt und Rekru-
tierungsfaktor
Im Institut für Medizininformatik, Biometrie und Epidemiologie wurden zusätzliche Analy-
sen mit uni- und multivariaten Modellen in Form von Varianzanalysen berechnet. Diese Be-
rechnungen wurden ausschließlich mit Erstapheresen durchgeführt.
In einem multivariaten Modell (N=89) mit den drei Zielvariablen Sammeleffizienz, Rekru-
tierungsfaktor und Monozytengehalt wurden die Einflüsse von Geschlecht, Zitratreaktion und
einer LDH-Erhöhung getestet. Zusätzlich wurde als Kovariate der prozentuale Anteil der Mo-
nozyten vor der Apherese mit aufgenommen. Zur Darstellung der Fallzahlen zu dieser Untersu-
chung wurde Tabelle 22 erstellt. Es zeigte sich, dass die Monozyten-Sammeleffizienz und der
Monozyten-Rekrutierungsfaktor hochsignifikant vom Ausgangswert, den Monozyten, abhängen
(p<0,001). Für den Monozytengehalt konnte dagegen keine signifikante Abhängigkeit nachge-
wiesen werden (p=0,078). Es wurden ebenfalls keine signifikanten Einflüsse von Geschlecht
(p=0,163), Zitratreaktion (p=0,517) oder LDH-Erhöhung (p=0,385) abgeleitet. Auch bezüglich
der Wechselwirkungen zwischen diesen einzelnen Faktoren konnten keine signifikanten Ergeb-
nisse berechnet werden (p=0,247, p=0,176, p=0,801).
71
Tabelle 22: Häufigkeiten von Geschlecht, Zitratreaktion und LDH-Erhöhung
In einer weiteren Untersuchung wurden die Einflüsse von Geschlecht, Chemotherapie einen
Monat vor Apherese und einer LDH-Erhöhung auf den Monozyten-Rekrutierungsfaktor unter-
sucht. Für Patienten mit einer Chemotherapie einen Monat vor Apherese (N=21) wurde ein
durchschnittlicher Rekrutierungsfaktor von 2,9 ± 0,9 berechnet. Der Monozyten-
Rekrutierungsfaktor von Patienten ohne Chemotherapie (N=67) lag mit 2,6 ± 0,6 unter diesem
Wert (p=0,076). Für die Variablen Geschlecht und LDH-Erhöhung wurden keine statistisch
signifikanten Werte berechnet (p=0,644, p=0,151). Es konnten ebenfalls keine statistisch signi-
fikanten Ergebnisse für Wechselwirkungen von Geschlecht und Chemotherapie einen Monat
vor Apherese (p=0,902), LDH-Erhöhung und Chemotherapie (p=0,178) und Geschlecht und
LDH-Erhöhung (p=0,337) erzielt werden. Abbildung 27 zeigt eine größere Streubreite bei ei-
nem durchschnittlich höheren Monozyten-Rekrutierungsfaktor, wenn bei dem Patient eine
Chemotherapie einen Monat vor Apherese durchgeführt wurde.
Geschlecht Zitratreaktion LDH-Erhöhung N
weiblich Ja Ja 3
Nein 15
Nein Ja 5
nein 13
männlich Ja Ja 2
nein 8
nein Ja 10
nein 30
72
Abbildung 27: Rekrutierungsfaktor in Abhängigkeit von Chemotherapie
Die Einflüsse von Geschlecht, Chemotherapie einen Monat vor Apherese und einer LDH-
Erhöhung wurden ebenfalls in Bezug auf die Sammeleffizienz getestet. Die Variablen Ge-
schlecht und Chemotherapie einen Monat vor Apherese zeigten keine signifikanten Auswirkun-
gen auf die Monozyten-Sammeleffizienz (p=0,106, p=0,393). Die LDH-Erhöhung ließ einen
tendenziellen Zusammenhang zur Sammeleffizienz erkennen (p=0,083). Patienten, bei denen
eine LDH-Erhöhung (N=20) gemessen wurde, wiesen mit 79,6 ± 19,5 Prozent eine höhere
Sammeleffizienz auf als Patienten ohne LDH-Erhöhung (N=66) mit 75,9 ± 24,3 Prozent. Der
Vergleich dieser beiden Gruppen wird in Abbildung 28 dargestellt. Es wurden keine Wechsel-
wirkungen von Geschlecht und Chemotherapie einen Monat vor Apherese (p=0,858), einer
LDH-Erhöhung und Chemotherapie (p=0,265) und dem Geschlecht und einer LDH-Erhöhung
(p=0,576) zwischen den einzelnen Variablen festgestellt.
73
Abbildung 28: Sammeleffizienz in Abhängigkeit von einer LDH-Erhöhung
74
5 Diskussion
Das Maligne Melanom ist ein Tumor der Haut, dessen Inzidenz vor allem innerhalb der
hellhäutigen Bevölkerung in den letzten Jahren zugenommen hat [6]. Da die Prognose eines
metastasierten Melanoms jedoch mit weniger als neun Monaten mittlerer Überlebenszeit als
besonders schlecht beschrieben wird, gilt es, möglichst schnell neue und effektive Therapien zu
entwickeln [18, 22]. Ein Ansatz ist die Vakzinationstherapie mit dendritischen Zellen. Auch bei
anderen Tumorarten wird diese Art von Therapie bereits eingesetzt. Als Beispiel für diese Form
der neuen immunologischen Therapieansätze bei Malignomen wurde im April 2010 Sipuleucel-
T als Vakzin für die Behandlung des fortgeschrittenen Prostata-Carcinoms in den USA zugelas-
sen [30]. In einer Studie von Small und Mitarbeitern konnte eine verlängerte mittlere Überle-
benszeit bei Patienten nachgewiesen werden, die Sipuleucel-T erhielten [63].
Da dendritische Zellen normalerweise nur in sehr geringer Zahl im peripheren Blut vor-
kommen, gibt es mehrere Ansätze zur Gewinnung und Vermehrung dieser Zellen [27]. Einer
davon ist die Herstellung aus Monozyten mit Wachstumsfaktoren in einer In-vitro-Zellkultur.
Zusätzlichen gibt es die Möglichkeiten, dendritische Zellen aus CD34+-hämatopoetischen
Stammzellen zu erzeugen oder durch Wachstumsfaktoren die Anzahl dendritischer Zellen direkt
im Blut zu erhöhen [44]. Da der Großteil dendritischer Zellen aus Monozyten gewonnen wird,
gilt die Leukozytapherese als Goldstandard, mit der ausreichend Monozyten hierfür aus dem
Blut der Patienten gewonnen werden können [3, 69, 71]. Die besondere Herausforderung bei
diesen Apheresen ist es, dass es sich bei den Zellspendern um schwerkranke Tumorpatienten
handelt, bei denen häufig bereits mehrere Vorbehandlungen, wie z.B. Chemotherapien oder
Bestrahlungen, durchgeführt wurden. Unter Umständen besteht bei diesen Patienten eine
schlechtere körperliche Verfassung als bei normalen Spendern. Zusätzlich findet bei dieser Art
von Apheresen keine Voruntersuchung auf Spendertauglichkeit nach den Kriterien für Fremd-
spender statt, die bei der Fremdblutspende vorgeschrieben ist [11]. Somit unterliegt die Patien-
tenauswahl nur den Kriterien des Studienprotokolls und der ärztlichen Begutachtung hinsicht-
lich einer Zellapherese und nicht, wie bei normalen Blutspendern, den Vorschriften der Hämo-
therapie-Richtlinien der Bundesärztekammer. In der vorliegenden Arbeit wurden deswegen
neben möglicher Einflussfaktoren auf die Produktqualität einer Apherese auch die Nebenwir-
kungshäufigkeiten untersucht.
75
5.1 Charakterisierung der Patientengruppe
In der Voruntersuchung erfolgt eine Blutentnahme, bei der Leukozyten, Thrombozyten,
Erythrozyten und MCV untersucht und in das Herstellungsprotokoll aufgenommen werden [11].
Im Gegensatz zu gesunden Blutspendern, deren Blutwerte vor Spende durch Richtlinien festge-
legt sind, unterliegen die Patienten nur der Festlegung des Studienprotokolls, wodurch eher die
Gefahr einer iatrogenen Thrombozytopenie oder einer Hypokalzämie besteht [46]. In den Blut-
bildern der Patienten vor und nach Erstapherese wurde bei allen Parametern, außer bei den
Lymphozyten, die in einer gleichbleibenden Konzentration von 1,1 x 103 Zellen pro Mikroliter
vorlagen, ein signifikanter Unterschied festgestellt. Speziell die Veränderungen von Throm-
bozyten mit einer Abnahme von durchschnittlich 74000 Zellen pro Mikroliter und Leukozyten
mit einer Abnahme von 700 Zellen pro Mikroliter wurden bereits von Nguyen und Chen be-
schrieben. In dieser Studie wurde bei Patienten mit metastasiertem Melanom im Mittel eine
Abnahme von 81800 Thrombozyten pro Mikroliter und 1000 Leukozyten pro Mikroliter wäh-
rend der Apherese gemessen [54]. Chen und Mitarbeiter berichteten von einer Differenz von
38000 Thrombozyten pro Mikroliter und 0,6 x 103 Leukozyten pro Mikroliter [14]. In den Un-
tersuchungen von Glaser wurde zusätzlich ein Abfall des Hämatokrits von 4,4 Prozent beschrie-
ben, der in den vorliegenden Untersuchungen 3,2 Prozent betrug und auf den Verdünnungsef-
fekt durch die Apherese zurückzuführen war [23]. Die in der vorliegenden Studie nachgewiese-
ne signifikante Abnahme von 0,1 x 103 Monozyten pro Mikroliter konnte jedoch weder von
Glaser noch von Nguyen bestätigt werden [23, 54]. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die
durchschnittlich kürzere Spendezeit in den Studien beider Autoren.
Zusätzlich zu den Blutbildern vor und nach Apherese wurden die Rekrutierungsfaktoren der
einzelnen Blutzellen berechnet. Ein Rekrutierungsfaktor von 1 oder kleiner als 1 bedeutet, dass
keine Zellmobilisierung stattgefunden hat. Bei Werten von über 1 während der Apherese hat
eine Zellrekrutierung stattgefunden, die eine Differenz zwischen den Blutwerten vor und nach
Apherese verringern oder einen Zellanstieg nach Apherese verursachen kann [71]. Es wurde
bereits mehrfach die Theorie geäußert, dass diesbezüglich die Regulation über eine Art negati-
ven Feedback-Mechanismus erfolgt [38, 71]. Anfänglich niedrige Zellkonzentrationen im Pati-
entenblut führen demnach zu einer höheren Zellrekrutierung und gleichen den durch die Zell-
sammlung verursachten Abfall der Zellen im Blut aus [71].
Für die Thrombozyten und die Granulozyten mit Rekrutierungsfaktoren zwischen 0,9 und
1,1 konnte keine Zellrekrutierung nachgewiesen werden. Knudsen und Mitarbeiter kamen bei
ihren Studien ebenfalls zu diesem Ergebnis. Als Erklärung nahmen sie an, dass die Abnahme
von beiden Zellpopulationen nicht ausreiche, um eine kritische Grenze zu unterschreiten und
damit eine Rekrutierung auszulösen [38]. Neben den Lymphozyten wiesen die Monozyten, die
76
im Vergleich zu den Granulozyten durch die Apherese hauptsächlich gesammelt wurden, mit
2,7 einen der höchsten Rekrutierungsfaktoren auf, sodass hier ein negativer Feedback-
Mechanismus stattgefunden haben könnte. Bezüglich der Lymphozyten mit einem Rekrutie-
rungsfaktor von 2,9 könnte die verstärkte Rekrutierung sogar zu einem Ausgleich der Zellver-
luste durch die Apherese geführt haben. Generell fiel bei Betrachtung der unterschiedlichen
Rekrutierungsfaktoren auf, dass mit einem höheren Rekrutierungsfaktor gleichzeitig auch die
Spannweite der Ergebnisse zunimmt. Dies lässt besonders bei einer verstärkten Zellrekrutierung
auf große Unterschiede zwischen den einzelnen Individuen schließen.
Da während der Apherese eine Antikoagulation essentiell ist, um eine Aktivierung der Blut-
gerinnung zu vermeiden, wird Zitrat als Antikoagulanz verwendet [40]. Durch die Verwendung
von Zitrat, das Komplexe mit Calcium bildet, sinkt die Konzentration der freien Calcium-Ionen
[6]. Hierbei kann es zu Hypocalciämien kommen, weshalb die Untersuchung der Elektrolyte im
Serum, Calcium, Natrium und Kalium, vor und nach Apherese wichtig ist und im Rahmen die-
ser Arbeit auch ausgewertet wurde [6]. Durchschnittlich zeigte sich während der Apheresen eine
geringfügige, signifikante Abnahme der Calcium-Konzentration von 2,30 Millimol pro Liter auf
2,28 Millimol pro Liter. Die Spannweite der Differenz vor und nach Apherese zeigte dagegen
deutlichere Unterschiede und betrug im Mittel 0,80 Millimol pro Liter. In der Literatur lassen
sich hierzu keine einheitlichen Ergebnisse finden. Bolan und Mitarbeiter berichteten 2002, dass
das Gesamt-Calciums während ihrer Untersuchungen bei Stammzellapheresen sich nicht signi-
fikant verändert habe [6]. In Untersuchungen von Haddad und Bolan 2005 wurde jedoch eine
signifikante Zunahme des Gesamt-Calciums nachgewiesen, wobei in dieser Studie jeder Patient
vier Ampullen Calciumchlorid erhielt [26]. In den Studien von Buchta und Kollegen stieg das
Gesamt-Calcium unter Calcium-Substitution und sank um 4,2 %, wenn kein Calcium substitu-
iert wurde [10]. Der Großteil der in dieser Studie vorliegenden Patientenkohorte erhielt Calci-
um-Brausetabletten oder intravenöses Calciumchlorid in einer geringeren Dosis im Vergleich zu
Haddad und Buchta, weswegen nur eine geringe Abnahme der Calcium-Konzentration resultier-
te. Bei weiteren Untersuchungen wäre hier eine genauere Differenzierung der Substitutionsart
und –menge interessant.
Bezüglich der Kalium-Werte konnte mit 3,9 Millimol pro Liter vor Apherese und 3,3 Mil-
limol pro Liter nach Apherese, wie bereits in anderen Studien von Haddad und Buchta, eine
signifikante Kaliumabnahme nachgewiesen werden [10, 26]. Die niedrigste durchschnittliche
Kalium-Konzentration von Haddad lag bei 3,21 Millimol pro Liter und damit unter den Werten
aus der vorliegenden Studie [26]. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die erhöhte Kalium-
Ausscheidung während einer Apherese, die bereits von Bolan beschrieben wurde [7]. Bei Be-
trachtung der Natrium-Konzentration im Serum fiel ein Anstieg der Werte von 138,7 Millimol
pro Liter auf 141,1 Millimol pro Liter auf. Bolan und Mitarbeiter beschrieben bei ihren Unter-
suchungen einen niedrigeren Anstieg von etwa einem Prozent, der durch die kürzere Spenden-
77
zeit bei einer Thrombozytenapherese entstanden sein könnte [7]. Die Applikation von Calcium-
chlorid, das zusammen mit Natriumchlorid-Lösung intravenös verabreicht wird, könnte eine der
Ursachen für den Anstieg der Natrium-Konzentration sein. Generell führen auch die vielen
Kompensationsmechanismen bei Zitrat-vermittelter Hypocalcämie zu Schwankungen der Se-
rumkonzentrationen von Natrium, Kalium und Calcium, wie zum Beispiel der hepatische und
der renale Metabolismus, bei dem Zitrat zu Bicarbonat verstoffwechselt wird, und das Anstei-
gen des Parathormons [7].
Zusammenfassend lässt sich die Leukozytapherese als Eingriff in die Homöostase des
menschlichen Körpers betrachten. Zu beachten sind hierbei die inter- und intraindividuellen
Unterschiede bei der Rekrutierung von Blutzellen, die den hohen Zellverlust teilweise oder voll-
ständig kompensieren kann. Dem gegenüber sollten aber auch möglichst frühzeitig die Patienten
erkannt werden, bei denen es durch niedrigere Zellrekrutierung zu einer stärkeren Abnahme
einzelner Zellpopulationen während der Apherese kommt. Gerade bei diesen Patienten besteht
die Gefahr einer Thrombozytopenie oder Leukozytopenie. Zusätzlich gilt es, die Veränderungen
in der Elektrolyt-Zusammensetzung zu beachten. Da Leukozytapheresen im Vergleich zu ande-
ren Apheresen eine lange Spendezeit haben und damit die Gefahr einer Zitrat-Anhäufung steigt,
liegt gerade bei dieser Patientengruppe das Risiko einer Zitratreaktion höher als bei anderen
Spendern [6]. Durch Calcium-Substitution lässt sich dieses Risiko senken. Eine orale oder in-
travenöse Calcium-Prophylaxe sollte somit gerade bei bekannter Zitrat-Unverträglichkeit zu
Beginn einer Apherese in Betracht gezogen werden.
5.2 Nebenwirkungen bei Erst- und Mehrfachapherese
Es besteht eine fast hundertjährige Erfahrung mit der Anwendung von Zitrat, da es seit 1914
als Antikoagulanz genutzt wird [51]. Die Vorteile von Zitrat gegenüber einer Antikoagulation
mit Heparin sind neben den niedrigen Kosten und der relativ sicheren Anwendung auch der
rasche Abbau im Körper bzw. der Leber [40]. Bei Personen ohne Leberzirrhose beträgt die
Halbwertszeit von Zitrat lediglich 36 Minuten [39]. Dennoch kann es auch bei der Verwendung
von Zitrat gewisse Nebenwirkungen kommen, die vor allem durch die Bindung von freien Cal-
cium-Ionen entstehen und zu einer Abnahme an ionisiertem Calcium im Blut führen [7]. Als
Nebenwirkung entsteht dadurch die sogenannte Zitratreaktion. Bei einer leichten Zitratreaktion
kommt es zu perioralen oder akralen Parästhesien, Tremor und Benommenheit [77]. Die schwe-
re Zitratreaktion äußert sich in Muskelzuckungen, Hypotonie, epileptischen Anfällen und kardi-
alen Arrhythmien [40]. Risikofaktoren für eine erhöhte Zitrattoxizität sind Alter, weibliches
Geschlecht, Leber- oder Niereninsuffizienz und ein Blutvolumen von unter vier Litern [40].
Während der Erstapherese trat die Zitratreaktion mit Kribbelparästhesien bei weiblichen Pa-
tienten mit 43,9 Prozent deutlich häufiger auf als bei den männlichen Patienten mit 18,9 Pro-
78
zent. In vergleichbaren Untersuchungen variieren die Häufigkeitsangaben von Zitratreaktionen
stark. Crocco und Mitarbeiter berichteten von Zitratreaktionen bei lediglich 1,2 Prozent aller
Spender, die sich verschiedenen Arten von Apheresen unterzogen [16]. Im Vergleich zur vorlie-
genden Studie mit Patienten handelte es sich allerdings um gesunde Spender mit deutlich kürze-
ren Spendezeiten. Diese Tatsache zeigt, dass sowohl die Dauer der Apherese als auch die Grun-
derkrankung und das Blutvolumen wichtige Einflussfaktoren für das Auftreten einer Zitratreak-
tion sind. In einer Studie von Buchta und Mitarbeitern bei Patienten mit verschiedensten Tumo-
rerkrankungen trat bei 48 Prozent aller Patienten ohne Calcium-Substitution eine Zitratreaktion
auf [10]. Mit einer intravenösen Calcium-Substitution wurde nur bei 17 Prozent eine Zitratreak-
tion festgestellt [10].
Zusätzlich trat während der Erstapherese bei 17,1 Prozent aller Frauen und bei 3,4 Prozent
aller Männer Übelkeit auf. Da Übelkeit sowohl ein Hinweis für eine Zitratreaktion als auch ein
möglicher Hinweis auf eine vasovagale Reaktion sein kann, wurde dieses Symptom gesondert
von der Zitratreaktion ausgewertet [77].
Bei Patienten mit zwei Apheresen fiel auf, dass die Häufigkeit der Zitratreaktion von 28,6
Prozent bei Erstapherese auf 25,7 Prozent bei der zweiten Apherese abnahm. Dieser Trend
konnte bei Patienten mit drei Apheresen bestätigt werden. Mit 42,9 Prozent der Patienten hatten
zwar mehr Personen eine Zitratreaktion während ihrer Erstapherese, die Häufigkeit einer Zit-
ratreaktion nahm jedoch mit 21,4 Prozent bei der zweiten und 7,1 Prozent bei der dritten Aphe-
rese stark ab. Eine Ursache hierfür könnte sein, dass bei Patienten mit bereits bekannter Zitrat-
Unverträglichkeit eine adäquate Calcium-Prophylaxe gegeben wurde.
Die Zitratreaktion ist generell die häufigste Nebenwirkung einer Apherese. Aufgrund der
Vielfalt verschiedener Symptome einer Zitratreaktion, die selten auch zur Kreislaufinstabilität
führen kann, ist die Abgrenzung gegenüber einer Volumenmangel-Reaktion oder einer vaso-
vagalen Reaktion nicht immer eindeutig. [40]. Grundsätzlich ist jedoch die Zitratreaktion die
deutlich häufiger vorkommende Nebenwirkung, die in fortgeschrittenen Fällen bis zur Tetanie
führen kann. Die vorliegende Studie zeigt, dass bei weiblichen im Vergleich zu männlichen
Patienten eine Zitratreaktion deutlich häufiger auftrat. Da das totale Blutvolumen in der Regel
bei Frauen kleiner ist, könnte dies zu einer höheren Zitratbelastung und dadurch zu mehr Zit-
ratreaktionen geführt haben. Zudem konnten in der vorliegenden Studie Hinweise gefunden
werden, dass sowohl die Spendezeit als auch die maligne Tumorerkrankung Risikofaktoren für
eine Zitratreaktion darstellen können. Therapiemöglichkeiten für eine Hypocalcämie-induzierte
Zitratreaktion wurden bereits von Buchta und Mitarbeitern 2003 beschrieben [10]. Neben einer
Blutflussreduktion, die zu einer längeren Spendezeit führen kann, und einer Kombination mit
Heparin, die zur Dosissenkung von Zitrat führen und auch eine systemische Antikoagulation zur
Folge haben kann, ist die Substitution von Calcium die am häufigsten angewandte Methode zur
Reduktion einer Zitratreaktion in der Klinik. Eine Substitution von Calcium kann oral oder pa-
79
renteral erfolgen. Da die Gabe von oralem Calcium bei zu hoher Dosierung zu Diarrhö führt,
sollte bei Langzeitapheresen die intravenöse Applikation über einen Perfusor bevorzugt werden,
da hierbei das Calcium nicht enteral resorbiert werden muss und im Körper sofort verfügbar ist
[36]. In der vorliegenden Studie zeigte sich besonders bei den männlichen Patienten unter Cal-
cium-Substitution eine deutliche Abnahme von Zitratreaktionen. Die Calcium-Substitution ist
daher eine einfache und sehr wirksame Maßnahme zur Vermeidung der Zitratreaktion oder zur
Reduktion der Symptomatik bei bereits bestehender Zitratreaktion. Der Vergleich der Mehr-
fachapheresen zeigt zusätzlich, dass eine Calcium-Prophylaxe bei bekannter Zitrat-Anfälligkeit
eine weitere Abnahme von Zitratreaktionen ermöglicht. Diese Prophylaxe sollte bei länger dau-
ernden Apheresen von über drei Stunden intravenös über den Perfusor appliziert werden.
5.3 Produktqualität der Leukozytapheresen bei Patienten
Als Zielwert für eine Leukozytapherese mit der COBE Spectra wird ein Zellgehalt von
mindestens 1,2 x 109 CD14+ Zellen und weniger als 1x 1011 Thrombozyten gefordert [67]. Die-
se Zielwerte basieren auf den Untersuchungen von Glaser und Mitarbeitern, die in ihrer Studie
zeigen konnten, dass eine hohe Thrombozyten-Kontamination signifikant den Zellgehalt der
dendritischen Zellen nach Anlegung einer Zellkultur beeinträchtigt [23]. Als mögliche Erklä-
rung nahmen sie an, dass die Thrombozyten während der Apherese aktiviert werden, an Mo-
nozyten binden und die Produktion von Zytokinen induzieren [2, 24, 62, 76]. Um eine erfolgrei-
che Reifung der dendritischen Zellen zu erreichen, sollte jedoch möglichst kein Kontakt mit
inflammatorischen Zytokinen außer GM-CSF und Interleukin-4 vor dem 5. Tag nach Kulturan-
legung erfolgen [4]. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern die Blutwerte der
Patienten vor Apherese die Zellkonzentrationen von Monozyten und Thrombozyten im Produkt
beeinflussen.
Bezüglich der Monozyten konnte eine signifikante Korrelation von 0,568 zwischen der
Monozytenkonzentration im Blut vor der Apherese und dem Zellprodukt berechnet werden. Bei
den Thrombozyten wurde ein wesentlich niedrigerer Korrelationskoeffizient von 0,322 zwi-
schen Blut- und Produktkonzentration berechnet. Nguyen und Mitarbeiter präsentierten in ihrer
Studie einen Korrelationskoeffizient von 0,74 für Monozyten [54]. Hinsichtlich der Thrombozy-
ten lag der von Nguyen berechnete Korrelationskoeffizient mit 0,88 jedoch wesentlich höher
[54].
Die Ergebnisse aus unserer Studie zeigen, dass die Monozytenkonzentration vor Apherese
als relativ guter Prädiktor für die Monozytenkonzentration im Produkt genutzt werden kann.
Der Korrelationskoeffizient der Thrombozyten war niedrig, weil im Vergleich zu anderen Stu-
dien durch Verwendung eines variablen Trennfaktors von 250 oder 700 auch ein unterschiedli-
cher Anteil an Thrombozyten in das Produkt gesammelt wurde. Daher lässt sich allein aufgrund
80
der Thrombozytenkonzentration vor Apherese keine Aussage über die Höhe der Kontamination
im Produkt und auf die Zellkultur treffen.
5.4 Leistungsdaten über die Monozytensammlung bei Mehrfachapherese
Bei Mehrfachapheresen wurde eine Abnahme der Häufigkeit von Nebenwirkungen beo-
bachtet. Dies wurde bereits von McLeod berichtet, der einen signifikanten Einfluss bei einer
vorherigen Apherese auf die Nebenwirkungsrate feststellte [48]. In seiner Studie hatten Erst-
spender damit häufiger Nebenwirkungen im Vergleich zu Mehrfachspendern [48]. In der vorlie-
genden Arbeit wurde daher untersucht, ob sich bei Mehrfachapheresen im Vergleich zu Einzel-
apheresen auch die Produktqualität hinsichtlich Monozyten-Sammeleffizienz, Monozytengehalt
und Monozyten-Rekrutierungsfaktor ändert.
Bei den Patienten mit zwei Apheresen konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen
erster und zweiter Apherese im Hinblick auf Monozyten-Rekrutierungsfaktor, Monozytenge-
halt, Monozyten-Sammeleffizienz und der Leukozyten- und Monozytenkonzentration vor der
Apherese gefunden werden. Allerdings stieg die Monozyten-Sammeleffizienz beispielsweise
von 81,7 Prozent bei der ersten Apherese auf 84,5 Prozent bei der zweiten Apherese. Der Mo-
nozyten-Rekrutierungsfaktor stieg ebenfalls um 0,3 bei der zweiten Apherese.
In den Untersuchungen zu Patienten mit drei Apheresen wurde ebenfalls eine nicht signifi-
kante Zunahme von Monozyten-Rekrutierungsfaktor, Monozytengehalt und Monozyten-
Sammeleffizienz bei der zweiten Apherese im Vergleich zur ersten ermittelt. Bezüglich der
Sammeleffizienz wurde jedoch eine starke signifikante Abnahme von 81,6 Prozent auf 60,9
Prozent festgestellt. Parallel dazu konnte auch beim Monozyten-Rekrutierungsfaktor und dem
Monozytengehalt eine, wenn auch nicht signifikante, Abnahme berechnet werden.
Der gezielte Einsatz der Calciumprophylaxe bei Patienten mit bekannter Zitratunverträg-
lichkeit könnte aufgrund des störungsfreien Verlaufs der Apherese Ursache für eine Verbesse-
rung der Monozytensammlung gewesen sein. Ob diese Prophylaxe eine signifikante Auswir-
kung bei Mehrfachapheresen hat, sollte zunächst an einem größeren Patientenkollektiv unter-
sucht werden. In der vorliegenden Studie konnten hierfür lediglich Hinweise gefunden werden,
die aufgrund der niedrigen Fallzahl nicht signifikant waren. Zusätzlich sollte bei Patienten mit
drei Apheresen untersucht werden, inwieweit Faktoren wie Krankheitsdauer oder Allgemeinzu-
stand nach Vorbehandlungen die Sammeleffizienz negativ beeinflusst haben könnten.
81
5.5 Einflüsse von patienten-, melanom- und apheresespezifischen Daten
Eine Zulassung zur Blutspende kann gesunden Spendewilligen nur erteilt werden, wenn
bestimmte Vorgaben erfüllt sind. Neben der Untersuchung von Blutbildparametern muss ein
Spender zwischen 18 und 68 Jahre alt sein [11]. Eine Spende mit einer älteren Person ist nur
nach individueller ärztlicher Entscheidung möglich [11]. Es erfolgt außerdem ein Ausschluss
zur Spende bei einem Körpergewicht von unter 50 Kilogramm oder einer bösartigen Neoplasie
[11]. Da es für Patienten mit Malignem Melanom bei Leukozytapheresen keine allgemein ver-
bindlichen Zulassungskriterien wie bei Blutspendern gibt, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit,
mögliche Einflüsse von Patienten- und melanomspezifischen Daten auf die Apherese zu unter-
suchen. Hinsichtlich der Produktqualität wurden die Monozyten-Sammeleffizienz, der Monozy-
ten-Rekrutierungsfaktor und der Monozytengehalt als Zielvariablen ausgewählt.
In der vorliegenden Studie konnten keine signifikanten Korrelationen zwischen Body-Mass-
Index und Sammeleffizienz, Rekrutierungsfaktor und Monozytengehalt aufgezeigt werden.
Steininger und Mitarbeiter konnten dagegen zeigen, dass zwischen dem Rekrutierungsfaktor
von CD45+-Zellen und dem Gewicht der Patienten eine signifikante, wenn auch schwache Kor-
relation von 0,565 besteht [64]. Bezüglich des Rekrutierungsfaktors von CD14+-positiven Zel-
len und der Variablen Gewicht fanden auch sie keine signifikanten Zusammenhänge [64]. Es
konnten außerdem keine Hinweise auf Zusammenhänge zwischen dem Spendenalter der Patien-
ten und der Sammeleffizienz, dem Monozytengehalt und dem Rekrutierungsfaktor nachgewie-
sen werden. Cassens und Mitarbeiter veröffentlichten 2004 hierzu, dass Patienten über 18 Jahre
einen durchschnittlich niedrigeren Zellgehalt im Vergleich zu Patienten unter 18 Jahren aufwie-
sen [13]. Andere Autoren berichteten, dass bei älteren Patienten weniger Stammzellen gesam-
melt werden und folgerten daraus, dass bei fortgeschrittenem Alter eine zusätzliche Apherese
benötigt werde [15, 43].
Es wurden außerdem keine signifikanten Unterschiede bei einem Vergleich von Monozy-
ten-Sammeleffizienz und Monozyten-Rekrutierungsfaktor in den unterschiedlichen Tumorstadi-
en nachgewiesen. Dies betrifft auch den Tumormarker Protein S 100, der mit keinem der oben
genannten Parameter korrelierte. Folglich eignet sich Protein S100 beim Malignen Melanom,
das bei Erhöhung mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist [74], nicht als Indikator für den
erfolgreichen Verlauf einer Apherese. Eine LDH-Erhöhung ließ jedoch geschlechtsspezifische
Unterschiede erkennen. Während bei Frauen der Monozytengehalt im Produkt um 0,3 x 109
Zellen abnahm, stieg der Monozytengehalt bei Männern um 1,3 x 109 Zellen bei einer LDH-
Erhöhung an.
Ein geschlechtsspezifischer Unterschied beim Monozytengehalt konnte ebenfalls bei Patien-
ten mit beziehungsweise ohne Zitratreaktion nachgewiesen werden. Während weibliche Patien-
ten mit einer Zitratreaktion einen höheren Monozytengehalt von 3,0 x 109 Monozyten im Ver-
82
gleich zu 2,6 x 109 Monozyten aufwiesen, wurde bei männlichen Patienten ein niedrigerer Zell-
gehalt von 2,7 x 109 Zellen mit Zitratreaktion im Vergleich zu 3,4 x 109 Monozyten ohne Ne-
benwirkung festgestellt.
Es wurde außerdem festgestellt, dass die Sammeleffizienz bei einem Trennfaktor von 700
mit 85,7 Prozent signifikant höher lag als bei einem Trennfaktor von 250 mit 74,5 Prozent. Es
konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede bei dem Monozyten-Rekrutierungsfaktor und
dem Monozytengehalt nachgewiesen werden. Strasser und Mitarbeiter wiesen 2004 sowohl
einen höheren Zellgehalt als auch eine höhere Sammeleffizienz bei weißen Blutkörperchen bei
Verwendung eines höheren Trennfaktors nach [68]. Norol und Mitarbeiter fanden ebenfalls bei
einem höheren Trennfaktor eine verbesserte Sammeleffizienz von Stammzellen [55]. Ihre Stu-
die zeigt zusätzlich, dass diese verbesserte Sammeleffizienz zusammen mit einer höheren
Thrombozyten-Kontamination auftrat [55]. Diese Ergebnisse wurden von Strasser und Mitarbei-
tern 2010 bestätigt [69]. Da eine hohe Thrombozyten-Kontamination den Zellgehalt von dendri-
tischen Zellen nach Anlegung einer Zellkultur beeinträchtigt [23], sollte bei der Wahl des
Trennfaktors nicht ausschließlich die verbesserte Sammeleffizienz im Vordergrund stehen. Soll-
te es doch zu einer erhöhten Thrombozyten-Kontamination kommen, ist eine Entfernung von
Thrombozyten und Anreicherung der Monozyten mittels Elutriation möglich [32].
Zusammenfassend stellt die autologe Zellspende bei Patienten mit Malignem Melanom, von
denen Monozyten im Rahmen einer Vakzinationstherapie gesammelt werden, aufgrund ihrer
Tumorerkrankung eine Besonderheit dar, da Tumorerkrankungen für eine Fremdblutspende laut
Hämotherapie-Richtlinien ein Ausschlusskriterium sind [11]. Zusätzliche Faktoren, wie ein
erhöhtes Alter, würden ebenfalls bei Apheresen mit gesunden Blutspendern zu einem Spenden-
ausschluss führen [11]. Patienten sollten aufgrund einer im Vergleich zu gesunden Blutspendern
höheren Nebenwirkungsrate, die vor allem auf die längere Spendezeit von bis zu 5 Stunden
zurückzuführen ist, während der Apherese engmaschig überwacht werden.
5.6 Einflüsse von Vorbehandlungen auf die Apherese
Viele Patienten unterzogen sich vor Apherese bereits einer Operation, einer Bestrahlung
oder einer Chemotherapie im Rahmen ihrer Melanomerkrankung. Zu den Frühreaktionen der
Nebenwirkungen einer Chemotherapie gehören neben einer Thrombopenie und einer hämolyti-
schen Anämie auch die Leukopenie, die innerhalb weniger Stunden, Tagen oder Wochen auftre-
ten kann [58]. Auch bei Bestrahlungen kann es vor allem in Kombination mit Chemotherapie zu
Einschränkungen des hämatopoetischen Systems kommen [75]. Eine der Fragestellungen dieser
Arbeit war daher, wie sich Vorbehandlungen in Form von Chemotherapie und Bestrahlung auf
eine Leukozytapherese auswirken.
83
In der vorliegenden Studie wurden zuerst die Leukozyten- und die Monozytenkonzentratio-
nen auf Unterschiede durch Vorbehandlungen untersucht, um mögliche Einflüsse der Vorbe-
handlung auf die Ergebnisse der Zellseparation zu erfassen und bewerten zu können. Es wurden
die jeweiligen Korrelationskoeffizienten bei männlichen und weiblichen Patienten berechnet,
um anschließend Rückschlüsse auf die Monozyten-Sammeleffizienz durchführen zu können.
Der Koeffizient zwischen der Monozytenkonzentration vor Apherese und der Monozyten-
Sammeleffizienz im Produkt betrug -0,386 bei weiblichen und -0,449 bei männlichen Patienten.
Damit ist eine niedrige Monozyten-Konzentration vor einer Apherese tendenziell eher mit einer
höheren Monozyten-Konzentration im Produkt verbunden. Bezüglich der Leukozytenkonzentra-
tion und der Sammeleffizienz konnte keine signifikante Korrelation gefunden werden.
Die Untersuchung der Leukozytenkonzentration vor der Apherese unterschied sich nicht
zwischen Patienten, die eine Chemotherapie einen Monat vor Beginn der Apherese erhielten,
und Patienten ohne Chemotherapie. Die Varianzanalyse zeigte jedoch eine gegenseitige Beein-
flussung der Variablen Geschlecht und Chemotherapie einen Monat vor der Apherese (p-Wert =
0,054). Dieses Ergebnis könnte auf geschlechtsspezifische Unterschiede der Chemotherapie auf
die Leukozytenkonzentration vor der Apherese hinweisen. Weibliche Patienten mit einer Che-
motherapie wiesen dabei mit 5,4 x 103 Zellen pro Mikroliter eine niedrigere Leukozytenkon-
zentration auf als Patientinnen ohne Chemotherapie, bei denen eine Leukozytenkonzentration
von 6,3 x 103 Zellen pro Mikroliter gefunden wurde. Bei männlichen Patienten mit einer Che-
motherapie wurde eine höhere Leukozytenkonzentration von 5,9 x 103 Zellen pro Mikroliter
gemessen im Vergleich zu männlichen Patienten ohne Chemotherapie mit einer Leukozyten-
konzentration von 5,2 x 103 Zellen pro Mikroliter. In den Untersuchungen zum Monozyten-
Rekrutierungsfaktor konnte bei männlichen Patienten mit Chemotherapie einen Monat vor der
Apherese ein signifikant höherer Rekrutierungsfaktor mit 2,9 berechnet werden. Bei männlichen
Patienten ohne Chemotherapie wurde dagegen ein Rekrutierungsfaktor von 2,5 berechnet. Bei
den weiblichen Patienten mit Chemotherapie konnte mit 3,0 ein höherer, jedoch nicht signifi-
kanter Rekrutierungsfaktor im Vergleich zu 2,8 berechnet werden.
In den Untersuchungen wurde außerdem festgestellt, dass von den 16 Patienten in der ge-
samten Patientenkohorte mit einer Leukopenie, einer Leukozytenkonzentration von unter 4,0 x
103 Zellen pro Mikroliter, bei 81,2 Prozent eine Chemotherapie durchgeführt wurde. Ein Unter-
schied bezüglich Sammeleffizienz und Rekrutierungsfaktor bei Patienten mit Leukopenie im
Vergleich zu Patienten ohne Leukopenie konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Chen und
Mitarbeiter, die ihre Studienkohorte in Gruppen mit Leukozytenkonzentrationen von unter be-
ziehungsweise über 5 x 109 Zellen pro Liter einteilten, konnten ebenfalls keine Unterschiede bei
der Monozyten-Sammeleffizienz feststellen [14].
Bei den männlichen Patienten wurden keine signifikanten Unterschiede einer Bestrahlung
einen Monat oder innerhalb eines halben Jahres vor der Apherese in Bezug auf die Monozyten-
84
und die Leukozytenkonzentration vor Apherese gefunden. Die Monozyten-Sammeleffizienz lag
jedoch mit 85,6 Prozent im Vergleich zu 72,1 Prozent signifikant höher, wenn innerhalb eines
halben Jahres vor der Apherese eine Bestrahlung durchgeführt wurde. Dies konnte nicht durch
einen höheren Rekrutierungsfaktor bei Patienten mit Bestrahlung erklärt werden, da sich dieser
nicht signifikant von Patienten ohne Bestrahlung unterschied.
Ähnliche Untersuchungen wurden bereits von Haas und Mitarbeitern bei Patienten mit
Stammzellapheresen durchgeführt [25]. In ihrer Studie führte eine vorangegangene Chemothe-
rapie oder eine Bestrahlung zu einer Abnahme des Zellgehalts von CD34+-positiven Zellen
[25]. Zusätzlich reduzierte eine großflächige Bestrahlung die Sammeleffizienz durchschnittlich
um 1,8 x 106 CD 34+-positive Zellen pro Kilogramm [25]. Die Faktoren Geschlecht und Zeit
seit der letzten Chemotherapie oder Bestrahlung zeigten dagegen bei Haas und Mitarbeitern
keine signifikanten Einflüsse auf die Sammeleffizienz [25]. Die Unterschiede zur vorliegenden
Studie sind jedoch möglicherweise durch die vorgenommene Zytokinbehandlung im Rahmen
der Stammzellmobilisierung vor einer Apherese zu erklären.
Insgesamt wurden in der vorliegenden Studie Hinweise auf geschlechtsspezifische Unter-
schiede sowohl bei der Leukozytenkonzentration vor der Apherese als auch beim Monozyten-
Rekrutierungsfaktor gefunden. Allerdings sollten diese Untersuchungen zunächst an einer grö-
ßeren Patientenkohorte geprüft werden, um die Effekte von Vorbehandlungen beim Malignem
Melanom, vor allem der Bestrahlung, auf die Ergebnisse der Apherese überprüfen zu können.
Zusammenfassend ist die Leukozytapherese bei Patienten mit Malignen Melanom eine spe-
zielle Herausforderung, da sie bei Patienten mit besonderen Ausgangsbedingungen durchgeführt
wird. Alter, BMI, ein fortgeschrittenes Tumorstadium oder eine Protein S100-Erhöhung schei-
nen tendenziell wenig Einfluss auf die Produktqualität zu haben. Zitratreaktionen traten statt-
dessen während der Apherese deutlich häufiger auf als bei normalen Spenden mit gesunden
Blutspendern. Bei Mehrfachapheresen ließ sich eine Abnahme von Zitratreaktionen beobachten,
die wahrscheinlich durch konsequente Anwendung der Calcium-Prophylaxe erzielt werden
konnte und zu einer nicht signifikanten Zunahme von Monozytengehalt und Monozyten-
Rekrutierungsfaktor führte. Vorbehandlungen in Form von Chemotherapie oder Bestrahlung
scheinen geschlechtsspezifische Unterschiede im Hinblick auf die Leukozytapherese aufzuwei-
sen, wie dies beispielsweise beim Monozyten-Rekrutierungsfaktor, der bei Männern mit Che-
motherapie höher lag, tendenziell zu sein scheint. Auch eine Leukopenie durch eine Chemothe-
rapie scheint sich nicht auf die Produktqualität hinsichtlich Monozyten-Sammeleffizienz und
Monozyten-Rekrutierungsfaktor auszuwirken. Patienten Leukozytapherese sollten jedoch wäh-
rend einer Leukozytaphere engmaschig überwacht werden, um Nebenwirkungen frühzeitig be-
heben und den dadurch entstehenden Nachteil auf die Produktqualität vermeiden zu können.
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7. Abkürzungsverzeichnis
ACD-A Acidum-Citricum-Dextrose, Formel A
Ag Antigen
Ak Antikörper
BMI Body-Mass-Index
CT Computertomografie
DC dendritische Zellen
Dl Deziliter
DNS Desoxyribonukleinsäure
Fl Femtoliter
G Gramm
Hb Hämoglobin
Hkt Hämatokrit
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
Kg Kilogramm
L Liter
LDH Lactatdehydrogenase
M Meter
MHC Major Histocompatibility Complex
Min Minuten
Ml Milliliter
mmHg Millimeter-Quecksilbersäule
Mmol Millimol
MRT Magnetresonanztomografie
N Anzahl
PBV Prozessiertes Blutvolumen
PET Positronen-Emissions-Tomografie
Pg Pikogramm
SE Sammeleffizienz
TNF Tumornekrosefaktor
µl Mikroliter
WBK weiße Blutkörperchen
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8. Anhang
Tabelle 23: Kategorisierung der klinischen Angaben
Kodierung Kategorie
Melanomtyp 1 2 3 4 5 6 7 8
Superfiziell spreitendes Melanom Noduläres Malignes Melanom Akral-lentiginöses Melanom Schleimhaut-Melanom Uvea-Melanom Unbekannt Nicht näher angegeben Lentigo-maligna-Melanom
Ulzeration 1 2 3
Ja Nein Unklar
Lokalisation des Primärtumors 1 2 3
Kopf Sonstiges Unklar
Tumorstadium 1 2
III IV
Stadium IV 1 2 3
M1a M1b M1c
Protein S100- Erhöhung 1 2
Ja Nein
LDH- Erhöhung 1 2
Ja Nein
Chemotherapie bis zu einem Mo-nat vor Apherese
1 2
Ja Nein
Chemotherapie bis zu einem hal-ben Jahr vor Apherese
1 2
Ja Nein
Bestrahlung bis zu einem Monat vor Apherese
1 2
Ja Nein
Bestrahlung bis zu einem halben Jahr vor Apherese
1 2
Ja Nein
Operation bis zu einem Monat vor Apherese
1 2
Ja Nein
Operation bis zu einem halben vor Apherese
1 2
Ja Nein
92
Tabelle 24: Zellverlust der Patienten
Zellverlust (N=91) Mittelwert Minimum Maximum
Leukozyten in % -10,9 ± 19,7 -41,7 68,3
Thrombozyten in % -31,0 ± 18,5 -74,8 7,9
Lymphozyten in % -0,3 ± 19,7 -39,1 62,1
Granulozyten in % -10,2 ± 28,7 -54,9 108,1
Monozyten in % -17,2 ± 26,5 -81,5 65,4
Tabelle 25: Zellzahlen der Patienten vor und nach Apherese
N=95 Vor Apherese Nach Apherese
Leukozytenzahl im Körper in Zellen * 1010 2,7 ± 0,9 2,4 ± 1,0
Erythrozytenzahl im Körper in Zellen * 1013 1,9 ± 0,5 1,8 ± 0,5
Thrombozytenzahl im Körper in Zellen * 1011 11,3 ± 3,7 7,9 ± 3,6
Lymphozytenzahl im Körper in Zellen * 109 5,2 ± 2,2 5,1 ± 2,3
Granulozytenzahl im Körper in Zellen *1010 1,9 ± 0,8 1,7 ± 0,7
Monozytenzahl im Körper in Zellen * 109 1,7 ± 0,9 1,4 ± 0,8
93
Tabelle 26: Geräteeinstellungen während Erstapherese
Mittelwert Standard-abweichung
Minimum Maximum
Blutfluss
(ml/Minute, N=91)
49,73 3,43 35 63
Trennfaktor
(N=93)
415,32 215,34 250 700
Drehzahl
(U/Minute, N=93)
811,60 200,50 541 1081
Plasmaflussrate (ml/Minute, N=51)
22,74 4,44 14 32
Abbildung 29: Auswirkungen von Bestrahlung auf die Sammeleffizienz
94
Tabelle 27: Korrelation des Monozytengehalts mit Alter, BMI und TBV
w:N=41
m:N= 56
Alter (Jahre) BMI (kg/m 2) TBV (ml)
W M w m w m
Koeffizient -0,044
p=0,787 †
0,021
p=0,876 ‡
0,272
p=0,085 †
-0,186
p=0,170 †
0,320
p=0,041 ‡
0,008
p=0,952†
w= weiblich, m= männlich; †= Korrelationskoeffizient nach Pearson; ‡= Korrelationskoeffi-
zient nach Spearman
95
Danksagung
Hiermit möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Reinhold Eckstein für die Möglichkeit einer
Dissertation in der transfusionsmedizinischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen-
Nürnberg bedanken.
Ich bedanke mich außerdem bei Herrn Prof. Dr. med. Erwin Strasser für die Ermöglichung einer
Promotion, die jahrelange Betreuung und die konstruktiven Ratschäge.
Herrn Dr. med. Michael Erdmann danke ich für die Hilfe bei der Datensuche in der dermatolo-
gischen Abteilung des Universitätsklinikum Erlangen-Nürnberg.
Frau Andrea Keller danke ich für die Unterstützung bei der statistischen Auswertug.
Darüber hinaus danke ich allen, die mir mit ihrer Unterstützung zur Seite standen und zum Fer-
tigwerden der Arbeit beigetragen haben.