viii taller de capacitación avícola ponedoras
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Taller de
capacitación avícola
PONEDORAS
Marco Cisneros Tamayo DVMZ MSc. Ph.D
Profesor FMVZ - UC
VIIIImpacto y Alternativas para el control de Mycoplasma sinoviae
Características de los micoplasmas aviares
• Bacteria sin pared. (Kleven et al., 1972)
• Muy pequeña talla: 0,2 – 0,5 µm. (Chalquest et Fabricant, 1960)
• Genoma reducido: 799 kpb para MS. (Razin, 1983)
• Fuerte tasa de mutaciones: el sistema de reparación del ADN es defectuoso. (Ferguson, 2013)
• Afecta a muchas especies de aves: pollos, gallinas, pavos (Nascimento et al., 2005)
• MS difunde más rápido que MG
• Carencia de elementos de resistencia y antigenicidad (capsulas, cilias, esporas, plásmidos,
toxinas, etc.)
• “Mejor ejemplo de parasitismo animal”, Artículo de la IOM, (Organización Internacional de Micoplasmología)
• Muy lábiles al medio ambiente y desinfectantes (¿?)
31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.
“Mejor ejemplo de parasitismo
animal”
Artículo de la IOM
(Organización Internacional de Micoplasmología)
Huespedes
• Reproductores livianos y pesados
• Gallinas de postura comercial
• Pollos de engorde
• Gallos de pelea.
• Pavos
• Faisanes
• Perdices
• Pavos reales
Distribucion Geografica
Cosmopolita
Mycoplasmas Aviaires
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• Infecciones respiratorias, articulares o genitales (Ferguson, 2013)
Mycoplasma gallisepticum (MG). 1935, enfermedad respiratoria crónica (MRC), aerosaculitis en pollos y pavos.
Mycoplasma synoviae (MS). 1950, articulares, respiratorios en las gallinas y pavos , alteración de los huevos en las ponedoras.
Mycoplasma meleagridis (MM). 1958, aerosaculitis, problemas de la reproducción en los pavos.
Mycoplasma iowae (MI). 1955, disminución de la tasa de eclosión y mortalidad de los embriones de los pavos.
• MS comúnmente se presenta sin signos clínicos y sin lesiones: la disminución de la
performance zootécnica de los lotes muchas veces no son significativos. (Ferguson,
2013)
Infecciones por MS
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• Difusión muy rápida del MS en las explotaciones. (Christensen et al., 1994)
• MS + stress u otros patógenos = micoplasmosis. (signes cliniques / lésions)
(Feberwee et al., 2008)
• Infecciones agudas frecuentemente asociadas con virus y bacterias : retardos de
crecimiento, edema de las articulaciones, cojeras, ligeros estornudos…
• Infección crónica sigue a la infección aguda. (Nascimento et al., 2005)
• Decomisos en camal (artritis) en ocasiones son muy importantes. (dindes, poulets de
chair)(Landman, 2014)
• Persistencia de MS a pesar de los tratamientos con antibióticos. (Le Carrou et al. 2006
; Kleven et al. 2008)
• Signos clínicos según el tropismo de la cepa…
Transmision/Incubacion
Transmisión
Vertical
Horizontal
Mecanica
Periodo de Incubación
Experimentalmente 6-21 dias
Naturalmente es variable
(Asintomaticos hasta que se estresan)
Sobrevida del Mycoplasma synoviae en el ambiente
ALGODON : 8 HS – 2 DIAS
• VIRUTA : 4 HS
• PLUMAS : 2 – 3 DIAS
• MADERA : 8 – 12 HS
• GOMA : 8 HS
• AGUA : 41 DIAS
• ALIMENTO : 21 DIAS
• POLVO : 51 – 77 DIAS (4 grados)
10 – 21 DIAS (20 grados)
Asociación de factores múltiples
Medio ambiente (humedad, temp.,amoníaco, etc.) - Manejo
Densidad animal (estrés)
La presencia de biofilms
Micotoxinas
Virus inmuodepresores (Gumboro, AI, EM, Reovirus)
Virus respiratorios (EN,BI,IA,LT,NV)
Bacterias (E. coli, Coriza, ORT, Pasteurella)
Micoplasmas (MG, MS)
Signos Clinicos
La information de Mycoplasma synoviae es escasa, y se ha vinculado con muchas
sintomatologias dentro del sindrome respiratorio.
La aereosaculitis se exacerba por vacunación de ND o IB.
Las lesiones se agravan en las épocas frías.
Las parvadas afectadas de sinovitis infecciosa tienen:
Cresta pálida, claudicación y crecimiento retardado, plumas erizadas, la cresta se
encoje,se la pude observar también de color azulado, Se observa hinchazón de
articulaciones y ampollas en el pecho.
Los M.sinoviae aislados de lesiones de sacos aéreos pueden provocar mas
aereosaculitis,mientras que los aislados de sinovia producen sinovitis.
Es frecuente encontrar aves con infección generalizada pero no con hinchazón aparente
de las articulaciones.
M.sinoviae se ha observado en pollos de seis días de edad, que sugiere que el periodo
de incubación es corto en aves infectadas por transmisión del huevo.
Se dice por ahi que:
Respiratorio
Articular
Reproductivo
TROPISMO ARTICULAR
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I. Kempt
Merck Veterinary ManualMerck Veterinary Manual
M. Cisneros
SELARL Vétérinaire de Malestroit, Anilab, Réseau Cristal
TROPISMO RESPIRATORIO
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“SÍNDROME DE HUEVOS CON
EXTREMIDAD DE CRISTAL (EAA)”
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TROPISMO GENITAL
• Sin Síntomas En Las Gallinas
• Afecta Solo Los Huevos
• Aspecto rugoso y/o fragilidad de la punta o del cono superior de los huevos
(huevos sucios). (Feberbee et al., 2009)
• Mayor carga del trabajo clasificando los huevos y lavando las instalaciones.
(Gautier-Bouchardon et al., 2012)
EAA : Eggshell Apex Abnormalities
A.V. Gautier-BouchardonA.V. Gautier-Bouchardon
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• Extremo delgado
• Evidencia de fisuras y rupturas
con la ayuda de: luminosidad
aumentada usando una lámpara.
(Jeon et al.,2014)
The poultrysite
Visualización de huevos con síndrome de EAA
R. Rodas, Guatemala, 2018
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EAA y la estructura de la cascara del huevo
Huevo normal Huevo EAAA : membranas internas
B : capa mamilar
C : capa palissadica
A : membranas internas
C : capa palissadica
50 µm 100 µm
• Microscopio electrónico (Feberwee et al., 2009) :
• Estructura de la cascara modificada:
o Desaparición de la capa mamilar o de una parte de la capa palisidica.
o Densidad disminuida de las membranas internas.
o Espesor reducido de la cascara de al menos 1/3.
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C
USA
Paraguay
Brésil
Argentine
Chine
Japon
Pakistan
Jordanie
Australie
EPIDEMIOLOGÍA DE MS EAA
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• Europa :
• Holanda (GD Deventer, 2008)
• Italia (IZSV, 2010)
• Reino Unidoi (AHVLA, 2011)
• Portugal (CECAV, 2012)
• Francia (Anses, 2009 - 2010)
Diagnóstico de micoplasmosis
Muestreo para el diagnostico en lotes
de aves
Tamaño del lote
Numero de muestras
10 10*
20 19
30 26
40 31
50 35
60 38
70 40
80 42
90 43
100 45
200 51
500 56
1000 57
2000 58
5000 59
>5000 59
Numero de muestras a tomar en función del
tamaño del lote, para tener 95% de probabilidad de
identificar al menos una muestra positiva si la
enfermedad esta presente en el 5% del lote (inicio
de la infeccion).
60 muestras (hisopos o muestras de sangre)
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Diagnostico bacteriológico
• Método de referencia para la diagnostico de Micoplasmas
• Muestreo :
• Animales vivos :
• Animales muertos :
• Muestreos medio ambientales
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Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS
M.
• Transporte : rápido, en temperatura de refrigeracion (4C)
•Ideal en agua peptonada tamponada con glicerol + inhibidores
• Hisopos traqueales (o fosas palatinas) o cloacales (genitales) para el
pavo (MM y MI)
• Huevos embrionados o no
• Semen
• Órganos del aparato respiratorio (tráquea, senos, sacos
aéreos…) o del aparato genital (oviducto) y articulaciones
PROTOCOLO: CULTIVO DE MYCOPLASMAS
hisopos
(traquea, cloaca, huevos)
Universitdad Central del Ecuador - FMVZ - CISNEROS M. 31/05/2019
M.Cisneros, 2017
M.Cisneros, 2016
cultivo
(medio FM4)
Con antibioticos
virage
37 oC
virage
PCR MS+
multiplicacion
37 oC
Conservacion cultivo
MS+ (20% de glycérol,
-70 oC)
Anses, 2017
M.Cisneros, 2016
M.Cisneros, 2016
Conservacion (-70
oC)
Aslamiento
1 colonia
Multiplicacion
Diagnostico bacteriológico
Cultivo :
• Laboratorios especializados.
31/05/2019
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CISNEROS M.
• Medios específicos y complejos (líquidos y gelosa) :
Base PPLO, suero de cerdo, extracto de levadura.
Rojo de fenol (detección de la actividad metabólica antes que
una turbidez como en las bacterias clásicas).
Diferentes substratos : glucosa (M. gallisepticum, M. synoviae,
M. iowae) o arginina (M. meleagridis).
Inhibidores (para limitar la contaminación).
• Incubación à 37°C (al menos un mes), diluciones de muestras,
control + y -.
• Identificación : determinación de las características bioquímicas,
antigénicas y genéticas (PCR).
• Ventajas :
• diagnóstico definitivo,
• precocidad, sensibilidad.
• Otros análisis posibles para la cepa aislada (CMI, poder patógeno…).
Diagnostico bacteriológico
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
• Inconvenientes/dificultades :
• Difícil cultivo (laboratorios especializados, largos periodos de cultivo).
• Difícil re-aislamiento después de un tratamiento con antibióticos (efecto inhibidor del
antibiótico en las muestras, persistencia de los mycoplasmas en bajas concentraciones).
• Para lograr el cultivo del mycoplasma es importante la vigilancia diaria de los cultivos
durante la incubación.
• Hay cepas de mycoplasmas más sensibles que otras a las variaciones de pH (M. synoviae
mucho más sensible que M. gallisepticum).
Diagnostico bacteriológico
• Re-aislamiento de M. gallisepticum 8 días post tratamiento de tilmicosina.
IT4 (300 mg/l)
IT3 (200 mg/l)
IT2 (100 mg/l)
IT1 (50 mg/l)
INT
NI
Lotes
0 /60
1 /60
19/60
40/60
60/60
0/60
Numero
de aves
positivas
0 /600 /600 /60
1 /600 /600 /60
15 /606 /602 /60
40 /6018 /608 /60
60/6060/6060/60
0/600/600/60
10-210-1Sin diluido
Diluciones de las muestras
NI : no infectados ; INT : infectados no tratados; IT : infectados y tratados
Importancia de las diluciones de la muestra original
(similar para las contaminaciones) 31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS
M.
Anses, 2017
Diagnostico bacteriológico
Dias post
inoculación
• Re-aislamiento de MG post tratamientos por enrofloxacina.
Coronavirus
TD/2 TD TD
Pmetaneumovirus
desaparición de mycoplasmas post tratamiento
re-aparacimiento después de una infección viral (o stress)
Persistencia de los mycoplasmas : falsos negativos en cultivo31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS
M.
Anses, 2017
Diagnostico por PCR
• PCR
– simple, multiplex y tiempo real
• Ventajas / inconvenientes comparado al cultivo
– Condiciones menos críticas para los Muestreos y el transporte
– Rapidez (algunas horas vs muchos días)
– Detección de bacterias no viables o viables no cultivables (estabilidad del ADN): los
mycoplasmas pueden ser detectadas pero pueden ya no estar presentes en la granja
– Reacciones específicas : Se detecta lo que se busca
– PCR normalmente más sensible que el cultivo
– Costo : más barato que el cultivo
31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.
Diagnostico por PCR
• PCR para las 4 especies patógenas
– PCR clásicos o cuantitativos (tiempo real)
– PCR simples o multiplex (una o muchas especies)
• PCR para mollicutes (van Kuppelveld et al., 1992)
Resultados de un PCR de M. synoviae (Lauerman et al., 1993) : fragmento de 207 pb
- Pocillo 1 : marcador de peso molecular- Pocillo 2 à 4 : muestra negativa- Pocillo 5 à 11 : muestra positiva (muestra 8 bajamente positiva)- Pocillo 12 : control positivo (cepa de referencia M. synoviae)- Pocillo 13 : control negativo (agua)
207 pb
31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M. Anses, 2017
Diagnostico serológico de mycoplasmas
• Principio del diagnóstico serológico : evidencia anticuerpos
específicos
• Naturaleza de anticuerpos detectados :
Ac post-infección, maternales o vacunales
• Muestreos : sangre
• Lectura de resultados :
PositivoNegativo 31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Diagnostico serológico de mycoplasmas
Diferentes técnicas :
• Aglutinación rápida en placa (ARP) : técnica la más utilizada
• Ventajas : rápida, poco costosa, precoz (IgM), relativamente sensible
• Inconvenientes : falta de especificidad (reacciones cruzadas MG/MS,
vacunas...) anamnesis es importante.
• ELISA indirectos o de competición : costo relativamente elevado,
sensibilidad, especificidad.
• Inhibición de la hemoaglutinación : poco utilizado.
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS
M.
Comparación de métodos de diagnostico
Detección más rápida por cultivo (o PCR) que por serología.
ARP más rápida que ELISA.
Efecto memoria de la serología (el lote continua positivo).31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Anses, 2016
ARP clásico - ARP modificado y ELISA
Diferencias importantes entre estas técnicas serológicas :
• ARP modificada (dilución y des-complementación) permite detectar más
aves positivas que el ARP clásico.
• Los resultados ELISA de manera general equivalen a los resultados ARP
modificado.
• No se puede diferenciar lotes vacunados o no por métodos serológicos.
• Explicacion de esta diferencia de lectura en ARP?
Effeto « prozona »
La reacción se hace positivasi se diluye el suero muestra
Resultado negativoSin la presencia de Anticuerpos
Resultado positivo(aglutinación)
Ac + Ag
Resultado negativoSi hay demasiados Ac
Comparado con la cantidad de Ag(la reacción de
aglutinaciónno se produce)
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA
• 1ra granja
– Muestra de sangre : ARP MG et MS
– Hisopos de tráquea y cloaca :
– Cultivo (medio líquido y agar FM4 + ATB)
– PCR para mollicutes, MG et MS
– Huevos : separación de albumen y yema
– Cultivo (FM4 + ATB)
– PCR para mollicutes, MG et MS
• 2da granja
– Hisopos traqueales y cloacales :
– Cultivo (medio FM4 + ATB)
– PCR mollicutes, MG et MS
Si el medio vira durante el cultivo : multiplicación, PCR, clones
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA
Resultados :
• 1era granja :
• 2da granja: 12/14 HT (83%) y 1/14 HC (4%) positivos
P1
P2
P3
P4
8/30
4/30
3/30
0/30
22/30
25/30
22/30
27/30
26/30
27/30
21/30
26/30
1/30
0/30
2/30
1/30
1/30
1/30
2/30
0/30
ARP MS HT HCPCR MS cult. PCR MS cult.
Baja proporción de sueros positivos (0 à 3%) 73 à 90% de los HT positivos en cultivo o PCR
3 à 7% des HC positivos en cultivo o PCR (contaminaciones, inhibition del PCR)
un huevo positivo en PCR MS (albumina)
31/05/2019
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CISNEROS M.
Anses, 2017
Comparación de métodos de diagnostico
36
Resultados :
PCR
Cultivo
PCR + cultivo
ARL
ELISA
(MS+/EAA-)%
49/60 (81,7)45/60 (75)
53/60 (88,3)
8/60 (13,3)60/60 (100)
galpón 1
(MS+/EAA-)/%
28/30 (93,3)
18/30 (60)
30/30 (100)
2/30 (6,7)
29/29 (100)
galpón 2 (MS+/EAA+)%
29/30 (96,7)
19/30 (63,3)
30/30 (100)
1/30 (3,3)
29/30 (96,7)
Resultados de los muestreos
88 à 100 % de aves positivas a nivel de la tráquea
Mas muestras positivas por PCR que por cultivo
Ciertas muestras son PCR-/culture+ y viceversa no hay hisopos cloacales positivos
HT
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Anses, 2017
Granja 3
Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA
Comparación de métodos de diagnostico
Granja 4
37
Resultados :
PCR
Cultivo
PCR + cultivo
ARP
ELISA
Granja 3
49/60 (81,7)
45/60 (75)
53/60 (88,3)
8/60 (13,3)
60/60 (100)
Galpón 1(MS+/EAA-)%
28/30 (93,3)
18/30 (60)30/30 (100)
2/30 (6,7)
29/29 (100)
Galpón 2
(MS+/EAA+)%
29/30 (96,7)
19/30 (63,3)
30/30 (100)
1/30 (3,3)
29/30 (96,7)
Resultados de la serología
3 à 13 % de las aves son positivas por ARP : confirmación de los
resultados de aves positivas por ARP.
96 à 100 % de aves positives en ELISA.
diferencia entre las dos técnicas serológicas.
31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Anses, 2017
(MS+/EAA-)%
Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA
Comparación de métodos de diagnostico
Granja 4
Seguimiento de un lote de ponedoras a diferentes semanas : resultados de ARP
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
27/04 16/05 29/05 13/06 26/06 16/07 10/09
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
27/04 16/05 29/05 13/06 26/06 16/07 10/09
Dil./descomplementación. si positivo (normal) Dil./descomplementacion. sistemática
La técnica ARP modificada permite detectar más aves positivas
(equivalente à la técnica ELISA)31/05/2019
Universidad Central del Ecuador - FMVZ-
CISNEROS M.
Anses,2017
Infecciones con Mycoplasma synoviae : EAA
Comparación de métodos de diagnostico
n
fecha
5-7 d 10-15 d
Ig M (ARP)
Ig G (ELISA-HI)
Tít
ulo
de
Inm
un
oglo
bu
lin
a
2-3 meses 8-10 meses
Curvas de ig producidas postinfeccion de mg o ms
Sem 18 22 26 30 34 464238
Ig M
Ig GARP +
ELISA-HI +
Perfil serológico más común en
reproductoras infectadas con MG/MS
IgG (Elisa/HI)
IgM (ARP)
15 d 25 d 40 d20 d1-3 d
Situación más común en progenie de reproductoras
infectadas con MG/MS
¿Cuando hay sintomas y cuando no hay sintomas ?
1. La Serologia nos da la primera informacion
2. El Cultivo del mycoplasma es el ideal para:
Estudios de la cepa de Ms:
Cmi para antibioterapia (dosis y frecuencia)
Caracterizacion genetica
Estudios de patogenicidad
Estudios epidemiologicos
ST 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
nb 2 2 1 2 8 2 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 2 2 1 1 3 1 1
Reparticion de las 44 cepas de MS :
Misma granja
diferentes ST
Misma gallina
diferentes STUBP17-365
gallina 1
3 ST
UBP17-365
gallina 2
2 ST
UBP17-218
gallina 13
4 ST
Resultados de la genotipificacion por MLST de 13 Sitios de comparacion
Universitdad Central del Ecuador - FMVZ - CISNEROS M. 31/05/2019
Impacto del Mycoplasma synoviae
• En la producción:
• Pérdidas directas (cuando hay signos clínicos):
• Retardo en crecimiento
• Enfermedad respiratoria crónica
• Disminución y deterioro en la producción de pollos y huevos
• Programas de erradicación difíciles de llevar a cabo.
• Perdidas indirectas (sin signos clínicos):
• Predisposición a enfermedades secundarias (post-vacunales)
• Resistencia a los antimycoplasmicos (Salud pública)
• Costos de antimycoplasmicos
• Es una de las enfermedades más costosas de la industria31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.
Estrategias de Control
Empleo de vacunas:
Bacterinas (MG-MS)
Vacunas vivas (cepa F, 6/85, ts-11 y MS-H)
Vacunas recombinantes para MG
Antibióticoterapias:
Preventivas
Curativas
Macrólidos (tilosina, tilvalosina, josamicina), pleuromutilinas (tiamulina, valnemulina), lincosamidas (lincomicina), fluoroquinolonas(enrofloxacina), tetraciclinas (clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina)
Vacunas Vivas Comerciales Contra Mg y Ms
Caracteristicas
Ventajas
Desventajas
Cepa MS-H
(Marham Et Al, 1998)
Características:
Buena protección de lesiones (87.5%)
Rápida seroconversión en el 100% de las aves (5ta semana PV)
A mayor dosis mayor protección
Asociación directa entre grado de aglutinación y grado de protección
Se requieren entre 2-3 semanas para obtener adecuada inmunidad
Alta seguridad (dosis 10 veces superiores)
Cepa MS-H
(Marham Et Al, 1998)
Seguridad en la combinación con otras vacunas (ts-11, IB, ILT)
Transmisión horizontal 2 sem PV
No se transmite verticalmente
Se observó un retraso en seroconversión por SAR de 16 a 20 semanas PV para el 100%
Observación de reversión en fenotipo de termosensibilidad en 9 de 50 cepas reaisladas
Factores que dificultan su control y erradicación
Concentración de granjas en regiones
Granjas de edades múltiples
Deficiencias de manejo
Fallas de bioseguridad
Transmisión vertical y horizontal
Fallas en técnicas de diagnóstico
31/05/2019Universidad Central del Ecuador - FMVZ-CISNEROS M.
Estudiar y determinar la presencia de MS y de EAA en el Ecuador?.
Considerar el efecto “Prozona en las pruebas de ARP.
Realizar encuesta nacional epidemiológica sobre los factores de riesgo en todos los sistemas
de producción avícola y la encuesta nacional bacteriológica de prevalencia de MG y MS.
Sugerir el uso del PCR para el diagnóstico temprano de MS en pollitos y las pollitas,
considerar el efecto “Prozona en las pruebas de ARP.
Mezcla de dos o más especies de mycoplasmas en las muestras de MS (MS+MP).
Gran diversidad genética de las cepas de Mycoplasmas de las aves.
El uso de antibióticos disminuye la sintomatología pero no elimina al MS.
Conclusion: