U2BP

3’5’

AAG GCA

47 51 52A

AAG GCA

47 52 AAAAA

AAG GCA

51

47 52

AAG GCA

47 52 AAAAA

U1 or U7 Double

3’ 5’

LTR

gag SV40 puro

LTR

pBabe puro

LTR

gag SV40 puroLTR

U1/U2 /U7

p antis

Muscular biopsy from a 48-50 patient

Immortalization with Large T Antigen

Infection with retroviral vectors containing the different therapeutic RNAs

Puromycin selection Analysis of the expression of the transgene

RT-PCR and western analysis

CELLULAR SYSTEM

M U1-5’

5'AAUUUUUCUCAUACCUUCUGCUUGAU 3'

U1-5’

probe

M U2BP

238

201

217

190180

160

AAAAAGAAGAAAAAGAAAAAUUAGAAAC

3'5'

probe

U2BP 238

201

217

190

180

307

C In vivo expression of

antisense RNAs

C

RT-PCR (single antisense)

47 51 52 53

RT

47 52

47 51 52

U1-5’

Duch

+- U2BP

Duch

U7d

U1-5’

M

51

RT-PCR (double antisense)

47 51 52 53

RT

AAGGCA

47 51 52

47 52

Duchenne

5’-3’

dBP

5’BP

CM

5’-

3’

dBP

5’BP

SMC

dyst

Duchenne

-427 kDa-

Western analysis

100 g of total proteins

In mioblasti DMD si ha ripristino di sintesi di distrofina e del complesso

del sarcoglicano

Verso un approccio di terapia genica

STOP

22 2423

degradazione

STOP

22 2423

SplicingSTOP

22 2423 mRNA

STOP

22 2423 pre-mRNA della

distrofina

Modello animale del topo mdx

AAAAA

traduzione

22 24

23

22 24

-Iniezione intramuscolo

-Somministrazione sistemicamediante iniezione nella vena caudale

Trasduzione in vivo di molecole antisenso:uso di vettori AAV

I muscoli iniettati vengono analizzati per: - analisi molecolare, (RT-PCR, Western)- immunoistochimica- saggi funzionali

U1/U7 promoter

Antisense

CMV promoter WpreGFP5’-ITR 3’-ITR

SV40 misc intron BGH pA

Il virus AAV ha un’alta efficienza di trasduzione nei muscoli e non è patogenico

La distrofina localizza correttamente alla periferia delle fibre e l’espressione è mantenuta

per diversi mesi

Iniezione intramuscolo

Anche il complesso distrofina-sarcoglicano è ripristinato

*cuore

quadricipite

tricipite

dorso

* diaframma

estensore

Gluteo

Gastrocnemiotibiale

Iniezione sistemica di AAV-U1

QuickTime™ e undecompressore TIFF (LZW)

sono necessari per visualizzare quest'immagine.

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Localizzazione di distrofina e complesso sarcoglicano

Saggi funzionali - Creatin kinasi I topi iniettati hanno livelli serici più bassi di CK

/b l6 mdx U70

5000

1000

15000

wt mdx U1

Saggi funzionali - ForzaI topi iniettati mostrano recupero della forza muscolare

c57 bl/6mdx U1/ GF P+ U1/GFP -0

20

40

60

3 ’5 ’

a 5 ’ a 3 ’3 ’5 ’

a 5 ’ a 3 ’3’5’

a5’ a3’3’5’

a5’ a3’

«

l l

kN/m2

wt mdx GFP+ GFP- singole fibre

c57 /b l6 mdx U7 U10

20

40

60

kN/m2

wt mdx U1 U7

Saggi funzionali - Treadmill exhaustion testI topi iniettati mostrano aumento della resistenza allo sforzo

c57 Bl6 mdx U10

10

20

30

3 ’5 ’

a 5 ’ a 3 ’3 ’5 ’

a 5 ’ a 3 ’3’5’

a5’ a3’3’5’

a5’ a3’

«

min

l

Wt mdx AAV-U1

Settembre 2006 -Stato dell’arte per una sperimentazione di terapia genica della DMD basata sull’approccio dell’exon skipping mediato da AAV-U1

Vettore AAV9 in sostituzione di AAV1 (tale vettore risulta avere un tropismo per il muscolo molto maggiore di AAV1 e in particolare per il muscolo cardiaco)

Collaborazione con il gruppo del Prof. Barry Byrne (Florida) capo delNational Gene Vector Laboratories (NGVL) per la produzione di virus ricombinanti di purezza GMP e per analisi tossicologica

Registrazione di AAV9-U1 come farmaco orfano.

Elaborazione di un CTD (Common Technical Document) da sottoporre all’ISS, e successivamente all’EMEA, per la richiesta di autorizzazione a sperimentazione clinica e registrazione del farmaco

Stato dell’arte della sperimentazione clinica su DMD

• PTC124 (PTC therapeutics)

• Plasmide codificante distrofina full-length (Transgene e Mirus)• Intramuscolare (completato)• Intravena (comincia inizio 2007)

• AAV1 codificante microdistrofina (AskBio)

• Exon skipping con oligonucleotidi:•2-O-metil fosforotioato contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007, Universita’ di Leiden e Prosensa)

•Morfolino contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007; UK MDEX Consortium)

•Fosforotioati contro esone 19, 1 soggetto (intravena, completato, Dr. Takeshima)

•Exon skipping con U7 snRNA :•Fase di preparazione di un AAV2/1 (Danos - Genethon)

Table 1 Summary of clinical trials for treatment of human diseases by AAV gene transfer

Disease Transgene Serotype Route of administration

Target cell Clinical trials

1-Antitrypsin deficiency 1-Antitrypsin

AAV-2, AAV-1

Intramuscular Skeletal muscle fibers

Phase I/II

Alzheimer’s disease

Nerve growth factor

AAV-2 Intracranial or ex vivo

Neurons Phase I/II

Canavan’s disease Aspartoacylase AAV-2 Intracranial Neurons Phase I

Cystic fibrosis CFTR AAV-2 Nasal, sinus, and bronchial epithelium

Lung epithelial cells

Phase I, phase II

Hemophilia B Factor IX AAV-2 Intramuscular Skeletal muscle fibers

Phase I/II

Hemophilia B Factor IX AAV-2 Hepatic artery Hepatocytes Phase I/II Leber congenital amaurosis (blindness)

RPE65 AAV-2 Subretinal space

Photoreceptors Phase I/II approved

Parkinson’s disease

Aromatic l-amino acid decarboxylase

AAV-2 Intracranial Neurons Phase I

Muscular dystrophy

Micro-dystrophin

AAV-1/2 hybrid

Intramuscular Skeletal muscle fibers

Phase I initiated

Parkinson’s disease

Glutamic acid decarboxylase

AAV-2 Intracranial Neurons Phase I

Strategia generale perla costruzione di un vettore virale

• I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis

– sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione

• La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali

– si sfrutta questa segragazione per progettare vettori virali ricombinanti.

• I geni virali e le sequenze che agiscono in cis sono separate su diverse molecole

– i prodotti dei geni virali agiscono in trans• i geni virali possono essere forniti in un virus helper, in

un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula “packaging”

– le sequenze “cis “ sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula

• produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione

Ciclo vitale di un retrovirus• RNA genomico, 2 copie.

• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta.

• (Il DNA è anche convertito in forma circolare, che però non sembra essere un intermedio della replicazione).

• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus.

• L’apparato della cellula ospite trascive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.

• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus

• Il genoma tipico contiene 3 “geni”– gene regione codificante che dà origine a più di

una proteina

• I tre geni sono– gag (componenti del core nucleoproteico)

– pol (replicazione e ricombinazione)

– env (componente della membrana esterna)

• Per l’espressione di pol deve essere ignorato un codone di stop

– soppressione da parte di un glutamil-tRNA se la fase di lettura è la stessa di gag

– slittamento del ribosoma se la fase di lettura è diversa da gag

• L’efficienza del processo è del 5%– la quantità di gag prodotta è 20 volte superiore a

quella di pol

Vettori retroviraliU3 R U5 U3 R U5

Gag-Pol

Env

1

2

1

2 3

3 Componentiseparate

U3 R U5 U3 R U5Gene terapeutico

Gag-Pol

p

p Env3

p VSV-G3

oppure

Titoli di 107 unitàtrasducenti (t.u.)/ml

Titoli di 1010 unitàtrasducenti (t.u.)/ml

Vettori Retrovirali: situazione attuale e prospettive future• Pro

– efficiente trasduzione ex vivo di cellule in attiva replicazione• linfociti e precursori delle linee ematopoietiche

– notevole esperienza clinica ex vivo• efficace terapia genica di due bambini affetti da imunodeficienza

– integra garantendo espressione prolungata, ma a basso livello

• Contro– integrazione random

• attivazione di oncogeni• shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione

– capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb)

• Sviluppi futuri: vettori lentivirali

Vettori lentivirali• I lentivirus hanno un genoma più complesso

– oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori.

• Originariamente derivati da HIV-1 per trasdurre linfociti– “pseudotipizzazione” con VSV-G espande il trofismo

– vettori “pseudotipizzati” con VSV-G possono essere somministrati direttamente in vivo

• efficiente trasduzione di neuroni e cellule della glia del sistema nervoso centrale di roditori e primati

• Vettori ibridi derivati da lentivirus non umani (SIV, FIV)– virus originale non infettivo per gli esseri umani

• la reale efficacia in vivo deve essere ancora dimostrata

Vettori lentivirali• Trasporto attivo del complesso di pre-integrazione attraverso i pori nucleari

– possibilità di trasdurre anche cellule quiescenti• efficaci nel trasdurre cellule quiescenti ex vivo

• trasduzione diretta in vivo potrebbe soffrire di alcune limitazioni– barriere tissutali nel caso della mucosa resporatoria

– condizione intracellulare (necessità di replicazione) nel caso degli epatociti

– devono ancora essere definiti il potenziale reale ed i limiti della trasduzione diretta in vivo mediata da vettori lentivirali

• Limite comune a vettori retro- e lentivirali– la fase a RNA obbligatoria nel ciclo vitale impone determinati limiti nella cassetta di

espressione, tra cui la mancanza di introni e di segnali di poliadenilazione.

Virus Adeno Associati (AAV)

• Parvovirus, inizialmente scoperti come contaminanti di preparazioni di Adeno, richiedono la presenza di un virus helper (per esempio, Adenovirus) per l’infezione produttiva– ad oggi sono stati caratterizzati 6 sierotipi

• la maggior parte deli studi si è concentrata su AAV-2

• Ad oggi non sono stati associati a nessuna patologia– caratteristica ideale per derivare un vettore di terapia genica

• Il genoma del virus naturale integra preferenzialmente in un sito specifico del genoma umano (AAVS1 nel cromosoma 19 q13.3-qter)

Struttura genomica dei Virus Adeno Associati

Cap

ITRITR (145 nt)

Rep

Replicazione del DNAIntegrazione

Rescue

Proteine del capside:VP1, VP2, VP3

IntegrazioneIncapsidazioneRescue

Ciclo vitale dei Virus Adeno Associati

Integrazionesito-specifica

Fase di latenza

Ad

Rescue

Fase litica

Replicazione

Ad

Vettori AAV: struttura e produzione

• 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap• 2) Adenovirus helperoppure• 2bis) Plasmide esprimente i geni di Adenovirus con

funzione helper

ITRITR (145 nt)

Promotore-Transgene (max 4.5 kb)

Vettori AAV: situazione attuale e prospettive future• Pro

– efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva replicazione

– espressione prolungata del transgene• descritte sia forme episomali che integrate

– bassa immunogenicità

• Contro– la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb

– con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo relativamente basso e contaminate da virus

• Sviluppi futuri:– miglioramento dei sistemi di produzione

– aumento dell’efficienza di integrazione sito-specifica