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  • Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik

    2. VL

    Thema Gentechnologie

  • gibt 4 ,IV

  • Restriktionsenzyme

    • Statistik:Enzymes: Total: 15093 • Restriction Enzymes 3843 • Type I 92 • Type II 3735 • Type III 11 • Type IV 5 • Weirdo REs 1 • Putative REs 3484 • Kommerziell erhältlich 278

  • Struktur R-Enzym HincII

  • Struktur der R-Endonuklease Bam HI

  • Erkennungssequenz

    Hochmolekulare DNA

  • Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die DNA an palindromischen Sequenzen

    z. B. 5´-GGAATTCC-3´

  • Restriktionsenzyme

    • Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen

  • Restriktionsenzyme

    Alles über R-Enzyme: http://rebase.neb.com

    • http://www.neb.com/nebecomm/products/c ategory1.asp

  • In der Gentechnologie ist die Neukombination unterschiedlicher DNA- Moleküle wichtig.

    Das Verknüpfen von DNA- Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“

  • Komplementäre überhängende Enden („Sticky ends“) erleichtern das Wiederverknüpfen von DNA- Molekülen

  • Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle

  • Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho- diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen dafü Energie, die entweder durch ATP oder NAD+ geliefert wird

    T4-DNA-Ligase

    E. coli DNA-Ligase

    Ligase AMP

    Ligase

    AMP

  • In der Gentechnologie ist die Neukombination unterschiedlicher DNA- Moleküle wichtig.

    Das Verknüpfen von DNA- Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“

  • Für die Selektion der gewünschten rekombinanten Klone braucht man die Vektor-DNA

  • Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA

    AATT GGCC

    CCGG AATT

  • Funktionen der Vektor DNA

    • Sorgt für Replikation in der Wirtszelle • Stellt selektierbare Markergene bereit • Hat Vielzweck-Klonierungsstelle • Trägt Signalsequenzen für Genexpression • Verschiedenste Modifikationen für

    spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“ zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)

  • Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin, selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

  • Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin, selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

  • Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene

  • Plasmide als Vektoren

    Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende, meist zirkuläre DNA-Moleküle, die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen

  • Plasmid-DNA

    E. coli DNA

  • Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform

    „supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“ (links)

    http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg

  • aus Weaver/Hedrick

    z.B. Resistenzplasmide

  • Plasmide als Vektoren