Vstupy centrálních regulátorů:

checkpoints – reakce na poškození

a zpětná vazba

„cell cycle engine“

vstupy výstupy

velikostsignálypoškození ...

gen. expresemorfogeneze...

???

• Why do events occur in a particular order?

• How are superficially unrelated events kept in phase?

• How are growth and division co-ordinated?

• How does the cell know where to locate new structures?

(A.E. Wheals, 1976)

L. Hartwell a T. Weinert, 80.- 90. léta

cdc9

Ale proč??

K čemu je dobrá ligáza?

Je zástava cyklu důsledkem zlomů DNA?

Mutace zvyšující citlivost ke zlomům: rad (radiation sensitive)

wt

rad9

UV

(mrtvé se barví methylenovou modří)

UV dělá zlomy ... a co defekt ligázy??

wt, 37 oC rad9, 25 i 37 oC

(občas ztráta chromosomu)

cdc9, 37 oC cdc9rad9, 37 oC

RAD9 nutnýk bloku cyklupři poškození!

(Hartwell and Weinert 1988)

Model „kontrolních bodů“ (checkpoints)

• Existují mechanismy, které průběžně monitorují úplnost a „zdraví“ důležitých mechanismů BC a v případě poruchy cyklus zastaví, aby byl čas na opravu.

• RAD9 je součástí dráhy, která takto monitoruje celistvost DNA (DNA damage checkpoint).

poškozená DNAv S nebo G2/M

G2 M

Jak funguje RAD9 checkpoint?

• 2 epistatické třídy RAD genů– RAD17, RAD24,

MEC3 a DDC1– RAD9

• protein kináza MEC1 – detektor?

(Melo and Toczyski 2002)

Cíl 1:transkripce cyklinů(CLN via SCB, CLB via MCB)

Cíl 2:replikace - přes primázu

Cíl 3:securin(inhibitor separacechromosomů, substrát APC, který vyvazuje separasu)

Tenodera aridifolia sinensis

Replikace není jediným zdrojem rizika ...

Chromosomové určení pohlaví u kudlanky

♀: X1X2

X1X2

♂: X1X2

Y

Anafázi lze obnovit mechanickým tahem za kinetochor!

(Li a Nicklas 1995)

Anafáze Blok Anafáze

Jak kinetochor ví, že se za něj tahá?

(anti-phosphoprotein Ab)

(Li and Nicklas 1997)

Jak je to u kvasinek?

• benomyl – destrukce vřeténka a M arrest

• MAD/BUB geny: mitotic arrest deficient/budding uninhibited by benomyl

wt, benomyl mad/bub, benomyl

„Spindle checkpoint“

• Aktivace u kvasinek:– benomyl, nocodazol a jiné mt jedy– mutace SPB– mutace centromer (CDEIII)– nadpočetné centromery (mnoho různých YCp)

• Aktivace u hmyzu:– nepřichycené chromosomy

Blok anafáze: via APC

Co když se chromosom ztratí později?Bub2: část „dvousložkového“ GAP

(připomínka: Cdc14 je fosfatáza nezbytná pro mitotic exit)

Regulace přechodu Ana/Telo

Spindle checkpoint - cíle

securin/separáza transkripce

CKI

telofázní regulátor APC

A to ještě není vše!

cdc24cdc42

(1995)

Proč jsou Hartwellovi mutanti dvojjaderní, ale v jiném genetickém backgroundu jen 1 G2 jádro?

iniciace

terminace

segregace

Absence pupene zdržuje mitosu!

Obecně: cell morphogenesis checkpoint

Senzor: proteinové komplexy asociované se septiny

Cíl: inhibiční fosforylace CDC28 (Y19)!

Y19F a někt. kmeny

standardní wt

Pro kontrolu pupenem nutná fosforylace Y19 (homolog Y15)

T14

Y15

T161

T161

Y15

T14

T161

Y15

T14T14

Y15

T161

T14Y15

T161

cdc25

wee1

Cíle – širší pohled

(Saccharomyces wee1)

???

• Why do events occur in a particular order?

• How are superficially unrelated events kept in phase?

• How are growth and division co-ordinated?

• How does the cell know where to locate new structures?

(A.E. Wheals, 1976)

Kontrola velikostí: necyklující cyklin CLN3

G1 S G2 M"start"

Cln3

Cln1,2

Clb5,6

Clb3,4

Clb1,2

SWI4/6

velikostCLN3

CLN1,2

START

Jaký to má vztah k živinám?A jak je kvasinka vnímá?

• „Start II“ mutace:– blok ve Startu bez růstu

– „kvasinka si myslí, že hladoví“

• CDC25: GEF pro RAS!

CDC25 stimuluje produkci cAMP

Ras-GDP Ras-GTP

Cdc25

Ira1,2

Cyr1

GEF

GAP

adenylátcykláza

ATP AMP

Pde

fosfodiesteráza

inhibice nebo stimulace Startu?

Regulace proteinkinázy A pomocí cAMP

Cyr1

adenylátcykláza

ATP AMP

Tpk1,2,3 Tpk1,2,3

Bcy1

proteinkináza A(PK-A)

Bcy1

?

(Bypass of Cyr)

(zase jedna kináza regulovaná inhibitorem)

(Cyr1: sporulace na bohatých médiích etc.)

Kvasinková RAS/cAMP dráha

Ras-GDP Ras-GTP

Cdc25

Ira1,2

Cyr1

GEF

GAP

adenylátcykláza

ATP AMP

Pde

fosfodiesteráza

Tpk Tpk

Bcy1

proteinkináza A(PK-A)

Bcy1

inhibice nebo stimulace Startu?

Předpokládali bychom, že cAMP stimuluje, ale ...

(M.D. Baroni, Milano, Italy – Nature 371:339, 1994

asyn

chro

nní k

ultu

ra

... cAMP inhibuje BC, aby mohla vzrůst kritická velikost!

-f

acto

r re

leas

e

cAMP zprostředkuje spřažení cyklu a růstu u S. cerevisiae

• Cíl regulace přes Tpk/PK-A: nastavení citlivosti transkripce CLN1 a CLN2 vůči hladině CLN3

• Čím víc cukru, tím víc cAMP a tím víc CLN3 = větší velikost před startem!

• cAMP podobně reguluje i anafázi a mitotic exit (srv. S. pombe!) – inhibice APC prostřednictvím PK-A