Vývoj histologických technik s nahlédnutím do historie

Světlana KOPECKÁ 1

Lenka MARTINKOVÁ 2

Hana ŠIMKOVÁ 1

1 Neuropatologická laboratoř Ústavu experimentální neurochirurgie UK LF-HK a FN v Hradci Králové

2 Oddělení patologie, Nemocnice Náchod

První docent histologie na české Universitě Karlově:

Jan Janošík (1856 – 1927)

První histologický ústav na české universitě:

založen roku 1889

Jak se oficiálně etabloval vědní obor “histologie” na české univezitě

Histologie (z řečtiny histos = tkáň, logos = slovo, nauka)

Vyobrazení mikroskopu ze druhé poloviny 19. století.

Převzato:

Ottův naučný slovník; vydání z r. 1901.

Klasický mikroskop

- v principu se za posledních asi 130 let prakticky nezměnil.

Mikroskop - klíčová podmínka vzniku a rozvoje histologie

První složený mikroskop

- sestrojen již kolem roku 1590 v Holandsku: Hans Janssen a syn Zacharias;

- v Italii roku 1630 - Stelluci, Malpighi.

Další zdokonalení

- Amici v Modeně na počátku 19. století;

- postupně sériová výroba v manufakturách, až po vrcholné propracování,

zásluhou Abbého koncem 19. století - Zeissova továrna v Jeně.

Badatelské intenzívní využití pro biologické objekty (a zdokonalení):

- Holanďan - Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723),

- Angličan - Robert Hooke (1635-1703).

Proklamace buněčné teorie – kolem poloviny 19. století

Motto: Buňka je elementární součástí těl obou říší: rostlinné a živočišné.

Jan Evangelista Purkyně (1787 - 1869) - viz portrét

Theodor Schwann (1810 - 1882)

Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821 - 1902)

- zejména v aplikaci na poli celulární patologie, podle principu:

“Omnis cellula e cellula” = “Každá buňka pochází z další buňky”

Protagonisté

J. E. Purkyně - jako autor zásadních biologicko-medicínských objevů, jakož i průkopník histologických technik

Hlavní objevy- mikroskopická stavba kůže- objev kostních buněk, skladba kosti kolem Haversových kanálků- podrobnosti stavby dentinu a skloviny zubní, dentinové kanálky- stavba žaludeční sliznice- buněčná struktura žláz s vnitřní a vnější sekrecí- nervové pleteně v mnohých orgánech - vlákna převodního systému v srdci- nervová vlákna nejsou dutá, ale obsahují axon- Purkyňovy buňky v CNS

Technologický přínos

- fixace měkkých tkání- dekalcifikace- výbrusy kostí a zubů- metody řezání preparátů (mikrotom pojmenoval a popsal Purkyňův žák A. Oschatz)

Santiago Ramón y Cajal

1852 - 1934

Snímek z Valencie z roku 1933

Převzato z publikace:

J. DeFelipe. TRENDS in Neurosciences, 25 (9): 481-484 (2002).

Významný představitel objevů a koncepcí v histologii nervového systému

FIXACE a její prostředky

CÍL: zastavení procesu autolýzy, denaturace bílkovin, zachování objemu preparátu.Používané fixační tekutiny: alkohol, kyselina chromová, kyselina pikrová, kyselina octová.

Formaldehyd - historické souvislosti:• r. 1859 - poprvé jej syntetizoval Alexandr Butlerov (známý ruský chemik);• r. 1867 - Hoffman teprve definitivně potvrdil jeho chemickou strukturu;• Ottův naučný slovník (vydání z r. 1895) popisuje formaldehyd jako „novum“ v histologii;• v poslední čtvrtině 19. století však již jistě používán byl (L. Pasteur, mozky, vzteklina).

Sušení tkáně - stará běžná technika pro fixaci a přípravu tkáně ke krájení:• r. 1720 Leeuwenhoek;• o 150 let později – Altmann vysoušel tkáň v exsikátoru nad kyselinou sírovou;• r. 1932 Gersch zkonstruoval lyofilizační aparát; • r. 1963 Pearse zavedl termoelektrický kryostat s vysoušením.

Kryostat - počátky vývoje: r. 1938 Lang a Morgensen.

Historický pohled na jednotlivé kroky histologických technik

ZALÉVÁNÍ

První zalévací média: mýdlo, pryskyřice, celoidin, vosk, želatina.

• r. 1869 Edwin Klebs – vynikající patolog i metodik: metoda zalévání parafínem;

• dnešní způsob, spojený s „prosycením“ preparátu, byl uplatňován až později;

• r. 1959 McCormick z Chicaga popsal metodu formace parafinových bločků s použitím plastikového prstence, což byl předchůdce dnešních kazet (formiček);

• od roku 1966 začíná automatizace různých kroků histologických technik, např. odvodnění (AUTOTECHNIKON, různé systémy tzv. „Tissue-Tek“).

KRÁJENÍ

MIKROTOMY:

Přístroje (obecně) nazvané podle Purkyněho; rozvoj v polovině 19. století.

ruční – v principu dobře nabroušená břitva, zdokonalil ji profesor Toldt;

strojové – sáňkové, rotační, zmrazovací.

RUČNÍ MIKROTOM

Je opatřen mikrometrickým šroubem (dole) pro odměření tlouštky řezu a zařízením pro uchycení preparátu.

Ilustrace převzata z knihy:

J. Wolf: Mikroskopická technika, nakl. „Vesmír“ s.r.o.; Praha 1940. Str. 305.

MIKROTOM ze 2. pol. 19. století.

(Převzato: Ottův naučný slovník; vydání z r. 1901.)

Podobnost s dnešním mikrotomem je přinejmenším sugestivní.

Prehistoricky: Již nejméně 3 tisíce let čítá éra barvení indigem (starověký Egypt).

• V 19. století je zde evidentní návaznost - a také podmíněnost - s rozvojem v textilním a kožedělném průmyslu.

• Je také jasná souvislost s objevem principu fotografie a jejím rozvojem (vč. impregnací).

• Prvním a nejvíce používaným barvivem byl karmín (má několik chemických variant).

• Klíčový objev anilinových barviv (1856) Henryho Perkina: nejprve pro průmysl a poté i pro mikroskopii se tím otevřela revoluční éra. (To se mimochodem promítlo i do tisku poštovních známek v Britanii za vlády královny Viktorie. Objevitel byl r. 1906 povýšen do šlechtického stavu.)

• Hematoxylin (znám nejméně od r. 1863) a eosin (dokumentovaně používaný v histologii již kolem roku 1870) - viz další snímek.

• Trichromová barvení, systematicky používaná od r.1900 (viz dále).

BARVENÍ - průmyslové kořeny a vlivy na histologii

Hematoxylin (HE)

• První zmínka - 18. století (Reichel).• Waldayer (1863) - extrakt ze dřeva (Hematoxylon campechianum).• Bohmer (1865) - poprvé publikoval postup barvení.• Ehrlich (1886) - aplikoval kyselinu octovou ve směsi.• Mayer (1891) - oxidační produkt HE - hematein.• 1900 Harris (1900) - kamencový HE.• Weigert (železitý HE) - a další barvicí varianty.

O

OH

OH

OH

OH

OHHEMATOXYLIN

O

OOH

OH

OH

OHHEMATEIN

Na+

Na+

OO-

O

O-

Br

O

Br

BrBr

EOSIN

Eosin (E) a pozdější kombinace s hematoxylinem (H & E):

• 60. – 70. léta 19. století – barvení eosinem v 1 kroku.• Dreschfeld a Fischer – sjednocení H+E do 1 postupu.• 1867 - Schwarz rozvinul sekvenční metodu (obě barvy).• 1869 - zavedena tzv. diferenciace alkoholem.

Vývoj barvicích kombinací - „TRICHROMY“

Prvé pokusy o kombinace „vícebarevných“ technik již v 80. letech 19. století:

Koch v r. 1882 - methylenová modř (alkalická) pro barvení bacilů „tbc“ s dobarvením Bismarckovou hnědí; Ehrlich (1982) toto obměnil za anilin/methylvioleť + methylen. modř.

Ziehl (též 1982) nahradil barvení anilinem (výše), a to fenolem s methylvioletí.

Neelsen (1983) zaměnil methylvioleť bazickým fuchsinem. (Mimochodem - spolu s Ehrlichem se při bádání nakazili „tbc“, přičemž Neelsen na ni zemřel ve 40 letech, zatímco Ehrlich se vyléčil a ještě dlouho žil).

Mallory na poč. 20. století se stal klasikem „trichromu“, podobně jako později Masson.

Gram, další z mikrobiologů, použil Lugolův roztok následně po obarvení genciánovou violetí, spíše náhodně, což vedlo ke známému barvení „Gram-pozitivních baktérií“.

van Gieson, Leishman, Giemsa, Romanowski, Unna, Pappenheim a jiní pak byli dalšími autory významných modifikací metody na přelomu 19. a 20. století.

Další vývoj barvení – zahrnuje např. „kongo-červeň“ (jež má dlouhou historii jako barva pro bavlnu od r. 1884), ale dalších téměř 50 let obohacovala histologii (axony, amyloid).

Vývoj sofistikovanějších metod pokračoval až do poloviny 20. století - Gömöri, Steedman, Kluver, Barrera a další…

Elektronový mikroskop 1924 Busch – prokázal možnost fokusace svazku elektronů magnetickým polem; 1931 Ruska a Knoll - zkonstruovali první elektronový mikroskop.

Enzymová histochemie – průkaz přítomnosti a aktivity enzymů ve tkáni po počátcích v 1. pol. 20. století bouřlivý rozvoj v 60. letech (nárůst o stovky enzymů); výrazný příspěvek (mezi mnoha jinými badateli) je od prof. MUDr. Z. Lojdy; dnes této technice (vědecky i diagnosticky) značně konkuruje imunohistochemie.

Imunohistochemie - průkaz antigenu pomocí protilátky (a jejího značení) 1941 – Coons se spol. poprvé konjugovali a použili protilátku s fluoresceinem (FITC); 1950, 1955 – identifikace antigenu ve tkáni, spolu s rozvojem fluorescenční mikroskopie. První použití enzymu (křenové peroxidasy) a substrátu, jako techniky pro značení protilátek s cílem vizualizace – 1966 Nakane a Pierce a zároveň Avremeas a Uriel). Od 70. let –zavedení (zejména Avremeas se spol.) dalších enzymů do techniky IHC, jako jsou nyní často užívané: alkalická fosfatasa, beta-galaktosidasa, glukosaoxidasa. 1975 – počátek revoluční éry s použitím monoklonálních protilátek v oboru IHC: přináší standardizaci protilátky prakticky na úrovni definované „chemikálie“.

Molekulární genetika – aplikace metod v histologii - SOUČASNOST „In situ“ hybridizace (ISH), založená na interakci definované „sondy“ s DNA; varianty detekce při ISH: simultánní autoradiografie nebo fluorescence (mFISH).

DALŠÍ ETAPY ROZVOJE

D Ě K U J I Z A P O Z O R N O S T

Dík patří: prof. MUDr. Z. Nožičkovi, DrSc, a doc. MUDr. J. Cermanovi, CSc., za pomoc s historickými literárními prameny a za kritické připomínky k textu.

Studie byla vytvořena za podpory Výzkumného záměru MSM 0021620820, MŠMT České republiky.

Hradec Králové, Staré náměstí