vÝzkumnÝ Ústav rostlinnÉ vÝroby v i...měří 104-135 µm od předního konce. nervový...
TRANSCRIPT
VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I.
Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi
pomocí polymerázové řetězové reakce
Shesh KumariPraha, 2008
Metodika pro praxi
Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a
X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce
Ing. Shesh Kumari, Ph.D.
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Odbor rostlinolékařství Drnovská 507, Ruzyně
16106 Praha 6 Česká republika
Email: [email protected]
VÚRV, v.v.i., Praha 2008
Tato publikace vznikla s podporou grantu MZe 0002700603
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008
ISBN: 978-80-87011-98-0
Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu. Bude využita pro molekulární
identifikace háďátek druhu X. diversicaudatum a X. vuittenezi.
Oponenti:
Ing. Vladimír Gaar
Státní rostlinolékařská správa Diagnostická laboratoř Praha Drnovská 507, Ruzyně 161 06 Praha 6
Ing. Petr Svoboda, CSc.
Chmelařský Institut s.r.o. Kadaňská 2525, Žatec 438 46
Metodika byla schválena MZe ČR pod č.j. 47822/2008-18020
Obsah
1 Cíl metodiky.......................................................................................... 1
2 Morfologické a morfometrické metody ............................................. 1
2.1 Úvod ................................................................................................................. 1
2.2 Obecná charakteristika rodu Xiphinema ........................................................... 2
2.3 Stručný popis Xiphinema diversicaudatum ...................................................... 4
2.4 Stručný popis Xiphinema vuittenezi.................................................................. 9
3 Molekulární metodika ....................................................................... 13
3.1 Extrakce DNA ............................................................................................... 13
3.2 Pre-PCR .......................................................................................................... 15
3.3 PCR................................................................................................................. 20
3.4 Post-PCR......................................................................................................... 21
4 Výsledky elektroforézy ...................................................................... 24
5 Srovnání ″novosti postupů″.............................................................. 25
6 Závěr.................................................................................................... 25
7 Literatura............................................................................................ 27
7.1 Použitá literatura ............................................................................................. 27
7.2 Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR ......................................................... 29
7.3 Původní poznatky ze světa k PCR .................................................................. 29
8 Přílohy ................................................................................................. 30
8.1 Jak se vyhnout PCR kontaminaci ................................................................... 30
8.2 Přepočty .......................................................................................................... 32
8.3 Potřebné věci .................................................................................................. 34
8.4 Referenční materiál......................................................................................... 36
1 Cíl metodiky
Hlavním cílem této práce je rychlá identifikace druhů háďátek X. diversicaudatum a
X. vuittenezi pomocí spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové
reakce (PCR).
2 Morfologické a morfometrické metody
2.1 Úvod
Fytoparazitická háďátka rodu Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) způsobují přímé škody
rostlin napadením jejich kořenových buněk. Některé druhy jsou i přenašeči nepovirů a jsou
ekonomicky významné (Taylor and Brown 1997), proto rod Xiphinema postupně dostává větší
taxonomickou pozornost. Nárůst počtu nových druhů, z nichž je mnoho morfologicky a
morfometricky podobných, zdůrazňuje potřebu dalšího precizního zkoumání a diagnostické
charakteristiky. Nutnost přesné identifikace druhů je klíčová pro studia jejich škodlivosti,
vztahu virus-vektor a efektivní kontrolu. Identifikace druhů Xiphinema je založena hlavně na
morfologických znacích a morfometrických datech samiček (Loof a Luc, 1990; 1993; Loof a
kol., 1996). Druhy Xiphinema je taxonomicky těžké identifikovat i pro zkušeného nematologa,
protože morfologické a morfometrické hodnoty jednotlivých druhů se silně překrývají. Kromě
toho se jedna populace může skládat z více druhů. Navíc, jestliže jsou v půdních vzorcích
nalezeny pouze larvy, může být mikroskopická identifikace problematická.
Poměrně nová studia (Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005) mají velký potenciál pro
molekulární identifikace druhů Xiphinema. Wang a kol. (2003) navrhovali druhově specifické
primery pro čtyři druhy rodu Xipinema a pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je
úspěšně aplikovali pro identifikaci druhů X. diversicaudatum; X. index; X. italiae a X. vuittenezi.
Ovšem pro běžnou praxi je optimalizovaná metoda PCR použitím jednotlivých chemikálií
časově náročná, proto je v této metodice zpracována rychlá diagnostika háďátek druhů X.
diversicaudatum a X. vuittenezi použitím PCR kuliček (PCR-beads).
Ačkoli bylo dokázáno, že pro rutinní identifikaci fytoparazitických háďátek je základní
diagnostika DNA rychlejší než tradiční strategie použití morfologie a morfometrických hodnot
(Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005), je morfologická identifikace dosud nezbytným
předpokladem pro základní diagnostiku DNA. Kombinace molekulárních a morfologických
studií může být nejspolehlivějším přístupem pro identifikaci druhů Xiphinema. Proto je v této
metodice také prezentován krátký popis dvou druhů.
1
2.2 Obecná charakteristika rodu Xiphinema
Kmen Nematoda Třída Adenophorea Podtřída Enoplia Řád Dorylaimida Podřád Dorylaimina Nadčeleď Dorylaimoidea Čeleď Longidoridae Podčeleď Xiphineminae Rod Xiphinema
Volně žijící fytofágní háďátka rodu Xiphinema (Cobb, 1913) jsou polyfágní a několik
druhů je vektory nepovirů (Taylor a Brown, 1997). Tato dlouhá háďátka (1 až 6 cm) se
odlišují od dalších parazitických háďátek dlouhým styletem od 89 m (X. lamberti) až
po 336 m (X. filicaudatum), s vidlicovitým odontostyletem a odontoforem s patkami.
Odontofor s bazálními křídly je rozlišujícím znakem rodu Xiphinema (obrázek 1).
Odontostylet je spojen s cheilostomou epidermální, různě zahnutou membránou (vodicí
prstenec). Dvojitý vodicí prstenec je umístěn na odontostyletu, těsně před jeho spojením
s odontoforem. Amfidní póry mají širokou štěrbinu a amfidní váček je nálevkovitý.
Hlavová část je kulatá nebo lehce zploštělá, navazuje na tělní obrys nebo je spojená se
spojovacím článkem. Pysky jsou sloučeny, obvykle s uspořádáním papil v počtu 6 + 10.
Dvoudílný jícen je typický pro Dorylaimida - užší přední trubicovitá část (která je
obvykle jako smyčka, když je odontostylet ve stažené pozici) a zduřený žláznatý a
svalnatý zadní bulbus. Jícnové žlázy jsou tři (dvě ventrosublaterální a jedna dorzální).
Střevo je jednoduché, dobře vyvinuté prerektum je několikrát delší než šířka těla v
oblasti anusu. Vulva se obvykle nachází ve středu párových gonád, občas se může
nacházet před nebo za mediánem.
Svalnatá vagina vedoucí k mohutnému ovijektoru leží v pravém úhlu k tělní ose a je
dobře vyvinuta. Genitální trakty jsou typicky amfidelicky zahnuté, ale mohou být i
pseudomonodelfické nebo mono-opistodelfické. Struktura gonád je často rozdílná, s
charakteristickými rysy pro jednotlivé druhy. Samičky mohou mít jeden nebo dva
vaječníky. Pokud se vyskytují oba vaječníky, jsou umístěny naproti sobě a zahnuty.
2
Obrázek 1 . Xiphinema. A: Přední část prvního larválního stadia; B: Přední část
druhého až čtvrtého larválního stadia; C: Přední část samičky; D: Celkový tvar
samečka; E: Celkový tvar samičky; F-M : Ocas samičky a samečka ( X. pachtaicum, X.
vuittenezi, X. diversicaudatum a X. brevicollum). 1: Funkční stylet; 2: Náhradní stylet;
3: Odonstostylet; 4: Odontofor; 5: Vodící kroužek; 6: Bazální křídla; 7: Mukro; 8:
Přídatné kopulační orgány. (částečně podle Kumari, 2005)
3
Genitální trakt samečků je diorchický, protikladný, zadní varle bývá zahnuto. Obě
varlata jsou spojena společným chámovodem těsně před kloakou. Spikuly jsou
dorylaimoidní, velké a párové. Kopulační svaly jsou šikmé a prominentní. Kopulační
přídatné orgány jsou ve formě adanálních párů a poté ventromediální série pěti až
deseti papil. Počet a uspořádání těchto papil má význam pro charakteristiku druhů.
Samečci mají párové spikuly, ale nemají gubernákulum ani burzu.
Tvar ocasu je rozdílný, ale většinou podobný u každého pohlaví. Ocas může být
krátký, zaoblený ale i zúžený, kuželovitý, zřídka i nitkovitý.
2.3 Stručný popis Xiphinema diversicaudatum
Obrázek 2; Tabulky 1 a 2
Samičky
Teplem usmrcení jedinci Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne,
1939 jsou na ventrální straně zahnuti do otevřené spirály. Tělní pokožka je hladká,
vnější vrstva užší než vnitřní. Hlavová část je malá, hladce zaoblená, spojená s tělním
obrysem. Amfidy jsou třmínkovité, postlabiální, téměř stejně široké jako oblast pysků.
Délka těla je 3,4-5,4 mm. Odontostylet je dlouhý 120-147 µm, na bázi zřetelně
rozvětvený. Odonofor s nápadnými bazálními křídly měří 67-91 µm. Vodící kroužek
měří 104-135 µm od předního konce. Nervový prstenec je malý a nachází se za
odontoforem. Jícen je dorylaimoidní (dvoudílný jícen - užší trubicovitá přední část a
zduřený žláznatý a svalnatý zadní bulbus). Jádro dorzální jícnové žlázy se nachází
blízko předního konce jícnového bulbusu a subventrální žlázy blízko středu. Vulva ve
tvaru příčné štěrbiny je umístěna ve 38-45% těla. Genitální trakt je amfidelický,
zahnutý. Každý vejcovod a děloha jsou připojeny pomocí svěrače. Nápadný pseudo Z-
orgán je přítomen a skládá se z 10-20 nepravidelných, 3-10 µm dlouhých kulovitých
orgánů podobných květáku. Prerektum je 7-12 krát delší než šířka těla. Rektum je
kratší než šířka těla v oblasti anusu. Ocas je kuželovitý, dorzálně vypuklý, ventrálně
poněkud zploštěný, zakončený s prstovitě zakulaceným, 7-14 µm dlouhým mukrem. U
některých jedinců mukro chybí, což je pravděpodobně způsobeno mechanickým
poškozením.
4
Obrázek 2: Xiphinema diversicaudatum. A-F Celá háďátka. A: Sameček; B: Samička;
C: J4; D: J3; E: J2; F: J1. G: Zadní pohlavní větev (šipka znázorňuje Z-orgán); H:
Bulbus jícnu samičky; I: Vulva; J: Přední část těla samičky; K: Ocas samičky bez
mukra; L: Ocas samičky s mukrem; M: Ocas samečka; N: Ocas J1; O: Ocas J2; P: Ocas
J3; Q: Ocas J4. ( podle Kumari, 2006)
5
6
Samečci
Samečci se obvykle vyskytují ve stejném počtu jako samičky, reprodukce je
amfimiktická. Tvar těla, hlavová část, odontostylet a jícen jsou popsány stejně jako u
samiček. Dvě varlata jsou umístěna napravo od střeva, jedno je zepředu roztaženo,
druhé zahnuto; chámovod je vyplněn vřetenovitými spermiemi. Kopulační přídatné
orgány se skládají z jednoho adanálního páru a 3-7 párů na ventrální straně. V oblasti
přídatných orgánů se nachází silné šikmé kopulační svaly způsobující silné zakřivení
ocasu. Spikuly jsou 63-79 µm dlouhé, v blízkosti středu na ventrální straně zahnuté.
Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti kopulačních svalů.
Larvy
Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu
odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle
funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na
přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží v odontoforu funkčního
odontostyletu (viz obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se
shoduje s délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (viz Tabulka 1). Pouze larvy
čtvrtého stadia mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stádií je více zúžen
s nezřetelným mukrem. První larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na ventrální
straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 2).
Lokalita
HostitelJedinci J1 J2 J3 J4 ♀ ♂ ♀ (menší)
n 7 6 18 14 22 10 1L 1010 ± 81 1445 ± 90 2274 ± 210 3241 ± 349 4644 ± 369 4591 ± 307 3245
(873-1102) (1320-1550) (1817-2559) (2636-3859) (3974-5484) (4154-5126)a 42,6 ± 2,80 43,0 ± 2,42 51,9 ± 4,15 59,6 ± 5,07 64,5 ± 3,25 69,5 ± 3,78 52,3
(36,7-45,1) (39,6-45,6) (46,5-60,5) (52,0-71,2) (59,5-69,9) (65,0-76,7)b 4,1 ± 0,40 4,9 ± 0,29 5,9 ± 0,59 7,2 ± 0,76 9,5 ± 0,93 8,9 ± 0,52 7,6
(3,4-4,6) (4,6-5,3) (4,9-7,1) (6,1-8,3) (7,8-11,4) (8,1-10,0)c 18,2 ± 1,14 23,6 ± 1,94 40,0 ± 5,91 61,5 ± 9,00 102,6 ± 8,95 96,0 ± 9,61 75,5
(16,5-20,1) (20,6-26,3) (31,7-56,3) (48,0-78,8) (88,3-121,1) (78,8-108,9)c΄ 3,64 ± 0,28 2,71 ± 0,32 1,84 ± 0,24 1,31 ± 0,13 0,88 ± 0,08 0,99 ± 0,06 0,91
(3,36-4,07) (2,46-3,30) (1,40-2,21) (1,17-1,65) (0,73-1,02) (0,92-1,09)V/spikuly — — — — 40,0 ± 1,49 74 ± 5,09 42,5
(37,7-43,2) (67-85)Náhradní stylet 67 ± 2,27 88 ± 5,05 111 ± 5,32 136 ± 4,99 — — —
(62-69) (81-95) (97-118) (129-145)Odontostylet 51 ± 1,38 64 ± 1,17 87 ± 3,12 108 ± 4,26 132 ± 4,69 132 ± 4,74 111
(49-52) (63-66) (81-93) (99-113) (123-138) (124-140)Odontofor 37 ± 1,90 46 ± 1,67 57 ± 2,06 69 ± 3,07 81 ± 3,11 80 ± 2,79 73
(34-39) (44-49) (53-61) (63-73) (76-86) (75-84)
Celková délka styletu 87 ± 2,69 110 ± 2,32 144 ± 6,51 178 ± 5,87 213 ± 6,36 212 ± 5,87 184
(83-90) (107-114) (125-154) (168-186) (200-224) (202-220)
Největší šířka křídel 7 ± 0,58 9 ± 0,55 10 ± 0,99 11 ± 0,73 12 ± 0,75 12 ± 1,37 13
(6-8) (8-9) (8-11) (10-13) (11-14) (9-14)
41 ± 1,83 54 ± 4,13 79 ± 5,45 94 ± 8,17 120 ± 9,31 120 ± 8,08 108
(39-44) (50-62) (69-93) (78-107) (104-135) (109-133)
Délka bulbusu jícnu 61 ± 5,19 72 ± 4,68 85 ± 5,18 96 ± 6,59 108 ± 6,62 109 ± 5,59 102
(51-65) (64-76) (69-91) (83-109) (94-118) (102-119)
Šířka bulbusu jícnu 14 ± 2,23 20 ± 1,83 24 ± 2,61 27 ± 2,83 32 ± 3,59 31 ± 2,84 34
(12-18) (18-23) (18-28) (23-32) (26-40) (25-35)
Délka ocasu 56 ± 4,47 62 ± 4,42 57 ± 5,07 53 ± 4,60 45 ± 4,19 48 ± 5,35 43
(47-60) (55-66) (42-63) (48-61) (38-52) (40-57)
Délka hyalinních pysků 9 ± 1,11 15 ± 2,28 19 ± 2,32 16 ± 1,79 16 ± 2,68 17 ± 2,23 14
(7-10) (11-18) (14-23) (14-19) (11-21) (14-21)
Průměr těla v oblasti pysků 7 ± 0,53 8 ± 0,52 10 ± 0,84 11 ± 0,61 13 ± 0,75 13 ± 0,74 12
(7-8) (8-9) (8-12) (10-12) (12-14) (12-14)
u vodícího kroužku 16 ± 0,38 23 ± 1,94 29 ± 2,43 35 ± 3,20 45 ± 3,31 42 ± 4,01 40
(16-17) (20-25) (26-35) (29-40) (40-50) (36-47)
na bázi jícnu 23 ± 2,21 32 ± 3,01 41 ± 4,58 51 ± 6,96 63 ± 4,44 59 ± 5,38 56
(20-27) (28-36) (29-48) (37-61) (56-70) (50-66)
u vulvy 24 ± 3,24 34 ± 2,66 44 ± 5,43 55 ± 7,27 72 ± 4,79 66 ± 5,07 62
(20-30) (31-38) (30-54) (37-65) (64-83) (58-73)
u anusu 15 ± 1,38 23 ± 1,94 31 ± 3,53 41 ± 3,46 52 ± 5,15 48 ± 3,62 47
(13-17) (20-26) (25-39) (32-46) (42-63) (42-53)
na počátku hyalinní části 6 ± 0,76 8 ± 0,82 11 ± 0,98 17 ± 1,45 24 ± 3,03 24 ± 4,11 22
(6-8) (7-9) (9-13) (14-19) (19-28) (18-32)
7
višeňBílé Podolí
Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek
Tabulka 1. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari 2006)
ZeměČeská
republikaJugoslávie Slovensko
Česká republika
Jugoslávie Slovensko
ReferenceKumari a kol.,
2005
Barsi a Lamberti ,
2000a
Lišková a kol., 1992
Kumari a kol., 2005
Barsi a Lamberti,
2000a
Lišková a kol., 1992
Jedinci ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂
n 22 17 7 16 10 7L 4679 ± 254 4200 ± 300 4300 4686 ± 244 4200 ± 290 4400
(3993-4991) (3680-4640) (4000-4600) (4304-5133) (3740-4730) (4100-4700)a 66,9 ± 5,38 78 ± 5,31 78,0 70,0 ± 3,98 78,6 4,45 89,0
(57,1-76,5) (65,6-88,3) (73-82) (62,6-75,2) (72,9-86,4) (86-91)b 10,0 ± 0,59 8,9 ± 0,82 9,2 9,1 ± 0,67 8,7 0,43 9,2
(8,8-11,0) (7,6-11,2) (8,7-10,7) (8,2-11,0) (8,1-9,5) (8,2-11,3)c 93,0 ± 9,74 84,8 ± 5,71 86,0 84,1 ± 7,62 78,3 4,71 90,0
(77,5-120,0) (77,2-101,7) (73-94) (73,7-98,3) (70,2-83,3) (80-96)c΄ 1,03 ± 0,09 1,18 ± 0,06 1,20 1,17 ± 0,10 1,22 ± 0,13 1,00
(0,87-1,20) (1,04-1,28) (1,0-1,3) (1,04-1,32) (0,98-1,48) (1,0-1,2)V/spikuly 44 ± 1,18 42,9 ± 1,50 43 72 ± 3,43 69,8 ± 2,66 69
(41-45) (40,4-45,2) (42-45) (63-79) (65,7-72,8) (63-70)Odontostylet 129 ± 3,76 130 ± 3,16 142 131 ± 4,19 130 ± 6,61 135
(121-135) (124-134) (133-147) (125-138) (120-141) (133-143)Odontofor 85 ± 3,12 75 ± 2,26 76 86 ± 3,00 74 ± 2,36 79
(79-89) (70-79) (70-80) (81-91) (70-76) (77-84)Celková délka styletu 213 ± 4,46 204 ± 4,26 217 ± 5,47 204 ± 8,0
(205-221) (196-213) (208-227) (195-216)Největší šířka křídel 13 ± 0,83 13 ± 0,93
(11-15) (11-14)
117 ± 5,93 115 ± 3,79 129 123 ± 5,73 118 ± 5,37 123
(107-126) (107-121) (119-133) (112-131) (112-128) (105-133)Délka bulbusu jícnu 101 ± 5,59 114 ± 6,00
(94-114) (103-126)Šířka bulbusu jícnu 30 ± 3,25 28 ± 2,30
(23-37) (22-32)Délka ocasu 51 ± 4,47 50 ± 3,41 50,00 56 ± 5,00 54 ± 4,84 48
(40-60) (43-54) (49-56) (47-66) (47-64) (44-54)Délka hyalinních pysků 18 ± 1,74 16 ± 2,70 21 18 ± 1,85 17 ± 1,89 19
(15-21) (8-19) (19-21) (14-20) (14-21) (14-22)Délka mukra 10 ± 1,51 12 ± 1,25
(7-13) (9-14)Přídatné orgány — 6 ± 0,93
(4-8)Průměr těla v oblasti pysků 13 ± 0,87 14 ± 0,30 14 14 ± 0,70 14 ± 0,38 13
(12-15) (13-14) (13-14) (12-15) (13-14) (10-14) u vodícího kroužku 43 ± 3,36 38 ± 1,07 38 42 ± 1,67 38 ± 1,38 36
(39-51) (36-40) (35-41) (40-45) (36-40) (35-38) na bázi jícnu 60 ± 5,12 48 ± 1,99 48 58 ± 4,78 48 ± 1,90 48
(53-68) (44-51) (42-49) (49-66) (43-50) (45-49) u vulvy 70 ± 5,52 54 ± 3,53 55 67 ± 4,06 54 ± 2,37 49
(60-79) (48-60) (52-56) (60-72) (47-55) (43-54) u anusu 49 ± 4,11 42 ± 1,59 44 48 ± 2,12 44 ± 2,17 46
(40-57) (38+44) (42-49) (43-52) (41-48) (42-49)
na počátku hyalinní části 24 ± 2,67 19 ± 2,69 25 19 ± 2,21 20 ± 3,37 24(20-31) (10-21) (21-28) (15-23) (15-25) (21-28)
* hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky
8
Tabulka 2. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum z České republiky (Hrušky), Slovenska a Jugoslávie.Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)*
Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek
2.4 Stručný popis Xiphinema vuittenezi
Obrázek 3; Tabulky 3 a 4 Samičky
Tělo Xiphinema vuittenezi Luc, Lima, Weischer & Flegg, 1964 je protáhle válcovité
(2,6-4,1 mm) a má tvar otevřené spirály s větším zakřivením v jeho zadní polovině.
Kutikula má zřetelnou vnější vrstvu v oblasti pysků. Hlavová část je hemisférická,
zvýrazněna nepatrným důlkem za amfidními póry. Amfidy jsou třmínkovité, se
štěrbinou podobnou pórům téměř stejně dlouhou jako šířka oblasti pysků. Amfidní póry
jsou někdy viditelné jako nezřetelná čára. Odontostylet měřící 116-139 µm, je na bázi
rozvětven, čímž vytváří pevné spojení k 66-92 µm dlouhému odontoforu se třemi
velkými bazálními křídly. Vodicí kroužek měří 91-133 µm od předního konce. Nervový
prstenec je malý a nachází se za odontoforem. Jícen je dorylaimoidní. Střevo obsahuje
rozptýlené granule a vakuoly. Vulva (46-57%) je hluboká, s příčnou štěrbinou a
svalnatým pyskem. Spermatéka je 2-3 krát delší než šířka těla. Vaječníky jsou zahnuty.
V děloze se obvykle nachází tenké, neidentifikované, 8-10 µm dlouhé orgány (pseudo
Z-orgány). Prerektum je 10krát delší než šířka těla. Ocas je kuželovitý, dorzálně
vypuklý, ventrálně poněkud zploštěný, s prstovitě zakulaceným, 2-6 µm dlouhým
mukrem. U některých jedinců mukro chybí, což je způsobeno mechanickým
poškozením. X. vuittenezi má v porovnání s X. diversicaudatum kratší mukro, umístěné
více ve středu ocasu, zatímco X diversicaudatum má mukro delší a je umístěno více
ventrálně.
Samečci
Samečci tohoto druhu jsou hodně vzácní, rozmnožování je partenogenetické. Přední
část těla se podobá samičkám. Zadní část těla je na ventrální straně silně zakřivena. Mají
dvě roztažená varlata, umístěná naproti sobě. Spikuly jsou poměrně rovné, 58-68 µm
dlouhé. Na ventrální straně se nachází jeden adanální pár a 4-5 párů kopulačních
přídatných orgánů. Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti
kopulačních svalů.
Larvy
Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu
odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle
funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na
9
10
Obrázek 3: Xiphinema vuittenezi. A-D: Přední část těla J1- J4; E-H: Ocas J1-J4; I:
Stylet samičky; J, K: Přední část těla a ocas samečka; L: Ocas samičky bez mukra; M:
Ocas samičky s mukrem. (podle Kumari, 2004)
Lokalita
Jedinci J1 J2 J3 J4 ♀ ♂n 12 13 17 19 28 3L 850 ± 48 1247 ± 99 1632 ± 93 2430 ± 96 3379 ± 223 3346 ± 33
(798-949) (1086-1402) (1466-1765) (2214-2619) (3008-4109) (3313-3379)a 32,6 ± 2,19 41,0 ± 3,00 38,7 ± 3,10 41,4 ± 2,05 52,3 ± 2,97 55,0 ± 3,40
(29,7-36,3) (36,5-46,9) (33,7-44,6) (36,9-44,9) (48,3-60,9) (52,0-58,7)b 3,6 ± 0,28 4,1 ± 0,35 4,3 ± 0,43 5,3 ± 0,20 6,9 ± 0,54 6,9 ± 0,29
(3,3-4,2) (3,5-4,5) (3,0-4,8) (5,0-5,8) (6,0-8,3) (6,7-7,2)c 18,1 ± 1,13 25,6 ± 1,64 37,4 ± 2,26 59,6 ± 5,08 90,9 ± 8,13 83,1 ± 3,95
(16,3-20,0) (23,4-29,0) (32,1-41,4) (49,7-69,1) (79,0-108,5) (78,6-85,8)c΄ 2,90 ± 0,36 2,34 ± 0,21 1,39 ± 0,14 0,94 ± 0,07 0,81 ± 0,08 0,91 ± 0,06
(2,32-3,42) (2,04-2,72) (1,13-1,71) (0,85-1,05) (0,70-1,03) (0,86-0,98)V/spikuly — — — — 51 ± 1,12 65 ± 2,08
(49-55) (63-67)Náhradní stylet 62 ± 1,42 84 ± 3,96 108 ± 3,98 130 ± 2,55 — —
(60-64) (72-88) (102-114) (126-136)Odontostylet 51 ± 1,07 62 ± 1,26 83 ± 4,25 105 ± 2,95 128 ± 4,44 128 ± 1,00
(48-52) (59-63) (75-90) (100-112) (117-134) (127-129)Odontofor 37 ± 1,04 49 ± 1,90 57 ± 1,80 69 ± 1,92 78 ± 2,39 79 ± 1,15
(36-39) (44-51) (54-60) (66-72) (73-82) (78-80)Celková délka styletu 88 ± 1,23 110 ± 2,61 140 ± 5,71 174 ± 2,79 206 ± 5,30 207 ± 2,08
(85-89) (105-114) (129-150) (167-181) (192-213) (205-209)Největší šířka křídel 8 ± 0,67 9 ± 0,49 11 ± 1,07 12 ± 0,90 13 ± 0,90 13 ± 0,58
(7-9) (8-10) (9-13) (11-14) (11-15) (12-13)41 ± 1,57 57 ± 1,91 76 ± 3,10 96 ± 4,18 108 ± 5,00 105 ± 1,15(38-43) (53-61) (69-81) (86-104) (101-118) (104-106)
Délka bulbusu jícnu 70 ± 3,98 83 ± 4,54 96 ± 5,24 115 ± 5,44 126 ± 5,55 124 ± 2,00(62-76) (76-89) (81-103) (107-129) (115-137) (122-126)
Šířka bulbusu jícnu 14 ± 1,80 15 ± 1,12 20 ± 2,38 24 ± 2,45 29 ± 2,71 30 ± 2,08(11-17) (13-17) (16-24) (19-28) (24-35) (28-32)
Délka ocasu 47 ± 2,31 49 ± 2,69 44 ± 2,66 41 ± 3,33 37 ± 2,88 40 ± 2,30(44-51) (45-55) (39-49) (34-47) (34-43) (39-43)
Délka hyalinních pysků 10 ± 0,88 13 ± 1,36 12 ± 1,91 12 ± 1,66 14 ± 1,81 12 ± 0,58(9-11) (11-15) (7-15) (10-17) (10-17) (11-12)
Přídatné orgány — — — — — 6 ± 0,00(6-6)
Délka mukra — — — — 4 ± 0,89 4 ± 0,58(2-6) (4-5)
Průměr těla v oblasti pysků 8 ± 0,00 9 ± 0,55 10 ± 0,59 12 ± 0,67 14 ± 0,84 14 ± 0,57(8-8) (8-10) (9-11) (11-13) (12-15) (13-14)
u vodícího kroužku 22 ± 1,56 24 ± 1,78 34 ± 3,37 43 ± 2,04 45 ± 2,62 43 ± 1,53(19-24) (22-27) (26-38) (39-45) (40-49) (42-45)
na bázi jícnu 26 ± 2,17 30 ± 3,00 42 ± 4,69 56 ± 2,32 59 ± 3,11 59 ± 2,08(23-29) (25-34) (32-48) (52-59) (53-64) (57-61)
u vulvy 25 ± 2,62 30 ± 3,25 43 ± 4,93 58 ± 3,08 65 ± 4,10 61 ± 4,00(21-28) (26-35) (33-49) (52-65) (55-74) (57-65)
u anusu 16 ± 1,83 21 ± 2,18 32 ± 3,44 43 ± 2,09 46 ± 2,88 44 ± 0,58(14-19) (18-24) (24-38) (40-47) (39-54) (44-45)
na počátku hyalinní části 6 ± 0,58 8 ± 0,77 13 ± 1,84 21 ± 2,11 29 ± 3,51 24 ± 1,53(5-7) (7-10) (8-15) (15-26) (23-37) (23-26)
11
Polešovice
Tabulka 3. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ±směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari a kol. 2005)
Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek
Země Česká republika Srbsko Slovensko Česká republika Srbsko
Reference Kumari, 2003Barsi a Lamberti,
2000bLiskova a kol,
1995Kumari a
Decreamer, 2006Barsi a Lamberti,
2000b
n 219♀ 30♀ 20♀ 8♂ 3♂L 3315 ± 221 3400 ± 270 3600 3201 ± 313 3400 ± 150
(2561-3809) (2750-3920) (3100-3800) (2757-3730) (3,25-3,54)a 57,4 ± 4,28 66,9 ± 4,06 63 59,0 ± 3,93 70,2 ± 3,55
(47,7-70,5) (59,9-76,0) (56-72) (54,4-65,3) (66,7-73,8)b 6,7 ± 0,45 6,9 ± 0,50 6,9 7,0 ± 0,75 7,0 ± 0,15
(5,2-7,7) (5,7-7,8) (6,2-8,1) (5,9-8,0) (6,9-7,2)c 85,4 ± 8,49 80,7 ± 5,81 89,0 76,0 ± 8,93 75,4 ± 6,51
(65,6-123,0) (72,3-96,3) (76-101) (64,1-95,6) (67,9-79,6)c΄ 0,95 ± 0,09 1,09 ± 0,07 0,9 1,11 ± 0,14 1,15 ± 0,07
(0,68-1,34) (0,93-1,22) (0,8-1,3) (0.98-1.43) (1,11-1,23)V/spikuly 51,5 ± 1,54 50,1 ± 1,32 50,00 63 ± 2,07 66,1 ± 2,31
(47,6-56,8) (48,0-52,3) (48-53) (59-66) (63,5-67,8)Odontostylet 128 ± 3,97 127 ± 3,09 130 124 ± 4,26 124 ± 3,90
(116-139) (118-131) (120-137) (117-130) (120-128)Odontofor 79 ± 2,79 75 ± 2,12 83 73 ± 0,83 74 ± 1,04
(67-86) (69-78) (77-92) (72-74) (74-76)Celková délka styletu 207 ± 4,37 202 ± 4,64 197 ± 4,11 199 ± 2,90
(194-216) (189-209) (191-203) (196-201)Největší šířka křídel 13 ± 1,02 12 ± 1,04
(9-16) (11-14)
103 ± 4,73 116 ± 6,08 113 104 ± 6,55 117 ± 5,65
(91-129) (91-123) (107-132) (96-117) (111-123)Délka bulbusu jícnu 123 ± 5,25 120 ± 5,34
(106-138) (116-133)Šířka bulbusu jícnu 29 2,91 24 ± 2,05
(23-37) (21-26)Délka ocasu 39 ± 3,16 42 ± 3,71 39 42 ± 2,97 45 ± 2,51
(30-47) (34-48) (37-45) (39-47) (43-48)Délka hyalinních pysků 14 ± 2,00 12 ± 1,23 13 12 ± 2,38 10 ± 1,37
(8-19) (9,4-14,4) (10-17) (8-16) (9-12)Přídatné orgány 5 ± 0,35
(4-5)Průměr těla v oblasti pysků 13 14 ± 0,30 14 13 ± 0,76 14 ± 0,12
(10-15) (14-15) (12-14) (12-14) (14-14) u vodícího kroužku 39 ± 2,24 38 ± 1,02 39 38 ± 2,33 38 ± 0,35
(34-46) (36-41) (35-45) (34-40) (38-38) na bázi jícnu 51 ± 4,02 46 ± 1,96 48 50 ± 3,15 45 ± 0,69
(41-61) (43-50) (45-52) (45-55) (45-46) u vulvy 57 ± 5,07 51 ± 2,81 57 54 ± 5,18 49 ± 2,21
(43-70) (45-55) (52-60) (46-60) (46-51) u anusu 41 ± 2,67 39 ± 1,89 41 40 ± 2,00 39 ± 0,75
(34-48) (35-43) (37-45) (37-44) (39-40)
na počátku hyalinní části 27 ± 2,70 22 ± 2,01 28 25 ± 2,76 19 ± 1,64(17-36) (19-28) (25-32) (22-30) (18-21)
* hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky
12
Tabulka 4. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi z České Republiky, Slovenska a Jugoslávie. Všechny hodnoty jsou vµm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)*
Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek
přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží za odontoforem funkčního
odontostyletu (obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se shoduje s
délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (Tabulka 3). Pouze larvy čtvrtého stadia
mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stadií je více zúžen s nedostatečně
zřetelným mukrem. První a druhé larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na
ventrální straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 3).
3 Molekulární metodika
3.1 Extrakce DNA
DNA se extrahuje pomocí metody dle Stanton a kol. (1998). Tato metoda extrakce
DNA je jedna z nejefektivnějších a rychlejších metod. Používá se opakovaně od roku
2005 pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X. vuittenezi v nematologické laboratoři
VÚRV. Ani jeden vzorek extrahovaný touto metodu nebyl negativní, proto se tato
metoda extrakce celkové DNA doporučuje pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X.
vuittenezi.
Potřebné věci (viz obrázek 5)
1) Eppendorf zkumavky (0,5 ml sterilní)
2) Háďátka
3) Chladnička s mrazícím boxem
4) Petriho miska
5) pH-metr
6) Pipeta a špičky
7) Stereomikroskop
8) Sterilní jehly
9) Stojan na zkumavky
10) Termoblok na zkumavky
11) Roztoky: 0,25M NaOH
0,25M HCl
0,5 M Tris-HCl (pH 8)
2% Triton X-100
13
Obrázek 5. Potřebné věci pro extrakce DNA. 1: Inkubátor na zkumavky; 2:
Stereomikroskop; 3: Box se špičkami; 4: Pipeta; 5: 2% Triton (X-100); 6: 0,5M Tris-
HCl; 7: 0,25M HCl; 8: 0,25M NaOH; 9: Rukavice; 10: Stojan na zkumavky; 11: 0,5 ml
Eppendorf zkumavky; 12: Jehly; 13: Živá háďátka v Petriho misce; 14: Háďátka ve
zkumavkách a stojan na zkumavky.
14
Postup
1) Napipetuje se 20 µl 0.25 M NaOH do každé 0,5 ml Eppendorf zkumavky.
2) Pod stereomikroskopem se přidají jednotlivá háďátka pomocí sterilní jehly do
Eppendorf zkumavek.
3) Zkumavky se inkubují přes noc při pokojové teplotě.
4) Druhý den se zkumavky s háďátky inkubují 3 minuty při 99°C v termobloku.
5) Poté se přidá
10 µl 0.25 M HCl
5 µl 0.5 M Tris–HCl (pH 8)
5 µl 2% Triton X–100
6) Zkumavky se znovu inkubují 3 minuty při 99°C.
7) Zkumavky se nechají zchladit.
8) DNA je připravená pro PCR.
Poznámka: DNA se může použít ihned pro PCR nebo se může skladovat pro další
použití v -20°C či pro dlouhodobé použití v -70°C.
3.2 Pre-PCR
Potřebné věci (viz obrázek 6)
1) Čisté PCR stojánky
2) Denaturovaný líh
3) DNA
4) Nádoba s ledem
5) Permanentní fixy
6) Pipety a špičky s filtrem
7) Rukavice
8) Sterilní ddH20
9) Zkumavky s PCR kuličkami
10) Sense primer pro X. diversicaudatum
D24 (5 ̦- GAG ATA TAA AGC GAA AAC CGC GAG -3 ̦) 11) Sense primer pro X. vuittenezi
V18 (5 ̦-GTG GAA CGA AAA GAC CTC-3 ̦) 12) Společný antisense primer
A-ITS1 (5 ̦- ACG AGC CGA GTG ATC CAC CGA TAA G -3 ̦)
15
Obrázek 6. Potřebné věci pro pre-PCR. 1: Stojan na pipety s pipetami; 2: Primery; 3:
Nádoba na led; 4: Led; 5: dd H2O; 6: DNA; 7: Denaturovaný líh; 8: Rukavice; 9: Box
se špičkami s filtrem; 10: Permanentní fixy; 11: Zkumavky s PCR kuličkami; 12: Stojan
na zkumavky; 13: Popsané zkumavky s PCR kuličkami; 14: Špičky s filtrem.
16
Složení PCR kuliček ( IllustraTM PuReTaq Ready-To-Go PCR beads )
PCR kuličky jsou navrženy tak, aby spolehlivě amplifikovaly DNA při standardních
reakčních podmínkách. PCR kuličky obsahují nezbytná činidla pro splnění pre-
optimalizace standardního PCR v reakčním objemu 25µl.
Činidla nacházející se v každé zkumavce:
Přibližně 2,5 jednotky PuReTaq polymerázy
200 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
BSA
Stabilizátory
Reakční pufr (10 mM Tris-HCl pH 9.0; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2).
Činidla přidaná navíc jsou pouze voda, DNA a primery.
Pokud je to nutné, může být navíc přidán MgCl2; k uchování výpočtů pro determinaci,
kolik roztoku MgCl2 má být přidáno, tabulka je obsažena v příloze 8.2 metodiky.
Skladování a zacházení s PCR kuličkami
Uchovávat v pokojové teplotě ve vzduchotěsném fóliovém sáčku se sušidlem.
Po otevření znovu uzavřít sáček - zahnout několikrát okraj a uzavřít klipem. V
prostředí s vysokou vlhkostí skladovat neotevřený či použity sáček v exsikátoru
pro maximální životnost produktu.
Vyřadit každou kuličku, která byla náhodně vytlačena z příslušné zkumavky.
Nosit vhodné ochranné oblečení, jako laboratorní kombinézu, bezpečnostní
brýle a rukavice.
Dbát na vyhnutí se kontaktu s pokožkou nebo očima. V případě kontaktu s
pokožkou či očima ihned umýt vodou.
17
Příprava PCR kuliček pro PCR
Vyjmout požadované množství zkumavek z fóliového sáčku. Odebrat jednotlivé
zkumavky z pásu po osmi zkumavkách přestřihnutím plastových spojení mezi
zkumavkami nůžkami.
Zkontrolovat tyto zkumavky kvůli ověření, jestli je kulička viditelná na dně
každé zkumavky. Vyřadit každou kuličku, která se zdá být podstatně menší nebo
deformovaná (indikace kontaminace vlhkostí).
Pokud je to nutné, zlehka poklepat zkumavkou o tvrdý povrch, aby se každá
kulička usadila se na dně zkumavky.
Důležité! Při vykonávání PCR amplifikace nutno dodržovat extrémní pozornost
předcházení kontaminace cizí DNA (viz příloha 8.1)
Postup
1) Nasadí se čisté rukavice a stůl se očistí denaturovaným lihem.
2) Na čistém stojánku se nechají rozmrazit alikvoty primerů a sterilní ddH20 při
pokojové teplotě.
3) Po rozmrazení se chemikálie udržují na ledu při teplotě 1-4 °C.
4) Připraví se 0,2 ml zkumavky s PCR kuličkami podle počtu vzorků (viz. výše
“příprava PCR kuliček pro PCR”).
5) Zkumavky s PCR kuličkami se popíší permanentním fixem.
6) Před použitím je nutné alikvoty primerů a vzorky DNA jemně promíchat
pipetou.
7) Nemíchat obsah PCR zkumavek do té doby, než jsou přidána všechna níže
uvedená činidla.
8) Do každé zkumavky s PCR kuličkou se napipetuje
20 µl sterilní ddH20
2 µl specifického primeru (dle zkoumaného druhu)
2 µl univerzálního primeru A-ITS1
9) Přidá se 1 µl DNA.
18
10) Zavřít víčka zkumavek, zatlačit pevně dolů k zabezpečení utěsnění. Zamíchat
obsah zkumavek klepnutím prsty do stěny zkumavky (finger-flick) nebo
pozvolna vortexovat a poté zkumavky centrifugovat po několik sekund, aby se
přesunuly všechny součásti na dno zkumavek.
11) Před PCR amplifikací minimalizovat čas chlazení na ledu, aby se zabránilo
formování nežádoucích produktů.
Pro větší počet vzorků se doporučuje připravit master mix ddH20 a dvou
primerů.
Příklad master mixu pro 25 vzorků X. diversicaudatum:
20µl ddH20 x 25 vzorků = 500 µl
2 µl primeru D24 x 25vzorků = 50 µl
2 µl primeru A-ITS1 x 25vzorků = 50 µl
Celkový objem 600 µl
Počet vzorků 25 = 24 µl master mixu do jedné zkumavky
Do každé zkumavky se napipetuje 24 µl master mixu a poté se přidá 1µl DNA.
Poznámky
Vždy připravit navíc master mix pro jeden dodatečný vzorek.
Ujistit se, že kuličky jsou dostatečně rozpuštěny.
19
3.3 PCR
Potřebné věci (viz obrázek 7)
1) PCR zkumavky připravené z “pre-PCR”
2) Stojan na zkumavky
3) Termocykler
Obrázek 7. Potřebné věci pro PCR. 1: Stojan na zkumavky;
2: Zkumavky z “pre-PCR”; 3: Termocykler
Postup
Zkumavky se vloží do termocykleru a jsou vystaveny následujícím podmínkám:
Počáteční denaturace 94°C = 3:00 min
Denaturace 94°C = 0:30 min
Annealing 55°C = 0:30 min 40X
Extenze 72°C = 0:30 min
Finální extenze 72°C = 10:00 min
20
Za 2 hodiny 4 minuty se termocykler vypne a zkumavky se dají do 4°C nebo pro další
použití do -20°C či do -70°C.
Poznámka
Tento program je optimalizován pro PTC–1148 termocykler (Bio-Rad).
3.4 Post-PCR
Potřebné věci (viz obrázek 8)
1) Agaróza
2) Analytická váha
3) Barvivo (Loading dye)
4) Délkový standard DNA (DNA ladder)
5) Erlenmayerovy baňky
6) Fotoaparát a tmavá komora
7) Horizontální elektroforetický aparát
8) Hřebeny do elektroforetické vany
9) Nádoba s ledem
10) Odměrný válec
11) Pipeta a špičky
12) Tepelná plotýnka
13) Sybr safe nebo ethidium bromid
14) TAE pufr
15) Transiluminátor
16) Vanička na agarózu
17) Váženka
18) Vzorky
19) Zdroj k elektroforéze
21
Obrázek 8. Potřebné věci pro post PCR. 1: Analytická váha; 2: Erlenmayerova baňka;
3: Tepelná plotýnka; 4: Fotoaparát; 5: Tmavá komora; 6: Transiluminátor; 7: Zdroj na
elektroforézu; 8: Horizontální elektroforetický aparát; 9: Pipeta; 10: Sybr safe; 11: Box
se špičkami; 12: Váženka; 13: Loading dye a DNA ladder; 14: Vanička na agarózu; 15:
TAE pufr; 16: Hřebeny; 17: Agaróza; 18: Amplifikované vzorky; 19: Stojan na
zkumavky; 20: Nádoba s ledem.
22
Postup
1) Připraví se vanička (např. 60x80mm) na agarózu a přiloží se hřeben na potřebné
množství vzorků.
2) Na analytické váze se na vážence naváží požadované množství agarózy.
3) Navážená agaróza se přesype do Erlenmayerovy baňky.
4) Na odměrném válci se naměří 40 ml 1x TAE pufru. Naměřený TAE pufr se
nalije do Erlenmayerovy baňky s naváženou agarózou.
5) Směs se ohřeje v Erlenmayerově baňce na plotýnce za průběžného promíchávání
a nechá se zchladit v pokojové teplotě.
6) Připipetuje se 0.4 l sybr safe nebo ethidium bromidu, vše se opatrně zamíchá a
nalije se do předem připravené vaničky s hřebenem. Je třeba dbát na to, aby po
přelití nezůstaly v gelu bublinky vzduchu.
7) Po ztuhnutí gelu (cca 30-45min) se hřeben opatrně vyjme a vanička se vloží do
horizontálního elektroforetického aparátu.
8) Loading dye (5 l) se promíchá s 25 l PCR produktu.
9) Do první a poslední jamky se napipetuje 5 l markeru (DNA ladder). Vzorky
(5l) se nanáší do jamek (z prava do leva). Nakonec se nanáší pozitivní kontrola
a kontrola bez DNA.
10) Elektroforetická vana se uzavře víkem.
11) Připojí se elektroforéza na zdroj a zapne se na 10 min na 40 voltů a poté na 1,5
hodiny na 55 voltů.
12) Po ukončení se elektroforéza odpojí. Gel se vyjme, vloží na transiluminátor a
vyfotí.
Elektroforetická separace PCR produktů na agarózovém gelu poskytuje možnost porovnat
velikost očekávaných amplikonů s délkovým standardem DNA. DNA se separuje
elektroforeticky na základě svého náboje a molekulární hmotnosti. Délka doby elektroforetické
separace je závislá na požadované délce dráhy migrace, protékajícím elektrickém proudu,
použitém elektroforetickém pufru a na koncentraci agarózy v gelu. Přidáním sybr safe nebo
ethidium bromidu do agarózového gelu je umožněno vizualizovat po proběhlé elektroforéze
proužky rozdělené DNA. Vizualizace PCR produktů po elektroforetické separaci probíhá
pomocí UV záření. Sybr safe nebo ethidium bromid se naváže na DNA a při excitaci UV
zářením vyzařuje. Hledaný produkt se pod UV světle zviditelní do podoby svítícího proužku,
podle srovnání pozice tohoto proužku s pozicí DNA fragmentů délkového standardu je pak
určena délka produktu.
23
4 Výsledky elektroforézy
Druhově specifický primer D24 a A-ITS1 amplifikuje 813 bp dlouhý fragment pro X.
diversicaudatum (obrázek 9). Druhově specifický primer V18 se společným opačným
primerem A-ITS1 amplifikuje 591 bp dlouhý fragment pro X. vuittenezi (obrázek 10) .
Porovnání PCR produktů dvou druhů je znázorněno na obrázku 11.
Obrázek 9. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. diversicaudatum (jamky 1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).
Obrázek 10. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. vuittenezi (jamky1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).
Obrázek 11. Porovnání PCR produktů dvou druhů. XD1, XD 2: X. diversicaudatum; XV1, XV2: X. vuittenezi.
24
5 Srovnání ″novosti postupů″
V předložené metodice jsou optimalizovány postupy molekulární diagnostiky
fytoparazitických háďátek druhů Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí
spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové reakce za účelem
rychlé identifikace ve srovnání s obtížnou a časově náročnou taxonomickou identifikací.
Výhody této metodiky jsou popsány v úvodu i závěru.
6 Závěr
V první části této metodiky je popsána stručná charakteristika háďátek druhů X.
diversicaudatum a X. vuittenezi, jejichž morfometrické hodnoty jsou uvedeny v
tabulkách. Tato část není daným předmětem metodiky, proto je uvedena jen stručně pro
rychlou orientaci uživatele této metodiky.
Tato metodika se zabývá molekulární identifikací háďátek X. diversicaudatum a X.
vuittenezi. Druh X. vuittenezi je nejrozšířenějším, a X. diversicaudatum druhým
nejrozšířenějším druhem v České republice (Erbenová, 1975; Kumari, 2004; Kumari a
kol., 2005; Kumari 2006). Navíc je X. diversicaudatum prokázaným vektorem dvou
nepovirů – viru latentní kroužkovitosti jahodníku (SLRSV - Strawberry latent ringspot
virus) a viru mozaiky huseníku (ArMV - Arabis mosaic virus) (Talyor a Brown, 1997).
Na základě jejich rozšíření a škodlivosti byly vybrány právě tyto druhy.
Určování háďátek X. diversicaudatum a X. vuittenezi se provádí pomocí časově
náročné morfologické a morfometrické studie. Proto byla optimalizována molekulární
metoda PCR (polymerázová řetězová reakce), která je spolehlivá a rychlá pro
identifikaci těchto druhů. Druhy Xiphinema se typicky vyskytují smíšeně; je tedy nutné,
aby druhově specifické primery byly selektivní a senzitivní. Tyto primery jsou
selektivní, protože amplifikují fragment odlišné velikosti pro X. diversicaudtaum a X.
vuittenezi.
25
Molekulární diagnostika dvou druhů (X. diversicaudatum a X. vuittenezi) na základě
polymerázové řetězové reakce je specifická a spolehlivá. Tento molekulární
diagnostický protokol je díky použitím druhově specifických primerů spolehlivý i pro
detekce všech vývojových stadií larev X. diversicaudatum a X. vuittenezi a je velkým
přínosem fytosanitárních služeb. Použití PCR kuliček (PCR-beads) je zvlášť užitečné ve
fytosanitárních laboratořích a ostatních diagnostických laboratořích.
Výhody PCR-beads
PCR systém puReTaq Ready-To-Go™ je výborný pro méně zkušený personál
laboratoře.
Ke stanovení PCR reakce přidá uživatel pouze specifický primer, ddH2O a
DNA.
PCR-kuličkový kit je velmi robustní a spolehlivý.
Snadné použití pro větší počet vzorků.
Ekonomicky výhodné.
Minimalizace jednotlivých kroků pipetování a redukce potenciálních chyb při
nich.
Zajišťění nejnižší možné úrovně kontaminace prokaryotické a eukaryotické
nukleové kyseliny u každé kuličky. Dodržování některých jednoduchých
opatření předejde reintrodukci kontaminace (viz příloha 8.1).
Zajišťění větší reprodukovatelnosti mezi reakcemi.
Kuličky jsou lyofilizované, proto mohou být uchovány v pokojové teplotě.
Vzorky s PCR kuličkami vyžadují minimální uživatelský vstup, čas a nižší
odbornost a podávají výsledky, které jsou pokaždé přesné a reprodukovatelné.
Poděkování
Autorka děkuje Markétě Vítámvásové za opravu češtiny a technickou pomoc.
26
7 Literatura
7.1 Použitá literatura
1. Barsi, L., Lamberti, F. (2000a): Morphometric variation and juvenile stages of
Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939 and X. index
Thorne et Allen, 1950 (Nematoda: Dorylaimida) from the former territory of
Yugoslavia. Nematologia Meditteranea 28: 171–187
2. Barsi, L., Lamberti, F. (2000b): Morphometric variation and juvenile stages of
Xiphinema vuittenezi (Nematoda: Dorylaimida) in Serbia. Nematologia
Mediterranea 28: 3–12
3. Erbenová, M. (1975): Ektoparazitická háďátka rodu Xiphinema cobb
v ovocných sadech ČSR. Sborník ÚVTI – Zahradnictví 2: 79–86
4. Kumari, S. ( 2003): A single specimen of Xiphinema vuittenezi with posterior
vulva from the Czech republic. International Journal of Nematology 13:
233–235
5. Kumari, S. (2005): Atlas for identification of 28 genera of plant-parasitic
nematodes. RICP,Prague, 60 s
6. Kumari, S. (2004): The occurrence of Xiphinema vuittenezi, X. pachtaicum and
Longidorus leptocephalus (Nematoda: Dorylaimida) in the Central Czech
Republic. Helminthologia 41: 103–108
7. Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech
Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50
8. Kumari, S., Decreamer, W. (2006): A female of Xiphinema vuittenezi
(Nematoda: Longidoridae) with two vulvae and abundant numbers of males
in a soil sample. Nematology, 8: 943–947
9. Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the
genus Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech
Republic. Nematology 7: 81–93
10. Liskova, M., Brown, D. J. F., Taylor, C. E. (1995): The occurrence and
distribution of Longidoridae and Trichodoridae in the Slovak Republic.
Russian Journal of Nematology 3: 49–60
11. Lišková, M., Sabová, M., Valocká, B. (1992): Contribution to the finding of the
southern border of Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne,
1939 distribution range in the Slovak Republic. Helminthologia 29: 181–184
27
12. Loof, P. A. A., Luc, M. (1990): A revised polytomous key for the identification
of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae)
with exclusion of the X. americanum-group. Systematic Parasitology 16: 35–
66
13. Loof, P. A. A., Luc, M. (1993): A revised polytomous key for the identification
of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae)
with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 1. Systematic
Parasitology 24: 185–189
14. Loof, P. A. A., Luc, M., Baujard, P. (1996): A revised polytomous key for the
identification of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda:
Longidoridae) with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 2.
Systematic Parasitology 33: 23–29
15. Oliveira, C. M. G., Fenton, B., Malloch, G., Brown, D. J. F., Neilson, R. (2005):
Development of species-specific primers for the ectoparasitic nematode
species Xiphinema brevicolle, X. diffusum, X. elongatum, X. ifacolum and X.
longicaudatum(Nematoda: Longidoridae) based on ribosoml DNA
sequences. Annals of Applied Biology 146: 281-288
16. Stanton, J. M., McNicol, C. D., Steele, V. (1998): Non-manual lysis of second-
stage Meloidogyne juveniles for identification of pure and mixed samples
based on the polymerase chain reaction. Australasian Plant Pathology 27:
112–115
17. Taylor, C. E., Brown, D. J. F. (1997): Nematode vectors of plant viruses. CABI,
Wallingford, UK.
18. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D.
(2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single
individuals of the longidorid nematodes Xiphinema index, X.
diversicaudatum, X. vuittenezi, and X. italiae using specific primers from
ribosomal genes. Phytopathology 93: 160–166
28
7.2 Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR
1. Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech
Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50
2. Kumari, S., Kundu, J. K., Polák, J. (2004): Identification of Xiphinema vuittenezi
by polymerase chain reaction. Plant Protection Science 40: 1–4
3. Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the genus
Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech Republic.
Nematology 7: 81–93
7.3 Původní poznatky ze světa k PCR
1. Hübschen, J., Kling, L., Ipach, U., Zinkernagel, V., Bosselut, N., Esmenjaud, D.,
Brown, D. J. F., Neilson, R. (2004): Validation of the specificity and sensitivity
of species-specific primers that provide a reliable molecular diagnostic for
Xiphinema diversicaudatum, X. index and X. vuittenezi. European Journal of
Plant Pathology 110: 779–788
2. Leopold, S., Fernández, B. E., Schartl, A., Laimer, M. (2007): Identification of
Xiphinema index in an Austrian vineyard. Vitis 46: 49–50
3. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D.
(2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals
of the longidorid nematodes Xiphinema index, X. diversicaudatum, X. vuittenezi,
and X. italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology 93:
160–166
29
8 Přílohy
8.1 Jak se vyhnout PCR kontaminaci
PCR je velmi senzitivní ke kontaminaci cizí DNA. PCR je molekulární biologická
technika, což připouští produkci více než 10 milionů kopií cílové DNA sekvence pouze
z několika molekul DNA. Senzitivita PCR znamená, že vzorek použitý pro PCR by
neměl být kontaminován žádnou další DNA, která se může usadit v laboratorním
prostředí. Proto je nutné provádět kroky, které zredukují kontaminaci.
Důležité! - Negativní kontroly (bez DNA) by měly být přidány do každého stanovení
PCR. Pokud jsou vidět proužky po provedení PCR na negativní kontrole, je
kontaminována.
Tipy jak předejít kontaminaci PCR
Nasazení čistého páru rukavic při zahájení práce s PCR.
Čištění pracovního povrchu 70% etanolem před a po práci.
Častá výměna rukavic.
Použití špiček s filtrem. Špičky do pipet s aerosolovými filtry poskytují prevenci
před mikrokapičkami vstříknutými do směsi PCR, čímž předchází kontaminaci
PCR reakcí.
Nekašlat nad zkumavkami.
Příprava DNA vzorků by se měla provádět ve vzdáleném prostoru nebo alespoň
odděleném od prostoru, kde se připravuje směs na PCR reakci.
Může být použit laminární flowbox, vybavený UV lampou k předcházení
bakteriálního růstu. Tato pracovní plocha může zabránit kontaminaci z předešlé
amplifikované DNA.
Vyhnout se tvorbě aerosolů.
Nedělat při práci prudké pohyby pipetou.
Příprava vlastní sady činidel a jejich udržování v malém alikvotu.
30
Tipy jak se vyvarovat přenosu PCR ″carry-over″ kontaminace
Izolovat DNA extrakce, pre-PCR a post-PCR. Pokud možno používat tři různé
místnosti. Nepřenášet vybavení jako jsou pipety, boxy se špičkami,
mikrocentrifugou atd. z jedné místnosti do druhé.
Každá osoba v laboratoři by měla mít svou vlastní sadu pipet a činidel pro DNA
extrakce, pre-PCR a post-PCR.
Činidla by měla být vytvořena a skladována v malých alikvotech, které mohou
být vyřazeny, jestliže existuje podezření na jejich kontaminaci.
Vždy zacházet se zkumavkami a roztoky z post-PCR s předpokladem, že jsou
zde přítomny amplifikované produkty. Používat pro tuto práci oddělené post-
PCR pipety.
Vyvarovat se vytvoření aerosolů. Aerosoly se snadno vytvoří při vyhazování
špiček, nebo jestliže se s pipetami příliš mává.
Používat špičky s filtrem k redukci rizika přenosu DNA mezi zkumavkami.
Pokud je to možné, používat UV-lampu pro dekontaminaci laboratoře, pokud v
ní nejsou přítomni lidé.
Další tipy při práci s PCR
Koncentrace činidel – “nižší je obvykle lepší” (více specifické).
Krátce vortexovat nebo zamíchat třepáním rukou činidla před použitím.
Spustit negativní kontrolu (y) pro ověření kontaminace.
Spustit pozitivní kontrolu (vzorek který byl opakovaně pozitivně amplifikován).
Vždy spustit délkový standard DNA na gelu (bude indikovat možné selhání PCR
nebo detekčního systému).
Shromáždit reakce na ledu.
Stále ošetřovat pracovní povrch 10% (v/v) roztokem sava. Ideální je nechat savo
působit na povrch nejméně 10 minut a poté setřít sterilní vodou .
31
8.2 Přepočty I) Přepočty molarity chemikálií na 100 ml pro extrakce DNA
a] 0,25M NaoH = 1 gram na 100 ml (0,1 litr)
1Molární na jeden litr = 40g (molekulární hmotnost NaOH) 1M 0,1 litr = 40 x 0,1 4g 0.25M 0,1 litr = 4 x 0,25 1g
b] 0,5M Tris-HCl = 7,88 gramů na 100 ml (0,1 litr)
1Molární na jeden litr = 157,60 g (Molekulární hmotnost Tris-HCl) 1M 0.1 litr = 157,60 x 0,1 15,76g 0.5M 0,1 litr = 15,76 x 0,5 7,88g
c] 0,25M HCl = 2,20 ml 35% HCl na 100 ml (0,1 litr)
1Molární na jeden litr = 36,46 g (Molekulární hmotnost HCl) 1M 0.1 litr = (36,46 x 0,1) 3,646g 0.25M 0,1 litr = (3,646 x 0,25) 0,9115g
1180 g = 1000 ml 0,9115g = X ml (1000x0,9115/1180 0,772 ml)
35% = 0,772 ml 100%= X ml (0,772x100/35 2,20 ml)
II) Přepočty koncentrace primerů pro 10 pmol/1l
10l “stock primeru” (Generi Biotech) na 90 l dd H2O 10 pmol/1l
III) Příprava 1x TAE pufru Zásobní roztok 50x TAE (Fermentas) se naředí deionizovanou vodou v poměru 1:49. Např. pro 1000 ml pracovní koncentrace (1x) se naměří 980 ml deionizované vody a přidá se 20 ml zásobního roztoku TAE (50x)
32
IV) Příprava 1,5 % agarózového gelu
Vanička 1x TAE
pufr Agaróza Ethidium bromid
Sybr safe
60 x 80 mm 40 ml 0,6 g 0,4l 0,4l 100 x 150 mm 80 ml 1,2 g 0,8l 0,8l
V) Denaturovaný líh (cca 70%) 70 ml absolutního ethylalkoholu (99,8%) se smíchá s 30ml deionizované sterilní vody. VI) Koncentrace magnesium chloridu
Pokud je každá PCR kulička dehydratizovaná v reakčním objemu 25 µl, směs se
skládá z 1,5mM MgCl2. Jestliže se požaduje vyšší koncentrace Mg2+, následující
tabulka může být použita k determinaci objemu sterilního roztoku 10mM MgCl2, který
by měl být přidán, aby se zvýšila koncentrace Mg2+ reakce. Jestliže je MgCl2 přidán do
reakce, sníží se množství přidané vody v reakci na finální reakční objem 25ul.
Konečný [MgCl2] Objem 10 mM MgCl2 k přidání 2,0 mM 1,25 l 2,5 mM 2,50 l 3,0 mM 3,75 l 3,5 mM 5,00 l 4,0 mM 6,25 l 4,5 mM 7,50 l 5,0 mM 8,75 l
Přepočet 10 mM MgCl2 = 0,095211g na 100 ml (0,1 litr)
1Molární na jeden litr = 95,211 g (Molekulární hmotnost MgCl2) 1M 0.1 litr = 95,211 x 0,1 9,5211g 1mM 0,1 litr = 9,5211/ 1000 0,0095211g 10mM 0,1 liter = 0,0095211 x 10 0,095211g
33
8.3 Potřebné věci
Informace o konkrétním přístrojovém a materiálním vybavení jsou přiloženy jen jako možná pomoc pro uživatele této metodiky, mohou však být použity i materiály od jiných dodavatelů za předpokladu, že bude dosaženo shodných výsledků. V případě neshody je třeba optimalizovat dané přístrojové a materiální vybavení.
P.č. Věc Katalogové číslo Výrobce Kontakt * 1. Agaróza (TopVision Agarose) R0491 Fermentas Biogen 2. Analytická váha - Radwag Váhy-Radwag 3. Centrifuga MiniSpin EPF5452000018 Eppendorf Maneko 4. DNA ladder 100 bp (50µg) SM0241 Fermentas Biogen 5. Eppendorf zkumavky (0,5 ml) bezbarvé T8911-500EA Eppendorf Sigma-Aldrich 6. Erlenmayerovy baňky (250 ml) KAV632417119250 Simax Maneko 7. Ethidium bromid (roztok) E1510 Sigma Sigma 8. Ethylalkohol 99,8% (1 litr) E 03502 - P-lab 9. Fotoaparát Canon A620 MEGA A620 Canon Schoeller Instruments 10. HCl (Hydrochloric acid -500 g) C6025-500G Lachner Lab Mark 11. Horizontální elektroforéza
s příslušenstvím (Biomax MP1015) IB53000 Biomax Biogen
12. Inkubátor na zkumavky BIO TDB-100 Biosan BioTech 13. Jehly - Medin Medin 14. Loading dye (6x orange) R0631 Fermentas Biogen 15. Nádoba na led R613071.Z Roth P-lab 16. NaOH (Sodium hydroxide) DB0617-500G Lachner Lab Mark 17. PCR kuličky
(illustra™ PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads)
27-9559-01 GE Healthcare AP Czech
18. PCR stojánky: Stojan na 0,2 ml zkumavky Stojan na 0,2-2 ml zkumavky Stojan na 0,5-2 ml zkumavky
5230-29S R181841.R Alpha LW5890AS
Bioplastics - AlphaLaboratories
Labmark P-lab East Port Scientific
19. Petriho miska (40mm) 632 492 002 040 - Vitrum 20. pH metr - inoLab Schoeller Instruments 21. Pipety : 0,5-10 µl
10-100 l 100-1000 µl
3111 000.122 3111 000.149 3111 000.165
Eppendorf Maneko
22. Primery - Generi Biotech Generi Biotech 23. Rukavice vynilové , vel.S
vel M vel L
202VP 202VM 202VG
Mercator Medical Biogen
24. Stereomikroskop Olympus SZX 9 - Olympus Olympus 25. Stojan na pipety 3111 000.003 Eppendorf Maneko 26. Sybr safe S33102 Invitrogen KRD 27. Špičky s filtrem: 0,1-10 µl
2-100 µl 50-1000 µl Špičky bez filtru: 0,1-10 µl 2-200 µl 50-1000 µl
PF0030 077 024 EPF0030 077.067 EPF0030 077.105 EPF0030 000 811 EPF0030 000 870 EPF0030 000 919
Eppendorf Maneko
28. TAE pufr (50x) B49 Fermentas Biogen 29. Tepelná plotýnka - Yellowline Neotec 30. Termocykler MJ Mini PTC-1148 BioRad BioTech 31. Tmavá komora (tubus) - - Schoeller Instruments 32. Transiluminátor 312 nm VIL ECX-26.MX Vilber Lourmat Schoeller Instruments 33. Tris-HCl (250g) DB0103-250G BioBasic Lab Mark 34. Triton X-100 (100 ml) T 8787 Sigma Sigma-Aldrich 35. Vortex (lab-dancer) 336500 IKA Neotec 36. Permanentní fixy (Cryoware marker) 6163 Nalgene Sigma
* adresy těchto firem jsou na následující stránce Poznámka: Katalogové číslo může být staré, proto je potřeba před objednáním zavolat určitou firmu.
34
Kontakty firem AP Czech s.r.o. Hošťálková 48 160 00 Praha 6 Tel/Fax: 220 511 392 220 518 399 220 518 743 [email protected] http://www.apczech.cz
Biogen Praha s.r.o. Ke sv. Isidoru 2293/4a 149 00 Praha 4, Chodov Tel: 241 401 693 Fax: 241 401 694 Mob: 602 665 384 [email protected] http://www.biogen.cz
BioTech a.s. Služeb 4 108 52, Praha 10 Tel: 272 701 739 Fax: 272 701 742 [email protected] http://www.biotech.cz
East Port Scientific, s.r.o. Rubličova 1/969 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 235 318 177 Fax: 233 312 428 [email protected] http://www.genetika.cz
Generi Biotech s.r.o Machkova 587 500 11 Hradec Králové 11 Tel: 495 056 353 Fax: 495 056 316 [email protected] http://www.generi-biotech.com
KRD, s.r.o. Pekařská 603/12 155 00 Praha 5, Jinonice Tel: 257 013 400 Fax: 257 013 405 [email protected] http://www.krd.cz
Lab Mark a.s., Pod Cihelnou 23 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 233 335 548 233 335 930 Fax: 224 311 830 [email protected] http://www.labmark.cz
Maneko, s. r. o. na Pískách 71 160 00 Praha 6, Tel: 233 335 638-9 233 336 579 Fax: 233 332 656 [email protected] http://www.maneko.cz
Medin Jana Želivského 6 130 00, Praha 3 Tel: 222 592 334 Fax: 222 592 334 Mob.: 606 686 530 [email protected] http://www.medin.cz
Neotec, spol. s. r.o Jinonická 80, 158 00 Praha 5 Tel: 257 289 511 257 289 515 Fax: 233 312 515 http://www.neotec.cz
Olympus C&S Evropská 176 160 41 Praha 6 Tel: 221 985 211 Fax: 221 985 505 [email protected] http://www.olympus.cz
P-lab a.s. Korunní 127 130 00 Praha 3,Vinohrady Tel: 271 730 800 Fax: 271 131 176 [email protected] http://www.p-lab.cz
Schoeller Instruments, s. r. o.
Vídeňská 1398/124 148 00 Praha 4 Tel: 261 009 111 261 711 765-6 Fax: 244 470 745 261 009 112 [email protected] http://www.schoeller.cz
Sigma-Aldrich spol. s r.o. Sokolovská 100/94 186 00 Praha 8 Tel: 246 003 251 246 003 252 Fax: 246 003 291 246 003 292 [email protected] http://www.sigmaaldrich.com
Váhy-Radwag Lidická 55 787 01 Šumperk Tel/Fax: 583 210 016 mob: 777 255 695 [email protected] http://vahy-radwag.cz
Vitrum Praha Pražská 442 281 67 Stříbrná Skalice Tel: 321 570 321 Fax: 321 570 320 [email protected] http://www.vitrum.cz
35
8.4 Referenční materiál I. Celková izolovaná DNA druhu X. vuittenezi
Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla
úspěšně amplifikována (obrázek 12). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní
vzorky.
Číslo
vzorku Počet háďátek v jedné zkumavce
Množství DNA
Číslo vzorku
Počet háďátek ve jedné zkumavce
Množství DNA
XV 1 1♀ 39 µm XV 12 1♀ 39 µm XV 2 1♀ 39 µm XV 13 1♀ 39 µm XV 3 1♀ 39 µm XV 14 1♀ 39 µm XV 4 1♀ 39 µm XV 15 1♀ 39 µm XV 5 1♀ 39 µm XV 16 1♀ 39 µm XV 6 1♀ 39 µm XV 17 1♀ 39 µm XV 7 1♀ 39 µm XV 18 1♀ 39 µm XV 8 1♀ 39 µm XV 19 1♀ 39 µm XV 9 1♀ 39 µm XV 20 1♀ 39 µm XV 10 1♀ 39 µm XV 21 15 ♀ 159 µm XV 11 1♀ 39 µm XV 22 15 ♀ 159 µm
Obrázek 12. Amplifikované referenční
vzorky druhu X. vuittenezi.
36
II. Celková izolovaná DNA druhu X. diversicaudatum
Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla
úspěšně amplifikována (obrázek 13). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní
vzorky.
Číslo
vzorku Počet háďátek v jedné zkumavce
Množství DNA
Číslo vzorku
Počet háďátek ve jedné zkumavce
Množství DNA
XD 1 1♀ 39 µm XD 12 1♂ 39 µm XD 2 1♀ 39 µm XD 13 1♂ 39 µm XD 3 1♀ 39 µm XD 14 1♂ 39 µm XD 4 1♀ 39 µm XD 15 1♂ 39 µm XD 5 1♀ 39 µm XD 16 1♂ 39 µm XD 6 1♀ 39 µm XD 17 1♂ 39 µm XD 7 1♀ 39 µm XD 18 1♂ 39 µm XD 8 1♀ 39 µm XD 19 1♂ 39 µm XD 9 1♀ 39 µm XD 20 1♂ 39 µm XD10 1♀ 39 µm XD 21 15 ♀ 159 µm XD 11 1♂ 39 µm XD 22 15 ♂ 159 µm
Obrázek 13. Amplifikované referenční
vzorky druhu X. diversicaudatum
37
III. Trvalé preparáty Tyto trvalé preparáty byly předány Státní rostlinolékařské správě Číslo preparátu
Druh Datum výroby
Počet jedinců Lokalita Hostitelská rostlina
Datum předělání
XV 1 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 2 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 3 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 4 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 5 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 6 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva
XV 7 X. vuittenezi 17.08.2004 1♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 8 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 9 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 10 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 11 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 12 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 13 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008
XV 14 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ bez mukra Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008
XV 15 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 16 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 17 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 18 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008
XV 19 X. vuittenezi 04.10.2004 2♀ Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008 XV 20 X. vuittenezi 04.10.2004 2♀ Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008
XV 21 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008 XV 22 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008 XV 23 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008
XD 24 X. diversicaudatum 28.08.2003 4 larvy Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 25 X. diversicaudatum 28.08.2003 5 larev Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 26 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 27 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 28 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 29 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 30 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 31 X. diversicaudatum 28.08.2003 5 larev Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008
XD 32 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 33 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 34 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 35 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 36 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ (1 bez mukra) Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 37 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 38 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 39 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♂ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 40 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♂ Třebanice třešeň 08.10.2008
XD 41 X. diversicaudatum 24.12.2004 2♂ Lhenice třešeň 08.10.2008 XD 42 X. diversicaudatum 24.12.2004 3♂ Lhenice třešeň 08.10.2008
38
Poznámky
39
40
Poznámky
Centrifuga
Centrifuga (otevřená)
pH metrVortex
Odměrné válce
Název: Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce (Metodika pro praxi)
Autor: Kumari S.
Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i.Drnovská 507, 16106 Praha 6–Ruzyně
Tisk: VÚRV, v.v.i., Praha
Počet stran: 40
Vydání: první
Rok vydání: 2008
ISBN: 978-80-87011-98-0
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008