Vztahy mezi jarovizací, mrazuvzdorností a expresí dehydrinů u ječmene (Hordeum vulgare L.)

Shrnutí Ph.D. práce

RNDr. Klára Kosová

Školitel: RNDr. Ilja Tom Prášil, CSc.

Katedra fyziologie rostlin, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze

Odbor genetiky a šlechtění rostlin, Výzkumný ústav rostlinné výroby,

Praha - Ruzyně

2008

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci zpracovala samostatně na základě svých vlastních výsledků kromě případů zvláště uvedených a řádně citovaných. Dále prohlašuji, že tuto práci ani její část nepředkládám za účelem získání jiného akademického titulu. V Praze, dne 25. září 2008 Klára Kosová Poděkování Nejprve bych chtěla poděkovat svému školiteli, RNDr. Iljovi Tomovi Prášilovi, CSc., za jeho stálou péči, liberální styl vedení a podnětné připomínky v průběhu celého mého Ph.D. studia. Chci také poděkovat ostatním členům naší laboratoře - Ing. Pavle Prášilové za praktické rady ohledně kultivace rostlinného materiálu, Mgr. Pavlu Vítámvásovi, Ph.D. za praktické rady týkající se elektroforézy a dalších molekulárně-biologických technik, Ing. Evě Vlasákové a Ing. Zbyňkovi Škodáčkovi za jejich dobrou náladu a Mgr. Lucii Davidové za její pečlivou technickou práci při kultivaci pokusných rostlin. Dále chci poděkovat RNDr. Ludmile Holkové z Ústavu pěstování a šlechtění rostlin a rostlinolékařství na Agronomické fakultě Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně za dobrou spolupráci a za zajištění analýzy dehydrinových transkriptů. Děkuji také RNDr. Věře Čapkové, CSc., z Ústavu experimentální botaniky Akademie věd ČR za cenné rady ohledně technik SDS-PAGE a imunoblotů. Jsem velmi vděčná též Prof. Timothy J. Close z Department of Botany and Plant Sciences, University of California at Riverside, USA, za jeho za bezplatné poskytnutí primární protilátky proti dehydrinům. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat svým rodičům Janě a Milanovi, své sestře Květě a svému příteli Zdeňkovi za podporu v průběhu celého studia. Experimentální část práce byla prováděna v laboratoři fyziologie stresu rostlin na Odboru genetiky a šlechtění ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, Praha - Ruzyně. Práce byla podpořena granty COST FA 0603, GA CR 522/08/1290, MZe 0002700602, MZe QF3191 a MZe 1G57060.

Obsah Úvod 1 Cíle disertační práce 3

Výsledky a diskuse 4

1. Zjišťování možnosti využití chladově indukovaných dehydrinů (proteinů) pro odlišení

odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti 4

2. Dynamika vývoje, dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5

v podmínkách dlouhodobého otužení 5

2.1. Počáteční stadia otužení (0 - 14 dnů) 5

2.2. Pozdější stadia otužení (14 - 112 dnů) 7

3. Vztah mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti 12

Závěry 14

Citovaná literatura 16

Seznam publikací 18

Rukopisy, které jsou součástí disertační práce 20

Rukopis 1 (Abstrakt) 21

Rukopis 2 (Abstrakt) 22

Rukopis 3 (Abstrakt) 23

Rukopis 4 (Abstrakt) 24

Úvod

Ječmen (Hordeum vulgare L.) je vedle pšenice (Triticum aestivum (L.) em Thell.) jednou

z ekonomicky nejvýznamnějších obilovin pěstovaných v oblastech mírného klimatického

pásma včetně České republiky. Navzdory mírným zimám v posledních několika letech

představuje poškození mrazem pro pěstování ječmene stále vážnou hrozbu. Navíc je známo,

že ozimé kultivary ječmene jsou obecně méně odolné vůči mrazu ve srovnání s ozimými

kultivary pšenice, žita a tritikale (Fowler a Carles, 1979; Fowler, 2008). Proto je testování

dosažené úrovně mrazuvzdornosti důležitou součástí šlechtitelských programů.

V poslední době probíhá bouřlivý rozvoj technik strukturní i funkční genomiky

(transkriptomiky, proteomiky a metabolomiky), který vede k objevu nových metod

využitelných ve šlechtění. Tyto techniky umožnily identifikaci specifických DNA markerů

spojených s hledanými znaky a rozvoj technik tzv. MAS (marker-assisted selection; selekce

spojená s využitím DNA markerů). Využívané markery mohou být buď náhodně detekované

jedinečné sekvence DNA jen volně spojené s hledaným genem (takové markery jsou

používány již od 90. let; viz markery RFLP, AFLP, RAPD, SCAR, SNP, SSR, STS a další

typy) anebo mohou být jako markery využity jedinečné sekvence v přímé vazbě s hledaným

genem (takové druhy markerů se nazývají rovněž diagnostické markery) (Andersen a

Lübberstedt, 2003). Z hlediska funkční genomiky se ukazuje, že kvantitativní úroveň exprese

určitého transkriptu (mRNA) anebo proteinu může korelovat s dosahovanou úrovní určitého

znaku kvantitativní povahy (např. mrazuvzdornost). Proto může být úroveň exprese určité

mRNA anebo proteinu také považována za marker (Houde et al., 1992).

Mrazuvzdornost není u mnoha odolných rostlin včetně obilovin neměnným znakem; naopak,

ukazuje se, že vyšší úroveň mrazuvzdornosti lze indukovat dlouhodobým působením nízkých

teplot nad bodem mrazu (tzv. otužování neboli chladová aklimace; chlad je nejčastěji

definován jako teploty v rozsahu +12 °C - 0 °C; Sakai a Larcher, 1985; Guy, 1990;

Thomashow, 1999). Jelikož je mrazuvzdornost kvantitativní znak, nemůže být spojena

s přítomností či nepřítomností jediné alely, která by mohla být použitelná jako molekulární

marker.

Bylo zjištěno, že změny v úrovni dosažené mrazuvzdornosti za podmínek chladové aklimace

poměrně dobře korelují se změnami v expresi a akumulaci některých chladově indukovaných

strukturních proteinů. Významnou skupinou chladově indukovaných strukturních proteinů

jsou COR/LEA proteiny, jejichž hromadění v rostlinných pletivech je spojeno s buněčnou

1

dehydratací. Buněčná dehydratace je důležitou součástí některých fyziologických procesů -

např. zrání rostlinných embryí - anebo výsledkem působení různých abiotických stresových

faktorů včetně chladu a mrazu. Jedna skupina COR/LEA proteinů se proto nazývá dehydriny

(LEA II proteiny).

V roce 1992 Houde et al. popsali u pšenice chladově indukovaný dehydrin WCS120 a navrhli

tento protein jako možný marker dosažené úrovně mrazuvzdornosti. Tato hypotéza byla

ověřována i v naší laboratoři, kde Vítámvás et al. (2007) rozlišili po třech týdnech otužování

dvě různě odolné odrůdy ozimé pšenice (Mironovská 808 a Bezostá) na základě různé úrovně

akumulace dehydrinu WCS120 v listových pletivech. U ječmene byl popsán ortolog

pšeničného genu Wcs120 a pojmenován jako gen Dhn5 (Close et al., 1995). Akumulace

proteinu DHN5 v podmínkách chladu byla prokázána několika výzkumnými skupinami (Van

Zee et al., 1995; Bravo et al., 1999; Zhu et al., 2000). Souvislost mezi kvantitativní akumulací

dehydrinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti nicméně u ječmene dosud prokázána

nebyla. Proto bylo jedním z cílů mé disertační práce studium vztahu mezi kvantitativní

akumulací dehydrinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti.

2

Cíle disertační práce

Hlavním cílem disertační práce bylo studium vztahů mezi vývojem (jarovizací), dosaženou

úrovní mrazuvzdornosti a akumulací dehydrinů (případně dalších COR proteinů) u ječmene

v podmínkách chladové aklimace (otužení).

K vyřešení tohoto hlavního cíle jsem si stanovila několik dílčích cílů:

• Prostudovat literární poznatky o vztahu mezi regulací vývoje a mrazuvzdorností u

ječmene a pšenice za podmínek chladové aklimace (publikace 1).

• Prostudovat literární poznatky o vlastnostech dehydrinů a jejich úloze v procesu

chladové aklimace (publikace 2).

• Detekovat chladově indukované dehydriny u ječmene a zvolit vhodnou metodu jejich

detekce a kvantifikace. Zjistit, zda může být některý dehydrin (resp. kvantitativní

úroveň akumulace tohoto dehydrinu) použit pro rozlišení odrůd s různou úrovní

mrazuvzdornosti. (Předpokládá se využití proteinu DHN5, jehož akumulace za

podmínek chladu již byla popsána v literatuře).

• Sledovat dynamiku vývoje mrazuvzdornosti a exprese genu Dhn5 a akumulace

proteinu DHN5 v souboru odrůd různého geografického původu a růstového typu -

přesívky, ozimé a jarní odrůdy (publikace 3).

• Zjistit, zda existuje vztah mezi kvantitativní akumulací dehydrinu DHN5 a dosaženou

úrovní mrazuvzdornosti v určité fázi chladového otužení (publikace 3).

• Sledovat dynamiku vývoje mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u odrůd

Atlas 68 (jarní odrůda) a Igri (ozimá odrůda) v průběhu dlouhodobého otužování

(publikace 4).

• Zjistit, zda existuje vztah mezi přechodem z vegetativní fáze vývoje do reproduktivní

fáze vývoje a mezi změnami ve vývoji mrazuvzdornosti a akumulace dehydrinu

DHN5 u odrůd Atlas 68 a Igri (publikace 4).

• Objasnit vztah mezi růstovým typem, dosaženou úrovní mrazuvzdornosti a akumulací

dehydrinu DHN5 u sady vybraných dihaploidních (DH) linií odvozených z křížení

mezi odrůdami Atlas 68 a Igri (publikace 4).

3

Výsledky a diskuse

1. Zjišťování možnosti využití chladově indukovaných dehydrinů (proteinů) pro odlišení

odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti

Na základě údajů z literatury jsem se zabývala možností využití dehydrinů (na proteinové

úrovni) k rozlišení odrůd ječmene s rozdílnou úrovní dosažené mrazuvzdornosti. Na

transkripční úrovni byla u ječmene za podmínek chladové aklimace popsána exprese genů

Dhn5, Dhn8 a Dhn11 (Choi et al., 1999; Zhu et al., 2000). Na úrovni proteinové exprese byla

popsána výrazná akumulace jednoho vysokomolekulárního dehydrinu - podle

elektroforeogramů označovaného jako protein o molekulové hmotnosti 80 - 90 kDa, čemuž

dle údajů ze sekvenčních databází (databáze NCBI) odpovídá jedině protein DHN5

(molekulová hmotnost vypočtená na základě znalosti proteinové sekvence je 66,5 kDa) (Van

Zee et al., 1995; Bravo et al., 1999; Zhu et al., 2000). Zatímco Van Zee et al. (1995) nenalezli

v podmínkách chladové aklimace významné kvantitativní rozdíly v akumulaci proteinu

DHN5 mezi jarní odrůdou Morex a vysoce odolnou přesívkou Dicktoo, Zhu et al. (2000)

naopak kvantitativní rozdíly v akumulaci DHN5 u stejných odrůd (Morex a Dicktoo), avšak

pěstovaných za poněkud odlišných podmínek, nalezli. Proto jsem nejprve testovala možnost

využití proteinu DHN5 nebo jiného dehydrinu pro rozlišení odrůd s různou úrovní dosažené

mrazuvzdornosti.

Srovnávala jsem akumulaci teplotně stabilních proteinů (dehydriny patří mezi teplotně

stabilní proteiny, které zůstávají ve vodných roztocích rozpuštěny i po varu) u jarní odrůdy

Atlas 68 (odrůda citlivá na chlad) a ozimé odrůdy Igri (relativně odolná odrůda) a nalezla

jsem v průběhu dlouhodobého otužování (0 - 16 týdnů otužování) kvantitativní rozdíly

v akumulaci proteinu DHN5. Identitu proteinu DHN5 jsem potvrdila na imunoblotech za

použití specifické primární protilátky. Proto jsem mohla dospět k závěru, že protein DHN5

mohu použít k rozlišení odrůd s různou úrovní mrazuvzdornosti. K dalším pokusům jsem pak

používala metodu jednorozměrné elektroforézy (1D SDS-PAGE; Laemmli, 1970) spojenou

s detekcí dehydrinů na imunoblotech pomocí specifické primární protilátky proti specifické

dehydrinové sekvenci, tzv. K-segmentu (Close et al., 1993).

Dosaženou úroveň mrazuvzdornosti jsem stanovovala jako hodnoty LT50 (letální teplota,

kterou 50 % vzorku nepřežije) pomocí metody přímého mrazového testu podle Janáčka a

4

Prášila (1991) spojené s následným konduktometrickým hodnocením stupně poškození

listových segmentů podle Prášila a Zámečníka (1998).

2. Dynamika vývoje, dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5

v podmínkách dlouhodobého otužení

2.1. Počáteční stadia otužení (0 - 14 dnů)

V počátečních stadiích otužení byla sledována exprese genu Dhn5, akumulace proteinu

DHN5 a vývoj dosažené úrovně

mrazuvzdornosti u sady dvaceti jedna

odrůd zastupujících všechny růstové

typy - jarní, ozimý a přesívka (Tab. 1).

Exprese genu Dhn5 byla stanovována dr.

Holkovou z MZLU Brno pomocí metody

kvantitativní PCR (tzv. real-time PCR).

Gen Dhn5 není v listech ječmene

pěstovaného za optimálních teplot (20 °C

a vyšší) exprimován. Po vystavení rostlin

podmínkám chladové aklimace je Dhn5

exprimován u všech růstových typů.

Kvantitativní exprese genu Dhn5

vykazuje typický průběh: nejprve rychlý

a výrazný nárůst exprese s dosažením

maxima po 3 - 7 dnech otužení a pak

následný pokles a dosažení nízké

ustálené (steady-state) hladiny exprese

ve stabilních kultivačních podmínkách

(nepřerušená chladová aklimace). Na

úrovni exprese genu Dhn5 nebyly mezi

jednotlivými růstovými typy (přesívky,

jarní a ozimé odrůdy) zjištěny žádné

statisticky významné rozdíly (Obr. 1A).

5

Obdobně jako u genu Dhn5 nebyla zjištěna přítomnost v neotužených listových pletivech ani

u proteinu DHN5. Po vystavení chladu se začal protein DHN5 akumulovat u všech tří

růstových typů. S postupující délkou chladového působení se rozdíly v akumulaci proteinu

DHN5 mezi jednotlivými růstovými typy zvyšovaly s tím, že množství naakumulovaného

proteinu DHN5 přestalo narůstat u jarních odrůd, zatímco u ozimých odrůd a přesívek

množství naakumulovaného proteinu DHN5 i nadále rostlo (Obr. 1B).

Po vystavení rostlin podmínkám chladové aklimace se rovněž začala u všech odrůd zvyšovat

úroveň dosažené mrazuvzdornosti. Počáteční nárůst indukované mrazuvzdornosti byl velký u

všech odrůd, avšak postupně se začaly projevovat rozdíly mezi jednotlivými růstovými typy.

U jarních odrůd se nárůst chladově indukované mrazuvzdornosti po zhruba 7 dnech otužování

výrazně zpomalil, zatímco u přesívek a ozimých odrůd se indukovaná mrazuvzdornost

zvyšovala výrazně ještě po 14 dnech otužování (Obr. 1C).

Tyto výsledky, tj. rychlý nárůst indukované mrazuvzdornosti, hladiny Dhn5 mRNA i

akumulace proteinu DHN5 na počátku otužování a následné zpomalení tohoto trendu, jsou

v souladu s výsledky obdobných studií prováděných na ozimých a jarních odrůdách pšenice

(např. Danyluk et al., 2003; Kane et al., 2005; Ganeshan et al., 2008). Tyto rozdíly

v dynamice vývoje mrazuvzdornosti mohou být vysvětleny pomocí výsledků získaných

Monroy et al. (2007) v transkriptomické studii provedené na jednom ozimém a jednom jarním

kultivaru pšenice s velkým rozdílem v mrazuvzdornosti (9 °C). Monroy et al. zjistili, že chlad

vedl k prudké indukci exprese mnoha chladově indukovaných transkriptů (mRNA) u obou

odrůd, ale pouze ozimá odrůda si dokázala udržet zvýšenou hladinu těchto transkriptů po delší

dobu. Ve svých experimentech jsem obdobnou dynamiku zjistila v případě hodnot dosažené

úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5, avšak nikoliv v případě exprese genu

Dhn5. V tomto případě je nutno zdůraznit, že dynamika exprese určitého genu na transkripční

úrovni a na proteinové úrovni spolu vždy si nemusí vždy navzájem odpovídat, a také, že

dynamika akumulace proteinu odpovídá lépe dynamice vývoje indukované mrazuvzdornosti

ve srovnání s expresí genu Dhn5 na transkripční úrovni. Lze tedy dospět k závěru, že rozdíly

mezi odrůdami s různou úrovní mrazuvzdornosti lze pozorovat pouze na úrovni akumulace

proteinu DHN5, nikoliv na úrovni exprese genu Dhn5 (transkripční úroveň).

6

Tabulka 1. 21 odrůd ječmene, jejich geografický původ, růstový typ (J - jarní; O - ozimý; P - přesívka), počet řad v klasu a jejich mrazuvzdornost stanovená jako LT50 po 3 týdnech otužení. Odrůdy jsou seřazeny sestupně podle jejich hodnot. Zkratky: CZE – Česká republika, DEU – Německo, DNK – Dánsko, FRA – Francie, GBR – Velká Británie, NLD – Nizozemí, NOR – Norsko, RUS – Rusko, USA – Spojené Státy Americké

Odrůda

Zkratka

Původ

Růstový typ Počet řad v klasu

LT50 ( °C)

Lunet Ln CZE P šestiřadý -15,6Dicktoo Dc USA P šestiřadý -15,3Luxor Lx CZE O šestiřadý -15,2Okal Ok CZE O šestiřadý -15,1Hutorok Hu RUS O šestiřadý -14,8Tiffany Ti DEU O dvouřadý -14,5 Luran Lr CZE O šestiřadý -14,4Kromir Ko CZE P šestiřadý -14,3Kromoz Km CZE O šestiřadý -14,3Campill Ca DEU O šestiřadý -14,2Vilna Vi NLD O dvouřadý -13,8Jolante Jl DEU O dvouřadý -13,5Igri Ig DEU O dvouřadý -13,4Duet Du GBR O dvouřadý -13,1Atlas 68 At USA J šestiřadý -11,5Prestige Pr FRA J dvouřadý -11,2Jotun Jt NOR J šestiřadý -11,0Braemar Br GBR J dvouřadý -10,9Diamant Da CZE J dvouřadý -10,9Sebastian Se DNK J dvouřadý -10,9Amulet Am CZE J dvouřadý -10,0

2.2. Pozdější stadia otužení (14 - 112 dnů)

Experimenty týkající se pozdějších stadií otužování byly prováděny na jarní odrůdě Atlas 68,

ozimé odrůdě Igri a sadě dvaceti jedna vybraných dihaploidních (DH) linií odvozených

z křížení mezi odrůdami Atlas 68 a Igri. Vybrané DH linie buď vykazovaly jarovizační

požadavek (ozimé linie) anebo žádnou jarovizaci neměly (jarní linie).

7

Prodloužení doby kultivace v podmínkách chladové aklimace vedlo u ozimých linií

k výraznému zkrácení následné doby kultivace za optimálních teplotních podmínek nutné

k vymetání rostlin. Tímto způsobem byl zjištěn jarovizační požadavek rostlin. U Igri byl

stanoven jarovizační požadavek na cca 63 dnů otužení při kultivaci při 3 °C a 12 hodinové

fotoperiodě. U jarních linií vliv délky otužení na dobu následné kultivace za optimálních

teplotních podmínek nezbytnou pro vymetání rostlin zjištěn nebyl (Obr. 2A). Tato doba se

shoduje se stadiem dvojitých hrbolků u vzrostného vrcholu. Stadium dvojitých hrbolků

indikuje nevratný přechod do reproduktivní fáze vývoje rostlin (Hay a Ellis, 1998). Danyluk

et al. (2003) zjistili, že exprese vernalizačního genu VRN-1, která je nezbytná k přechodu

rostlin do reproduktivního stadia vývoje

(Shitsukawa et al., 2007), časově předchází stadium

dvojitých hrbolků.

Otužení také vedlo k nárůstu hodnot dosažené

mrazuvzdornosti u odrůd Atlas 68 i Igri (Obr. 2B).

V počátečních stadiích otužení byl nárůst

mrazuvzdornosti u obou odrůd rychlý, v pozdějších

stadiích se však začaly mezi nimi objevovat rozdíly.

U odrůdy Atlas 68 přestala mrazuvzdornost dále růst

(přestaly klesat hodnoty LT50), zatímco u Igri

klesaly hodnoty LT50 výrazně delší dobu. Minimální

hodnoty LT50 byly u odrůdy Atlas 68 výrazně vyšší

(cca -13 °C) než u odrůdy Igri (cca -17 °C) a bylo

jich dosaženo výrazně dříve (cca 35 dnů otužení pro

maximální hodnotu LT50 u odrůdy Atlas 68 ve

srovnání s cca 70 dny otužení pro maximální

hodnotu LT50 u odrůdy Igri). Po dosažení

maximálních hodnot indukované mrazuvzdornosti

(minimálních hodnot LT50) došlo v dalších stadiích

otužení u odrůdy Atlas 68 k poklesu

mrazuvzdornosti, zatímco u odrůdy Igri

mrazuvzdornost výrazně neklesla až do konce

otužení (112 dnů). Obdobné výsledky jsem získala i

u DH linií (Obr. 3B), kde míra přežití rostlin po mrazovém testu dosáhla u jarních linií

maxima po 21 dnech otužení a v pozdějších stadiích otužení míra přežití rostlin v případě

8

jarních linií klesala, zatímco u ozimých linií naopak míra přežití rostlin dále rostla až do doby

63 dnů otužení. I po 84 dnech otužení zůstala u ozimých linií úroveň přežití rostlin po přímém

mrazovém testu (pro test byla ve všech případech použita sada tří teplot -10 °C, -12 °C a -14

°C) vysoká, zatímco u jarních odrůd byla ve stejné fázi otužení úroveň přežití rostlin relativně

užení byla již

nízká.

Úroveň akumulace proteinu DHN5 v průběhu prvních

25 dnů otužení u odrůdy Atlas 68 i odrůdy Igri rostla a

mezi odrůdami jsem nezjistila statisticky významné

rozdíly (Obr. 2C a Obr. 4). Za 25 dnů otužení

dosáhla odrůda Atlas 68 maximální akumulace

proteinu DHN5, pak následoval u této odrůdy

významný pokles hladiny naakumulovaného proteinu

DHN5. Obdobně byla u jarních DH linií zjištěna

nejvyšší míra akumulace proteinu DHN5 po 21 dnech

otužení. Naproti tomu u odrůdy Igri akumulace

proteinu DHN5 stále rostla až do 63 dnů otužení

(splnění jarovizačního požadavku). Teprve

v pozdějších stadiích otužení (63 - 112 dnů) hladina

akumulace proteinu DHN5 u Igri klesala. Obdobné

výsledky jsem získala i u ozimých DH linií; největší

rozdíl v akumulaci proteinu DHN5 mezi ozimými a

jarními DH liniemi jsem nalezla při 63 dnech otužení

(Obr. 3C a Obr. 5). Po 112 dnech ot

akumulace DHN5 u odrůdy Igri relativně nízká a

výrazně se nelišila od odrůdy Atlas 68.

Zjistila jsem, že splnění jarovizačního požadavku vede

k poklesu akumulace proteinu DHN5. Tento výsledek

odpovídá tzv. vývojové teorii (developmental theory)

formulované Fowlerem et al. (1999), kteří přišli s myšlenkou, že přechod z vegetativního

stadia vývoje do reproduktivního stadia vývoje vede k poklesu schopnosti rostlin indukovat

mrazuvzdornost a akumulovat COR proteiny za podmínek chladové aklimace. Já jsem však

pozorovala, že Igri a ozimé DH linie si dokázaly udržet zvýšenou úroveň mrazuvzdornosti i

po splnění jarovizačního požadavku (prakticky až do konce otužování). Množství

naakumulovaného proteinu DHN5 však u Igri i u ozimých DH linií po splnění jarovizačního

9

požadavku klesalo. Významný rozdíl mezi dynamikou indukované mrazuvzdornosti a

akumulace dehydrinu (na proteinové úrovni) zjistili Vítámvás a Prášil (2008) při sledování

akumulace proteinu WCS120 u ozimé odrůdy pšenice Mironovská 808 po splnění

jarovizačního požadavku. Tento jev naznačuje, že akumulace dehydrinů na proteinové úrovni

může být používána jako marker dosažené úrovně mrazuvzdornosti jen u těch rostlin ječmene

či pšenice, které jsou ve vegetativní fázi vývoje. Naopak využití akumulace dehydrinů jako

arkerů dosažené úrovně mrazuvzdornosti v reproduktivní fázi vývoje rostlin se jeví jako m

značně problematické.

Mohu tedy shrnout, že

studium vlivu

dlouhodobého otužení

na sadu rostlin

ječmene tvořenou

odrůdami Atlas 68,

Igri a vybranými DH

liniemi ukázalo, že

vztah mezi růstovým

typem rostlin a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 je

v počátečních stadiích otužení poměrně nevýznamný, tj. křížením lze získat jarní DH linie

s relativně vysokou úrovní dosažené mrazuvzdornosti a obráceně (ozimé DH linie s relativně

nízkou úrovní dosažené mrazuvzdornosti). Jedno z možných vysvětlení tohoto jevu může

spočívat ve skutečnosti, že v geonomu ječmene bylo kromě hlavního lokusu mrazuvzdornosti

(lokus Fr-H1) nacházejícího se v těsné vazbě s hlavním lokusem pro jarovizaci (lokus Vrn-

H1) identifikováno více lokusů majících vliv na mrazuvzdornost. Jde především o lokus Fr-

H2, do něhož již byl lokalizován klastr CBF genů (Choi et al., 2002; Francia et al., 2004;

Skinner et al., 2005), které jsou známy ze studií prováděných na Arabidopsis thaliana jako

významné chladově indukované transkripční faktory, které mimo jiné aktivují expresi

různých Cor genů (Jaglo-Ottosen et al., 1998). Aktivace Cor genů za chladu prostřednictvím

CBF transkripčních faktorů byla prokázána i u Triticeae (pšenice a ječmen). Nedávno pak

publikovali Badawi et al. (2007; pšenice) a Stockinger et al. (2007; ječmen) práce, v nichž

ukazují, že se různě odolné odrůdy (jarní a ozimé odrůdy) liší úrovní exprese řady CBF genů

nejen za chladu, ale i za optimálních teplotních podmínek. Stockinger et al. (2007) ve své

práci potvrdili významný vliv lokusu Vrn-H1/Fr-H1 na úroveň exprese mnoha HvCBF genů

10

(především genů HvCBF2 a HvCBF4) lokalizovaných v oblasti Fr-H2. Knox et al. (2008)

dokonce detekovali alelickou variabilitu u jednoho genu TmCBF (gen TmCBF12 lokalizovaný

ve střední části klastru TmCBF genů v lokusu Fr-Am2) u pšenice jednozrnky (Triticum

monococcum). Tito vědci zjistili, že citlivá jarní linie má v geonomu zastoupenu nefunkční

adně ovlivňuje schopnost rostlin ječmene udržet si (angl.

alelu genu TmCBF12, která se v důsledku dalece v oblasti domény AP2 nedokáže vázat do

CRT/DRE oblastí v promotorech Cor genů a nedokáže tudíž indukovat jejich expresi.

Výsledky získané u sady odrůd Atlas 68, Igri a DH linií tudíž mohou být interpretovány na

základě existence a vzájemné výměny dalších Fr lokusů kromě lokusu Vrn-H1/Fr-H1 mezi

jarními a ozimými liniemi. Tyto výměny pak mohou vést ke snížení rozdílů v dosažené

úrovni mrazuvzdornosti a akumulaci proteinu DHN5 mezi jarními a ozimými DH liniemi.

Nicméně ani poměrně odolné jarní linie nejsou schopny dosáhnout takových maximálních

hodnot indukované mrazuvzdornosti (minimálních hodnot LT50) a maximálních hodnot

akumulace proteinu DHN5, které by byly srovnatelné s ozimými liniemi. Důvodem je odlišná

časová dynamika vývoje mrazuvzdornosti u jarních a ozimých linií za stejných podmínek

chladové aklimace, která je podmíněna jejich odlišným vývojem. U jarních DH linií vede

absence jarovizačního požadavku k rychlému přechodu do reproduktivní fáze vývoje rostlin,

což je spojeno se poklesem mrazuvzdornosti. U ozimých DH linií naopak jarovizační

požadavek brání předčasnému přechodu do reproduktivní fáze vývoje spojenému s poklesem

mrazuvzdornosti. Mohu tedy tvrdit, že růstový typ nemá rozhodující vliv na úroveň dosažené

mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u rostlin ječmene v počátečních stadiích

otužení, avšak růstový typ zás

11

maintenance) si zvýšenou úroveň mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v pozdějších

tadiích dlouhodobého otužení.

u

jen tehdy, když jsem hodnotila relativně

s

3. Vztah mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti

Od doby publikace práce Houde et al. (1992) je známo, že chladově indukovaný dehydrin

WCS120 (resp. míra jeho akumulace na proteinové úrovni) může být využíván jako marker

dosažené úrovně mrazuvzdornosti u pšenice. U ječmene byl identifikován ortolog pšeničného

genu Wcs120 a nazván Dhn5 (Close et al., 1995). Chladově indukovaná exprese genu Dhn5

byla popsána na transkripční i proteinové úrovni (Van Zee et

Choi et al., 1999; Zhu et al., 2000), avšak dosud nebyl p

al., 1995; Bravo et al., 1999;

blikován nějaký vztah mezi

kvantitativní úrovní exprese

proteinu DHN5 a dosaženou

úrovní mrazuvzdornosti u

ječmene.

Ve svém experimentu jsem

použila sadu dvaceti jedné

odrůd ječmene různého

geografického původu, v níž

byly zastoupeny všechny

růstové typy - jarní a ozimé

linie i přesívky. Jednotlivé

odrůdy se lišily rovněž

maximální dosaženou úrovní

mrazuvzdornosti (Tab. 1).

Ve 21 dnech otužení byla u

většiny odrůd dosažena dostatečně vysoká úroveň mrazuvzdornosti, takže již byly zjištěny

výrazné rozdíly mezi odrůdami. V čase jsem rovněž analyzovala úroveň akumulace proteinu

DHN5 v listových pletivech a zjistila jsem statisticky významnou (r = 0,9) korelaci mezi

kvantitativní akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti (Obr. 6).

Musím však zdůraznit, že tuto korelaci jsem získala

velký soubor odrůd s výraznými rozdíly v hodnotách dosažené mrazuvzdornosti. Když jsem

počítala např. pouze s jarními liniemi anebo pouze s ozimými liniemi a s přesívkami,

12

statisticky významnou korelaci mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní

mrazuvzdornosti jsem nezískala.

Jak jsem již zmínila v oddíle 2.2., úroveň akumulace proteinu DHN5 a dosažená úroveň

razuvzdornosti korelují pouze u rostlin ve vegetativním stadiu vývoje. Po přechodu do

produktivního stadia jsem zjistila rozdíly v dynamice vývoje indukované mrazuvzdornosti a

kumulace proteinu DHN5, které omezují využití proteinu DHN5 jako markeru indukované

razuvzdornosti pouze na vegetativní stadia vývoje rostlin.

m

re

a

m

13

Závěry

V tomto oddíle shrnuji hlavní výsledky, které jsem získala v publikacích 3 a 4.

• Na základě poznatků z literatury a na základě vlastních experimentů jsem prokázala,

zdornosti a

sady 21 odrůd byla zjištěna statisticky významná

einu DHN5 klesat již po

že protein DHN5 může být používán k rozlišení odrůd ječmene s různou úrovní

dosažené mrazuvzdornosti. Pro detekci rozdílů v akumulaci proteinu DHN5 jsem se

rozhodla použít metodu 1D SDS-PAGE spojenou s detekcí proteinu DHN5 na

imunoblotech pomocí specifické primární protilátky.

• Chlad vede k indukci zvýšené úrovně mrazuvzdornosti a k indukci exprese genu Dhn5

a proteinu DHN5 u odrůd ječmene patřících ke všem růstovým typům - přesívky,

ozimé i jarní odrůdy. V průběhu otužení se však objevují rozdíly spojené s různým

růstovým typem, které jsou pravděpodobně podmíněny různým vývojem rostlin. Jarní

odrůdy, které nemají jarovizaci, ustávají ve zvyšování indukované mrazuv

akumulace proteinu DHN5 dříve než odrůdy ozimé a přesívky (přesívky sice také

nemají jarovizaci, ale dokáží indukovat mrazuvzdornost srovnatelnou s ozimými

odrůdami v důsledku obdobného vývoje - schopnosti setrvat poměrně dlouhou dobu

ve vegetativní fázi vývoje za podmínek krátkodenního světelného režimu).

• Akumulace proteinu DHN5 je indukována chladem a míra akumulace proteinu DHN5

je u různě odolných odrůd odlišná. U

korelace mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti po 21

dnech otužení. Nutno však připomenout, že tato korelace byla zjištěna především

proto, že v souboru odrůd použitém v tomto pokuse byly zjištěny velké rozdíly

v dosažené úrovni mrazuvzdornosti.

• Po vystavení rostlin chladovému působení se jak u jarní odrůdy Atlas 68, tak i u ozimé

odrůdy Igri zvýšila úroveň dosažené mrazuvzdornosti. U obou odrůd se rovněž začal

akumulovat protein DHN5. V průběhu otužení se však mezi oběma odrůdami objevily

rozdíly, které souvisely s odlišnou dynamikou jejich vývoje. Zatímco u odrůdy Atlas

68 začala úroveň dosažené mrazuvzdornosti a akumulace prot

3 týdnech otužení, u rostlin odrůdy Igri se úroveň indukované mrazuvzdornosti a

akumulace proteinu DHN5 zvyšovala až do doby splnění jarovizačního požadavku (9

týdnů otužení). U odrůdy Atlas 68 jsem totiž prokázala jsem výrazně časnější přechod

do reproduktivního stadia vývoje ve srovnání s odrůdou Igri.

14

• Na základě souběžného sledování dynamiky indukované mrazuvzdornosti, akumulace

proteinu DHN5 a vývoje vzrostného vrcholu mohu tvrdit, že přechod do

reproduktivního stadia vývoje (indikovaný tvorbou dvojitých hrbolků) předchází

pokles dosažené úrovně mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 u odrůdy Atlas

68 i u odrůdy Igri. Dále mohu na základě svých výsledků tvrdit, že vzájemný vztah

mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou úrovní mrazuvzdornosti je závislý na

vývojovém stadiu rostlin. Korelaci mezi akumulací proteinu DHN5 a dosaženou

úrovní mrazuvzdornosti jsem nalezla pouze u rostlin ve vegetativním stadiu vývoje.

nemá rozhodující vliv na akumulaci proteinu DHN a na

dosaženou úroveň mrazuvzdornosti v počátečních stadiích otužení, avšak

rozhodujícím způsobem ovlivňuje dlouhodobé udržení (angl. maintenance) zvýšené

úrovně indukované mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5 v průběhu

dlouhodobého otužení.

Naopak u rostlin v reproduktivním stadiu vývoje jsem nalezla výrazné rozdíly

v dynamice vývoje dosažené mrazuvzdornosti a akumulace proteinu DHN5. Tyto

rozdíly mohou být vysvětleny tím, že mrazuvzdornost je kvantitativní znak

determinovaný mnoha faktory a úroveň akumulace dehydrinů je pouze jedním z nich.

• Studium vlivu otužení na sadu odrůd Atlas 68, Igri a soubor dihaploidních linií

ukázalo, že růstový typ

15

Citovaná literatura dersen, J.R., Lübberstedt, T.: Functional markers in plants. - Trends Plant Sci. 8: 554-560, 2003. dawi, M., Danyluk, J., Boucho, B., Houde, M., Sarhan, F

An

Fo

Gu

Ba .: The CBF gene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cereal CBFs. - Mol. Genet. Genomics 277: 533-554, 2007.

Bravo, L.A., Close, T.J., Corcuera, L.J., Guy, Ch.L.: Characterization of an 80-kDa dehydrin-like protein in barley responsive to cold acclimation. - Physiol. Plant. 106: 177-183, 1999.

Choi, D.W., Zhu, B., Close, T.J.: The barley (Hordeum vulgare L.) dehydrin multigene family: sequences, allele types, chromosome assignments, and expression characteristics of 11 Dhn genes of cv. Dicktoo. - Theor. Appl. Genet. 98: 1234-1247, 1999.

Close, T.J., Fenton, R.D., Moonan, F.: A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxy terminal peptide. - Plant Mol. Biol. 23: 279-286, 1993.

Close, T.J., Meyer, N.C., Radik, J.: Nucleotide sequence of a gene encoding a 58.5-kilodalton barley dehydrin that lacks a serine tract. - Plant Gene Register. Plant Physiol. 107: 289-290, 1995.

Danyluk, J., Kane, N.A., Breton, G., Limin, A.E., Fowler, D.B., Sarhan, F.: TaVRT-1, a putative transcription factor associated with vegetative to reproductive transition in cereals. - Plant Physiol. 132: 1849-1860, 2003. wler, D.B.: Cold acclimation threshold induction temperatures in cereals. - Crop Sci. 48: 1147-1154, 2008.

Fowler, D.B., Carles, R.J.: Growth, development, and cold tolerance of fall-acclimated cereal grains. - Crop Sci. 19: 915-922, 1979.

Fowler, D.B., Limin, A.E., Ritchie, J.T.: Low-temperature tolerance in cereals: model and genetic interpretation. - Crop Sci. 39: 626-633, 1999. ncia, E., Rizza, F., Cattivelli, L., Stanca, AFra .M., Galiba, G., Tóth, B., Hayes, P.M., Skinner, J.S., Pecchioni, N.: Two loci on chromosome 5H determine low-temperature tolerance in a ‘Nure‘ (winter) × ‘Tremois‘ (spring) barley map. - Theor. Appl. Genet. 108: 670-680, 2004.

Ganeshan, S., Vítámvás, P., Fowler, D.B., Chibbar, R.N.: Quantitative expression analysis of selected COR genes reveals their differential expression in leaf and crown tissues of wheat (Triticum aestivum L.) during an extended low temperature acclimation regimen. - J. Exp. Bot. 59: 2393-2402, 2008. y, C.L.: Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. - Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187-223, 1990.

Hay, R.K.M., Ellis, R.P.: The control of flowering in wheat and barley: what recent advances in molecular genetics can reveal. - Ann. Bot. 82: 541-554, 1998.

Houde, M., Dhindsa, R.S., Sarhan, F.: A molecular marker to select for freezing tolerance in Gramineae. - Mol. Gen. Genet. 234: 43-48, 1992. lo-Ottosen, K.R., Gilmour, S.J., Zarka, D.G., Schabenberger, OJag ., Thomashow, M.F.: Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. - Science 280: 104-106, 1998.

Janáček, J., Prášil, I.T.: Quantification of plant frost injury by nonlinear fitting of an S-shaped function. - Cryo-Lett. 12: 47-52, 1991. ne, N.A., Danyluk, J., TardifKa , G., Quellet, F., Laliberté, J.F., Limin, A.E., Fowler, D.B., Sarhan, F.: TaVRT-2, a member of the St-MADS-11 clade of flowering repressors, is regulated by vernalization and photoperiod in wheat. - Plant Physiol. 138: 2354-2363, 2005. ox, A.K., Li, C., Vágújfalvi, A., Galiba, G., Stockinger, E.J., Dubcovsky, J.: Identification of caKn ndidate CBF genes for the frost tolerance locus Fr-Am2 in Triticum monococcum. - Plant Mol. Biol. 67: 257-270, 2008. emmli, U.K.: Cleavage of structural proteinsLa during the assembly of the head of bacteriophage T4. - Nature 227: 680-685, 1970. nroy, A.F., Dryanova, A., Malette, B., Oren, D.H., Farajalla, M.R., Liu, WMo ., Danyluk, J., Ubayasena, W.C., Kane, K., Scoles, G.J., Sarhan, F., Gulick, P.J.: Regulatory gene candidates and gene expression analysis of cold acclimation in winter and spring wheat. - Plant Mol. Biol. 64: 409-423, 2007.

16

Prášil, I., Zámečník, J.: The use of a conductivity measurement method for assessing freezing injury. I.

Sa . Springer

Sa

Sh S., Kitagawa, S., Sakamoto, K., Saito, H., Ryuto, H., Fukunishi, N.,

.: Structural, functional, and phylogenetic

Sto BF1 encodes an AP2 domain-

Acad.

Stot the Frost resistance-H2 locus are dependent upon alleles at Fr-H1 and Fr-H2. - Plant J. 51:

Th tory mechanisms. - Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 571-599, 1999.

an Zee, K., Chen, F.Q., Hayes, P.M., Close, TJ., Chen, T.H.H.: Cold-specific induction of a dehydrin gene family member in barley. - Plant Physiol. 108: 1233-1239, 1995.

ítámvás, P., Prášil, I.T.: WCS120 protein family and frost tolerance during cold acclimation, deacclimation and reacclimation in winter wheat. - Plant Physiol. Biochem. 46: 970-976, 2008.

ítámvás, P., Saalbach, G., Prášil, I.T., Čapková, V., Opatrná, J., Jahoor, A.: WCS120 protein family and proteins soluble upon boiling in cold-acclimated winter wheat. - J. Plant Physiol. 164: 1197-1207, 2007.

hu, B., Choi, D.W., Fenton, R., Close, T.J.: Expression of the barley dehydrin multigene family and the development of freezing tolerance. - Mol. Gen. Genet. 264: 145-153, 2000.

Influence of leakage time, segment number, size and shape in a sample on evaluation of the degree of injury. - Environ. Exp. Bot. 40: 1-10, 1998.

kai, A., Larcher, W.: Frost survival of plants. Responses and adaptation to freezing stressVerlag Berlin – Heidelberg – New York – London – Paris – Tokyo 1985.

rhan, F., Ouellet, F., Vazquez-Tello, A.: The wheat wcs120 gene family. A useful model to understand the molecular genetics of freezing tolerance in cereals. - Physiol. Plant. 101: 439-445, 1997. itsukawa, N., Ikari, C., Shimada,Abe, T., Takumi, S., Nasuda, S., Murai, K.: The einkorn wheat (Triticum monococcum) mutant, maintained vegetative phase, is caused by a deletion in the VRN1 gene. - Genes Genet. Syst. 82: 167-170, 2007.

Skinner, J.S., von Zitzewitz, J., Szücs, P., Marquez-Cedillo, L., Filichkin, T., Amundsen, K., Stockinger, E.J., Thomashow, M.F., Chen, T.H.H., Hayes, P.Mcharacterization of a large CBF gene family in barley. - Plant Mol. Biol. 59: 533-551, 2005. ckinger, E.J., Gilmour, S.J., Thomashow, M.F.: Arabidopsis thaliana Ccontaining transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription response to low temperature and water deficit. - Proc. Natl.Sci. USA 94: 1034-1040, 1997. ckinger, E.J., Skinner, J.S., Gardner, K.G., Francia, E., Pecchioni, N.: Expression levels of barley Cbf genes a308-321, 2007. omashow, M.F.: Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regula

V

V

V

Z

17

Seznam publikací Originální práce Kosová, K., Haisel, D., Tichá, I. (2005): Photosynthetic performance of two maize genotypes as affected by chilling stress. Plant, Soil, Environment 51 (5): 206-212. Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V.

008): Expression of dehydrin 5 during the development of frost tolerance in barley 165 (11): 1142-1151.

s 68 × Igri cross during a long-term cold acclimation.

syntézu u rostlin citlivých vůči chladu.

lantarum 51 (4): 601-617.

(2008): Recent advances in breeding of cereals for resistance a review. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 44

KpB C

lastnosti rostlin 2005. Příspěvek na konferenci. Str.

abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2006.

(2(Hordeum vulgare). Journal of Plant Physiology Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J.: The development of frost tolerance and DHN5 protein accumulation in a set of barley (Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from AtlaSubmitted to Environmental and Experimental Botany. Literární rešerše Kosová, K., Tichá, I. (2005): Vliv chladu na fotoBiologické listy 70 (2): 107-128. Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2007): The role of dehydrins in plant response to cold. Biologia P Vítámvás, P. Kosová, K., Prášil, I.T. (2007): Proteome analysis in plant stress research. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 43 (1): 1-6. Kosová, K., Chrpová, J., Šíp, V.to Barley Yellow Dwarf Virus -(1): 1-10.

osová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P. (2008): The relationship between vernalization- and hotoperiodically-regulated genes and the development of frost tolerance in wheat and barley. iologia Plantarum 52(4): 601-615.

ontributions in proceedings

Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T., Prášilová, P., Chrpová, J. (2005): Dehydriny u ječmene (Hordeum vulgare) a jejich funkce v odpovědi rostlin na sucho a chlad V: Vliv abiotických a biotických stresorů na v158-163. Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha - Ruzyně, 11.5. 2005. Kosová, K., Prášil, I. T., Chrpová, J. (2006): Akumulace dehydrinů u dvou kultivarů ječmene (Hordeum vulgare) Atlas 68 a Igri v závislosti na délce působení chladu a osmotického stresu. V: Vliv Příspěvek na konferenci. Str. 264-269. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů ČZU v Praze, Praha 17.5. 2006.

18

Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T., Prášilová, P. (2007): The use of dehydrin 5 in screening for frost tolerance in barley (Hordeum vulgare). In: 4th Workshop on Advances in

olecular Biology: New Approaches in Plant Analysis. Pp. 42-48. Crop Research Institute, .

tr. 239-244. Fakulta agrobiologie, otravinových a přírodních zdrojů ČZU v Praze, Praha 12.-13. 2. 2008.

nosti rostlin vůči ízkým teplotám. V: Konference experimentální biologie rostlin. 11. dny fyziologie rostlin.

ás, P., Prášilová, P., Chrpová, J., Bradáčová, . (2007): Vztah akumulace dehydrinu 5 k odolnosti vůči nízkým teplotám u ječmene

ítámvás, P., Kosová, K. (2007): Proteins and proteomics, in relation to the ost tolerance (stress physiology) of plants. In: Plant Proteomics in Europe. P. 41. COST

rences in the pattern of accumulation of two cold-regulated dehydrin proteins in heat and barley. In: Plant Proteomics in Europe. P. 37-38. COST FA0603. Cordoba, Spain, .-8. 2. 2008.

Kosová, K. (2008): The relationship between development, frost tolerance and accumulation of DHN5 protein in barley (Hordeum vulgare). In: Fresh Insights in Plant Affairs. International conference of PhD students on experimental botany. P. 18. Nové Hrady, 8.-10. 4. 2008.

MPrague-Ruzyně 10. 12. 2007 Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2008): Dehydriny - struktura, funkce a využití při studiu stresů vyvolávajících dehydrataci rostlin. V: Vliv abiotických a biotických stresorů na vlastnosti rostlin 2006. Příspěvek na konferenci. Sp Abstracts in proceedings Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I. T. (2007): Úloha dehydrinů v odolnSborník abstraktů. Str. 57-58. Olomouc, 9.-12. 7. 2007. Kosová, K., Holková, L., Prášil, I. T., VítámvM(Hordeum vulgare L.). V: Konference experimentální biologie rostlin. 11. dny fyziologie rostlin. Sborník abstraktů. Str. 114-115. Olomouc, 9.-12. 7. 2007. (poster) Prášil, I. T., VfrFA0603. Munich, Germany, September 2007. Vítámvás, P., Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P. (2008): WCS120 and DHN5 similarities and diffew6

19

ment of frost tolerance in arley (Hordeum vulgare). Journal of Plant Physiology 165 (11): 1142-1151.

Rukopis 4: Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J.: The development of frost tolerance and DHN5 protein accumulation in a set of barley (Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from Atlas 68 × Igri cross during a long-term cold acclimation. Zasláno do Environmental and Experimental Botany.

Rukopisy, které jsou součástí disertační práce

Rukopis 1: Kosová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P. (2008): The relationship between vernalization- and photoperiodically-regulated genes and the development of frost tolerance in wheat and barley. Biologia Plantarum 52 (4): 601-615. Rukopis 2: Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T. (2007): The role of dehydrins in plant response to cold. Biologia Plantarum 51 (4): 601-617. Rukopis 3: Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V. (2008): Expression of dehydrin 5 during the developb

20

Ruk

The relationship between vernalization- and photoperiodically-regulated genes and the

opis 1

development of frost tolerance in wheat and barley

or/Lea genes are listed. Important regulatory mechanisms, i.e., CBF

athway, controlling the expression of Cor/Lea genes under cold, are discussed. The major

ci affecting the development of FrT in Triticeae, the Fr loci, are characterised. In

onclusion, current progress in this research field is summarized and new questions arising in

e area are formulated.

Kosová, K., Prášil, I.T., Vítámvás, P.

Biologia Plantarum 52(4): 601-615, 2008

Abstract The review summarizes the level of current knowledge of impacts of vernalization and

photoperiod on the induction and maintenance of frost tolerance (FrT) in wheat and barley.

The phenomenon of vernalization is briefly described and the major vernalization (VRN) loci

are characterised. Vernalization requirement and the three major growth habits of Triticeae

(facultative, winter and spring) are defined on the basis of the two-locus VRN-2/VRN-1

epistatic model. Major photoperiodically regulated genes, which influence the transition to

flowering, are characterised and their interactions with VRN genes are briefly discussed. The

phenomenon of induction of FrT during the process of cold acclimation (CA) is described and

the major cold-induced C

p

lo

c

th

21

Rukopis 2

The role of dehydrins in plant response to cold

transcriptional activators, the activity of vernalization genes and

hotoperiodic signals. At the end, we outline some new approaches emerging to the solution

f complex mechanisms involved in plant cold-acclimation, especially methods of functional

enomics that enable to observe simultaneously changes in the activity of many genes and

roteins in one sample.

Kosová, K., Vítámvás, P., Prášil, I.T.

Biologia Plantarum 51 (4): 601-617, 2007

Abstract Dehydrins present a distinct biochemical group of late embryogenesis abundant (LEA)

proteins characterised by the presence of a lysine-rich amino acid motif, the K-segment. They

are highly hydrophilic, soluble upon boiling, and rich in glycine and polar amino acids. It is

proposed that they can act as emulsifiers or chaperones in the cells, i.e., they protect proteins

and membranes against unfavorable structural changes caused by dehydration. Cold usually

preceeds freezing in nature and induces many physiological and biochemical changes in the

cells of freezing-tolerant plant species (cold-acclimation) that enable them to survive

unfavorable conditions. It is demonstrated that the induction of dehydrin expression and their

accumulation is an important part of this process in many dicotyledonous both herbaceous

and woody species, and also in winter cultivars of cereals, especially wheat and barley. Some

mechanisms are discussed which are proposed to be involved in regulation of dehydrin

expression, i.e., endogenous content of abscisic acid, homologues of Arabidopsis C-repeat

binding factor (CBF)

p

o

g

p

22

Ruk

Expression of dehydrin 5 during the development of frost tolerance in barley

opis 3

(Hordeum vulgare)

t as a consequence of different developmental

gulation of FT. The amount of accumulated DHN5 corresponded well with the level of FT

f individual cultivars. It can be concluded that the amount of accumulated DHN5 after a

ertain period of CA differed according to the growth habits of cultivars and can be used as a

arker for determination of FT in barley.

Kosová, K., Holková, L., Prášil, I.T., Prášilová, P., Bradáčová, M., Vítámvás, P., Čapková, V.

Journal of Plant Physiology 165 (11): 1142-1151, 2008

Abstract Dhn5 gene is the major cold-inducible dehydrin gene in barley. This study deals with the

relationship between Dhn5 gene expression and its protein product accumulation and the

development of frost tolerance (FT) upon cold acclimation (CA) in ten barley cultivars of

different growth habit and geographical origin. The activation of Dhn5 gene expression was

determined by qRT PCR, the accumulation of DHN5 protein by protein gel blot analysis

using a specific anti-dehydrin antibody and the actual level of FT by direct frost test. During

the first two weeks of CA, there was a rapid increase in Dhn5 gene expression, DHN5 protein

accumulation and FT in all cultivars examined. After two weeks of CA, the differences in

DHN5 accumulation and in FT measured as lethal temperature (LT50) were observed between

the cultivars belonging to different growth habits: intermediate (I) and winter (W) cultivars

showed a higher level of DHN5 accumulation and LT50 values than the spring (S) ones which

exhibited a lower level of accumulated DHN5 and FT. In contrast, no differences between the

cultivars belonging to different growth habits in Dhn5 mRNA accumulation have been found.

After three weeks of CA, the differences in accumulated DHN5 and FT between the

individual growth habits became eviden

re

o

c

m

23

24

The development in a set of barley

Rukopis 4

of frost tolerance and DHN5 protein accumulation(Hordeum vulgare) doubled haploid lines derived from Atlas 68 × Igri cross during a

long-term cold acclimation

lines when compared with the winter ones. After the

evelopmental transition into the reproductive stage, a significant decrease in DHN5

ccumulation was found in all lines; however, the FT level remained high for quite a long

me. This discrepancy between FT level and DHN5 level in barley plants after the

evelopmental transition is discussed.

Kosová, K., Prášil, I.T., Prášilová, P., Vítámvás, P., Chrpová, J.

Zasláno do Environmental and Experimental Botany

Abstract The dynamics of a long-term cold acclimation (CA) process was studied in spring barley

cultivar Atlas 68, winter barley cultivar Igri and a set of selected doubled haploid (DH) lines

derived from Atlas 68 × Igri cross. The aim of the study was to evaluate the effect of the plant

development on the ability to induce frost tolerance (FT) and to accumulate dehydrin 5

(DHN5) protein during a long-term CA. The developmental stage of the plants was

determined according to the phenological development of shoot apex and by determination of

the length of plant cultivation at optimum growth temperature after a certain period of CA

which was necessary to heading. The level of acquired FT was determined by direct frost tests

in laboratory freezers. The accumulation of DHN5 protein was evaluated by densitometric

analysis of the protein gel blots. The CA treatment led to the induction of increased FT level

and to the accumulation DHN5 protein in both spring and winter DH lines. However, with the

progress of CA treatment, differences between spring and winter DH lines began to occur as

the winter DH lines were able to maintain increased FT level and DHN5 level for a

significantly longer time than the spring DH lines. The probable cause of this difference was

the absence of vernalization in spring lines which led to the much earlier transition into the

reproductive growth stage in the spring

d

a

ti

d