· web viewa doua zi, blocurile au fost spălate o dată în 3 ml apă distilată timp de 10...
TRANSCRIPT
RAPORT DE ACTIVITATE PENTRU ETAPA UNICĂ
PN-II-RU-TE- 2014-4-2037
Perioada raportată: ianuarie-decembrie 2016
Ob.1. Selectarea unui număr semnificativ de tulpini de BGN izolate din diferite
secții spitalicești pozitive pentru gene codificatoare de carbapenemaze stabilite anterior
ca fiind relevante clinic și epidemiologic
1.5. Determinarea clonalitatii tulpinilor izolate prin PFGE si MLST
1.5.1.Prepararea tulpinilor bacteriene selectate pentru tehnica PFGE
(încorporarea în blocuri de agaroză și liza celulară a culturilor bacteriene)
Tulpinile producătoare de carbapenemaze au fost tipizate prin metoda PFGE (Pulsed
Field Gel Electrophoresis). Aceasta presupune încorporarea culturii bacteriene în agaroză,
liza proteinelor celulare, urmată de clivarea ADN bacterian cu enzime cu situsuri de restricție
rare. Migrarea fragmentelor de ADN în electroforeză se realizează cu un aparat care schimbă
direcția curentului electric după un program prestabilit. Profilul electroforetic al ADN rezultat
prin metoda PFGE este comparat, pentru a determina gradul de înrudire al tulpinilor
bacteriene selectate. Criteriile de interpretare ale profilului electroforetic al fiecărei tulpini
sunt descrise în tabelul 1.
Tabelul 1. Criteriile de interpretare ale profilului ADN prin metoda PFGEi
Categoria de
înrudire a profilului ADN
Numărul de diferențe la
nivel genetic între tulpinile
comparate
Diferențele în numărul de
fragmente (benzi) obținute
după elecroforeză
Identice 0 0
Strâns înrudite 1 2-3
Posibil înrudite 2 4-6
Diferite ≥3 ≥7
Tulpinile au fost cutlivate timp de 16-18 ore într-un volum de 1 ml mediu LB lichid,
după care culturile obținute au fost centrifugate (4 min, 8000 rpm) și spălate de două ori cu 1
ml soluție TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8).
Încorporarea culturilor în agaroză:
se prepară o soluție 1,6% de agaroză tip ultrapure, low-melting point (BioRad) în
soluție TE, răcită la temperatura de 56°C;
se amestecă 0,5 ml soluție agaroză cu 0,5 ml suspensie celulară;
amestecul se repartizează în matrițe de plastic - plug molds (matrițe pentru blocuri) -
câte trei pentru fiecare tulpină;
după solidificarea agarozei rezultă blocuri de celule bacteriene încoporate în geloză.
Fiecare bloc a fost introdus în tuburi de tip Falcon de 50 ml, peste care s-au adăugat 3
ml soluție de liză (50 mM Tris, 50 mM EDTA, 1% N-lauril-sarcozină, 0,1 mg/ml proteinază
K, pH 8) și incubat peste noapte la 54°C pe baie de apă cu agitare.
A doua zi, blocurile au fost spălate o dată în 3 ml apă distilată timp de 10 minute la
temperatura de 54°C pe baie de apă cu agitare, apoi de trei ori în 3 ml soluție TE, timp de 25
minute în aceleași condiții. După spălare, blocurile pot fi păstrate în soluție TE la 4°C, până la
un an.
1.5.2.Restricția enzimatică și separarea fragmentelor ADN prin electroforeză în
câmp pulsator
Restricția enzimatică a ADN din celulele încorporate în agaroză a fost catalizată de
enzima XbaI (Promega, Wisconsin, SUA). Fiecare bloc de agaroză a fost tăiat la 1/3 din
dimensiunea inițială, introdus în soluția de digestie (preparată conform indicațiilor
producătorului) și incubat peste noapte la temperatura de 37°C.
După restricția enzimatică a ADN bacterian, a fost preparat gelul pentru electroforeză
(1,2% agaroză tip ultrapure, low-melting point în soluție TBE – Tris acid boric EDTA –
0,5x). Blocurile de agaroză cu ADN au fost transferate pe suprafața pieptenului pentru
electroforeză, iar apoi a fost turnat gelul de migrare, astfel încât blocurile au fost încorporate
în masa gelului.
După solidificare, gelul a fost transferat în aparatul CHEF DR III (BioRad), iar
probele au fost migrate în câmp pulsator, utilizând următoarele condiții de migrare:
voltaj 6V/cm (200 V), timp de 24 h;
timpul inițial de schimbare a direcției curentului: 8-10 sec timp de 4 h;
timpul intermediar de schimbare a direcției curentului: 15-25 sec timp de
16 h;
timpul final de schimbare a direcției curentului: 50-65 sec timp de 4 h;
temperatura de migrare 14°C.
Gelul a fost vizualizat cu bromură de etidiu, prin expunerea la UV și captarea
imaginilor cu un aparat Gel Doc XR + System (BioRad).
1.5.3. Rezultate
În urma screening-ul efectuat în etapa anterioară a proiectului, au fost selectate 34
tulpini de Klebsiella pneumoniae din diferite surse clinice (8 uroculturi, 7 secreție plagă, 4
secreție traheală, 3 hemoculturi, 2 exsudat faringian, 1 septicemie) și 9 de la pacienți
asimptomatici, din portaj anal, provenind de la pacienți internați la Institutul de Boli
Cardiovasculare ”Prof. C.C. Iliescu” și Spitalul Clinic Fundeni. Aceste tulpini au prezentat
fenotip MDR, prezentând rezistență la antibioticele β-lactamice (piperacilină – 88.9%;
ceftazidim – 85.2%; cefepim – 85.2%; aztreonam – 85.2%; ticarcilin – 59.3%; piperacilin/
tazobactam – 51.9%; meropenem – 37% și imipenem – 29.6%), aminoglicozide (gentamicină,
tobramicină -51.9% și amikacină – 14.8%), quinolone (ciprofloxacin și pefloxacin – 51.9%;
levofloxacin și moxifloxacin – 33.4%), tetracicline – 29.6%. Un procentaj ridicat (76%)
dintre tulpini sunt rezistente la colistin. Dintre aceste tulpini, 82% produc β-lactamaza de
spectru extins CTX-M, iar 25% produc carbapenemaza OXA-48. O tulpină este producătoare
de carbapenemază NDM-1, concomitent cu CTX-M-15. Asocierea β-lactamazelor CTX-
M-15 și OXA-48 și, respectiv, TEM și OXA-48 a fost observată la 6% dintre tulipini.
Analiza PFGE a relevat prezența a 10 pulsotipuri, însă niciunul dintre acestea nu a
putut fi corelat cu un anumit fenotip de rezistență.
Lambda Ladder PFG Marker Biolabs; 2- K17; 3-K23; 4-K4; 5-K18; 6- K10; 7-K16; 8-K19; 9-K8; 10-K12; 11-K17; 12-K25; 13-K20; 14- Lambda Ladder PFG Marker Biolabs
1. Lambda Ladder PFG Marker Biolabs; 2- K13; 3-K5; 4-K9; 5-K15 498; 6- E21; 7-K27 642; 8-K58; 9-K3825; 10-K29653; 11-K1305; 12-K57; 13-K30453; 14- Lambda Ladder PFG Marker Biolabs; 15- godeu liber
1-Lambda Ladder PFG Marker Biolabs; 2- E 21 825; 3-E24 992; 4-E23; 5-E41; 6- E61; 7-E66; 8-E70; 9-E75; 10-K4 1311; 11-K7 1043; 12-K11 1071; 13-K16; 14- Lambda Ladder PFG Marker Biolabs; 15-K19 449
Astfel, se observă că rezistența la antibiotice (specific prin producere de β-lactamaze
de tip CTX-M-15, OXA-48 și TEM) nu este corelată cu o clonă specifică, ceea ce sugerează
răspândirea policonală a rezistenței în mediul spitalicesc, mediată de elemente genetice
mobile.
Tulpinile de Acinetobacter baumannii care produc blaOXA-72 vor fi tipizate prin tehnica
PFGE în etapa următoare a proiectului.
1.5.4. Selectarea unor tulpini reprezentative din fiecare profil PFGE pentru
aplicarea tehnicii MLST
În această etapă a proiectului au fost selectate tulpini aferente fiecărui pulsotip, pentru
care s-a efectuat optimizarea reacției PCR pentru evidențierea genelor house-keeping
specifice fiecărei specii, urmând ca în etapa următoare a proiectului să fie realizate
activitățile de amplificare prin PCR a genelor house-keeping la tulpinile selectate,
secvențierea ampliconilor și interpretarea rezultatelor pentru aplicarea schemei MLST.
Tabelul 2. Genele house-keeping ce vor fi utilizate in tipizarea tulpinilor cu diferite
profiluri PFGE cu ajutorul metodei MLSTii,iii,iv.
K. pneumoniae P. aeruginosa A. baumannii
rpoB (subunitatea β a ARN
polimerazei);
gapA (gliceraldehidă 3-
fosfat dehidrogenaza);
mdh (malat
dehidrogenaza);
pgi (fosfoglucozo
izomeraza);
phoE (fosforina E);
infB (factorul 2 de inițiere
a translației);
tonB (transductor
periplasmic).
acetil coenzima A sintetază
(acsA),
shikimat dehidrogenază
(aroE),
GMP sintază (guaA),
proteina ,,reparatoare” a
AND (mutL),
lanțurile C, D ale NADH
dehidrogenazei I (nuoD),
fosfoenolpiruvat-sintază
[ppsA]
componentul I al
antranilat-sintetazei I
(trpE);
cpn60 (60-KDa
chaperonin)
fusA (factorul de elongare
EF-G)
gltA (citrat sintetaza)
pyrG (CTP sintetaza)
recA (factor de
recombinare omolog)
rplB (subunitatea 50S a
proteinei ribosomale L2)
rpoB (ARN polimeraza
subunitatea B)
Colaborarea cu dr. Zong Zhiyong - Infectious Diseases Centre of West China Hospital
of Sichuan University, ne-a permis aplicarea unor metode cu o rezolutie mai mare decât cele
prevăzute inițial pentru îndeplinirea obiectievelor propuse, respectiv secvențierea integrală a
plasmidelor de rezistență, astfel că abordarea eperimentală a anumitor activități prevăzute în
planul inițial al proiectului, și anume determinarea localizarii in genom
(cromosomale/plasmidiale) a genelor codificatoare de carbapenemaze, restricția enzimatică
a plasmidelor transferate prin conjugare, design-ul unor primeri specifici, in amonte si in
aval de genele/alelele cu grad mare de risc, care sa acopere o distanta de cca 10 kb,
utilizarea acestor primeri pentru clonarea si sceventierea fragmentelor flancatoare de ADN,
secventierea ampliconilor obtinuti si analiza bioinformatica a secventelor acestora, in
vederea identificarii prezentei unor eventuale elemente transpozabile, nu a mai fost necesar în
aceasta etapă a proiectului.
Ob.3. Evaluarea potentialului de transfer al genelor/alelelor CPG cu risc crescut 3.1. Studiul capacității de transfer a genelor plasmidiale de rezistență la carbapeneme
(conjugare), compararea secvențelor plasmidelor transferate cu cele ale plasmidelor
localizate în baza de date GeneBank prin metoda RFLP/digestie in silico.
3.1.1.Inocularea în mediu solid/lichid a câte unei tulpini rezistente
reprezentative, concomitent cu o tulpină bacteriană cu marker de selecție în prezența unei
concentrații subinhibitorii de imipenem.
Investigarea transferabilității genelor de rezistență la antibiotice a fost efectuată pentru
două tulpini: Morganella morganii producătoare de carbapnemază NDM-1 și Acinetobacter
baumannii producătoare de carbapenemază OXA-72
Pentru realizarea experimentelor de conjugare pentru M. morganii s-au realizat
suspensii celulare cu densitatea optică echivalentă standardului 2 McFarland (aproximativ 600
x 106 UFC/ml) din culturile tulpinilor donor și tulpina receptor - E.coli J53 (rezistentă la azida
de sodiu), în faza staţionară. Cantități egale din cele două suspensii (0,5 ml) au fost inoculate
într-un volum de patru ori mai mare de mediu lichid (4 ml LB) și incubate peste noapte la
37°C. Selecția conjuganților s-a realizat pe mediu de cultură MacConkey cu adaus de 1mg/l
imipenem și 130µg/ml azidă de sodiu.
Pentru realizarea experimentelor de conjugare pentru tulpina de A. baumannii s-au
realizat suspensii celulare cu densitatea optică echivalentă standardului 2 McFarland
(aproximativ 600 x 106 UFC/ml) din culturile tulpinilor donor și tulpina receptor de A. bailyi
ADP1 (rezistentă la rifampicină) în fază staţionară de crestere. Cantități egale din cele două
suspensii (0,5 ml) au fost inoculate într-un volum de patru ori mai mare de mediu lichid (4 ml
LB) și incubate peste noapte la 37°C. Selecția conjuganților s-a făcut pe mediu de cultură BHI
cu adaus de 0,2mg/l meropenem și 300µg/ml rifampicină.
3.1.2.Investigarea transconjuganților prin metode fenotipice (Blue-Carba) și
moleculare (PCR) pentru confirmarea transferului conjugativ
Conjuganții (tulpina receptor care a dobândit elementul genetic mobil purtător al genei
de rezistență) au fost testați cu testul Blue-carba pentru producere de carbapenemaze,
rezultatul fiind confirmat prin PCR folosind primerii pentru genele blaNDM și blaOXA-72, iar
rezultatele au fost pozitive pentru ambele categorii de teste de confirmare.
3.1.3.Izolarea ADN plasmidial din transconjuganți
Pentru tulpina de M. morgannii, pentru izolarea de ADN plasmidial a fost izolat
utilizând kit-ul QUIAGEN Plasmid Mini Kit, conform indicațiilor producătorului. În cazul
tulpinii de A. baumannii, nu a fost necesară purificarea ADN plasmidial.
3.2. Secvențierea plasmidelor purtătoare de gene de rezistență
3.2.1. Secvențierea plasmidei purtătoare a genei bla OXA-72
Plasmida denumită pICUB_Aba1886 a fost secvențiată folosind o abordare de tip
primer-walking. Aceasta a presupus construirea unor primeri care să permită secvențierea
”din aproape în aproape” a întregii plasmide. Analiza bazei de date GenBankv
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) a relevat prezența genei blaOXA-72 în plasmide de
aproximativ 10.000 pb. Secvențele acestora au fost aliniate utilizând software-ul Mauve
progressive aligner (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html)vi, pentru a evidenția regiunile
comune ale acestor plasmide. Pe baza accestor regiuni, au fost construiți primeri specifici
pentru amplificarea și secvențierea plasmidei pICUB_Aba1886, folosind software-ul
PrimerBlast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)vii. Toți produșii de amplificare
au fost secvențiați la ambele capete prin metoda Sanger. Asamblarea secvențelor a fost
realizată utilizând software-ul Genome ARTIST (www.genomeartist.ro)viii. Adnotarea
secvenței asamblate a fost efectuată utilizând software-le GeneMark
(http://exon.gatech.edu/GeneMark/gmhmmp.cgi)ix și BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)x. Încadrarea plasmidei în grupul de rezistență a fost
realizată folosind metoda PCR in silico, utilizând software-ul PrimerBlast. Secvența acestei
plasmide urmează să fie depusă în baza de date GenBank.
Plasmida pICUB_Aba1886 aparține grupului II (GRII) al plasmidelor de rezistență de
la A. baumannii. Analiza secvenței plasmidei a relevat prezenta unei secvențe de inserție
(transpozon) numită ISAba31, localizată în vecinătatea genei blaOXA-72. Acest transpozon este
susceptibil să medieze mobilizarea genei de rezistență blaOXA-72, ceea ce reprezintă un semnal
de alarmă referitor la potențialul de transfer al acestei gene. De asemenea, au fost cartate două
gene de virulență: spl - al cărei produs, septicolizina,este o toxină formatoare de pori și TonB-
dependent receptor, al cărei produs, un recetor membranar localizat în membrana externă,
receptor-dependent-TonB, este responsabil de preluarea fierului în celula microbiană și în
virulență, fiind probabil implicat în menținerea viabilității celuei bacteriene în țesutul
pulmonar și sânge). Astfel, aceste rezultate relevă prezența unei platforme mobile într-o
tulpină de tip XDRxi (Extended Drug Resistant) de A. baumannii în țara noastră. Deoarece a
fost observată o omologie de secvență de 99% cu o plasmidă identificată la o tulpină de A.
baumannii din Serbia (Accession No. KX230793.1)xii este probabilă diseminarea acestei
plasmide în Europa de Est.
3.2.2. Secvențierea plasmidei purtătoare a genei bla NDM-1
ADN plasmidial izolat din tulpina de M. morgannii a fost secvențiat utilizând o
metodă paired-end (2 x 125 bp) whole genome sequencing, cu acoperire (coverage) de
calitate aproximativ 100x, folosind un secvențiator HiSeq2500 (Illumina). Reads-urile
rezultate au fost asamblate de novo în contiguri, folosind software-ul Spades
(http://cab.spbu.ru/software/spades/)xiii. Adnotarea a fost realizată cu ajutorul software-lor
Prokka (http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml)xiv, GeneMark și Genome
ARTIST. Secvențele de inserție au fost adnotate folosind software-le ISFinder (https://www-
is.biotoul.fr/)xv și Genome ARTIST.
Analiza bioinformatică a condus la determinarea unei secvențe parțiale a plasmidei ce
poartă gena NDM-1, plasmidă denumită pICUB_Mmo2580. Această secvență are un conținut
de nucleotide GC de 48,36%. A fost cartată prezența a 6 gene de rezistență pentru patru clase
de antibiotice: β-lactamice (blaNDM-1 și blaDHA-1), aminoglicozide (armA), sulfonamide (sul1) și
macrolide (msr și mph(E)). De asemenea, au fost observate mai multe secvențe de inserție
astfel: ISKpn21 și IS903B, ambele în câte două copii, și câte o copie a secvențelor de inserție
ISEc29 și ISEc29 și ISCR1. Analiza comparativă a acestei plasmide parțiale a evidențiat rate
înalte de omologie cu plasmide de la alte enterobacterii (în special de la K. pneumoniae).
Notabil este însă un fragment de aproximativ 10.000 pb, care poartă, în ordine, genele
mph(E), msr, ISEc29, armA, ISEc28, ISCR1șisul1. În cazul plasmidei pICUB_Mmo2580,
adăugarea genelor de rezistență la β-lactamice la o regiune genetică codificatoare pentru
diferite alte gene de rezistență conduce la generarea unei platforme genetice MDR (Multi
Drug Resistance). Omologiile de secvență ale acestei plasmide cu altele din bazele de date
provenite de la diferite specii de enterobacterii, coroborat cu adăugarea genelor de rezistență
la diferite clase de antibiotice, sugerează posibilitatea unor recombinări genetice, argument
sprijinit de evidențierea a mai multor secvențe de inserție, care au rol în mobilizarea genelor.
Astfel, aceste rezultate reprezintă prima descriere în România a unei platforme
purtătoare de gene de rezistență la diferite clase de antibiotice, la Morganella morganii, un
patogen oportunist până nu de mult neglijat din punct de vedere epidemiologic.
Ob.4. Implementarea algoritmilor și protocoalelor moleculare pentru
identificarea gradului de risc si al potentialului de transfer pe orizontala a anumitor
CPG în clinicile și spitalele din România
4.1. Comunicarea progreselor înregistrate pe parcursul proiectului pe pagina web a
proiectului pentru specialiștii români implicați în managementul rezistenței la antibiotice -
http://carmenchifiriuc.ro/?page_id=226
4.2. Rezultatele obținute au fost discutate cu colaboratorii din clinicile în cadrul cărora
au fost izolate tulpinile.
5. Coordonarea si monitorizarea optima a activitatilor de cercetare stiintifica
5.2. Organizarea unor intalniri periodice cu toti membrii echipei pentru centralizarea
si prelucrarea datelor experimentale
În perioada 05-16 Iulie 2016 doi dintre mebrii echipei au efecuat un stagiu de
cercetare la Centre of Infectious Diseases, West China Hospital (Huaxi), Chengdu, Sichuan,
China, sub coordonarea Prof. Dr. Zong Zhiyong.
6. Valorificarea si diseminarea rezultatelor
6.1. Comunicarea rezultatelor obtinute in cadrul ECCMID – European Congress for
Clinical Medicine and Infectious Diseases, 9-12 April, 2016, Amsterdam, The Netherlands (3
postere), Vilnius International Communicable Disease week (26 Iunie-1 Iulie, 2016, Vilnius,
Lituania) (1 poster), Conferința Școlii Doctorale a Universității Dunărea de Jos, 4 Iunie,
2016, Galați, România (1 conferință plenară), Conferinta Diaspora, 25-28 Aprilie, 2016,
Timișoara, România (1 poster), 19th INTERNATIONAL SYMPOSIUM – SIMI
2016„ENVIRONMENT AND INDUSTRY” 13-14 Octombrie, București, România (2 postere).
6.2. Cel putin patru publicatii in reviste ISI/2 BDI – în această etapă au fost publicate
5 articole în reviste ISI cu factor de impact, 5 articole publicate în reviste indexate ISI, dar
fără factor de impact calculat, 2 articole in extenso în reviste indexate BDI și 3 capitole de
carte.
Bibliografie seelctivă
i Tenover F. C., Arbeit R. D., Goering R. V., Mickelsen P. A., Murray B. E., Persing D. H., Swaminathan B. 1995.
Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial
strain typing. J. Clin. Microbiol. 33: 2233–2239.ii http://www.pasteur.fr/mlst/.iii http://pubmlst.org/paeruginosa/.iv http://pubmlst.org/abaumannii/info/primers_Pasteur.shtml.v Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., & Sayers, E. W. 2016. GenBank. Nucleic Acids Research, 44:
D67–D72. http://doi.org/10.1093/nar/gkv1276vi Darling A.E., Mau B., Perna N.T. 2010. progressiveMauve: Multiple Genome Alignment with Gene Gain, Loss and
Rearrangement. PLoS ONE 5(6): e11147. doi:10.1371/journal.pone.0011147vii Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T. 2012. Primer-BLAST: A tool to design
target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13:134.viii Ecovoiu A. A., Ghionoiu I. C., Ciuca, A. M, Ratiu, A. C. 2016. Genome ARTIST: a robust, high-accuracy aligner
tool for mapping transposon insertions and self-insertions. Mobile DNA. 7(3). http://doi.org/10.1186/s13100-016-
0061-0ix Borodovsky M., Lomsadze A. 2014. Gene identification in prokaryotic genomes, phages, metagenomes, and EST
sequences with GeneMarkS suite. Curr Protoc Microbiol. doi: 10.1002/9780471729259.mc01e07s32x Altschul S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D. J. 1990. Lipman Basic local alignment search tool. J Mol
Biol. 215(3): 403–410. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2 xi Magiorakos A.P., Srinivasan A., Carey R.B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., Harbarth S., Hindler J.F.,
Kahlmeter G., Olsson-Lilijequist B., Paterson D.L., Rice L.B., Stelling J., Struelens M.J., Vatopolus A., Weber J.T.,
Monnet D.L. 2012. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international
expert proposal for iterim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 18: 268-281.xii Dortet L., Bonnin R.A., Bernabeu S., Escaut L., Vittecoq D., Girlich D., Imanci D., Fortineau N., Naas T. 2016. First
occurrence of OXA-72-producing Acinetobacter baumannii in Serbia. Antimicrob Agents Chemother 60:5724–5730.
doi:10.1128/AAC.01016-16.xiii Bankevich A., Nurk, S., Antipov D., Gurevich A. A., Dvorkin M., Kulikov A. S., Pevzner, P. A. 2012. SPAdes: A
New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational
Biology, 19(5), 455–477. http://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021xiv Seemann T. 2014. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30(14):2068-9. PMID:24642063xv Siguier P. et al. 2006. ISfinder: the reference centre for bacterial insertion sequences. Nucleic Acids Res. 34: D32-
D36