Materia: MicrobiologíaProfesor: Abate, Sergio.Alumnas: Klopertanz, Naiara; Saade, Valeria; Santos Vega, Carolina. Año: 2016

Introducción al tema:

Qué es el Glifosato? El Glifosato(N-(fosfonometil) glicina) es un compuesto orgánico, soluble en agua, formado por una fracción de glicina y un radical aminofosfato. Naturalmente se puede encontrar en su forma ácida pero es usado generalmente en su forma de sal, más comúnmente como sal de isopropilamina de Glifosato.

El Glifosato es un compuesto utilizado como herbicida no selectivo de amplio espectro. Es aplicado con el fin de terminar con la presencia de hierbas, arbustos, cultivos leñosos, frutales, viñas y viveros. Una vez ingresado a la planta, además de sus efectos mortales, llega por las raíces hasta el suelo de los cultivos, siendo muy estable y difícil de degradar.Uno de los herbicidas más utilizados es el Roundup, producido por Monsanto, aplicado generalmente en cultivos transgénicos, modificados genéticamente para ser tolerantes a este compuesto. También para brindar protección contra plagas y mejor rendimiento en los cultivos. Este herbicida es filtrado a través de las capas de la tierra eliminando los microorganismos beneficiosos del suelo, incluyendo los que actúan como control biológico de patógenos, pudiendo llegar a pozos de aguas subterráneas o desembocar en ríos cercanos del cultivo.

El Glifosato es nocivo para la salud debido a su efecto gravemente tóxico sobre las células de los humanos causando alteraciones genéticas. Puede generar autismo, enfermedad inflamatoria del intestino, diarrea crónica, colitis y enfermedad de Crohn, obesidad,

enfermedad cardiovascular, depresión, cáncer, alzheimer, enfermedad de Parkinson, diabetes,

entre otros. Tabla: Consumo de glifosato y del total de productos fitosanitarios utilizados en las provincias, según el tipo de cultivo y actividad. Argentina. 2007.

Efectos sobre aguas superficiales y subterráneasLa contaminación de aguas subterráneas con glifosato resulta poco probable, excepto en el caso de un derrame apreciable o de otra liberación accidental o descontrolada. En aguas superficiales, la sustancia puede encontrarse cuando se aplica cerca de los cuerpos de agua, por efecto de la deriva o a través de la escorrentía. Estudios en otros países indican que la persistencia del herbicida en el suelo podría alcanzar 6 meses, si bien debe considerarse que el clima templado, como el de algunas regiones de la Argentina donde se lo utiliza, aumentaría la velocidad de degradación del producto y su metabolito. La normativa argentina establece un límite máximo de glifosato en aguas de bebida de 0,3 mg/L.

Qué es la biorremediacion?Se conoce como biorremediación a la utilización de bacterias como medio de solución para la descontaminación de suelos y aguas con glifosato.Ventajas de biorremediación: Técnica segura y económica; los contaminantes son transformados y algunos llegan a la mineralización produciendo CO2 y H2O; se utilizan

microorganismos autóctonos y exógenos; el suelo saneado no requiere un confinamiento posterior.Desventajas de biorremediación: Los microorganismos pueden inhibirse por la presencia de altas concentraciones de contaminantes; requiere de largos períodos de tiempo.

Características generales del grupo de   Pseudomonas

Las bacterias del grupo al que pertenecen Pseudomonas está constituido por microorganismos Gram-negativos, siempre móviles con flagelación polar. Se encuentran normalmente en el suelo, aunque pueden ser patógenos oportunistas en animales (Ps. aeruginosa) y patógenos de plantas (Ps. syringae).

Su metabolismo es siempre respiratorio, o bien aerobio (la mayoría usa como aceptor de electrones O2) o anaerobio (algunos usan NO-). Presentan una versatilidad metabólica muy grande que se traduce en su capacidad de utilizar como fuente de carbono substratos muy variados (hay especies, como Ps. cepacia, que pueden utilizar como nutrientes más de 100 compuestos químicos diferentes). Por otra parte, hay algunos individuos del grupo que son quimiolitotrofos usando H2 o CO como donadores de electrones.

Algunas Pseudomonas (p.ej. Ps. aeruginosa) son capaces de llevar a cabo procesos de desnitrificación (NO3

-  NO2-  N2) con lo que se empobrecen los suelos de nitrógeno

utilizable desde el punto de vista agrícola. Este proceso de reducción del nitrógeno (que actúa como aceptor de electrones en un proceso de respiración anaerobia) se denomina reducción disimilatoria del nitrógeno.

La versatilidad metabólica del grupo se debe a la presencia de un gran número de plásmidos que contienen operones inducibles para la síntesis de enzimas específicas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. Esto confiere una importancia grande a las bacterias del género Pseudomonas como digestores aerobios de materiales animales y vegetales, lo que contribuye al reciclaje biológico de materia orgánica.

Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Estos pigmentos actúan como sideróforos: moléculas cuya función es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del microorganismo

TOLERANCIA Y DEGRADACIÓN DEL GLIFOSATO POR BACTERIAS AISLADAS DE SUELOS CON APLICACIONES FRECUENTES DE ROUNDUP SL®

Esta investigación evaluó la degradación del glifosato, la resistencia bacteriana a diferentes concentraciones de este compuesto y la afinidad por compuestos hidrofílicos o hidrofóbicos de bacterias aisladas de suelos donde se emplea comúnmente el herbicida Roundup SL®.

En las muestras de suelos se aislaron catorce cepas bacterianas que crecieron en glifosato como única fuente de carbono. De estas bacterias por turbidimetría se escogieron: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Burkolderia gladioli y Flavimonas oryzihabitans. INTRODUCCIÓN

El mecanismo de acción de estos herbicidas se basa en la inhibición de la enzima 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintetasa (EPSPS), responsable de la biosíntesis del corismato.En el suelo, el glifosato es fuertemente adsorbido por los minerales de arcillas y materia orgánica, compitiendo con el fósforo por sus sitios de unión. Este compuesto es degradado por microorganismos edáficos en dependencia del tipo de suelo, concentración de nutrientes, pH, temperatura y humedad. Los microorganismos, principalmente las bacterias, son capaces de catabolizar compuestos organofosfonados, los cuales utilizan como fuente de carbono, nitrógeno y fósforo. Las bacterias degradan el glifosato por dos vías, produciendo como intermediarios glicina o ácido aminometilfosfónico.

MATERIALES Y MÉTODOSZona de muestreo: El estudio fue realizado al norte del Municipio de Facatativa (Cundinamarca, Colombia), en la zona San Rafael bajo.

Toma de muestras

Se estableció una unidad de muestreo relativamente uniforme en cuanto a suelos (tipo y uso) y topografía, a partir de un punto al azar, se siguió un recorrido en zig-zag, recolectando cinco submuestras cada 200 m2 (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC), para un total de 30 muestras compuestas. Las muestras fueron tomadas de 5 a 10 cm de profundidad (Horizonte A), en bolsas de polietileno debidamente marcados para su posterior procesamiento en el laboratorio.

Cultivo, aislamiento e identificaciónMedios de cultivo: Para el pre-enriquecimiento se utilizaron tres medios líquidos con glifosato al 1 %, como única fuente de carbono, llamados G1, G2 y G3. Los tres medios variaron en su fuente de nitrógeno, nitrato de amonio, cloruro de amonio o extracto de levadura fueron adicionados a los medios G1, G2 y G3 respectivamente. Los otros componentes de los tres medios fueron cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato de potasio. Adicionalmente el medio G3 contenía biotina y piridoxina.Métodos de Cultivo y aislamiento: Las muestras de suelo fueron llevadas a preenriquecimiento en 45 mL de los medios líquidos G1, G2 y G3 y se incubaron por un periodo de 10 días a una temperatura de 17 º C. Luego se realizaron repiques a los medios sólidos correspondientes para aislamiento de los microorganismos. De acuerdo con sus características macroscópicas y microscópicas se sembraron en agar nutritivo, realizando nuevamente coloración de Gram para asegurar la pureza de los aislamientos.Identificación: Se utilizaron pruebas bioquímicas convencionales para bacterias Gramnegativas fermentadoras y no fermentadoras. Los resultados se confirmaron mediante el sistema comercial de identificación microbiana BD BBL Crystal Enteric/Nonfermenter ID.

Métodos analíticosPrueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano: Las cepas puras fueron sembradas en medio líquido G3 a partir de agar nutritivo. El desarrollo bacteriano fue medido por espectrofotómetro a 660 nm escogiendo las cuatro mejores bacterias en cuanto a crecimiento. A las cepas escogidas se les realizo curvas de crecimiento cada 24 h hasta 264 h.Antagonismo: Esta prueba se realizó con el fin de evaluar si las cepas escogidas presentaban o no inhibición de crecimiento, lo que determinó las diferentes mezclas para la evaluación cromatográfica. La técnica utilizada fue la prueba de anillos de vidrio con un diámetro de 0.5 cm y 0.7 cm de alto.Toxicidad: A partir de una concentración inicial de glifosato 48 % m/v (según instrucciones del Roundup SL producido por Monsanto) se realizaron las siguientes concentraciones: 0,25, 0,48, 2, 10, 15, 20, 30 y 40 %. Las bacterias puras y en consorcios, según los resultados obtenidos por la prueba de antagonismo, fueron inoculadas en estas concentraciones por un tiempo de 72 horas, realizando recuentos en placa sobre agar nutritivo.Medida de hidrofobicidad: Esta prueba determinó el grado de afinidad de las bacterias por compuestos hidrofílicos o hidrofóbicos; mediante el método de adherencia al poliestireno por tinción con el colorante violeta de genciana.Cromatografía: La biodegradación (descomposición biótica) del glifosato por las bacterias escogidas y sus mezclas se analizaron por cromatografía de papel con dimensiones de 22 cm de largo x 3 cm de ancho y como solvente se utilizó agua/metanol 2:3 v/v.

RESULTADOS Y DISCUSIÓNCultivo, aislamiento e identificaciónSe aislaron cinco géneros bacterianos que utilizaron el glifosato como única fuente de carbono, predominando Pseudomonas spp. con un 42, 9 %. Las especies aisladas de este género fueron cercanas a P. cichorii, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. stutzeri y P. vesicularis. También se aislaron cepas cercanas a Burkholderia cepacia, B. gladioli, Alcaligenes sp., Flavimonas oryzihabitans y Pantoea aglomerans.Se comprobó que el glifosato es mejor fuente de fósforo que de carbono.

Métodos analíticosPrueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano: Todas las bacterias escogidas crecieron bien con glifosato como única fuente de carbono. La fase de adaptación al herbicida fue más larga en F. oryzihabitans y B. gladioli con un promedio de 72 horas; mientras que en P. aeruginosa y P fluorescens, la duración fue de 48 y 12 h respectivamente. Estos resultados sugieren que estas bacterias posiblemente se adaptaron y utilizaron más fácilmente al glifosato como única fuente de carbono y concuerda con los crecimientos celulares presentados por P. putida en un medio de cultivo similar con una fase de adaptación (lag) de aproximadamente 8 horas y P. fluorescens con una fase lag de aproximadamente 12 horas con 2,5% de glifosato. En la naturaleza la eficiencia en la degradación de glifosato está dada por la relación planta-microorganismo, las especies vegetales y microbianas, el tipo de suelo, dosis aplicada y condiciones experimentales.

Figura 2. Curvas de crecimiento de las bacterias escogidas en medio líquido con glifosato al 1% y extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno.

Antagonismo: Al enfrentar la bacteria P. aeruginosa con B. gladioli se presentó un halo de inhibición de 0,4 cm y con F. oryzihabitans 0,45 cm. Al mismo tiempo, al enfrentar B.

gladioli con P. aeruginosa se observó la presencia de un halo de 0,3 cm. En el caso de la bacteria F. oryzihabitans al enfrentarse con P. aeruginosa mostró un halo de inhibición de 0,4 cm. Tomando como referencia estos resultados se pudieron realizar las siguientes mezclas: F. oryzihabitans + P. fluorescens + B. gladioli y P. fluorescens + P. aeruginosa. Esta prueba por lo tanto dio lugar a la formación de dos consorcios para realizar las cromatografías y las pruebas de toxicidad.Toxicidad: En la prueba de toxicidad todas las bacterias arrojaron patrones diferentes de resistencia al compuesto con crecimientos en los medios que contenían hasta un 10 % de glifosato en el caso de P. aeruginosa, 2 % para P. fluorescens y B. gladioli y 0.25 % en el caso de F. oryzihabitans. Los consorcios mostraron una mejor resistencia con crecimientos hasta 20 o 30 % del herbicida para B. gladioli + F. oryzihabitans + P. fluorescens y P. fluorescens + P. aeruginosa, respectivamente. La importancia funcional de las asociaciones en consorcios se demuestra por la capacidad de resistencia a altas dosis de sustancias químicas, donde los microorganismos que conforman el consorcio actúan benéficamente entre sí para tolerar diferentes concentraciones de los compuestos y metabolizarlos, lo cual podría ser la explicación de la resistencia de los dos consorcios bacterianos evaluados en esta investigación. Medida de hidrofobicidad: Las bacterias estudiadas prefieren compuestos hidrofílicos como lo es el glifosato. El potencial de hidrofobicidad está correlacionado con la estructura de los microorganismos teniendo influencia sobre mecanismos de adhesión a diferentes sustancias.Cromatografía: Los procedimientos de cromatografía realizados con el revelador ninhidrina, dieron un valor Rf de 0,63 para el glifosato. (El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7)

A las 264 horas se observan diferencias significativas en los porcentajes de degradación (P=0,004), siendo los mejores tratamientos de acuerdo a la prueba de Rango Múltiple de Duncan P. fluorescens (59,2%), P. aeruginosa + P. fluorescens (56,7%) y P. fluorescens + Flavimonas oryzihabitans + Burkholderia gladioli (51,9%).

Porcentajes de degradación de glifosato por P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens, F. oryzihabitans y las mezclas.

Análisis:

En estudios posteriores de biorremediación de este herbicida a altas concentraciones, sería aconsejable ensayar los consorcios bacterianos ya que crecieron con concentraciones de glifosato de 20 y 30 %, mientras que P. fluorescens sólo tolero un 2 % del compuesto; demostrando la existencia de sinergismo entre las bacterias para potenciar su acción degradadora. En biorremediación se busca que el crecimiento bacteriano se obtenga en menor tiempo y que alcance un porcentaje de degradación alto.

CONCLUSIÓNEl papel de las bacterias edáficas en la degradación, tolerancia y afinidad al glifosato en suelos con uso frecuente del herbicida Roundup ® SL se comprobó en esta investigación donde los microorganismos utilizaron el glifosato como única fuente de carbono y actuaron sinérgicamente para resistir hasta un 30 % del herbicida resultando promisorio su uso en programas de biorremediación.