Problema 1Ud. trabaja en una empresa dedicada al desarrollo de kits para inmunofenotipificación por citometría de flujo. De parte de un laboratorio de análisis clínicos le solicitan un kit de detección de linfomas partir de muestras de sangre periférica que identifique las siguientes subpoblaciones linfocitarias: T CD4+, T CD8+ y LB (CD19). El único requisito que impone el laboratorio es poder detectar las muestras usando un citómetro de flujo que está provisto con un único láser (ión-argón 488 nm). Para armar el kit usted dispone de los siguientes clones:

Purified monoclonal CD8 antibody, clone :UCH-T4, isotype: IgG2aPurified monoclonal CD19 antibody, clone: HD37, isotype: IgG1Purified monclonal CD4 antibody, clone: 13B8.2, isotype: IgG1

Por otro lado, dispone de los siguientes fluorocromos para conjugar a los anticuerpos: FITC, PerCP, APC y PE, cuyos espectros de absorción y emisión son los siguientes:

ABSORCIÓN EMISIÓN

a) Seleccione los fluorocromos que utilizará para conjugar a los distintos anticuerpos y justifique.

b) Diseñe el kit. (No olvide incluir los controles necesarios dentro del kit).

Luego de la puesta a punto del kit, y habiendo comprobado que todo funciona adecuadamente, según lo esperado, Ud. deber armar el Manual del fabricante incluyendo:

c) Breve descripción del protocolo de marcación. d) Procedimiento para calibrar el equipo.

e) Instrucciones para el análisis de resultados (FSC vs SSC; FL-1 vs FL-2, etc.), tomando como ejemplo los resultados esperados para una muestra de un paciente normal, cuyos valores de referencias son los siguientes:

Valores de referencia (% del total de linfocitos)Linfocitos T CD4+ 48.1 %Linfocitos T CD8+ 23.7 %Linfocitos B 13 %

Problema 2A continuación se muestra un esquema de dot plot de linfocitos de sangre humana marcados con anti-CD8-ECD(FL-1) y anti-CD4-PE(FL-2). ¿Qué puede decir acerca de la figura? ¿Cómo lo solucionaría? Esquematice cómo debería verse el mismo gráfico, una vez corregido el problema.

Problema 3En el laboratorio Ud se encuentra probando un protocolo de diferenciación de células dendríticas a partir de médula ósea de ratón. Una vez completada la diferenciación se desea confirmar la efectividad del método utilizado. Para ello decide realizar una fenotipificación marcando con anticuerpos específicos y posterior análisis por citometría de flujo.

A) Defina los anticuerpos que utilizará para marcar las muestras y controles, especificando sus características.

B) Explique y esquematice qué tipo de análisis seleccionará (por ejemplo, utilizando el programa Flowing) para determinar el porcentaje de células diferenciadas.

Ud. ha llevado a cabo la marcación de células dendríticas tal como lo describió en el punto anterior, obteniéndose como resultado un 50 % de células diferenciadas. Ahora Ud. desea confirmar sus resultados, y para ello quiere determinar si estas células dendríticas diferenciadas responden a LPS (lipopolisacárido, es un componente bacteriano que activa varios tipos celulares, incluyendo células dendríticas). Con este objetivo se realizará una nueva diferenciación a partir de médula ósea y posterior marcación y análisis por citometría de flujo.

C) En este caso, ¿qué criterios utilizará para seleccionar los anticuerpos?D) Enumere y explique las muestras y controles que incluirá en el ensayo. Con qué

anticuerpos tratará a cada uno de ellos.E) Explique y esquematice qué tipo de análisis seleccionará (por ejemplo, utilizando el

programa Flowing) para determinar el porcentaje de células diferenciadas y activadas.F) Suponiendo que los anticuerpos que Ud seleccionó para este ensayo dan una superposición

de la señal fluorescente mayor al 50 %, haciendo dificultosa la compensación, ¿qué posible solución se le ocurre?

DATOS: CD86: un marcador de superficie de células dendríticas activadas.CD11c: es un marcador de superficie de células dendríticas diferenciadas

Problema 4A) Defina 3 ventajas del uso del reactivo CFSE para medir proliferación celular sobre el

método de incorporación de timidina-tritio.B) Enumere cuatro características propias del CFSE por las cuales puede ser

utilizado para medir la proliferación celular.

Problema 5

Problema 6 

Tabla 2: % de proliferación85,6%3,1%5,2%39,8%

En el laboratorio se desea conocer la capacidad proliferativa de una lectina de planta sobre los esplenocitos de ratón. Para ello se marcan las células con 5 μM de CFSE, se lavan y luego se la cultivan con 4 dosis crecientes de lectina (1, 10, 100 y 1000 μM ). Luego de 96 hs se cosechan las células y se analizan por citometría de flujo en el canal FL-1.Grafique cómo se verían los histogramas de: a-    Control de autofluoresenciab-    Control sin lectinac-     Lectina 1 μM (si sólo prolifera una subpoblación linfocitaria)d-    Lectina 10 μM (si proliferan todas las poblaciones)e-     Lectina 100 μM (si proliferan todas las poblaciones y en mayor medida que con la

dosis anterior)f-     Lectina 1000 μM (si esta dosis resulta extremadamente tóxica y se olvidó de hacer

el gate en FSC vs SSC para eliminar las células no viables)

  Problema 7Un compañero suyo trabaja en un laboratorio donde estudian el daño cardíaco inducido por la infección con el parásito Tripanosoma cruzi. Por inmunohistoquímica, él observó un gran infiltrado linfocitario en un corte de músculo cardíaco de ratón infectado, con tinción de hematoxilina-eosina. Con el fin de identificar las poblaciones linfocitarias del infiltrado, realizó una disgregación de una muestra de tejido cardíaco de un animal infectado, y a la suspensión celular le agregó el anticuerpo anti-CD3-FITC y anti-CD19-PE, con el fin de evaluar la presencia de células T y B, respectivamente. Luego de analizar las muestras por citometría, obtiene el siguiente gráfico: 

   Desconcertado por el resultado, su compañero le pide ayuda, ya que Ud. es un experto en citometría. a)    Explique a su compañero porqué obtuvo ese resultado. Fundamente.b)   Indíquele, de manera precisa, cómo procedería Ud. para resolver el problema.c)    Esquematice cómo esperaría ver el resultado siguiendo el procedimiento correcto.

 Problema 8

En el laboratorio Ud. gana un gran subsidio del exterior y decide comprar algunos ratones transgénicos para poner a punto diferentes modelos de proliferación in vivo con la técnica de CFSE. Los ratones que se compraron son DO11.10 y OTII. Luego se compró el péptido de OVA que reconocen los TCR de los mismos y la proteína entera OVA. Para probar que efectivamente el modelo funciona realizó la transferencia de células marcadas con CFSE provenientes de estos ratones a sus correspondientes del mismo background.

1)      ¿Qué ratones se usaron como receptores de las células marcadas con CFSE según qué ratón transgénico se trate?

Al día siguiente se inyectaron los ratones con el péptido o la OVA en diferentes concentraciones: 2 y 8 ug/uldel péptido, 10 y 50 ug/ul de OVA. Se inyectaron además un ratón con PBS como control de cada uno (total 10 ratones (5 DO.11.10 y 5 OTII).

2)      Realice los cálculos necesarios para inyectar los estímulos teniendo en cuenta que los mismos deben estar en 200 ul de PBS y calculando dos ratones de más.

Stock péptido de OVA: 10 mg/mlStock OVA: 1000 mg/ml Luego de sacrificar los ratones usted realizó el protocolo de marcación de esplenocitos, las pasó por el citómetro y obtuvo los siguientes porcentajes de proliferación: PBS 5%2ug/ul péptido20%8ug/ul péptido 45%10ug/ul OVA 15%50 ug/ul OVA 35% PBS 5%2ug/ul péptido40%8ug/ul péptido90%10ug/ul OVA 30%50 ug/ul OVA 55%

3)      A qué ratones corresponden cada grupo de resultados? Justifique. Tenga en cuenta la especificidad de los TCR por el péptido y suponga concentraciones equimolares de ambos tratamientos. 4)      Calcule el índice de proliferación y compare los resultados obtenidos.

 

Problema 9En el laboratorio se repitió un experimento de estimulación de linfocitos TCD4 en dos días distintos, para tener duplicados independientes. El ensayo consistió en incubar linfocitos TCD4 purificados de ratones DO11.10 previamente marcados con CFSE en presencia de células presentadoras de antígeno (APC) y una dosis definida del péptido OVA323-339 (Ag/APC). Además, se incluyeron células sin estimular y también tratadas con un mitógeno T (CD3/CD28). Luego de 5 días de incubación, se analizaron las muestras por citometría de flujo. En la primer gráfico de barras se muestran los resultados obtenidos para cada uno de los días: 

a)- Complete los casilleros en ambos grupos de histogramas, indicando día y tratamiento, según corresponda.

 Luego de analizar los datos, considera que en el día 2 obtuvo el resultado correcto, y que en el día 1 ocurrió alguno de los siguientes inconvenientes:

a) Se equivocó en la concentración de ovoalbúmina         b) La marcación inicial de las células con CFSE fue ineficiente         c) La viabilidad celular se encontraba disminuida b)- Elija la/las opciones que considere posibles. Justifique.

Problema 10La hemaglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una enfermedad caracterizada por una anemia severa entre otros signos clínicos, originada por una alteración genética en el gen PIG-A (cromosoma X) que tiene como resultado la deficiencia parcial o total de todas las proteínas ancladas a membrana por glicosilfosfatidil-inositol (GPI). La inmunofenotipificación basada en la citometría de flujo de marcadores presentes en la superficie de células de la sangre periférica es el método de elección para el diagnóstico de esta enfermedad. Uno de las mejores combinaciones consiste en evaluar la disminución de la expresión del CD14 presente en monocitos y el CD16 presente en neutrófilos, dado que ambas proteínas con ancla a GPI permiten la identificación inequívoca de células de pacientes con HPN.

Marcadores de subpoblacionesCD64: marca exclusivamente monocitosCD49: marca todas las poblaciones de la sangre, excepto los neutrófilos.

Usted diseña un kit diagnóstico para HPN con los siguientes anticuerpos.

anti-CD14 (IgG2a)- APC anti-CD16 (IgG1)- FITC anti-CD49 (IgG1)-PerCP-Cy5.5 anti-CD64 (IgG1)-PE

a) ¿Cómo tiene que ser el control de isotipo del kit?

b) Esquematice los dot-plots de CD14 vs CD64; CD16 vs CD49 de las siguientes muestras. Justifique brevemente los esquemas.

1- Paciente normal marcado con el control de isotipo 2- Paciente normal marcado con mix de anticuerpos3- Paciente con HPN marcado con el control de isotipo 4- Paciente con HPN marcado con mix de anticuerpos

Problema 11

Usted está por realizar un ensayo de transferencia de células desde ratones dadores DO11.10, cuyos TCR se encuentran rearreglados para reconocer un péptido de OVA, con el fin de cuantificar la proliferación in vivo de linfocitos CD4+Durante el experimento usted: tiene 2 ml de RPMI completo y contó en la cámara de Neubauer los siguientes números de células vivas: 44/42/48/50.Ajustar la solución de células a una concentración de 40x106cel/ml (con el agregado de CFSE va a quedar 20x106/ml final). Concentración final CFSE: 7μM Llevar a concentración para inyectar 20x106 células por ratón en 100 μl.

Al día siguiente se inmunizarán los ratones wt por vía intraperitoneal con:

1-PBS2-OVA 10ug4-OVA 10ug+1ug LPS

Stock CFSE: 5mM, Stock OVA 1mg/ml, Stock LPS 5mg/ml

Haga todos los cálculos correspondientes para realizar el experimento. Haga diluciones si lo considera necesario. Haga los cálculos de manera de optimizar los reactivos para disminuir costos.

Problema 12

Se realiza un ensayo de transferencia adoptiva de células de bazo de ratones DO11.10 a ratones BALB/c wild type, como control dos ratones BALB/c no son transferidos. Al día siguiente se inmunizan los ratones con solución fisiológica o con OVA mas el adyuvante de Freund Completo.Dos días después se obtienen los bazos de los ratones inmunizados y se marcan las células

con anticuerpos anti CD4 y anti KJI-26+ (anti idiotipo del TCR presente en los animales DO11.10).

1. Teniendo en cuenta las marcaciones realizadas determine en los dot plots cuales serian los ejes.

2. Teniendo en cuenta los porcentajes mostrados, determine a que ratón (A,B,C y D) corresponde cada dot plot.

3. Como esperaría que fueran los dot plots si además las células hubieran sido marcadas con CFSE antes de la transferencia? Dibújelos especificando

los ejes y porcentajes esperados.

Problema 13

En un laboratorio se encuentran estudiando el efecto de administrar nanopartículas (iNPs) cargadas con la novedosa droga Inhibina y un antígeno X (AgX) frente a la respuesta T Ag específica.Para ello inmunizaron a ratones Balb/c con:

- iNPs (nanpoparticulas conteniendo inhibina y AgX)

- cNPs (nanoparticulas conteniendo AgX)- no los inmunizaron.

Luego transfirieron a los ratones con linfocitos T transgénicos cuyo TCR reconoce un péptido de AgX en el contexto de MHC-I marcados con CFSE.

5 días más tarde obtuvieron los bazos de los animales y evaluaron la proliferación de los linfocitos trasferidos por citometría de flujo. Para poder analizar las subpoblaciones que proliferaron, marcaron las células de bazo con anticuerpos específicos anti-CD4-PE y anti-CD8-APC.La figura 1A muestra los resultados representativos para un ratón de cada tratamiento. La figura 1B muestra el gráfico de barras los porcentajes de células que proliferaron para cada tratamiento.

Teniendo en cuenta los resultados de las figuras 1 y 2:

A) complete la tabla 1 indicando qué tratamiento corresponde con cada número. Justifique.

B) Complete los casilleros vacíos en la figura 2. Justifique su respuesta

C) A partir de los resultados obtenidos los investigadores obtuvieron concluyeron (indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. Justifique brevemente su respuesta):I) Las nanopartículas conteniendo AgX (cNPs) indujeron la proliferación de LT

CD4+ específicos para AgX.

II) En los ratones inmunizados con cNPs la proliferación observada corresponde a más de una población de linfocitos (CD4, CD8, B).

III) Las nanopartículas conteniendo inhibina y AgX (iNPs) indujeron la proliferación de LT CD8+ específicos para AgX.

Problema 14En el laboratorio Ud. posee un ratón transgénico cuyo TCR reconoce el antígeno HEL en el contexto de MHCII. Para realizar ensayos de estimulación Ud. compró la proteína recombinante HEL y la proteína OVA para usar como control. El problema es que ambas proteínas vinieron sin rótulo y Ud necesita identificarlas (las llamó A y B, arbitrariamente). Dado que ambas poseen el mismo PM y concentración, decide hacer un ensayo de proliferación in vitro para identificarlas por su actividad en esplenocitos provenientes del modelo trasngénico.

Ud. decide estimular 2 x 106 esplenocitos marcados con CFSE en presencia de 1, 5 y 20 ug/ml de las proteínas A ó B (conc. stock: 1 mg/ml) en un volumen final de 1ml de RPMI + suero fetal bovino, durante 72 hs. Con este objetivo se purificaron esplenocitos de un ratón TCRHEL y se resuspendieron en 2 ml de PBS. Luego se contaron las células en cámara de Neubauer: para ello se tomó una alícuota de 2 ul de la suspensión de células y se resuspendieron en 198 ul de PBS. Se contaron 45 – 49 – 42 – 40 por cuadrante.

a) Calcule el número de células por ml. Haga los cálculos necesarios para la marcación con CFSE, teniendo en cuenta que la concentración final de CFSE debe ser 5 uM

(stock: 10 mM) y que se prepara 1 ml de una solución 2X para mezclar con el mismo volumen de una suspensión de células (concentración final de células: 20 x 106/ml).

b) Luego de bloquear y lavar las células, Ud vuelve a contar y obtiene 30 x 106/ml esplenocitos marcados con CFSE. A partir de aquí indique cómo realizará el ensayo (incluya todos los cálculos). ¿Qué controles le parece conveniente agregar en el experimento? Justifique

Problema 15La gammapatías monoclonales son un grupo de enfermedades que se caracterizan por la expansión clonal de células plasmáticas (CP) que producen una inmunoglobulina monoclonal (componente M), detectable en orina y/o suero. Dentro de estas patologías encontramos al mieloma múltiple (MM), y a la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI). La importancia de hacer una diferenciación entre los MM y las GMSI viene determinado porque la inapropiada falta de tratamiento en los MM diagnosticados erróneamente como GMSI, puede llevar al desarrollo de síntomas clínicos y complicaciones de gravedad como fallos renales y fracturas óseas, y por otro lado los pacientes con GMSI diagnosticados erróneamente como MM, son sometidos a un tratamiento innecesario con quimioterapia.

En el laboratorio donde Ud trabaja le encargan diseñar un reactivo para diferenciar entre MM y GMSI en base a la cuantificación y caracterización de células plasmáticas inmunofenotípicamente normales y/o patológicas. Ud cuenta con la siguiente infromación:

(MGUS=GMSI PC=CP)

En las muestras de médula ósea de los pacientes con GMSI coexisten dos subpoblaciones de CP: una subpoblación muestra el mismo patrón inmunofenotípico al de las CP normales, mientras que la segunda y predominante subpoblación de CP presenta un patrón inmunofenotípico tumoral En cambio en la medula ósea de los pacientes con MM la presencia de CP normales es casi nula, sinedo en casi su totalidad CP con inmunofenotipo tumoral.

a) Diseñe el kit reactivo. ¿Qué controles incluiría en el mismo para la calibración del equipo?. Justifique.

b) Complete los siguientes diagramas de dot plot con los eventos esperados para cadas caso

Problema 16Un directivo de la empresa farmacéutica donde usted trabaja le pide que cambie la forma de detectar los distintos grupos sanguíneos y que diseñe un nuevo método mediante la técnica de ELISA.

Usted cuenta con extracto de glóbulos rojos de los distintos GS, anticuerpos y reactivos necesarios.

a) Realice un esquema breve del ELISA.b) ¿qué cuidados hay que tener con la identificación del grupo 0?c) Aunque le van a pagar una cuantiosa suma de dinero, ¿tiene algún sentido hacerlo?

Problema 171- Explique en qué consiste cada uno de los siguientes controles, cómo los prepara y para qué los

utiliza.i) Control de autofluorescencia.

ii) Controles simples positivos.

iii) Controles de isotipo.

2- Un grupo de investigadores se encuentra evaluando la diferencia de dirigir el antígeno a diferentes receptores sobre las células dendríticas sobre la presentación antigénica vía MHC-I y MHC-II, que finalmente lleva a la activación de LT CD8+ y CD4+ Ag-específicos.

Para ello llevan a cabo un experimento de proliferación in vivo cuyos resultados se muestran en la Figura 3.

Complete los casilleros vacíos:

i) Las respuestas FcγRIV-dependientes en los LT CD_____+ fueron superiores a las de los grupos FcγRIIB or FcγRIIB/III.

ii) Se requiere, una dosis 30-veces mayor de _______________ o ______________ para inducir una respuesta comparable al grupo αFcγRIV-Ova en los LT CD_______+

3- Los investigadores repitieron el experimento de transferencia adoptiva e inmunizaron a los animales con 1µg de Fc RIIB-Ova con agregado o sin agregado del adyuvante MLPB y α γanalizaron la proliferación de los LT a diferentes tiempos.

Figura 3: Proliferación in vivo de LT CD4+ y CD8+ luego de la administración del antígeno unido a anticuerpos dirigido a diferentes receptores de las células dendríticas. (a y b) Linfocitos T purificados y marcados con CFSE (106 CD8+) de ratones OT-I (a) o (2 × 106 CD4+) de ratones OT-II (b) fueron transferidos por vía endovenosa a ratones congénicos C57BL/6. Luego de 16 h, los ratones receptores fueron inyectados por vía intraperitoneal con las dosis indicadas (10, 3, 1, 0.3, 0.1, y 0 µg) de los siguientes anticuerpos conjugados a OVA: isotype-Ova, DEC205-Ova, DCIR2-α αOva, Fc RIIB-Ova, Fc RIV-Ova, or Fc RIIB/III-Ova en PBS. α γ α γ α γ 3 días post inmunización con los anticuerpos la proliferación in vivo para cada anticuerpo inyectado fue analizada en los bazos de los animales mediante análisis de dilución de CFSE en LT V 2α +CD45.1+CD8+ (a) y V 2α +CD45.1+CD4+ (b) por citometría de flujo.

a- Complete los casilleros vacíos en la figura 4: Fc RIIB-Ova + MPLB; Fc RIIB-Ova; α γ α γCD4+, CD8+ (puede utilizar cada rótulo las veces que considere necesario).

b- Qué efecto tiene el adyuvante MPLB sobre la presentación vía MHC-I?

c- Qué efecto tiene el adyuvante sobre la presentación vía MHC-II?

Problema 18

Con el fin de desarrollar una nueva vacuna para la tuberculosis que genere respuestas T en el pulmón, un grupo de investigadores desea estudiar la activación de linfocitos T CD4+ y CD8+ vírgenes tanto en las mucosas como a nivel sistémico luego de la administración intranasal de una bacteria recombinante S. gordonii que expresa en la superficie celular antígeno Ag85B-ESAT-6 de M. tuberculosis fusionado a epitopes T helper y T citotóxicos de ovoalbúmina (OVA).Para ello realizan experimentos de transferencia adoptiva utilizando linfocitos T provenientes de animales transgénicos cuyos receptores T (TCR) específicos restringidos a H-2b reconocen los epitopes T-helper (CD4) y T-citotóxicos (CD8) de OVA (aminoácidos 323 a 339 [OVA323-339] y 257 a 264 [OVA257-264], respectivamente). Los linfocitos T CD4+ y CD8+ transgénicos marcados con CFSE fueron transferidos adoptivamente simultaneamente a los ratones receptores, y se evaluó su activación in vivo en ganglios linfáticos cervicales (CLN), pulmones (LUNG) y bazos (SPLEEN) luego de 3 días de la administración nasal de la bacteria recombinante -GP1456- (que posee el Ag con los epitopes de OVA pata LT CD4+ y CD8+) o una cepa control que no expresa el Ag -GP1295-.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 1:

Figura 4: Proliferación in vivo de LT CD4+ y CD8+ luego de la administración de

Fc RIIB-Ova solo o conα γ adyuvante (MPLB). Linfocitos T purificados y marcados con CFSE (106 CD8+) de ratones OT-I o (2 × 106 CD4+) de ratones OT-II fueron transferidos por vía endovenosa a ratones congénicos C57BL/6. Luego de 16 h, los ratones receptores fueron inyectados por vía intraperitoneal con 1µg de

Fc RIIB-Ovaα γ con o sin 100 ng de MPLB. A diferentes tiempos post inmunización se evaluó la proliferación in vivo en los bazos de los animales mediante análisis de dilución de CFSE en LT V 2α +CD45.1+CD8+ y V 2α +CD45.1+CD4+ por citometría de flujo.

A) Enumere los pasos que realizaron los investigadores para poder obtener los resultados obtenidos. (Desde el inicio del experimento hasta la obtención de las muestras para ir al citómetro).

B) Enumere y explique TODOS los controles experimentales que necesitaron (Tanto controles biológicos como controles de marcación y seteo del equipo).

C) En base a los resultados de la figura: Cómo interpreta el resultado obtenido en pulmón entre la cepa recombinante y control y con respecto a los otros tejidos-

D) Si todos los datos se obtuvieron a partir de una muestra de cada grupo experimental, diga el número mínimo de canales que posee el citómetro que utilizaron los investigadores para realizar el experimento y qué parámetros midieron.

Los investigadores decidieron luego evaluar la expresión de marcadores de activación (CD69, CD44 y CD45RB) en los LT que proliferaron en los ganglios cervicales (CLN). A partir de los resultados obtenidos graficaron la intensidad de fluorescencia media para cada marcador en función de el número de divisiones celulares.E) Teniendo en cuenta los resultados de la Figura 2 A, una con flechas los dot plots con los gráficos

de barras de la Figura 2 B. Justifique brevemente cada flecha.

Figura 2:

Problema 19En el laboratorio donde Ud. trabaja están probando una molécula con capacidad inmunoestimuladora de la respuesta celular, llamada LEC1. Para determinar si esta molécula es capaz de estimular la respuesta celular antígeno-dependiente in vivo, diseña un experimento donde inmuniza ratones OTI (donde la mayoría de las células T CD8 presentan un TCR transgénico que reconoce un péptido de la proteína OVA) con una dosis mínima de antígeno OVA (0,5 ug/ratón), sola o en combinación de la molécula LEC1 (25 ug/ratón). Cabe aclarar que la dosis elegida de OVA es incapaz de activar la respuesta antigénica por sí sola. 1)Indique cómo prepara las soluciones de los inmunógenos para inyectar suponiendo que tiene como soluciones stock LEC1 0,5 mg/ml y OVA 100 ug/ml. El volumen a inyectar por ratón es de 200 ul (en PBS) y tiene 3 animales por grupo experimental.

Luego 48 hs post-inmunización se sacrifican los ratones, se remueve el bazo y se purifican los esplenocitos, los cuales se resuspenden en 2 ml de PBS. Luego, toma una alícuota de 5 ul de la suspensión celular y la resuspende en 495 ul de PBS, para contar. En cámara de Neubauer cuenta en 4 cuadrantes 45 – 51 – 49 – 53 células.

2) Indique cómo procede para preparar los tubos para la marcación, teniendo en cuenta que necesita 1 x 106 esplenocitos en un volumen final de 100 ul de solución de bloqueo. Incluya los cálculos necesarios.

3) Para la citometría cuenta con los siguientes anticuerpos:Anti-CD69-FITC (FL1): marcador de activaciónAnti-CD3-PE (FL2): marcador de linajeAnti-CD4-PerCp (FL3): marcador de linajeAnti-CD8-APC (FL-4): marcador de linaje

En el caso en que la molécula LEC1 haya funcionado como lo esperaba, indique cómo esperaría ver los siguientes gráficos de dot plots de los tratamientos OVA y OVA + LEC-1; y también de los controles PBS (-) y del mitógeno T Concanavalina A (+) . Justifique.

FL1 vs FL2

FL1 vs FL3

FL-1 vs FL4