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Margarida Luísa Baptista Aparício Amaral Santiago Monteiro Grilo

EFEITO DA CICLOSPORINA A NA VIA

DA L-ARGININA:NO:GMPc VASCULAR E

PLAQUETAR NUM MODELO ANIMAL

EXPERIMENTAL

Coimbra2004

Dissertação de Mestrado submetida à Faculdade de

Farmácia da Universidade de Coimbra, sob orientação

científica do Professor Doutor Frederico Teixeira, no âmbito

do Curso de Mestrado em Tecnologias do Medicamento, na

área de Farmacologia

Trabalho experimental realizado na Unidade de

Terapêutica do Instituto de Farmacologia e Terapêutica

Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de

Coimbra

Aos meus pais

Ao Tiago

À Maria Miguel

Ao Miguel

Agradecimentos

Ao Professor Doutor Frederico Teixeira, desejo expressar a minha sincera gratidão e

o meu profundo reconhecimento pela sua orientação científica, os seus ensinamentos

indispensáveis para a concretização deste trabalho, pelo seu apoio e pelas facilidades

laboratoriais e experimentais que disponibilizou e pela oportunidade concedida para a

realização deste mestrado.

Ao Professor Doutor Luís de Almeida desejo agradecer pela sua valiosa colaboração,

pela amizade pessoal, pelo estímulo e pelas contínuas palavras de incentivo e pela

permanente disponibilidade com que sempre me apoiou e acompanhou o desenvolvimento

deste trabalho.

Ao Mestre Flávio Reis manifesto um especial apreço pela pronta e desinteressada

colaboração e auxilio prestados, além da sua amizade pessoal.

À Mestre Teresa Alcobia pela colaboração dispensada e pela amizade.

Aos restantes colegas e funcionários do Instituto de Farmacologia e Terapêutica

Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, agradeço o

ambiente de trabalho proporcionado.

Ao Dr. Joaquim Dionísio agradeço a elevada competência, empenho e espírito de

sacrifício na realização do trabalho experimental.

Ao Dr. Adamo Caetano agradeço o apoio na administração dos ratos e na

composição desta tese.

Ao Sr. Paulo Borges agradeço a sua valiosa ajuda na preparação do trabalho

experimental.

À Dra. Helena Teixeira pela motivação e palavras amigas de incentivo.

À Sra. Professora Doutora Luísa Leitão agradeço os conhecimentos transmitidos, o

seu valioso apoio e a colocação à nossa disposição os meios técnicos do Departamento de

Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia, indispensável à realização das

determinações espectofotométricas.

Ao senhor Dr. Ferrer Antunes, desejo expressar o meu agradecimento pelo apoio

dispensado na realização dos estudos efectuados nos Laboratório de Hematologia dos

Hospitais da Universidade de Coimbra.

À Dra. Margarida Lourenço o meu agradecimento pela colaboração dispensada durante a

realização daqueles estudos.

Ao senhor Manuel Gomes Almeida agradecemos toda a ajuda prestada na montagem

final deste trabalho.

Ao PRAXIS desejo agradecer o apoio financeiro concedido através da atribuição de

uma bolsa de mestrado PRAXIS XXI/BM/14666/97 e pelo financiamento obtido do

Programa PRAXIS (PRAXIS/PSAU/C/SAU/57/96), os quais me permitiram realizar este

trabalho.

À NOVARTIS Farmacêutica, pela gentil cedência da ciclosporina.

À Cristina e à Sofia obrigado pela vossa amizade e apoio.

A todos os que directa ou indirectamente tornaram possível este trabalho, obrigado.

ÍNDICE

ABREVIATURAS..............................................................................................................15

RESUMO............................................................................................................................21

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL

A HIPERTENSÃO ARTERIAL.......................................................................................29

O ENDOTÉLIO VASCULAR..........................................................................................33Regulação do tónus vascular dependente do endotélio....................................................371. Factores constritores.....................................................................................................38

1.1. Endotelina.............................................................................................................381.2. Factores constritores derivados da cicloxigenase.................................................401.3. Sistema renina-angiotensina..................................................................................401.4. Sistema adrenérgico..............................................................................................42

2. Factores relaxantes.......................................................................................................432.1. Factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)........................................442.2. Prostaciclina..........................................................................................................452.3. Monóxido de azoto (NO)......................................................................................50

2.3.1.Perspectiva histórica........................................................................................502.3.2.Biossíntese de NO...........................................................................................512.3.3. Isoformas da sintase do NO...........................................................................532.3.4.Transporte e moléculas alvo do NO................................................................56

GMPc. O principal sistema efector da acção do NO...........................................582.3.5. Funções do NO endógeno..............................................................................63

a) Sistema imunitário e inflamatório....................................................................63b) Sistema nervoso central e periférico................................................................64c) Sistema cardiovascular. O papel do NO na homeostase vascular....................65

1. Acções vasculares do NO.............................................................................652. Acções do NO na homeostase e na função das plaquetas............................683. Acções do NO nos leucócitos......................................................................72

O PAPEL DAS PLAQUETAS NA FISIOPATOLOGIA DA HIPERTENSÃO..........751. Introdução....................................................................................................................752. Estrutura das plaquetas.................................................................................................763. Funções........................................................................................................................784. A plaqueta como unidade de produção e libertação de NO.........................................85

A CICLOSPORINA A.......................................................................................................911. Introdução....................................................................................................................912. Propriedades farmacodinâmicas. Mecanismo de acção...............................................923. Propriedades farmacocinéticas.....................................................................................95

3.1. Absorção...............................................................................................................95

3.2. Distribuição...........................................................................................................953.3. Metabolismo e excreção........................................................................................96

4. Efeitos secundários.......................................................................................................984.1. A ciclosporina como agente indutor de hipertensão arterial.................................994.2. A influência da ciclosporina na reactividade vascular........................................1014.3. A influência da ciclosporina na função plaquetar...............................................106

CAPÍTULO II – OBJECTIVOS.....................................................................................109

CAPÍTULO III – PARTE EXPERIMENTAL

I Modelo animal e protocolo experimental....................................................................1191. Modelo animal...........................................................................................................1192. Protocolo Experimental..............................................................................................120

2.1 Grupo de ratos......................................................................................................1202.2 Doses administradas.............................................................................................1212.3 Caracterização do modelo animal experimental..................................................122

A) Peso dos ratos....................................................................................................122B) Parâmetros hematológicos................................................................................124

1 - Metodologia..................................................................................................1242 - Resultados e comentários..............................................................................124

C) Pressão arterial..................................................................................................1261 - Metodologia..................................................................................................1262 - Resultados e comentários..............................................................................127

II O sistema NO:GMP.....................................................................................................137A - Introdução................................................................................................................137B - Metodologia.............................................................................................................141

1. Determinação dos teores arteriais de NO...............................................................1412. Determinação dos teores arteriais de GMPc..........................................................1443. Determinação dos níveis plaquetares de NO.........................................................146

3.1 Ensaios ex vivo.................................................................................................1463.2 Ensaios in vitro.................................................................................................148

4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc.....................................................149C - Reagentes.................................................................................................................150D - Resultados................................................................................................................151

1. Determinação dos teores arteriais de NO...............................................................1512. Determinação dos teores arteriais de GMPc..........................................................1603. Determinação dos níveis plaquetares de NO.........................................................163

3.1 Ensaios ex vivo.................................................................................................1633.2 Ensaios in vitro.................................................................................................167

4. Determinação dos níveis plaquetares de GMPc.....................................................171E - Comentários..............................................................................................................174

III PGI2 – factor vasorelaxante e inibidor da agregação plaquetar............................185A - Introdução................................................................................................................185

B - Metodologia.............................................................................................................1861. Determinação dos teores arteriais de 6-ceto-PGF1a.............................................1862. Determinação dos teores plasmáticos de 6-ceto-PGF1a.......................................187

C - Reagentes.................................................................................................................187D - Resultados................................................................................................................188

1. Determinação dos teores arteriais 6-ceto-PGF1a..................................................1882. Determinação dos teores plasmáticos 6-ceto-PGF1a............................................189

E - Comentários..............................................................................................................191

CAPÍTULO IV - SÍNTESE E CONCLUSÕES.............................................................193

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................201

ABREVIATURAS

Abreviaturas_________________________________________________________________________

AA - Ácido araquidónico

ACD - Ácido-citrato-dextrose

ADP - Adenosina difosfato

ADN - Ácido desoxiribonucleico

AMPc - 3’, 5’-monofosfato de adenosina cíclico

ANG I - Angiotensina I

ANG II - Angiotensina II

ARNm - Ácido ribonucleico mensageiro

ATP - 5’-trifosfato de adenosina

ATPase - Trifosfatase de adenosina

BH4 - Tetrahidrobiopterina

[Ca2+]i - Concentração de cálcio livre intracelular

CAM - Calmodulina

6-ceto-PGF1α - 6-ceto-prostaglandina F1α

COX - Cicloxigenase

COX-1 - Cicloxigenase (tipo 1)

COX-2 - Cicloxigenase (tipo 2)

CsA - Ciclosporina A

DAG - Diacilglicerol

DMSO - Dimetilsulfóxido

ADN - Ácido desoxiribonucleico

EDHF - Factor hiperpolarizante derivado do endotélio

EDRF - Factor de relaxamento derivado do endotélio

EDTA - Ácido etilenodinitrilotetracético

ELISA - Ensaio imunoadsorvente de ligação enzimática

FAD - Flavina adenina dinucleótido

FC - Frequência cardíaca

FMN - Flavina adenina mononucleótido

GC - Guanilciclase

GCs - Guanilciclase solúvel

GDP - 5’-Difosfato de guanosina

17

Abreviaturas_________________________________________________________________________

GMPc - 3’,5’- monofosfato de guanosina cíclico

GTP - 5’-trifosfato de guanosina

HEPES - (N-[2-hidroxietil] piperazina- N’- [2- ácido etanosulfónico])

HDL - Lipoproteína de alta densidade

5-HT - 5-hidroxitriptamina (serotonina)

IBMX - Isobutilmetilxantina

IF-γ - Interferon γ

IL-1 - Interleucina-1

IL-1b - Interleucina-1b




IL-β - Interleucina β

Ins - Inositol

InsP3 - Inositol-1,4,5- trifosfato

LDL - Lipoproteína de baixa densidade

LPS - Lipopolissacarídeo

MAO - Monoaminoxidase

NA - Noradrenalina

NADH - Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida)

NADPH - Nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada)

L-NNA - NG-nitro-L-arginina

NO - Monóxido de azoto

NOS - Sintase do NO

NOSc - Forma constitutiva da sintase de NO

NOSe - Forma constitutiva da sintase de NO endotelial

NOSi - Forma indutível da sintase do NO

NOSn - Sintase do NO neuronial

PA - Pressão arterial

PAD - Pressão arterial diastólica

PAF - Factor activador das plaquetas

PAM - Pressão arterial média

18

Abreviaturas_________________________________________________________________________

PAS - Pressão arterial sistólica

PBS - Solução tampão de fosfato

PDGF - Factor de crescimento derivado das plaquetas

PGD2 - Prostaglandina D2

PGE2 - Prostaglandina E2

PGF1α - Prostaglandina F1α

PGG2 - Prostaglandina G2

PGH2 - Prostaglandina H2

PGI2 - Prostaglandina H2 (prostaciclina)

PI - Fosfatidilinositol

PI-P2 - Fosfatidilinositol- 4,5-bifosfato

PKC - Proteína cinase C

PLA2 - Fosfolipase A2

PLC - Fosfolipase C

PPP - Plasma pobre em plaquetas

PRP - Plasma rico em plaquetas

R - Receptor

RVP - Resistência vascular periférica

SNC - Sistema nervoso central

SNP - Sistema nervoso periférico

SNS - Sistema nervoso simpático

TGF-β - Factor β transformador do crescimento

TNF - Factor de necrose tumoral

TXA2 - Tromboxano A2

TXB2 - Tromboxano B2

VS - Volume sistólico

vWF - Factor de von Willebrand

19

Abreviaturas_________________________________________________________________________

20

RESUMO

21

Resumo_________________________________________________________________________

A CsA foi introduzida como fármaco imunossupressor na década de 70 em

transplantes renais humanos e ainda hoje é aceite como um dos fármacos de eleição no

transplante de orgãos e no tratamento de algumas doenças auto-imunes. Esta possui uma

potente acção imunossupressora selectiva nos linfócitos e não apresenta actividade

citostática relevante. Contudo, o seu uso terapêutico tem estado associado ao aparecimento

de efeitos secundários graves, como a nefrotoxicidade, o desenvolvimento de hipertensão e

o aumento do risco de complicações tromboembólicas.

Apesar da intensa investigação que tem ocorrido ao longo dos anos, o mecanismo

fisiopatológico subjacente à resposta hipertensora que ocorre tanto em doentes como em

modelos animais experimentais tratados com a CsA continua por esclarecer, pelo menos na

sua totalidade. Contudo, têm sido desenvolvidos esforços substanciais para tentar

compreender estes efeitos e têm sido propostos variados mecanismos. Mas, a identificação

dos mediadores biológicos responsáveis pelo aumento da pressão sanguínea e a precisa

implicação de alguns destes mediadores continua em aberto. Além disso, continua o debate

em relação à relativa contribuição de diferentes tecidos alvo para a patogénese da

hipertensão induzida pela CsA. Têm sido implicados mecanismos renais, vasculares e

neuroniais e estes não são mutuamente exclusivos. A contribuição relativa de cada um

destes deve variar consideravelmente dependendo de variados factores, incluindo a

espécie, a dose e a duração do tratamento.

Em relação aos mecanismos vasculares, hoje está estabelecido que a CsA pode

inibir as vias vasodilatadoras e/ou activar as vias vasoconstrictoras. Um dado consensual é

o aumento da vasoconstrição e têm sido propostos variados mecanismos para explicar essa

vasoconstrição induzida pela CsA, nomeadamente: um efeito directo sobre a

contractilidade do músculo liso vascular, através do aumento da concentração do cálcio

livre intracelular; um efeito indirecto através da potenciação da resposta contráctil a certos

agentes vasoconstrictores como a noradrenalina e a angiotensina II; uma interferência com

a produção local de substâncias hemodinâmicas vasoactivas, nomeadamente o aumento da

vasoconstrictores e/ou a diminuição de vasodilatadores e um aumento da actividade do

sistema nervoso simpático e/ou da libertação de neurotransmissores das terminações

nervosas do músculo liso vascular.

23

Resumo_________________________________________________________________________

Variados estudos clínicos sugerem que a patologia cardiovascular estará associada,

entre outras, a disfunções no sistema L-arginina:NO:GMPc. Assim, as alterações nesta via

poderão ser uma das principais causas do aumento da reactividade vascular e plaquetar

associada à hipertensão arterial induzida pelo tratamento com a CsA.

Assim, com este trabalho pretendeu-se avaliar qual ou quais as alterações que

podem ocorrer nos mecanismos vasodilatadores, em especial na via da L-

arginina:NO:GMPc, visto ser o monóxido de azoto o principal factor relaxante derivado do

endotélio e o GMPc o seu principal sistema efector. Fomos também estudar as alterações

que a PGI2 poderia apresentar quer a nível vascular quer a nível plasmático, uma vez que

esta é também um importante factor vasodilatador derivado do endotélio e um potente

inibidor da activação plaquetar, contribuindo assim igualmente para a fisiologia e

fisiopatologia cardiovascular.

Uma vez que existe a possibilidade das plaquetas estarem também envolvidas no

aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base nos variados mecanismos

propostos para o aumento da vasoconstrição e visto que as plaquetas também possuem uma

via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade, fomos também estudar se estaria

alterada a via da L-arginina:NO:GMPc das plaquetas.

Nos estudos realizados em trabalhos anteriores verificou-se que no nosso modelo

experimental a lesão morfológica arterial ainda insipiente, já comprometia, sobretudo a

camada da íntima (edema endotelial, esporões, ruptura da lâmina elástica), cujas lesões

atingiam essencialmente as células endoteliais e não o músculo liso vascular. Apesar disso,

nós encontrámos um aumento da síntese de colagénio. Nos estudos morfológicos das

plaquetas identificaram-se alguns sinais, como a formação de pseudópodos, a alteração da

forma e a modificação da estrutura membranar, que sugerem uma activação plaquetar nos

ratos tratados com CsA (estudos realizados em trabalhos anteriores).

Apesar de discretas, tais alterações são relevantes porque são acompanhadas por

evidentes distúrbios da pressão arterial e por nítidas alterações bioquímicas.

De facto, a administração de CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, induziu hipertensão

arterial no nosso modelo animal experimental, reproduzindo o que sucede em doentes

24

Resumo_________________________________________________________________________

sujeitos ao tratamento clínico com a CsA. Tal hipertensão arterial caracteriza-se por um

aumento da pressão arterial média, mas também da sistólica e diastólica, sem alteração da

frequência cardíaca. Tais factos deixam antever alterações na resistência vascular

periférica e, consequentemente, na reactividade vascular.

A CsA actua sobre a via da L-Arg:NO:GMPc já que se constatou que a nível

arterial o tratamento com a CsA levou a um decréscimo de cerca de 30% no conteúdo de

NO acompanhado de uma diminuição mais elevada, de cerca de 66% no conteúdo de

GMPc. Tal facto deverá ser devido a um efeito combinado da CsA nos processos de síntese

no endotélio e nos processos de formação de GMPc a partir de NO, contribuindo para a

elevada perda de GMPc a nível arterial. Assim, a CsA actuará quer a nível endotelial quer

a nível do músculo liso vascular. A diminuição de NO e de GMPc a nível vascular deverá

contribuir para o aumento da resistência vascular periférica encontrada no nosso modelo.

Estas alterações foram acompanhadas por uma diminuição do teor de PGI2 a nível

arterial, o que também deverá contribuir de forma efectiva para o aumento da resistência

vascular periférica que caracteriza o nosso modelo experimental.

Nos estudos bioquímicos das plaquetas dos ratos tratados com CsA encontramos um

aumento do conteúdo de NO e de GMPc plaquetar o que provavelmente lhes induz um

estado não reactivo ou “antihiperreactivo”. De facto, nas condições de disfunção

endotelial, como as por nós verificadas, a própria produção de NO pelas plaquetas pode

tornar-se importante na regulação da resposta das plaquetas, nomeadamente na modulação

e inibição da sua activação. O aumento do NO e consequentemente o do GMPc encontrado

irá levar à diminuição dos níveis de Ca2+ intracelular e assim actuar como mecanismo de

retrocontrolo negativo intraplaquetar que previne a activação e agregação excessiva das

plaquetas.

O aumento da concentração de PGI2 plasmática poderá também actuar na

contraregulação do estado hiperactivo das plaquetas.

25

Resumo_________________________________________________________________________

A administração conjunta de L-arginina e CsA apesar de prevenir as alterações

relacionadas com os níveis de NO e de GMPc não preveniu o desenvolvimento da

hipertensão arterial, o que sugere o envolvimento de outras alterações a nível da via NO-

GMPc, que deverão também ser avaliadas. Além disso, a simples administração de L-

arginina não parece constituir a solução para tais alterações e outras estratégias clínicas

poderão ser equacionadas, nomeadamente o recurso a dadores de NO com outras

propriedades que não apenas o de substrato da NOS, como o é a L-arginina.

26

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO GERAL

Introdução geral___________________________________________________________________________

A HIPERTENSÃO ARTERIAL

Para a O.M.S. a hipertensão arterial essencial pode ser definida como uma elevação

dos valores da pressão arterial sistólica e/ou diastólica acima de 140 e 90 mmHg,

respectivamente, para pessoas que não tenham tomado qualquer medicação para a

hipertensão. No entanto, os valores considerados normais para a pressão arterial variam com

o sexo e a idade: os homens apresentam valores mais elevados do que as mulheres e os

idosos valores mais altos do que indivíduos mais jovens.

As alterações hemodinâmicas da hipertensão arterial iniciam mudanças adaptativas

nos vasos de condução e de resistência caracterizadas por hipertrofia e hiperplasia do

músculo liso da média, aumento da matriz extracelular, diminuição da “compliance”, e

aumento da resistência. A resposta remodeladora adaptativa tende a normalizar o “stress” na

parede e confere um aumento da reactividade vascular. Todavia, as próprias alterações

vasculares podem contribuir para a amplificação da vasoconstrição, perpetuação da

hipertensão e promoção do desenvolvimento de complicações vasculares como a

aterosclerose.

Variados factores parecem estar envolvidos no aumento observado da resistência

vascular periférica total:

a) Alterações histológicas nos leitos vasculares: endotélio, íntima e média.

b) Alteração do metabolismo do cálcio que leva a um aumento do Ca2+livre intracelular,

facto que facilita a contracção desencadeada pelas substâncias vasoconstritoras.

c) Aumento da permeabilidade da membrana ao Na+ e ao Ca2+.

d) Redução da actividade da Ca2+-ATPase da membrana celular e do retículo

sarcoplasmático e da troca Na+-Ca2+, aumentando o Ca2+ livre intracelular.

e) Modificação da actividade da bomba de Na+ da membrana plasmática.

f) Aumento do tónus adrenérgico periférico com um aumento da libertação de NA.

g) Alterações no sistema renina-angiotensina, essencialmente o existente nos tecidos

extrarrenais.

29

Capítulo I___________________________________________________________________________

h) Aumento da reactividade vascular dos adrenoreceptores a1 pós-sinápticos e

atenuação da resposta b-adrenérgica.

i) Aumento da densidade do adrenoreceptor a renal (sobretudo ao nível dos túbulos

proximais).

j) Alteração do endotélio vascular com produção de substâncias vasoconstritoras e

facilitando a produção de mitogénios.

k) Presença de substâncias endógenas que inibem a bomba de Na+ presente nas células

musculares lisas vasculares e nos terminais nervosos noradrenérgicos. Esta inibição

aumenta os níveis intracelulares de Ca2+nos dois locais, ao facilitar o influxo de

Ca2+através do trocador Na+-Ca2+, aumento do tónus vascular e da libertação de NA,

respectivamente. A acção das substâncias endógenas em ambos os locais parece ser

modulada por factores libertados pelo endotélio.

Todos estes mecanismos causam um aumento no tónus vascular e na resistência

arterial, produzindo hipertensão (Marín, 1993).

A hipertensão arterial, ela própria, provoca também alterações morfológicas que

afectam não só o endotélio mas também a íntima e as células musculares lisas vasculares.

Têm sido referenciadas alterações no citoplasma, tamanho e forma das células endoteliais

(Haudenschild, Prescott e Chobanian, 1980), assim como na replicação endotelial (Huttner e

Gabbiani, 1982). A íntima e a média sofrem alterações estruturais e bioquímicas que

produzem hipertrofia e provavelmente hiperplasia (Bachmann e col., 1992). Também tem

sido descrita a aceleração da aterosclerose e a deposição subendotelial de macrófagos (Clozel

e col., 1991). Além disso, as interacções das plaquetas e dos monócitos com o endotélio

também se apresentam aumentadas nos vasos dos hipertensos quando comparados com os

vasos controlo dos normotensos.

As alterações das células endoteliais são consideradas como os principais factores

para o aumento da resistência vascular sistémica total, levando ao aumento da pressão

sanguínea arterial (Shepherd, 1990).

30


Também é sugerido que alterações genéticas possam gerar uma formação

predominante de factores constritores derivados do endotélio e mitogénicos, os quais

aumentam as respostas desencadeadas pelos vasoconstritores e reduzem a área do lúmen.

Todos estes mecanismos e substâncias vasoconstritoras limitam a vasodilatação e perpetuam

a hipertensão (Shepherd, 1990). Assim, as alterações da função ou funções endoteliais podem

contribuir para a patogénese, assim como para a progressão e complicações da hipertensão.

31

Capítulo I___________________________________________________________________________

32


O ENDOTÉLIO VASCULAR

Todo o sistema vascular é revestido internamente por uma monocamada celular

contínua de endotélio.

Durante muito tempo, o endotélio foi encarado como uma simples “alcatifa” actuando

como mera barreira mecânica, sendo-lhe atribuída apenas a função de proteger internamente

os vasos e de permitir a passagem de diversas substâncias de e para a circulação sanguínea.

Mas hoje sabe-se que o endotélio é uma estrutura complexa e heterogénea com capacidade

para reagir a estímulos humorais e hemodinâmicos, que desempenha um papel chave na

regulação da parede dos vasos quer em condições fisiológicas quer patológicas e está

envolvido em funções tão importantes e variadas como as que se encontram resumidas no

Quadro 1 e que serão descritas ao longo do texto.

Quadro 1 - Funções do endotélio_____________________________________________________

barreira selectivamente permeável entre a circulação e a parede vascular

actividades coagulantes/anti-coagulantes

vasoconstrição/vasodilatação

promotor/inibidor do crescimento

síntese/degradação

adesão/não adesão

fenómenos inflamatórios e resposta imunitária

_____________________________________________________

33

Capítulo I___________________________________________________________________________

As células endoteliais ocupam uma posição anatómica estratégica entre o sangue e o

músculo liso vascular desempenhando um importante papel não só como “sensor” mas

também como “modulador” da biologia da parede arterial, sendo o endotélio quer um alvo

quer um mediador da doença cardiovascular.

As células endoteliais desempenham um papel fundamental na manutenção da

estrutura normal da artéria e da sua integridade funcional. O endotélio não só forma uma

barreira permeável que controla as trocas de nutrientes e fluidos entre o plasma e as diversas

estruturas da parede do vaso mas também providencia uma superfície não aderente para os

leucócitos, os eritrócitos e as plaquetas; superfície não trombogénica também através da

formação de moléculas como a ectoADPase (ecto-nucleotidase ADP difosfohidrolase), a

PGI2 e o sulfato de heparina (Ross, 1995).

As células endoteliais produzem substâncias constituintes da lâmina basal,

nomeadamente colagénio tipo IV e V, elastina, fibronectina, mucopolissacáridos e

condroitina; participam na formação e secreção de uma série de moléculas reguladoras do

crescimento e citocinas e possuem a capacidade de modificar substâncias como as

lipoproteínas a partir do plasma (Ross, 1995). O endotélio desempenha um papel chave na

coagulação. Em relação ao sistema solúvel da coagulação, as células endoteliais podem ter

um papel pró-coagulante ou um papel anti-coagulante (Ross, 1995). As células endoteliais

também segregam um activador do plasminogénio que actua na lise dos coágulos sanguíneos

e o factor von Willebrand (factor VIII) que é um importante componente nas interacções

entre as plaquetas e a parede vascular (Ross, 1995).

O endotélio controla a proliferação das células do músculo liso vascular subjacente e

regula a adesão e extravasão de neutrófilos, de monócitos e de linfócitos.

Ao nível da agregação plaquetar, o endotélio também desempenha um papel de

relevo: liberta substâncias que apresentam um efeito anti-agregante plaquetar como é o caso

da PGI2 (Moncada e col., 1976; Tateson, Moncada e Vane, 1977) e do NO (Radomski,

Palmer e Moncada, 1990a) sendo importantes factores para a manutenção da homeostase e

para a prevenção da trombose.

34


Para manter a regulação do tónus vascular e a fluidez do sangue, as células

endoteliais sintetizam diversas substâncias vasoconstritoras e vasodilatadoras: a) moléculas

de elevado peso molecular como a fibronectina, o sulfato de heparina, a IL-1 e diversos

factores promotores de crescimento; b) moléculas de baixo pequeno peso molecular como o

factor activador das plaquetas, a endotelina-1, a PGI2 e o NO. A produção destas substâncias

é regulada através de alterações na concentração de diversos mensageiros intracelulares tais

como o AMPc, o GMPc ou o ião cálcio e através da interacção das células endoteliais com

diferentes tipos de leucócitos, com as plaquetas ou com compostos constituintes do plasma

(Vane, Änggard e Botting, 1990). Além disso, o NO parece ser um factor inibidor do

crescimento que se opõe aos factores promotores do crescimento, como a angiotensina II, a

endotelina-1 e os radicais livres derivados do oxigénio.

As substâncias constritoras derivadas do endotélio são diversas e incluem os aniões

superóxido ou os metabolitos do ácido araquidónico sintetizados através da via da

cicloxigenase, como o TXA2 e a PGH2 (Katusic e Shepherd, 1991). Para este efeito

vasoconstritor a superfície das células endoteliais contém também a enzima conversora da

angiotensina, que catalisa a formação do composto vasoconstritor angiotensina II a partir do

seu percursor inactivo angiotensina I. Esta mesma enzima também tem a capacidade de

inactivar a bradicinina, um potente vasodilatador. Além disso, as células endoteliais possuem

sistemas de transporte específicos para a serotonina e para a adenosina para o seu interior,

onde são depois metabolizadas pela monoaminoxidase e pela desaminase da adenosina

endoteliais respectivamente (Vane, Änggard e Botting, 1990). Mas a actividade

vasoconstritora mais potente é devida à endotelina-1.

As substâncias vasodilatadoras derivadas do endotélio mais relevantes são a PGI2 e o

NO (Vane, Änggard e Botting, 1990).

A síntese de uma determinada substância derivada do endotélio pode estar

dependente de diversos factores que podem actuar independentemente mas em simultâneo.

Assim, o endotélio modula o tónus vascular ao participar na formação de substâncias

vasoconstritoras e vasodilatadoras. Em condições normais, os factores relaxantes, em

especial o NO são libertados de forma predominante pelas células endoteliais. Um

desequilíbrio no balanço entre vasopressores e vasodepressores tem sido identificado em

vária doenças cardiovasculares, incluindo a hipertensão arterial, a aterosclerose e a diabetes

(Lüscher e Vanhoutte, 1990; Shepherd e Vanhoutte, 1991).

35

Capítulo I___________________________________________________________________________

Por tudo isto, a disfunção endotelial parece desempenhar um dos principais papéis na

alteração da resposta vascular (Kaul e col., 1993).

Quadro 2 - Factores derivados do endotélio.

Factor Papel

NO (EDRF) Inibição plaquetar

PGI2 VasodilataçãoInibição plaquetar

Hormonas/Autocóides Estimulação da libertação de NONoradrenalina (receptores a2)SerotoninaBradicininaHistamina

Coagulação / Trombose Estimulação da libertação de NOTrombinaADPATP

Factores de CrescimentoTGF-B Inibição da proliferaçãoPDGF Estimulação da proliferação de células do

músculo lisoPromoção de vasoconstrição

Heparina Inibição do crescimentoSulfatos de heparina

Pró-coagulantes Coagulação

Endotelina Promoção da vasoconstriçãoAgente de proliferação (actua através de mediadores)

Substâncias derivadas da cicloxigenase

Promoção de vasoconstrição

Tromboxano A2

Prostaglandina H2

Aniões superóxido

Adaptado de Lüscher, 1995.

36


Regulação do tónus vascular dependente do

endotélio

Fig.1. Substâncias vasoactivas derivadas do endotélio. O endotélio é uma fonte de factores relaxantes (lado direito) e de factores constrictores (lado esquerdo): AA- ácido araquidónico; AI- angiotensina I; AII- angiotensina II; ECA- enzima de conversão da angiotensina; Ach- acetilcolina; ADP- adenosina difosfato; bET- “grande”- endotelina-1; Bk- bradicinina; AMPc- monofosfato de adenosina cíclico; GMPc- monofosfato de guanosina cíclico; EDHF- factor hiperpolarizante derivado do endotélio; ECE- enzima conversora da endotelina; ET-1- endotelina-1; NO- monóxido de azoto; 5-HT- serotonina; L-arg - L-arginina; NOS- sintase do monóxido de azoto; PGH2- prostaglandina H2; PGI2- prostaciclina; TGFβ1- factor β1 transformador do crescimento; Thr- trombina; TXA2- tromboxano A2. Os círculos representam os receptores. (Adaptado de Vanhoutte, 1997).

37

Capítulo I___________________________________________________________________________

1. Factores constritores As contracções dependentes do endotélio podem ser explicadas quer pela supressão

da libertação de factores de relaxamento dependentes do endotélio quer pela produção de

substâncias vasoconstritoras difusíveis.

Os factores vasoconstritores derivados do endotélio incluem: um peptídeo, a

endotelina; os prostanóides vasoconstritores como o TXA2 e a prostaglandina H2, os

derivados do sistema renina-angiotensina e os aniões superóxido.

1.1. Endotelina

As endotelinas têm efeitos biológicos potentes a nível vascular, regulando por

exemplo a vasoconstrição, a vasodilatação, a potenciação de outros agentes vasoconstritores

e a mitogénese.

Existem 3 isoformas de endotelina com diferente estrutura e actividade

farmacológica: a endotelina-1 (ET-1), a endotelina-2 (ET-2) e a endotelina-3 (ET-3). A ET-1

é a única isoforma sintetizada pelas células endoteliais, sendo um potente vasoconstritor

tanto in vivo como in vitro. É um peptídeo linear com 21 aminoácidos e com 2 pontes de

cisteína que na sua estrutura tridimensional apresenta uma forma espiral cónica. A ET-1

resulta da proteólise de um percursor de 203 aminoácidos, a pré-proendotelina-1, por

endopeptidases específicas, com formação de um resíduo intermédio de 39 aminoácidos

chamado proendotelina-1, a qual é provavelmente segregada pelas células endoteliais e

posteriormente convertida em endotelina (Shimada, Takahashi e Tanzawa, 1994; Xu e col.,

1994).

A conversão da proendotelina-1 em ET-1 é mediada por uma das duas isoformas da

enzima conversora da endotelina (ECE1 e ECE2). A regulação da secreção de ET-1 pelas

células endoteliais processa-se a nível da síntese do peptídeo (transcrição, translação e

processamento). A célula endotelial não contém grânulos secretórios densos para o

armazenamento e libertação da ET-1 em resposta a estímulos (Sakurai e Goto, 1993).

38


Nas células endoteliais, como na maior parte das células, as endotelinas são

sintetizadas por uma via constitutiva, podendo essa síntese ser aumentada por estímulos de

natureza físico-química ou por agonistas que operam através de receptores. São exemplos as

hormonas (a angiotensina II e a arginina-vasopressina), os factores de coagulação (a

trombina), as citocinas (a IL-1) e os factores de crescimento (o factor b transformador de

crescimento -TGF-b), assim como a bradicinina, a endotoxina e o TNF. A hipóxia é também

um importante estímulo para a produção de endotelina (Simonson, 1994).

Os níveis circulantes da endotelina-1 são de um modo geral extremamente baixos,

sendo possível que em condições fisiológicas a estimulação basal da produção de endotelina

seja reduzida e/ou existam potentes mecanismos inibitórios que evitem a sua produção

excessiva ou tal facto também pode ser devido a que este péptideo seja libertado

preferencialmente em direcção às células do músculo vascular liso (Lüscher, 1994). Já foram

delineados três mecanismos inibitórios reguladores da produção de ET-1: 1) inibição

dependente do GMPc (Boulanger e Lüscher, 1990); 2) inibição dependente do AMPc

(Yokokawa e col., 1991); e 3) um factor inibidor produzido pelas células musculares lisas

vasculares (Stewart e col., 1990).

Quando libertada, a ET-1 actua em receptores selectivos presentes no músculo liso e

também no próprio endotélio. Já foram identificados e clonados dois subtipos de receptores

da endotelina, o ETA e o ETB, os quais pertencem à superfamília dos receptores de sete

hélices, acoplados a proteínas G, embora pareça existir outros subtipos de receptores

(Masaki, Vane e Vanhoutte, 1994).

As células endoteliais expressam receptores ETB ligados à formação de NO e de

PGI2. Assim, a ET-1 pode libertar NO e de PGI2 a partir das células endoteliais que, como

mecanismo de feedback negativo, reduzem a produção de ET no endotélio e a sua acção

vasoconstritora no músculo liso. No músculo liso, os receptores ETA e em parte os ETB

medeiam a constrição e a proliferação (Warner, 1993). A ET-1 em baixas concentrações

causa vasodilatação e em concentrações elevadas causa uma constrição marcada e sustentada

(Kiowski e col., 1991; Yanagisawa e col., 1988).

A acção mais marcante da ET-1 é a sua actividade hipertensora prolongada e parece

ser mais um factor de regulação local do que sistémico (Vane, Änggard e Botting, 1990). O

mecanismo pelo qual as endotelinas intervêm nos fenómenos de vasoconstrição parece

envolver a ligação da ET-1 ao receptor ETA presente nas células musculares lisas vasculares,

39

Capítulo I___________________________________________________________________________

com a subsequente activação da via celular dos fosfatos de inositol resultando no aumento da

concentração de cálcio intracelular e activação da proteína cinase C (Simonson e Dunn,

1990).

A ET-1 é vista como um mediador de eventos patológicos, ao contrário do NO e da

PGI2 cuja produção é de um modo geral essencial para a manutenção de um estado de

“saúde” do sistema cardiovascular (Battistini, D’Orleans-Juste e Sirois, 1993). Ao contrário

do NO e da PGI2, a ET-1 parece não exercer efeitos directos nas plaquetas circulantes, se

bem que possa afectar a actividade das plaquetas de um forma indirecta ao estimular a

libertação de NO e de PGI2 a partir do endotélio vascular (Thiemermann e col., 1990) e ao

aumentar a libertação do activador plasminogénico de tecidos (Filep e col., 1991).

1.2. Factores constritores derivados da

cicloxigenase

A acetilcolina e a histamina induzem uma contracção dependente do endotélio através

da produção dependente da cicloxigenase de TXA2 e de endoperóxidos PGH2,

respectivamente, os quais activam as células musculares lisas vasculares. O TXA2 e a PGH2

activam o receptor do tromboxano nas células musculares lisas e nas plaquetas e assim

apresentam uma acção contrária à do NO e da PGI2.

A via da cicloxigenase também produz aniões superóxido, os quais ao inactivar o NO

aumentam a contractilidade, mas que apresentam também efeitos directos no músculo liso

(Lüscher e col., 1993; Rubanyi, 1993). A libertação de factores constritores dependentes do

endotélio provenientes da via da cicloxigenase parece ser mais importante nas veias do que

nas artérias.

40


1.3. Sistema renina-angiotensina

Hoje está bem estabelecido que o sistema renina-angiotensina desempenha um

importante papel na fisiologia cardiovascular, na homeostase dos fluidos e no funcionamento

celular.

A renina é uma enzima proteolítica que é sintetizada, armazenada e secretada

essencialmente pelo rim (nas células justaglomerulares, localizadas nas paredes das arteríolas

aferentes quando entram no glomérulo). As consequências fisiológicas da libertação da

renina resultam de uma série de reacções enzimáticas que levam à formação de uma hormona

polipeptídica activa. A renina cinde o percursor proteico angiotensinogénio, uma globulina

a2 sintetizada pelo fígado para produzir o decapeptídeo angiotensina I. A enzima de

conversão, uma dipeptidilcarboxilpeptidase, remove já depois o carboxilo terminal His-Leu

da Angiotensina I para produzir o octapeptídeo Angiotensina II.

A ANG II é a principal hormona efectora do sistema renina-angiotensina que por

acção sobre os receptores AII da ANG II se apresenta como uma substância vasoconstritora

potente, um acelerador da síntese proteica (hipertrofia) nos tecidos vasculares, um acelerador

da síntese e da libertação de aldosterona [e através desta, da recaptação renal de Na+

(retenção de Na+) e água ] e estimula a síntese e libertação de catecolaminas a partir dos

terminais nervosos simpáticos.

De acordo com os dados in vitro e in vivo, a ANG II é produzida localmente na

parede vascular (Admiraal e col., 1990).

A ANG liga-se a dois tipos de receptores, o AT1 e o AT2. O AT1 é encontrado no

músculo liso vascular e potencialmente medeia a vasoconstrição, a proliferação, a fibrose, a

angiogénese e apresenta efeitos pró-oxidantes; o AT2 apresenta efeitos opostos. A ANG II

activa o metabolismo celular nas células musculares lisas através de 3 diferentes vias, a via

de síntese do IP3 e DG através da cisão de PI-P2, activação dos canais de Ca2+dependentes da

voltagem e reduzindo a síntese de GMPc através da inibição da adenilciclase (Gardner e col.,

1992). Estas acções da ANG II são praticamente as mesmas do que as observadas com os

outros agentes vasoconstritores.

A ANG II tem uma semi-vida curta (10-12 s) sendo rapidamente destruída nos leitos

capilares periféricos pelas angiotensinases e o passo limitante da sua formação local é a

41

Capítulo I___________________________________________________________________________

libertação de renina que está sujeita a um feedback de controlo directamente pela ANG II e

indirectamente através do efeito da angiotensina no volume sanguíneo, na pressão sanguínea

e no balanço do sódio.

A ANG II, ao induzir vasoconstrição e proliferação das células musculares lisas

vasculares, desempenha um importante papel nos mecanismos patológicos da hipertensão e

consequente evolução fisiopatológica.

Além disso, a ANG II ao ligar-se aos receptores da superfície das células endoteliais

activa o ARNm para a endotelina e assim induz a libertação de endotelina a partir do

endotélio vascular. Assim, a ANG II também pode ser considerada como um factor constritor

dependente do endotélio. Uma vez que, a ECA é idêntica à cininase II, a qual cinde a

bradicinina (degradação hidrolítica em metabolitos inactivos), um nonapeptídeo endógeno

circulante que causa relaxamento dependente do endotélio através da estimulação dos

receptores B2 para a bradicinina, sendo um potente estimulante da libertação endotelial de

NO, a ECA tecidular pode diminuir os níveis locais de NO e reduzir o efeito vasodilatador da

bradicinina no músculo liso vascular (Lüscher, 1993; Rubanyi, 1993).

1.4. Sistema adrenérgico

O sistema adrenérgico é o protótipo de um sistema neuro-hormonal. O principal

neurotransmissor deste sistema é a noradrenalina (NA), a qual é libertada a partir dos axónios

terminais dos neurónios simpáticos pós-ganglionares e depositada directamente nas células

alvo enervadas. A medula adrenal também liberta alguma NA e pode mesmo, em certas

situações patológicas ser a principal fonte de NA plasmática. Contudo, a NA plasmática

parece derivar essencialmente dos nervos simpáticos, uma vez que a excreção urinária desta

catecolamina não sofre alteração após adrenalectomia (Sigurdsson, 1995). A NA é libertada

por exocitose, a partir das vesículas das terminações nervosas simpáticas e estimula os

receptores a- e b-, sobretudo os a, desencadeando vasoconstrição e um aumento da pressão

sanguínea (Guyton, 1993).

A adrenalina (AD) é uma hormona, segregada pela medula adrenal para a circulação

sanguínea e transportada até aos vários orgãos alvo. A AD é um potente estimulante dos

receptores a- e b-, e tal como a NA, é um vasoconstritor, embora em alguns casos a AD

42


possa causar alguma vasodilatação (Guyton, 1993), consoante a dose e tipo de receptores

adrenérgicos presentes nos diferentes territórios vasculares.

A dopamina (DA), o percursor da NA, é um neurotransmissor em muitas partes do

cérebro, podendo também desempenhar essa função em certos neurónios periféricos,

produzindo geralmente vasodilatação (Rang e Dale, 1993).

43

Capítulo I___________________________________________________________________________

2. Factores relaxantesO relaxamento dependente do endotélio ocorre tanto in vitro como in vivo (Furchgott

e Zawadzki, 1980; Linder e col., 1990; Yang e col., 1991). Estas respostas podem ser

causadas por factores dependentes do endotélio, hormonas, substâncias derivadas das

plaquetas e pelo sistema da coagulação (Lüscher e Vanhoutte, 1990). Além disso, também o

estímulo físico, como o “shear stress” (exercido pelo sangue circulante) desencadeia uma

vasodilatação dependente do endotélio (Rubanyi, Romero e Vanhoutte, 1986).

Fig.2. Libertação de factores relaxantes derivados do endotélio.A activação do receptor endotelial (R) induz um influxo de Ca2+ para o citoplasma das células

endoteliais. Quando os agonistas activam as células endoteliais, um aumento no IP3 pode contribuir para o aumento do Ca2+ citoplasmático através da libertação deste a partir do retículo sarcoplasmático (SR). Após a interacção com a calmodulina, o Ca2+ activa a NOS e leva à libertação de factor hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF); o aumento do Ca2+ também acelera a formação de PGI2 a partir do ácido araquidónico (AA) pela cicloxigenase. O NO causa relaxamento através da activação da formação de GMPc a partir de GTP; a PGI2 causa relaxamento através da activação da formação de AMPc a partir do ATP; o EDHF causa hiperpolarização e relaxamento através da abertura dos canais de K+. Qualquer aumento do Ca2+ citosólico (incluindo o induzido pelo ionófero A23187), desencadeia a libertação de factores de relaxamento derivados do endotélio. (Adaptado de Vanhoutte, 1997).

44


2.1. Factor hiperpolarizante derivado do

endotélio (EDHF)

O EDHF é uma substância ainda não identificada que hiperpolariza as células

musculares lisas vasculares e causa relaxamento (Nagao e Vanhoutte, 1993; Shimokawa e

Takeshita, 1995).

Os estudos electrofisiológicos em diversas artérias, incluindo a artéria coronária

humana, demonstram que a acetilcolina e outros vasodilatadores dependentes do endotélio

desencadeiam hiperpolarizações e relaxamentos dependentes do endotélio, os quais são

devidos a um factor hiperpolarizante endotelial difusível (EDHF) distinto do NO e da PGI2

(Féletou e Vanhoutte, 1988; Vanhoutte, 1996). De facto, a observação de que nas artérias

coronárias de porco, o relaxamento dependente do endotélio induzido pela bradicinina apenas

era inibido de forma parcial pelos inibidores da formação de NO ou da cicloxigenase sugere

que uma substância relaxante derivada do endotélio, distinta do NO e da PGI2 fosse formada

ao mesmo tempo (Richards, Poston e Hilton, 1990).

A identidade química do EDHF não é conhecida e podem mesmo existir variados

EDHFs. Em certos vasos sanguíneos, os ácidos epieicosanóides (EET) formados a partir do

ácido araquidónico por acção da citocromo P450 podem corresponder ao EDHF (Campbell e

col., 1996; Vanhoutte, 1996).

A hiperpolarização das células do músculo liso vascular induzida pelo EDHF é

mediada por um aumento do efluxo dos iões K+. O tipo de canal de K+ implicado não foi

ainda completamente definido, mas provavelmente serão os de K+ dependentes do Ca2+ e não

os dependentes do ATP (Cohen e Vanhoutte, 1995; Vanhoutte, 1996). A libertação de

EDHF, tal como o que acontece para o NO, requer que ocorra um aumento do Ca2+

intracelular nas células endoteliais. A sua acção é independente do GMPc e causa o fecho dos

canais dependentes do Ca2+.

A contribuição da hiperpolarização no relaxamento vascular dependente do endotélio

varia consoante o tamanho das artérias, sendo mais importante nos vasos de resistência do

que nas artérias de condução e deve desempenhar um papel importante no controlo endotelial

da resistência vascular periférica e da pressão sanguínea (Campbel e col., 1996). Nos grandes

vasos, tanto o NO como o EDHF podem contribuir para o relaxamento dependente do

45

Capítulo I___________________________________________________________________________

endotélio, mas em condições normais o papel do NO é predominante. Nestas artérias, se a

síntese de NO se encontrar inibida, o EDHF poderá ser o responsável pelo facto do

relaxamento dependente do endotélio se encontrar praticamente normal (Kilpatrick e Cocks,

1994; Vanhoutte, 1996).

Em certas patologias, como a aterosclerose na qual a produção ou a actividade do NO

estão reduzidas, a contribuição do EDHF pode ser importante na regulação do tónus vascular.

Ao contrário do NO, o qual é produzido de forma contínua pela NOSc, o EDHF

provavelmente não apresenta uma libertação basal. A sua libertação pode ser desencadeada

não só pela acetilcolina, mas também pela bradicinina, pelos nucleótidos da adenina, pela

histamina, pela trombina e pela substância P.

Os efeitos do NO e do EDHF são aditivos, mas não sinérgicos (Nagao e Vanhoutte,

1993).

2.2. Prostaciclina

A prostaciclina (PGI2) é um prostanóide e foi descoberta em 1976 (Moncada e col.,

1976), sendo o principal membro da família das prostaglandinas produzido pelas células

endoteliais. A formação de PGI2 é iniciada pela enzima fosfolipase A2 que liberta ácido

araquidónico a partir dos fosfolipídeos da membrana. Assim, a PGI2 é um metabolito do

ácido araquidónico (AA), formada a partir da prostaglandina PGH2 (o mesmo percursor do

TXA2 ) através da acção PGI2 sintetase. A conversão do AA em prostaglandinas

endoperóxidos H2 é mediada pelas sintases da PGH ou cicloxigenase. A isomerização ou

redução, específica do tipo celular, da PGH2 a prostanóides biologicamente activos é

mediada por isomerases ou redutases. Este passo apresenta duas actividades distintas, a

actividade endoperóxido que oxigena e cicliza o ácido gordo percursor não esterificado a

formar o endoperóxido cíclico PGG2 e a actividade peroxidase que converte a PGG2 em

PGH2 mediante uma redução de dois electrões.

Foram identificadas duas isoenzimas da PGH sintase designadas por sintase da PGH

(PGHs ou COX), a COX-1 e a COX-2. Estas duas isoenzimas são idênticas em 60% dos

resíduos de aminoácidos, apresentando a mesma afinidade e capacidade de conversão do AA

46


em PGH2. As diferenças mais importantes entre as duas isoenzimas são a nível da regulação e

da expressão (DeWitt, Meade e Smith, 1993). A COX-1 é expressa de forma constitutiva e

está presente em grande parte das células, embora o nível de expressão seja variável entre as

diferentes células. São encontrados elevados níveis de COX-1 nas células endoteliais e nas

plaquetas. Os seus níveis são constantes, embora estes possam ser aumentados através da

estimulação hormonal ou por factores de crescimento. A COX-2 em condições fisiológicas é

quase indetectável em muitos tecidos, mas é rapidamente induzida em resposta a variados

mediadores pró-inflamatórios, endotoxinas, factores de crescimento, IL-1b, TNFa. A indução

da transcrição da COX-2 é rápida, transitória e selectivamente inibida pelos glucocorticóides.

A COX-1 não é induzida pelos mediadores inflamatórios, nem a sua expressão é alterada

pelos glucocorticóides (Kujubu e col., 1993). Existem dados que apoiam o conceito de que a

produção de prostaglandinas pela enzima constitutiva contribui para os efeitos benéficos e

fisiológicos atribuídos às prostaglandinas (citoprotecção no estômago e rim, homeostase

vascular) enquanto que a produção de prostaglandinas pela enzima indutível contribui para os

efeitos pró-inflamatórios e/ou mitogénicos (Isakson e col., 1995).

A PGI2 é sintetizada (figura 3) e libertada pelas células endoteliais em consequência

de uma grande variedade de alterações mecânicas e químicas sofridas pela membrana celular,

não sendo armazenada nas células, tal como as outras prostaglandinas (Piper e Vane, 1989).

Assim, a pressão pulsátil, variados mediadores endógenos e alguns fármacos estimulam a

formação de PGI2. Alguns dos estímulos químicos endógenos englobam substâncias

derivadas do plasma, como a bradicinina e a trombina e as libertadas a partir das plaquetas

activadas como a serotonina, o factor de crescimento derivado das plaquetas, a IL-1 e os

nucleótidos de adenina (Forsberg e col., 1987).

Os prostanóides não são armazenados no interior das células pois após a sua síntese

intracelular, são libertados por difusão facilitada, actuando na própria célula de origem e/ou

nas células vizinhas por interacção com os respectivos receptores, os quais estão ligados a

proteínas G específicas, estimulando ou inibindo alterações a nível dos segundos

mensageiros.

A curtíssima semi-vida e os baixos níveis plasmáticos sugerem que a PGI2 é uma

hormona local que actua após a libertação abluminal e luminal a partir do endotélio, sobre a

média dos vasos quando passa para as células do sanguíneas (Blair e col., 1982).

47

Capítulo I___________________________________________________________________________

Após a sua libertação na circulação sanguínea, a PGI2 é rapidamente hidrolizada, por

via não enzimática, em 6-ceto-prostaglandina F1a (6-ceto-PGF1a).Esta substância é

metabolizada enzimaticamente dando origem a dois metabolitos: 2,3-dinor-6-ceto-

prostaglandina F1a e 2,3-dinor-6,15-diceto-prostaglandina F1a. Ambas as substâncias, assim

como a 6-ceto-PGF1a são quimicamente estáveis e são os principais metabolitos da PGI2

excretados na urina (Vane, Änggard e Botting, 1990).

As principais acções farmacológicas da PGI2 incluem a inibição da activação

plaquetar, a vasodilatação e efeitos citoprotectores (Moncada e col., 1976; Tateson, Moncada

e Vane, 1977). A PGI2 também deprime a proliferação vascular e para tal inibe a libertação

de mitogénios a partir das plaquetas, das células endoteliais e dos macrófagos (Willis e col.,

1986). Assim, como é notado para outras respostas, o NO e a PGI2 podem actuar

conjuntamente para suprimir a proliferação do músculo liso, por exemplo nas placas

ateroscleróticas.

A PGI2 é o mais potente inibidor endógeno da agregação plaquetar, sendo por isso um

importante regulador da função das plaquetas. O facto de ser menos forte na inibição da

adesão das plaquetas, sugere que a PGI2 permite às plaquetas aderirem ao tecido vascular e

interagir com este, embora ao mesmo tempo previna e limite a formação de trombos

(Moncada, 1982). De modo contrário, o NO é um fraco inibidor da agregação das plaquetas,

o que sugere que os dois possuem papéis complementares na regulação da reactividade

plaquetar. De facto, parece que o NO não é um importante inibidor da agregação dentro do

lúmen do vaso, já que ele se liga avidamente à hemoglobina e não se pode difundir numa

forma activa para longe da superfície endotelial (Moncada, Palmer e Higgs, 1991). Nas

plaquetas, o NO e a PGI2 actuam através de vias de sinalização diferentes para produzir

efeitos semelhantes. Baixas doses de NO e de PGI2 somados conjuntamente produzem um

efeito anti-agregante mais elevado do que poderia ser esperado de uma associação puramente

aditiva (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a).

No músculo liso vascular e nas plaquetas, a PGI2 actua através da ligação a receptores

específicos da membrana, os quais estão ligados a proteínas G ligadoras de guanina

nucleótido que estimulam a adenilciclase. Tal ligação leva à conversão do ATP em AMPc e

ao aumento dos níveis intracelulares de AMPc e à subsequente fosforilação dependente do

48


AMPc de proteínas específicas, como a rap 1B e a fosfoproteína estimulada pela proteína

vasodilatadora 50-Kd (VASP) nas plaquetas (Siess, Winegar e Lapetina, 1990; Nolte e col.,

1991). Esta acção desencadeia vasodilatação no músculo liso e ao nível das plaquetas a

inibição de todos os passos e consequências da activação plaquetar, tais como a mudança de

forma, agregação, reacções de libertação e adesão, independentemente do tipo de estímulo da

activação plaquetar (Schillinger e Losert, 1980).

Parece que a sua libertação basal não é importante no controlo fisiológico do tónus

vascular, já que a pressão sanguínea parece ser pouco afectada pela aspirina ou por outros

fármacos anti-inflamatórios não esteróides, os quais inibem a actividade da cicloxigenase e

assim reduzem a produção de PGI2. Pelo contrário, a produção basal de NO parece ser da

maior importância no controlo da função local do músculo liso vascular, já que a inibição da

formação de NO pela aplicação de inibidores da NOS como a NG-monometil-L-arginina

causa um imediato aumento na pressão sanguínea e vasoconstrições locais (Gardiner e col.,

1990).

A COX-1 e a COX-2, ao conterem um centro heme-Fe no seu local activo, são alvos

possíveis da activação pelo NO.

49

Capítulo I___________________________________________________________________________

Fig. 3. Metabolismo do ácido araquidónico nas células endoteliais. (Adaptado de Vane, Änggard e Botting, 1990).

50


2.3. Monóxido de azoto (NO)

O NO (NºO) é uma molécula pequena (Peso molecular 30Da), com uma estrutura

simples de apenas dois átomos, um de nitrogénio e outro de oxigénio, que formam ligações

covalentes com grande facilidade, sem carga, mas que apresenta um electrão não

emparelhado, apresentando propriedades paramagnéticas. O NO é um radical na forma

gasosa. É relativamente instável, apresentando nos sistemas biológicos uma semi-vida

inferior a 30 segundos. O NO é menos reactivo do que vários radicais livres já que não é

capaz de reagir com ele próprio.

O NO é uma importante molécula mensageira e está envolvido em diversas funções

fisiológicas como a neurotransmissão, a regulação do tónus vascular, a integridade da parede

vascular, a reactividade plaquetar e a citotoxicidade mediada pelo sistema imunitário, sendo

o activador endógeno da forma solúvel da guanilciclase.

O NO é também considerado como “componente incómodo” da chuva ácida e do

buraco do ozono.

2.3.1.Perspectiva histórica

O conhecimento exacto acerca dos mecanismos moleculares envolvidos na constrição

e no relaxamento vascular só foi possível depois da identificação do EDRF (endothelium

derived relaxing factor), cujas propriedades químicas, bioquímicas e farmacológicas são

idênticas às do NO.

A descoberta do NO como mediador biológico nas células dos mamíferos ficou a

dever-se aos trabalhos de Furchgott e Zawadzki (1980) ao demonstrarem que só se verificava

uma resposta vascular relaxante ao agente muscarínico, acetilcolina, quando o endotélio

estava presente e que aquela não era mediada pelas prostaglandinas. Mais tarde, verificou-se

que esse comportamento se devia à formação de NO pelas células endoteliais. A natureza

química do EDRF só foi descrita em 1987. Inicialmente pensou-se que o EDRF correspondia

a um produto da lipoxigenação do ácido araquidónico (Singer e Peach, 1983), ou a um

produto da oxigenação deste ácido gordo catalisado por uma enzima dependente do

citocromo P450 (Pinto, Abraham e Mullane,1986), ou a um aldeído, a uma cetona ou a uma

51

Capítulo I___________________________________________________________________________

lactona instável (Griffith e col., 1984). A identificação do NO com o EDRF foi baseada na

verificação da semelhança de efeitos entre os nitratos vasodilatadores e aquele factor

relaxante: tanto o NO como os nitratos orgânicos activam a guanilciclase solúvel (Kukovetz

e col., 1979; Schultz, Schultz e Schultz, 1977) com o consequente aumento do GMPc

intracelular, enquanto a oxihemoglobina e o azul de metileno inibem o relaxamento vascular

e o aumento do GMPc induzidos por aquelas substâncias (Rapoport e Murad, 1983). Assim,

com base na semelhança dos efeitos farmacológicos do EDRF e do NO, Furchgott (1988) e

Ignarro e col. (1987), de forma independente, sugeriram que o EDRF podia ser o NO.

Palmer, Ferrige e Moncada (1987), usando um método químico de identificação do NO,

baseado na formação de um produto quimiluminescente resultante da reacção com o ozono e

um método de doseamento biológico na aorta do coelho, mostraram que o NO explicava a

actividade biológica do EDRF e que a L-arginina era o seu percursor (Palmer, Ashton e

Moncada, 1988).

Embora muitos estudos sugiram que o NO é o principal produto libertado por

diversas células por acção da sintase do NO, nenhum demonstrou até agora que a sua

produção é independente de outros óxidos de azoto os quais são igualmente mais reactivos

que os nitritos. A contribuição destes óxidos de azoto reactivos na actividade do EDRF ainda

aguarda um esclarecimento. Assim, a utilização do termo NO é simplista, porque,

provavelmente, as células que contêm NOS libertam para o meio extracelular uma mistura de

NO, NO2, N2O3, NO2-, NO3

-, nitrosaminas, nitrosotiois não-proteicos e proteína S-

nitrosiladas.

A descoberta da participação da função endotelial na dilatação arterial, a

caracterização do NO como molécula responsável por este fenómeno e a identificação de

enzimas com capacidade para produzir NO levaram à atribuição, em 1998, do prémio Nobel

a R. Furchgott, F. Murad e Louis Ignarro.

2.3.2.Biosíntese de NO

A formação biológica de NO deve-se a uma via metabólica relativamente simples, a

qual se encontra esquematizada na figura 4. A reacção envolve 5 electrões, a L-arginina, o

52


oxigénio e o NADPH como co-substratos, o FAD, o FMN, o heme, a BH4 reduzida e a

calmodulina como co-factores ou grupos prostéticos e o NO e a L-citrulina como co-produtos

(Knowles e Moncada, 1994; Nathan, 1992). O átomo de N do NO deriva do nitrogénio

guanidina da L-arginina e o átomo de O deriva do O2 molecular. Os electrões requeridos para

conduzir este processo derivam do NADPH.

Embora não sejam ainda conhecidos os mecanismos moleculares da reacção química,

a biossíntese parece ocorrer em duas reacções sucessivas de oxidação: a fase 1, envolve a

hidroxilação do átomo de N do grupo guanidina da L-arginina (molécula percursora),

formando-se L-NG-hidroxiarginina (ArgOH). Na segunda fase, o ArgOH é oxidado a NO e

L-citrulina.

Fig.4. Síntese de NO a partir da L-arginina. A L-citrulina é reciclada em L-arginina. (Adaptado de Änggard, 1994).

Normalmente, os níveis tecidulares de L-arginina são suficientes para a secreção

contínua de NO, mas a L-citrulina pode ser reciclada em L-arginina pela incorporação de um

átomo de N. Existe uma via metabólica que permite reciclar a L-arginina a partir da L-

citrulina por incorporação de um grupo NH2 (Hecker e col., 1990). Este ciclo da ureia

53

Capítulo I___________________________________________________________________________

modificado apresenta duas funções: por um lado, constitui um papel de regeneração da L-

arginina a partir do processo de síntese do NO e, por outro lado, é uma forma de eliminação

do excesso de nitrogénio formado pelo metabolismo celular (Ängard, 1994).

A reacção é catalisada enzimaticamente por uma das isoformas da sintase do NO

(NOS), uma dioxigenase dependente do NADPH (Nathan, 1992).

2.3.3. Isoformas da sintase do NO

A sintase do NO é uma enzima que contém o grupo heme e apresenta uma sequência

semelhante à citocromo P450 redutase.

Desde que a sua existência foi originalmente descrita em 1989, em mamíferos, têm

sido identificadas várias isoformas da sintase do NO (Lowenstein, Dinerman e Snyder, 1994;

Nathan, 1992). Foram purificadas, clonadas e sequenciadas três enzimas envolvidas na

síntese de NO, distribuídas por duas classes de sintases do NO: a chamada forma constitutiva

da enzima (NOSc) que está presente em condições fisiológicas, no endotélio e no tecido

neuronial, e a indutível (NOSi) que é funcionalmente independente do Ca2+, localizada nos

macrófagos activados, nas células musculares lisas e endoteliais. Pelo menos duas das

enzimas constitutivas já clonadas exibem propriedades muito semelhantes: a enzima

endotelial (NOSe) e a enzima neuronial (NOSn), localizada em alguns neurónios centrais e

nos neurónios periféricos não-adrenérgicos e não-colinérgicos (NANC).

A distribuição de cada uma das isoformas pelos tecidos é diferente mas parece que o

mesmo tipo de célula pode expressar mais do que um tipo de NOS (Nathan, 1992). De facto,

a NOSi pode estar presente de forma constitutiva em certos tecidos como no epitélio

brônquico humano e além disso, a NOSn tem sido localizada em variados tipos de células

não neuroniais e já foi demonstrada a NOSe em alguns neurónios. Estudos recentes

evidenciaram que as enzimas expressas de forma constitutiva também podem ser induzidas

em certas condições (Knowles e Moncada, 1994), como durante o exercício crónico ou

durante a gravidez, na qual tanto a NOSe como a NOSi podem ser induzidas (Weiner e col.,

1994).

A isoforma constitutiva produz pequenas quantidades de NO que participam na

transmissão neuronial e activam a guanilciclase solúvel do músculo liso vascular e das

54


plaquetas, provocando vasodilatação e com uma acção antiagregante plaquetar. Por outro

lado, a isoforma indutível é induzida em algumas células por estímulos imunológicos ou

inflamatórios, como a IL-1, o IF-g ou o TNF ou por compostos produzidos por

microorganismos e produz quantidades elevadas e um fluxo contínuo de NO até o substrato

se esgotar, as quais podem ser citotóxicas para as células tumorais, microorganismos como

as bactérias e fungos e para as próprias células endoteliais (Palmer, Ferrige e Moncada,

1987). Além disso, esta isoforma tem sido responsabilizada na patogénese do choque

séptico, de doenças imunológicas e inflamatórias. A forma indutível está essencialmente

presente nas células que participam nos processos imunitários, nomeadamente nos

processos inflamatórios, mas a distribuição não se limita apenas a estes tecidos.

A nível da regulação existem diferenças significativas. Ambas as isoformas NOSc são

activadas a nível pós-transcricional pela calmodulina por estímulos que levam a um aumento

do cálcio intracelular. Este liga-se à calmodulina, resultando a formação de um complexo que

se liga à enzima. Pelo contrário, a NOSi é regulada a nível da transcrição apresentando uma

ligação permanente à calmodulina o que permite que a enzima permaneça num estado

activado e seja insensível à concentração de cálcio intracelular (Cho, Xie e Calaycay, 1992).

No Quadro 3 são apresentadas, em resumo, as características comuns e as diferenças

entre as duas classes de sintases do NO.

55

Capítulo I___________________________________________________________________________

Quadro 3

Características comunsSubstrato L-argininaCo-factores NADPH,FAD,FMN,BH4Grupo heme protoporfirina IXCo-produtos NO, L-citrulinaLocalização CitosólicaDiferenças

NOSc NOSiExpressão permanente requer induçãoProdução reduzida e intermitente

liberta picomoles (pmol) de NO

elevada e sustentadaliberta nanomoles (nmol) de NO

Activação acetilcolina,glutamato trombina,ADP,ATP PAF,bradicinina NMDA,leucotrieno pressão sanguínea, ionóforos de Ca2+

Indução NOSe NOSnexercício trauma físico neuronial

“shear stress”

lisofosfatidilcolina (Lyso PC)

como agente único:INFd, INFa, LPS, TNF, IL-1em combinações sinérgicas:INFd+TNFbINFd+TNFaINFd+LPSINFd+IL-1IL-1+LPSINFa+LPSINFb+LPSLDL oxidadas

Dependência do Ca2+ sim nãoFunção regulação defesaAlvos moleculares proteínas heme

tióisguanilciclase solúvel

tióisproteínas Fe-S

Localização cromossómica no humano

NOSe NOSn 7 12 17

NMDA- N-metil-D-aspartato, INF- interferon. (Adaptado de Änggard, 1994).

56


2.3.4.Transporte e moléculas alvo do NO

O NO é marcadamente lipofílico, o que lhe permite atravessar as membranas por um

processo de difusão simples não utilizando transportadores de membrana específicos. As

características químicas da molécula de NO não permitem que este possa exercer acções em

locais distantes da sua formação, já que é rapidamente consumido e inactivado quer em

circulação quer no espaço intracelular. Assim, a maioria das acções do NO são observadas a

nível local. É o caso do NO formado a nível das células endoteliais que se difunde fácil e

rapidamente para as células musculares lisas subjacentes, activando a guanilciclase por

ligação ao grupo heme daquela enzima.

No espaço extracelular, o NO é inactivado ao reagir com o oxigénio e com os aniões

superóxido. Mas, tem-se observado que o NO pode circular no plasma dos mamíferos através

da formação de aductos com a albumina, formando S-nitroso-albumina (Keaney e col.,1993;

Stamler e col., 1992). De facto, em condições fisiológicas, os óxidos de azoto reagem

facilmente com os grupos tiol das proteínas, formando S-nitroso-compostos estáveis e

biologicamente activos. Os tióis parecem ter, em certa medida, a função de armazenar o NO,

prolongando a sua acção (Änggard, 1994).

Imediatamente após a sua síntese, o NO exerce efeitos biológicos na célula em que

foi formado ou nas células subjacentes. A este conceito de formação e utilização imediata

tem sido sugerida a possibilidade de armazenamento do NO. Esta hipótese é

fundamentalmente aplicável ao NO formado por via indutível, ou seja, em situação em que o

NO se encontra em excesso. O NO pode reagir com o ferro ferroso a nível intracelular

formando com as proteínas complexos dinitrosil-ferro ferroso, que o protegem da

inactivação. Mas ainda não foi demonstrado se os complexos dinitrosil-ferro podem libertar

NO (Busse e col., 1993). O NO também pode nitrosar moléculas que contenham o grupo

sulfidrilo, como o glutatião, a cisteína e a albumina. A cinética da associação e dissociação

destas moléculas, retendo ou libertando o NO, torna-as potenciais depósitos ou

transportadores de NO que prolongam a sua acção (Änggard, 1994).

57

Capítulo I___________________________________________________________________________

Os alvos conhecidos do NO são diversos e incluem tanto substâncias de baixo peso

molecular como macromoléculas, nomeadamente a guanilciclase solúvel (GCs), a

hemoglobina (Hb), a mioglobina e os aniões superóxido (Fig. 5).

Fig. 5. As interacções do NO com biomoléculas. (Adaptado de Radomski e Salas, 1995).

O NO interage com variadas enzimas. Tal resulta numa inibição selectiva da 12-

lipoxigenase das plaquetas e numa diminuição da conversão do ácido araquidónico nos seus

derivados 12-hidroperoxi/hidroxi bioactivos (Nakatsuka e Osawa, 1994). A capacidade do

NO para interagir com os complexos I (NADH:oxiredutase da ubiquinona) e II (oxiredutase

do succinato-ubiquinona) envolvidas no transporte de electrões na respiração mitocondrial, e

com a cis-aconitase no ciclo do ácido cítrico, tem sido relacionado com as sua propriedades

citostáticas/citotóxicas direccionadas não apenas contra os microorganismos mas também

para as células e tecidos do hospedeiro (Hibbs e col., 1990). Está demonstrado que o NO

derivado dos macrófagos inibe a síntese de ADN. Tal pode dever-se à inibição da indução

58


pelo NO da redutase do ribonucleótido, a enzima limitadora da biossíntese de ADN

(Lepoivre e col., 1991).

Tem-se verificado que o NO exógeno e alguns compostos geradores de NO quando

aplicados em elevadas concentrações podem causar mutagenicidade por desaminação do

ADN (Wink e col., 1991). Contudo, tal facto ainda não foi demonstrado com o NO

endógeno.

As reacções de S-nitrosilação dos tióis levam á formação de S-nitrosiltióis. A S-

nitrosilação de alguns tióis como a albumina e a glutamina pode prolongar a vida biológica

do NO (Stamler e col., 1992), mas a S-nitrosilação de tióis associada com os canais iónicos e

com os receptores pode modificar as funções destas estruturas.

GMPc. O principal sistema efector da acção do NO

O grupo heme da forma solúvel da guanilciclase é claramente um dos mais sensíveis e

importante local de acção do NO, baseado no bem estabelecido papel do GMPc em variadas

respostas mediadas pelo NO. Antes da descoberta do NO como um produto do metabolismo,

já se sabia que os agentes libertadores de NO estimulavam a guanilciclase através de um

mecanismo que requeria heme (Craven e DeRubertis, 1978). O NO exerce muitos dos seus

efeitos através da acumulação intracelular do GMPc o qual, por sua vez, actua em variadas

proteínas alvo intracelulares (Ignarro, 1991; Murad e Ishii, 1990).

Tanto a acção inibidora do NO sobre a adesão das plaquetas ao colagénio e às células

endoteliais como a agregação plaquetar são mediadas por um mecanismo dependente do

GMPc (Moncada, Palmer e Higgs, 1991). A inibição da mitogénese e da proliferação do

músculo liso vascular pelo NO também é realizada através do aumento de GMPc (Garg e

Hassid, 1989).

59

Capítulo I___________________________________________________________________________

Em várias células, a acumulação de GMPc é despoletada por hormonas e

neurotransmissores que aumentam a concentração de cálcio livre intracelular (Waldman e

Murad, 1987). O GMPc medeia a resposta intracelular destes sinais extracelulares e contribui

para a regulação de variados processos biológicos, como o relaxamento do músculo liso, a

inibição plaquetar e talvez também regule a libertação de neurotransmissores cerebrais. Os

alvos moleculares do GMPc incluem as proteínas cinases estimuladas pelo GMPc que

fosforilam substratos específicos, os canais iónicos regulados pelo GMPc e as

fosfodiesterases (Butt e col., 1993; Schimidt, Lohmann e Walter, 1993; Walter, 1989). A

formação de GMPc a partir de magnésio guanosina 5’-trifosfato (Mg2+-GTP) é catalisada por

uma família de guanilciclases, as quais existem em duas grandes formas: uma ligada à

membrana e a guanilciclase solúvel. Ambas as formas têm sido purificadas, clonadas,

sequenciadas e expressas como enzimas funcionalmente intactas.

A guanilciclase solúvel (GCs) representa o receptor para o NO e existe

predominantemente nas fracções citoplasmáticas (Koesling, Böhme e Schultz, 1991). O NO

liga-se ao complexo heme da GCs, talvez deformando o anel porfirínico, e a deformação

resultante da estrutura terciária da enzima resulta no aumento de 400 vezes a actividade da

enzima e assim na formação do segundo mensageiro intracelular, o GMPc.

As isoformas da GCs são proteínas heterodiméricas constituídas por duas

subunidades diferentes, a e b, com peso molecular de aproximadamente 70 e 73 kDa,

respectivamente. Até à data foram identificadas quatro subunidades (a1, a2, b1 e b2)

(Koesling, Böhme e Schultz, 1991 ). Todas as subunidades da GCs possuem um domínio

catalítico ciclase C-terminal comum, o qual está também presente na GC ligada à membrana

e nas adenilciclases. A GCs contém dois domínios catalíticos diferentes.

O NO activa a guanilciclase solúvel por nitrosação do seu heme ligando-se ao Fe2+,

aumentando os níveis intracelulares do GMPc nas células do músculo liso ( Angus e Cock,

1989; Furchgott, 1984). Este aumento do GMPc medeia a acção relaxante do NO pela

redução dos níveis do Ca2+intracelular nestas células (Schini, Malta e Miller, 1987).

Têm sido propostos variados mecanismos para explicar o relaxamento desencadeado

pelo GMPc:

60


1. Interferência com os sistemas de influxo/extrusão do Ca2+ ao nível da membrana

celular:

a) por activação da ATPase dependente de Ca2+ (Fiscus, 1988):

por fosforilação de proteínas do citoesqueleto, as quais promovem a

mobilização da enzima a partir de fontes intracelulares;

por fosforilação do fosfatidil inositol (PI) da membrana em fosfato de

fosfatidil inositol (PIP).

b) por fosforilação e consequente inibição dos canais de cálcio dependentes de

receptor (ROC) ou da voltagem (VOC) (Godfraind, 1986);

c) por fosforilação e consequente estimulação de canais de potássio dependentes

do Ca2+, resultando uma hiperpolarização da célula com inibição do influxo de

Ca2+(Komori e Suzuki, 1987).

2. Interferência com os sistemas de influxo/extrusão do Ca2+ ao nível do retículo

sarcoplasmático:

a) inibição da fosfolipase C (PLC) com redução da formação de trifosfato de

inositol (IP3) e consequente diminuição da libertação de Ca2+a partir do

retículo sarcoplasmático (Rapoport e Murad, 1986);

b) fosforilação do receptor do IP3 com diminuição da afinidade para aquele

segundo mensageiro;

c) por activação da ATPase dependente de Ca2+através da fosforilação da

proteína fosfolamban.

3. Aumento da desfosforilação das cadeias leves de miosina (Rapoport, Draznin e

Murad, 1983).

Ainda não está esclarecido quando é que o relaxamento é apenas desencadeado pelo

aumento do GMPc ou por outras acções do EDRF que possam contribuir para a

vasodilatação. Como nem todas as acções do NO são mediadas pelo GMPc, também no

relaxamento vascular podem estar envolvidas outras proteínas alvo.

As concentrações elevadas de GMPc activam a proteína cinase dependente do GMPc

e a fosforilação de variadas proteínas alvo. Entre as proteínas fosforiladas em resposta ao

61

Capítulo I___________________________________________________________________________

GMPc (Walter, 1989), a melhor caracterizada é a fosfoproteína estimulada pelo vasodilatador

(VASP), de 46/50 kDa. A associação da VASP com o citoesqueleto plaquetar deve ser

importante para o efeito inibitório no receptor do fibrinogénio (Horstrup e col., 1994).

A fosforilação proteica induzida pelo GMPc também deve estar envolvida na

captação de serotonina pelas plaquetas (Launay e col., 1994).

O GMPc diminui as concentrações basais e estimuladas do cálcio intracelular

(Johansson e Hayness, 1992). Em certas condições o GMPc ao inibir a fosfodiesterase do

AMPc inibida pelo GMPc pode impedir a hidrólise do AMPc e aumentar os efeitos

biológicos deste último nucleótido (Maurice e Haslam, 1990).

O metabolismo dos fosfolípidos da membrana também pode ser modificado pelo

GMPc. De facto, tem sido referenciado que o GMPc inibe a actividade quer da fosfolipase C,

quer da fosfolipase A2 nas plaquetas (Sane e col., 1989).

Por fim, o GMPc inibe a função de alguns receptores plaquetares, incluindo o

receptor IIb/IIIa do fibrinogénio e a P-selectina (Salas e col., 1994).

As acções biológicas do GMPc são terminadas pela fosfodiesterase do GMPc assim

como pelo seu efluxo das células (Walter, 1989; Wu e col., 1993).

Como já foi referido, o NO é o mais potente e efectivo activador da GCs. Mas além

do NO, a GCs também é regulada por uma família de factores activadores da guanilciclase

(GAF), formados por via enzimática, os quais incluem o CO e o OH (Schmidt e col., 1991).

O CO é formado a partir de dois percursores, os ácidos gordos ou o heme. A formação de OH

pode ser enzimática ou não enzimática.

O mecanismo pelo qual o CO activa a GCs é provavelmente idêntico ao do NO

(Brune e Ullrich, 1987). Além do mais, o CO e o NO têm efeitos similares na agregação

plaquetar (Brune e Ullrich, 1987), na função do músculo liso vascular (McFaul e McGrath,

1987) e nos níveis intracelulares de GMPc (Firgaira, Cotton e Danks, 1981). O mecanismo

de activação da GCs pelo OH ainda não está esclarecido, mas parece ser diferente do do NO

e do CO. O OH deve interagir com os grupos tióis reguladores da GCs (Wu e col., 1992), os

quais funcionam como um sistema sensor redox celular e como proteína efectora.

O CO e o OH de forma semelhante ao NO, dependendo das suas concentrações

podem apresentar funções sinalizadoras ou podem ser altamente citotóxicos.

62


Fig. 6. Acções subsequentes à síntese de GMPc. (Adaptado de Schmidt, Lohmann e Walter, 1993).

63

Capítulo I___________________________________________________________________________

2.3.5. Funções do NO endógeno

Os estudos efectuados têm demonstrado a natureza ubiquitária do NO, apresentando

este efeitos importantes em muitos sistemas como o cardiovascular, o gastrintestinal, o

respiratório, o geniturinário, o imunológico e também a nível do sistema nervoso central e

periférico.

Variadas situações patológicas estão associadas quer a um déficit de NO, como a

hipertensão arterial e a impotência sexual masculina, quer a um excesso de NO como o

choque séptico, desordens neurodegenerativas e a inflamação.

a) Sistema imunitário e inflamatórioOs efeitos citotóxicos e/ou citostáticos do NO são importantes na defesa do

hospedeiro contra numerosos agentes patogénicos incluindo bactérias (Mayer, Brunner e

Schmidt, 1993), fungos (Alspaugh e Granger, 1991), virus (Croen, 1993) e parasitas

metazoários, como sobre células do próprio organismo, nomeadamente as células tumorais

(Hibbs e col., 1988).

As células do sistema imunitário, incluindo os macrófagos, os monócitos e as células

de Kupffer apresentam a capacidade de produzir NO em quantidades muito superiores à

formada pelo endotélio ou pelos neurónios, o que sugere um papel daquele mediador na

regulação da imunidade e da inflamação.

O NO formado por este tipo de células tem origem na actividade da sintase do NO

indutível. A produção de NO pela NOSi ocorre em grandes quantidades e durante um longo

período de tempo e está muitas vezes associada a consequências patológicas como a sepsis, a

diabetes e a cirrose hepática(Moncada, Palmer e Higgs, 1991; Nathan, 1992).

As acções citostáticas/citotóxicas do NO parecem resultar das suas acções inibitórias

em enzimas chave da cadeia respiratória e na síntese de ácido desoxiribonucleico nas células

alvo (Hibbs e col. 1990; Nguyen e col., 1992). O NO também pode interagir com radicais

derivados do oxigénio o que leva à formação de outras substâncias tóxicas (Hibbs, 1992)

como o peroxinitrito (Beckman e col., 1990).

64


Este é um poderoso oxidante, contudo parecem existir mecanismos muito efectivos

para a sua remoção e inactivação (Moro e col., 1994).

b) Sistema nervoso central e periféricoO NO é sintetizado nos neurónios do SNC, onde actua como neuromediador com

variadas funções fisiológicas, incluindo a formação da memória, a coordenação entre a

actividade neuronal e o fluxo sanguíneo e a modulação da dor (Garthwait, 1991; Snyder e

Bredt, 1992).

No SNP, sabe-se agora que o NO é o mediador libertado por uma vasta rede nervosa,

conhecida como não-adrenérgica e não-colinérgica (NANC). O NO, actuando como

neurotransmissor e/ou neuromodulador, medeia algumas formas de vasodilatação

neurogénica e regula várias funções gastrintestinais, respiratórias e geniturinárias (Gillespie,

Liu e Martin, 1990; Rand, 1992; Toda, 1995).

Parecem ser os neurónios NANC os responsáveis pela mediação do relaxamento

muscular a nível gastrintestinal cujo neurotransmissor está descrito como sendo o NO (Stark

e Szurszewski, 1992). A formação do NO a partir dos neurónios NANC parece ser a

responsável pela dilatação gástrica adaptativa e pelo peristaltismo (Desai, Sessa e Vane,

1991). Também tem sido descrita a neurotransmissão dependente do NO nos esfíncteres

esofágico, ileocólico e anal (Ängard, 1994).

A nível pulmonar o NO é libertado pelos nervos nitrérgicos exercendo uma actividade

broncodilatadora (Belvisi e col., 1992).

O NO parece estar relacionado com a modulação de canais de potássio que intervêm

na regulação da transmissão neuronial (Katayama, 1995).

65

Capítulo I___________________________________________________________________________

c) Sistema cardiovascular. O papel do NO na

homeostase vascular

Fig. 7. Processos de transdução de sinal que ocorrem numa célula endotelial normal. A activação da célula endotelial leva à libertação do factor de relaxamento derivado do endotélio EDRF-NO, o qual apresenta importantes acções protectoras na parede vascular. 5-HT1D -receptor da serotonina; α2 –adrenoreceptor α2; ETB -receptor da endotelina; B2 -receptor da bradicinina; P2Y -receptor purinérgico; G -proteína G; LDL-lipoproteína de baixa densidade. (Adaptado de Vanhoutte, 1997).

1. Acções vasculares do NO

A história do NO na biologia vascular começa na segunda metade do Século XIX

com o uso dos nitratos orgânicos no tratamento da angina. O NO é considerado como o

nitrovasodilatador endógeno.

A identificação em 1987 do NO como mediador responsável pelas acções do EDRF

levou a uma explosão na quantidade de trabalhos de investigação tentando definir o papel

daquele mediador na homeostase cardiovascular.

66


O sistema cardiovascular está num constante estado de vasodilatação activa

dependente da formação de NO. A manutenção do tónus vascular normal resulta, para além

da intervenção do sistema nervoso simpático, da interacção dos mediadores

vasodilatadores (NO e a PGI2) e vasoconstritores (endotelina-1) derivados do endotélio.

Em condições fisiológicas basais, este balanço resulta a favor da vasodilatação (Furchgott e

Vanhoutte, 1989). O NO libertado pelas células endoteliais e pelos nervos nitrérgicos é o

sistema vasodilatador endógeno mais importante que contrabalança a vasoconstrição

produzida pelo sistema nervoso simpático e pelo sistema renina-angiotensina.

O NO e a prostaciclina parecem actuar sinergicamente, embora utilizando

diferentes segundos mensageiros: a prostaciclina actua através do AMPc e o NO através do

GMPc. Mas, embora a prostaciclina apresente um tempo de semi-vida mais longo do que o

NO, este parece ser o principal mediador determinante do tónus vascular basal (Rodeberg e

col., 1995).

O NO é libertado continuamente pela circulação arterial, parecendo ser o mediador

mais importante na regulação do tónus vascular basal. A nível endotelial a enzima

responsável pela formação do NO é a sintase do NO constitutiva endotelial. Esta enzima

controla dois tipos de libertação do NO: a libertação basal e a libertação estimulada. Durante

a libertação basal contínua, a síntese endotelial de NO pode ser aumentada pela estimulação

de receptores (por exemplo, acetilcolina, ATP, ou a bradicinina) ou independentemente de

receptores (por exemplo, ionóforos de Ca2+, policatiões ou inibidores da ATPase dependente

de Ca2+). Os estímulos físicos como o shear stress do fluido ou o estiramento pulsátil da

parede do vaso também estimulam a libertação de níveis de NO acima do valor basal e

podem representar o mecanismo mais importante de libertação do NO no endotélio vascular.

Busse e col. (1993) consideram que a libertação de NO induzida pelo shear stress do fluido

parece ser o factor mais importante de regulação do tónus vascular, enquanto que a libertação

de NO mediada por agonistas funciona como um mecanismo de reserva para aumentar as

concentrações de NO aquando das necessidades transitórias e locais como, por exemplo,

durante a formação de microtrombos. O aumento da síntese do NO nas células endoteliais

induzido por agonistas ou independentemente de receptores tem como pré-requisito o

67

Capítulo I___________________________________________________________________________

aumento da concentração de Ca2+livre intracelular ([Ca2+]i). A elevação de [Ca2+]i é mediada

por um aumento transitório de IP3 que promove a libertação de Ca2+do retículo

sarcoplasmático e por um influxo transmembranar sustentado de Ca2+ a partir do espaço

extracelular. Enquanto o papel do IP3 (resultante da hidrólise do fosfoinositol da membrana

por activação da fosfolipase C pelos agonistas como a vasopressina, a angiotensina II e a

endotelina) na libertação de Ca2+ está bem documentada nas células endoteliais, a regulação

do influxo de Ca2+ transmembranar ainda é mal compreendida (Busse e col., 1993).

O mecanismo através do qual o NO relaxa os vasos sanguíneos consiste na interacção

deste com o centro heme da guanilciclase solúvel resultando na formação de GMPc (Ignarro

e col., 1981; Katsuki e col., 1977). A acumulação de GMPc resulta na activação da proteína

cinase dependente do GMPc, na diminuição da fosforilação das cadeias leves de miosina e no

relaxamento (Fiscus, Rapoport e Murad, 1984). Esta acção do GMPc é desencadeada através

da diminuição do Ca2+ livre intracelular (Cornwell e Lincoln, 1988; Johnson e Lincoln,

1985).

Através de estudos realizados com análogos da L-arginina inibidores da sintase do

NO, foi demonstrado que a resposta vasodilatadora ao NO ocorre predominantemente no

sistema arterial, sugerindo que as artérias apresentam uma produção basal superior de NO e

que estão assim mais dependentes do mediador para a regulação do tónus vascular do que as

veias. Mas, embora as veias apresentem uma produção inferior de NO do que as artérias,

estas possuem níveis de GMPc mais elevados como mecanismo compensatório (Rodeberg e

col., 1995). Estes dados poderão explicar a observação clínica de que as veias são mais

susceptíveis à acção vasodilatadora dos fármacos nitrovasodilatadores, os quais estimulam

directamente a guanilciclase do músculo liso. O desenvolvimento do fenómeno característico

de tolerância aos nitrovasodilatadores administrados exogenamente parece dever-se a um

decréscimo no metabolismo do NO ou a uma dessensibilização da guanilciclase ao NO

(Ignarro e col., 1981). O contributo do NO diminui à medida que o tamanho dos vasos se

torna menor tanto em condições basais como durante a estimulação (Shimokawa e Takeshita,

1995).

68


O NO também intervém na regulação da permeabilidade das células endoteliais

(Kubes e Granger, 1992).

O NO inibe a síntese de ADN, a mitogénese e a proliferação das células musculares

lisas subjacentes (Nakaki e col., 1990), tal acção pode ser devida quer à capacidade do NO

em diminuir a libertação de factores mitogénicos a partir das plaquetas (Barrett, Willis e

Vane, 1989), quer através de um evento directo mediado pelo GMPc dentro do músculo liso

vascular (Garg e Hassid, 1989).

O NO inibe a formação de endotelina (Boulanger e Lüscher, 1990).

O NO pode também influenciar a produção e/ou a libertação de outros mediadores

associados à regulação do tónus vascular, como por exemplo, a produção endógena de NO no

rim inibe a libertação de renina.

Os níveis de produção basal de NO parecem ser responsáveis pela regulação do

débito sanguíneo no cérebro (Faraci e Brian, 1994), no coração (Chu e col., 1990), nos

pulmões (Fineman, Heymann e Soifer, 1991), no tracto gastrintestinal (Iwata e col., 1992) e

no rim (Deng e Baylis, 1993; Yukimura e col., 1992).

As alterações na formação de NO podem contribuir para estados de doença vascular

ou serem consequência de processos patológicos a nível vascular. De facto, uma diminuição

da síntese de NO endotelial apresenta consequências importantes: por um lado, leva a uma

diminuição do relaxamento vascular, podendo contribuir para o desenvolvimento de

hipertensão arterial, por outro lado, como consequência da perda de capacidade em prevenir

a agregação plaquetar e a proliferação das células musculares lisas, pode ocorrer o

desenvolvimento de lesões e disfunção vascular progressiva como a que se observa em

situações patológicas como a aterosclerose ou a diabetes melitus. Mas, a formação de

quantidades excessivas de NO também pode ser prejudicial como se verifica na hipotensão

associada ao choque séptico.

2. Acções do NO na homeostase e na função das plaquetas

O NO formado pelas células endoteliais não apresenta apenas um papel como

vasodilatador. Ao formar-se no endotélio das células do leito vascular, pode interagir

directamente com as plaquetas. Assim, o NO também previne a agregação e a adesão

69

Capítulo I___________________________________________________________________________

plaquetar (Ignarro, 1990; Moncada, Palmer e Higgs,1991), acção essa, desencadeada

através da estimulação da guanilciclase solúvel plaquetar (Mellion, Ignarro e Ohlstein,

1981; Nishikawa e col., 1982; Salvemini e col., 1990).

A inibição da agregação plaquetar dependente do endotélio é controlada através de

dois mecanismos diferentes: através da prostaciclina com o consequente aumento do

AMPc e do NO com o aumento do GMPc. Estes dois mediadores actuam de forma

sinérgica embora pareça que o NO desempenhe um papel preponderante, já que a adesão

das plaquetas ao endotélio ou ao colagénio pode ser completamente bloqueada pelo NO,

enquanto que a prostaciclina apenas inibe parcialmente este fenómeno.

Fig. 8. Efeitos do NO na função das

plaquetas. PDE-III-fosfodiesterase; VASP-fosfoproteína estimulada por vasodilatador. (Adaptado de Body, 1996).

70


O mecanismo molecular subjacente às propriedades do NO que determinam a

prevenção da adesão e agregação plaquetar não está ainda esclarecido, mas as hipóteses

propostas são a activação das enzimas adenilciclase e guanilciclase plaquetares pelo NO

(Radomski, Palmer e Moncada, 1987a), a inibição da fosfolipase C plaquetária (Durane e

col., 1992) ou a promoção da ligação da ADP-ribose à enzima plaquetar desidrogenase do

3-fosfato-gliceraldeído (Brune, Molina y Vedia e Lapetina, 1990).

Um dos mecanismos através do qual o NO endotelial pode regular a função das

plaquetas já foi elucidado por Murohara e col. (1995). A P-selectina encontra-se

normalmente presente nos corpos de Weibel-Palade existente nas células endoteliais e

também nos grânulos a das plaquetas. Quando estas são activadas, os grânulos fundem

com a membrana plasmática e a P-selectina é rapidamente translocada para a superfície

extracelular.

Os inibidores da NOS, como o L-NAME, induzem a expressão de P-selectina na

superfície das células endoteliais na circulação mesentérica do rato in vivo. Este dado

sugere que o NO regula a adesão das plaquetas ao endotélio ao diminuir a expressão da P-

selectina requerida para a “ligação” inicial das plaquetas ao endotélio.

A inibição da libertação de NO (resultante de doenças como a hipertensão ou a

aterosclerose ou após bloqueio com inibidores da NOS) a partir das células endoteliais

promove a adesão e agregação plaquetar (Radomski, Palmer e Moncada, 1987a; Sneddon e

Vane, 1988); contudo, quando as plaquetas agregam, elas libertam, entre outros mediadores,

a 5-HT e o ADP, substâncias que podem causar constrição vascular por actuação directa na

camada de células de músculo liso. No entanto, em condições normais de saúde das artérias

humanas, as plaquetas agregadas causam dilatação porque a 5-HT e o ADP actuam em

receptores presentes nas células endoteliais, os receptores 5-HTiD e P2y, respectivamente, que

estão em ligação com o sistema de NOS (Vanhoutte, 1991). Mas, em condições normais, as

plaquetas não aderem à superfície do endotélio e, se ocorrer a formação de agregados

plaquetares, a libertação de NO abre de imediato o vaso sanguíneo e liberta o microagregado.

Assim, os estudos em humanos já demonstraram que o NO inibe: 1) a agregação

plaquetar (Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991; Radomski, Palmer e Moncada, 1987a);

2) a ligação do fibrinogénio às plaquetas (Mendelsohn e col., 1990); 3) a adesão das

plaquetas ao endotélio lesado (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b; Sneddon e Vane, 1988)

71

Capítulo I___________________________________________________________________________

e 4) a secreção dos grânulos densos plaquetares (Broekman, Eiroa e Marcus, 1991;

Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991). Contudo, ainda não são conhecidos os efeitos do

NO: 1) na P-selectina da superfície das plaquetas ( que reflecte a secreção dos grânulos a)

(McEver, 1990); 2) no CD63 (que reflecte a secreção lisossomial) (Nieuwenhuis e col.,

1987); 3) no complexo glicoproteíco GPIb-IX (receptor para o factor vW envolvido na

adesão das plaquetas ao endotélio lesado) (Ruggeri, 1991) e 4) no complexo GPIIb-IIIa

(receptor para o fibrinogénio, necessário para a agregação das plaquetas) (Phillips e col.,

1988). Apenas se sabe que o GMPc regula de forma negativa a exposição à superfície das

plaquetas da P-selectina, do CD63 e o complexo GPIIb-IIIa, mas não a exposição à superfície

do complexo GPIb-IX (Michelson e col., 1996).

De forma semelhante às células endoteliais, as plaquetas conseguem produzir NO

(Radomski, Palmer e Moncada, 1990a).

A NOS das plaquetas fica activada durante a adesão das plaquetas ao colagénio

(Polanowska-Grabowska e Gear, 1994), a agregação induzida pelo colagénio, o ADP e o

ácido araquidónico (Malinski e col., 1993; Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski,

Palmer e Moncada, 1990b; Zhou, Hellermann e Solomonson, 1995). O mecanismo desta

activação não é claro; contudo, o NO gerado durante estas reacções actua como contra-

regulador da extensão da activação das plaquetas.

Assim, uma acção concertada da NOS das plaquetas e da NOS endotelial regula a

activação das plaquetas, causando inibição da adesão e da agregação e indução da

desagregação.

72


Fig. 9. Interacção entre os produtos das plaquetas, a trombina e o endotélio.Se o endotélio se encontrar intacto, variadas substâncias libertadas a partir das plaquetas (em particular

o ADP, o ATP e a 5-HT) causam a libertação de EDRF e de PGI 2. Aplica-se o mesmo mecanismo quando a trombina é formada. O EDRF libertado irá relaxar o músculo liso subjacente, “abrindo” o vaso sanguíneo e dispersando assim os microagregados formados; o EDRF também é libertado para o lúmen do vaso para prevenir a adesão das plaquetas ao endotélio e de forma sinérgica com a PGI 2, inibirá a agregação plaquetar. Além disso, a MAO (monoaminoxidase) e outras enzimas irão degradar a 5-HT, limitando a quantidade de monoamina que se poderá difundir para o músculo liso. Por fim, o endotélio actua como uma barreira física que previne o acesso ao músculo liso dos produtos vasoconstrictores plaquetares, como a 5-HT e o TxA 2. Estas diferentes funções do endotélio desempenham um papel chave na prevenção da coagulação não “desejável” e de episódios vasospásticos nos vasos sanguíneos que apresentem uma íntima normal. Se as células endoteliais forem destruídas (por ex. por traumatismo), o papel protector do endotélio é localmente “perdido”, as plaquetas podem aderir e agregar-se, seguindo-se um fenómeno vasoconstrictor, que contribui para a fase vascular da homeostase. (+) → activação; (-) → inibição. (Adaptado de Vanhoutte, 1997).

3. Acções do NO nos leucócitos

O NO afecta as interacções entre os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e as células

endoteliais. Já foi demonstrado que a inibição da formação de NO resulta num profundo

aumento na adesão dos PMN às vénulas pós-capilares. Assim, o NO também deve estar

implicado na regulação da adesão dos leucócitos às células endoteliais.

Esta acção do NO pode ser desencadeada pela estimulação da GCs ou pela

interferência com a capacidade da molécula de adesão dos leucócitos CD11/CD18 para

formar uma ligação com a superfície celular endotelial ou ainda pela supressão da expressão

de CD11/CD18 nos leucócitos (Kubes, Suzuki e Granger, 1991).

73

Capítulo I___________________________________________________________________________

Ainda não está claro quando é que as acções reguladoras do NO na adesão dos PMN

às células endoteliais são directas ou são mediadas via modulação da reactividade de

intermediários como os mastócitos. O NO ao regular a adesão dos PMN contribui também

para a manutenção da integridade da barreira microvascular e pode actuar na diminuição da

inflamação, da permeabilidade vascular e na formação de edema (Gaboury e Kubes, 1995).

74


75

Capítulo I___________________________________________________________________________

O PAPEL DAS PLAQUETAS NA

FISIOPATOLOGIA DA HIPERTENSÃO

1. IntroduçãoDesde o final dos anos 70, que as plaquetas têm merecido uma atenção crescente nos

estudos relacionados com a hipertensão arterial. Tal deve-se a que, por um lado, as plaquetas

são um elemento de fácil e rápido acesso, que se encontra “equipado” com receptores para

variados tipos de substâncias e possui mecanismos de secreção e de recaptação, assim como

elementos contrácteis semelhantes aos das células musculares lisas vasculares. Estas

propriedades funcionais e bioquímicas, que se demonstrou estarem alteradas em tecidos

específicos e diferentes de animais hipertensos, muitas vezes inacessíveis, em especial no

homem, podem ser estudadas in vitro nas plaquetas obtidas a partir de uma simples amostra

de sangue.

Por outro lado, a função plaquetar é fundamental para manter a integridade anatómica

da parede vascular e para garantir a funcionalidade de todo um conjunto de reacções

químicas e de interacções celulares que asseguram a fisiologia dos vasos sanguíneos. Assim,

as plaquetas podem estar directamente implicadas na génese da hiperreactividade vascular

e/ou das alterações secundárias como a proliferação das células do músculo liso vascular,

devido ao seu potencial de crescimento, à produção de prostaglandinas e de NO e às

interacções plaquetas-endotélio-músculo liso vascular (Sixma, 1981). As plaquetas são

mediadores das complicações trombóticas, vectores do tónus vascular e promotores da

aterosclerose.

76


2. Estrutura das plaquetasAs plaquetas (figura 10) são produzidas pelos megacariócitos por invaginação da sua

membrana plasmática (Pennington, 1981) e possuem aproximadamente 3 mm de diâmetro.

Em condições normais circulam no sangue durante cerca de 10 dias e apresentam uma forma

discóide, achatada, não sendo aderentes entre elas ou ao endotélio.

A membrana plasmática das plaquetas é trilamelar, semelhante à de outras células,

coberta por uma capa amorfa (glicocálix) com 10 a 20 nm de espessura, sendo rica em

glicoproteínas, as quais formam a base do sistema de receptores para a activação (Hourani e

Cusak, 1991). A membrana plasmática invagina em determinados pontos de modo a formar

uma rede de canais tortuosos no citoplasma plaquetar. Este sistema de canais (sistema tubular

aberto) alarga significativamente a superfície membranar e serve como condutor para

substâncias recém formadas no citoplasma e para a extrusão de substâncias secretadas pelos

grânulos. A plaqueta possui um sistema tubular denso que é sugerido como sendo derivado

do retículo endoplasmático, sendo um local de armazenamento do cálcio (Skaer, Peters e

Emmines, 1974).

As plaquetas contêm bandas circulares com uma estrutura semelhante a cilindros

com a aparência dos microtúbulos encontrados nas outras células cuja principal função deve

ser, provavelmente, a de manter a alta assimetria de forma das plaquetas em circulação

(White, 1968). Além disso, possuem um sistema fibrilar contráctil que permite as alterações

da forma, a formação de pseudópodes e a contracção.

A matrix plaquetária é constituída por um sol/gel com conteúdo granular

diversificado e estes grânulos contêm um grande número de compostos que tornam as

plaquetas participantes activos em múltiplas reacções.

Nas plaquetas foram identificados três tipos de grânulos: densos, a e lisossomiais. Os

grânulos densos contêm elevadas concentrações de aminas biogénicas (sobretudo

serotonina), nucleótidos de adenosina (ATP e ADP) e cálcio. A libertação do conteúdo destes

grânulos pode afectar o tónus vascular assim como a capacidade de outras plaquetas em

formar trombos. Os grânulos a contêm essencialmente proteínas que podem influenciar a

função dos vasos sanguíneos e a cascata da coagulação como o factor plaquetar 4, o factor de

crescimento derivado das plaquetas e a b-tromboglobulina. Estes grânulos contêm

fibrinogénio, que é importante para a agregação plaquetar. Os grânulos lisossomais só

77

Capítulo I___________________________________________________________________________

libertam o seu conteúdo após as plaquetas serem estimuladas com agentes agregantes fortes

como a trombina ou elevadas concentrações de colagénio. Além destes três tipos de grânulos,

as plaquetas activadas podem libertar substâncias farmacologicamente activas, as quais são

essencialmente sintetizadas e não armazenadas, como as prostaglandinas, o TXA2 e o PAF

que afectam o tónus vascular e a permeabilidade e que activam outras plaquetas (Hourani e

Cusak, 1991).

As mitocôndrias são poucas e de estrutura simples. Existem também de forma

abundante no citoplasma, grânulos de glicogénio. A energia provém essencialmente da

glicólise (Holmsen, 1977).

As plaquetas não têm núcleo ou ADN e estruturas próximas de ribossomas raramente

são encontradas, no entanto existem pequenas quantidades de ARN, tendo já sido

demonstrada a síntese de proteínas (Weiss, 1975).

As plaquetas contém actina e miosina e podem ser consideradas como células

contrácteis (Salganicoff e Sevy, 1985; Yamakado e col., 1983).

Fig. 10. Representação esquemática da estrutura das plaquetas, onde se mostram os seus principais componentes morfológicos: G-grânulos; M–mitocôndrias; std– sistema tubular denso; SCO – sistema canicular aberto. Retirado de Morian et al. Blood Platelets, 1990.

78


3. FunçõesAs plaquetas sanguíneas têm manifestamente várias funções no nosso organismo,

sendo sem dúvida as melhor conhecidas as relativas à sua participação na homeostase e

trombose. De facto, as plaquetas desempenham um papel fundamental na homeostase, devido

à formação do tampão plaquetar que impede a hemorragia nos vasos lesados.

Contudo, elas também participam noutros processos sistémicos, como a reacção

inflamatória aguda ou crónica e as reacções imunes ou imunoalérgicas. Assim, são elementos

importantes em muitos processos fisiológicos e fisiopatológicos.

Em condições normais a activação das plaquetas encontra-se suprimida, e estas não

interagem com a superfície endotelial nem com as outras células sanguíneas. O endotélio e as

próprias plaquetas libertam mediadores que atenuam a resposta homeostática (Figura 13).

Existem três produtos endoteliais conhecidos que inibem a activação plaquetar: os

metabolitos da cicloxigenase e da lipoxigenase, a PGI2e o ácido 13-hidroxioctadecadienóico

(13-HODE), respectivamente; a ecto-nucleotidase ADP difosfohidrolase (ecto-ADPase) e o

NO (Buchanan e Brister, 1991; Moncada, 1982; Radomski, Palmer e Moncada, 1987b). A

PGI2 inibe a agregação plaquetar (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b) enquanto que o 13-

HODE regula a adesividade da parede vascular, modulando a expressão do receptor da

integrina (Buchanan e Brister, 1991). As ecto-nucleotidases metabolizam o ADP em AMP e

adenosina, o que resulta no decréscimo do recrutamento das plaquetas e da actividade do

agonista dinucleótido (Marcus e Safier, 1993). Em relação aos efeitos do NO, os quais se

encontram resumidos no Quadro 4, os estudos em humanos já demonstraram que o NO inibe

a agregação das plaquetas (Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991; Radomski, Palmer e

Moncada, 1987a), a ligação do fibrinogénio às plaquetas (Mendelsohn e col., 1990), a adesão

das plaquetas ao endotélio lesado (Radomski, Palmer e Moncada, 1987b; Sneddon e Vane,

1988) e a secreção dos grânulos densos das plaquetas (Broekman, Eiroa e Marcus, 1991;

Lieberman, O’Neill e Mendelsohn, 1991).

79

Capítulo I___________________________________________________________________________

Quadro 4 Efeitos do NO na função das plaquetas

__________________________________________Inibição daalteração da forma +mobilização do Ca2+ +adesão +libertação de PAI-1 ++agregação reversível ++agregação irreversível -libertação de TXA2 -__________________________________________ Adaptado de Body, 1996

Mas, quando as plaquetas são expostas a situações em que o vaso se encontra lesado, num sistema reologicamente activo, elas aderem às estruturas sub-endoteliais expostas e ficam activadas . O estímulo fundamental para a activação das plaquetas é a ligação de uma agonista (trombina, fibrina (ogéneo), colagénio, vWF, TXA2) ao receptor ligado à membrana

das plaquetas.

80


Fig. 11. Contribuição das plaquetas para a homeostase.Os componentes da membrana importantes, numa plaqueta não estimulada incluem: (R) receptor para

agonistas; complexo gpIa/IIa, receptor constitutivo para o colagénio; complexo membranar gpIb/IX, receptor constitutivo para o factor de von Willebrand da parede do vaso; receptor gpIIb/IIIa, receptor induzido induzido pelo agonista fibrinogénio e para o factor de von Willebrand. Os organelos citoplasmáticos importantes incluem os grânulos α, que contém muitas proteínas, incluindo o fibrinogénio, o factor de von Willebrand e a trombospondina e os grânulos densos, que contém pequenas moléculas, incluindo o ADP e Ca2+.

A adesão inicial à matrix subendotelial, como a que ocorre através da interacção do gpIa/IIa com o colagénio ou do gpIb/IX com o factor de von Willebrand não requerem uma activação prévia das plaquetas. A activação plaquetar pode ocorrer em resposta a estímulos de agonistas solúveis como o ADP ou a trombina, com os seus receptores de membrana (R) ou através do contacto das plaquetas com a matrix subendotelial. As principais respostas das plaquetas à activação são as apresentadas no desenho da plaqueta estimulada: a plaqueta transforma-se, de disco compacto numa esfera com longos pseudópodes, estendidos pela a matrix subendotelial. O TXA2 formado a partir do ácido araquidónico libertado dos fosfolípidos da membrana, difunde-se das plaquetas, liga-se a receptores da membrana e amplifica as reacções de activação das plaquetas. O gpIIb/IIIa transforma-se num receptor para o fibrinogénio (FG), fibronectina e para o factor de von Willebrand. Os grânulos α secretam fibrinogénio, o vWF e trombospondina (TSP), os quais medeiam e “reforçam” a adesão e a agregação plaquetar. Os grânulos densos secretam ADP e Ca2+, os quais “consolidam” a activação das plaquetas. Os fosfolípidos da membrana rearramjam-se e as vesículas da membrana largam-se, facilitando a formação de trombina e a formação de fibrina por “aceleração” da conversão do factor X da coagulação do plasma em Xa e de protrombina em trombina. (Adaptado de George e Shattil, 1991).

81

Capítulo I___________________________________________________________________________

As respostas plaquetares podem ser divididas em duas categorias: 1) respostas

reversíveis , as quais englobam a adesão, a alteração da forma e a agregação primária e 2)

respostas irreversíveis como a resposta de libertação e a agregação secundária. Parece existir

uma verdadeira “diferenciação” da resposta plaquetar, que depende em elevado grau da

concentração local dos agonistas. Uma concentração fraca pode provocar libertação e

secreção plaquetar com citotoxicidade para parasitas ou elementos celulares, enquanto que

concentrações mais elevadas são responsáveis pela agregação plaquetar (Tran, 1992).

Fig. 12. Metabolismo de activação e secreção plaquetária.

Os fenómenos de adesão e agregação plaquetária possuem base estrutural e

anatómica, identificada como a formação de ligações moleculares entre glicoproteínas da

membrana plaquetária e moléculas de adesão celular. As plaquetas aderem ao subendotélio

vascular, particularmente ao colagénio, fibronectina e laminina através da formação de

ligações moleculares. Para estas, o factor von Willebrand assume particular importância,

estabelecendo pontes entre o colagénio subendotelial e o complexo de glicoproteínas

82


plaquetárias Ib/IX/V. O factor vW tanto promove a adesão das plaquetas ao endotélio lesado,

como a agregação das plaquetas entre si, ligando-se ao complexo de glicoproteínas IIb/IIIa

(Janes e col., 1995).

A agregação das plaquetas entre si produz-se através da formação de pontes entre os

complexos de glicoproteínas membranares IIb/IIIa e as moléculas de fibrinogénio. Assim é

que a membrana das plaquetas possui um complexo sistema de reconhecimento de estruturas

adesivas que justifica esta sua função (Clemetson, 1995).

Mas, este sistema não é exclusivo das plaquetas, já que a maioria destas moléculas

são comuns a outros elementos celulares como os linfócitos, os granulócitos, os monócitos e

os macrófagos, determinando portanto uma similitude de funções entre estas células. As mais

importantes pertencem à família das integrinas, como o receptor do fibrinogénio, a integrina

alfa IIb/beta3, que simultaneamente fixa também a fibronectina, o factor vW e a vibronectina

(Shattil, 1995). A glicoproteína alfaV/beta3 também fixa, além de todas as anteriores, a

trombospondina e as glicoproteínas alfa2/beta1, o colagénio, a alfaV/beta a fibronectina e a

alfa6/beta1 a laminina.

Após a sua adesão inicial, as plaquetas apresentam um metabolismo de activação

muito complexo e importante. Através de complexos mecanismos bioquímicos, produz-se

um aumento da concentração intracelular de cálcio que leva à activação enzimática

necessária à degradação de fosfolípidos de membrana. O metabolismo subsequente é

responsável pela activação progressiva das plaquetas, com a formação de potentes agonistas

plaquetários, como os leucotrienos e as prostaglandinas. Da posterior degradação destas

últimas forma-se o ácido araquidónico, talvez o mais potente agonista plaquetário. A

activação metabólica plaquetária conduz subsequentemente à contracção das plaquetas, com

exocitose granular, modificação da forma e activação irreversível (Cerlettie e col., 1995).

As plaquetas também possuem a capacidade para se activarem mutuamente. De facto,

as suas membranas possuem receptores para os produtos do seu próprio metabolismo,

funcionando portanto a secreção plaquetária como uma actividade autócrina que permite a

amplificação de todo o processo. As plaquetas libertam assim o seu conteúdo granular

diversificado, apresentando também secreção parácrina que implica a activação de plaquetas

adjacentes (Furie e Furie, 1995).

83

Capítulo I___________________________________________________________________________

Existem várias vias bioquímicas e fisiológicas possíveis de autoactivação das

plaquetas, sendo as três vias mais estudadas: 1) libertação de ADP; 2) libertação de TXA2

formado por uma cascata dependente do ácido araquidónico e da actividade da cicloxigenase;

3) síntese do factor agregante das plaquetas (PAF). Cada uma destas vias gera compostos

que actuam como mediadores intercelulares para propagar a rápida activação de todas as

plaquetas. Pensa-se que o mecanismo de estimulação das vias endógenas ocorre através de

um “disparo” intracelular comum, possivelmente o cálcio.

Nas fases finais da homeostase, as plaquetas servem de superfície activadora para os

complexos enzimáticos da coagulação plasmática, nos complexos designados por “tenase”

(activação do factor X) e “protrombinase” (activação da protrombina).

A activação plaquetar é mediada pela interacção sinérgica de vias dependentes e

independentes do cálcio. No primeiro caso, o agonista estimulador das plaquetas leva à

elevação do cálcio livre citosólico [Ca]i. No caso da via independente do Ca2+, o agonista

estimulante leva à formação de 1,2-diacilglicerol (DAG), o activador endógeno da proteína

cinase C (Rink, Sanchez e Hallam, 1983). O aumento do [Ca]i e da formação de DAG resulta

de um processo comum de transdução pela activação do receptor : hidrólise dos fosfolípidos

de inositóis em fosfatidilinositóis (PtdIns), PtdIns 4-fosfato (PtdIns 4P) ou mais

provavelmente PtdIns 4,5-bifosfato (PtdIns 4,5P2) (Berridge, 1984). A hidrólise do PtdIns

4,5P2 catalisada pela fosfolipase C pode mobilizar o Ca2+ a partir dos locais de

armazenamento intracelular (O’Rourke e col., 1985).

84


Fig. 13. Mecanismo de activação das plaquetas.

IP3 → aumenta a libertação de Ca2+ a partir do sistema tubular denso das plaquetas; activação DAG → activa a proteína cinase C → fosforilação proteica → secreção de grânulos e expressão do receptor do fibrinogénio na membrana plaquetar. Fosfolipase A2 → quebra do ácido araquidónico a partir da membrana. No citosol este é metabolizado pela cicloxigenase e pela 12-lipooxigenase em PGH2 e depois em TxA2. DAG- diacilglicerol; G- proteína ligadora de nucleótido de guanina; PIP2- fosfatidilinositol 4,5- bifosfato; IP3- trifosfato de inositol; TxA2- tromboxano A2. (Adaptado de Body, 1996).

85

Capítulo I___________________________________________________________________________

4. A plaqueta como unidade de produção e

libertação de NOAs plaquetas não são apenas alvos do NO produzido nas células endoteliais

(Radomski, Palmer e Moncada, 1987a), nos neutrófilos (Salvemini e col., 1989) ou nas

células musculares lisas vasculares (Mollace e col., 1991), mas elas próprias também são

capazes de libertar NO durante a agregação induzida pelo colagénio, pela adenosina difosfato

e pelo ácido araquidónico (Lantoine e col., 1995; Malinski e col., 1993; Noris e col., 1993;

Radomski, Palmer e Moncada, 1990a). De facto, as plaquetas humanas também possuem

uma via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade e assim, as próprias plaquetas de

forma semelhante às células endoteliais produzem NO, se bem que em pequenas quantidades

(Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski, Palmer e Moncada, 1990b). Esta via

parece modular as respostas de agregação plaquetar e pode ser responsável, em parte, pela

limitação da auto-amplificação da formação de trombos plaquetares in vivo. Assim, a via da

L-arginina:NO supõe-se actuar como um mecanismo de retrocontrolo negativo intraplaquetar

que previne a activação e agregação excessiva.

Radomski e colaboradores (Radomski, Palmer e Moncada, 1990a; Radomski, Palmer

e Moncada, 1990b) foram os primeiros a descrever a existência da via da L-arginina:NO nas

plaquetas humanas. Eles foram capazes de demonstrar a libertação de NO a partir do citosol

das plaquetas (determinação espectofotométrica), a qual foi aumentada pela L-arginina e

inibida por inibidores específicos da NOS. A agregação induzida pelo colagénio foi

acompanhada por um aumento do GMPc intracelular e a L-arginina inibia a agregação

plaquetar e os níveis de GMPc.

Noris e col. (1993) confirmaram estes dados através de ensaios para medir a

conversão da L-arginina marcada em L-citrulina. Nos seus estudos também conseguiram

demonstrar a libertação de NO das plaquetas estimuladas com colagénio. De notar que sem

estimulação a libertação de NO não foi detectada.

Recorrendo ao uso de um microsensor porfirínico, Malinski e col. (1993) mediram

directamente o NO plaquetar libertado no sangue e em suspensões de plaquetas durante a

86


agregação induzida pelo colagénio, a qual foi bloqueada por um inibidor da NOS e

potenciada pela L-arginina. Mais uma vez, a libertação basal de NO não foi detectada.

Através de ensaios de detecção electroquímica do NO, Lantoine e col. (1995),

confirmaram estes resultados. Eles demonstraram a libertação de NO pelas plaquetas, mas

somente após a estimulação com colagénio, facto que era consistente com os dados

histológicos, que mostravam que uma NOS activa estará presente apenas nas plaquetas

activadas (Berkels e col., 1995).

Todos estes dados confirmam a presença de uma isoforma dependente do Ca2+ e

semelhante à NOSe.

Apenas os estudos de Zhou, Hellermann e Solomonson (1995) através de

determinações espectofotométricas, encontraram uma significativa libertação de NO nas

plaquetas em “repouso” e a estimulação com colagénio resultou num aumento da libertação

de NO, o que confirma os dados anteriormente descritos.

Chen e Mehta (1996), conseguiram induzir a actividade da NOSi nas plaquetas

através da incubação destas com citocinas. Parece um dado surpreendente já que as plaquetas

possuem uma capacidade reduzida para a biossíntese de proteínas. Mas, parece que a enzima

já existe nas plaquetas num estado inactivo e que, durante activação/agregação das plaquetas,

os níveis intracelulares de Ca2+ estão elevados (Kroll e Schafer, 1989), o que pode activar a

NOS das plaquetas, libertando assim quantidades significativas de NO, o qual deve actuar

como um mecanismo de retrocontrolo negativo para inibir a excessiva activação/agregação

das plaquetas.

Estes também demonstraram a presença quer de uma NOSe quer de uma NOSi nos

megacarioblastos (Lelchuk e col., 1992).

Os estudos de Chen e Mehta (1996) mostraram que as plaquetas humanas possuem

uma NOSe e o seu ARNm. Além disso, estes também descreveram a presença de uma NOSi

e do seu ARNm em plaquetas não estimuladas. Os estudos anteriores destes autores (Mehta e

col., 1995) relatam apenas uma actividade insignificante da NOSi nas plaquetas humanas

“em repouso”. Contudo, eles especulam sobre a existência da NOSi numa forma inactiva,

ligada a proteínas desconhecidas, formando um complexo de 200 kDa nas plaquetas “em

repouso”. Estas proteínas devem desempenhar um papel chave na activação da NOSi quando

as plaquetas são estimuladas, como foi descrito acerca da expressão da P-selectina na

superfície das plaquetas activadas (Modderman, Von Dem Borne e Sonnenberg, 1994).

87

Capítulo I___________________________________________________________________________

Contudo, o mecanismo envolvido na activação da NOSi pelo LPS ou pelas citocinas nas

plaquetas continua por identificar.

Um facto muito importante é que embora os estudos in vitro demonstrem que o NO

derivado do endotélio seja um inibidor da adesão e da agregação plaquetar em condições

estáticas (Furlong, Henderson e Lewis, 1987; Radomski, Palmer e Moncada, 1987b;), os

estudos ex vivo em humanos mostraram que o NO derivado do endotélio não é suficiente

para afectar o “funcionamento” das plaquetas em condições hemodinâmicas (Vallance,

Benjamin e Collier, 1992; Varela e col., 1992). Assim, é concebível que a NOSc nativa das

plaquetas deve desempenhar um papel fundamental na regulação das plaquetas in vivo, pelo

qual pequenas quantidades de NO previnem a deposição das plaquetas nos vasos sanguíneos

das pessoas saudáveis. A segunda forma da NO sintase deve ser relevante em estados

patológicos como no choque séptico quando o LPS e as citocinas podem induzir a expressão

da NO sintase nas plaquetas para “contrariar” os efeitos hemodinâmicos deletórios da

invasão bacteriana, ou na trombose e na aterosclerose nas quais as plaquetas estimuladas

pelas citocinas podem produzir grande quantidade de aniões superóxido e possivelmente

perpetuar a cascata de eventos que levam à trombose (Metha, Chen e Metha, 1995).

Assim, parece que enquanto que a libertação constitutiva de NO deve ter um papel

fisiológico importante, as grandes quantidades de NO libertado em resposta a estímulos

inflamatórios devem ser citotóxicas. A NOSi das plaquetas também deve desempenhar um

importante papel nos estados patológicos como a trombose e a aterosclerose.

Já existem dados que suportam o facto de que, em certas condições patológicas, a

síntese de NO das plaquetas está aumentada.

Já foi demonstrado existirem isoformas da NO sintase nas plaquetas humanas

(Muruganandam e Mutus, 1994). A análise por RT PCR confirmou a expressão do ARNm

codificante das isoformas da sintase do NO endotelial e indutível, mas não da neuronial nas

plaquetas (Mehta e col., 1995). Uma isoforma “like” a NOSe já foi isolada das plaquetas e

parece requerer co-factores similares aos da própria NOSe. O peso molecular desta NOS

expressa de forma constitutiva é de 80-kDa em contraste com os 130-kDa da proteína

existente nas células endoteliais. Uma isoforma da NOS homóloga com a NOSi também já

foi caracterizada nas plaquetas assim como, o seu ARNm nas plaquetas não estimuladas. A

NOSi das plaquetas exibe características cinéticas e um peso molecular diferente das NOSi

de outras células (Chen e Mehta, 1995).

88


Uma vez que as plaquetas são anucleadas, com uma pool mínima de ARNm (Djaffar

e col., 1991), só sendo capazes de sintetizar quantidades modestas de proteínas, a maior parte

das proteínas plaquetares derivam da sua célula percursora, o megacariócito. Já foram

identificadas nos megacariócitos humanos as formas indutível e constitutiva da sintase do

NO (Lelchuk e col., 1992). Assim, o “limitado” ARNm para a NOSi, é provavelmente capaz

de sintetizar NOSi rapidamente, facto consistente com a natureza activa das plaquetas.

O mecanismo que controla a produção de NO nas plaquetas não é ainda conhecido.

Já foi demonstrado que a L-arginina inibe a agregação plaquetar quer in vitro quer

in vivo e também já foi demonstrado que o movimento da L-arginina para dentro das

plaquetas se processa através de um sistema de transporte simples, saturável e

independente do sódio (Vasta e col., 1995).

O mecanismo pelo qual o NO inibe a função das plaquetas é complexo e não está

completamente esclarecido. No entanto, estudos demonstraram que o NO se liga ao grupo

heme da guanilciclase solúvel das plaquetas, o que leva a um aumento significativo da

concentração de GMPc. Este aumento do GMPc é acompanhado pela inibição da activação

das plaquetas (Mellion, Ignarro e Ohlstein, 1981; Mendelsohn e col., 1990) e os picos de

concentração do GMPc estão bem correlacionados com a extensão da inibição plaquetar in

vitro (Mendelsohn e col., 1990). Os dados disponíveis suportam o facto de que o GMPc

activa a proteína cinase (“proteína cinase dependente do GMPc”) que fosforila as cinases das

cadeias leves de miosina, o que, por sua vez, regula a actividade da ATPase actina-miosina

(Hathaway, Konicki e Coolican, 1985). A fosforilação da cinase das cadeias leves de miosina

reduz a sua afinidade para o complexo Ca2+/calmodulina o que resulta na diminuição da

fosforilação das cadeias leves de miosina, estabilizando a forma inactiva da miosina (Ikebe e

Reardon, 1990). A activação da proteína cinase dependente do GMPc pode também levar à

fosforilação dos transportadores de cálcio, o que resulta na diminuição da concentração de

cálcio intracelular (Ignarro e Kadowitz, 1985). A diminuição das concentrações intracelulares

de cálcio estão associadas à alteração de conformação da integrina das plaquetas, a

glicoproteína IIb/IIIa, para um estado que não se liga ao fibrinogénio (Mendelsohn e col.,

1990). Além disso, o GMPc induzido pelo NO inibe a translocação da P-selectina a partir dos

grânulos plaquetares para a membrana plasmática, diminuindo a formação de agregados

plaquetas-leucócitos (Kurose e col., 1993; Moro e col., 1993). Todos estes mecanismos

reduzem as respostas de activação e de agregação das plaquetas. Assim, uma acção

89

Capítulo I___________________________________________________________________________

concertada das NOS endotelial e plaquetar regula a activação das plaquetas, causando

inibição da adesão e agregação plaquetar e a indução da desagregação.

Os efeitos inibitórios do NO nas plaquetas também podem influenciar a reactividade

plaquetar através de um mecanismo independente do GMPc, como: a) inibição da

fosfodiesterase do AMPc de baixo Km (Maurice e Haslam, 1990); b) inibição da

desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (Dimmeler, Lottspeich e Brune, 1992; Molina y

Vedia e col., 1992; Zhang e Snyder, 1992); c) ribosilação do ADP (Brune e Lapetina, 1989) e

d) um aumento do Ca2+i independente da GCs (Ivanova e col., 1993; Menshikov e col.,

1993).

90


91

Capítulo I___________________________________________________________________________

A CICLOSPORINA A

1. IntroduçãoA ciclosporina A (Figura 14) é um agente imunosupressor derivado de um

metabolito do fungo Cylindrocarpon lucidum Booth e Tolypocladium inflatum Gams.

Trata-se de uma substância apolar, lipofílica, com características polipeptídicas cíclicas,

constituída por 11 aminoácidos (Kahan, 1989). A sua característica farmacológica principal

é a actividade imunosupressora (Borel e col., 1976; Borel e col., 1977).

Fig. 14 – Fórmula estrutural da ciclosporina onde se representam os 11 resíduos de aminoácidos. Adaptado de Kahan, 1989

92


A CsA (Calne e col., 1978), tem sido extensivamente utilizada desde 1978, sendo o

fármaco de 1ª escolha, só ou em associação com outras terapêuticas, como agente

imunossupressor, aumentando a sobrevivência após o transplante de orgãos e é

indubitavelmente benéfica no tratamento, se bem que em doses mais baixas, de variadas

doenças autoimunes (Feutren, 1992). Sabe-se que apresenta um grande número de potenciais

efeitos secundários, alguns destes como consequência da diminuição das defesas do doente.

Entre estes, encontram-se alguns que podem contribuir para o processo aterogénico,

incluindo a hipertensão arterial e a hipercolesterolémia.

2. Propriedades farmacodinâmicas Mecanismo de acção

O mecanismo exacto da actividade imunosupressora da ciclosporina não está

completamente esclarecido, mas parece estar intimamente relacionado com a inibição da

função e proliferação linfocitária. A CsA actua de modo específico e reversível nos linfócitos

(em especial nas células T-Helper), produzindo a supressão selectiva da imunidade mediada

por estas células. A produção de IL-2 pelas células T é um passo fundamental na evolução da

resposta imune, já que esta é necessária para a activação e para a expressão clonal das células

T-Helper e T-Citotóxicas e para a maturação de outros tipos de células. Assim, a inibição da

expressão da IL-2 pela CsA reduz a formação de uma série de citocinas, produzindo efeitos

indirectos em outras células envolvidas na resposta imune (Faulds, Goa e Benfield, 1993).

Tem sido sugerido como explicação que o mecanismo de acção se baseia na inibição

específica e reversível das células T imunocompetentes (linfócitos-T) na fase G0 ou G1 do

ciclo celular (Borel e col., 1977).

As propriedades imunomoduladoras da CsA estão dependentes de uma acção

específica para inibir os estados iniciais de activação das células T, resultando na inibição

da produção de citocinas (Foxwell e col., 1990; Furue, Katz e Kawakami, 1990; Granelli-

Piperno, Andrus e Steinman, 1986; Reems, Cook e Palladino, 1983).

93

Capítulo I___________________________________________________________________________

A CsA atravessa as membranas, sendo biologicamente inerte até se ligar ao seu

receptor citoplasmático, a ciclofilina , que é uma proteína intracelular específica, inibindo a

sua actividade peptidil-prolina cis-trans isomerase (rotamase) e formando um complexo

tóxico ciclosporina-ciclofilina (Handschumacker et al. 1984; Takahashi, Mayano e Suzuki,

1989; Walsh, Zydowsky e McKeon, 1992). O alvo celular deste complexo é uma enzima

citosólica, a calcineurina.

A calcineurina é um complexo heterodimérico composto de uma subunidade

catalítica e de uma subunidade reguladora B, que possui actividade enzimática fosfatase

serina/treonina dependente do complexo Ca2+-calmodulina (Klee, Crouch e Krinks, 1979;

Klee, Draetta e Hubbard, 1988), a qual é inibida pelo complexo CsA-ciclofilina (Clipstone

e Crabtree, 1992; Liu e col., 1992; Liu e col., 1991; O'Keefe e col., 1991; Swanson e col.,

1992). O efeito funcional da inibição da actividade da calcineurina pela CsA é a

interrupção de uma via de sinalização dependente do cálcio, responsável pelo transporte

celular da subunidade citoplasmática de um factor de transcrição nas células T, o factor

nuclear das células T activadas (NF-AT), o qual é necessário para a expressão dos genes

induzidos por antigénios. Na ausência da CsA, a calcineurina desfosforila o NF-AT,

levando à sua translocação para o núcleo celular. O resultado destes efeitos da CsA nos

linfócitos é o bloqueio da transcrição da fase G0 à G1 do ciclo celular (activação) e a

inibição da expressão do ARNm que codifica a síntese de diversas proteínas. Desconhece-

se se existe um mecanismo semelhante no tecido vascular, já que as vias de transmissão de

sinal da CsA estão por caracterizar nas células endoteliais e nas células do músculo liso

vascular.

Nas células T, os substratos relevantes para a calcineurina são os factores

transcripcionais fosforilados no gene para a IL-2. A inibição da calcineurina desempenha um

papel chave na prevenção da activação das células T (ou seja da rejeição do enxerto) por

impedir a desfosforilação destes factores transcripcionais (Clipstone e Crabtree, 1992; Liu e

col., 1991; Liu e col., 1992; O,Keefe e col., 1991). Embora a inibição da produção da IL-2

seja a melhor descrita, também ocorre inibição na produção de IL-3, IL-4, factor de necrose

tumoral a (TNFa), IF-g e factor de estimulação da colónia granulócito-macrófago (Mueller e

col., 1994).

A calcineurina também medeia os efeitos da CsA nos eventos imunes pós-

transcricionais incluindo a libertação exocitária de histamina dos mastócitos e das citocinas

94


pelas células T citotóxicas (Dutz e col., 1993; Hultsch e col., 1991; Trenn e col., 1989;

Triggioni e col., 1989).

Tendo por base o seu mecanismo de acção, parece lógico que a CsA deve ser mais

efectiva quando administrada num estado precoce, idealmente antes ter sido estabelecida uma

resposta das células T.

Fig. 15. Representação esquemática dos principais passos do mecanismo responsável pelo efeito imunossupressor da ciclosporina. A ligação citoplasmática da ciclosporina (CsA) à ciclofilina (CyP) inibe uma enzima dependente de Ca2+ e calmodulina (CaM), a calcineurina, o que impede a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e de outras citocinas necessárias à activação das células T. A redução drástica do número de células T activadas explica a sua acção imunossupressora (Reis, tese de mestrado 1999).

95

Capítulo I___________________________________________________________________________

3. Propriedades farmacocinéticas

3.1. Absorção

Relativamente à administração por via oral, a absorção da CsA produz-se,

principalmente, no intestino delgado, a nível do duodeno e do jejuno (Drewe, Beglinger e

Kissel, 1992), de forma rápida e incompleta. A biodisponibilidade absoluta da CsA situa-se

nos 30% e deve-se a factores como a existência de um processo metabólico pré-sistémico,

que engloba as isoenzimas do citocromo P-450 do tracto gastrintestinal; a presença de

bactérias no mesmo; os transportadores de membrana dependentes de ATP (como a

glicoproteína P) presentes nos enterócitos e a existência do efeito de primeira passagem

hepático.

A presença simultânea destes factores no tracto gastrintestinal e a sua diferente

importância qualitativa e quantitativa no processo de absorção, condiciona a elevada

variabilidade da biodisponibilidade da CsA.

Entre os factores mencionados, a expressão da glicoproteína P na membrana dos

enterócitos parece ser o principal determinante da biodisponibilidade da CsA e da sua

variabilidade, já que actua como uma “bomba” que expele o fármaco, impedindo a entrada de

substâncias estranhas na circulação sistémica (entre elas a CsA), mediante o transporte de

moléculas lipofílicas desde o interior do enterócito até ao lúmen intestinal.

Brynskov e col. (1992) concluíram que a absorção da CsA era bem descrita por uma

cinética de ordem zero (independente da dose), o que também indica que o tempo do trânsito

intestinal é o factor que mais influencia a absorção.

A absorção ocorre através de um processo de difusão não saturável (Ueda e col.,

1983).

3.2. Distribuição

A CsA possui um elevado volume aparente de distribuição, como consequência da

sua ampla dispersão a diversos orgãos e tecidos (Kahan e Grevel, 1988).

96


A CsA distribui-se, principalmente, ao fígado, mas também a tecidos adiposos,

sangue, coração, pulmões e pâncreas. Nestes tecidos e, fundamentalmente em orgão ricos

em leucócitos, as concentrações alcançadas são mais altas que as obtidas no sangue.

O fármaco permanece nos tecidos durante um considerável período de tempo após ter

sido interrompida a terapêutica (Holt e col., 1994).

A CsA passa rapidamente para a linfa, originando concentrações situadas entre 40 a

60% das encontradas no sangue (Fahr, 1993).

No sangue, 58% da CsA circulante está unida aos eritrócitos, 4% aos granulócitos,

5% aos linfócitos e os restantes 33% encontram-se no plasma, 98% dos quais unidos a

proteínas plasmáticas (85-90% a lipoproteínas e 5-15% a outras proteínas plasmáticas)

(Faulds, Goa e Benfield, 1993).

A maior percentagem de união da CsA às lipoproteínas plasmáticas produz-se na

fracção HDL (43-57%) e LDL (25%) (Gurecki, Warty e Sanghui, 1985). Segundo alguns

autores as LDL actuam como transportadores da CsA e facilitam a entrada do fármaco no

interior das células.

A união da CsA a eritrócitos é saturável e, para além disso, depende da temperatura e

do hematócrito. Assim, uma diminuição da temperatura e/ou um aumento do hematócrito

supõem um aumento da fracção da CsA unida aos eritrócitos. Por outro lado, a fracção da

CsA unida às lipoproteínas aumenta quando se eleva a temperatura e é dependente da

concentração no sangue total. Logo, quando a concentração no sangue da CsA num estado

estacionário aumenta, a fracção livre também se incrementa e condiciona a resposta clínica

dos pacientes.

3.3. Metabolismo e excreção

A principal via de eliminação da CsA é a metabolização nos microssomas hepáticos,

catalizada pelas isoenzimas da família 3A4 do sistema enzimático citocromo P450

(CYP3A4). A biotransformação hepática da CsA, principalmente mediante reacções de

hidroxilação, oxidação e/ou N-desmetilação, origina um grande número de metabolitos, os

quais mantêm a estrutura oligopéptida da CsA intacta e se distinguem pela posição do

aminoácido transformado (Combalert e col., 1989; Gonzalez, 1992; Kronbach, Fischer e

97

Capítulo I___________________________________________________________________________

Meyer, 1988). Todos os outros fármacos metabolizados por este sistema podem

potencialmente interferir com o metabolismo da CsA.

Até ao momento, foram identificados mais de 30 metabolitos na bílis, nas fezes, no

sangue e na urina. Destacam-se, pela sua concentração sanguínea, o M1 (oxidação em

posição 1 beta [8`]), o M4N (derivado 4-N-desmetilado), o M9 (oxidação em posição 1 beta,

9 gama) (Bertault-Peres e col., 1987). Num estado estacionário, a concentração no sangue do

metabolito M1 e a sua área abaixo da curva pode exceder a do fármaco original; para além

disso, é o composto mais activo, com 10 a 20% de actividade in vitro de CsA. Todavia, não

existem conclusões definitivas sobre a contribuição destes metabolitos na efectividade e na

nefrotoxicidade do tratamento com CsA, pelo que a relevância clínica da sua monitorização

não foi estabelecida (Fahr, Hiestand e Ryffel, 1990).

Existem evidências directas e indirectas de um significativo metabolismo pré-

hepático da CsA após a administração oral pelas isoenzimas do citocromo CYP3A nas

membranas intestinais (Hoppu e col., 1991; Kolars e col., 1991).

O metabolismo da CsA pode ser afectado pelo estado clínico ou pela idade do doente,

pela disfunção concomitante do fígado, ou pela interacção de fármacos com as enzimas

responsáveis pela oxidação da CsA.

A excreção biliar é a via maioritária dos metabolitos da CsA, uma vez que a sua

concentração na bílis é maior que a concentração total no sangue. O fármaco inalterado é

eliminado por esta via numa percentagem inferior a 1%.

Em alguns pacientes existem evidências de circulação entero-hepática, tanto da CsA

como dos seus metabolitos. Por outro lado, a eliminação renal da CsA é de escassa

importância (Maurer e Lemaire, 1986; Venkaratamanan e col., 1985).

A monitorização da CsA tem sido fundamental para se assegurar uma eficácia

imunossupressiva sem efeitos adversos, fazer a distinção entre um processo de rejeição e a

toxicidade induzida pelo fármaco e detectar as interacções de fármacos não esperadas e que

afectam a concentração desta. Além disso, é necessária uma monitorização rotineira dos

níveis sanguíneos de ciclosporina e os resultados obtidos servirão de orientação para se

individualizar o regime posológico com o objectivo de se atingirem as concentrações

necessárias.

98


Adicionalmente, devem ser também monitorizados os parâmetros clínicos de

segurança tais como a creatinina sérica e a pressão sanguínea e as concentrações sanguíneas

de CsA, as quais são apenas um dos factores que contribuem para o estado clínico do doente,

não devem ser interpretadas isoladamente dos dados clínicos. Assim, os resultados deverão

servir unicamente como orientação da dosagem terapêutica no contexto de outros parâmetros

clínicos e laboratoriais.

4. Efeitos secundáriosTêm sido relatados variados tipos de reacções adversas. Mas os efeitos secundários

mais importantes da CsA incluem a hepatotoxicidade (Loertscher e col., 1983), as

complicações cardiovasculares como a hipertensão arterial (Bellet e col., 1985; Cohen e col.,

1984; Hamilton e col., 1982; Myers e col., 1988; Thompson e col., 1983), a nefrotoxicidade

(Cohen e col., 1984; Myers e col., 1988; Shulman e col., 1981) e os eventos

tromboembólicos incluindo a microangioplastia trombótica (Neild e col., 1985; Sommer e

col., 1985; Vanrenterghem e col., 1985).

Já foi sugerido que a elevação da pressão arterial sanguínea pela CsA é secundária à

vasoconstrição renal e à anti-natriurese, resultando na expansão do volume dos fluidos

extracelulares e numa forma de hipertensão dependente do sódio (Curtis e col., 1988).

Contudo, o aumento da pressão arterial precede qualquer alteração da função renal, o que

serve de argumento contra este factor como mecanismo único. Alternativamente, é possível

que a CsA exerça os seus efeitos vasculares ao alterar a reactividade e/ou a síntese de

substâncias vasoactivas endógenas.

Mas, o mecanismo ou mecanismos destes efeitos não estão ainda estabelecidos

(Óskarsson, Hofmeyer e Olivari, 1997). De facto, têm sido implicados mecanismos renais,

vasculares e neuroniais e estes não são mutuamente exclusivos. Além disso, a importância

relativa de cada um deles ou de todos ainda não está esclarecida e o desvendar dos

mecanismos moleculares subjacentes, nestes diferentes tecidos alvo “ainda agora começou”.

99

Capítulo I___________________________________________________________________________

4.1. A ciclosporina como agente indutor de

hipertensão arterial

Os eventos cardiovasculares são a principal causa de mortalidade recente após um

transplante renal ou cardíaco (Ballentyne e col., 1998; Kasiske e col., 1996; Whitworth,

1992). Assim, o tratamento dos factores de risco cardiovasculares coexistentes, como a

hipertensão, é provavelmente um elemento importante e definitivamente determinante do

resultado após o transplante de orgãos.

Está estabelecido que a CsA é uma importante causa iatrogénica de hipertensão

arterial no homem (Bellet e col., 1985). A hipertensão pode desenvolver-se em poucas

semanas em 10-80% dos doentes, dependendo da dose e da duração de exposição ao

fármaco, da terapia concomitante e da situação clínica para a qual foi utilizada a CsA.

Mas os efeitos, embora dependentes da dose utilizada, apresentam uma grande

heterogeneidade entre os diversos indivíduos e uma insuficiente correlação com os níveis

plasmáticos de CsA em relação aos quais se manifestam (Myers, 1986), e esta pode

manifestar-se de uma forma aguda ou crónica.

É difícil fazer uma estimativa da incidência de hipertensão arterial em doentes

tratados com a CsA. Contudo, a hipertensão tem sido relatada tanto em transplantados

(Barrett e col., 1982; Hamilton e col., 1982; Hunt, 1983; Thompson e col., 1983) como em

não transplantados (Berg e col., 1986; Palestine e col., 1986) que tomam o fármaco.

A CsA emergiu assim como uma nova causa de hipertensão arterial e têm sido

descritos dois síndromas: a) elevações agudas da pressão arterial durante o início do

tratamento com a CsA; b) elevações crónicas da pressão arterial durante a administração a

longo prazo. Qualquer dos casos requer tratamento com terapêutica anti-hipertensora

múltipla.

A taxa de incidência da hipertensão clínica, antes e após a introdução da CsA,

encontra-se sumariada na Quadro 5.

100


Quadro 5. Incidência de hipertensão arterial antes e após a administração de CsA

Indicação Hipertensão arterial (%)

Antes da CsA Após a CsA

Transplante:medula óssea 5-10 33-60coração 10 71-100fígado NA 65-85rim 45-55 67-86Não transplante:artrite reumatóide NA 42-45uveíte NA 23-29miastenia grave NA 81psoríase NA 30

NA – Não aplicável. Adaptado de Taler e col., 1999.

Embora a nefrotoxicidade provocada pela CsA possa estar subjacente ao

desenvolvimento da hipertensão arterial, o aparecimento precoce da hipertensão leva a crer

na existência de um mecanismo vascular eventualmente comum ao aparecimento da

hipertensão arterial e da nefrotoxicidade, mas inicialmente independente das lesões renais.

Ambas as condições reflectem vasoconstrição e têm sido consideradas diferentes facetas de

um só problema (Textor e col., 1994). Variados estudos apresentam diferentes dados, os

quais suportam várias causas possíveis para a hipertensão, contudo até agora nenhum

clarificou realmente o ou os mecanismos. Como resultado, o tratamento efectivo da

hipertensão induzida pela CsA permanece empírico.

101

Capítulo I___________________________________________________________________________

4.2. A influência da ciclosporina na

reactividade vascular

Numa revisão dos trabalhos de investigação sobre os prováveis mecanismos

responsáveis pela alteração da reactividade vascular induzida pela ciclosporina, verifica-se

que a literatura existente é muito inconsistente devido aos muitos resultados contraditórios

obtidos, se bem que tanto nos animais como no homem se verifica um aumento da resistência

vascular renal e da resistência periférica total. No entanto, podem salientar-se algumas das

alterações descritas na literatura:

O uso crónico de CsA pode interferir com a vasoregulação local ao alterar tanto a

função do endotélio como do músculo liso.

Quando se administra a CsA podemos verificar: aumento (Bartholomeusz e col.,

1996; Gerkens, 1989; Hansen e col., 1997; Hansen e col., 1999; Lusting e col., 1989; Moss,

Powell e Falk, 1985; Oriji, 1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999; Rego e col.,

1991; Roullet e col., 1994; Takeda e col., 1992; Tonnesen, Hamner e Weinmann, 1983;

Vaziri e col., 1998), diminuição (Murray, Paller e Ferris, 1985) ou mesmo uma ausência de

efeitos desta ao nível da pressão arterial (Garr e Paller, 1990; Kaskel e col., 1987; Textor,

Smith-Powell e Telles, 1990). Não obstante, os estudos mais recentes acerca do assunto

descrevem, praticamente todos, o aumento da pressão arterial induzida pelo tratamento com a

CsA.

Contudo, os estudos tanto in vitro como in vivo têm descrito de forma consistente que

a CsA exerce um potente acção na vasculatura ao alterar a reactividade desta. Assim tem sido

descrita uma significativa potenciação da vasoconstrição (Hertel e Bossaller, 1989; Lamb e

Weeb, 1987; Rego e col., 1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991; Rossi e col., 1989) e

uma marcada atenuação da vasodilatação (Bossaller e col., 1989; Huang e col., 1987; Rego e

col., 1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991) o que pode fornecer uma explicação para o

aumento da resistência vascular observada durante o tratamento com a CsA em humanos

(Curtis e col., 1986; Greenberg e col., 1985; Scherrer e col., 1990), nos roedores (Kaskel e

col., 1987; Murray, Paller e Ferris, 1985) e noutros animais (Whitworth e col., 1987). Outra

implicação destas observações é de que a hipertensão induzida pela CsA pode resultar de

uma sensibilidade vascular alterada às substâncias vasoconstritoras e/ou vasodilatadoras.

102


Além disso, a alteração da sensibilidade vascular pode ser devida não só a alterações

funcionais mas também a alterações morfológicas induzidas pela CsA.

Outro facto consistente é o de que a ciclosporina enfraquece o relaxamento vascular

dependente do endotélio (Balligand e Godfraind, 1991; Bossaller e col., 1989; Chan e col.,

1992; Diederich e col., 1994; Dinh e col., 1990; Dudhir e col., 1994; Gallego e col., 1994;

Gerkens, 1989; Rego e col., 1990a; Roullet e col., 1994; Stephan e col., 1995; Yaris, Tuner e

Ilhan, 1992). De facto, os anéis aórticos tanto os pré-incubados (Rego e col., 1990b) como os

isolados de animais tratados com o fármaco (Mikkelsen e col., 1992; Rego e col., 1988; Rego

e col., 1990b), as arteríolas de resistência subcutâneas humanas alteradas in vitro pela CsA

(Richards Poston e Hilton, 1989), os leitos vasculares mesentéricos perfundidos com a CsA

(Rego e col., 1990a) e aos animais aos quais foi administrada a CsA (Gallego e col., 1993)

todos exibem uma resposta enfraquecida à acetilcolina. Os microvasos renais de ratos

tratados com a CsA também apresentam uma resposta vasodilatadora à acetilcolina mais

atenuada (Takenaka, Hashimoto e Epstein, 1992).

Quanto ao impacto adverso da CsA no músculo liso arterial e no relaxamento

independente do endotélio, os dados são por vezes contraditórios. Variados estudos in vitro e

ex vivo utilizando grandes vasos ou preparações de leitos arteriais mesentéricos descrevem

um efeito atenuado pela acção da CsA no relaxamento suscitado pelo nitroprussiato de sódio

(Bossaller e col., 1989; Gerkens, 1989; Huang e col., 1987; Luscher, Weber e Buhler, 1988;

Rego e col., 1988; Rego e col., 1990a; Rego e col., 1991; Roullet e col., 1994; Yang e col.,

1989). Pelo contrário, outros estudos in vitro (O,Neil e col., 1991; Schrör e col., 1989) e ex

vivo (Richards, Poston e Hilton, 1989) as respostas de vasodilatadores que actuavam através

de mecanismos independentes do endotélio não apresentavam qualquer alteração. Mais, nos

estudos de Richards, Poston e Hilton (1989) a resposta ao nitroprussiato de sódio encontrava-

se aumentada nos vasos de resistência humanos incubados com CsA.

O mecanismo molecular de acção do fármaco ainda não foi esclarecido, contudo,

variadas linhas de investigação sugerem que um provável alvo intracelular é a via metabólica

do NO, incluindo o sistema de formação do NO no endotélio e o sistema efector do NO nas

células musculares lisas. Nos estudos de Solagni e col. (1990) em ratos espontaneamente

hipertensos e de Gallego e col. (1993) em ratos normotensos, a administração de L-arginina,

103

Capítulo I___________________________________________________________________________

o substrato natural para a síntese de NO, apresentava um efeito protector contra a hipertensão

induzida pela CsA. Amore e col. (1995) também relataram que a administração de L-arginina

exerce um efeito protector contra a vasoconstrição renal induzida pela CsA nos ratos. Assim,

uma capacidade diminuída da vasculatura em produzir e/ou responder aos vasodilatadores

pode favorecer a vasoconstrição. Em alguns estudos nos quais foram utilizados o azul de

metileno, um dador de superóxidos, os quais inactivam os factores de relaxamento

dependentes do endotélio, este não apresentava qualquer efeito na vasodilatação induzida

pela acetilcolina nos vasos de resistência previamente incubados com CsA, facto que é

consistente com os relatos que sugerem que o sistema de formação do NO se encontra

enfraquecido pela acção da CsA. Noutros estudos, também se verifica que o sistema efector

do NO no músculo liso, testado por exemplo com o dador de NO, nitroprussiato de sódio,

também se encontra alterado pela CsA, se bem que em menor grau. A enzima sintase do NO

é um substrato da calcineurina in vitro (Dawson e col., 1993), sugerindo um potencial

mecanismo para explicar um efeito inibitório da CsA na vasodilatação induzida pelo NO.

Contudo, os dados ainda são conflituosos em relação a quando é que a desfosforilação

mediada pela calcineurina aumenta ou diminui a actividade da sintase do NO (Busse,

Luckhoff e Mülsch, 1991; Förstermann e col., 1991; Marumo e col., 1995; Mittal e Jadhau,

1994).

Os estudos prévios de Rego e col. (1990a) mostraram uma diminuição do conteúdo de

GMPc na aorta de ratos tratados com CsA e uma diminuição da produção de GMPc pelos

grandes vasos “estimulados” in vitro pelo fármaco, sugere que a CsA pode enfraquecer o

relaxamento independente do endotélio dos vasos de resistência ao interferir com a via do

GMPc. Assim, na hipertensão induzida pela CsA a diminuição das respostas relaxantes

parece estar também associada à diminuição dos conteúdos de GMPc no músculo liso

vascular.

O efeito da CsA na libertação do vasodilatador eicosanóide, PGI2 a partir de

diferentes tipos de células vasculares é contraditório. Têm sido relatados tanto efeitos

inibitórios (Bossaller e col., 1989; Brown e Neild, 1987; Brown, Neild e Lewis, 1990; Fan e

Lewis, 1985; Neild e col., 1983) como efeitos estimulantes (Landolfi e Steiner, 1984; Lau e

Wong, 1987; Oriji e Keiser, 1998).

104


A CsA causa um aumento no tónus simpático (Golub e col., 1989; Morgan e col.,

1991; Scherrer e col., 1990). Pelo contrário, Rego e col. (1991) e Gerkens (1989) afirmam ser

pouco provável que os efeitos provocados pela CsA sejam devidos à libertação endógena de

catecolaminas e à possível activação directa dos adrenoreceptores a pela ciclosporina. Além

disso a CsA aumenta as respostas vasculares aos vasoconstritores como a fenilefrina, a

noradrenalina e a angiotensina II (Bossaller e col., 1989; Cartier e col., 1994; Rego e col.,

1988; Rego e col., 1990b; Rego e col., 1991; Schwelk e col., 1993). No entanto, também em

relação à sensibilidade vascular outros estudos obtiveram resultados opostos, ou seja, uma

resposta atenuada a algumas destas substâncias vasoconstritoras (Garr e Paller, 1990; Roullet

e col., 1994; Textor, Smith-Powell e Telles, 1990).

A CsA aumenta a produção de tromboxano A2 (Benigni e col., 1988; Jorkasky e col.,

1989; Kawaguchi e col., 1985) e de endotelina (Bunchman e Brookshire, 1991; Grieff e col.,

1993; Haug e col., 1995), os quais são ambos potentes vasoconstritores. A endotelina, o

peptídeo vasoconstritor endógeno mais potente (Yanagisawa e col., 1988), também tem sido

sugerida como mediadora da vasoconstrição e da hipertensão induzida pela CsA. Verificou-

se que: 1) a hipoperfusão glomerular induzida pela CsA está associada a um marcado

aumento na ET urinária (Perico e col., 1992) e em alguns casos na ET plasmática (Textor e

col., 1992); 2) as concentrações de endotelina no plasma e na urina encontram-se

aumentadas em doentes com transplante hepático ou cardíaco (Grieff e col., 1993; Textor e

col., 1995); 3) a CsA estimula a produção de ET em variados tipos de células, renais e não

renais (Bunchman e Brookshire, 1991), como se verifica in vivo no rato (Takeda e col., 1992)

e nas células endoteliais de cultura humanas (Bunchman, Mauer e Kim, 1990) e de ratos

(Takeda e col., 1993) e 4) a hipoperfusão/filtração glomerular e a proliferação celular

exagerada relacionada com a CsA pode ser melhorada por agentes que bloqueiam as acções

da ET, como os anticorpos anti-ET (Kon e col., 1990) ou os antagonistas selectivos da ET

(Fogo e col., 1992). De facto, o antagonismo agudo ou crónico dos receptores da ET baixa a

pressão sanguínea de animais com hipertensão induzida pela CsA (Bartholomeusz e col.,

1996; Phillips e col., 1994). Todos estes resultados são consistentes com o facto de que o

aumento da produção de ET seja patogénica na hipertensão induzida pela CsA,

potencialmente conjuntamente com uma redução na produção de NO. Contudo, o papel

preciso desempenhado pela endotelina na hipertensão causada pela CsA é ainda

105

Capítulo I___________________________________________________________________________

desconhecido. Por exemplo, em ratos o efeito hipertensivo agudo causado pela CsA não é

afectado pela inibição da endotelina mas é abolido pela simpatectomia química ou cirúrgica,

o que pode indiciar uma mediação neuronial simpática (Morgan e col., 1991). Também está

descrito que a CsA aumenta os receptores ETA para a endotelina na vasculatura (Takeda e

col., 1995).

Um aumento transitório do cálcio intracelular é fundamental na mediação das

respostas contrácteis do músculo liso vascular (Rasmussen, 1986). A CsA aumenta este

cálcio transitório em resposta a agentes vasoconstritores, incluindo a angiotensina II e a

noradrenalina, tanto nas células musculares lisas de cultura (Bokemeyer e col., 1994; Meyer-

Lehnert e Schrier, 1989) como nas preparações de anéis de vasos sanguíneos isolados (Lamb

e Webb, 1987; Rego e col., 1990b; Xue e col., 1987). A ciclosporina pode aumentar tanto o

influxo de Ca2+ a partir dos compartimentos extracelulares (Meyer-Lehnert e Schrier, 1989;

Rego e col., 1990b) como a partir dos compartimentos intracelulares que o armazenam

(Bokemeyer e col., 1994), factos que levam a colocar a hipótese de que os mecanismos de

armazenamento e de libertação do cálcio estarem alterados após o tratamento (Auch-Schwlk

e col., 1993; Meyer-Lehnert e Schrier, 1987; Meyer-Lehnert e Schrier 1989; Pfeilschifter,

1988; Pfeilschifter e Rüegg, 1987).

O sistema renina-angiotensina também tem sido considerado como possível factor

contribuinte para a hipertensão associada à CsA, já que têm sido observados níveis

sanguíneos aumentados de renina em ratos (Perico e col., 1986). Contudo este facto parece

não ser confirmado em humanos (Bellet e col., 1985).

A CsA também provoca efeitos adversos no equilíbrio homeostático intravascular,

favorecendo um estado protrombótico ao diminuir a libertação de prostaciclina (Bossaller e

col., 1989; Sharp e col., 1988) e de monóxido de azoto (Bossaller e col., 1989; Chan e col.,

1992; Diederich e col., 1994; Dudhir e col., 1994; Rego e col., 1990a) a partir do endotélio

ao mesmo tempo que aumenta a síntese de tromboxano A2 e a libertação de serotonina pelas

plaquetas (Fernandes e col., 1993; Fishman e col., 1991; Grace e col., 1987; Jorkasky e col.,

1989). Além disso, a inibição da síntese de NO promove a adesão das plaquetas, um evento

que se sabe causar injúria das células endoteliais. O NO actua como protector em condições

106


fisiológicas, já que pode sequestrar pequenos fluxos de superóxidos produzidos pelas células

endoteliais. Assim, a inibição da produção de NO favorece a acumulação de superóxidos

e/ou de peróxidos de hidrogénio, os quais se sabe que alteram a integridade microvascular,

limitando a toxicidade associada com os radicais livres.

Não obstante, a variação dos efeitos descritos pode ser devida a uma grande

heterogeneidade no modelo animal escolhido, na dose escolhida de CsA, no período de

duração do tratamento e no veículo usado nos diferentes estudos descritos, os quais

influenciam a consistência dos resultados. De realçar ainda o facto, de que o efeito da CsA

pode variar consoante o tipo e o tamanho do vaso estudado.

4.3. A influência da ciclosporina na função

plaquetar

A terapêutica com a ciclosporina aumenta a activação expontânea das plaquetas

(Cohen e col., 1988), torna as plaquetas hiperagregáveis em resposta a variados agonistas

(Cohen e col., 1988; Fishman e col., 1991; Grace e col., 1987; Jorkasky e col., 1989) e causa

um aumento na expressão dos receptores para o fibrinogénio na superfície da membrana das

plaquetas (Fernandes e col., 1993; Fishman e col., 1991).

As plaquetas normais activadas desencadeiam uma vasodilatação nas artérias normais

através da secreção de ADP e ATP, que estimulam a libertação de NO (Föstermann e col.,

1988; Kaul e col., 1993; Öskarsson e Hofmeyer, 1996). Isto pode ser considerado como um

mecanismo contra-regulador no qual a libertação de NO causa uma vasodilatação em

oposição às forças vasoconstritoras desencadeadas por vários vasoconstritores como o TXA2

e a serotonina, também libertados durante a agregação plaquetar. Além disso, o NO libertado

no espaço da íntima pode inibir a proliferação das células musculares lisas (Newby,

Southgate e Assender, 1992; Nunokawa e Tanaka, 1992) e a síntese da matriz extracelular

(Kolpakov e col., 1995). O NO é também libertado no lúmen do vaso onde inibe a agregação

107

Capítulo I___________________________________________________________________________

plaquetar e a formação de trombos (Durane e col., 1992; Kaul e col., 1995; Nguyen, Saitoh e

Wane, 1991), providenciando um importante mecanismo de feedback negativo do processo

de activação plaquetar em curso. Assim, a incapacidade das plaquetas expostas à CsA em

mediar estes efeitos criam condições que favorecem os vasospasmos e a trombose

intravascular durante a activação plaquetar. Este facto deve possuir consequências clínicas

significativas e pode em parte explicar algumas das complicações tromboembólicas

relacionadas com o uso da CsA. Contudo, não está ainda estabelecido como é que a CsA

influência o balanço entre estas forças vasodilatadoras e vasoconstritoras mediadas pelas

plaquetas activadas.

A CsA provoca variadas alterações nas plaquetas mas não é ainda conhecido quando

é que estas afectam a capacidade das plaquetas em mediar a vasodilatação.

As plaquetas humanas, quando expostas à CsA tanto in vivo como in vitro possuem

uma capacidade diminuída em mediar a vasodilatação. Isto não é devido a um aumento da

vasoconstrição mediada pelas plaquetas ou a uma diminuição na libertação de nucleótidos

derivados das plaquetas mas, provavelmente, a um composto (ou vários) ainda não

identificado libertado pelas plaquetas quando expostas à CsA mas não libertado das plaquetas

normais com uma semi-vida curta, o qual interfere com a vasodilatação dependente do

endotélio ou que diminui a libertação de NO (Óskarsson, Hofmeyer e Olivari, 1997).

108


109

CAPÍTULO II

OBJECTIVOS

Capítulo II _________________________________________________________________________

A ciclosporina A foi introduzida como fármaco imunossupressor nos processos de

transplantação humanos na década de 80. Mas, a sua utilização é complicada devido a uma

série de efeitos secundários, e em particular à hipertensão arterial e à nefrotoxicidade que

induz. Um elemento comum tanto à nefrotoxicidade como à hipertensão arterial é a

vasoconstrição, mas o mecanismo exacto desta resposta permanece por esclarecer.

Contudo, parece que a CsA altera a reactividade vascular e/ou a síntese de substâncias

vasoactivas endógenas e pode assim causar uma significativa potenciação da

vasoconstrição e/ou uma atenuação da vasodilatação. Têm sido sugeridos variados

mediadores, incluindo um efeito no sistema renina – angiotensina, na actividade nervosa

simpática renal, as endotelinas, o tromboxano A2, as prostaglandinas vasodilatadores, o

factor activador das plaquetas, um efeito directo na captação do cálcio pelas células

musculares lisas vasculares, entre outros.

Os estudos mais recentes encontram-se direccionados para a via da L-arginina:NO,

já que hoje se sabe que um dos mecanismos da vasoconstrição induzida pela CsA é a

diminuição do relaxamento dependente do endotélio mediado pelo NO.

O NO é um importante mediador das alterações vasculares associadas à hipertensão

arterial e variados estudos têm sugerido que as alterações da produção e/ou acção do NO

deva ser um factor chave na resposta vasoconstritora à CsA.

Assim, a CsA continua a ser um fármaco imunossupressor de eleição; até ao

presente, nenhum outro que não lhe perca em eficácia lhe tem ganho em segurança. Além

disso, a toxicidade, nomeadamente a hipertensão arterial, parece decorrer ou relacionar-se

intimamente com o próprio mecanismo benéfico.

Sem um fármaco que claramente destrone a CsA, resta ao investigador tentar

“inibir” ou diminuir a toxicidade do fármaco, mas, para isso, é forçado a estudar os

mecanismos subjacentes ao efeito hipertensor e a desenvolver abordagens preventivas ou

terapêuticas para limitar a magnitude das suas acções adversas.

Este trabalho insere-se num projecto mais amplo e ambicioso através do qual

tentamos propor um(s) possível(is) mecanismo(s) subjacentes à hipertensão arterial

induzida pela CsA.

112

Objectivos_________________________________________________________________________

Até ao momento, o nosso grupo de trabalho (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares,

tese de doutoramento 1999) desenvolveu e caracterizou um modelo animal de hipertensão

arterial secundária à ciclosporina A.

Na verdade, o rato Wistar reproduz o desenvolvimento humano de hipertensão

arterial sequente à administração de ciclosporina.

Morfologicamente, através de microscopia electrónica e de técnicas

anatomopatológicas, o nosso grupo descreveu lesões condizentes com um estado

hipertensivo em ratos submetidos a ciclosporina:

a nível renal foram encontradas lesões ligeiras, não parecendo suficientemente

graves para originar a hipertensão arterial desenvolvida;

foram registadas alterações cardíacas dependentes da dose;

as lesões vasculares encontradas apresentavam uma severidade ligeira,

predominando a ruptura e a desorganização das fibras elásticas. A aorta

apresentava um perfil de lesões arterioscleróticas precoces mais facilmente

associadas a alterações hemodinâmicas;

a nível celular, a microscopia electrónica revelou um aumento da síntese de

colagénio com uma aparente relação entre este facto e a ruptura das fibras.

O nosso grupo (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento 1999)

seriou as alterações morfológicas e funcionais num quadro de hiperactivação plaquetar as

quais parecem sugerir que as plaquetas reflectem se não mesmo contribuem para a

hipertensão arterial neste modelo experimental.

Tais alterações são, por exemplo:

como confirmação da hiperreactividade plaquetar associada ao tratamento

com a CsA, verificou-se no nosso modelo um aumento in vitro da formação

plaquetar de TxA2 e, paralela e/ou consequentemente, um aumento da

agregação plaquetar induzida por colagénio;

113

Capítulo II _________________________________________________________________________

a diminuição da concentração de serotonina nas plaquetas dos ratos tratados

com a CsA, como resultado da activação plaquetar propriamente dita e/ou

da inibição da sua captação (como a inibição in vitro da ligação de

[3H]imipramina ao transportador de serotonina, para a concentração mais

elevada, sugere), confirma a possibilidade de envolvimento de alterações na

actividade do sistema serotoninérgico periférico no desenvolvimento da

hipertensão arterial;

a nível dos segundos mensageiros intracelulares verificou-se que a CsA

promoveu um aumento da [Ca2+]i basal e após estimulação com serotonina e

trombina. Para além de um aumento do influxo do meio extracelular através

dos transportadores membranares, também parece ocorrer uma exagerada

libertação de cálcio das reservas intracelulares;

o aumento da produção de fosfatos de inositol em relação ao controlo,

incluindo o Ins(1,4,5)P3 reforça esta suposição. Estes resultados foram

confirmados pelos estudos in vitro.

O endotélio desempenha um papel chave na homeostase do sistema cardiovascular

ao regular o tono vascular. Esta acção endotelial é exercida através da libertação de

diferentes substâncias que modulam a actividade contráctil do músculo liso vascular.

A respeito de moléculas envolvidas na inibição do tono vascular e na vasodilatação,

estudam-se os dois principais factores de relaxamento derivados do endotélio: o monóxido

de azoto (e o respectivo mediador, o GMPc) e a prostaciclina, uma vez que a observação

da inibição da síntese de NO em indivíduos normais pode causar um aumento da

resistência vascular até níveis de hipertensão arterial e de variados estudos terem indicado

que as artérias de doentes com hipertensão essencial apresentam um déficit na síntese do

NO (quer a produção basal quer a estimulada) derivado do endotélio sugerem que tal facto

deve desempenhar um papel determinante quer do aumento da resistência vascular destes

doentes quer da sua resposta enfraquecida aos agentes dependentes do endotélio, assim,

esta deve desempenhar um papel primário nos mecanismos “causais” da hipertensão

essencial.

114

Objectivos_________________________________________________________________________

Além disso, o facto de ocorrer uma elevação da pressão arterial a acompanhar o

tratamento com a CsA levou-nos agora a orientar os nossos esforços na investigação da ou

das alterações que possam ocorrer nos mecanismos vasodilatadores, em especial na via da

L-arginina:NO, visto ser o monóxido de azoto, o principal factor relaxante derivado do

endotélio.

Mas, uma vez que existe a possibilidade das plaquetas estarem também envolvidas

no aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base nos variados mecanismos

propostos para o aumento da vasoconstrição e visto que, as plaquetas também possuem

uma via da L-arginina:NO que regula a sua agregabilidade, também fomos estudar se

estaria alterada a via da L-arginina:NO:GMPc das plaquetas.

Assim, o estudo que estabelecemos foi “pensado” para tentarmos responder às

seguintes questões:

1. Qual ou quais as alterações encontradas na aorta do principal factor

vasodilatador derivados do endotélio, o NO se há algumas, estas acompanham ou não a

hipertensão arterial induzida pela CsA no modelo animal (rato Wistar) escolhido?

2. O principal sistema efector da acção do NO, o GMPc, também apresentará

qualquer tipo de desregulação a nível do músculo liso vascular.

3. As plaquetas também sofrerão qualquer tipo de alteração no respeitante à

produção e/ou ao armazenamento do NO?

4. O que ocorre ao GMPc a nível das plaquetas?

5. As alterações do sistema da L-arginina:NO desencadeadas pela

administração crónica da CsA (estudos in vivo) serão correlacionáveis com as alterações

encontradas após adição aguda de CsA às plaquetas (estudos in vitro).

115

Capítulo II _________________________________________________________________________

6. Existirá qualquer relação entre a variação do conteúdo de NO e do GMPc

quer nas plaquetas quer na aorta?

7. O ou os efeitos verificados poderão ser revertidos ou impedidos pela

administração de L-arginina?

8. O conteúdo de PGI2, outro importante factor vasodilatador derivado do

endotélio, também se encontrará alterado na aorta do nosso modelo animal de hipertensão

induzida pela CsA?

9. Apresentarão as variações de conteúdo(s) do NO e da PGI2 encontradas

comportamentos semelhantes, opostos ou interrelacionáveis?

10. Ocorrerão alterações nos teores plasmáticos de PGI2?

11. Serão as plaquetas um “espelho” das alterações que possam ser detectadas a

nível arterial, quer em relação aos conteúdos do NO quer do GMPc.

12. Qual o factor que sofrerá uma modificação mais precoce?

Para tal seguimos o seguinte protocolo:

a) Em primeiro lugar, comprovou-se se no nosso modelo experimental, à

semelhança dos estudos anteriores, a administração de 5 mg/kg/dia de CsA aos ratos

também desencadeia a elevação da pressão arterial, através da avaliação de:

pressão arterial sistólica, diastólica e média;

frequência cardíaca;

principais parâmetros hematológicos, como o número de plaquetas,

plaquetócrito, volume plaquetar médio, coeficiente de variação plaquetar e

hematócrito.

116

Objectivos_________________________________________________________________________

b) De seguida, avaliaram-se os efeitos do tratamento prolongado com a CsA ex vivo

nos seguintes parâmetros.

conteúdos arteriais dos principais factores de relaxamento derivados do

endotélio, o NO e a PGI2;

conteúdo arterial do principal sistema efector do NO, o GMPc;

alteração nos conteúdos plasmáticos de PGI2;

conteúdos plaquetares de NO e de GMPc;

Foram também realizados estudos in vitro, para:

avaliar a reactividade plaquetar em relação às substâncias administradas nos

estudos in vivo;

excluir os mecanismos (efeitos) compensatórios que possam “mascarar” o

efeito da CsA;

determinar a importância relativa do efluxo e do conteúdo residual da

produção de NO e de GMPc pelas plaquetas.

117

CAPÍTULO III

PARTE EXPERIMENTAL

Capítulo III_________________________________________________________________________

I Modelo animal e protocolo

experimental

1. Modelo animal

Como modelo animal experimental, escolheu-se o rato, visto este ser muito utilizado

para estudos de hipertensão arterial, nomeadamente nos estudos de hipertensão induzida

pela administração de CsA.

Foram utilizados ratos da estirpe Wistar, machos, com cerca de três meses de idade e

um peso de 250-300 gr, provenientes do biotério Charles-River (Barcelona, Espanha). Os

animais foram mantidos durante as experiências no biotério de manutenção do Instituto de

Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de

Coimbra de acordo com as normas legislativas europeias e em vigor no nosso país,

mantidos em gaiolas apropriadas (um por gaiola) em condições de temperatura (22 ± 1ºC)

e humidade (50 ± 10%) controlada e ciclos de luz/escuro de 12 horas diários, com dieta

sintética de manutenção para rato , IPM-R20 (Letica, Espanha). Tanto a alimentação como

a água foram fornecidas ad libitum até às 24 horas anteriores ao dia das colheitas, altura

em que os animais foram colocados em jejum, mantendo-se apenas a água de bebida.

120

Parte Experimental_________________________________________________________________________

2. Protocolo Experimental

2.1 Grupo de ratos

Após um período de duas semanas para aclimatização e obtenção do peso mínimo

exigido para a experimentação, os ratos foram divididos por forma randomizada em 4

grupos com pesos idênticos e submetidos diariamente, durante 4 semanas, às seguintes

dietas:

Grupo 1 – Grupo controlo com 10 ratos aos quais foram administrados sumo de laranja e

fornecida água destilada ad libitum.

Grupo 2 – Grupo ciclosporina (CsA) com 10 ratos aos quais foram administrados 5

mg/Kg/dia de ciclosporina A (Sandimmune Neoral®, Sandoz Pharma, Basel,

Suiça) diluída em sumo de laranja e fornecida água destilada ad libitum.

Grupo 3 – Grupo L-arginina com 10 ratos aos quais foram administrados sumo de laranja

e fornecida água destilada com L-Arg. (1,25 g/L) ad libitum.

Grupo 4 – Grupo L-arginina + CsA com 10 ratos aos quais foram administrados 5

mg/Kg/dia de ciclosporina A (Sandimmune Neoral®, Sandoz Pharma, Basel,

Suiça) diluída em sumo de laranja e fornecida água destilada com L-Arg.

(1,25 g/L) ad libitum.

121

Capítulo III_________________________________________________________________________

2.2 Doses administradas

Neste modelo experimental (ratos Wistar machos), foi escolhida a via oral para

administração da CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, a qual corresponde aos valores

farmacocinéticos normalmente obtidos em doentes sujeitos ao tratamento com uma “dose

de manutenção” deste imunossupressor. Tal dose é assim designada por corresponder à

chamada a “concentração de vale”, de aproximadamente 0,1 mM, que se mantém durante

20-22 horas. O fármaco foi administrado durante quatro semanas, uma vez que em estudos

preliminares já publicados (Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento

1999) se encontrava hipertensão arterial e diversas alterações bioquímicas decorrido este

período de tempo.

A administração oral de ciclosporina A e/ou de sumo de laranja foi realizada

através de uma cânula esofágica, no final da tarde e sempre à mesma hora.

Nos estudos in vitro foi escolhida a dose de 0,1 mM que, como atrás se disse,

corresponde à concentração atingida, numa toma diária, após a estabilização dos processos

de distribuição/metabolização da CsA no sangue (concentração de “vale”). A solução

padrão de ciclosporina foi preparada por diluição com DMSO

A dose e o processo de administração de L-arginina (1,25 g por litro de água) foi

escolhida de acordo com dados descritos na literatura consultada (Ashab e col., 1995;

Yang e col., 1998).

122


2.3 Caracterização do modelo animal

experimental

Antes do início do tratamento (semana 0) e no final deste (semana 4) cada um

dos ratos foi submetido às seguintes determinações:

A) peso corporal;

B) hemograma;

C) pressão arterial e frequência cardíaca (esfigmomanometria a nível da artéria

da cauda do rato).

A) Peso dos ratos

O peso corporal dos diferentes grupos de ratos foi avaliado antes de se iniciar o

período de tratamento, para que os ratos incluídos no estudo tivessem o peso requerido

como média e, depois, se pudesse avaliar a evolução no final do tratamento, isto é, às

quatro semanas (Tabela 1).

Tabela 1

Peso corporal (em gramas) dos grupos de ratos sujeitos aos diferentes tratamentos,

no início (semana 0) e no final do estudo (semana 4).

Semanas Controlo CsA L-Arg. L-Arg+CsA

0 296 ± 7 313 ± 6 339 ± 5 339 ± 7

4 324 ± 10 =28 320 ± 4 =7 377 ± 7 =38 348 ± 9 =9

Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n = 10, para cada grupo).

123

Capítulo III_________________________________________________________________________

Com os resultados obtidos, verifica-se um aumento do peso do grupo controlo e no

grupo de ratos aos quais foi fornecido um aporte exógeno de L-arginina (1,25 gr/L), na

água de bebida.

Nos ratos tratados apenas com a CsA 5 mg/Kg/dia ou com CsA 5 mg/Kg/dia e L-

arginina (1,25 gr/L), na água de bebida, não se registou uma variação significativa do peso

ao longo das quatro semanas de duração do estudo (Tabela 1).

A diminuição no ganho de peso já foi previamente reconhecida como um efeito

secundário da administração de CsA tanto em humanos como em animais (Gerkens e col.,

1984; McCauley e col., 1987; Reis, tese de mestrado 1999; Tavares, tese de doutoramento

1999). Tal efeito pode ser devido a uma redução no aporte de alimentos (não determinado

neste estudo), mas este facto não parece ser a causa , já que os estudos de Natelson e col.

(1992) descrevem que a privação parcial crónica de alimentos foi um factor que contribuiu

para a redução da pressão arterial. Tal efeito pode ser devido a um efeito catabólico do

fármaco como sugerido pelo aumento da ureia plasmática (Roullet e col., 1994). Assim, é

possível que o fármaco diminua a absorção intestinal de um nutriente crítico para o

controlo da pressão sanguínea, como o cálcio e o magnésio, contribuindo para o aumento

desta. Além disso, o menor peso corporal dos ratos tratados relativamente aos ratos

controlo poderá ficar a dever-se a uma diminuição da massa muscular, uma hipótese com

alguma relevância, já que a simples observação dos ratos permitia visualizar uma atrofia

muscular nos dois grupos de ratos tratados com CsA.

124


B) Parâmetros hematológicos

1 - Metodologia Na determinação dos principais parâmetros hematológicas efectuaram-se medições

do plaquetócrito, do número de plaquetas, do volume plaquetar médio, do coeficiente de

variação plaquetar e do hematócrito no sangue de ratos controlo e no sangue dos ratos

sujeitos aos diferentes tratamentos no início (semana 0), ao fim de duas semanas de

tratamento (semana 2) e no final do estudo (semana 4).

O sangue foi colhido da veia jugular direita dos ratos, previamente anestesiados

através de injecção intraperitoneal de 2 ml/Kg de uma solução 2:1 (v:v) de 50 mg/ml de

cetamina (Ketalar®, Park-Davis) em clorpromazina a 2,5% (Largactilâ, Rhône-Poulenc),

para seringas com ACD 3,2% (w/v) (0,1 ml/ml sangue), como anticoagulante, cuja

composição é (em mM): (71) ácido cítrico, (85) citrato de sódio e (111) D-glucose. Após a

colheita, o sangue foi transferido para tubos teste de polipropileno contendo EDTA

trissódico, e os parâmetros hematológicos foram de imediato determinados num contador

Coulter (Coulter, E.U.A.), cujo funcionamento se baseia no método da impedância

eléctrica.

Este estudo foi realizado em colaboração com o Laboratório de Hematologia dos

Hospitais da Universidade de Coimbra.

2 - Resultados e comentários A determinação dos principais parâmetros hematológicas: plaquetócrito, número de

plaquetas, volume plaquetar médio, coeficiente de variação plaquetar e hematócrito

fundamentou-se no facto de que a CsA pode produzir alterações do plaquetócrito, número

de plaquetas, como se observa para os fármacos citostáticos em geral. Assim, poderíamos

pensar que alguns dos efeitos da CsA nas plaquetas se poderem dever a uma diminuição do

número de plaquetas e do plaquetócrito, e não a certos mecanismos plaquetares que esta

possa alterar.

125

Capítulo III_________________________________________________________________________

Contudo, em nenhum dos parâmetros hematológicos avaliados se verificaram

alterações entre os diferentes grupos de ratos em nenhumas das semanas avaliadas .

Tabela 2Número de plaquetas, plaquetócrito, volume plaquetar médio, coeficiente de

variação plaquetar e hematócrito em ratos controlo e em ratos tratados com ciclosporina, L-arginina e L-arginina + ciclosporina A nas semanas 0 e 4 de tratamento.

Parâmetroem estudo

Semana Trata/o

GrupoControlo

CsA L-Arg. L-Arg.+

CsA

NÚMERO DE 0 615 ± 13 611 ± 13 609 ± 15 613 ± 13

PLAQUETAS (GL) 4 609 ± 20 607 ± 18 611 ± 18 609 ± 23

PLAQUETÓCRITO 0 0,28 ± 0,01

0,28 ± 0,01

0,30 ± 0,01

0,26 ± 0,02

(%) 4 0,30 ± 0,01

0,28 ± 0,02

0,32 ± 0,01

0,27 ± 0,02

VOLUME

PLAQUETAR

0 5,2 ± 0,2 5,2 ± 0,2 5,3 ± 0,2 5,4 ± 0,1

MÉDIO (f L) 4 5,4 ± 0,2 5,3 ± 0,1 5,6 ± 0,1 5,4 ± 0,2

COEF. DE VAR.

PLAQUETAR

0 15,9 ± 0,3 16,0 ± 0,3 16,2 ± 0,1 16,0 ± 0,2

(ratio) 4 16,1 ± 0,2 16,3 ± 0,2 16,5 ± 0,1 16,3 ± 0,1

HEMATÓCRITO 0 37,3 ± 0,4 37,5 ± 0,3 37,3 ± 0,3 37,1 ± 0,4

(%) 4 37,0 ± 0,2 37,0 ± 0,3 37,2 ± 0,2 37,3 ± 0,2

Dados apresentados em médias ± e.p.m.(n = 10, para cada grupo).As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de Fisher¢s através da análise da

126


varância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade inferiores a 0,05 (p<0,05) foram considerados como estatisticamente significativos.

127

Capítulo III_________________________________________________________________________

C) Pressão arterial

1 - Metodologia

Neste estudo foi avaliada a pressão arterial sistólica, diastólica e média, assim como,

a frequência cardíaca através de um método não invasivo como o método de “tail cuf” no

início (semana 0) e no final do tratamento (semana 4), dos diferentes grupos de ratos em

estudo após um período prévio de adaptação dos animais ao sistema de medição e às

condições de quase total imobilidade dentro das caixas de contenção.

A determinação dos diferentes parâmetros foi efectuada através do método

oscilométrico, utilizando-se um equipamento LE 5001 (Letica, Espanha) na artéria da

cauda do rato, a qual sendo uma artéria elástica com características semelhantes à artéria

aorta é muito utilizada para a medição da pressão arterial.

As medições foram realizadas em ratos conscientes, em condições de repouso para se

evitar induzir qualquer tipo de “stress” nos animais, tendo-se submetido a cauda dos ratos a

uma temperatura de cerca de 30ºC durante 20 minutos, para obter uma dilatação dos vasos

periféricos.

Foram efectuadas várias determinações consecutivas no mesmo animal a cada tempo

e os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo de

variação dos valores, em erro padrão da média.

As diferenças entre duas médias foram avaliadas pelo teste do t de Student para

observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de

Fisher¢s através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de probabilidade

inferiores a 0,05 (p<0,05) foram considerados como estatisticamente significativos. O

número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado nos vários gráficos.

Os resultados foram expressos em mmHg.

128


2 - Resultados e comentários

2.1 Pressão arterial sistólica (PAS)

No início do estudo (semana 0), os valores obtidos da pressão arterial sistólica,

equiparavam-se para os diferentes grupos de ratos (Fig. 2.1):

grupo controlo: 148 ± 4,3 mmHg

grupo CsA: 152 ± 3,5 mmHg

grupo L-arginina: 153 ± 2,3 mmHg

grupo L-arginina + CsA: 154 ± 4,7 mmHg

No final do tratamento (semana 4), verificou-se um aumento da pressão arterial

sistólica no grupo de ratos aos quais foi administrada a CsA relativamente ao controlo. No

grupo de ratos aos quais apenas se administrou a L-arginina, não se verificou qualquer

variação da PAS em relação aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de

ratos aos quais foi administrada simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram

alterações significativas da PAS relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento com

a L-arginina não preveniu o aumento da PAS induzido pela CsA (Fig. 2.1):


grupo CsA: 173* ± 5,0 mmHg (p<0,05)



129

Capítulo III_________________________________________________________________________

Fig. 2.1 Pressão arterial sistólica de ratos controlo, ratos administrados com (5

mg/Kg/dia) de CsA, ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados com

CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no final do

tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada grupo).

*(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo.

130


2.2 Pressão arterial diastólica (PAD)

Os valores da pressão arterial diastólica obtidos na semana 0 foram também

semelhantes para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.2):





Após 4 semanas de tratamento verificou-se um aumento da pressão arterial

diastólica no grupo de ratos aos quais foi administrada a CsA. No grupo de ratos aos quais

apenas se administrou a L-arginina, não se verificou qualquer variação da PAD em relação

aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de ratos aos quais foi administrada

simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram alterações significativas da PAD

relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento com a L-arginina não preveniu o

aumento da PAD induzido pela CsA (Fig. 2.2):


grupo CsA: 94* ± 2,2 mmHg (p<0,05)



131

Capítulo III_________________________________________________________________________

Fig. 2.2 Pressão arterial diastólica de ratos controlo, ratos administrados com

(5 mg/Kg/dia de CsA), ratos tratados com L-arginina (1,25 g/L) e de ratos administrados

com CsA (5 mg/Kg/dia) e tratados com L-arginina (1,25 g/L), no início (semana 0) e no

final do tratamento (semana 4). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=10 para cada

grupo). *(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo.

132


2.3 Pressão arterial média (PAM)

Em relação à pressão arterial média, verificou-se à semelhança do que já foi

descrito para a PAS e PAD, que no início do tratamento, os valores da pressão arterial

média, equiparavam-se para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.3):





Ao fim das quatro semanas de tratamento ocorreu um aumento significativo da

pressão arterial média apenas no grupo de ratos tratados com CsA. A PAM do grupo ao

qual apenas se administrou a L-arginina não apresentou qualquer variação, ao longo do

tempo do estudo em relação aos valores do grupo de referência (controlo). No grupo de

ratos aos quais foi administrada simultaneamente a CsA e a L-arginina não se verificaram

alterações significativas da PAM relativamente ao grupo da CsA, ou seja, o tratamento

com a L-arginina não preveniu o aumento da PAM induzido pela CsA (Fig. 2.3):


grupo CsA: 131* ± 3,5 mmHg (p<0,05)



133

Capítulo III_________________________________________________________________________

Fig. 2.3 Pressão arterial média de ratos controlo, ratos administrados com




grupo). *(p<0,05): grupos sujeitos aos diferentes tratamento vs respectivo controlo.

134


2.4 Frequência cardíaca

Quando estudamos a frequência cardíaca, verificou-se que no início do tratamento,

os valores da frequência cardíaca, eram semelhantes para os quatro grupos de ratos:





Após o tratamento, não se registaram quaisquer alterações significativas nos valores

da frequência cardíaca, para os quatro grupos de ratos (Fig. 2.4):





135

Capítulo III_________________________________________________________________________

Fig. 2.4 Frequência cardíaca de ratos controlo, ratos administrados com




grupo).

136


A pressão arterial média (PAM) é obtida pela fórmula : PAM = PAD + 0,33 x (PAS-

PAD). A PAS é a pressão arterial sistólica ou máxima que corresponde à sístole

ventricular, dependendo essencialmente do débito cardíaco. A PAD representa a pressão

arterial diastólica, ou mínima, e corresponde ao final da diástole, dependendo sobretudo da

resistência vascular periférica, a qual por sua vez, depende da distensibilidade da parede

dos vasos e/ou do desequilíbrio entre factores contracturantes e relaxantes.

Actualmente, aquele que era um comportamento diverso entre os autores, passou a

ser recentemente aceite por praticamente todos: a CsA aumenta a pressão arterial.

Assim, tal como já anteriormente fora encontrado pelo nosso grupo de trabalho

(Reis, tese de mestrado 1999 e Tavares, tese de doutoramento 1999), e em concordância

com a generalidade dos estudos descritos na literatura acerca da hipertensão arterial

induzida pelo tratamento com a CsA, verificou-se que o tratamento com CsA, na dose de 5

mg/Kg/dia, induziu um aumento da pressão arterial sistólica, da pressão arterial diastólica e

da pressão arterial média, não ocorrendo qualquer variação da frequência cardíaca. Mais a

pressão diastólica (aumento de cerca de 23% - grupo controlo: 76 ± 2,3 mmHg vs grupo

CsA: 94 ± 2,2 mmHg) do que a pressão sistólica (aumento de cerca de 15% - grupo

controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo CsA: 173 ± 5,0 mmHg). No entanto, considere-se quer

a pressão arterial sistólica quer a pressão arterial diastólica, o aumento é significativo.

Embora, não se tenha determinado os mecanismos subjacentes ao aumento da PAS, é de

presumir que estes estejam relacionados com o aumento do volume sistólico, tanto mais

que a frequência cardíaca não foi influenciada pela CsA (frequência cardíaca - grupo

controlo: 332 ± 10,2 mmHg vs grupo CsA: 341 ± 12,1 mmHg).

O aumento da PAS e a ausência de alterações significativas na frequência cardíaca,

pode sugerir a existência de uma alteração do volume sistólico, facto que por sua vez

poderá indiciar um maior trabalho cardíaco. Além deste facto, ao verificarmos um aumento

simultâneo da PAD podemos pressupor que a CsA na dose de 5 mg/Kg/dia ao diminuir a

distensibilidade arterial, aumentará a resistência vascular periférica, o que também deve

desempenhar um papel importante na elevação da pressão arterial.

137

Capítulo III_________________________________________________________________________

A L-arginina não apresenta um efeito directo na pressão arterial média (grupo

controlo: 105 ± 3,4 mmHg vs grupo L-Arg.: 116 ± 3,0 mmHg) ou na frequência cardíaca

(grupo controlo: 332 ± 10,2 mmHg vs grupo CsA: 351 ± 13,3 mmHg).

No grupo de ratos aos quais se forneceu antecipadamente um suplemento

exógeno de L-arginina e que foram depois tratados durante 4 semanas com CsA e L-

arginina, verificou-se que o aumento da PAS (grupo controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo

L-Arg. + CsA: 178 ± 7,1 mmHg) não difere do induzido unicamente pela CsA (grupo

controlo: 150 ± 3,2 mmHg vs grupo CsA: 173 ± 5,0 mmHg). Que este efeito se deverá à

incapacidade da L-arginina para contrariar esse aumento parece ser evidenciado pela

semelhança da PAS entre o grupo controlo e o grupo da L-arginina (grupo controlo: 150

± 3,2 mmHg vs grupo L-Arg.: 155 ± 3,3 mmHg). O mesmo não parece acontecer com a

PAD, visto que, quando se adicionam os dois tratamentos, o aumento da PAD (grupo

controlo: 76 ± 2,3 mmHg vs grupo L-Arg. + CsA: 86 ± 2,2 mmHg) embora não seja

anulado é inferior aquele que se verifica com o uso isolado da CsA (grupo controlo: 76 ±

2,3 mmHg vs grupo CsA: 94 ± 2,2 mmHg). A L-arginina tende a contrariar o aumento da

PAD induzido pela CsA.

Assim, parece que a L-arginina não influencia o aumento da PAS mas sim o da

PAD.

138


II O sistema NO:GMP

Sistema NO:GMPc

A - IntroduçãoO NO no sistema cardiovascular desempenha um papel fundamental mantendo os

vasos sanguíneos num estado dilatado e mantendo a superfície do endotélio como não

trombogénica. O NO estimula a guanilciclase solúvel através da interacção com o seu

centro heme, resultando na formação de GMPc. O aumento do GMPc leva

subsequentemente à vasodilatação e à inibição da agregação das plaquetas.

139

Capítulo III_________________________________________________________________________

Muitos dados apoiam um papel para o NO nos efeitos descritos para a CsA. De

facto, a inibição da NOS em ratos normais produz uma vasoconstrição generalizada, um

aumento da pressão sanguínea e alterações nos electrólitos urinários, efeitos semelhantes

ao observados com o tratamento pela CsA. Além disso, com a inibição do NO através de

estudos com inibidores das NOS em humanos saudáveis, verificou-se que estes

desencadeavam um aumento significativo na pressão arterial (Bech, Nielsen e Pederson,

1996; Berger e col., 1998; Hansen e col., 1999; Haynes e col., 1993)

A diminuição de NO pode determinar quer o aumento da resistência vascular

periférica quer o enfraquecimento da resposta aos agentes dependentes do endotélio.

A hipótese de uma possível inibição dos mecanismos vasodilatadores leva a

pensar que a CsA deve ter um efeito sobre o endotélio vascular que é o principal local de

formação de metabolitos vasodilatadores.

Um factor chave dos mecanismos que poderão estar implicados na hipertensão

arterial induzida pela CsA parece ser a alteração da reactividade vascular e o desequilíbrio

do balanço entre factores vasoconstritores e factores vasodilatadores. De facto, ao longo do

tempo têm sido fortalecidas as evidências que sugerem a injúria e a disfunção endotelial

como causa central das alterações renais e circulatórias induzidas pela CsA.

Particularmente, parece que a CsA diminui o relaxamento dependente do endotélio

numa grande variedade de modelos in vivo, ex vivo e in vitro, assim como em preparações

vasculares de diferentes tamanhos e características funcionais. Estas incluem: animais

intactos tratados com a CsA (Gallego e col., 1993); anéis de aorta de animais aos quais foi

previamente administrada a CsA (Mikkelsen e col., 1992); anéis aórticos normais

incubados num meio que contém CsA (Rego e col., 1990b); artérias femorais de ratos

tratados com CsA, leitos mesentéricos vasculares perfundidos com CsA e arteríolas

subcutâneas humanas estimuladas com CsA (Gallego e col., 1994; Rego e col., 1990a;

Richards, Poston e Hilton, 1989; Roullet e col., 1994; Sudhir e col., 1994; Takenaka

Hashimoto e Epstein, 1992).

Uma vez que o NO tem sido implicado como um mediador central das alterações

hemodinâmicas microvasculares associadas à hipertensão (Vallance, Collier e Moncada,

1989), tem sido colocada a hipótese que a CsA deve interferir com a produção e/ou a acção

140


do principal factor de relaxamento derivado do endotélio, o NO, e tal facto deve ser

importante na resposta vasoconstritora à CsA. Além disso, variados grupos de investigação

têm verificado a existência de um enfraquecimento do relaxamento dependente do

endotélio, o que sugere que este fármaco pode interferir com o normal funcionamento da

via da L-Arginina:NO. Contudo o passo preciso da interferência ainda não se encontra

estabelecido e permanecem variadas possibilidades, entre as quais a possibilidade de existir

uma diminuição da quantidade de substrato disponível (L-arginina) ou ocorrer uma

alteração na via efectora do GMPc.

Alguns dos estudos já realizados demonstraram que a CsA induz uma diminuição

na produção de NO em diferentes modelos animais e sistemas, embora os resultados

obtidos sejam muitas vezes contraditórios (Gallego e col., 1993; Khalil e col., 1996;

O’Neil e col., 1991; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999; Sudhir e col., 1994; Vaziri e

col., 1998) .

No entanto, não existe consensualidade nos estudos descritos na literatura a respeito

da relação: alteração na via da L-arginina:NO / diminuição do relaxamento vascular e

aumento da reactividade vascular. Já tem sido verificada em alguns estudos a inexistência

de qualquer alteração ou até mesmo, um aumento da formação de NO ( Assis, Monteiro e

Seguro, 1997; Bobadilla e col., 1994; Hansen e col., 1999; O’Neil e col., 1991; Stroes e

col., 1997), assim como um aumento da actividade da NOS (Stroes e col., 1997). Alguns

destes autores sugerem mesmo que o aumento da produção de NO pode actuar como uma

resposta contra-reguladora perante o aumento da vasoconstrição induzida pela CsA, o qual

está associado tanto à nefrotoxicidade como à hipertensão (Assis, Monteiro e Seguro,

1997; López-Ongil e col., 1996; Stroes e col., 1997).

Também tem sido sugerido que a diminuição da expressão e da actividade da NOS,

referida em alguns estudos com células vasculares e renais (Lee e col., 1999; Marumo e

col., 1995; Vaziri e col., 1998), possa explicar a diminuição da síntese de NO. Tem sido

descrito que a CsA inibe tanto a actividade (Conde e col., 1995) como a expressão da

enzima indutível (Kunz e col., 1995).

A CsA pode limitar a quantidade disponível de substrato para a NOS, pode inibir

competitivamente a NOS e tal facto poderá ser contornado com a presença de um excesso

de substrato.

141

Capítulo III_________________________________________________________________________

Contudo, não se pode excluir um efeito tóxico directo da CsA nas células do

músculo liso vascular e nos seus componentes contrácteis.

A alteração da reactividade vascular e da reactividade plaquetar são dois fenómenos

centrais para a oclusão dos vasos sanguíneos. De facto, existe a possibilidade das plaquetas

estarem também envolvidas no aumento da pressão arterial induzida pela CsA, com base

nos variados mecanismos propostos para o aumento da vasoconstrição.

A maior parte destes e de outros estudos demonstram que a L-arginina pode

prevenir e/ou reverter a diminuição da síntese de NO e o enfraquecimento do relaxamento

dependente do endotélio induzido pela CsA, factores associados à nefrotoxicidade e à

hipertensão (Amore e col., 1995; Andoh, Burdmann e Bennett, 1997; Auch-Schwelk e col.,

1993; Kim e col., 1996; Lee e col., 1999; Mathieu e col., 1997; Orijii e Keiser, 1998; Orijii

e Keiser, 1999; Yang e col., 1998).

Uma deficiente produção de GMPc é um dos mecanismos fisiopatológicos

fundamentais nos modelos genéticos de hipertensão, tanto no modelo de rato

espontaneamente hipertenso como na hipertensão essencial no homem (Rego e col.,

1990a). De facto, estes autores descrevem uma diminuição do conteúdo de GMPc na aorta

de ratos tratados com a CsA e uma diminuição na produção de GMPc pelos grandes vasos

desencadeada in vitro pelo fármaco, o que sugere que a CsA pode diminuir o relaxamento

independente do endotélio dos vasos de resistência ao interferir com a via do GMPc. Os

estudos de Caramelo e col. (1995) também corroboram esta opinião, já que estes

verificaram que os vasos obtidos de animais tratados com CsA apresentam uma produção

diminuída de GMPc.

Mas, alguns dos resultados, total ou parcialmente contraditórios, descritos nos

estudos sobre o assunto a respeito do efeito da CsA na via da L-arginina:NO:GMPc podem

ser devidos a diferenças nas condições experimentais. Existem, pelo menos, quatro

variáveis importantes que podem influenciar esta grande variabilidade de resultados: o

modelo experimental utilizado, a via de administração, a dose de CsA administrada e a

duração do tratamento.

142


B - Metodologia

1. Determinação dos teores arteriais de NO

A medição de NO da aorta nas diferentes condições experimentais foi feita por

recurso a um método que tem sido muito utilizado por outros autores, método de Griess

(Green e Col., 1982), que se baseia nas propriedades apresentadas pelo NO em solução

aquosa. O NO é quimicamente instável, aos valores fisiológicos de pH, apresentando uma

semi-vida de 3 a 5 segundos e em solução aquosa 90% do NO formado é espontaneamente

convertido em ião nitrito (NO2-), o principal produto estável resultante da oxidação do NO,

sendo apenas uma pequena porção convertida em ião nitrato (NO3-) (Feelisch e Noack,

1987). O método de Griess baseia-se na determinação da quantidade de ião nitrito que

forma com o reagente de Griess um composto com propriedades cromóforas (H2N-

C10H6NN-C6H4SO3H). Assim, este método consiste numa reacção de diazotação na qual

os nitritos formados interagem com a naftiletilenodiamina em meio acídico, produzindo

um composto rosa que absorve a um comprimento de onda na região dos 540 nm, presente

no meio sobrenadante em estudo. Como padrões, foram utilizadas soluções de nitrito de

sódio de concentrações conhecidas, o que permite traçar uma curva de calibração e

quantificar indirectamente o NO.

No final de cada série de tratamento foi realizado o estudo ex vivo com isolamento

da artéria aorta torácica de cada rato. Os ratos foram sacrificados por distensão da cervical.

A aorta torácica dos ratos foi removida imediatamente após o sacrifício com cuidado para

evitar o estiramento vascular e o vaso foi colocado numa placa de Petri com solução salina

fisiológica (PSS), fria, gaseificada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2, cuja

composição (em nmol/L) é: (140) NaCl, (4.6) KCl, (2) CaCl2, (10) MgCl2, (10) HEPES,

(1) D-glucose, pH 7,4. A artéria foi limpa de gorduras e de tecido conjuntivo adjacente,

com os devidos cuidados para que não fosse danificado o endotélio.

De seguida, esta foi cortada e dividida em vários segmentos, tendo sido dois destes

segmentos utilizados, cada um com aproximadamente 4-5 mm de espessura, para os

estudos do NO arterial. Num deles foi removido o endotélio por fricção cuidadosa da

superfície da íntima com a passagem de um cotonete húmido no sentido do comprimento,

143

Capítulo III_________________________________________________________________________

para a determinação do conteúdo de NO na aorta sem endotélio. A ausência de endotélio

foi confirmada por observação das tiras através da microscopia electrónica.

Assim, após obtenção dos anéis de aorta, estes foram deixados em repouso até

estabilização num banho de orgãos, com 15 ml cada, durante 2 horas aquecidos a 37ºC por

circulação de água contendo uma solução de Krebs-Henseleit gaseificada com um mistura

de 95% de O2 e 5% de CO2 com a seguinte composição (em mM): (118) NaCl, (4.7) KCl,

(2.5) CaCl2, (1.2) KH2PO4, (1.2) MgCl2, (25) NaHCO3, (0.01) Na2-EDTA, (11.1) glucose e

H2O q.b.p. 1L (pH 7,4). O meio foi renovado cada hora e no final da incubação os tecidos

mantidos no gelo foram homogeneizados num homogenizador rotativo. Seguidamente, os

homogeneizados foram centrifugados a 2500 ´g durante 30 minutos a 4ºC.

Os nitritos nos sobrenadantes aórticos foram determinados através do método do

reagente de Griess. A 1 ml de amostra foi adicionado 1 ml do reagente de Griess,

previamente preparado da seguinte forma: N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em H3PO4 a

5% e sulfanilamida a 1% em H3PO4 a 5% na proporção de 1:1. Após um período de 10

minutos de incubação à temperatura ambiente para a formação de um cromófero, a

absorvância foi lida a 540 nm num espectofotómetro (Shimadzu, UV-Visible Recording

Spectrophotometer UV-2100).

Paralelamente foi efectuada uma curva padrão com várias concentrações

conhecidas de nitrito de sódio (NaNO2) (nm/ml) e a concentração de nitritos foi calculada

por interpolação nesta curva padrão.

Nas determinações espectofotométricas foram utilizadas cuvetes especiais de

quartzo com 2 ml de capacidade para se “aumentar” a concentração de nitrito e

aumentarmos a sensibilidade do ensaio.

A concentração da proteína solúvel em cada amostra foi determinada pelo método

de ligação ao azul de Coomassie – Método de Sedmak, usando como padrão a albumina

bovina sérica (BSA). A curva de calibração foi construída a partir de uma solução padrão

de BSA a 0,1%. O procedimento foi idêntico tanto para a determinação da proteína das

amostras como da curva de calibração. O volume das amostras (25 ml) e do BSA foi

ajustado até 1 ml com água, adicionando-se de seguida 2 ml do reagente de Sedmak

diluído na proporção de 30 ml de reagente de Sedmak concentrado para 70 ml de solvente

(HClO4 0,3 M). A composição de reagente de Sedmak concentrado é a que a seguir se

144


indica: 0,06% de Coomassie blue G 250 em 3% de HClO4 (w/v). Após agitação, a amostra

foi incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente, determinando-se de seguida a

absorvância das amostras, a 620 nm, num espectofotómetro de UV-visível.

Os resultados são expressos em média aritmética complementada com o intervalo

de variação dos valores, em erro padrão da média.

Alguns dos resultados são apresentados em % em relação a determinado grupo,

devidamente indicado.


observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação ou pelo teste de




Os resultados foram expressos em pg por mg de proteína.

145

Capítulo III_________________________________________________________________________

2. Determinação dos teores arteriais de GMPc

Os segmentos arteriais obtidos como descrito anteriormente e após o procedimento

de lavagem foram divididos em anéis com um tamanho de aproximadamente 4-5 mm de

espessura. Estes foram deixados em repouso até estabilização, num banho de orgãos, com

15 ml cada, durante 2 horas, aquecidos a 37ºC por circulação de água, contendo uma

solução de Krebs-Ringer gaseificada com um mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 com a

seguinte composição (em mM): (118) NaCl, (4.7) KCl, (2.5) CaCl2, (1.2) KH2PO4, (1.2)

MgCl2, (25) NaHCO3, (0.01) Na-EDTA, (1) glucose e H2O q.b.p. 1L (pH 7,4), contendo

indometacina (5 mM). O meio foi renovado cada hora e no final da incubação o meio foi

substituído por tampão com igual composição ao qual foi adicionado IBMX (2 mM), um

inibidor da fosfodiesterase do GMPc para prevenir a degradação expontânea do nucleótido.

Após 40 minutos de incubação, o tecido foi rapidamente congelado em azoto líquido. O

tecido congelado foi mantido no gelo e homogeneizado num homogeneizador rotativo. Os

homogeneizados foram incubados durante 1 hora a 4ºC com ácido perclórico (0,5 M) e no

final foram centrifugados a 12,000 ´g durante 5 minutos a 4ºC e neutralizados com K3PO4

(1 M) (Moro e col.,1996 ).

Após decantação do sobrenadante no qual se encontrava o extracto de GMPc, este

foi evaporado à secura a 23ºC num banho de areia. O extracto seco foi reconstituído em

tampão acetato de sódio (50mM, pH 6,2) e acetilado com uma solução de anidrido

acético:trietilamina (1:2, v/v) antes de ser analisado.

As concentrações de GMPc nos sobrenadantes foram determinadas através de um

método enzimoimunológico utilizando um “Kit” específico da R&D Systems após

acetilação das amostras e padrões de acordo com as instruções do fabricante.

A leitura foi efectuada em sistema de micro-ELISA (Enzyme Linked Immuno

Sorbent Assay) Mios Merck e os níveis de GMPc, calculados a partir da curva de

calibração efectuada para cada “Kit”, foram expressos em pmol de GMPc por mg de

proteína por segmento vascular.

A concentração da proteína solúvel em cada amostra foi determinada pelo método

de ligação ao azul de Coomassie , utilizando a albumina bovina sérica como padrão, o qual

já foi descrito anteriormente.

146




Alguns dos resultados são apresentados em % em relação a determinado grupo,

devidamente indicado.


observações emparelhadas ou não-emparelhadas de acordo com a situação, ou pelo teste de




147

Capítulo III_________________________________________________________________________

3. Determinação dos níveis plaquetares de NO

3.1 Ensaios ex vivo

O sangue foi obtido da veia jugular direita dos ratos, previamente anestesiados

através de injecção intraperitoneal de 2 ml/Kg de uma solução 2:1 (v:v) de 50 mg/ml de

cetamina (Ketalar®, Park-Davis) em clorpromazina a 2,5% (Largactilâ, Rhône-Poulenc),

para seringas com ACD 3,2% (w/v) (0,1 ml/ml sangue), como anticoagulante, cuja

composição é (em mM): (71) ácido cítrico, (85) citrato de sódio e (111) D-glucose.

Após a colheita, o sangue foi transferido para tubos teste de silicone e analisado de

imediato. As amostras foram centrifugados a 160 ´g durante 10 minutos, à temperatura

ambiente, para obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP), numa centrífuga refrigerada.

A partir do PRP, por centrifugação a 900 ´g durante 15 minutos, obteve-se um precipitado

de plaquetas (“pellet”). Ao “pellet” de plaquetas foi de seguida adicionado 1ml de tampão

de lavagem cuja composição (em mM) é a seguinte: (90) NaCl, (5) KCl, (36) ácido cítrico,

(5) glucose e (10) EDTA e H2O q.b.p. 1L (pH 6,5) e centrifugado a 800 ´g durante 15

minutos, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi de novo

ressuspendido em igual volume da mesma solução de lavagem e o processo de

centrifugação e separação foi repetido, num total de duas lavagens.

Após a completa eliminação do tampão de lavagem, o “pellet” de plaquetas foi

ressuspendido em 1100 ml de tampão Tyrode modificado com a seguinte composição (em

mM): (134) NaCl, (3) KCl, (12) NaHCO3, (1) MgCl2.6H2O, (0.42) NaH2PO4, (1.8)

CaCl2, (5) Hepes, (0.56) glucose e H2O q.b.p. 1L (pH 7,4) (Shinya e col., 1996).

Retiraram-se 100 ml para contagem do número de plaquetas e as amostras foram incubadas

durante 2 horas a 37ºC.

No final da incubação, a reacção foi terminada no gelo e a amostra foi centrifugada

a 3600 ´g durante 15 minutos para se obter o sobrenadante (conteúdo efluído), no qual se

determinou a quantidade de nitritos libertados durante o tempo de incubação. O “pellet” de

plaquetas obtido foi ressuspenso em 1000 ml água ultra-pura e sonicado durante 10

minutos, após o que a amostra foi centrifugada a 3600 ´g durante 15 minutos para se obter

148


um segundo sobrenadante, no qual foram quantificados os nitritos não libertados durante o

tempo de incubação (conteúdo intraplaquetar).

A formação de NO foi avaliada pelo doseamento da produção de nitritos através da

Reacção de Griess, já anteriormente descrita. Assim, a 1 ml de amostra foi adicionado 1 ml

do reagente de Griess, previamente preparado da seguinte forma: N-1-naftiletilenodiamina

a 0,1% em H3PO4 a 5% e sulfanilamida a 1% em H3PO4 a 5% na proporção de 1:1. Após

um período de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente para a formação de um

cromóforo, a absorvância foi lida a 540 nm num espectofotómetro (Shimadzu, UV-Visible

Recording Spectrophotometer UV-2100). Paralelamente, foi efectuada uma curva padrão

com várias concentrações conhecidas de nitrito de sódio (NaNO2) (nm/ml) e a

concentração de nitritos foi calculada por interpolação nesta curva padrão.

Os valores de nitritos reflectem a actividade da sintase do NO já que não existe

outra fonte potencial deste ião.

As medições espectofotométricas foram realizadas em cuvetes especiais, de quartzo

com 2 ml de capacidade, para se “aumentar” a concentração de nitrito e “melhorar” a

sensibilidade do ensaio.




observações emparelhadas ou não-emparelhadas, de acordo com a situação, ou pelo teste

de Fisher¢s através da análise da variância de uma via (ANOVA). Os níveis de

probabilidade inferiores a 0,05 (p<0,05) foram considerados como estatisticamente

significativos. O número de determinações efectuadas para cada parâmetro é o indicado

nos vários gráficos.

Os resultados são expressos em nmol/109plaquetas.

149

Capítulo III_________________________________________________________________________

3.2 Ensaios in vitro

Nos estudos in vitro foram realizados os mesmos procedimentos, diferindo apenas

na incubação de várias suspensões plaquetares às quais foram adicionadas as seguintes

substâncias:

CsA 0,1 mM, dissolvida em dimetilsulfóxido;

L-arginina 0,2 mM, o substrato da via da L-Arg:NO, como controlo positivo da

produção de NO;

LPS 1 mMml-1 e IL-1b 20 ngml-1, indutores da sintase indutível do NO, como

controlo positivo da produção de NO;

L-NNA 0,1 mM, um inibidor da NOS, com uma maior “selectividade” para a

sintase constitutiva;

aminoguanidina 2 mM um inibidor da NOS, com uma maior “especificidade”

para a sintase indutível;

ou não ( tubo controlo).

150


4. Determinação dos níveis plaquetares de

GMPc

O sangue recolhido da jugular do rato, em ACD 3,2% (w/v) 1/10 em tubos teste de

silicone foi centrifugado de imediato a 120 ´g durante 20 minutos à temperatura ambiente

para obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP) numa centrífuga refrigerada.

O PRP foi incubado a 37ºC durante 5 minutos com 100 mM de AAS (para prevenir

a formação de prostaglandinas, endoperóxidos e tromboxanos), e centrifugado a 900 ´g

durante 10 minutos para obtenção do “pellet” de plaquetas. O “pellet” de plaquetas foi de

seguida ressuspenso em 1ml de tampão Tyrode-Hepes modificado cuja composição (em

mM ) é a seguinte: (134) NaCl, (3) KCl, (12) NaHCO3, (1) MgCl2.6H2O, (0.34) NaH2PO4,

(5) Hepes, (5) D-Glucose, H2O q.b.p. 1L (pH 7,4). Ao tampão foi adicionado apirase (20

mg ml-1) e posteriormente incubado durante 2 minutos com IBMX (10 mM), um inibidor da

fosfodiesterase, para se impedir qualquer degradação expontânea dos nucleótido.

Foram retirados 100 ml para contagem do número de plaquetas e a uma alíquota de

200 ml da amostra foram adicionados 1800 ml de uma solução de etanol a 72%, aguardou-

se 5 minutos à temperatura ambiente, após o que se procedeu a uma centrifugação a 1200

´g durante 15 minutos a 4ºC. Após decantação do sobrenadante no qual se encontrava o

extracto de GMPc, este foi evaporado à secura a 23ºC num banho de areia. O extracto seco

foi reconstituído em tampão acetato de sódio (50mM, pH 6,2) e acetilado com uma solução

de anidrido acético:trietilamina (1:2, v/v) antes de ser analisado.

As concentrações de GMPc nos sobrenadantes foram determinadas através de um

método enzimoimunológico utilizando um “Kit” específico da R&D Systems, após

acetilação das amostras e padrões de acordo com as instruções do fabricante.

A leitura foi efectuada em sistema de micro-ELISA Mios Merck e os níveis de

GMPc, calculados a partir da curva de calibração efectuada para cada “Kit”, foram

expressos em pmol de GMPc por 109plaquetas.

151

Capítulo III_________________________________________________________________________

C - Reagentes Todos os reagentes foram obtidos através da Sigma Chemicals Co. (St. Louis,

E.U.A.).

Os kits de imunoensaio foram adquiridos na R&D Systems (McKindley Place,

E.U.A.).

Em todas as preparações (soluções e tampões) foi utilizada água ultra-pura.

O principio activo CsA foi gentilmente cedido pela NOVARTIS, Portugal.

152


D - Resultados

1. Determinação dos teores arteriais de

NO

A - Efeitos do tratamento com a CsA

A administração diária de 5 mg/Kg de CsA, durante o período do tratamento (4

semanas), conduziu a uma diminuição do conteúdo de monóxido de azoto nos dois

segmentos de aorta de rato estudados, quando comparado com os valores obtidos nos

respectivos segmentos do grupo controlo (Fig. 1.1):

a) quer na artéria total (segmento vascular integro):

grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pgmgprot-1

grupo CsA: 4,6* ± 0,7 pgmgprot-1 (p<0,05)

Fig. 1.1 Teor arterial total de NO de ratos controlo e de ratos tratados com CsA

(5 mg/Kg/dia), após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=

10, para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em

relação ao grupo controlo. * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo.

153

Capítulo III_________________________________________________________________________

b) quer no segmento da artéria após remoção do endotélio, ainda que de forma

tendencial:


grupo CsA: 2,0 ± 0,2 pgmgprot-1

Fig. 1.2 Teor de NO no segmento arterial desprovido de endotélio de ratos controlo

e de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia), após 4 semanas de tratamento. Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados também foram

apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo. * (p<0,05) grupo CsA vs

grupo controlo.

Em termos percentuais, o tratamento com a CsA levou a uma diminuição de

cerca de 30% (p<0,05) do conteúdo de NO na artéria total, se considerarmos que ao

segmento total da aorta do grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pgmgprot-1 correspondem 100%

(Fig. 1.1).

154


Verifica-se que na aorta do grupo controlo após remoção do endotélio o teor de

NO ficou apenas em 41% do valor inicial (Fig. 1.3):

segmento total do grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pgmgprot-1 (100%)

segmento da aorta desprovido de endotélio do grupo controlo: 2,7 ± 0,3

pgmgprot-1 (41%)

Isto é, no grupo controlo com a remoção do endotélio perderam-se 3,9 pgmgprot-1

(59%) de NO presente no segmento vascular total, e no restante tecido vascular ficaram

2,7 pgmgprot-1 (41%) de NO residual.

0

2

4

6

8

NO

Art

eria

l (pg

/mg

prot

.)

Com Endotélio

Grupo Controlo

Sem Endotélio

41%

100%

Fig. 1.3 Relação entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de

endotélio do conteúdo de NO arterial, no grupo de ratos controlo, após 4 semanas de

tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados também foram

apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria.

155

Capítulo III_________________________________________________________________________

No grupo tratado com a CsA, com a remoção do endotélio perderam-se 2,6

pgmgprot-1 (56%) de NO encontrado no segmento vascular total e no restante tecido

vascular ficaram 2,0 pgmgprot-1 (44%) de NO (Fig. 1.4):

segmento total : 4,6 ± 0,7 pgmgprot-1 (100%)

segmento desprovido de endotélio: 2,0 ± 0,2 pgmgprot-1 (41%)

Fig. 1.4 Relação do conteúdo de NO arterial entre o segmento total da artéria e o

segmento desprovido de endotélio, no grupo de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após

4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10); os dados

também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento total da artéria.

Isto é, a quantidade de NO residual nos segmentos vasculares após a remoção do

endotélio é em proporção semelhante à encontrada nos segmentos vasculares em que o

endotélio não foi removido.

Tal significará, por isso, muito provavelmente que a redução de 30% no conteúdo

de NO no tratamento com a CsA se deverá à menor produção de NO endotelial, perda

deste para o espaço vascular e/ou aumento da sua degradação.

156


0

2

4

6

8

**

59%59%

Distribuição Monóxidode Azoto Endotélio/Músculo liso

41%43%

57%

30%

Endotélio

Endotélio

MúsculoLiso

**

**

*Efeito da CsA

MúsculoLiso

Controlo CsA

NO

Art

eria

l (pg

/mgp

rot.)

Fig. 1.5 Distribuição do teor de NO arterial entre o endotélio e o músculo liso no

grupo de ratos controlo e no grupo tratado com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de

tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo); os dados

também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao grupo controlo e em

relação ao segmento total da artéria em cada grupo. * (p<0,05), **(p<0,01) grupo CsA vs

grupo controlo.

157

Capítulo III_________________________________________________________________________

B- Efeitos do tratamento com a L-arginina

No grupo de ratos tratados com a L-arginina (Fig. 1.6), verificou-se que em relação

aos teores do grupo controlo, esta não alterava o conteúdo de NO no segmento total do

vaso:


grupo L-arginina: 6,0 ± 0,7 pgmgprot-1

mas a quantidade que se encontrava no endotélio era significativamente menor já que a

maioria se virá a encontrar nos restantes tecidos vasculares (Fig. 1.7):


grupo L-arginina: 4,5 ± 1,1 pgmgprot-1

Controlo CsA L-Arg L-Arg+ CsA

0

2

4

6

8

NO

Art

eria

l (pg

/ mgp

rot.)

Aorta Total

*

†

Fig. 1.6 Teor arterial total de NO nos grupos de ratos: controlo, tratados com CsA

(5 mg/Kg/dia), administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e tratados com CsA (5

mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L) no final do tratamento (4 semanas). Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) diferentes grupos vs

grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA.

158


Assim, após a remoção do endotélio a perda em NO (25%) (Fig. 1.7) foi menor à

verificada no grupo controlo (59%)(Fig. 1.4)

Fig. 1.7 Relação entre o segmento total da artéria e o segmento desprovido de

endotélio do conteúdo de NO arterial, no grupo de ratos administrados com L-arginina

(1,25 mg/L) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n=

10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao segmento

total da artéria.

Tal, pode-nos levar a pressupor que a L-arginina poderá levar a um maior fluxo

de NO para as camadas subendoteliais e vasculares, para uma maior utilização deste a

esse nível.

159

Capítulo III_________________________________________________________________________

C- Efeitos do tratamento com L-arginina e CsA

Quando os valores obtidos no grupo de ratos aos quais se administrou

conjuntamente a CsA e a L-arginina são comparados com os valores do grupo da CsA,

verifica-se que a nível da aorta total existem diferenças (Fig.1.6):


grupo L-arginina + CsA: 6,7† ± 0,4 pgmgprot-1 (p<0,05)

uma vez que a administração simultânea de L-arginina “impediu” a diminuição do

conteúdo arterial de NO que ocorre no grupo da CsA. Isto é, a diminuição dos teores de

NO encontrados para o grupo da CsA isoladamente foi completamente revertida quando

se lhe associou a L-arginina.

A remoção do endotélio nos grupos controlo e CsA resultou em idêntica

percentagem nas duas camadas vasculares (59% no endotélio e 41% no músculo liso) (Fig.

1.3 e 1.4). Contudo, no grupo da L-arginina e CsA, o valor encontrado após a remoção do

endotélio foi ainda ligeiramente inferior (perda de apenas 46%) (Fig. 1.8).

160


Fig. 1.8 Relação do conteúdo de NO arterial entre o segmento total da artéria e o

segmento desprovido de endotélio, no grupo de ratos tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) e

L-arginina (1,25 mg/L) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ±

e.p.m. (n= 10); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação ao

segmento total da artéria.

Ou seja, após remoção do endotélio, parece ocorrer um “impedimento”, ainda

que apenas tendencial, para que o efeito da CsA se manifeste quando a L-arginina é

administrada conjuntamente com a CsA:


grupo L-arginina + CsA: 3,6 ± 0,6 pgmgprot-1

161

Capítulo III_________________________________________________________________________

2. Determinação dos teores arteriais de GMPc

Os teores arteriais de GMPc dos ratos tratados com CsA foram muito inferiores

aos do grupo de ratos controlo. De facto, a administração diária de CsA, durante quatro

semanas, conduziu à diminuição de cerca de 67% (p<0,01) do conteúdo de GMPc nos

segmentos de aorta total, quando comparados com os do grupo controlo (Fig. 2.1):

grupo controlo: 22,0 ± 2,2 pmolmprot-1 (100%)

grupo CsA: 7,2** ± 0,5 pmolmprot-1 (33%) (p<0,01)

Este comportamento está de acordo com a diminuição no conteúdo de NO que se

verifica quando se compara o mesmo segmento do grupo controlo (6,6 ± 0,5 pgmgprot-1)

(100%) e do grupo ao qual se administrou a CsA (4,6* ± 0,7 pgmgprot-1) (41%) (p<0,05)

(Fig.1.6). No entanto, a percentagem perdida em GMPc (67%) é substancialmente maior

do que a perda em NO (30%), sugerindo, uma vez mais, um efeito da CsA não apenas na

síntese a nível endotelial como também nos processos que ocorrem no músculo liso

vascular.

Fig. 2.1 Teor arterial de GMPc de ratos controlo e de ratos tratados com CsA (5

mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10,

para cada grupo); os dados também foram apresentados em percentagem (%) em relação

ao grupo controlo. ** (p<0,01) grupo tratado com CsA vs grupo controlo.

162


No grupo de ratos ao qual se administrou L-arginina, não se verificaram

alterações no conteúdo arterial de GMPc, em relação ao grupo controlo (Fig. 2.2):

grupo controlo: 22,0 ± 2,2 pmolmprot-1

grupo L-arginina: 23,7 ± 5,8 pmolmprot-1

Quando os teores de GMPc do grupo da L-arginina + CsA são comparados com

os obtidos no grupo ao qual se administrou somente CsA (Fig. 2.2):

grupo da CsA: 7,2 ± 0,5 pmolmprot-1

grupo da L-arginina + CsA: 24,2** ± 6,5 pmolmprot-1(p<0,01)

verifica-se que estes já apresentam diferenças significativas: parece que a L-arginina

quando é administrada conjuntamente com a CsA não deixa esta “actuar”, ou seja a

L-arginina impede a diminuição do conteúdo de GMPc arterial desencadeada pela CsA.

163

Capítulo III_________________________________________________________________________

0

5

10

15

20

25

30

35G

MPc

Art

eria

l (pm

ol/m

gpro

t.)

ControloCsAL-ArgL-Arg+CsA

** †

Fig. 2.2 Teor arterial de GMPc de ratos controlo, ratos tratados com CsA (5

mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados com CsA

(5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), no final do tratamento (4 semanas). Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupos tratados vs

grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA.

Tal comportamento, poderá sugerir que também a nível do GMPc, o principal

sistema efector da acção do NO a nível vascular, a L-arginina conseguirá “neutralizar” o

efeito da administração da CsA.

164


3. Determinação dos níveis plaquetares de NO

3.1 Ensaios ex vivo

Antes do início do tratamento (semana 0), o teor de NO nas plaquetas dos ratos do

grupo controlo era similar ao teor de NO nas plaquetas dos ratos que depois foram sujeitos

aos diferentes tratamentos ao longo das quatro semanas de duração do estudo (Fig. 3.1):

grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq.

grupo CsA: 25,9 ± 2,0 nmol10-9plaq.

grupo L-arginina: 26,3 ± 2,1 nmol10-9plaq.

grupo L-arginina + CsA: 28,0 ± 1,3 nmol10-9plaq.

Com as determinações efectuadas após duas semanas de administração dos

diferentes tratamentos, verificou-se que estes não desencadearam qualquer alteração no

teor de NO das plaquetas, quando os níveis de NO dos diferentes grupos são comparados

com os determinados no grupo controlo (Fig. 3.1):





165

Capítulo III_________________________________________________________________________

Os resultados obtidos após quatro semanas de tratamento, isto é, no final das

administrações (Fig. 3.1), mostram que no grupo de ratos aos quais se administrou a CsA,

os teores plaquetares de NO se encontram aumentados em relação aos valores do grupo

controlo:


grupo CsA: 35,0** ± 2,3 nmol10-9plaq. (p< 0,01)

No grupo de ratos aos quais se administrou a L-arginina o teor de NO plaquetar

mantêm-se semelhante ao do grupo controlo:



Quando os teores de NO do grupo da L-arginina + CsA são comparados com os

obtidos no grupo ao qual se administrou somente CsA (Fig. 3.1):



verifica-se que a L-arginina não impediu o aumento de NO intraplaquetar que a CsA

isoladamente provocara.

166


0

10

20

30

40

50

0 2 4

ControloCsAL-ArgL-Arg+CsA

NO

Pla

quet

ar(n

mol

/109 pl

aq.)

** †

Fig. 3.1 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato controlo, ratos tratados com CsA (5

mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados com CsA

(5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento. Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupos tratados vs

grupo controlo. † (p<0,05) grupo tratado com CsA e L-arginina vs grupo CsA.

Quando se analisam os resultados, apresentados no Fig. 3.2, verifica-se que,

embora a administração de CsA leve ao aumento do teor de NO nas plaquetas destes ratos:


grupo CsA: 35,0** ± 2,3 nmol10-9plaq. (p<0,01)

não se encontram alterações na relação entre o teor de NO que é efluído da plaqueta:



167

Capítulo III_________________________________________________________________________

e o que fica retido no interior desta após o efluxo:



se bem que, num e noutro caso, tendencialmente os valores sejam superiores nos grupos

tratados com CsA.

0

10

20

30

40

50

NO

Pla

quet

ar(n

mol

/109 pl

aq.) Controlo

CsA

Total Efluído Intraplaquetar

**

Fig. 3.2 Conteúdo de NO nas plaquetas nos rato (total, efluído e intraplaquetar)

controlo e tratados com CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). ** (p<0,01) grupo tratado com

CsA vs grupo controlo.

168


3.2 Ensaios in vitro

Também foi estudado o efeito da adição in vitro de CsA (0,1 mM), concentração

que corresponde à obtida com a dose utilizada in vivo, no conteúdo de NO plaquetar para

se poder confirmar ou não os resultados obtidos com a CsA in vivo. Verificou-se que com

a adição de CsA (0,1 mM) ocorreu um aumento da concentração do NO produzido pelas

plaquetas (Fig. 3.3), à semelhança do efeito verificado nos estudos ex vivo:

Grupo controlo: 27,0 ± 1,9 nmol10-9plaq.

Grupo CsA: 40,1* ± 9,2 nmol10-9plaq. (p< 0,05)

Mas, desta vez, esse aumento foi acompanhado por um aumento na quantidade de

NO efluído por estas, durante a incubação com CsA:


Grupo CsA: 31,6** ± 9,4 nmol10-9plaq. (p< 0,01)

sem alteração significativa das quantidades de NO retido no interior das plaquetas:


Grupo CsA: 8,5 ± 0,8 nmol10-9plaq.

169

Capítulo III_________________________________________________________________________

0

10

20

30

40

50


NO

Pla

quet

ar(n

mol

/109 pl

aq.)

ControloCsA


***

Fig. 3.3 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato (total, efluído e intraplaquetar) “não

estimuladas” (basal) e nas plaquetas de ratos incubadas com CsA (0,1 µM). Dados

apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05), ** (p<0,01) grupo

CsA vs grupo controlo (basal).

Neste ponto, os efeitos diferem dos verificados nos estudos ex vivo, uma vez que,

embora nestes ocorra um aumento da produção de NO nas plaquetas, estas não libertam

NO em maior quantidade, uma vez que, o conteúdo intraplaquetar de NO é idêntico ao

encontrado no grupo de ratos controlo.

170


Ainda nos estudos in vitro, as plaquetas foram também incubadas nas mesmas

condições mas em meios aos quais se adicionaram dois controlos positivos diferentes e

dois inibidores da NOS na produção de NO.

Nas plaquetas às quais se adicionou a L-arginina, o substrato da via da

L-arginina:NO, observou-se um aumento no teor de NO produzido em relação ao teor

“basal” das plaquetas não “estimuladas” do grupo de controlo (Fig. 3.4):


grupo L-arginina: 41,0* ± 6,9 nmol10-9plaq. (p< 0,05)

As plaquetas incubadas num meio contendo IL e LPS, indutores da enzima NOSi,

também apresentaram um aumento da quantidade de NO produzido por estas (Fig. 3.4):


grupo IL + LPS: 44,8* ± 6,9 nmol10-9plaq. (p< 0,05)

Quando as plaquetas foram incubadas com os diferentes inibidores, o L-NNA,

(inibidor “específico” da NOSe) ou com a aminoguanidina (inibidor “específico” da

NOSi), estas apresentaram uma reactividade semelhante com qualquer um deles, ou seja,

um teor total de NO tendencialmente inferior ao do grupo controlo mas não

estatisticamente significativo (Fig. 3.4):


grupo L-NNA: 19,8 ± 3,0 nmol10-9plaq.

grupo aminoguanidina: 20,7 ± 2,6 nmol10-9plaq.

171

Capítulo III_________________________________________________________________________

0

10

20

30

40

50

60N

OPl

aque

tar

(nm

ol/1

09 pla

q.)

Ctrl

L-Arg IL+LPS

L-NNA Amg

CsA

** *

Fig. 3.4 Conteúdo de NO nas plaquetas de rato em condições basais e após

incubação com: L-arginina (0,2 mM); IL (20 ngml-1) + LPS (1 µgml-1); L-NNA (0,1 mM);

aminoguanidina (2 mM) e CsA (0,1 µM). Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10,

para cada grupo). * (p<0,05) diferentes grupos vs grupo controlo (basal).

172


4. Determinação dos níveis plaquetares de

GMPc

Antes do início do tratamento, o conteúdo de GMPc nas plaquetas dos ratos do

grupo controlo era similar ao conteúdo de GMPc nas plaquetas dos ratos que depois foram

sujeitos aos diferentes tratamentos ao longo das quatro semanas de duração do estudo

(Fig. 4.1) :

grupo controlo: 2,7 ± 0,2 pmol10-9plaq.

grupo CsA: 2,7 ± 0,7 pmol10-9plaq.

grupo L-arginina: 3,1 ± 0,5 pmol10-9 plaq.

grupo L-arginina + CsA: 2,6 ± 0,4 pmol10-9plaq.

Com as determinações efectuadas após duas semanas de administração dos

diferentes tratamentos, verificou-se um aumento significativo no nível de GMPc das

plaquetas de ratos tratados com a CsA e que a administração de L-arginina não

desencadeou qualquer alteração estatisticamente significativa no conteúdo de GMPc das

plaquetas, quando os níveis deste são comparados com os existentes no grupo controlo,

embora fosse tendencialmente maior. Já com a associação de L-arginina e CsA tais teores

revertem a resposta à CsA, voltando a valores estatisticamente semelhantes aos do controlo

(Fig. 4.1):


grupo CsA: 6,8* ± 1,6 pmol10-9plaq. (p< 0,05)

grupo L-arginina: 5,4 ± 1,7 pmol10-9plaq.

grupo L-arginina + CsA: 4,3 ± 0,5 pmol10-9plaq.

173

Capítulo III_________________________________________________________________________

Os resultados obtidos após 4 semanas de tratamento (Fig. 4.1), mostram-nos que no

grupo de ratos aos quais se administrou a CsA, os conteúdos plaquetares de GMPc se

mantinham aumentados em relação aos valores do grupo controlo, à semelhança do obtido

ao fim das 2 primeiras semanas de tratamento :


grupo CsA: 7,3** ± 1,1 pmol10-9plaq. (p< 0,01)

mas os níveis do GMPc das plaquetas dos ratos tratados com CsA eram ainda mais

elevados do que os encontrados após as duas primeiras semanas de administração da CsA.

No grupo de ratos aos quais se administrou a L-arginina, o conteúdo plaquetar de

GMPc mantêm-se semelhante ao do grupo controlo:


grupo L-arginina: 3,1 ± 1,0 pmol10-9plaq.

Mas, mais uma vez e agora ainda mais claramente quando se comparam os

conteúdos plaquetares do grupo da CsA com os do grupo tratado conjuntamente com a

mesma dose de CsA e com L-arginina, verifica-se que os teores plaquetares de GMPc são

francamente inferiores e semelhantes aos do controlo (Fig. 4.1):

grupo CsA (T4): 7,3 ± 1,1 pmol10-9plaq.

grupo L-arginina + CsA (T4): 3,3* ± 1,2 pmol10-9plaq. (p< 0,05)

174


0

2

4

6

8

10

0 2 4 (Semanas)

GM

Pc P

laqu

etar

(pm

ol/1

09 plaq

.)ControloCsAL-ArgL-Arg+CsA

* **

†

Fig. 4.1 Concentrações plaquetares de GMPc de ratos controlo, ratos tratados com

CsA (5 mg/Kg/dia), ratos administrados com L-arginina (1,25 mg/L) e de ratos tratados

com CsA (5 mg/Kg/dia) e L-arginina (1,25 mg/L), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento.

Dados apresentados em médias ± e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05), ** (p<0,01)

grupos tratados vs grupo controlo; † (p<0,05) grupo tratado com L-Arg. + CsA vs grupo

CsA.

Isto é, a administração de L-arginina em simultâneo com a CsA impede o efeito

atribuído à CsA.

175

Capítulo III_________________________________________________________________________

E - ComentáriosCom os resultados obtidos neste estudo, ou seja, uma diminuição de cerca de 30%

(p<0,05) do teor de NO na aorta total do grupo tratado com a CsA em relação ao conteúdo

de NO do grupo controlo, que se considerou corresponder a 100%, parece lógico assumir

que a hipertensão arterial induzida neste modelo animal, através da administração durante

um período de quatro semanas de uma dose de 5 mg/Kg/dia de CsA é, pelo menos em

parte, causada pela deficiência em NO e GMPc a nível arterial, facto que sugere que a via

vasodilatadora da L-arginina:NO:GMPc está enfraquecida. A diminuição da produção

vascular de NO permite o aumento da resistência vascular periférica.

A administração prévia de um suplemento exógeno de L-arginina ao grupo tratado

com CsA impede que o teor de NO e de GMPc diminua (grupo CsA: 4,6 ± 0,7 pgµgprot -1

vs grupo CsA + L-Arg.: 6,7 ± 0,4 pgµgprot-1; grupo CsA: 7,2 ± 0,5 pmolµgprot-1 vs grupo

CsA + L-Arg.: 24,2** ± 6,5 pmolµgprot-1, respectivamente), ou seja, a L-arginina foi capaz

de preservar a capacidade vascular de formação de NO e de GMPc, o que está de acordo

com o possível efeito protector do tratamento com a L-arginina na produção de NO e no

relaxamento dependente do endotélio.

Estes dados estão de acordo com os obtidos em alguns estudos até agora realizados.

Por exemplo, Khalil e col. (1996) relatam que a injecção de CsA directamente nas

artérias coronárias de cães causava vasoconstrição através de “mecanismos miogénicos e

dependentes do endotélio”; Sudhir e col. (1994) descrevem que a injecção aguda de CsA

“diminui a libertação de factores de relaxamento dependentes do endotélio nas coronárias

epicárdicas e de resistência dos cães ”; Richards e col. (1990) mostraram que a incubação

de vasos de resistência subcutâneos com a CsA em humanos, inibia o relaxamento

dependente do endotélio, experimentando a resposta à acetilcolina; Vaziri e col. (1998)

descrevem uma acentuada diminuição na excreção urinária de NOx o que sugere uma

diminuição na produção de NO; Gallego e col. (1993) mostraram que a administração

crónica de CsA induz uma disfunção endotelial em anéis de aorta femoral do rato e um

decréscimo do relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina, o qual

seria corrigido pela incubação das artérias do rato com a L-arginina; Oriji e col. (Oriji,

176


1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999) descrevem que o NO2/NO3 e o GMPc

(que medeia a acção do NO) se encontravam diminuídos tanto na urina como nos anéis

aórticos de ratos tratados com a CsA, que a administração crónica de L-arginina revertia os

efeitos da CsA quer in vitro quer in vivo e que a administração crónica de CsA enfraquecia

a acção vasodilatadora do endotélio; Yang e col. (1998) também descrevem que a CsA

diminui a excreção urinária de metabolitos do NO em ratos, mas que um suplemento

exógeno de L-arginina, aumentava a produção urinária de NO; Bartholomeusz e col.

(1996) também referem uma diminuição da excreção urinária de nitritos/nitratos.

As alterações desencadeadas pela administração de CsA podem ocorrer em

variados locais:

1. Redução da concentração (por diminuição da sua biodisponibilidade ou por

redução da sua captação pelas células endoteliais) ou diminuição do uso da L-

arginina.

Já foi demonstrado que o tratamento com a CsA está associado a alterações físico-

químicas na estrutura da membrana (Fahr, Nimmerfall e Wenger, 1994; Keelan e col.,

1993). Estas alterações físicas e/ou químicas da membrana podem influenciar a actividade

dos transportadores de membrana, nomeadamente o transportador da L-arginina.

Os efeitos tóxicos da CsA nas respostas dependentes do endotélio são reversíveis

pela administração de L-arginina, o substrato do NO (Mathieu e col., 1997; Prieto e col.,

1997). Alguns estudos descrevem que a L-arginina é capaz de reverter a disfunção vascular

desencadeada pela administração de CsA (Gallego e col., 1993), assim como o

enfraquecimento do vasorelaxamento dependente do endotélio (Lee e col., 1999). Tal

efeito pode ser devido ao aumento da recaptação da L-arginina com o consequente

aumento da cascata do NO:GMPc.

A CsA pode limitar a quantidade de substrato disponível para a NOS ou pode inibir

a NOS de forma competitiva e tal pode ser torneado pela presença de um excesso de

substrato.

177

Capítulo III_________________________________________________________________________

Na ausência de L-arginina, a NOS reduz o O2 a H2O2 ou a O2-. Assim, é possível

que a hiperactividade da NOS induzida pela CsA se deva a um stress oxidativo, o qual

poderá contribuir para os efeitos vasoconstrictores e para a lesão provocada pela CsA. A L-

arginina pode prevenir estes efeitos deslocando a NOS da acção redutase do O2 para a sua

função fisiológica

Tem sido descrito que o endotélio possui L-arginina suficiente para a produção

basal de NO, mas não para a indução da NOSi após estimulação, como um estímulo por

lesão.

Neste não se avaliou se a administração de L-arginina conseguiria reverter a acção

da CsA, uma vez que a administração de L-arginina foi iniciada 5 dias antes do início do

tratamento com a CsA e não após este. Mas pôde verificar-se que a L-arginina foi capaz de

prevenir os efeitos devidos ao tratamento dos ratos com CsA, ou seja a diminuição do NO

(grupo controlo: 6,6 ± 0,5 pgmgprot-1 vs grupo CsA: 4,6* ± 0,7 pgmgprot-1 vs grupo

L-arginina + CsA: 6,7† ± 0,4 pgmgprot-1) e do GMPc (grupo controlo: 22,0 ± 2,2

pmolmgprot-1 vs grupo CsA: 7,2* ± 0,5 pmolmgprot-1 vs grupo L-arginina + CsA: 24,2† ±

6,5 pmolmgprot-1) da aorta.

2. Redução da concentração ou da actividade das duas enzimas do NO.

Alguns estudos propõem que as alterações da calcineurina intracelular, devidas à

CsA, medeiam tanto a vasoconstrição como os mecanismos imunossupressores (Sander e

Victor, 1995).

A diminuição da formação de NO em ratos tratados com a CsA pode estar

relacionada com o efeito da CsA no bloqueio da forma constitutiva da NOS dependente do

complexo Ca2+/calmodulina, uma vez que esta se liga à calcineurina (Amore e col., 1995;

Dawson e col., 1993).

A CsA é permeável nas membranas, mas é biologicamente inerte até se ligar ao

seu receptor citoplasmático, a ciclofilina, uma imunofilina (Walsh, Zydowsky e

McKeon, 1992). O alvo celular do complexo CsA-ciclofilina é a calcineurina, uma

fosfatase dependente do Ca2+ (Klee, Crouch e Krinks, 1979) e da calmodulina, a qual é

inibida por este complexo (Liu e col., 1991).

178


Já foi demonstrado que a calcineurina e as imunofilinas existem mesmo mais nos

tecidos não linfóides, como no sistema nervoso (Steiner e col., 1992), no músculo liso

vascular (Dawson, Boland e Holmes, 1993) e no rim (Otsuka e col., 1994). Como estes

são os principais locais alvo para a toxicidade induzida pela CsA, em especial na

hipertensão arterial, a inibição da calcineurina nestes diferentes tecidos pode mediar a

hipertensão induzida pela CsA.

A enzima NOS é um substracto da calcineurina in vitro (Dawson e col., 1993),

existindo a possibilidade da CsA interferir com a NOS, responsável pela síntese de NO,

que é dependente do Ca2+ e da calmodulina. Este facto sugere um possível mecanismo

para explicar o efeito inibidor da CsA na vasodilatação induzida pelo NO. Contudo, os

dados são conflituosos acerca de quando é que a desfosforilação mediada pela

calcineurina aumenta (Busse, Luckhoff e Mülsch, 1991; Förstermann e col., 1991),

diminui (Dawson e col., 1993; Mittal e Jadhau, 1994; Zhang e Steiner, 1995), ou não

apresenta qualquer efeito na actividade da NOS in vitro (Marumo e col., 1995). Além

disso, o significado fisiológico in vivo ainda terá que ser avaliado.

Foi sugerido que a CsA inibe a NOSi ao nível do seu ARNm nas células

musculares lisas vasculares de rato (Marumo e col., 1995) que descreve que a CsA não

diminui a estabilidade da NOSi mas afecta sobretudo a sua transcrição. A expressão

vascular da NOSi encontrava-se inibida (Lee e col., 1999), facto concordante com os

estudos de Marumo e col. (1995), nos quais a administração aguda de CsA inibia a indução

da NOS nas células musculares lisas da aorta de ratos ou que a administração de CsA

durante 3 semanas resultava numa redução marcada do ARNm da NOSi vascular, assim

como da expressão proteica (Vaziri e col., 1998), os quais sugeriam que a CsA exercia uma

inibição na transcrição da NOSi na vasculatura. A CsA inibe a NOSi, quer a sua actividade

(Conde e col., 1995) quer a sua expressão (Kunz e col., 1995).

Pelo contrário, alguns estudos mostram quer a inexistência de alteração ou mesmo

um aumento da expressão e da actividade da NOS (López-Ongil e col., 1996). Estes

observaram um aumento da síntese de NO na presença da CsA e descrevem que não existe

déficit na expressão da NOSe mas sim um pequeno aumento da sua actividade após a

exposição de células endoteliais aórticas bovinas à CsA. A expressão da NOSe não era

afectada de forma significativa pelo tratamento com a CsA (Lee e col., 1999), facto

apoiado por Vaziri e col. (1998), que não observaram uma alteração da abundância

179

Capítulo III_________________________________________________________________________

proteica de NOSe na aorta torácica após 3 semanas de tratamento com a CsA; Amore e col.

(1995) também descrevem que não ocorre alteração na “síntese de novo” da proteína

NOSe após a administração crónica de CsA. Contudo, a massa proteica da NOSe pode não

estar correlacionada com a actividade enzimática. A diminuição da formação de NO pode

estar correlacionada com uma interferência da CsA na activação dependente do Ca2+ da

NOSe.

Assim, ainda que os dados encontrados na literatura sejam muito dispares, poderá

verificar-se neste estudo não apenas a diminuição do substracto ou da sua utilização mas

também, uma alteração da actividade das enzimas que sintetizam o NO, as NOS.

3. Aumento da degradação local de NO por aumento da formação de radicais

livres de O2 ou por outro tipo de radicais.

O NO é um radical livre que pode participar em diferentes tipos de reacções redox,

algumas das quais medeiam os seus efeitos biológicos como a reacção que é responsável

pela activação da guanilciclase, mas outro tipo de reacções podem limitar a sua actividade.

A inactivação do NO ocorre essencialmente através de reacções oxidativas mediadas pelos

intermediários reactivos de O2, incluindo o superóxido e o peróxido de hidrogénio (Kelm,

1999). Estes intermediários são encontrados numa grande variedade de alterações

vasculares, incluindo a hipertensão arterial e na disfunção endotelial que sustenta ou

acompanha esta (Zalba e col., 2000).

O radical livre NO é formado exclusivamente pela enzima NOS. Mas, em certas

condições, a NOS pode gerar superóxidos. A formação de superóxidos pela NOSe é

mediada pelo grupo heme do seu domínio oxigenase e depende da presença do seu

substrato, a L-arginina, e do co-factor BH4; quando existe abundância dos dois, a NOSe

produz NO; mas quando a abundância de um deles é relativamente baixa, a NOSe gera

superóxidos. Além disso, a NOSi também pode gerar superóxidos através do seu domínio

reductase.

O mecanismo de redução selectiva da pressão sanguínea por sequestração do O2-

não é conhecido. Uma possível explicação pode ser a de que o O2- pode inactivar o NO e

assim bloquear esta via vasodilatadora.

180


O sistema do citocromo P-450 é sugerido como sendo uma fonte de formação de

radicas livres dependentes da CsA (Ashmed e col., 1995; Inselmann e col., 1991; L’Azou e

col., 1999). Este sistema forma aniões superóxido (O2-) e peróxido de hidrogénio (H2O2)

sob certas condições (Halliwell e Gutteridge, 1999). Uma vez que a CyP3A é a única

enzima capaz de metabolizar a CsA, esta parece ser um “candidato” óbvio para a formação

de intermediários reactivos de oxigénio. Além disso, já foi demonstrada a existência das

isoenzimas CyP3A1 e CyP3A2 nas células musculares lisas vasculares do rato, um

potencial local de actuação da CsA na hipertensão (Nguyen e col., 1999). Mas estes

estudos utilizaram doses de CsA acima das concentrações terapêuticas normalmente

utilizadas na prática clínica e, assim, a formação de intermediários reactivos de oxigénio

pode não ser a causa do aumento da contracção das células musculares lisas desencadeada

por esta. Contudo, não pode ser excluído o facto de que a formação local deste tipo de

substâncias pode contribuir para a sinalização de processos que levam ao aumento da

vasoconstrição (Avdonin e col., 1999). Além disso, os estudos de McGrath e col. (1997)

demonstraram que doentes transplantados, tratados com CsA, apresentavam sinais de stress

oxidativo determinado pela expressão alterada de enzimas antioxidantes.

Assim, parece que a CsA é capaz de formar intermediários reactivos de oxigénio.

Mas, os radicais formados não derivam directamente da molécula de CsA nem parecem ser

derivados da mitocôndria nem do metabolismo da CsA mediado pela CyP, antes parecem

ser formados tanto no fígado como no rim e nas células de cultura, incluindo as células

vasculares. Um dos principais radicais formados parece ser o O2-, o qual é reduzido em

radical ˙OH nos sistemas biológicos.

Neste estudo, quando se adicionou a L-arginina ao tratamento com a CsA, esta

poderá ter impedido a formação de aniões superóxido com o concomitante aumento da

produção de NO.

4. Diminuição da difusão do NO a partir do endotélio para as células da íntima

e/ou diminuição da sensibilidade do músculo liso vascular às substâncias

vasodilatadoras.

Para além das possibilidades já expostas para explicar uma diminuição do conteúdo

vascular de NO, poderá ocorrer uma diminuição da difusão de NO formado no endotélio

181

Capítulo III_________________________________________________________________________

para as células musculares onde se transforma em GMPc e promove as funções de

vasorelaxamento.

Contudo, os resultados deste trabalho parecem afastar esta possibilidade.

Assim, a CsA diminui (cerca de 30% como se viu), o conteúdo de NO em aorta

total. Este decréscimo não modificou a relação entre o conteúdo medido na tira da aorta

desprovida de endotélio e a tira total estudada no grupo controlo, pelo que é provável que a

CsA não interfira com o fluxo de NO produzido pelo endotélio para o músculo liso.

5. Diminuição da interacção entre o NO e a guanilciclase e da transdução de

sinal pelo NO, pela diminuição da actividade da guanilciclase e a subsequente

limitação do aumento dos níveis intracelulares de GMPc.

Em diferentes estudos descritos na literatura, o relaxamento independente do

endotélio não se encontra alterado, uma vez que a resposta aos dadores exógenos de NO se

encontra preservada (Bossaller e col., 1989; Diederich, Yang e Lüscher, 1992; Sudhir e

col., 1994). Assim, parece que a resposta do músculo liso ao NO não é influenciada pelo

tratamento com a CsA.

Não obstante, também já foi relatado que a administração de CsA por períodos

prolongados diminui o vasorelaxamento ao nitroprussiato de sódio, um dador de NO

(Huang e Detwiller, 1987).

Os estudos de Rego e col. (1990) sugerem que a CsA actua directamente no

músculo liso vascular, diminuindo na aorta do rato, a vasodilatação mediada pelo GMPc.

A CsA atenua de forma significativa a formação vascular de GMPc. Assim,

parece que os passos que ocorrem após a formação de NO também possam ser afectados

pela CsA. A actividade da guanilciclase por si só também pode estar inibida pela CsA, o

que resulta numa inadequada estimulação da formação de GMPc em resposta ao NO.

Mas, os estudos de Caramelo e col. (1995), descrevem que nos vasos tratados

com CsA, a adição de um excesso de L-arginina ao meio, além de conseguir restabelecer

a produção normal de GMPc, ainda alcançou valores acima dos normais. Assim, parece

que a alteração produzida pela CsA não deve afectar a guanilciclase.

182


No modelo usado por Mathieu e col. (1997), o vasorelaxamento desencadeado

pela nitroglicerina, um agente independente do endotélio e mediado pelo GMPc, não se

encontrava significativamente diminuído após a administração de CsA.

Nos estudos de Gallego e col. (1994), a L-arginina preservava a formação de

GMPc induzida pelo nitroprussiato de sódio, um dador não enzimático de NO. Assim, a

actividade da guanilciclase solúvel não deveria estar alterada.

Contudo, no nosso trabalho salienta-se o facto de ter ocorrido uma diminuição de

GMPc (67%) na aorta total do grupo CsA vs controlo superior à perda em NO (30%). Se

parece afastada a hipótese de alteração do transporte de NO entre o endotélio e o

músculo liso, não se poderá excluir a hipótese de alteração ao nível do mecanismo de

síntese do GMPc na camada muscular. Ora, isto estaria de acordo com um efeito

combinado da CsA nos processos de síntese de NO no endotélio e nos processos de

formação de GMPc a partir de NO, contribuindo para a elevada perda de GMPc

relativamente ao NO. Esta explicação suporta um efeito exacerbado da CsA sobre toda a

via L-Arg:NO:GMPc vascular, ou seja no endotélio mas também no músculo liso.

Em conjunto, pode sugerir-se que os mecanismos através dos quais a CsA altera a

função vascular devem ser multifactoriais, incluindo a actividade da NOS e da

guanilciclase.

Se a aorta de rato tratado com ciclosporina, durante quatro semanas, está apta a

um estado hipertensivo, a plaqueta, caso pudesse influenciar este estado, estaria apta a

contribuir para o estado inverso. A ciclosporina causa em aorta e em plaqueta variações

do conteúdo de NO que não se assemelham. Na verdade, os conteúdos de NO e de

GMPc aumentam significativamente nas plaquetas e assim, as plaquetas não “imitam” o

comportamento da aorta nem em relação ao NO nem ao GMPc.

A variação dos níveis de NO e de GMPc plaquetares induzida pela CsA, embora

seja a inversa da verificada na aorta, não parece derivar de um mecanismo compensatório

passivo. Se fosse este o caso, não se compreenderia que in vitro a CsA provocasse um

aumento significativo de NO. In vivo, as alterações, pese embora não tão marcadas, são

semelhantes pelo que, haja compensação ou não, aquela dependerá muito mais de um

183

Capítulo III_________________________________________________________________________

mecanismo activo do que um mecanismo passivo. Quando se estudaram os níveis de

GMPc nas plaquetas, o aumento foi ainda maior do que o verificado com o NO, mas segue

o comportamento que ocorre para este factor; contudo, convém mencionar que em relação

ao GMPc os teores plaquetares ao fim de duas semanas de tratamento já apresentaram um

aumento significativo em relação aos teores do grupo controlo, enquanto que os teores do

NO às duas semanas apresentaram um aumento ainda pequeno em relação ao grupo

controlo. Este dado parece reforçar a hipótese já avançada de um efeito da CsA não apenas

a nível da síntese endotelial do NO como também do seu metabolismo no músculo liso,

com formação de GMPc.

A CsA aumenta a agregação plaquetar (Furchgott e Zawadzki, 1980). Na

literatura, podem encontrar-se variados estudos sobre os efeitos da CsA na agregação

plaquetar, mas os resultados nem sempre são concordantes. A alteração da agregação

plaquetar pode desempenhar um importante papel na variação da pressão arterial

induzida pela CsA. O aumento da formação de agregados nos vasos periféricos pode ser

um mecanismo do aumento da resistência vascular.

Além disso, o tratamento com a CsA aumenta a libertação de TXA2 das plaquetas

(Grace e col., 1987). Assim, tem sido sugerido que esta alteração do metabolismo das

prostaglandinas possa explicar a activação crónica in vivo e a hiperagregabilidade in

vitro de pacientes que tomam CsA.

O TXA2 é o principal produto de activação da COX nas plaquetas e funciona

através do 2º mensageiro, o Ca2+. Nas plaquetas, o aumento do TXA2 verificado num

estado de hiperactivação plaquetar, já descrito por outros autores e confirmado com

trabalhos anteriores do nosso grupo (Reis, tese de mestrado 1999), pode aumentar a

concentração intracelular do Ca2+. Mas a CsA pode aumentar este através de outras vias.

O aumento do Ca2+ no citoplasma está associado às alterações bioquímicas que

culminam na activação das plaquetas. De facto, o Ca2+ apresenta uma papel crucial nos

processos que conduzem à activação das plaquetas e às consequentes respostas

funcionais, como as reacções de libertação e de agregação, e este pode também activar a

NOS plaquetar, aumentando a concentração do NO das plaquetas. Assim, a possível

184


interacção entre a actividade da COX e da NOS e do papel central do Ca2+ nesta

interacção não pode ser descartada.

Existem variados estudos que demonstram o aumento do Ca2+ nas plaquetas em

doentes e animais tratados com CsA (Haller e col., 1994; Reis, tese de mestrado 1999).

Além disso, o AMPc e o GMPc são dois dos principais reguladores da inibição das

plaquetas; nomeadamente através do influxo e da libertação intracelular de Ca2+, podem

desempenhar um papel decisivo na homeostase do Ca2+.

Em condições de disfunção endotelial, como as por nós verificadas, a própria

produção de NO pelas plaquetas pode tornar-se importante na regulação da resposta das

plaquetas, nomeadamente na modulação e inibição da sua activação.

O aumento do NO e consequentemente o do GMPc encontrado irá levar à

diminuição dos níveis de Ca2+ intracelular e assim actuar como mecanismo de retrocontrolo

negativo intraplaquetar que previne a activação e agregação excessiva das plaquetas e/ou

como mecanismo hemodinâmico intrínseco que protege a parede do vaso da vasoconstrição

induzida pela CsA. Muito embora este último possa ocorrer para compensar o déficit de

NO e de GMPc arterial observado, tal não deverá ser provável, uma vez que através dos

estudos in vitro se verificou que a CsA apresenta um efeito directo no aumento da

formação de NO e de GMPc das plaquetas.

A administração de L-arginina per si não alterou nem o teor de NO nem o teor de

GMPc quer a nível vascular quer a nível plaquetar, no que se concorda com outros autores

(Oriji, 1999; Oriji e Keiser, 1998; Oriji e Keiser, 1999). Assim, somos levados a supor que

não é necessário um suplemento exógeno de L-arginina para se atingir a sua magnitude

normal. De facto, parece que a L-arginina existe em abundância no organismo, em

concentrações que excedem o Km da NOS e, assim, a adição exógena de L-arginina não

deverá levar à formação de mais NO.

Contudo, na presença do agente agressor CsA, à semelhança do verificado a nível

vascular, a nível das plaquetas a administração conjunta da L-arginina e da CsA parece

“neutralizar” o efeito desencadeado pelo tratamento com CsA per si. Tal facto é importante

185

Capítulo III_________________________________________________________________________

pois poderá significar que esta possa “ajudar” a reverter o efeito hipertensor atribuído ao

uso da CsA.

186


III PGI2 – factor vasorelaxante e inibidor

da agregação plaquetar

A. IntroduçãoNão obstante a contribuição da PGI2 para o relaxamento dependente do endotélio

ser negligenciável na maior parte dos vasos sanguíneos, sendo o seu efeito essencialmente

aditivo ao do NO, a prostaciclina é também um importante factor vasodilatador derivado

do endotélio e inibidor da activação plaquetar. A PGI2 será mesmo o mais potente inibidor

endógeno da agregação plaquetar e, assim, um importante regulador da função das

plaquetas.

De facto, alguns estudos demonstram que a PGI2 não contribui de forma

significativa para o relaxamento dependente do endotélio desencadeado pela acetilcolina

(Bassange e Heusch, 1990; Shimokawa e col., 1996), visto que, embora ocorra a libertação

de PGI2 durante o fluxo pulsátil, o nível de PGI2 libertado é inferior às elevadas

quantidades que são necessárias para induzir o relaxamento. Mas, como os efeitos

cardiovasculares exercidos pelo NO são muitas vezes mediados em conjunto com outro

importante factor vasodilatador e inibidor da adesão das plaquetas, libertado pelas células

endoteliais, a PGI2, fomos também estudar as alterações que esta poderia apresentar quer a

nível vascular quer a nível plasmático. Além do mais, a libertação de PGI2 é independente

do GMPc.

A PGI2 forma-se durante a bioconversão do ácido araquidónico pela cicloxigenase

e exerce os seus efeitos vasodilatadores e antitrombóticos activando a adenilciclase e

aumentando os níveis de AMPc. A capacidade da CsA de se inserir na bicamada lipídica

da membrana celular e activar a fosfolipase A2 sugere uma possível interferência deste

fármaco com o metabolismo do ácido araquidónico.

A implicação dos produtos da cicloxigenase também tem sido investigada em

variados estudos, mas também até agora não existe um consenso.

187

Capítulo III_________________________________________________________________________

Os estudos de Hansen e col. (1999) descreveram um aumento da excreção urinária

de todos os metabolitos do ácido araquidónico medidos nesse estudo em humanos (TXB2,

6-ceto-PGF1α e PGE2), após o tratamento com a CsA. Este dado sugere uma activação do

sistema enzimático da cicloxigenase, causando um aumento não específico tanto das

prostaglandinas vasodilatadores como das prostaglandinas vasoconstrictoras. Tal facto está

de acordo com outros estudos realizados em animais que relatam um aumento da excreção

urinária de 6-ceto-PGF1α, TXB2 e PGE2 com a utilização de CsA (Hansen e col., 1999;

Rigotti e col., 1991; Smeester e col., 1988).

B. Metodologia

1. Determinação dos teores arteriais de

6-ceto-PGF1a

Uma vez que a PGI2 apresenta uma semi-vida muito curta em condições

fisiológicas, a sua formação é quantificada através da determinação da de 6-ceto-PGF1α, o

produto equimolar estável da metabolização da PGI2, o qual é usado como indicador

directo da produção de PGI2.

Os segmentos arteriais de 2-3 mm de espessura foram colocados em solução

tampão cuja composição em (mmol/L) é: 100 NaCl, 4 KCl, 25 NaHCO3, 2.1 Na2SO4, 20

citrato de sódio e 50 TRIS, H2O q.b.p. 1L (pH 8,2) e incubados a 37ºC durante 5 minutos.

A solução tampão foi substituída e adicionada de ácido araquidónico (100 mmol/L), 5

minutos depois foi adicionada indometacina (100 mmol/L). O tecido foi então seco e

pesado e no sobrenadante foi determinada a 6-ceto-PGF1α que é o produto estável da

degradação de PGI2 por imunoensaio (De La Cruz e col., 1997).

Os teores arteriais de 6-ceto-PGF1α foram quantificados através de “Kits” de

imunoensaio R&D Systems. O imunoensaio tem por base o princípio da ligação

competitiva. A 6-ceto-PGF1α presente nas amostras e uma quantidade fixa de 6-ceto-

188


PGF1α marcada com fosfatase alcalina competem pelo mesmo anticorpo. Durante a

incubação, o anticorpo liga-se a outro anticorpo que está aderente à micro-placa. Segue-se

a lavagem para remover o excesso de amostra conjugada e não ligada. Em seguida

adiciona-se o substrato da enzima e verifica-se o aparecimento de cor, seguindo-se a leitura

da absorvância a 405 nm. A intensidade da cor é inversamente proporcional à concentração

de 6-ceto-PGF1α na amostra.

As concentrações arteriais de 6-ceto-PGF1α obtém-se por média das contagens em

duplicado de cada amostra por interpolação a partir da curva padrão.

Os resultados foram expressos em ng por mg de aorta.

2. Determinação dos teores plasmáticos de

6-ceto-PGF1a

Após colheita de sangue em tubos heparinizados, este foi de imediato centrifugado

a 1100 ´g durante 15 minutos em filtros Centricon (YM 10,000 NMWL, Millipore Corp.,

Bedford, MA), durante 1 hora a 5000 ´g.

Os teores plasmáticos de 6-ceto-PGF1α foram quantificados através de “Kits” de

imunoensaio R&D Systems seguindo o protocolo já descrito anteriormente.

Os valores das concentrações plasmáticas de 6-ceto-PGF1α das amostras foram

calculados por extrapolação da curva padrão.

Os resultados foram expressos em ng ml-1.

C. Reagentes Todos os restantes reagentes foram obtidos através da Sigma Chemicals Co. (St.

Louis, E.U.A.).

189

Capítulo III_________________________________________________________________________

Os kits de imunoensaio foram adquirido na R&D Systems (McKindley Place,

E.U.A.).

Em todas as preparações (soluções e tampões) foi utilizada água ultra-pura.

D. Resultados

1. Determinação dos teores arteriais

6-ceto-PGF1a

Os níveis de 6-ceto-PGF1α na aorta de ratos tratados durante 4 semanas com a CsA

5 mg/Kg/dia, foram inferiores ao do grupo de ratos controlo (Fig. 1.1):

grupo controlo: 53,0 ± 6,1 pg/mg aorta

grupo da CsA: 26,8* ± 5,2 pg/mg aorta (p<0,05)

0

10

20

30

40

50

60

PGI 2

Art

eria

l (pg

/mg

aort

a)

Controlo CsA

*

Fig. 1.1 Concentração arterial de PGI2 de ratos controlo e de ratos tratados com

CsA (5 mg/Kg/dia) após 4 semanas de tratamento. Dados apresentados em médias ± e.p.m.

(n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo.

190


2. Determinação dos teores plasmáticos

6-ceto-PGF1a

Em relação ao conteúdo de 6-ceto-PGF1α, verificou-se que os teores plasmáticos no

início do tratamento eram semelhantes no grupo controlo e no grupo ao qual iria ser

administrada durante 4 semanas a CsA 5 mg/Kg/dia (Fig. 2.1):

grupo controlo: 0,81 ± 0,1 ngml-1

grupo CsA: 0,79 ± 0,1 ngml-1

Após as duas primeiras semanas de tratamento, os níveis plasmáticos de 6-ceto-

PGF1 α do grupo de ratos tratados com a CsA eram mais elevados do que os do grupo

controlo de ratos (Fig. 2.1):


grupo CsA: 1,7* ± 0,05 ngml-1 (p<0,05)

No final do tratamento (4 semanas), no grupo da CsA este aumento era ainda

maior quando comparado com o grupo controlo (Fig. 2.1):


grupo CsA: 2,0* ± 0,2 ng ml-1 (p<0,05)

191

Capítulo III_________________________________________________________________________

Fig. 1.2 Concentrações plasmáticas de PGI2 de ratos controlo e ratos tratados com

CsA (5 mg/Kg/dia), nas semanas 0, 2 e 4 de tratamento. Dados apresentados em médias ±

e.p.m. (n= 10, para cada grupo). * (p<0,05) grupo CsA vs grupo controlo.

192


E. ComentáriosJá foi descrito que a CsA altera o metabolismo do ácido araquidónico nas células

endoteliais (Brown e Neild, 1987; Brown, Neild e Lewis, 1990; Voss e col., 1988) e nas

células musculares lisas vasculares (Kurtz e col., 1987), desencadeando uma diminuição

da produção do agente inibidor das plaquetas PGI2, facto que também foi verificado

também neste trabalho.

Variados estudos sugerem que o NO estimula a actividade da COX, levando a um

aumento da produção de metabolitos da COX (Salvemini e col., 1995a; Salvemini e col.,

1995b; Salvemini, Currie e Mollace, 1996), nomeadamente a formação de PGI2 a nível

endotelial e o vasorelaxamento mediado pelo AMPc nos segmentos aórticos de rato é,

pelo menos em parte, mediado pelo NO produzido nas células endoteliais.

Assim, a diminuição do NO encontrada também pode impedir, se bem que não de

forma directa, a formação de um outro factor vasodilatador, a PGI2, agravando ainda

mais o aumento da resistência vascular periférica através da diminuição do relaxamento

mediado pelo endotélio.

Com os valores obtidos na medição de 6-ceto-PGF1α podemos referir que a

concentração arterial de PGI2 se encontra diminuída em relação aos valores do grupo

controlo (grupo CsA: 26,8 ± 5,2 ng/mg aorta vs grupo controlo: 53,0 ± 6,1 ng/mg aorta) e

que esta diminuição também deverá contribuir para o aumento da resistência vascular

periférica encontrada no nosso modelo.

O aumento da concentração de PGI2 plasmática é já mais difícil de explicar.

Todavia poderá pensar-se que, por um qualquer mecanismo compensatório, isto é, esse

aumento (eventualmente por uma mais rápida saída do endotélio para o plasma) poderá ir

desempenhar um qualquer papel como inibidor da hiperreactividade plaquetar

desencadeada pelo tratamento com a CsA. Aliás, quer o aumento do GMPc plaquetar por

nós encontrado, quer o aumento do AMPc plaquetar verificado por outro estudo do nosso

193

Capítulo III_________________________________________________________________________

grupo de trabalho (Reis, tese de mestrado 1999), contribuirão também para a inibição das

plaquetas, tentando “restaurar” a reactividade excessiva manifestada por estas.

Estes resultados, porém, deverão ser reavaliados e alvo de novos estudos tendentes

à sua confirmação.

194

CAPÍTULO IV

SÍNTESE E CONCLUSÕES

Síntese e conclusões_________________________________________________________________________

A Ciclosporina é um agente

imunossupressor que previne a

rejeição do órgão transplantado ao

impedir a activação e proliferação

dos linfócitos T, mediante a inibição

da síntese das linfocinas. O mecanismo de acção da CsA é baseado na inibição da actividade da fosfatase da

calcineurina. Desta forma, evita-se a desfosforilação do NF-ATc das células T,

imprescindível na translocação ao núcleo e no início da síntese de interleucina-2.

Desde o aparecimento da CsA na prática clínica que a maioria dos protocolos de

imunossupressão nos transplantes se baseiam neste fármaco.

Não obstante, o tratamento com a CsA é acompanhado de importantes efeitos

secundários como a hipertensão arterial e a toxicidade renal e os seus efeitos causam

problemas clínicos críticos que limitam a extensão do seu uso em algumas outras doenças

imunológicas. O desenvolvimento de hipertensão arterial durante o tratamento com CsA é

um facto quase “universal” que ocorre tanto em transplantados como em não

transplantados.

Um dos aspectos mais preocupantes da toxicidade provocada pelo uso da CsA é a

possibilidade de que os efeitos tóxicos estejam directamente relacionados ou sejam

idênticos aos efeitos imunossupressores . Será que ao tentar uma atitude terapêutica que

bloqueie a toxicidade da CsA não se esteja a fazer o mesmo com o efeito terapêutico do

fármaco. A resposta ainda não está dada e passará pela elucidação dos mecanismos

intracelulares da toxicidade da CsA.

197

Capítulo IV_________________________________________________________________________

A hipertensão arterial aparece com concentrações sanguíneas normais (necessárias

para garantir uma óptima imunossupressão) e requer tratamento farmacoterapêutico.

O mecanismo pelo qual a CsA provoca hipertensão continua por esclarecer, pelo

menos na sua totalidade. Contudo, hoje é evidente que o mecanismo não deverá depender

exclusivamente de um determinado factor ou de efeitos desencadeados num determinado

sistema, antes será uma patologia com uma causa multifactorial.

Na hipertensão, o relaxamento dependente do endotélio apresenta-se reduzido nos

modelos experimentais assim como nos pacientes. Os mecanismos são complexos e

envolvem, entre outras, uma redução na produção de NO, um aumento da produção de

prostaglandinas vasoconstritoras e possivelmente uma alteração na libertação ou na acção

de outros factores de relaxamento como o factor hiperpolarizante derivado do endotélio

(EDHF).

Hoje, sabe-se que o NO é um multifacetado mensageiro celular, ubiquísta e “sem

igual”, envolvido na regulação de diversos processos fisiológicos incluindo a

contractilidade do músculo liso, a reactividade plaquetar, a neurotransmissão central e

periférica e as acções citotóxicas das células imunológicas. O NO é crucial para muitas

funções fisiológicas e uma libertação “desregulada” deste mediador tem sido relacionada

com variadas patologias.

Do nosso estudo, devem realçar-se os seguintes aspectos:

1. A administração de CsA, na dose de 5 mg/Kg/dia, induziu hipertensão

arterial no nosso modelo animal experimental, reproduzindo o desenvolvimento de

hipertensão arterial encontrada em doentes sujeitos ao tratamento clínico com a CsA.

2. A hipertensão arterial induzida pela CsA no rato caracterizou-se por um

aumento da pressão arterial média, apresentando ao mesmo tempo um aumento da pressão

198


arterial sistólica e um aumento da pressão arterial diastólica, sem alteração da frequência

cardíaca.

3. Se se adicionar a L-arginina, o substrato da NOS, ao tratamento com a CsA,

o aumento da pressão arterial sistólica é semelhante aquele que se atinge com o uso de

CsA. Mas, o aumento da pressão arterial diastólica é apenas parcialmente anulado.

4. Os principais parâmetros hematológicos avaliados não mostraram diferenças

significativas entre os ratos do grupo controlo e os ratos tratados com CsA.

5. Os estudos bioquímicos na aorta de ratos tratados com CsA evidenciaram

que esta induz alterações que parecem ser subjacentes, se não mesmo determinantes, para a

hipertensão arterial idiopática:

um decréscimo de cerca de 30% no conteúdo de NO no segmento total da

aorta em relação ao grupo controlo. Tal facto poderá indiciar um bloqueio da síntese e/ou

maior libertação endotelial de NO, podendo este ocorrer em qualquer um dos passos desta;

um decréscimo de cerca de 66% no conteúdo de GMPc no segmento total da

aorta em relação ao grupo controlo. Este dado pode sugerir que além da modificação da

síntese do NO a nível endotelial, a sua efectividade também pode estar comprometida.

Além deste facto, convém salientar que a acção da CsA também deverá manifestar-se

directamente sobre a formação de GMPc;

a hiperreactividade vascular, pelo menos resultante da diminuição destes

factores, é contrariada pela administração de L-arginina;

199

Capítulo IV_________________________________________________________________________

um decréscimo de 45% no conteúdo de PGI2 no segmento total da aorta em

relação ao grupo controlo o qual tal deverá contribuir para o aumento da resistência

vascular periférica e para o aumento da tensão arterial diastólica.

Tais variações poderão contribuir para a hipertensão arterial induzida pela CsA,

sobretudo se ocorrerem também nos vasos de resistência, porque provavelmente o

relaxamento diminui. Além disso, a diminuição da produção vascular de NO aumenta

necessariamente a resistência vascular periférica ao reduzir o tónus vasodilatador.

6. Os estudos bioquímicos nas plaquetas indicam que os ratos tratados com

CsA apresentam em relação ao grupo de ratos controlo:

um aumento do conteúdo de NO plaquetar.

um aumento do teor de GMPc plaquetar.

o que provavelmente lhe induz um estado não reactivo ou “antihiperreactivo”. Aliás,

parece ser essencialmente este último, porque há alterações morfológicas das plaquetas

encontradas pelo nosso grupo de trabalho, embora insipientes e indiciadas pela formação

de pseudópodes, dismorfia e alteração da estrutura membranar, indicadoras de um estado

reactivo.

7. Os teores plasmáticos de PGI2 no grupo de ratos tratados com CsA estavam

aumentados em relação aos do grupo controlo e uma vez que esta é o principal inibidor da

agregação das plaquetas, o seu aumento poderá contribuir para a contraregulação do estado

hiperactivo das plaquetas.

Apesar da L-arginina reverter a diminuição de NO e de GMPc vascular e

normalizar os valores plaquetares, não previne de forma eficaz o desenvolvimento de

hipertensão arterial, quer da pressão arterial sistólica quer da pressão arterial diastólica.

Este dado parece indicar, tal como, extensamente discutido, a existência de outras passos

200


da via da L-arginina:NO:GMPc alterados pela administração da CsA e não apenas o

substrato da NOS.

Assim, deverá ser equacionada uma abordagem terapêutica com outro grupo de

dadores de NO que não se cinjam à simples suplementação do substrato.

201

Capítulo IV_________________________________________________________________________

202

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

Referências bibliográficas_________________________________________________________________________

BibliografiaAdmiraal PJ, Derkx FH, Jandanser AH et al. (1990). Metabolism and production of An-

giotensin I in different vascular beds in subjects with hypertension. Hypertension

15:44-45.

Alspaugh JA, Granger DL (1991). Inhibition of Cryptococcus neoformans replication by

nitrogen oxides supports the role of these molecules as effectors of macrophage-me-

diated cytostasis. Infect Immun 59:2291-2296.

Amore A, Gianoglio B, Ghigo D, Peruzzi L, Porcellini MG, Bussolino F, Costamagna C,

Cacace G, Picciotto G, Mazzucco G, Sena LM, Coppo R (1995). A possible role for

nitric oxide modulating the functional cyclosporine toxicity by arginine. Kidney Int

47:1507-1514.

Andoh TF, Burdmann EA, Bennett WM (1997). Nephrotoxicity of immunosuppressive

drugs: experimental and clinical observations. Semin Nephrol 17:34-35.

Änggard E (1994). Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. Lancet 343:1199-

1206.

Angus JA, Cocks TM (1989). Endothelium-derived relaxing factor. Pharmacol Ther

41:303-351.

Ashab I, Peer G, Blum M, Wollman Y, Chernihovsky D, laina A (1995). Oral administra-

tion of L-arginine and captopril in rats prevents chronic renal failure by nitric oxide

production. Kidney Int 47:1515-1521.

Ashmed SS et al (1995). Oxygen radical formation during cytochrome P450-catalysed

cyclosporine metabolism in rat and human liver microsomes at varying hydrogen ion

concentrations. Mol Cell Biochem 151:131-140.

Assis SM, Monteiro JL, Seguro AC (1997). L-arginine and allopurinol protect against cyc-

losporine nephrotoxicity. Transplantation 63(8): 1070-1073.

Auch-Schwelk W, Bossaller C, Götze J, Thelen J, Flecke E (1993). Endothelial and vascu-

lar smooth function after chronic treatment with cyclosporin A. J Cardiovasc Phar-

macol 21:435-444.

Avdonin PV et al (1999). Cyclosporine A up-regulates angiotensin II receptors and cal-

cium responses in human vascular smooth muscle cells. Kidney Int 55:2407-2414.

Bachmann S, Peters J, Engler E, Ganten D, Mullins J (1992). Transgenic rats carrying the

mouse renin gene-morphological characterization of a low-renin hypertension model.

Kidney Int 41(1):24-36.

205


Ballentyne CM, Bourge RC, Domalik LJ et al. (1998). Treatment of hyperlipidemia after

heart transplantation and rational for the Heart Transplant Lipid Registry. Am J Car-

diol 78:766-771.

Balligand JL, Godfraind T (1991). Endothelium-derived relaxing factor and muscle relax-

ing factor in rat aorta: action of cyclosporine A. J Cardiol Pharmacol 17(supp

3):S213-S221.

Barrett AJ, Kendra JR, Lucas CF, Joss DV, Joshi R, Pendharkar P, Hugh-Jones K (1982).

Cyclosporin A as a prophylaxis against graft-versus-host disease in 36 patients. Br

Med J 285:162-166.

Barrett ML, Willis AL, Vane JR (1989). Inhibition of platelet-derived mitogen release by

nitric oxide. Agents Actions 27(3-4):488-91.

Bartholomeusz B, Hardy kJ, Nelson AS, Phillips PA (1996). Bosentan ameliorates Cyc-

losporin A-induced hypertension. Hypertension 27:1341-1345.

Bassange E, Heusch G (1991). Endothelial and neurohumoral control of coronary blood

flow in health and disease. Rev Physiol Biochem Pharmacol 116:77-165.

Battistini B, D’Orleans-Juste P, Sirois P (1993). Endothelins: circulating plasma levels

and presence in other biologic fluids. Lab Invest 68:600-628.

Bech JN, Nielsen CB, Pedersen EB (1996). Effects of systemic NO synthesis inhibition on

RPF, GFR, UNa, and vasoactive hormones in healthy humans. Am J Physiol 270:

F845-F851.

Beckman JS, Beckman TW, Chen J, Marshall PA, Freeman BA (1990). Apparent hy-

droxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from

nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA 87:1620-1624.

Bellett M, Cabrol C, Sassano P, Leger P, Corvol P, Menard J (1985). Systemic hyperten-

sion after cardiac transplantation: Effect of cyclosporine on the renin-angiotensin-al-

dosterone systems. Am J Cardiol 56:927-931.

Belvisi MG, Stretton CD, Barnes PJ (1992). Nitric oxide is the endogenous neurotransmit-

ter of bronchodilator nerves in human airways. Eur J Pharmacol 210:221-222.

Benigni A, Chiabrando C, Piccinelli A, Perico N, Gavinelli M, Furci L, Patino O, Abbate

M, Bertani T, Pemuzzi G (1988). Increased urinary excretion of thromboxane B2 and

2,3-dinor-TxB2 in cyclosporin-A nephrotoxicity. Kidney Int 34:164-174.

206


Berg kJ, Forre O, Bjerkhoel F, Amundsen E, Djoseland O, Rugstad HE, Westre B (1986).

Side effects of cyclosporin A treatment in patients with rheumatoid arthritis. Kidney

Int 29:1180-1187.

Berger ED, Rauscher MAS, Rub N, Risler T, Erley CM (1998). Changes in renal hemody-

namics after systemic NO synthesis inhibition in healthy volunteers versus persons

with family history of hypertension or diabetes Abstract. J Am Soc Nephrol 9:351A.

Berkels R, Cordes A, Meyer D, Klaus W, Rosen R (1995). Caracterisation of an endogen-

ous L-arginine/NO pathway in platelets. Endothelium 3 Supp: S18.

Berridge MJ (1984). Biochem J 220:345-360.

Bertault-Peres P, Bonfils C, Fabre G, Just S, Cano JP, Maurel P (1987). Metabolism of

cyclosporine A II. Implication of the macrolide antibiotic inducible cytochrome P-

450 3c from rat liver microssomes. Drug Metab Dispos 15:391-398.

Blair IA, Barrow SE, Wadell KA et al. (1982). Prostacyclin is not a circulating hormone in

man. Prostaglandins 23:579-589.

Bobadilla NA, Tapia E, Franco M, Lopez P, Mendoza S, Garcia-Torres R, Alvarado JA,

Herrera-Acosta J (1994). Role of nitric oxide in renal hemodynamic abnormalities of

cyclosporin nephrotoxicity. Kidney Int 46: 773-779.

Body S (1996). Platelet activation and interactions with the microvasculature. J Cardiov

Pharmacol 27(Suppl 1):S13-S25.

Bokemeyer D, Friedrichs U, Backer A, Kramer HJ, Meyer-Lehnert H (1994). Cyclospor-

ine A enhances total cell calcium independent of Na-K-ATPase in vascular smooth

muscle cells. Clin Investig 72:992-995.

Borel JF, Feurer C, Gubler HU, Stahelin H (1976). Biological effects of cyclosporin A: a

new antilymphocyte agent. Agents Actions 6:468-475.

Borel JF, Feurer C, Magnee CU, Stahelin H (1977). Effect of the new antilymphocytic

peptide cyclosporin A in animals. Immunology 32:1017-1025.

Bossaler C, Forstermann U, Hertel R, Olbricht C, Reschke V, Fleck E (1989). Cyclosporin

A inhibits endothelium-dependent vasodilatation and vascular prostacyclin produc-

tion. Eur J Pharmacol 165: 165-169.

Boulanger C, Lüscher TF (1990). Release of endothelin from the porcine aorta. Inhibition

of endothelium-derived nitric oxide. J Clin Invest 85:587.

207


Broekman MJ, Eiroa AM, Marcus AJ (1991). Inhibition of human platelet reactivity by

endothelium-derived relaxing factor from human umbilical vein endothelial cells in

suspension: blockade of aggregation and secretion by an aspirin-insensitive mechan-

ism. Blood 78:1033-1040.

Brown Z, Neild GH (1987). Cyclosporin inhibits prostacyclin production by cultured hu-

man endothelial cells. Transplant Proc 19:1178.

Brown Z, Neild GH, Lewis GP (1990). Inhibition of prostacyclin formation by cyclospor-

ine is not due to reduced availability of arachidonic acid in membrane phospholipids

of cultured human endothelial cells. Biochem Pharmacol 39(6):1136.

Brune B, Lapetina EG (1989). J Biol Chem 264:8455-8458.

Brune B, Molina y Vedia L, Lapetina EG (1990). Agonista-induced ADP-ribosylation of a

cytosolic protein in human platelets. Proc Natl Acad Sci USA 87(9):3304-8.

Brune B, Ullrich V (1987). Mol Pharmacol 32:497-504.

Brynskov J, Freund L, Campanini MC, Kampmann JP (1992). Cyclosporine pharma-

cokinetics after intravenous and oral administration in patients with Crohn,s disease.

Scandinavian Journal of Gastroenterology 27:961-967.

Buchanan MR, Brister SJ (1991). Antithrombotics and the lipoxygenase pathway. In Anti-

thrombotics, edited by A.G. Herman, pp. 159-180. Kluwer Academic Publishers.

Bunchman TE, Brookshire CA (1991). Cyclosporin-induced synthesis of endothelin by

cultured human endothelial cells. J Clin Invest 88:310-314.

Bunchman TE, Mauer SM, Kim Y (1990). Effect of cyclosporin on generalized schwartz-

man reaction in diabetic rats. Diabetes 39:83-86.

Busse R, Luckhoff A, Mülsch A (1991). Cellular mechanisms controlling EDRF/NO form-

ation in endothelial cells. Basic Res Cardiol 2:7-16.

Busse R, Mülsch A, Fleming I, Hecker M (1993). Mechanisms of nitric oxide release from

the vascular endothelium. Circulation 87:V18-V25.

Butt E, Geiger J, Jarchau T, Lohmann SM, Walter U (1993). The cGMP-dependent pro-

tein-kinase gene, protein, and function. Neurochem Res 18:27-42.

Calne RY, White DJG, Thiru S, Evans DB, McMaster P, Dunn DC, Craddock GN,

Pentlow DB, Rolles K (1978). Cyclosporin A in patients receiving renal allografts

from cadaver donors. Lancet ii, 1323-1327.

208


Campbell WB, Gebremedhin D, Pratt PF, Harder DR (1996). Identification of

epoxyeicosatrienoic acids as endothelium -derived hyperpolarizing. Circ Res 78:415-

423.

Caramelo C, López Farré A, Villalón Garcia A, et al., (1995). Efectos tóxicos vasculares

de la ciclosporina A. Nefrologia 15 (suppl 1):61-66.

Cartier R, Dagenais F, Hollmann C, Cambron H, Buluran J (1994). Chronic exposure to

cyclosporine affects endothelial and smooth muscle reactivity in the rat aorta. Ann

Thorac Surg 58:789-794.

Cerletti C, Evangelista V, Molino M, de Caetano G (1995). Platelet activation by

polymorphonuclear leukocytes: role of cathepsin G and P-selectin. Thrombosis and

Haemostasis 74:218-223.

Chan BB, Kern JA, Flanagan TL, Kron IL, Tribble CG (1992). Effects of in vivo cyc-

losporine administration on endothelium-dependent responses in isolated vascular

rings. Circulation 86(suppl II):II295-II299.

Chen LY, Mehta JL (1995). Further evidence of the presence of constitutive and inducible

nitric oxide synthase isoforms in human platelets. J Cardiovasc Pharmacol 27:154-

158.

Chen LY, Mehta JL (1996). Further evidence of the presence of constitutive and inducible

nitric oxide synthase isoforms in human platelets. J Cardiovasc Pharmacol 27:154-8.

Cho HJ, Xie Q, Calaycay J (1992). Calmodulin is a subunit of nitric oxide synthase from

macrophages. J Exp Med 176:599-604.

Chu A, Chambers DE, Lin C, kuehl WD, Cobb FR (1990). Nitric oxide modulates epicar-

dial coronary basal vasomotor tone in awake dogs. Am J Physiol 258:H1250-H1254.

Clemetson kJ (1995). Platelet activation: signal transduction via membrane receptors.

Thrombosis and Haemostasis 74:111-116.

Clipstone NA, Crabtree GR (1992). Identification of calcineurin as a key signalling en-

zyme in T-lymphocyte activation. Nature 357:695-6973.

Clozel M, Kuhn H, Hefti F, Baumgartner HR (1991). Endothelial dysfunction and

subendothelial monocyte macrophages in hypertension. Effect of angiotensin con-

verting enzyme inhibition. Hypertension 18(2):132-41.

209


Cohen DJ, Loertscher R, Rubin MF, Tilney NL, Carpenter CB, Strom TB (1984). Cyc-

losporine: a new immunosuppressive agent for organ transplantation. Ann Intern Med

101:667-682.

Cohen H, Neild GH, Patel R, Mackie IJ, Machin SJ (1988). Evidence for chronic platelet

hyperaggregability and in vivo activation in cyclosporin-treated renal allograft recipi-

ents. Thromb Res 49:91-101.

Cohen RA, Vanhoutte PM (1995). Endothelium-dependent hyperpolarization: beyond

nitric oxide and cyclic GMP. Circulation 92:3337-3349.

Combalert J, Fabre I, Fabre G, Dalet I, Derancourt J et al. (1989). Metabolism of cyc-

losporin A. IV. Purification and identification of the rifampicin inducible human liver

cytochrome P450 (cyclosporin A oxidase) as a product of P450IIIA gene subfamily.

Drug Metabolism and Disposition 17:197-207.

Conde M, Andrade J, Bedoya FJ, Santa Maria C, Sobrino F (1995). Inhibitory effect of

cyclosporine A and FK506 on nitric oxide production by cultured macrophages: evid-

ence of a direct effect on nitric oxide synthase activity. Immunology 84:476-481.

Cornwell TL, Lincoln TM (1988). Regulation of phosphorilase a formation and calcium

content in aortic smooth muscle and smooth muscle cells. Effects of atrial natriuretic

peptide II. J Pharmacol Exp Ther 247:524-530.

Craven PA, DeRubertis FR (1978). Restoration of the responsiveness of purified

guanylate cyclase to nitrosoguanidine, nitric oxide, and related activators by heme

and hemoproteins. J Biol Chem 253:8433-8443.

Croen KD (1993). Evidence for antiviral effect of nitric oxide. Inhibition of herpes sim-

plex virus type 1 replication. J Clin Invest 91:2446-2452.

Curtis JJ, Dobovsky E, Whelchel JD, Luke RG, Diethelm AG, Jones P (1986). Cyc-

losporine in therapeutic doses increases renal allograft vascular resistence. Lancet

2:477-479.

Dawson TM, Steiner JP, Dawson VL, Dinerman JL, Uhi GR, Snyder SH (1993). Immun-

osuppresant FK506 enhances phosphorylation of nitric oxide synthase and protects

against glutamate neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA 90:9808-9812.

De La Cruz JP, González-Correa JÁ, Martín-Aurioles E, Ortiz P, de la Cuesta FS (1997).

Effects of S-adenosyl-L-methionine on platelet thromboxane and vascular prostacyc-

lin. Biochem Pharmacol 53:1761-1763.

210


Deng A, Baylis C (1993). Locally produced EDRF controls preglomerular resistance and

ultrafiltration coefficient. Am J Physiol 264(2 Pt 2):F212-5.

Desai KM, Sessa WC, Vane JR (1991). Invovement of nitric oxide in the reflex relaxation

of the stomach to accommodate food or fluid. Nature 351:477-479.

DeWitt DL, Meade EA, Smith WL (1993). PGH synthase isoenzyme selectivity: the po-

tential for safer nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Am J Med 95(suppl 2A):40S-

44S.

Diederich D, Skopec J, Diederich A, Dai FX (1994). Cyclosporine produces endothelial

dysfunction by increased production of superoxide. Hypertension 23(part 2):957-961.

Diederich D, Yang Z, Lüscher TF (1992). Chronic cyclosporine therapy impairs endothe-

lium-dependent relaxation in the renal artery of the rat. J Am Soc Nephrol 2:1291-

1297.

Dimmeler S, Lottspeich F, Brune B (1992). J Biol Chem 267:16771-16774.

Dinh Xuan AT, Fan TPD, Higenbottam TW, Walwork J (1990). Cyclosporin in vitro re-

duces endothelium-dependent relaxation to acetylcholine but does not affect relaxa-

tion to nitrovasodilators. Transplant Proc 22:1723-1725.

Djaffar I, Vilette D, Bray PF, Rosa JP (1991). Quantitative isolation of RNA from human

platelets. Thrombosis Research 62:127-135.

Drewe J, Beglinger C, Kissel T (1992). The absorption site of cyclosporin in the human

gastrointestinal tract. British Journal of Clinical Pharmacology 33:39-43.

Dudhir K, MacGregor JS, DeMarco T, DE Groot CJ, Taylor RN, Chou TM, Youc PG,

Chatterjee K (1994). Cyclosporine impairs release of endothelium-derived relaxing

factors in epicardial and resistance coronary arteries. Circulation 90:3018-3023.

Durane W, Droll MH, Vanhoutte PM, Schafer AI (1992). Endothelium-derived relaxing

factor inhibits thrombi-induced platelet aggregation by inhibiting platelet phospholi-

pase C Blood 79.110-116.

Dutz JP, Fruman DA, Burakoff SJ, Bierer BE (1993). A role for calcineurin in degranula-

tion of murine cytotoxic T lymphocytes. J Immunol 150:2591-2598

Fahr A (1993). Cyclosporine clinical pharmacokinetics. Clin Pharmacokinetic 24(6):472-

495.

211


Fahr A, Hiestand P, Ryffel B (1990). Studies on the biological activities of Sandimmun

metabolites in humans and in animal models: review and original experiments.

Transplantation Proceedings 22:1116-1124.

Fahr A, Nimmerfall F, Wenger R (1994). Interactions of cyclosporine and some derivat-

ives with model membranes: binding and ion permeability changes. Transplant Proc

26(5):2837-41.

Fan TPD, Lewis GP (1985). Mechanism of cyclosporin A-induced inhibition of prostacyc-

lin shyntesis by macrophages. Prostaglnadins 30:735.

Faraci FM, Brian JE Jr (1994). Nitric oxide and the cerebral circulation. Stroke 25(3):692-

703.

Faulds D, Goa KL, Benfield P (1993). Cyclosporin: a review of its pharmacodynamic and

pharmacokinetic properties, and therapeutic use in immunoregulatory disorders.

Drugs 45(6):953-1040.

Feelisch M, Noack EA (1987). Eur J Pharmacol 139:19-30.

Féletou M, Vanhoutte PM (1988). Endothelium-dependent hyperpolarization of canine

coronary smooth muscle. Br J Pharmacol 93:293-331.

Fernandes JB, Naik UP, Markell MS, Kornecki E (1993). Comparative investigation of

the effects of the immunosuppressants cyclosporine A, cyclosporine G and FK-506

on platelet activation. Cell Mol Biol Res 39:265-274.

Feutren G (1992). Clinical experience with sandimmune (cyclosporine) in autoimmune

diseases. Transplant Proc 24(Suppl 2):S55-60.

Filep JG, Herman F, Battistini B, Chabrier P E, Braquet P, Sirois P (1991). Antiaggregat-

ory and hypotensive effects of endothelin-1 in beagle dogs: role for prostacyclin. J

Cardiovasc Pharmacol 17(suppl 7):S216-214.

Fineman JR, Heymann MA, Soifer SJ (1991). N omega-nitro-L-arginine attenuates en-

dothelium-dependent pulmonary vasodilation in lambs. Am J Physiol 260(4 Pt

2):1299-306.

Firgaira FA, Cotton RGH, Danks DM (1981). Biochem J 197:31-43.

Fiscus R, Rapoport R, Murad F (1984). Endothelium-dependent and nitrovasodilator-in-

duced activation of cyclic GMP dependent protein kinase in the rat aorta. J Cyclic

Nucl Protein Phosphorylation Res 9:415-425.

212


Fiscus RR (1988). Molecular mechanisms of endothelium-mediated vasodilation. Sem

Thromb Hemost 14(suppl) 12-22.

Fishman SJ, Wylonis LJ, Glickman JD, Cook JJ, Warsaw DS, Fisher CA, Jorkasky DJ,

Niewiabrowski S, Addonizio VP (1991). Cyclosporine A augments human platelets

sensivity to aggregating agents by increasing fibrinogen receptor availability. J Surg

Res 51:93-98.

Fogo A, Hellings SE, Inagami T, et al. (1992). Endothelin receptor antagonism is protect-

ive in vivo acute cyclosporine toxicity. Kidney Int 42:770-774.

Forsberg EJ, Feuertein G, Shohami E, Pollard HB (1987). Adenosine triphosphate stimu-

lates inositol phospholipid metabolism and prostacyclin formation in adrenal

medullary endothelial cells by means of P2-purinergic receptors. Proc Natl Acad Sci

USA 84:5630-5634.

Förstermann U, Mugge A, Alheid U, Haverich A, Frolish JC (1988). Selective attenu-

ation of endothelium-mediated vasodilation in atherosclerotic human coronary arter-

ies. Circ Res 62:185-190.

Förstermann U, Pollock JS, Schmidt HH, Heller M, Murad F (1991). Calmodulin-de-

pendent endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase activity is present

in the particulate and cytosolic fractions of bovine aortic endothelial cells. Proc Natl

Acad Sci USA 88:1788-1792.

Foxwell B, Simon J, Herrero J et al. (1990). Anti-CD3 antibody-induced expression of

both p55 and p75 chains of the high affinity interleukin 2 receptor on human T

lymphocytes is inhibited by cyclosporin A. Immunology 69:104-109.

Furchgott RF (1984). The role of endothelium in the responses of vascular smooth muscle

to drugs. Annu Rev Pharmacol Tox 24:175-197.

Furchgott RF (1988). Studies on relaxation of rabbit aorta by sodium nitrite: the basis for

the proposal that the acid-activatable inhibitory factor from retractor penis is inor-

ganic nitrite and the endothelium-derived relaxing factor is nitric oxide. In Vanhoutte

PM (Ed): Vasodilatation: Vascular Smooth Muscle, Peptides, Autonomic Nerves and

Endothelium. Raven Press, New York, pp. 401-414.

Furchgott RF, Vanhoutte PM (1989). Endothelium-derived relaxing and contracting

factors. Faseb J 3:2007-2018.

213


Furchgott RF, Zawadzki JV (1980). The obligatory role of endothelial cells in the relaxa-

tion of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288:373-376.

Furie B, Furie BC (1995). The molecular basis of platelet and endothelial cell interaction

with neutrophils and monocytes: role of P-selectin and de P-selectin ligand, PSGL-1.

Thrombosis and Haemostasis 74(1):224-227.

Furlong B, Henderson AH, Lewis MJ (1987). Endothelium-derived relaxing factors inhib-

its in vitro platelet aggregation. Br J Pharmacol 90:687-692.

Furue M, Katz SI, Kawakami Y (1990). Coordinate expression of three family proto-on-

cogenes in T cell activation and its modulation by cyclosporine. J Immunol 144:736-

739.

Gaboury JP, Kubes P (1995). Endogenous antiadhesive molecules. In:Granger DN;

Schmid-Schonbein GW (eds). New York, Oxford: Leukocyte Adhesion, Oxford Uni-

versity Press 241-277.

Gallego MJ, Farre AL, Riesco A, Monton M, Grandes SM, Barat A, Hernando L, Casado

S, Caramelo CA (1993). Blockade of endothelium-dependent responses in conscious

rats by cyclosporin A: effect of L-arginine. Am J Physiol 264:H708-H714.

Gallego MJ, Garcia AL, Lopez AJ, Garcia JL, Placidad MG, Casado S, Hernando L,

Caramelo CA (1994). Mechanism of the endothelial toxicity of cyclosporine A: role

of nitric oxide, cGMP, and Ca2+. Circ Res 74:477-484.

Gardiner SM, Compton AM, Bennett T, Palmer RMJ, Moncada S (1990). Regional hae-

modynamic changes during oral ingestion of NG-monomethyl-L-arginine or NG-nitro

-L-arginine methyl ester in conscious Brattleboro rats. Br J Pharmacol 101:10-12.

Gardner JP, Tokudome G, Tomonari H, Maher E, Hollander D, Aviv A (1992). Endoth-

elin-induced calcium responses in human vascular smooth muscle cells. Am J Physiol

262:C148-C155.

Garg UC, Hassid A (1989). Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic

guanosine monophosphate inhibits mitogenesis and proliferation of cultured rat vas-

cular smooth muscle. J Clin Invest 83:1774-1777.

Garr MD, Paller MS (1990). Cyclosporin augments renal but not systemic vascular react-

ivity. Am J Physiol 258:F211-F217.

Garthwait J (1991). Glutamate, nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system.

Trends Neurol Sci 14:60-67.

214


George JN, Shattil SJ (1991). The clinical importance of acquired abnormalities of platelet

function. The New Engl J Med 324(1):27-39.

Gerkens JF (1989). Cyclosporine treatment of normal rats produces a rise in blood pres-

sure and decreased renal vascular responses to nerve stimulation, vasoconstrictors

and endothelium-dependent dilators. J Pharmacol Exp Ther 250:1105-1112.

Gerkens JF, Bhagwandeen SB, Dosen PJ, Smith AJ (1984). The effect of salt intake on

cyclosporine-induced impairment of renal function in rats. Transplantation (Bal-

timore) 84:412-417.

Gillespie JS, Liu X, Martin W (1990). The neurotransmitter of the non-adrenergic non-

cholinergic inhibitory nerves to smooth muscle of the genital system. In Nitric oxide

from L-arginine: A Biorregulatory System, ed. by S Moncada and EA Higgs, pp.

147-164, Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam.

Godfraind T (1986). EDRF and cyclic GMP control gating of receptor-operated calcium

channels in vascular smooth muscle. Eur J Pharmacol 126:341-343.

Golub MS, Lustig S, Berger ME, Lee DBN (1989). Altered responses in cyclosporin-

treated rats. Transplantation 48:116-118.

Gonzalez FJ (1992). Human cytochromes P450: problems and prospects. Trends Phar-

macol Sci 13:346-352.

Grace AA, Barradas MA, Mikhailidis DP, Jeremy JY, Moorhead JF, Sweny P, Dandona P

(1987). Cyclosporine A enhances platelet aggregation. Kidney Int 32:889-895.

Granelli-Piperno A, Andrus L, Steinman RM (1986). Lymphokine and non-lymphocytic

mRNA levels in stimulated TR cells: kinetics, mitogen requirements and effects of

cyclosporin A. J Exp Med 163:922-937.

Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnock JS, Tannenbaum SR (1982).

Analysis of nitrate, nitrite and [15N]nitrate in biological fluids. Anal Biochem

126:131-138.

Greenberg ML, Uretsky BF, Reddy PS, Bernstein RL, Griffith BP, Hardesty RL,

Thompson ME, Bahnson HT (1985). Long-term hemodynamic follow-up of cardiac

transplant patients treated with cyclosporine and prednisone. Circulation 71:487-494.

Grieff M, Loertscher R, Shohaib AS, Stewart DJ (1993). Cycloporin-induced elevation in

circulating endothelin-1 in patients with solid-organ transplantation. Transplantation

56:880-884.

215


Griffith TM, Edwards DH, Lewis MJ, Newby AC, Henderson AH (1984). The nature of

endothelium-derived vascular relaxant factor. Nature 308:645-647.

Gurecki J, Warty V, Sanghui A (1985). The transport of cyclosporine in association with

plasma lipoproteins in heart and liver transplant patients. Transplant Proc 17:1997-

2002.

Guyton A (1993). Fisiologia humana e Mecanismos das doenças. 5ª Ed., Guanabara

Koogan, Rio de Janeiro.

Haller H, Spies K, Lindschau C, Quass P, Distler A (1994). The effects of cyclosporine on

calcium protein kinase C and sodium proton exchange in platelets. Transplantation

57:1516-1520.

Hamilton DV, Carmichael DJS, Evans DB, Calne RY (1982). Hypertension in renal trans-

plant recipients on cyclosporin A and corticosteroids and azathioprine. Transplant

Proc 14:597-600.

Handschumacker RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW (1984). Cyclo-

philin: a specif cytosolic binding protein for cyclosporine A. Science 226:544-547.

Hansen JM, Fogh-Andersen N, Christensen NJ, Strandgaard S (1997). Cyclosporin-in-

duced hypertension and decline in renal function in healthy volunteers. J Hypertens

15: 319-326.

Hansen JM, Johansen NJ, Mollerup HM, Anderson NF, Strandgaard S (1999). Effects of

nitric oxide blockade and cyclosporin A on cardiovascular and renal function in nor-

mal man. J Hypertens 17: 1707-1713.

Hansen JM, Johansen NJ, Mollerup HM, Fogh-Andersen N, Strandgaard S (1999). Effects

of nitric oxide blockade and cyclosporin A on cardiovascular and renal function in

normal man. J Hypertens 17: 1707-1713.

Hathaway DR, Konicki MV, Coolican AS (1985). Phosphorylation of myosin light chain

kinase from vascular smooth muscle by cyclic AMP- and cyclic GMP-dependent pro-

tein kinases. J Mol Cell Cardiol 17:841-850.

Haudenschild CC, Prescott MF, Chobanian AV (1980). Effects of hypertension and its re-

versal on aortic intima lesions of the rat. Hypertension 2(1):33-44

Haug C, Duell T, Voisard R, Lenich A, Kolb HJ, Mickley V, Homback V, Grunert A

(1995). Cyclosporine A stimulates endothelin release. J Cardiovasc Pharmacol

26(suppl 3):S239-S241.

216


Haynes WG, Noon JP, Walker BR, Webb DJ (1993). L-NMMA increases blood pressure

in man. Lancet 342:931-932.

Hecker M, Sessa WC, Harris HJ, Änggard EE, Vane JR (1990). The metabolism of L-ar-

ginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing

factors: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc Natl Acad

Sci 87:8612-8616.

Hertel RF, Bossaller C (1989). Effects of chronic cyclosporine A treatment on the skin

microcirculation of conscious rats. Z Kardiol 78:suppl. 6, 92-94.

Hibbs Jr JB (1992). Overview of cytotoxic mechanisms and defense of the intracellular

environment against microbes. In The Biology of Nitric Oxide: Enzymology, Bio-

chemistry and Immunology, vol. 2, ed. by S Moncada, MA Marletta, JB Hibbs Jr,

and EA Higgs, pp. 201-206, Portland Press, London.

Hibbs Jr. JB, Taintor RR, Vavrin Z, Granger DL, Drapier JC, Amber IJ, Lancaster JR Jr

(1990). Synthesis of nitric oxide from a terminal guanidino nitrogen atom of L-argin-

ine: a molecular mechanism regulating cellular proliferation that targets intracellular

iron. In Nitric Oxide from L-arginine: A Biorregulatory System, ed. by Moncada and

EA Higgs, pp. 189-223, Elsevier, Amsterdam.

Hibbs Jr. JB, Taintor RR, Vavrin Z, Rachlin EM (1988). Nitric oxide: a cytotoxic actived

macrophage effector molecule. Bioch Biophys Res Commun 157:87-94.

Holmsen H (1977). Platelet energy metabolism in relation to function. In Platelets and

Thrombosis, ed. by DCB Mills and FI Paretti, pp. 45-62, Academic Press, New York.

Holt DW, Johnston A, Roberts NB, Tredger JM, Trull AK (1994). Methodological and

clinical aspects of cyclosporin monitoring: report of the Association of Clinical Bio-

chemists task force. Ann Clin Biochem 31:420-446.

Hoppu K, Koskimies O, Holmberg C, Hirvisalo EL (1991). Evidence for the pre-hepatic

metabolism of oral cyclosporine in children. Br J Clin Pharmacol 32:477-481.

Horstrup K, Jablonka B, Honig-Liedl P et al. (1994). Phosphorylation of focal adhesion

vasodilator-stimulated phosphoprotein at Ser 157 in intact human platelets correlates

with fibrinogen receptor inhibition. Eur J Biochem 225:21.

Hourani SMO, Cusak NJ (1991). Pharmacological receptors on blood platelets. Phar-

macol Rev 43:243-298.

217


Huang EM, Detwiller T (1987). Thrombin-induced phosphoinositide hydrolisis in plate-

lets. Receptor occupancy and desensitisation. Biochem J 242:11-18.

Huang HC, Rego A, Vargas R, Foegh ML, Ramwell PW (1987). Nitroprusside-induced

vascular relaxation is attenuated in organ-transplanted animals treated with cyc-

losporine. Transplant Proc 19:126-130.

Hultsch T, Albers MW, Schreiber SL, Hohman RJ (1991). Immunophilin ligands demon-

strate common features of signal transduction leading to exocytosis or transcription.

Proc Natl Acad Sci USA 88:6229-6233

Hunt SA (1983). Complications of heart transplantation. Transplant 3:70-74.

Huttner I, Gabbiani G (1982). Vascular endothelium: recent advances and unanswered

questions. Lab Invest 47(5):409-11.

Ignarro LJ (1990). Biosynthesis and metabolism of endothelium-derived nitric oxide.

Annu Rev Pharmacol Toxicol 30:535-560.

Ignarro LJ (1991). Heme-dependent activation of guanylate cyclase by nitric oxide: a

novel signal transduction mechanism. Blood vessels 28:67-73.

Ignarro LJ, Buga GM, Wood KS, Byrns RE, Chaudhuri G (1987). Endothelium-derived

relaxing factor produced and release from artery and vein is nitric oxide. Proc Natl

Acad Sci USA 84:9265-9269.

Ignarro LJ, Kadowitz PJ (1985). A pharmacological and physiological role of cyclic

GMP in vascular smooth muscle relaxation. Annu Rev Pharmacol Toxicol 25:171-

191.

Ignarro LJ, Lipton H, Edwards JC et al. (1981). Mechanism of vascular smooth muscle

relaxation by organic nitrates, nitrites, nitroprusside, and nitric oxide: evidence for

the involvement of S-nitrosothiols as active intermediates. J Pharmacol Exp Ther

218:739-749.

Ikebe M, Reardon S (1990). Phosphorylation of myosin light chain kinase by smooth

muscle Ca2+/calmodulin-dependent multi-functional protein kinase. J Biol Chem

265:8975-8978.

Inselmann G et al (1991). Cyclosporin-A-induced lipid peroxidation in human liver mi-

crosomes and its influence on cytochrome P450. Eur J Clin Invest 21:461-465.

Isakson P, Seibert K, Masferrer J, Salvemini D, Lee L, Needleman P (1995). Discovery of

a better aspirin. Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 23:49-54.

218


Ivanova K, Schaefer M, Drummer C, Gerzer R (1993). Eur J Pharmacol 244:37-47.

Iwata F, Joh T, Kawai T, Itoh M (1992). Role of EDRF in splanchnic blood flow of nor-

mal and chronic portal hypertensive rats. Am J Physiol 263(2 Pt 1): G149-54.

Janes SL, Kyle PM, Pedma CH, Goodal AH (1995). Flow cytometric detection of activ-

ated platelets in pregnant women prior the development of Pre-Eclampsia. Throm-

bosis and Haemostasis 74:1059-1063.

Johansson JS, Hayness DH (1992). Cyclic GMP increases the rate of the calcium extru-

sion pump in intact platelets but has no direct effect on the dense tubular calcium ac-

cumulation system. . Biochem Biophys Acta 1105:40.

Johnson RM, Lincoln TM (1985). Effects of nitroprusside, glyceryl nitrate, and 8-bromo-

cyclic GMP on phosphorilase a formation and myosin light chain phosphorylation in

rat aorta. Mol Pharmacol 27:333-342.

Jorkasky DK, Fisher CA, Sthal RF, Addonizio VP, Glickman JD (1989). The effects of

cyclosporine on human platelet aggregation and thromboxane release. Transplant

Proc 21:948-949.

Kahan BD (1989). Cyclosporine. New England Journal of Medicine 321:1725-1738.

Kahan BD, Grevel J (1988). Optimization of cyclosporine therapy in renal transplantation

by a pharmacokinetic strategy. Transplantation 46:631-644.

Kasiske BL, Guijarro C, Massy ZA et al. (1996). Cardiovascular disease after renal trans-

plantation. J Am Soc Nephrol 7:158-165.

Kaskel F, Devarajan P, Arbeit LA, Partin JS, Moore LC (1987). Cyclosporin nephrotox-

icity: sodium excretion, autoregulation and angiotensin II. Am J Physiol 252:F733-

F742.

Katayama Y (1995). Nitric oxide: mysterious messenger. Dojindo News Lett 1:1-29.

Katsuki S, Arnold W, Mittal C, Murad F (1977). Stimulation of guanylate cyclase by so-

dium nitroprusside, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue preparations and

comparison to the effects of sodium azide and hydroxylamine. J Cyclic Nucleotide

Res 3:23-35.

Katusic ZS, Shepherd JT (1991). Endothelium-derived vasoactive factors: II. Endothe-

lium-dependent contraction. Hypertension 18(5 Suppl):III86-92.

219


Kaul S, Naqvi TZ, Fishbein MC, Cercek B, Forrester JS, Molloy MD, Badimon JJ, Hutsell

TC, Shah PK,(1995). Profound inhibition of arterial thrombosis by a novel nitric ox-

ide donor. Am J Coll Cardiol (February special issue):34A, Abstract.

Kaul S, Waack BJ, Padgett RC, Brooks RM, Heistad DD (1993). Altered vascular re-

sponses to platelets from hypercolesterolemic humans. Circ Res 72:737-743.

Kawaguchi A, Goldman MH, Shapiro R, Foegh ML, Ramwell PW, Lower RR (1985). In-

crease in urinary thromboxane B2 in rats caused by cyclosporine. Transplantation

40:214-216.

Keaney JF, Simon DI, Stamler JS, et al. (1993). NO forms and adduct with serum albumin

that has endothelium derived relaxing factor-like properties. J Clin Invest 91:1582-

1589.

Keelan M, Wierzbicki E, Sigalet D, Kneteman N, Clandinin MT, Thomson AB (1993).

Alteration of intestinal brush border membrane lipid composition in rats by cyc-

losporine. Transplantation 56:1560-1564.

Kelm M (1999). Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta

5;1411(2-3):273-89.

Khalil A, Carrier M, Latour JG, Pelletier LC (1996). Cyclosporin A-induced coronary

artery vasoconstriction through myogenic and endothelium-dependent mechanisms.

Circulation 94(suppl II):II-308-II311.

Kilpatrick EV, Cocks TM (1994). Evidence for differential roles of nitric oxide (NO) and

hyperpolarization in endothelium-dependent relaxation of pig isolated coronary

artery. Br J Pharmacol 112:557-565.

Kim HS, Kim DH, Kang SW, Choi KH, Lee HY, Han DS, Lee YH, Kang BS (1996). L-

Arginine restores suppressed acetylcholine-induced endothelium-dependent vascular

relaxation in cyclosporin A-treated rats. Transplant Proc 28(3): 1372-1374.

Kiowski W, Linder L, Stoschitzky et al., (1991). Diminished response to inhibition of en-

dothelium-derived nitric oxide and enhanced vasoconstriction to exogenously admin-

istered endothelin-1 in clinically healthy smokers. Circulation 90:27-34.

Klee CB, Crouch TH, Krinks MH (1979). Calcineurin: a calcium- and calmodulin-binding

protein of the nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 76:6270-6273.

220


Klee CB, Draetta GF, Hubbard MJ (1988). Calcineurin. In Advances in enzymology and

related areas of molecular biology. Edited by Meister A. New York: John Wiley and

Sons; 61:149-200.

Knowles RG, Moncada S (1994). Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J 298:249-

258.

Koesling D, Böhme E, Schultz G (1991). Guanylyl cyclases, a growing family of signal

transducing enzymes. Faseb J 5:2785-2791.

Kolars JC, Awni WM, Merion RM, Watkins PB (1991). First-pass metabolism of cyc-

losporin by the gut. Lancet 338:1488-1489.

Kolpakov V, Gordon D, Kulik TJ (1995). Nitric oxide-generating compounds inhibit total

protein and collagen synthesis in cultured vascular smooth muscle cells. Circ Res

76(2):305-9.

Komori K, Suzuki H (1987). Electrical responses of smooth muscle cells during choliner-

gic vasodilation in the rabbit saphenous artery. Circ Res 61:586-593.

Kon V, Sugiura M, Inagami T, et al. (1990). Role of endothelin in cyclosporine-induced

glomerular dysfunction. Kidney Int 37:1487-1491.

Kroll M, Schafer A (1989). Biochemical mechanisms of platelet activation. Blood

74:1185-1195.

Kronbach T, Fischer V, Meyer UA (1988). Cyclosporine metabolism in human liver:

identification of a cytochrome p-450III gene family as the major cyclosporine-meta-

bolizing enzyme explains interactions of cyclosporine with other drugs. Clinical

Pharmacology and Therapeutics 43:630-635.

Kubes P, Granger DN (1992). Nitric oxide modulates microvascular permeability. Am J

Physiol 262:H611-15.

Kubes P, Suzuki M, Granger DN (1991). Nitric oxide: An endogenous modulator of leuk-

ocyte adhesion. Proc Natl Acad Sci USA 88:4651.

Kujubu DA, Reddy ST, Fletcher BS, Herschman HR (1993). Expression of the protein

product of the prostaglandin synthase-2/TIS10 gene in mitogen-stimulated Swiss 3T3

cells. J Biol Chem 15;268(8):5425-30.

Kukovetz WR, Holzmann S, Wurm A, Poch B (1979). Evidence for cyclic GMP-mediated

relaxant effects of nitro-compounds in coronary smooth muscle. Naunyn-

Schmiedeberg,s Arch Pharmacol 310:129-138.

221


Kunz D, Walker G, Eberhardt W, Nitsch D, Pfeilschifter J (1995). Interleukin 1B-induced

expression of nitric oxide synthase in rat renal mesangial cells is suppressed by cyc-

losporine A. Biochem Biophys Res Commun 216:438-446.

Kurose I, Kubes P, Wolf R et al. (1993). Inhibition of nitric oxide production. Mechan-

isms of vascular albumin leakage. Circ Res 73:164-171.

Kurtz A, Pfeilschifter J, Kühn K, Koch KM (1987). Cyclosporin A inhibits PGE2 release

from vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 147:542-9.

Lamb FS, Weeb RC (1987). Cyclosporin augments reactivity of isolated blood vessels.

Life Sci 40:2571-2578.

Landolfi R, Steiner M (1984). Ethanol raises prostacyclin in vivo and in vitro. Blood

64:679.

Lantoine F, Brunet A, Bedioui F, Devynck J, Devynck MA (1995). Direct measurement

of nitric oxide production in platelets: relationship with cytosolic Ca2+ concentration.

Biochem Biophys Res Commun 215:842-848.

Lau DCW, Wong KL (1987). Effect of cyclosporine on microvascular endothelial cell

growth in culture. Transplant Proc 19:3496.

Launay JM, Bondoux D, Oset-Gasque MJ et al. (1994). Increase of human platelet sero-

tonin uptake by atypical histamine receptors. Am J Physiol 266:R526.

L'Azou B et al (1999). In vitro models to study mechanisms involved in cyclosporine A-

mediated glomerular contraction. Arch Toxicol 73:337-345.

Lee J, Kim SW, Kook H, Kang DG, Kim NH, Choi KC (1999). Effects of L-arginine on

cyclosporin-induced alterations of vascular NO/cGMP generation. Nephrol Dial

Transplant 14: 2634-2638.

Lelchuk R, Radomski MW, Martin JF, Moncada S (1992). Constitutive and inducible

nitric oxide synthases in human megakaryoblastic cells. J Pharmacol Exp Ther

262:1220-1224.

Lepoivre M, Fieschi F, Coves J, Thelander L, Fontecave M (1991). Inactivation of ribo-

nucleotide reductase by nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 179:442.

Lieberman EH, O’Neill S, Mendelsohn ME (1991). S-nitrosocysteine inhibition of human

platelet secretion is correlated with increases in platelet cGMP levels. Circ Res

68:1722-1728.

222


Linder L, Kiowski W, Bühler FR, Lüscher TF (1990). Indirect evidence for release of en-

dothelium-derived relaxing factor in human forearm circulation in vivo: blunted re-

sponse in essential hypertension. Circulation 81:1762-1767.

Liu J, Albers MW, Wandless TJ, Luan S, Alberg DG, Belshaw PJ, Cohen P, MacKintosh

C, Klee CB, Schreiber SL (1992). Inhibition of T cell signalling by immunophilin-

ligand complex correlates with loss of calcineurin phosphatase activity. Biochemistry

31:3896-3901.

Liu J, Farmer JD, Lane WS, Friedman J, Weissman I, Schreiber SL (1991). Calcineurin is

a common target of cyclophilin-cyclosporine A and FKBP-FK506 complexes. Cell

66:807-815.

Loertscher R, Thiel G, Harder F, Brunner FP (1983). Persistent elevation of alkaline

phosphatase in cyclosporin A-treated renal transplant recipients. Transplantation

36:115-116.

López-Ongil S, Saura M, Rodriguez-Puyol D, Rodriguez-Puyol M, Lamas S (1996). Reg-

ulation of endothelial NO synthase expression by cyclosporin A in bovine aortic en-

dothelial cells. Am J Physiol 271(3pt2):H1072-H1078.

Lowenstein CJ, Dinerman JL, Snyder SH (1994): Nitric oxide: a physiologic messenger.

Ann Intern Med 120:227-237.

Lüscher TF (1993). Angiotensin, ACE-inhibitors and endothelial control of vasomotor

tone, in Grobecker H, Heusch G, Strauer BE (eds.): Angiotensin and The Heart.

Steinkopff Verlag Darmstad.

Lüscher TF (1994). Endothelin, endothelin receptors, and endothelin antagonists. Curr

Opin Neph Hypertens 3:92-98.

Lüscher TF (1995). Endothelial dysfunction in atherosclerosis. J Myocard Ischemia

7(suppl 1): 15-20.

Lüscher TF, Tanner FC, Tschudi MR et al. (1993). Endothelial dysfunction in coronary

artery disease. Ann Rev Med 44:395-418.

Lüscher TF, Vanhoutte PM (1990). The endothelium-Modulator of Cardiovascular Func-

tion. Boca Raton, CRC Press, pp1-215.1-215.

Lüscher TF, Weber E, Bühler FR (1988). Effects of cyclosporine A on endothelium-de-

pendent relaxation in the rat renal artery. Kidney Int 33:247.

223


Lusting S, Stern N, Golub MS, Eggena P, Barret J, Lee DBN (1989). Experimental cyc-

losporin hypertension: Characterization of the rat model: Transplant Proc 21:950-

951.

Malinski T, Radomski MW, Taha Z, Moncada S (1993). Direct electrochemical measure-

ment of nitric oxide released from human platelets. Biochem Biophys Res Commun

194:960-965.

Marcus AJ, Safier LB (1993). Thromboregulation: milticellular modulation of platelet re-

activity in hemostasis and thrombosis. Faseb J 7:516-522.

Marín J (1993). Mechanisms involved in the increased vascular resistance in hyperten-

sion. J Auton Pharmacol 13:127-176.

Marumo T, Nakaki T, Hishikawa K, Suzuki H, Kato R, Saruta T (1995). Cyclosporine A

inhibits nitric oxide synthase induction in vascular smooth muscle cells. Hyperten-

sion 25:764-768.

Masaki T, Vane JR, Vanhoutte PM (1994). International union of pharmacology nomen-

clature of endothelin receptors. Pharmacol Rev 46:137-142.

Mathieu P, Carrier M, Dupuis J, Ryan J, Pelletier LC (1997). L-Arginine prevents cyc-

losporin A-induced pulmonary vascular dysfunction. Ann Thorac Surg 64: 414-420.

Mathieu P, Carrier M, Dupuis J, Ryan J, Pelletier LC (1997). L-arginine prevents cyc-

losporin A-induced pulmonary vascular dysfunction. Ann Thorac Surg 64(2):414-

420.

Maurer G, Lemaire M (1986). Biotransformation and distribution in blood of cyclospor-

ine and its metabolites. Transplantation Proceedings 18(Suppl. 5):25-34.

Maurice DH, Haslam RJ (1990). Molecular basis of the synergistic inhibition of platelet

function by nitrovasodilators and activators of adenylate cyclase: inhibition of cyclic

AMP breakdown by ciclic GMP. Mol Pharmacol 37:671-681.

Mayer B, Brunner F, Schmidt K (1993). Inhibition of nitric oxide synthesis by methylene

blue. Biochem Pharmacol 4:367-74.

McCauley FT, Whitting PH, Thomson AW, Simpson JG (1987). The influence of en-

alapril or spironolactone on experimental cyclosporine nephrotoxicity. Biochem

Pharmacol 36:699-703.

McEver RP (1990). Properties of GMP-140, an inducible granule membrane protein of

platelets and endothelium. Blood Cells 16:1722-1728.

224


McFaul SJ, McGrath JJ (1987). Toxicol Appl Pharmacol 87:464-473.

McGrath LT et al (1997). Oxidative stress in cyclosporin and azathioprine treated renal

transplant patients. Clin Chim Acta 264:1-12.

Mehta JL, Chen LY, Mehta P (1995). Identification of constitutive and inducible forms of

nitric oxide synthase in human platelets. J Lab Clin Med 25: 753-760.

Mellion BT, Ignarro LJ, Ohlstein EH (1981). Evidence for the inhibitory role of the

guanosine 3,: 5,-monophosphate in ADP induced human platelets aggregation in the

presence of nitric oxide and related vasodilators. Blood 57:946-955.

Mendelsohn M, O,Neill S, George D, Loscalzo J (1990). Inhibition of fibrinogen binding

to human platelets by S-nitroso-N-acetylcysteine. J Biol Chem 265:19028-19034.

Menshikov MY, Ivanova K, Schaefer M, Drummer C, Gerzer R (1993). Eur J Pharmacol

245:281-284.

Meyer-Lehnert H, Schrier RW (1987). Potential mechanisms of cyclosporin A-induced

hypertension: enhancement of vasopressin (AVP)-stimulated Ca++ mobization and

cell contraction in vascular smooth muscle cells. Kidney Int 31:464.

Meyer-Lehnert H, Schrier RW, (1989). Potential mechanisms of cyclosporin A-induced

vascular smooth muscle contraction. Hypertension 13:352-360.

Michelson AD, Barnard MR, Hechtman HB, MacGregor H, Connolly RJ, Loscalzo J,

Valeri CR (1996). In vivo tracking of platelets: circulating degranulated platelets rap-

idly lose surface P-selectin but continue to circulate and function. Proc Natl Acad Sci

USA 93(21):11877-82.

Mikkelsen EO, Poulsen SH, Nyborg NCB, Korsgaard N, Sehested J (1992). Difference

between aortic and renal vascular reactivity in cyclosporin A treated rats and the ef-

fect of cicletanine. Arch Pharmcol 345:356-361.

Mittal CK, Jadhav AL (1994). Calcium-dependent inhibition of constitutive nitric oxide

synthase. Biochem Biophys Res Commun 203:8-15.

Modderman PW, Von Dem Borne EGK, Sonnenberg A (1994). Tyrosine phosphorilation

of P-selectin in intact platelets and in a disulphide-linked complex with immuno-

precipitated pp60c-src. Biochem J 299:613-621.

Molina y Vedia L, McDonald B, Reep B, Brune B, Di Silvio M, Billiar TR, Lapetina EG

(1992). J Biol Chem 267:24929-24932.

Mollace V, Salvemini D, Änggard E, Vane J (1991).Br J Pharmacol 104:633-639.

225


Moncada S (1982). Biological importance of prostacyclin. Br J Pharmacol 76:3-31.

Moncada S, Gryglewski R, Bunting S, Vane JR (1976). An enzyme isolated from arteries

transforms prostaglandin endoperoxides to an unstable substance that inhibits platelet

aggregation. Nature 263:663-665.

Moncada S, Palmer RM, Higgs EA (1991). Nitric oxide: physiology, pathophysiolgy and

pharmacology. Pharmacol. Rev 43:109.

Morgan BJ, Lyson T, Scherrer U, Victor RG (1991). Cyclosporine causes sympathetically

mediated elevations in arterial pressure in rats Hypertension 18:458-466.

Morian M, Lavenne EP, Scheiff J, Debeys C (1990). Blood platelets, Holograme ed. Paris.

Moro MA, Darley-Usmar VM, Goodwin DA, Read NG, Zamora-Pino R, Feelisch M,

Radomski MW, Moncada S (1994). Paradoxical fate and biological action of per-

oxynitrite on human platelets. Proc Natl Acad Sci USA 91:6702-6706.

Moro MA, Russell RJ, Cellek S, Lizasoain I, Su Y, Darley-Usmar VM, Radomski MW,

Moncada S (1996). cGMP mediates the vascular and platelets actions of nitric oxide:

Confirmation using na inhibitor of the soluble guanylyl cyclase. Proc Natl Acad Sci

USA 93:1480-1485.

Moro MA, Salas E, Radomski MW et al. (1993). Comparative pharmacology of analogues

of S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine in platelets. Endothelium 1 S39.

Moss NG, Powell SL, Falk RJ (1985). Intravenous cyclosporine activates afferent and ef-

ferent renal nerves and causes sodium retention in innervated kidneys in rats. Proc

Natl Acad Sci USA 82:8222-8226.

Mueller EA, Kovarik JM, Van Bree JB et al. (1994). Improved dose linearity of cyc-

losporine pharmacokinetics from a microemulsion formulation. Pharm Res

11(2):301-304.

Murad F, Ishii K (1990). In Endothelium-derived relaxing factors. ed. Rubanyi GM and

Vanhoutte PM pp. 151-165, Karger, Basel.

Murohara T, Parkinson SJ, Waldman SA, Lefer AM (1995). Inhibition of nitric oxide

biosynthesis promotes P-selectin expression in platelets. Role of protein kinase C. Ar-

terioscler Thromb Vasc Biol Nov 15(11):2068-75.

Murray BM, Paller MS, Ferris TF (1985). Effect of cyclosporine administration on renal

hemodynamics in conscious rats. Kidney Int 28:767-774.

226


Muruganandam A, Mutus B (1994). Isolation of nitric oxide synthase from human plate-

lets. Bioch Biophys Acta 1200:1-6.

Myers BD (1986). Cyclosporine nephrotoxicity. Kidney Int 30:964-974.

Myers BD, Sibley R, Newton L, Tomlanovich SJ, Boshkos C, Stinson E, Leutscher JA,

Whitney DJ, Krasny D, Cplon NS, Perlroth MG (1988). The long-term course of cyc-

losporine-associated chronic nephropathy. Kidney Int 33:590.

Nagao T, Vanhoutte PM (1993). Endothelium-derived hyperpolarizing factor and endothe-

lium-dependent relaxations. Am J Respir Cell Mol Biol 8:1-6.

Nakaki T, Hishikawa K, Suzuki H, Saruta T, Kato R (1990). L-arginine-induced hypoten-

sion. Lancet 336:696.

Nakatsuka M, Osawa Y (1994). Selective inhibition of the 12-lipoxygenase pathway of

arachidonic acid metabolism by L-arginine or sodium nitroprusside in intact human

platelets. Biochem Biophys Res Commun 200:1630.

Natelson BH, Ottenweller JE, Servatius RJ, Drastal S, Bergen MT, Tapp T, Pichlmayr R

(1992). Effect of stress and food restriction on blood pressure and lifespan of Dahl

salt-sensitive rats. J Hypertension 10:1457-1462.

Nathan C (1992). Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. Faseb J 6:3051-

3064.

Neild GH, Reuben R, Hartley RB, Cameron JS (1985). Glomerular thrombi in renal allo-

grafts associated with cyclosporin therapy. J Clin Pathol 38:253-258.

Neild GH, Rocchi G, Imberti L et al., (1983). Effect of cyclosporin A on prostacyclin syn-

thesis by vascular tissue. Thromb Res 32:373.

Newby AC, Southgate KM, Assender JW (1992). Inhibition of vascular smooth muscle

cell proliferation by endothelium-dependent vasodilators. Herz 175:291-299.

Nguyen BL, Saitoh M, Wane JA (1991). Interaction of nitric oxide and cGMP with signal

transduction in activated platelets. Am J Physiol 26:H1043-H1052.

Nguyen T, Brunson D, Crespi CL, Penman BW, Wishnok JS, Tannenbaum SR (1992).

DNA damage and mutation in human cells exposed to nitric oxide in vitro. Proc Natl

Acad Sci USA 89:3030-3034.

Nieuwenhuis HK, Van Oosterhout JJ, Rozemuller E, van Iwaarden F, Sixma JJ (1987).

Studies with a monoclonal antibody against activated platelets: evidence that a

227


secreted 53,000-molecular weight lysosome-like granule protein is exposed on the

surface of activated platelets in the circulation. Blood 70:838-845.

Nishikawa M, Kanamori M, Hidaka H (1982). Inhibition of platelet aggregation and stim-

ulation of guanylate cyclase by an antianginal agent molsidomine and its metabolites.

J Pharmacol Exp Ther 220:183-190.

Nolte C, Eigenthaler M; Schanzenbacher P, Walter U (1991). Endothelial cell-dependent

phosphorylation of a platelet protein mediated by cAMP and cGMP-elevating factors.

J Biol Chem 266:14808-14812.

Noris M, Benigni A, Boccardo P, et al (1993). Enhanced nitric oxide synthesis in uremia:

implications for platelet dysfunction and dialysis hypotension. Kidney Int 44:445-

450.

Nunokawa Y, Tanaka S (1992). Interferon-gamma inhibits proliferation of rat vascular

smooth muscle cells by nitric oxide generation. Biochem Biophys Res Commun

188:409-415.

O, Keefe SJ, Tamura J, Kincaid RL, Tocci MJ, O,Neill EA (1991). FK506- and cyclospor-

ine A-sensitive activation of the interleukin-2 promoter by calcineurin. Nature

357:692-694.

O,Neil GS, Chester AH, Kushwaha S, Rose M, Tadjkarimi S, Yacoub MH (1991). Cyc-

losporin treatment does not impair the release of nitric oxide in human coronary ar-

teries. Br Heart J 66:212-216.

O’Rourke FA, Halenda SP, Zavoico GB, Feinstein MB (1985). J Biol Chem 260:956-962.

Oriji GK (1999). Nitric oxide in cyclosporine A-induced hypertension: endothelin recept-

ors gene expression. Prostagaglandins LeuKot Essent Fatty Acids 61(1):41-44.

Oriji GK, Keiser HR (1998). Role of nitric oxide in cyclosporine A-induced hypertension.

Hypertension 32:849-855.

Oriji GK, Keiser HR (1999). Nitric oxide in cyclosporine A-induced hypertension: role of

protein kinase C. Am J Hypertens 12:1091-1097.

Óskarsson HJ, Hofmeyer TG (1996). Platelets from patients with diabetes mellitus have

impaired ability to mediate vasodilation. J Am Coll Cardiol 27:1464-1470.

Óskarsson HJ, Hofmeyer TG, Olivari MT (1997). Cyclosporine impairs the ability of hu-

man platelets to mediate vasodilatation. Hypertension 29:1314-1321.

228


Otsuka M, Tareda Y, Yang T, Nonoguchi H, Tomita K, Marumo F (1994). Localization of

cyclophilin A and cyclophilin C mRNA in murine kidney using RT-PCR. Kidney Int

45(5):1340-5.

Palestine AG, Howard AA, Balow JE, Antonovych TT, Sabuis SG, Preuss HG, Hussen-

blatt RB (1986). Renal histopathologic alterations in patients treated with Cyclospor-

ine for uveitis. N Engl J Med 314:1293-1298.

Palmer RMJ, Ashton DS, Moncada S (1988). Vascular endothelial cells synthesize nitric

oxide from L-arginine. Nature 333:664-666.

Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S (1987). Nitric oxide release accounts for the biolo-

gical activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 327:524-526.

Pennington DG (1981). Formation of platelets. In Platelets in Biology and Pathology 2,

ed. by JL Gordon, pp. 19-41, Elsevier, Amsterdam

Perico N, Ruggenenti P, Gaspari F, et al. (1992). Daily renal hypoperfusion induced by

cyclosporine in patients with renal transplantation. Transplantation 54:74-80.

Perico N, Zoja C, Benigni A, Ghilardi F, Gualandris L, Remuzzi G (1986). Effect of short

term cyclosporine administration in rats on renin-angiotensin and thromboxane A2:

Possible relevance to the reduction in glomerular filtration rate. J Pharmacol Exp

Ther 239:229-235.

Pfeilschifter J (1988). Cyclosporin A augments vasoconstrictor-induced rise in intracellu-

lar free calcium in rat renal mesangial cells. Biochem Pharmacol 37:4205-4210.

Pfeilschifter J, Rüegg UT (1987). Cyclosporin A augments angiotensin II-stimulated rise

in intracellular free calcium in vascular smooth muscle cells. Biochem J 248:883-887.

Phillips DR, Charo IF, Parise LV, Fitzgerald LA (1988). The platelet membrane glycopro-

tein IIb-IIIa complex. Blood 71:831-843.

Phillips PA et al. (1994). Vascular endothelin responsiveness and receptor characteristics

in vitro and effects of endothelin receptor blockade in vivo in cyclosporin hyperten-

sion. Clin Exp Pharmacol Physiol 21:223-226.

Pinto A, Abraham NG, Mullane KM (1986). Cytochrome P-450-dependent monooxy-

genase activity and endothelial-dependent relaxations induced by arachidonic acid. J

Pharmacol Exp Ther 236:445-451.

Piper P, Vane JR (1989). The release of prostaglandins from lung and other tissues. Ann N

Y Acad Sci 180:363-385.

229


Polanowska-Grabowska R, Gear ARL (1994). Role of cyclic nucleotides in rapid platelet

adhesion to collagen. Blood 83:2508.

Prieto M, Escallada R, Cobo M, Cotorruelo JG, Morales P, de Francisco AL, Rodrigo E,

Sanz S, Arias M (1997). Oral arginine restores endothelium-dependent vasodilation

in cyclosporine treated rats. Transplant Proc 26(1-2):1244-5.

Radomski MW, Palmer RM, Moncada S (1987a). Comparative pharmacology of endothe-

lium-derived relaxing factor, nitric oxide, and prostacyclin in platelets. Br J Phar-

macol 92:181-187.

Radomski MW, Palmer RM, Moncada S (1987b). Endogenous nitric oxide inhibits human

platelet adhesion to vascular endothelium. Lancet 2:1057-1058.

Radomski MW, Palmer RMJ, Moncada S (1990a). An L-arginine/nitric oxide pathway

present in human platelets regulates aggregation. Proc Nat Acad Sci USA 87, 5193-

5197.

Radomski MW, Palmer RMJ, Moncada S (1990b). Characterization of the L-arginine/

nitric oxide pathway in human platelets Br J Pharmacol 101:3225-3228.

Radomski MW, Salas E (1995). Nitric oxide – Biological mediator, modulator and factor

of injury: its role in the pathogenesis of atherosclerosis. Atherosclerosis 118 (Suppl.):

S69-S80.

Rand MJ (1992). Nitrergic transmission: nitric oxide as a mediator of non-adrenergic,

non-cholinergic neuro-effector transmission. Clin Exp Pharmacol Physiol 19:147-

169.

Rang HP, Dale MM (1993). Farmacologia. 2ª Ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

Rapoport RM, Draznin MB, Murad F (1983). Endothelium-dependent relaxation in rat

aorta may be mediated through cyclic GMP-dependent protein phosphorylation.

Nature 306:174-176.

Rapoport RM, Murad F (1983). Agonist induced endothelium-dependent relaxation in the

rat thoracic aorta may be mediated through cyclic GMP. Circ Res 52:352357.

Rapoport RM, Murad F (1986). Cyclic AMP may produce vascular relaxation by inhibi-

tion of inositol triphosphate generation in rat aorta. Circ Res 61:265-272.

Rasmussen H (1986). The calcium messenger system (1). N Engl J 314:1094-1101.

Reems GH, Cook LA, Palladino MA (1983). Cyclosporin A inhibits interleukin 2 and

gamma interferon synthesis by human thymocytes. Transplant Proc 15:2387-2389.

230


Rego A, Vargas A, Cathapermal S, Kuwahara M, Foegh ML, Ramwell PW (1991). Sys-

temic vascular effects of cyclosporin A treatment in normotensive rats. J Pharmacol

Exp Ther 259:905-915.

Rego A, Vargas A, Foegh ML, Ramwell PW (1988). Effects of cyclosporine A treatment

on vascular reactivity of the rat thoracic aorta. Transplant Proc 20:572-577.

Rego A, Vargas R, Suarez KR, Foegh ML, Ramwell PW (1990b). Mechanism of cyc-

losporin potentiation of vasoconstriction of the isolated rat mesenteric arterial bed:

Role of extracellular calcium. J Pharmacol Exp Ther 254:799-808.

Rego A, Vargas R, Wroblewska B, Foegh ML, Ramwell PW (1990a). Attenuation of vas-

cular relaxation and ciclic GMP responses by cyclosporin A. J Pharmacol Exp Ther

252:165-170.

Reis F (1999). Efeitos da ciclosporina A na reactividade plaquetar num modelo animal

experimental. Dissertação de mestrado.

Richards NT, Poston L, Hilton P (1990). Cyclosporin A inhibits endothelium-dependent,

prostanoid-induced relaxation in human subcutaneous resistance vessels. J Hypertens

8:159-163.

Richards NT, Poston L, Hilton PJ (1989). Cyclosporine A inhibits relaxation but does not

induce vasoconstiction in human subcutaneous resistance vessels. J Hypertens 7:1-3.

Rigotti P, Amodio P, Sacerdoti D, Ferraresso M, Borsato M, Morpurgo E, e al. (1991). Ef-

fects of defibrotide on renal fubction and urinary prostanoid excretion in cyclosporin-

treated rats. Nephron 59:477-481.

Rink TJ, Sanchez A, Hallam TJ (1983). Nature 305:317-319.

Rodeberg DA, Chaet MS, Bass RC, Arkovitz MS, Garcia VF (1995). Nitric oxide: an

overview. Am J Surg 170:292-303.

Ross R (1995). Cell biology of atherosclerosis. Annu Rev Physiol 57:791-804.

Rossi NF, Churchill PC, McDonald FD, Ellis VR (1989). Mechanism of cyclosporine A-

induced renal vasoconstriction in the rat. J Pharmacol Exp Ther 250:896-901.

Roullet JB, Xue H, McCarron DA, Holcomb S, Bennett WM (1994). Vascular mechan-

isms of cyclosporine-induced hypertension in the rat. J Clin Invest 93:2244-2250.

Rubanyi GM (1993). The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases.

J Cardiovasc Pharmacol 22(suppl 4):S1-14.

231


Rubanyi GM, Romero JC, Vanhoutte PM (1986). Flow-induced release of endothelium-

derived relaxing factor. Am J Physiol 250:H1145-1149.

Ruggeri ZM (1991). The platelet glycoprotein Ib-IX complex. Prog Hemostasis Thromb

10:35-68.

Sakurai T, Goto K (1993). Endothelins: vascular actions and clinical implications. Drugs

46:795-804.

Salas E, Moro MA, Askew S et al. (1994). Comparative pharmacology of analogues of S-

nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine in platelets. Br J Pharmacol 112:1071.

Salganicoff L, Sevy RW (1985). The platelets strip II. Pharmacomechanical coupling in

thrombin-activated human platelets. Am J Physiol 249:C288-C296.

Salvemini D, Currie MG, Mollace V (1996). Nitric-oxide-mediated cyclooxigenase activa-

tion. J Clin Invest 97:2562-2568.

Salvemini D, DeNucci G, Gryglewski RJ, Vane JR (1989). Proc Natl Acad Sci USA

86:6328-6332.

Salvemini D, Korbut R, Änggard E, Vane J (1990). Immediate release of nitric oxide-like

factor from bovine aortic endothelial cells by Escherichia coli lipopolysaccharide.

Proc Natl Acad Sci USA 87:2593-7.

Salvemini D, Manning PT, Zweifel BS, Seibert K, Connor J, Currie MG, Needleman P,

Masferrer JL, (1995b). Dual inhibition of nitric oxide and prostaglandin production

contibutes to the antiinflammatory properties of nitric oxide synthase inhibitors. J

Clin Invest 96:301-308.

Salvemini D, Misko TP, Seibert K, Masferrer JL, currie MG, Needleman P (1995a). Role

of nitric oxide in the regulation of cyclooxygenase. Biology of nitric oxide. Enzymo-

logy. Biochemistry and Immunology. Vol. 4 S. Moncada and E.A. Higgs, editors.

Portland Press Ltd., London 304-309.

Sander M, Victor RG (1995). Hypertension after cardiac transplantation: pathophysiology

and management. Pharmacol and Ther 4:443-451.

Sane DC, Bielawska A, Greenberg CS, Hannun YA (1989). Cyclic GMP analogs inhibit

gamma thrombin-induced arachidonic acid release in human platelets. Biochem Bio-

phys Res Comm 165:708.

232


Scherrer U, Vissing SF, Morgan BJ, Rollins JA, Tindall RS, Ring S, Hanson P, Mohanthy

PK, Victor RG (1990). Cyclosporine-induced sympathetic activation and hyperten-

sion after heart transplatation. N Engl J Med 323:693-699.

Schillinger E, Losert WF (1980). Identification of PGI2 receptors and cAMP levels in

platelets and femoral arteries. Acta Ther 6:37.

Schini V, Malta E, Miller RC (1987). Effect of endothelium and carbachol on alpha-ad-

renoceptor agonists stimulates uptake and efflux of 45Ca in rat isolated aorta. Naunyn-

Schmiedeberg,s Arch Pharmacol 336:287-294.

Schmidt HHHW, Lohmann SM, Walter U (1993). The nitric oxide and cGMP signal

transduction system - regulation and mechanism of action. Biochem Biophys Acta

1178:153-175.

Schmidt HHHW, Pollock JS, Nakane M, Gorsky LD, Forstermann U, Murad F (1991).


Schrör K, Förster F, Woditsch I, Schröder H (1989). Generation of NO from molsidomine

(SIN-1) in vitro and its relationship to changes in coronary vessel tone. J Cardiovasc

Pharmacol 14(suppl 11):29-34.

Schultz KD, Schultz K, Schultz G (1977). Sodium nitroprusside and other smooth muscle

relaxants increase cyclic GMP levels in rat ductus deferents. Nature 265:750-751.

Schwelk WA, Bossaller C, Gotze S, Thelen J, Fleck E (1993). J Cardiovasc Pharmacol

21:435:440.

Sharp WV, Pippert TR, Igel BJ, Schmidt SP (1988). Effect of cyclosporine on prostacyc-

lin production by human endothelial cells. Trans Proc 20:187-189.

Shattil SJ (1995). Function and regulation of beta3 integrins in haemostasis and vascular

biology. Thrombosis and Haemostasis 74:149-155.

Shepherd JT (1990). Franz Volhard lecture. Increased systemic vascular resistance and

primary hypertension:the expanding complexity. J Hypertens Suppl 8(7):S15-27.

Shepherd JT, Katusic ZS, Vedernikov Y, Vanhoutte PM (1991). Mechanisms of coronary

vasopasm: role of endothelium. J Mol Cell Cardiol 23 Suppl 1:125-31.

Shimada K, Takahashi M, Tanzawa K (1994). Cloning and functional expression of en-

dothelin-converting enzyme from rat endothelial cells. J Biol Chem 269:18275-

18278.

233


Shimokawa H, Takeshita A (1995). Endothelium-dependent regulation of the cardiovas-

cular system. Intern Med 34:939-946.

Shimokawa H, Yasutake H, Fujji K, Owada MK, Nakaike R, Fukumoto Y, Takayanagi T,

Nagao T, Egashira K, Fujishima M, Takeshita A (1996). The importance of the hy-

perpolarizing mechanism increases as the vessel size decreases in endothelium-de-

pendent relaxations in rat mesenteric circulation. J Cardiovasc Pharmacol 28:703-

711.

Shulman H, Striker G, Deeg HJ, Kennedy M, Storb R, Thomas ED (1981). Nephrotox-

icity of cyclosporin A after allogenic marrow transplantation. N. Engl. J Med

305:1392-1395.

Siess W, Winegar DA, Lapetina EG (1990). Rap1-B is phosphorylated by protein kinase A

in intact human platelets. Biochem Biophys Res Commun 170:944-950.

Sigurdsson A (1995). Neurohormonal activation in patients with acute myocardial infarc-

tion or chronic congestive heart failure. Blood Pressure 1, 1:1-45.

Simonson MS (1994). Endothelin peptides and compensatory growth of renal cells. Curr

Opin Neph Hypertens 3:73-85.

Simonson MS, Dunn MJ (1990). Endothelin-1stimulates contraction of rat glomerular

mesangial cells and potentiates β-adrenergic-mediated cyclic adenosine monophos-

phate accumulation. J Clin Invest 85:790-797.

Singer HA, Peach MJ (1983). Endothelium dependent relaxation of rabbit aorta. I. Relaxa-

tion stimulated by arachidonic acid. J Pharmacol Exp Ther 226:790-795.

Sixma JJ (1981). In “Haemostasis e Thrombosis” (A. L. Bloom and D. P. Thomas, Cd),

pp. 252-267. Churchill-Livingstone, Edinburgh.

Skaer RJ, Peters PD, Emmines JP (1974). The localization of calcium and phosphorus in

human platelets. J Cell Sci 15:679-692.

Smeesters C, Chaland P, Giroux L, Moutquin JM, Etienne P, Douglas F, et al. (1988). Pre-

vention of acute cyclosporine A nephrotoxicity by a thromboxane synthase inhibitor.

Transplant Proc 20:658-664.

Sneddon JM, Vane JR (1988). Endothelium-derived relaxing factor reduces platelet adhe-

sion to bovine endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 85:2800-2804.

Snyder SH, Bredt DS (1992). Biological roles of nitric oxide. Sci Am 266:68-71.

234


Solagni K, Martasek P, Schwartzman M, Korczek L, Goodman A, Abraham N, Levere RD

(1990). L-arginine protects cyclosporin A-induced blood pressure elevation in spon-

taneously rats. Clin Res 38:349.

Sommer BG, Innes JT, Whitehurst RM, Sharma HM, Ferguson RM (1985). Cyclosporine-

associated renal arteriopathy resulting in loss of allograft function. Am J Surg

149:756-764.

Stamler JS, Simon DJ, Osborne JA et al. (1992). S-Nitrosylation of proteins with nitric

oxide: Synthesis and characterization of biologically active compounds. Proc Natl

Acad Sci USA 89:444.

Stark ME, Szurszewski JH (1992). Role of nitric oxide in gastrintestinal and hepatic func-

tion and disease. Gastroenterology 103:1928-1949.

Steiner JP, Dawson TM, Fotuhi M, Glatt CE, Snowman AM, Cohen N, Snyder SH

(1992). High brain densities of the immunophilin FKBP colocalized with calcineurin.

Nature 13;358(6387):584-7.

Stephan D, Billing A, Krieger JP, Grima M, Fabre M, Hofner M, Imbs JL, Barthelmebs M

(1995). Endothelium-dependent relaxation in the isolated rat kidney: impairment by

cyclosporine A. J Cardiovasc Pharmacol 26:859-868.

Stewart DJ, Langleben D, Cernacek P, Cianflone K (1990). Endothelin release is inhibited

by coculture of endothelial cells with cells of vascular media. Am J Physiol

259:H1928.

Stroes ESG, Luscher TF, de Groot FG, Koomans HA, Rabelink TJ (1997). Cyclosporin A

increases nitric oxide activity in vivo. Hypertension 29:570-575.

Sudhir K, MacGregor JS, DeMarco T, De Groot CJM, Taylor RN, Chou TM, Yock PG,

Chatterjee K (1994). Cyclosporine impairs release of endothelium-derived relaxing

factors in epicardial and resistence coronary arteries. Circulation 90:3018-3023.

Swanson SK-H, Born T, Zydowsky LD, Cho H, Change HY, Walsh CT, Rusnak F (1992).

Cyclosporine-mediated inhibition of bovine calcineurin by cyclophilins A and B.


Takahashi N, Mayano T, Suzuki M (1989). Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase is the cyc-

losporine A binding protein cyclophilin. Nature 337:473-475.

Takeda Y, Itoh Y, Yoneda T (1993). Cyclosporine A induced endothelin-1 release from

cultured rat vascular smooth muscle cells. Eur J Pharmacol 233:299-301.

235


Takeda Y, Miyamori I, Wu P, Yoneda T, Furukawa K, Takeda R (1995). Effects of an en-

dothelial receptor antagonist in rats with cyclosporine-induced hypertension.

Hypertension 26(part I):932-936.

Takeda Y, Miyamori I, Yoneda T, Takeda R (1992). Endothelin-1 release from the mesen-

teric arteries of cyclosporine-treated rats. Eur J Pharmacol 213:445-447.

Takenaka T, Hashimoto Y, Epstein M (1992). Diminished acetylcholine-induced vas-

odilation in renal microvessels of cyclosporine-treated rats. J Am Soc Nephrol 3:42-

50.

Taler SJ, Textor SC, Canzanello VJ, Schwartz L (1999). Cyclosporin-induced hyperten-

sion. Drug Safety 20 (5):437-449.

Tateson JE, Moncada S, Vane JR (1977). Effects of prostacyclin (PGX) on cyclic AMP

concentrations in human platelets. Prostaglandins 13:389-397.

Tavares P (1999). Efeitos da ciclosporina na reactividade e na proliferação do músculo

liso vascular. Tese de doutoramento.

Textor SC, Burnett JC Jr, Romero JC, Canzanello VJ, Taler SJ, Wiesner R, Porayko M,

Krom R, Gores G, Hay E (1995). Urinary endothelin and renal vasoconstriction with

cyclosporine or FK506 after liver transplantation. Kidney Int 47:1426-1433.

Textor SC, Canzanello VJ, Taler SJ, et al. (1994). Cyclosporine induced hypertension

after transplantation. Mayo Clin Proc 69:1182-1193.

Textor SC, Smith-Powell L, Telles T (1990). Altered pressor responses to norepinephrine

and ANG II during cyclosporin A administration to conscious rats. Am J Physiol

258:H854-H860.

Textor SC, Wilson DJ, Lerma A, et al. (1992). Renal hemodynamics, urinary eicosanoids,

and endothelin after liver transplantation. Transplantation 54:74-80.

Thiemermann C, May GR, Page CP, Vane JR (1990). Endothelin-1 inhibits platelet ag-

gregation in vivo: a study with indium labelled platelets. Br J Pharmacol 99:303-308.

Thompson ME, Shapiro AP, Johnson R, Reeves R, Itzicoft S,, Ginchezeau F, Hardesty

RL, Griffith BL, Bahnson HT, McDonald R (1983). New onset of hypertension fol-

lowing cardiac transplantation preliminary report and analysis. Transplant Proc

15(suppl 1):2573-2577.

Toda N (1995). Nitric oxide and the regulation of cerebral arterial tone. In Nitric Oxide in

the Nervous System, ed. by S Vincent pp. 207-225, Academic Press Ltd., Orlando.

236


Tonnesen AS, Hamner RW, Weinmann EJ (1983). Cyclosporine and sodium and po-

tassium excretion in the rat. Transplant Proc 15:2730-2735.

Tran A (1992). Separate induction of human blood platelet aggregation or citotoxicity by

different concentrations of PAF-acether and thrombin. Agent Actions 35:105-109.

Trenn G, Taffs R, Hohman R, Kincaid R, Shevach EM, Sitkovsky M (1989). Biochemical

characterization of the inhibitory effect of cyclosporine A on cytolytic T lymphocyte

effector functions. J Immunol 142:3796-3802.

Triggiani M, Cirillo R, Lichtenstein LM, Marone G (1989). Inhibition of histamine and

prostaglandin D2 release from human lung mast cells by cyclosporine A. Int Arch Al-

lergy Appl Immunol 88:253-255.

Ueda CT, Lemaire M, Gsell G, Nussbaumer K (1983). Intestinal lymphatic absorption of

cyclosporine A following oral administration in an olive solution in rats. Biopharma-

ceutics and Drug Disposition 4:113-124.

Vallance P, Benjamin N, Collier J (1992). The effects of endothelium-derived nitric oxide

on ex vivo whole blood platelet aggregation in man. Eur J Clin Pharmacol 42:37-41

Vallance P, Collier J, Moncada S (1989). Effects of endothelium-derived nitric oxide on

peripheral arteriolar tone in man. Lancet ii:997-1000.

Vane J, Änggard E, Botting R (1990). Regulatory functions of the vascular endothelium. N

Engl J Med 323:27-36.

Vanhoutte PM (1990). Platelet-derived serotonin, the endothelium, and cardiovascular

disease. J Cardiovasc pharmacol 17(Suppl.5):S6-S12.

Vanhoutte PM (1996). Endothelium-derived hyperpolarizing factor. The Netherlands:

Harwood Academic Publishers.

Vanhoutte PM (1997). Dysfonctionnement endothelial and athérosclérose. Archives des

maladies du coeur et des vaisseaux tome 90 (spécial VI):9-19.

Vanrenterghem Y, Roels L, Lerut T, Gruwez J, Michielsen P, Gresele P, Deckmyn H,

Colucci M, Armout J, Vermylen J (1985). Thromboembolic complications and hae-

mostatic changes in cyclosporin-treated cadaveric kidney allograft recipients. Lancet

ii, 999.

Varela AF, Runge A, Ignarro LJ, Chaudhuri G (1992). Nitric oxide prostacyclin inhibit

fetal platelet aggregation: a response similar to that observed in adults. Am J Obste.

Gynecol 167:1599-1604.

237


Vasta V, Meacci E, Farnararo M, Bruni P (1995). Identification of a specific transport sys-

tem for L-arginine in human platelets. Biochem Biophys Res Comm 206:878-884.

Vaziri ND, Ni Z, Zhang YP, Ruzics EP, Maleki P, Ding Y (1998). Depressed renal and

vascular nitric oxide synthase expression in cyclosporine-induced hypertension. Kid-

ney Int 54(2): 482-491.

Venkataramanan R, Starzl TE, Yang S, et al. (1985). Biliary excretion of cyclosporin in

liver transplant patients. Transplantation Proceedings 17 (Suppl.2):286-289.

Voss BL, Hamilton KK, Scott Samara EN, McKee PA (1988). Cyclosporine suppession of

endothelial prostacyclin generation: a possible mechanism for nephrotoxicity. Trans-

plantation 45:793-796.

Waldman S, Murad F (1987). Cyclic GMP synthesis and function. Pharmacol Rev

39:163-165.

Walsh CT, Zydowsky LD, McKeon FD (1992). Cyclosporine A, the cyclophilin class of

peptidylprolyl isomerases, and blockade of T cell signal transduction. J Biol Chem

267:13115-13118.

Walter U (1989). Physiological role of cGMP and cGMP-dependent protein kinase in the

cardiovascular system. Rev Physiol Biochem Pharmacol 113:41.

Warner TD (1993). Characterization of endothelin synthetic pathways and receptor sub-

types: physiological and pathophysiological implications. Eur Heart J 14(suppl I):42-

47.

Weiner CP, Lizasoain I, Baylis SA, Knowles RG, Charles IG, Moncada S (1994). Induc-

tion of calcium-dependent nitric oxide synthases by sex hormones. Proc Natl Acad

Sci USA 91:5212-16.

Weiss HJ (1975). Platelet physiology abnormalities of platelet function (first of two parts).

N Eng J Med 11:531-541.

White JG (1968). Effects of colchicine and Vinca alkaloids on human platelets. 1. Influ-

ence on platelet microtubes and contractile function. Am J Pathol 53:281-291.

Whitworth JA (1992). Renal parenchymal disease and hypertension. In:Robertson JIS,

editor. Clinical hypertension. Amsterdam Elsevier: 326-350.

Whitworth JA, Mills EH, Coghlan JP, McDougall JG, Nelson MA, Spence CD, Tresham

JJ, Scoggins BA (1987). The hemodynamic effects of cyclosporin A in sheep. Clin

Exp Pharmacol Physiol 14:573-580.

238


Willis AL, Smith DL, Vigo C, Kluge AF (1986). Effects of prostacyclin and orally active

stable mimetic agents RS- 93427-007 on basic mechanisms of atherogenesis. Lancet

2:682-3.

Wink DA, Kasprazk KS, Maragos CM, et al. (1991). DNA deaminating ability and geno-

toxicity of nitric oxide and its progenitors. Science 254:1001.

Wu XB, Brune B, Von Appen F, Ullrich V (1992). Arch Biochem Biophys 294:75-82.

Wu XB, Brune B, von Appen F, Ullrich V (1993). Efflux of cyclic GMP from activated

platelets. Mol Pharmacol 43:564.

Xu D, Emoto N, Giaid A, Slaughter C, Kaw S, deWit D, Yanagisawa M (1994). ECE-1: a

membrane-bound metaloprotease that catalyses the proteolytic activation of big en-

dothelin-1. Cell 78:473-485.

Xue H, Bukowski RD, McCarron DA, Bennett WM (1987). Induction of contraction in

isolatd rat aorta by cyclosporin. Transplantation 43:715-718.

Yamakado T, Nishikawa M, Azuma H, Hidaka H (1983). Pharmacologics properties of

platelets strips. Eur J Pharmacol 91:441-447.

Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M, Mitsui Y, Yazaki Y,

Goto K, Masaki T (1988). A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascu-

lar endothelial cells. Nature (Lond.) 332:411-415.

Yang CW, Kim YS, Kim J, Kim YO, Min SY, Choi EJ, Bang BK (1998). Oral supple-

mentation of L-arginine prevents chronic cyclosporine nephrotoxicity in rats. Exp

Nephrol 6(1):50-56.

Yang Z, Diederich D, Buhler F, Luscher T (1989). Cyclosporin therapy impairs endothe-

lim-dependent relaxation in the renal circulation. Kidney Int 35:511.

Yang Z, von Segesser L, Bauer E, et al (1991). Different activation of endothelial L-argin-

ine and ciclooxygenase pathway in human internal mammary artery and saphenous

vein. Circ Res 68:52-60.

Yaris E, Tunoer M, Ilhan M (1992). Actions of cyclosporina A preparation and cremophor

EL in rabbit mesenteric artery and thoracic artery in vitro. Clin Sci 83:179-182.

Yokokawa K, Kohno M, Yasunari K, Murakawa K, Takeda T (1991). Endothelin-3 regu-

lates endothelin-1 production in cultured human endothelial cells. Hypertension

18:304.

239


Yukimura T, Yamashita Y, Miura K, Okumura M, Yamanaka S, Yamamoto K (1992).

Renal effects of the nitric oxide synthase inhibitor, L-NG-nitroarginine, in dogs. Am J

Hypertens 5(7):484-7.

Zalba G, Beaumont J, San Jose G, Fortuno A Fortuna MA, Diez J (2000). Vascular oxid-

ant stress: molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol Bio-

chem 56:57-64.

Zhang J, Snyder SH (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89:9382-9385.

Zhang J, Steiner JP (1995). Nitric oxide, immunophilins and poly(ADP-ribose)synthetase:

novel targets for the development of neuroprotective drugs. Neurol Res 17(4):285-

288.

Zhou Q, Hellermann GR, Solomonson LP (1995). Nitric oxide release from resting plate-

lets. Thromb Res 77:87-96.

240

estudogeral.sib.uc.ptestudogeral.sib.uc.pt/bitstream/10316/15834/1/tese... · web viewefeito da...

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