workshop de validação de metodologia analítica

Dezembro - 2012

Ministrante: Professora Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira

Workshop de Validação de Metodologia Analítica

• Apresentar a teoria de validação de métodos à luz da Anvisa,

traçando paralelo com outras normas nacionais e

internacionais;

• Estimular análise crítica a respeito do tema;

• Mostrar a importância da leitura de artigos científicos, pois

nenhum tema é esgotado por si só em regulamentos

técnicos;

• Na legislação encontramos “o que deve ser feito” e “não o

como fazer”;

• Refletir a respeito da construção do conhecimento em nossa

prática diária e a contribuição desta para o regulatório.

Objetivos da Palestra

Introdução à Validação

Validação

Definição:

Validação é um ato documentado que atesta que qualquer

procedimento, processo, equipamento, material, atividade ou sistema realmente e consistentemente leva aos

resultados esperados. (RDC nº 17/2010)

“Os estudos de validação são parte essencial das BPF e

devem ser conduzidos de acordo com Protocolos pré-

definidos e aprovados. Relatório (...) contendo os

resultados e conclusões devem ser preparados e

arquivados.” (RDC nº 17/2010)

Validação

Plano Mestre de Validação

“Planejamento de todas as atividades de validação com os

objetivos, procedimentos, prazos e responsabilidades

definidos.”

Deve conter no mínimo: RDC nº 17/2010

I - uma política de validação;

II - estrutura organizacional das atividades de validação;

III - sumário (situação atual e programação);

IV - modelos de documentos ou referência a eles;

V - planejamento e cronograma;

VI - controle de mudanças; e

VII - referências a outros documentos existentes.

É um plano escrito que descreve como a validação será conduzida, definindo os critérios de aceitação.

Inclui:

Pontos de decisão e responsabilidades

Lista de equipamentos

Parâmetros de teste

Desenho experimental

Dados que devem ser coletados e medidos

Documentos inerentes

Protocolo de Validação

É um resumo ou sumário do processo de validação, contendo todos os dados e resultados

obtidos. Deve concluir se os critérios de aceitação foram atingidos e relatar as não conformidades.

Relatório de Validação

Validação da Metodologia

Analítica

Validação de Metodologia Analítica

É o processo pelo qual se estabelece, através de

estudos laboratoriais, que as características de

performance do método, também denominadas

parâmetros de validação, apresentam os requisitos

necessários para aplicação analítica pretendida.

(USP 36).

Definição:

Objetivo:

“A validação dos procedimentos analíticos tem por

objetivo demonstrar que os métodos de ensaio

utilizados apresentam resultados que permitem avaliar

objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme

os parâmetros especificados.”


A Anvisa ressalta a importância da qualidade analítica

dos resultados como um dos instrumentos

fundamentais para a proteção e promoção da saúde

da população. (Guia para qualidade em química

analítica)


Verificar adequação ao uso;

Identificar fontes potenciais de erros;

Conhecer as variáveis críticas;

Apresentar prova de que o método pode ser usado

para tomada de decisão;

Satisfazer especificações / requisitos legais;

EURACHEM, 1998


Uma das ferramenta que garante a qualidade analítica dos

resultados. Permite:

Definições

Método Normalizado:

É aquele desenvolvido por um organismo de

normalização ou outras organizações, cujos métodos

são aceitos pelo setor técnico em questão. (INMETRO -

DOQ-CGRE-008/2011)

Estão aqui incluídos os Métodos Farmacopéicos.

Definições

Método Não Normalizado:

É aquele desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras

partes (por exemplo: pelo laboratório produtor do

medicamento), ou adaptados a partir de métodos

normalizados e validados. (INMETRO - DOQ-CGRE-

008/2011)

Quando Efetuar a Validação do Método?

Método não normalizado

Método criado/desenvolvido pelo próprio laboratório

Ampliações / Modificações dos métodos normalizados

Método normalizado usado fora do escopo indicado

Segundo INMETRO (DOQ-CGRE-008/2011).

Segundo a Anvisa (RE 899/2003).

No caso de metodologia analítica não descrita em

farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente

reconhecido pela Anvisa, deverá ser validada.

Quando Efetuar a Validação do Método?

A metodologia analítica deverá ser revalidada:

Mudanças na síntese da substância ativa;

Mudanças na composição do produto acabado;

Mudanças no procedimento analítico.

Segundo a RE 899/2003.

Determinadas outras mudanças podem requerer validação.

Quando Efetuar a Revalidação do Método?

pH da fase móvel (CLAE) + 0,2 unidades,

Concentração de sais no tampão (CLAE) + 10% (absoluto),

Relação de componentes da fase móvel (CLAE) + 30% (relativo),

Nenhum componente pode ser reduzido a zero (CLAE) ,

Comprimento de onda (CLAE) + 3 nm,

Comprimento da coluna (CLAE, CG) + 70%,

Diâmetro interno da coluna (CLAE) + 50%, (CG) + 25%,

Velocidade de fluxo + 50%,

Revisão: Pharmacopeial Forum 31(3), pag. 834 – 835 .

Modificação x Ajuste

Os Métodos Normalizados Devem Ser Validados?

No caso de metodologias analítica descrita em

farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente

reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será

considerada validada. (RE 899/2003)

O laboratório deve confirmar que tem competência para

aplicar o método de modo apropriado e que atinge o

pretendido e que opera bem sob as condições normais de

uso.(DOQ-CGCRE-008-INMETRO/2011)


Para usar metodologia analítica descrita na USP-NF é necessário verificar sua adequação nas

condições atuais de uso.


Estratégia para Validação de Métodos Normalizados

Definir escopo da aplicação

O método atende ?

N Validação

completa

Verificar competência do

laboratório

S

Documentar resultados

Definição:

Evidência documentada que um método previamente validado desempenha como pretendido, no ambiente em que está sendo aplicado.

O que é Verificação?

Segundo a RDC Nº. 31, DE 11 DE AGOSTO DE 2010

Validação parcial para método de teor.

Especificidade, linearidade, exatidão, precisão

(repetibiliddae e intermediária) e intervalo.

Verificar a especificidade, a estabilidade da solução da

amostra e a precisão intermediária.

Segundo o FDA.

Verificação da competência analítica.

Validação

Otimização Desenvolvimento

Estratégia para Validação de Métodos Não Normalizados

Resultado obtido com colunas cromatográficas diferentes.

Desenvolvimento/Otimização

T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos teóricos.

Coluna

cromatográfica

T

k’

N

C18 1,63 8,93 1969

C8 1,27 9,76 5175

Resultados referentes à variação proporção da fase móvel.


Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos

teóricos.

Proporção da fase móvel Rt T k’ N

75:25 2,93 1,51 4,87 3320

80:20 3,79 1,39 6,58 4055

85:15 5,32 1,27 9,65 5249


Resultados referentes à variação de pH da fase móvel (85:15).

Rt = tempo de retenção; T=Fator de cauda ou assimetria; k’= Fator de capacidade; N - Número de pratos

teóricos.

pH Rt T k’ N

5,0 5,44 1,29 9,88 5208

6,0 5,45 1,28 9,89 5252

6,5 5,38 1,28 9,77 5165

No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou

formulários oficiais.

Robustez

LQ e LD

Repetibilidade

Reprodutibilidade

Precisão intermediária

Especificidade e Seletividade

Linearidade

Intervalo

Precisão

Exatidão De acordo com

a classificação

do teste segundo

sua finalidade.

Segundo a RE 899.


Classificação dos testes segundo sua finalidade

Categoria Finalidade do teste

I Testes quantitativos para determinação do

princípio ativo em produtos farmacêuticos ou

matérias-primas.

II Testes quantitativos ou ensaio limite para

determinação de impurezas e produtos de

degradação em produtos farmacêuticos ou

matérias-primas.

III Testes de performance (por exemplo: dissolução,

liberação do ativo)

IV Testes de identificação.

Definir o objetivo do método;

Definir os parâmetros de desempenho e critérios de aceitação;

Desenvolver o PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO;

Definir os experimentos de validação – conhecer bem o método antes de iniciar a validação;

Executar os experimentos preliminares (definição dos testes de conformidades do sistema);

Ajustar os parâmetros do método se necessário;

Realizar os experimentos completos de validação - Executar o protocolo de validação;

Desenvolva POP para a execução do método, na rotina;

Prepare o RELATÓRIO DE VALIDAÇÃO.

Planejamento (passos) da Validação.

Ensaios necessários para a validação do método.

Categoria IV

Categoria III

Categoria II

Quantitativo Ensaio limite

Categoria I Parâmetro

Especificidade SIM SIM SIM SIM

Linearidade SIM SIM

SIM SIM Intervalo

*

*

LD

LQ

Exatidão

Robustez

Precisão SIM SIM

SIM

SIM

SIM

SIM

SIM

** **

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

*

Repe

Inter

*

NÃO

SIM

SIM

*

**

*

*

*

SIM

NÃO NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

NÃO

* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária.

Teste de Adequação do Sistema

Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da adequação do sistema (SHABIR, 2003)

Parâmetros Recomendações

Fator de capacidade (k') O pico deve estar bem resolvido de outros

picos e do volume morto k' 2,0.

Repetitividade É desejável um DPR 1% para N 5

Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada

Resolução (R)

R 2 entre o pico de interesse e o potencial

interferente que elui mais próximo

Fator de cauda (T) T 2

Número de pratos teóricos (N) Em geral deve ser 2000

Definição dos Parâmetros de

Validação

Definição dos Parâmetros de Validação

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário demonstrar a capacidade de discriminação do método.

Especificidade

Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas comparação dos resultados obtidos de amostras contaminadas (impurezas ou excipientes) com amostras não contaminadas –

demonstrar que o resultado do teste não é afetado.

Impureza ou produto de

degradação não disponíveis

Utilizar amostras armazenadas sob

condições de estresse (Ex: luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica,

oxidação).


Especificidade

Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos.

Detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas.

Plano Experimental

Análise Qualitativa – Identificação

Preparar um placebo (matriz),

Contaminar o placebo com o material de referência,

Comprovar o resultado positivo para o placebo contaminado com o material de referência e o resultado negativo para a matriz em branco.

Especificidade

2.41

2.94

3.10

4.39

5.28, Didanosina

0 1 2 3 4 5 6 7

Retention Time (min)

0

50

100

150

200

250

300

350

Intensity (mV)

Exemplo de um estudo de Especificidade.

Cromatograma do Padrão 100%.

N

N

N

NH

O

OHO

3.29

0 1 2 3 4 5 6 7


0

50

100

150

200

250

300

350

400

Intensity (mV)


Cromatograma do Placebo.

2.41

2.94

3.10

3.33

4.39

5.29, Didanosina

0 1 2 3 4 5 6 7


0

50

100

150

200

250

300

350

Intensity (mV)

Cromatograma do Placebo contaminado.

N

N

N

NH

O

OHO


Resolução entre picos adjacentes, do componente principal e outros componentes (Rs) > 2.

Impurezas e produtos de degradação não disponíveis, submeter

amostras a condições de estresse: exposição a temperatura, exposição a luz, hidrólise ácida (HCl 0,1N), hidrólise alcalina (NaOH 0,1N) e Oxidação (H2O2 3%). Comparar os resultados obtidos com as amostras degradadas e não degradadas.

Plano Experimental

Especificidade

Cromatograma obtido após exposição à temperatura de 1000 C

2.48

3.03

3.18

4.83

5.48, Didanosina

0 1 2 3 4 5 6 7


0

50

100

150

200

250

300

Intensity (mV)


Cromatograma obtido após exposição à solução de ácido clorídrico 0,1N.

2.49

3.26

0 1 2 3 4 5 6 7


0

100

200

300

400

Intensity (mV)


Cromatograma obtido após exposição à solução de peróxido de

hidrogênio 3 %

0.24

1.62

2.30

2.51

3.26

3.96

4.59

5.66, Didanosina

0 1 2 3 4 5 6 7


0

50

100

150

200

250

300

350

400

Intensity (mV)


Cromatograma após injeção da solução de hipoxantina

2.54, Hipoxantina

0 1 2 3 4 5 6 7


0

10

20

30

40

50

60

70

80

Intensity (mV)


Cromatograma obtido após injeção da solução de Didanosina

contaminada com hipoxantina, R= 13,51

2.51, Hipoxantina

3.34

5.79, Didanosina

0 1 2 3 4 5 6 7


0

50

100

150

200

250

300

350

Intensity (mV)


Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise

de, no mínimo, 5 concentrações diferentes.

Linearidade

É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado.

Estas concentrações devem seguir os intervalos da tabela a seguir:


Limites percentuais do teor do analito que devem estar contidos no

intervalo de linearidade para alguns métodos analíticos.

Ensaio Alcance

Determinação quantitativa do analito em

matérias-primas ou em formas farmacêuticas

De 80% a 120% da concentração teórica

do teste.

Determinação de impurezas Do nível de impureza esperado até 120%

do limite máximo especificado. Quando apresentarem importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os

limites de quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de

impurezas a serem controladas.

Uniformidade de conteúdo De 70% a 130% da concentração teórica

do teste.

Ensaio de dissolução De ± 20% sobre o valor especificado para

o intervalo. Caso a especificação para a dissolução envolva mais de um tempo, o alcance do método deve incluir –20%

sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor.

Plano Experimental

Preparar uma solução mãe da substância química de

referência e a partir desta, diluições a fim de obtermos

soluções em cinco níveis de concentração. Por exemplo:

50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.

Linearidade

Elaborar Curva de Calibração

Calcular coeficiente angular (b)

Calcular coeficiente linear (a)

Cálculo do coeficiente de correlação linear (r)

Cálculo do erro padrão da estimativa (desvio padrão residual), (Se)

Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE)

Calcular a Média, Variância o DP e o DPR . Prosseguir com

os seguintes cálculos.

Cálculos Estatísticos

Linearidade

Um resultado analítico afetado por erro grosseiro difere, quase

sempre de modo visível, dos demais resultados do conjunto das

determinações executadas (replicatas) em paralelo na mesma amostra.

Determinação de Valores Aberrantes.

Tais resultados são denominados aberrantes, comprometendo a

precisão e a exatidão do resultado final.

Portanto o tratamento estatístico dos dados inicia-se pela detecção

de valores aberrantes, que pode ser realizado através do teste de

Grubbs.

Este teste estatístico pode ser aplicado quando se deseja verificar se

o menor valor ou o maior valor é aberrante, denominado teste de

Grubbs para um valor aberrante, onde n 3.


s

xxG

i

Em função do número de replicatas (n) e um nível de significância .

Onde :

= valor suspeito de ser aberrante.

= média dos valores obtidos.

= desvio padrão dos valores obtidos.

ix

x

s

Teste de Grubbs.

Se G calculado > G tabelado ----- valor suspeito é considerado

aberrante, e então descartado.

Se G calculado < G tabelado ------- valor suspeito não é considerado

aberrante.


Determinação de valor aberrante. Teste de Grubbs

Estudo de caso.

s

xxG

i

Gcalc > Gtab

x s= 74,76 = 0,75 Aberrante, portanto, é descartado.


Gtab = 1,89

Padrão 50 % Padrão 75 % Padrão 100 % Padrão 125 % Padrão 150 %

Replicata 1 49,94 75,10 100,18 124,35 148,43

Replicata 2 49,88 75,00 100,07 124,31 148,44

Replicata 3 49,99 75,14 99,78 124,15 148,25

Replicata 4 49,96 73,23 99,95 124,04 148,26

Replicata 5 49,99 75,00 99,93 124,43 148,23

Replicata 6 49,99 75,09 100,10 124,30 148,19

04,2

75,0

76,7423,73

G

A variância é calculada dividindo o somatório dos quadrados dos

desvios de cada valor em relação à média, pelo número de graus de

liberdade (n-1).

Variância (s2 ou V).

1

2

2

n

xxs

i

Desvio padrão é igual a raiz quadrada positiva da variância. Deve

ser expresso com dois algarismos significativos.

Desvio padrão (s ou DP).

1

2

n

xxs

i



Homocedasticidade Verificar a homocedasticidade, ou seja, a independência da variância

das respostas do método com as concentrações das amostras

analisadas (homogeneidade da variância dos resíduos) pelo teste de

Cochran, aplicando a fórmula que se segue.

2

2

s

maiorsC

cal

maiors2

2

s

Onde:

= maior variância

= somatório das variâncias

Se C calculado < C tabelado Homocedasticidade

Se C calculado > C tabelado Heterocedasticidade


Homocedasticidade:

Se o critério de homocedasticidade for aceito, a regressão linear é

executada pelo método dos mínimos quadrados, que estima qual a

melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente a

partir da curva de calibração.

Se não houver relação linear, realizar transformação matemática

Homocedasticidade

2

2

s

maiorsC

cal

maiors2

2

s

= 0,020

= 0,058


Aplicando a fórmula, C calculado = 0,344.

Como C calculado 0,344 é menor que

C tabelado 0,506.

O critério de homocedasticidade foi

aceito.

Curva de calibração:

Realizada análise de regressão deve-se apresentar o coeficiente de

correlação linear (r), a inclinação (coeficiente angular), o intercepto

da reta (coeficiente linear), soma residual dos quadrados mínimos

da regressão linear e desvio padrão. A regressão linear é

representada por uma equação do tipo:

Onde, é o valor da resposta para uma dada concentração x do

analito.

bxay ˆ

y


2

ˆii

yySSE

= valor previsto pela reta (valor projetado).

SSE

iy

iy

Onde,

= soma dos quadrados dos resíduos.

= valor observado experimentalmente (valor medido).

Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).


Cálculo da soma dos quadrados dos resíduos (SSE).

O critério da reta de regressão é encontrar os coeficientes a e b,

que minimizem a soma dos quadrados dos resíduos, procedimento

denominado método dos quadrados mínimos.

Se os pares de valores estiverem contidos na reta ajustada a

soma dos quadrados dos resíduos será igual a zero e a explicação

da reta ajustada será completa (reta ideal), portanto o objetivo é que

a soma dos quadrados dos resíduos seja mais próxima de zero

possível.


2

ˆ2

n

yys

ii

e

= n -2 graus de liberdade

Onde,

= erro padrão da estimativa (desvio padrão residual)

= valor observado experimentalmente (valor medido)

= valor previsto pela reta (valor projetado)

es

iy

iy

Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).


O erro padrão da estimativa mede a dispersão dos desvios,

denominados resíduos, ao redor da reta de regressão.

Cálculo do erro padrão da estimativa (Se).

O conceito do erro padrão da estimativa ou desvio padrão

residual, é equivalente ao do desvio padrão que mede a

variabilidade dos valores da amostra ao redor da média aritmética

desses valores.

Atendidas as premissas de regressão linear, se espera que

aproximadamente 95 % dos valores da amostra y se encontrem no

intervalo de + 2 x se de seus respectivos valores projetados pela reta

de regressão , ou seja, que os valores dos resíduos se encontrem

neste intervalo (+ 2 x se).


Cálculo da Linearidade usando a Planilha Excel.

Analista 1:

Estatística de regressão

R múltiplo 0,999972427

R-Quadrado 0,999944855

R-quadrado ajustado 0,999940613

Erro padrão 0,27788902

Observações 15

Resultado:

Erro Padrão da Estimativa ou Desvio Padrão Residual (Se)

Estudo de caso.

Critério de Aceitação:

Os valores dos resíduos devem-se encontrar no intervalo (+ 2 x Se).


Resultado dos resíduos.

Como pode ser observado na tabela o resultado dos resíduos foi satisfatório.

Encontram-se dentro do intervalo de + 2 x 0,28 = + 0,56.


Analista 1:

Identificação da amostra: Padrão Lamivudina INCQS

Concentração Y previsto Resíduos

1 50,32 -0,23

2 50,32 -0,30

3 50,32 -0,23

4 74,95 0,18

5 74,95 0,10

6 74,95 0,16

7 99,59 0,44

8 99,59 0,35

9 99,59 0,44

10 124,22 -0,22

11 124,22 -0,23

12 124,22 -0,29

13 148,85 0,06

14 148,85 -0,18

15 148,85 -0,05

Variável X 1 Plotagem de resíduos

-0,50

0,00

0,50

0 200 400 600 800

Variável X 1

Resíd

uo

s

PLOTAGEM DE AJUSTE DE

LINHA.

0

200

0 200 400 600 800

Variável X 1

Y Y

Y previsto

Estudo dos resíduos e dos valores medido e previsto para y.

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor

verdadeiro.

Ou compara-se os resultados obtidos com aqueles resultantes de uma segunda metodologia bem caracterizada, cuja exatidão tenha sido estabelecida.

Exatidão.

Para o Fármaco:

Aplica-se a metodologia analítica proposta, na análise de uma substância de pureza conhecida (padrão de referência).


No caso de todos os componentes do medicamento não estarem disponíveis, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao medicamento.

Para o Produto (Forma Farmacêutica).

Analisa-se uma amostra, na qual foi adicionada uma quantidade conhecida do fármaco a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado).


Exatidão.

No caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de degradação, aceita-se a comparação dos resultados obtidos com um segundo método bem caracterizado (metodologia farmacopéica ou outro procedimento analítico validado).

Para Impurezas.

Utiliza-se o método de adição de padrão, no qual adiciona-se quantidades conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao fármaco.


Exatidão.

no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada.

A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de:

A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, acrescida do intervalo de confiança.


Exatidão.

Preparar uma solução mãe concentrada e efetuar as diluições na matriz a fim de obter três concentrações diferentes. Partir da solução mãe também para a calibração, para evitar erros de pesagem.

Plano Experimental

Exatidão.

Efetuar nove determinações, em três concentrações diferentes, com três réplicas cada, por exemplo: 75%, 100% e 125% do valor rotulado, em triplicata de injeção.

Realizar as análises no mesmo dia usando o mesmo analista.

É geralmente expressa como porcentagem de recuperação (R%) da

substância de interesse, calculada segundo a fórmula, acrescida

dos intervalos de confiança.

Onde,

= concentração teórica correspondente (valor esperado).

= porcentagem de recuperação.

= média dos resultados (valor determinado experimentalmente).

x

xR

100%

R %

x

x


Exatidão.

a

saca

x

xxR

100%

Onde,

= porcentagem de recuperação

Quando não há possibilidade de preparar matriz limpa da amostra,

adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de

referência) ao medicamento, para determinar a Exatidão, que é

calculada segundo a fórmula.

= conc. medida na amostra com adição do analito ou padrão

= conc. medida na amostra sem adição do analito ou padrão

= concentração adicionada

%R

cax

sax

ax


Exatidão.

Calcular a Média,

Calcular o Desvio padrão (DP),

Calcular o Desvio padrão relativo (DPR),

Calcular o percentual de Recuperação,

Calcular o Intervalo de confiança.

Critérios de Aceitação - Exatidão

Para ensaios de teor (maior componente) a recuperação média

deve ser de 100% + 2% para cada concentração na faixa de 80 a

120% da concentração alvo ou de estudo.


Exatidão.

Intervalo de confiança (IC).

É o intervalo dentro do qual o valor verdadeiro se encontra.

n

tsx

Portanto:

= valor verdadeiro

= média dos valores obtidos x

n

tsIC

n0 de graus de liberdade, = n –1

Onde,

= valor tabelado, em função de:

= desvio padrão

= tamanho da amostra (número de replicatas)

s

n

t


nível de significância ().

Analista 1:

Identificação das amostras: Placebo contaminado - Lamivudina comprimido revestido

Concentração da

amostra

75% 100% 125%

Replicata A1 98,02 99,34 99,26

Replicata A2 98,31 99,48 99,18

Replicata A3 98,35 99,51 99,14

Replicata B1 100,71 98,32 99,44

Replicata B2 100,51 98,40 99,36

Replicata B3 100,56 98,39 99,42

Replicata C1 98,63 99,12 99,36

Replicata C2 98,68 99,38 99,38

Replicata C3 99,18 99,21 99,46

Média 99,22 99,02 99,33

DP 1,08 0,50 0,11

DPR 1,09 0,51 0,12

% Recuperação 99,22 99,02 99,33

IC +0,83 +0,38 +0,08

Cálculos Estatísticos Exatidão.

n

tsIC

ttab = 2,306.

= n –1 = 8

Nível de 75%.

83,09

08,1306,2

IC

Nível de 100%.

Nível de 125%.

38,09

50,0306,2

IC

08,09

11,0306,2

IC

% R = 99,22 + 0,83%

% R = 99,02 + 0,38 %

% R = 99,33 + 0,08 %


Exatidão.

60 – 115 0,000 000 01 10 ppb

80 – 110 0,000 001 1 ppm

90 – 107 0,000 1 0,01 %

95 – 105 0,001 0,1 %

97 – 103 0,01 1 %

98 – 102 0,1 10 %

98 – 102 1,0 100 %

Recuperação média

%

Concentração

Fracional

Concentração

Critério De Aceitação : AOAC, 2000

Critérios de Aceitação - Exatidão

Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

Precisão.

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é considerada em três níveis.

Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação.


Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias.

Estes dados não precisam ser apresentados para a concessão de registro.


Precisão.

Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.

A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste.


Precisão.

Verificar a precisão nos níveis repetibilidade e precisão intermediária. Efetuar seis determinações, a 100% do valor rotulado, através da analise de três amostras diferentes.

No nível repetibilidade realizar as seis análises, de cada uma das amostras, no mesmo dia e com o mesmo analista. Para o parâmetro precisão intermediária, com as mesmas amostras descritas acima, executar três tipos de comparação: Repetir as análises, usando um analista diferente. Repetir as analises, utilizando um equipamento diferente.

Plano Experimental

Precisão.

Repetibilidade Calcular a Média,

Calcular o DP,

Calcular o DPR.

Precisão Intermediária – Teste de F Calcular as variâncias (s2),

Calcular o valor de F para cada uma das comparações utilizadas

para avaliação da precisão intermediária.


Precisão.

Amostra Laboratório A Laboratório B Laboratório C

A1 101,84 100,16 96,97

A2 102,61 100,52 97,32

B1 101,54 98,05 96,55

B2 101,71 98,26 96,78

C1 100,58 99,27 98,27

C2 100,57 99,31 98,46

D1 101,85 98,56 96,41

D2 101,74 98,72 95,80

E1 101,18 98,52 96,35

E2 101,19 98,78 96,15

F1 100,54 99,00 96,83

Média 101,33 99,02 96,89

DP 0,67 0,73 0,79

DPR 0,66 0,74 0,82


Precisão.

Repetibilidade Calcular a Média,

Calcular o DP,

Calcular o DPR.

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a

metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, do

tipo de matriz e a finalidade do método, não se admitindo valores

superiores a 5% (RE 899).

Critério de Aceitação segundo a RE 899/2003:


Precisão.

Repetibilidade

Critérios de Aceitação - Precisão

Fórmula empírica de Horwitz RSD r 2(1 - 0,5 log c). 0,67

Analito % Horwitz Calculado DPR r %

100 2 1,3

10 2,8 1,9

1 4 2,7

0,1 5,6 3,7

0,01 8 5,3

0,001 11 7,3

0,0001 16 11

0,00001 23 15

0,000001 32 21

0,0000001 45 30

c – concentração fracional: representa a concentração percentual

dividida por cem.

Precisão Intermediária – Teste de F Calcular as variâncias (s2),

Calcular o valor de F para cada uma das comparações

utilizadas para avaliação da precisão intermediária.


Comparação de variâncias (s2): Teste de F.

Para comparação de variâncias pelo Teste-F, partimos da

hipótese nula de que não há diferença significativa entre as

variâncias comparadas, ou seja:

2

2

2

1ss :

1H:

0H 2

2

2

1ss


O teste de hipótese aqui realizado, ou seja para comparação

de variâncias, é um teste em duas caudas, portanto a tabela de F

utilizada é a bicaudal.



para os graus liberdade (para o numerador)

o (nível de significância) definido;

111 n

122 n e para os graus liberdade (para o denominador)

calcF

2

2

2

1

s

s

2

2

2

1ss

O Ftab é encontrado na tabela de F, para:

calcF

2

2

2

1

s

s

2

2

2

1ss



Para que a hipótese nula seja aceita, Fcalc < Ftab ou Fcrit .

O valor de Fcalc é sempre maior que a unidade.

Identificação das amostras: Amostras do laboratório A

analisadas por analistas diferentes.

Amostras

Laboratório A

Analista 1

Equip. 2

Analista 2

Equip. 2

A1 101,84 100,36

A2 102,61 100,54

B1 101,54 99,46

B2 101,71 99,55

C1 100,58 101,53

C2 100,57 99,89

D1 101,85 100,24

D2 101,74 100,39

E1 101,18 100,05

E2 101,19 100,02

F1 100,54 100,85

F2 100,58 100,84

Média 101,33 100,31

DP 0,67 0,58

DPR 0,66 0,58

s2 0,45 0,34

Fcalc. = 0,45/0,34

Fcalc = 1,32

Ftab= 3,43

Fcalc< Ftab

H0 é aceita.

Analistas diferentes:

satisfatória

:0

H 2

2

2

1ss

2

2

2

1ss :

1H

Precisão Intermediária

Identificação das amostras: Amostras do laboratório A analisadas

com equipamentos diferentes.

Amostras

Laboratório A

Analista 2

Equip.2

Analista 2

Equip.1

A1 100,36 99,21

A2 100,54 98,80

B1 99,46 100,41

B2 99,55 100,83

C1 101,53 99,50

C2 99,89 99,64

D1 100,24 100,41

D2 100,39 100,07

E1 100,05 99,02

E2 100,02 99,03

F1 100,85 99,02

F2 100,84 98,80

Média 100,31 99,56

DP 0,58 0,70

DPR 0,58 0,70

S2 0,34 0,49


:0

H 2

2

2

1ss

2

2

2

1ss :

1H

Fcalc = 0,49/0,34

Fcalc = 1,44

Ftab= 3,43

Fcalc< Ftab

H0 é aceita.

Equip. diferentes:

satisfatória

A ANOVA (análise de variância) é utilizada para comparação de

duas ou mais análises, a partir da distribuição F, utilizada para

realizar o teste de hipótese, onde a hipótese nula é de que não

há diferenças estatisticamente significativas entre as análises,

se Fcalc < Ftab aceita-se a hipótese nula ( ). :0

H

Ftab para o nível de significância adotado.



Exatidão,

Intervalo

Intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico.

É estabelecido pela confirmação de que o método apresenta:

O intervalo depende da aplicação pretendida.

Precisão, Linearidade

... adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substâncias dentro do intervalo especificado.


O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável.

Limite de Detecção (LD).

O Limite de Detecção é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.


A avaliação do limite de detecção (LD) pode ser: Visual,

Relação sinal/ruído - 3:1,

Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 3 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração

A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :

Desvio padrão do Branco.

Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.


A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.

O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.

Limite de Quantificação (LQ).

O Limite de Quantificação é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser determinada com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições experimentais estabelecidas.



Limite de Quantificação (LQ).

Relação sinal/ruído - 10:1,

Desvio Padrão da resposta e inclinação. LD = 10 x DP DP = Desvio padrão IC IC = Inclinação da curva de calibração A inclinação pode ser estimada da curva de calibração do analito.

A estimativa do desvio padrão DP pode ser feita :

Desvio padrão do Branco.

Baseado na Curva de Calibração - Construir três curvas de calibração na faixa do LQ, o DP da intersecção Y pode ser usado como DP.

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal.

Robustez.

Caso haja susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.


Robustez.

Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico:

Preparo das Amostras: Tempo de extração

Estabilidade das soluções analíticas

Espectrofotometria: Variação do pH da solução Diferentes fabricantes de solventes

Cromatografia Líquida: Variação do pH da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel


Cromatografia Gasosa. Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

Temperatura

Velocidade do gás de arraste


Robustez.

Avaliação da Robustez

Planejamento experimental para avaliar a robustez pelo

método de Youden – matriz de experimento;

A verificação da robustez deve ser realizada após a

validação do método;

Avaliar qual o impacto das variações – teor (exatidão)

Bibliografia

ANVISA, Habilitação de Laboratórios Analíticos em saúde – segundo os

requisitos da ISO/IEC 17025 – Procedimento GGLAS 02/17025, 2. ed, Brasília,

2002.

ANVISA, Guia para Qualidade em Química Analítica – Uma Assistência a

Acreditação, v. 1, 1. ed, Brasília, 2004.

BRASIL, Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a

publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". Diário

Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003.

ANVISA, Informe Técnico nº 1 de 15 de julho de 2008 – Esclarecimento sobre o

item 2.9 do anexo da Resolução RE nº 1 de 29/07/2005, que trata do Guia para

Realização dos Estudos de Estabilidade.

Bibliografia

FURMAN,W. B. Pharm.Techn. 22, (6), 1998, 54 -65.

CDER (Center for Drug Evaluation and Research). Validation of Chromatografic

Methods, nov. 1994.

INMETRO DOQ-CGCRE-008 Orientações sobre Validações de Métodos de

Ensaios Químicos. RJ, Brasil, 20003.

LAPPONI, J.C. Estatística usando Excel. São Paulo: Lapponi treinamento e editora,

2000.

BRITO, N.M. Avaliação da Exatidão e da Precisão de Métodos de Análise de

Resíduos de Pesticidas Mediante Ensaios de Recuperação. Pesticidas:

R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 12, p. 155-168, jan./dez. 2002

BRASIL, Resolução (RDC) nº 210, de 04 de agosto de 2003. Atualiza as Boas

Práticas de Fabricação de medicamentos com o objetivo de acompanhar o

desenvolvimento de novas tecnologias. Diário Oficial [da] Republica Federativa do

Brasil, Brasília, DF, 14 de agosto de 2003.

Bibliografia

PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. Verification of Compendial

Procedures, 31(2), Mar-Abr, 2005, p. 555-558.

PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs. 31(3), May-June, 2005, p. 834-835.

SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for

pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between

validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US

Pharmacopoeia and the International Conference on Harmonization. Journal of

Chromatography A, 987, p. 57-66, 2003. Disponível em http://www.sciencedirect.com,

Acesso em: 16 de abril de 2003.

USP (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA). Chromatography, 27 ed. Rockville:

United States Pharmacopeial Convention, 2004, p. 2272 – 2284.

NBR ISO/IEC 17025, Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de

Calibração e de Ensaios. ABNT, RJ, Brasil, 2001.

http://www.sciencedirect.com/







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