współdziałanie szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych hsf1 i nfκb

Współdziałanie szlaków sygnałowych zależnych od

czynników transkrypcyjnych HSF1 i NFκB

Patryk Janus

Opiekun pracy: Prof. Dr hab. Piotr Widłak

Przebieg pracy:

I. Identyfikacja genów zależnych od NFκB, których ekspresja ulega zmianie w obecności aktywnej formy HSF1:

1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne w komórkach U2-OS w warunkach hipertermii i/lub stymulacji cytokiną TNFα:

a) przeprowadzenie eksperymentu – stymulacja komórek HS i/lub TNFα,b) analiza mikromacierzowa – Human Genome U133 Plus 2.0 Array

(Affymetrix),c) normalizacja i analiza otrzymanych danych mikromacierzowych.

2. Analiza funkcjonalna:

a) wybór genów up- i down-regulowanych w różnych wariantach traktowania HS i/lub cytokiną TNFα,

b) wykorzystanie internetowych baz danych umożliwiających klasyfikację wybranych genów do określonych ścieżek sygnałowych i procesów biologicznych – Gene Ontology, KEEG Pathway, PANTHER.

II. Identyfikacja genów zależnych od NFκB, z których promotorami wiąże się HSF1:

1. ChIP - sequencing

2. ChIP – real-time PCR kinetyka wiązania się aktywnego czynnika HSF1 do promotorów wybranych genów zależnych od NFκB:

a) bioinformatyczna analiza promotorów genów zależnych od NFκB, których ekspresja ulega zmianie w obecności aktywnego HSF1 (wg danych mikromacierzowych, wg danych ChIP-seq)

b) przeprowadzenie eksperymentu – stymulacja komórek HS i immunoprecypitacja chromatyny z przeciwciałem anty-HSF1

c) przeprowadzenie reakcji real-time PCR dla wybranych genów

1. Całogenomowe profilowanie ekspresyjne (…)

a) przeprowadzenie eksperymentu

U2OS WT U2OS TG

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

TNFα

TNFαHS

HS

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

-1,5h -0,5h 0h 1,5h

TNFα

WT K

WT TNF

WT HS/TNF

WT HS

TG K

TG TNF

b) analiza mikromacierzowa

TNFα 10 ng/ml

HS 43°C

c) normalizacja i analiza otrzymanych danych mikromacierzowych


4542 1189343NFκB consensus HSF1 consensus

Liczba genów posiadająca w obszarze promotorowym motyw dla czynnika NFκB lub/i czynnika HSF1 (wg bazy GO)

18 966 genów poddanych analizie metodą mikromacierzy


Wpływ szoku termicznego (HS) lub obecności aktywnego czynnika HSF1 (aHSF1) na zmianę profilu ekspresji genów potencjalnie zależnych od NFκB lub HSF1


Zmiana profilu ekspresji genów aktywowanych cytokiną TNFα (TNF) w komórkach typu „dzikiego” (WT) stymulowanych HS lub w komórkach z ekspresją

konstytutywnie aktywnego czynnika HSF1 (TG)

(WT HS/TNF vs WT K) (TG TNF vs TG K)

324 geny

WT TNF (WT TNF vs WT K)

(wzrost lub spadek ekspresji)

(WT HS/TNF vs WT HS) (TG TNF vs WT K)

1748 genów


218

141 genów(wzrost lub spadek ekspresji)

24

1170 genów


274 geny(wzrost lub spadek

ekspresji)

114

250


(WT HS/TNF vs WT K) (TG TNF vs TG K)

324 geny



(WT HS/TNF vs WT HS) (TG TNF vs WT K)

1748 genów


218

141 genów(wzrost lub spadek ekspresji)

24

1170 genów


274 geny(wzrost lub spadek

ekspresji)

114

250

2. Analiza funkcjonalna

324 geny



02468

101211.4285714285714

6.451612903225815.797101449275365.607476635514024.44444444444445

3.333333333333333.194888178913743.004291845493562.918287937743192.830188679245282.65780730897012.628571428571431.985111662531021.532567049808430.7518796992481210.505050505050505

Gene Ontology

% g

enów

o z

mie

nio

nej

eksp

resj

i

„X” - liczba genów o zmienionej ekspresji


324 geny



Z motywem dla NFκB

113

Z motywem dla HSF1

29

INNE

182

Geny z motywem dla NFκB:ADAMTS6 ARAP2 ARL14 ATF3 AZIN1 BCL2A1 BDKRB1 BDNF BIRC2 BIRC3 BTG2 C14orf43 C19orf21 C3orf52 CCL2 CCL20 CCNL1 CD83 CEP135 CHRND

CHST3 COL12A1 CYP27B1 CYR61 DCAF12 DNAJC30 DNASE2 DUSP2 EDN1 EGR1 EGR2 EGR4 EHD1 EPB41L2 ETS1 ETS2 FAM179A FAM46C FAM82B FEM1C FOSB FOSL1 FRMD6 GADD45B GEM GJB3 HIST1H1A HMGCS1 HOXA3 IFNGR2 IKBKB IL17RD IL8 INHBA IRF1 IRF2BPL ITPRIPL2 KBTBD2 KCTD11

LAMB3 LIF MAP2K3 MED26 MSX1 NACC2 NFKB1 NFKBIA NFKBIE NR2F2 NR4A1 NR4A2 PCDH7 PMEPA1 PPP1R15A PSG2 PTX3 REL RELB RHOB RPS19BP1 RRAD S1PR1 SAT1 SDC4 SLC12A7 SMAD7 SQSTM1 TBC1D1 TGIF1 TIPARP TMEM126B TMEM170A TNFAIP3 TNFRSF9 TNIP1 TRAF5 TRAK1

TRIM47 UPF2 USP37 USP46 WDR1 WDR24 ZC3H10 ZCCHC9 ZFP36 ZFP90 ZNF133 ZNF140 ZNF398 ZNF441 ZNF805 ZNF827

+ aHSF

1GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG K

ADAMTS6 1,37 1,30ARAP2 0,70 1,12ARL14 2,90 2,64ATF3 2,19 1,17

AZIN1 1,22 1,12BCL2A1 3,24 4,49BDKRB1 2,39 3,34

BDNF 0,64 0,72BIRC2 1,33 1,38BIRC3 7,27 5,81BTG2 1,67 1,62

C14orf43 1,57 1,41C19orf21 0,86 0,98C3orf52 1,70 1,99

CCL2 8,26 6,14CCL20 10,24 6,01CCNL1 1,57 1,10CD83 4,73 4,39

CEP135 1,26 1,22CHRND 1,04 1,00CHST3 0,85 0,97

COL12A1 1,19 1,11CYP27B1 2,00 1,24

CYR61 1,30 1,06DCAF12 0,95 1,00

DNAJC30 0,90 1,06DNASE2 1,18 1,00DUSP2 2,10 1,25EDN1 1,80 1,55EGR1 2,23 0,91EGR2 3,39 0,96EGR4 2,37 0,91EHD1 1,30 1,44

EPB41L2 1,25 1,11ETS1 1,43 1,49ETS2 1,85 1,97

FAM179A 0,92 1,00FAM46C 1,51 1,38

GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG KFAM82B 0,88 0,91FEM1C 1,45 1,08FOSB 4,05 1,61FOSL1 1,55 1,22

FRMD6 1,09 1,20GADD45B 1,52 1,03

GEM 1,68 1,56GJB3 0,74 0,89

HIST1H1A 0,74 0,94HMGCS1 1,30 1,25HOXA3 0,80 0,93IFNGR2 1,32 1,20IKBKB 1,12 1,01

IL17RD 0,83 1,00IL8 8,81 4,18

INHBA 1,63 1,74IRF1 3,37 2,39

IRF2BPL 0,81 0,91ITPRIPL2 0,84 0,99KBTBD2 1,25 1,07KCTD11 1,46 1,50LAMB3 1,61 1,58

LIF 1,44 1,49MAP2K3 1,12 1,16MED26 1,19 1,04MSX1 1,32 1,16

NACC2 0,79 0,89NFKB1 3,21 3,11NFKBIA 2,87 1,38NFKBIE 2,26 1,90NR2F2 0,80 0,82NR4A1 1,55 0,94NR4A2 1,64 0,91PCDH7 0,79 1,01

PMEPA1 0,81 0,95PPP1R15A 1,56 1,30

PSG2 0,99 1,00PTX3 10,10 11,06

GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG KREL 2,72 2,42

RELB 3,44 2,78RHOB 1,37 1,01

RPS19BP1 0,90 0,88RRAD 1,43 1,23S1PR1 0,91 1,02SAT1 1,44 1,12SDC4 1,46 1,27

SLC12A7 2,03 1,69SMAD7 1,33 1,19SQSTM1 1,29 1,12TBC1D1 0,94 1,01TGIF1 0,84 1,02

TIPARP 1,61 0,96TMEM126B 0,93 0,95TMEM170A 1,16 0,88

TNFAIP3 9,12 3,40TNFRSF9 1,78 2,46

TNIP1 1,21 1,25TRAF5 0,75 0,93TRAK1 0,89 0,99

TRIM47 1,34 1,43UPF2 0,92 0,95

USP37 0,85 0,95USP46 0,90 0,99WDR1 1,14 1,08

WDR24 0,97 1,00ZC3H10 0,78 0,90ZCCHC9 0,88 0,92ZFP36 1,85 1,11ZFP90 0,87 1,01

ZNF133 0,72 0,85ZNF140 1,23 1,12ZNF398 0,97 1,00ZNF441 0,97 1,00ZNF805 1,20 0,98ZNF827 0,75 0,90

Geny ze zmienionym poziomem ekspresji pod wpływem tgHSF1 >= 20%:

GeneSymbol WT TNF vs WT K TG TNF vs TG K Różnica w %EGR2 3,39 0,96 71,7

TNFAIP3 9,12 3,40 62,7EGR4 2,37 0,91 61,4FOSB 4,05 1,61 60,2EGR1 2,23 0,91 59,1

IL8 8,81 4,18 52,6NFKBIA 2,87 1,38 52,1

ATF3 2,19 1,17 46,8NR4A2 1,64 0,91 44,4CCL20 10,24 6,01 41,3DUSP2 2,10 1,25 40,3TIPARP 1,61 0,96 40,2ZFP36 1,85 1,11 40,1NR4A1 1,55 0,94 39,0

CYP27B1 2,00 1,24 37,9ARAP2 0,70 1,12 37,3

GADD45B 1,52 1,03 32,4CCNL1 1,57 1,10 29,6IRF1 3,37 2,39 29,2

BDKRB1 2,39 3,34 28,5BCL2A1 3,24 4,49 27,9

TNFRSF9 1,78 2,46 27,6RHOB 1,37 1,01 26,2CCL2 8,26 6,14 25,7

FEM1C 1,45 1,08 25,1TMEM170A 1,16 0,88 24,2

SAT1 1,44 1,12 22,1HIST1H1A 0,74 0,94 21,6

PCDH7 0,79 1,01 21,4FOSL1 1,55 1,22 21,2BIRC3 7,27 5,81 20,0

II. Identyfikacja potencjalnych sekwencji HSE

1. Bioinformatyczna analiza promotorów genów zależnych od NFκB ze zmienionym profilem ekspresji pod wpływem tgHSF1 >=20%

tctcccgcaaccccaggagcaagcctactaaagggtttctctgcatcgttgttattttactttctggctctggaatctggacaaagcaaattggaatctggcatgagtttgctactcttttaatagccctgatacatcttggagtgccccatttagtcgggcatttttacaggtctattttaaagaaagttgtttctttgttggatttttaatcaaaacaaaaaagttcaaatgcttaatagtagggaccatggtacatgtttgtattcaactctcacattctccatccccacacccctccacctccagcacagtatcttgctcagtaaaccctttggagtttttacttgtccgcacttctttcttttctcacctcttcttgtctccaggaaggatactgtggggctagcttctcttatgacagcgcctattagtatgctggctttgtgccagcctggctattccatccacagtctaggtctggagagcccaagaactcaaattctccctttacagtgggcagggggcgtgtccatgacagtcccttcctccttgcctgtagaaagccctgacctcagctttgctctcctcagaaatggcaaagaaaggagatgaaattggcggaggcggcctgattcttccctagtgggctgagtcaggctcccaatcctcaaagaagtgttcacttttcagacctgggttttcctgagggcacgatgtagcgaccactgtgcgctgtacttggattcagaagacccagctgcaagtttggacacgaccacttaccagctacgtgactttaggcaagccactttagctttctgagcttatccacagggtggctggcttgaaagggtgcgccttgattctgttccattatctgcactacccatatttaagggttggtacttcaagagacactcaaaaaaacaaaggttacgagagttatctactgacttgtttcagcggaggttcaataaaggcctcccaggactggccccaggcattccctggcctccccgcagctgccgcccgtccccgcccccactccattccctgcgcaccccaggct(…….4210………) ATG

EGR2

ttctcaaaagaagcccaattatttcaagtactgattccagggagatatttcccacggattccctgtgtgttgctgggatcaacatccttagagcgaaagccatttgtatgaaggcagaaaaaatgttctgcagaagcatctcataccctgtgggtgagggaggagtgagcaggaattggccctacttttctggaagacaatttgccagttgtctatcaaaattttacatatactttggcacacaattacactcgttggaatttatctcacagacacattcacatttatatagtcaaggatgttgactccaacaacattggtataagtaaaaagttggaaactgcctacatgctcatggataggggacaaatcgactaactcaaggtcctcccttacaatggagtactatacagccttgaaaaagaatgacaagatctttatgtcaggacatggcacaatctctaagttatttcaagtgaaaaaataataataataataatattgcagaacaatgtgtatggttggatatacataaaattcttctgaaagaatacccaagaaacttaaatgtggctacctcaggagctaggaatgaaggtaggtggagaggagggacttttacttttcaatttagaatataccctgttgtgctagttgactttcctcctactgttaacaagtattacagtcctttttaatttaaattatttttcctagcacaaatttaaaaaaaaaaaacttaaaatggaaaaacacacaggcgtgagcaaaagaaatgaatggcaataatctctgtggtttactgagtgcgcctggacatttatgtgctctcagtttctctccacaggaaatgcacaggtgagaaactgacgttaagggggactgagtgtcaagctagttagtggcagagggcagattcaaacccaacacggtcctcccctgctgcccctcggcctctgcctccaggtgggaagcgcatctaccggacggtcggcccggtgaggcgcagcgccccagactggcgcatccgcggccccagcgctccacgcctggggagcgcgcgcgcacgcagcggcgcgagcctggcggcggcggcgacaacaacaacgtcacagctcgagctttccttttcgggagtccccggcacacatcctgtgtccatgtttgggcatttacgtcacggcggcagggccggggcctcccaaaATG

EGR4

cgggcaatcagcttccccacttcggtcccccaaaggtgggctctttgccggcggggactagggaacagcctttcggttccgggggagcacaggggaccccaggcaccagcagccccatcccaccgacaggtggcagaggcaaggcagctcactgctatacagtgtcccaagaaccaagtggccgtgacttcctatcctcaatttcccagcgacacccggaaagacaccgtgccatagatcgaggcccggggtcaaggccccgcctctcctgggcggcccctgcccaggcgggcccagccgctcctcccccgcactcccggttcgctctcacggtccctgaggtgggcgggcgggccctggatgacagcgatagaaccccggcccgactcgccctcgcccccgctctgggtctgggcttccccagcctagttcacgcctaggagccgcctgagcagccgcgcgcccagcgccacacgccacgagccctccccgcctgggcgtccccggatcccgcgagcgctcgggctcccggcttggaaccagggaggagggagggagcgagggagcaaccagctgcgacccggaaatgccatataaggagcaggaaggatcccccgccggaacaacccttatttgggcagcaccttatttggagtggcccgatatggcccggccgcttccggctctgggaggagggaagaaggcggagggaggggcaacgcgggaactccggagctgcgcgggtcccggaggccccggcggcggctagagctctaggcttccccgaagcctgggcgcctgggatgcgggcgcgggcgcgggccctagggtgcaggatggaggtgccgggcgctgtcggatggggggcttcacgtcactccgggtcctcccggccggtcctgccatattagggcttcctgcttcccatatatggccatgtacgtcacgacggaggcggacccgtgccgttccagacccttcaaatagaggcggatccggggagtcgcgagagatcccagcgcgcagaacttggggagccgccgccgccatccgccgccgcagccagcttccgccgccgcaggaccggcccctgccccagcctccgcagccgcggcgcgtccacgcccgcccgcgcccagggcgagtcggggtcgccgcctgcacgcttctcagtgttccccgcgccccgcatgtaacccggccaggcccccgcaactgtgtcccctgcagctccagccccgggctgcacccccccgccccgacaccagctctccagcctgctcgtccaggATGgccgcggc…

EGR1

Konsensus dla HSF1

II. Identyfikacja potencjalnych sekwencji HSE

2. Przeprowadzenie eksperymentu

3. Analiza

współdziałanie szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych hsf1 i nfκb

Documents