xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng...

8/19/2019 Xây dựng quy trình phân tích tổng Flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-phan-tich-tong-flavonoid-tu-mot-so-cao-duoc 1/55

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

LƯU THÚY DIỄM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH TỔNG

FLAVONOID TỪ MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU

BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Hóa học

Khóa: 35

Cần Thơ, 2013

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

- - - - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH TỔNG

FLAVONOID TỪ MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU

BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ths. Nguyễn Thị Ánh Hồng Lưu Thúy DiễmMSSV: 2096741

Lớp: Cử nhân Hóa K35





ii

Trường Đại học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Đôc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn: Th.s. Nguyễn Thị Ánh Hồng

1. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao

dược liệu bằng phương pháp UV-VIS”

Sinh viên thực hiện: Lưu Thúy Diễm MSSV: 2096741Lớp: Hóa học – Khóa 35 Nội dung nhận xét:Hình thức

........................................................................................................

........................................................................................................

Nội dung

........................................................................................................

........................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế

........................................................................................................

........................................................................................................

Kết luận, đề nghị và điểm

........................................................................................................

........................................................................................................

Cần Thơ, Ngày 20 tháng 05 năm 2013

Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Thị Ánh Hồng





iii

Trường Đại học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Đôc lập – Tự do – Hạnh phúcBộ Môn Hóa

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Cán bộ phản biện:

..................................................................................................................

..................................................................................................................

1. Tên đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao

dược liệu bằng phương pháp UV-VIS”

Sinh viên thực hiện: Lưu Thúy Diễm MSSV: 2096741

Lớp: Hóa học – Khóa 35 Nội dung nhận xét:Hình thức

........................................................................................................

........................................................................................................

Nội dung

........................................................................................................

........................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế

........................................................................................................

........................................................................................................

Kết luận, đề nghị và điểm

........................................................................................................

........................................................................................................

Cần Thơ, Ngày 20 tháng 05 năm 2013

Cán bộ phản biện





iv

MỞ ĐẦU

Flavonoid là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, có trong hơn

nửa các loại rau quả dùng hàng ngày. Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận củacác loài thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để

quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây. Trong cây, flavonoid giữvai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cảnmột số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng,…), một số còn có tácdụng điều hoà sự sinh trưởng của cây cối. Hơn thế, flavonoid còn là chất có nhiều

hoạt tính sinh học như: ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, xúc tác ngăncản các phản ứng oxy hoá, bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biếnmạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ, làm bền thành mạch, được

dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnhmạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc…. chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảovệ chức năng gan…Vì vậy, việc tách, chiết, định lượng flavonoid từ dược liệu đã vàđang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, có nhiều phương pháp táchchiết Flavonoid đang được sử dụng : phương pháp chiết xuất ướt, phương phápchiết xuất trào ngược, sắc kí lớp mỏng, sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao…Nhưng, để phân tích tổng flavonoid, các phương pháp trên cho hiệu suất không cao, tốn nhiềuthời gian và chỉ thể hiện kết quả một cách gần đúng dẫn đến kết quả không chínhxác. Xuất phát từ lí do trên tôi chọn đề tài “Xây dựng qui trình phân tích tổng

flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS ” nhằm đưa ra phương pháp mới định lượng Flavonoid một cách chính xác hơn, độ tin cậy caohơn.





v

TÓM TẮT

Với đề tài “Xây dựng qui trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dượcliệu bằng phương pháp UV-VIS” luận văn sẽ tiến hành tối ưu hóa quy trình

định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp thêm chuẩn với chất chuẩn làRutin và Quercetin đối với mỗi loại cao dược liệu khác nhau với các thông số:

max (200-500nm), nồng độ dung môi ethanol hòa tan (40-90%), nồng độ AlCl3

(5-11%) và thời gian phản ứng. Sau đó tiến hành định lượng tổng flavonoid theoquy trình đã tối ưu hóa.

Kết thúc quá trình thí nghiệm, đề tài đã tối ưu hóa quy trình định lượng tổngflavonoid với các thông số như sau: Tùy theo những dược liệu khác nhau có bước sóng hấp thụ riêng, nồng độ ethamol hòa tan là 80%, nồng độ AlCl3: 10%

và thời gian tiến hành phản ứng là trước 15 phút. Đề tài cũng đã tiến hành địnhlượng tổng flavonoid trong 5 loại cao: bìm bìm, rau đắng, kim tiền thảo, đinhlăng và diếp cá bằng phương pháp đã tối ưu hóa. Kết quả cho thấy hàm lượngtổng flavonoid trong 5 loại cao trên khá cao và phương pháp thêm chuẩn vớichất chuẩn quercetin cho kết quả cao hơn.





vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN................................................................ii

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN..................................................................iiiMỞ ĐẦU ........................................................................................................................ivTÓM TẮT ............................ ......................... ........................... ........................... ............ vMỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG.............................................................................................viiDANH MỤC HÌNH ...............................................................................................ixPHẦN 1. TỔNG QUANCHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ FLAVONOID ......................................2

1.1. FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU. ..........................................................21.1.1. Khái niệm [1]. ............................................................................................21.1.2. Nguồn gốc [2]. ...........................................................................................21.1.3. Phân loại [1,2]............................................................................................3

1.1.3.1. Euflavonoid. ........................................................................................41.1.3.2. Isoflavonoid.........................................................................................41.1.3.3. Neoflavonoid. ......................................................................................4

1.1.4. Tính chất [1,2]............................................................................................51.1.4.1. Eucoflavonoid .....................................................................................5a. Flavon, Flavonol...........................................................................................5 b. Flavanon, flavanol. .......................................................................................5d. Anthocyanidin, anthocyanin. ........................................................................61.1.4.2. Isoflavonoid (isoflavon, isoflavanon, rotenoid)....................................7

1.1.5. Phân bố trong thực vật [2]. .........................................................................71.1.6. Tác dụng sinh học [2].................................................................................81.2. TỔNG QUAN VỀ QYERCETIN VÀ RUTIN. .............................................91.2.1. Quercetin....................................................................................................91.2.2. Rutin. .......................................................................................................10

1.2.3. Tác dụng sinh học của Quercetin và Rutin............................................10CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNGFLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU. ..................................................................12

2.1. PHƯƠNG PHÁP TRÍCH FLAVONOID RA KHỎI CÂY. .........................122.1.1. Phương pháp trọng lượng.........................................................................122.1.2. Phương pháp hấp phụ. ..............................................................................13

2.1.3. Phương pháp tách phân đoạn....................................................................132.2. ĐỊNH TÍNH [1]. .........................................................................................152.3. ĐỊNH LƯỢNG [8]......................................................................................172.3.1. Phương pháp trọng lượng.........................................................................172.4.2.Phương pháp UV-VIS...............................................................................18

CHƯƠNG 3. SƠ LƯỢC MỘT SỐ CAO TRONG PHÂN TÍCH. ..........................203.1. HẠT BÌM BÌM BIẾC .................................................................................203.2. ĐINH LĂNG ..............................................................................................20





vii

3.3 RAU ĐẮNG ................................................................................................213.4 DIẾP CÁ......................................................................................................223.5 KIM TIỀN THẢO........................................................................................22

PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...........................................................24CHƯƠNG 1. VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ................25

1.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH.................................................251.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ..............................................................251.2.1. Dụng cụ....................................................................................................251.2.2. Hóa chất. ..................................................................................................251.2.3. Thiết bị nghiên cứu. .................................................................................261.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm. ......................................................................261.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ..............................................................27

CHƯƠNG 2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONOIDBẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS.........................................................................28

2.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONPOID BẰNG PHƯƠNGPHÁP UV-VIS. .................................................................................................282.2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH. .....................................................................282.2.1. Xác định bước sóng tối ưu........................................................................282.2.2. Khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ.............................292.2.3. Khảo sát nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ..................................302.2.4. Khảo sát thời gian phản ứng ảnh hưởng đến độ hấp thụ............................322.2.5. Quy trình định lượng tồng flavonoid. .......................................................34

CHƯƠNG 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONOID TRONG MỘT SỐ CAODƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS...................................................36

3.1. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨNQUERCETIN.....................................................................................................36

3.2. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨN RUTIN.....38PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................42TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................44





viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Phân loại flavonoid.....................................................................................3Bảng 2. Màu của flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại khi có ......................................16

Bảng 3. Bước sóng cực đại của các chất. ...............................................................29Bảng 4. Nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ...........................................30Bảng 5. Nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ ................................................31Bảng 6. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Quercetin..........................................36Bảng 7. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Rutin.................................................38Bảng 8. Hàm lượng mẫu tính theo Quercetin và Rutin...........................................40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Quy trình tủa flavonoid bằng Chì acetat....................................................13

Hình 2. Quy trình chiết tách flavonoid ra khỏi cây bằng dung dịch kiềm ...............15Hình 3. Giấy kiểm định chất lượng Quercetin và rutin...........................................26Hình 4. Quy trình định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS.....................28Hình 5. Đồ thị biểu diển nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ..................30Hình 6. Đồ thị biểu diển nồngdđộ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ.......................31Hình 5. Thời gian phản ứng của cao Kim tiền thảo. ...............................................32Hình 6. Thời gian phản ứng của cao Đinh lăng. .....................................................32Hình 7. Thời gian phản ứng của cao diếp cá. .........................................................33Hình 8. Thời gian phản ứng của cao Rau đắng.......................................................33Hình 9. Thời gian phản ứng của cao Bìm bìm........................................................33Hình 10. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu của cao Kim Tiền Thảo-Quercetin ...............36

Hình 11. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của cao Đinh lăng-Quercetin........................37Hình 12. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của cao Rau đắng-Quercetin ........................37Hình 13. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Quercetin................................37Hình 14. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Rau đắng-Rutin .....................................38Hình 15. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Rutin ......................................39Hình 16. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Đinh lăng-Rutin.....................................39Hình 17. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Kim tiền thảo-Rutin...............................39Hình 18. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của Diếp cá-Rutin........................................40





2

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀFLAVONOID

1.1. FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU.

1.1.1. Khái niệm [1].Là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật,

tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flvonoid có màu vàng (dotừ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố xanh, tím, đỏ, không màu cũng đượcxếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn cơ bản.Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩalà hai vòng benzen A và B nối nhau qua dây có 3 carbon, nên thường được gọi làC6-C3-C6.

Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắtđầu từ dị vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòngB và đánh số phụ trên vòng A.

1.1.2. Nguồn gốc [2].Cũng giống vitamin C, các flavonoid được khám phá bởi một trong những

nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỷ 20: Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986). Ôngnhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitaminC và flavonoid.Trong quá trình phân lập vitamin C, Szent-Gyorgyi đã khám phá ra các flavonoid.Một người bạn của ông đã ngừng chảy máu nứơu răng sau khi dùng dịch chiết giàuvitamin C trong dịch chiết nước chanh. Nhưng sau đó khi người bạn bị chảy máunướu răng tái phát, Szent-Gyorgyi cho bạn ông dùng vitamin C nguyên chất, thì sựcải thiện không xảy ra. Như vậy đã có sự tham gia của một chất khác bên cạnhvitamin C trong dịch chiết nước chanh. Và Szent-Gyorgyi đã phân lập được chấtnày, giúp người bạn chống chảy máu nướu răng hữu hiệu.





3

Ban đầu Szent-Gyorgyi gọi chất này là “vitamin P”, do có khả năng làm giảm tính thấm

thành mạch của nó (vascular permeability), một trong những triệu chứng thường gặp của

bệnh Scurvy do thiếu vitamin C. Sau này ông đã công bố bệnh Scurvy xảy ra không chỉ dothiếu vitamin C mà còn do thiếu flavonoid. Tuy nhiên vì flavonoid không có đầy đủ tínhchất của một vitamin nên sau này người ta bỏ tên vitamin P này đi. Như hầu hết các

vitamin và khoáng chất, flavonoid là một dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể chúng ta.

1.1.3. Phân loại [1,2].Thường các flavonoid mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên

nhân A và vị trí 3,4,5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặcdạng glycosid. Các đường thường gặp nhất là D-glucose, kế đó là D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic.

Các flavonoid được phân thành nhiều nhóm với cấu trúc cơ bản khác nhau,dựa vào việc sinh tổng hợp.

Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trícủa gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C.

Euflavonoid isoflavonoid neoflavonoid

các flavonoid có gốc aryl ở vịtrí C-2

các flavonoid có gốc aryl ởvị trí C-3

các flavonoid cógốc aryl ở vị tríC-4

anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-

diol, flavanon, 3-hydroxyflavanon, flavon,flavonol, dihydrochalcon, chalcon,auron.

Isoflavan, Isoflav-3-ene,Isoflavan-4-ol, Isoflavon,

rotenoid, pterocarpan,

Coumestan, 3- phenylcoumarin,coumaronochromen,

coumaronochromon

Bảng 1. Phân loại flavonoid



http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Isoflavan.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/anthocyanidin.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/flavan.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/catechin.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavan%20-%204-%20ol.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavan%203,4-diol.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavanon.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/3-Hydroxy%20flavanon.gif


http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavon.gif


http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Isoflavon.gif


http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Auron.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Chalcon0.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Dihydrochalcon.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Dihydrochalcon.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavonol.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavon.gif



http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavanon.gif



http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Flavan%20-%204-%20ol.gif



http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/flavan.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/anthocyanidin.gif

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Neoflavonoid/Neoflavonoid.htm

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Isoflavonoid/Isoflavonoid.htm

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Daicuong/glycosid/flavonoid/Euflavonoid/Euflavonoid.htm

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/glycosidch5.html





4

1.1.3.1. Euflavonoid.Bắt nguồn từ cấu trúc của 2-phenylchromen-4-one (2-phenyl-

1,4benzopyrone)

Flavon (= Flav-2-en-4-on) Flavonol (=3-Hydroxy-4-oxoflav-2-en)

Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá)….

Flavanon ( = Flavan-4-on ) Chalcon

Chalcon có chủ yếu ở một số cây họ cúc.Asteraceac tập trung nhiều nhất ở vỏ cây, gổ lõi (keo, bạch đàn, dẻ, đậu tương, trinh

nữ hoàng cung, dương xỉ…). Không tìm thấy ở động vật.

1.1.3.2. Isoflavonoid.Bắt nguồn từ cấu trúc của 3-phenylchromen-4-one (3-phenyl-1,4-

benzopyrone)

Isoflavan isoflavonoid

1.1.3.3. Neoflavonoid.Bắt nguồn từ cấu trúc của 4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone).

Vì thế flavonoid được xem là một nhóm hoạt chất lớn trong dược liệu.





6

Flavanon Flavanol- Các dẫn xuất flavan-3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt.- Flavanon, flavanol có trong lá, vỏ hoặc gỗ của một số loại cây. Flavanon,

flavanol là các dẫn chất không màu, nhưng khi tác dụng với acid vô cơ thì có màuđỏ.

- Dễ bị oxy hóa và trùng hợp hóa nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khókhăn.

c. Chalcon.

Chalcon- Kém bền trong môi trường kiềm.- Tác dụng với dung dịch FeCl3 : cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tùy

theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử.- Dễ tan trong nước nóng, alcol,...tạo dung dịch không màu, không tan trong

các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực nnhu7benzene hoặc chloroform.- Dưới tác dụng của H+ hoặc OH-, chalcon có thể chuyển sang flavanon

- Khi tạo liên kết glycoside phần đường nối vào vị trí 4’, một số ở 2’.d. Anthocyanidin, anthocyanin.

Anthocyanidin- Anthocyanidin có tính base đủ mạnh để tạo thành muối bển với acid vô cơ.- Chúng tạo dung dịch màu đỏ trong acid và màu xanh da trời trong môi

trường kiềm.





7

- Ở dạng base tự do, anthocyanidin là chất đồng phân với flavanon.- Là dẫn xuất của flavon mà nhóm carbonyl bị khử thành rượu.- Anthocyanidin thường tồn tại dưới dạng glycozit, gọi là anthocyanin.

1.1.4.2. Isoflavonoid (isoflavon, isoflavanon, rotenoid)

Isoflavon IsoflavanonTất cả các Isoflavonoids không có màu sắc. Nó được tạo thành từ axetat theo

cơ chế đóng vòng với phenylalamine, cinnamat dẫn xuất được sát nhập vào vòng Bvà C-2,-3 và -4 của dị vòng.

1.1.5. Phân bố trong thực vật [2].Flavonoid ít gặp trong thực vật bậc thấp. Trong ngành rêu ít thấy, trong

dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon,flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.- Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoid cũng không nhiềunhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon,

flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp vàngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid.- Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họchứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưngcho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rấtnhiều dẫn chất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng

riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặpcác dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chấtflavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì

hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon vàflavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol. HọRanunculaceae và Paeoniaceae hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. HọRosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp các anthocyanin có mạchđường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon vàflavonol sulfat.





9

- Theo nghiên cứu của bác sĩ Lee Hooper, giảng viên trường đại học East Anglia tại bang Norwich,U.K., và cộng sự đã sàng lọc hơn 133 nghiên cứu đã tìm ra được mốiliên kết giữa những phân lớp flavonoid khác nhau và thực phẩm giàu flavonoid trênnhững tác nhân gây nguy cơ cho bệnh tim mạch, như cholesterol có hại, huyết

áp cao hay máu chảy chậm. Báo cáo đưa ra kết luận sau:+ Ăn chocolate hoặc ca cao làm tăng sự giãn nở mạch máu. Chúng cũng làm giảmáp suất của máu, tâm thu (phản ánh áp lực tối đa khi tim co lại) bằng khoảng 6điểm, và tâm trương (phản ánh áp lực tối đa khitim giãn) khoảng 3.3 điểm. Nhưng điều này dường như không có ảnh hưởng gì đến cholesterol LDL xấu.+ Protein đậu nành cũng làm giảm áp lực máu tâm trương gần bằng 2 điểm thủyngân và cải thiện protein xấu, nhưng không ảnh hưởng đến cholesterol HDL tốt. Những ảnh hưởng này được tìm thấy trong protein đậu nành đơn, không có trongnhững sản phẩm từ đậu nành khác.

+ Thói quen uống trà xanh cũng làm giảm lượng cholesterol xấu trong máu, nhưnguống trà đen sẽ làm tăng áp suất của cả tâm thu và tâm trương, tăng lên 5.6 điểmcho tâm thu và 2.5 điểm cho tâm trương.- Nghiên cứu tác dụng chống viêm của flavonoid chiết xuất từ rễ cây cao cẳng

(Radix Ophiopogonis confertifolius) trên thực nghiệm. Đề tài do các tác giả NguyễnThị Vinh Huê, Nguyễn Duy Thuần (Viện Dược liệu), Phạm Thị Vân Anh, NguyễnTrọng Thông (Bộ môn Dược lý – Trường ĐH Y Hà Nội) thực hiện nhằm đánh giátác dụng chống viêm của flavonoid chiết từ rễ cao cẳng trên thực nghiệm.Trong dân gian từ lâu đã sử dụng những dược liệu giàu flavonoid để giữ gìn sức

khoẻ bằng cách dùng đơn giản là trà thuốc, thuốc sắc như nước trà (chè), tràartichaut,… vừa rẻ tiền vừa hiệu quả. Những dược liệu có hàm lượng cao flavonoidđã được khai thác và chiết xuất lấy flavonoid để phục vụ nền công nghiệp dược: hoaHoè, vỏ Cam, Núc nác, Hoàng cầm, lá Xoài, bồ Kết… và một số flavonoid đã được

nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc nước,… rất tiện sử dụng.

1.2. TỔNG QUAN VỀ QYERCETIN VÀ RUTIN.1.2.1. Quercetin.

Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4 H -chromen-4-one

Tên khác: Shophoretin, Meletin, Xanthaurine, Quercetol, Quercitin,Quertine, Flavin meletin.Công thức phân tử: C15H10O7.Khối lượng mol: 302.236 g/molTỷ trọng: 1.799 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: 3160C





10

Là hợp chất tinh thể màu vàng nhạt, phát huỳnh quang ở bước sóng 510nm.Tan tốt trong methanol, ethylacetat, không tan trong nước, n-hexan, aceton.

1.2.2. Rutin.

Tện IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranosyloxy]-4 H -chromen-4-one

Công thức phân tử: C 27 H 30 O 16

Khối lượng phân tử: 610,52 g mol -1 Nhiệt độ nóng chảy: 242 ° C

Là tinh thể màu vàng nhạt hay hơi vàng lục, không mùi hay hơi có mùi đặc

trưng. Dể ra ánh sáng có màu hơi sẫm lại.Phần glycon của rutin là quercetin (= quercetol) thuộc nhóm flavonol, phần

đường là rutinose (=6-O--L-rhammopyranosul--D-glucopyranose).

Dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và trong các dung dịch kiềm loãng,tan ít trong glycerin, khó tan trong etanol (1/650) và iso-propanol, tan trong etanolnóng (1/60), khó tan trong nước (1/10000), tan trong nước nóng (1/200), không tantrong: aceton, ether, chloroform, eter dầu hỏa, benzene, các acid và carbon disulfid.

1.2.3. Tác dụng sinh học của Quercetin và Rutin.Quercetin và Rutin là những hợp chất có nhiều tác dụng sinh học:Chúng là những hợp chất chống oxy hóa, do có khả năng dập tắc các gốc tự

do như OH˜, ROO˜ (là các yếu tố gây biến dị, hủy hại tế bào, ung thư, tăng nhanh sựlão hóa). Đồng thời, tạo phức với một số kim loại mà các ion kim loại đó là tác nhâncủa các phản ứng oxy hóa trong cơ thể. Do đó chúng có tác dụng bảo vệ cơ thể,ngăn ngừa chứng xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn

thương do bức xạ, làm cho vết thương chóng lành sẹo.Quercetin, Rutin ức chế sự hoạt động của Hyaluronidase là enzyme làm tăngtính thấm mao mạch, khi thừa enzyme sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da, vìthế nếu bổ sung Quercetin, Rutin đầy đủ và kịp thời tình trạng trên sẽ được cảithiện, phối hợp với Vitamin C sẽ tăng cường tác dụng điều trị.

Quercetin, Rutin làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rốiloạn chức năng tĩnh mạch, rối loạn tuần hoàn võng mạc.





11

Quercetin, Rutin còn có tác dụng chống độc, làm giảm tổn thương gan, bảovệ chức năng gan lợi tiểu và làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thuần hoàn máutrong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, được dùng cho những người có biểuhiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc, đầu óc kém tập trung, hay cáo

gắt,… Ngoài ra, Rutin còn có hoạt tính của Vitamin P, có tác dụng tăng cường sức

bền và làm giảm tính thấm của mao mạch, làm tăng sự bền vững của hồng cầu, làmhạ thấp trương lực cơ nhãn, chống co thắt.

Bên cạnh đó, Rutin còn được dùng để phòng biến chứng và điều trị chứngchảy máu trong nhãn cầu do đái tháo đường (chưa có xuất hiện trong nhãn cầu cũngnhư các vi phình mạch trên những mao mạch của võng mạc).

Rutin khi thủy phân cho ra Quercetin enzyme.Rutin tăng sức bền mao mạch và làm giảm tính thấm của các mao mạch nhỏ.

Rutin bít các lổ thủng li ti trên những vi phình mạch của những bệnh nhân đái tháođường.Tuy nhiên, Rutin không được dùng trong trường hợp nghẽn mạch, máu có độ

đông cao.





12

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, ĐỊNHTÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG

DƯỢC LIỆU.

2.1. PHƯƠNG PHÁP TRÍCH FLAVONOID RA KHỎI CÂY.

Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số lượng nhóm hydroxy vàcác nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một phương phápchung để ly trích flavonoid ra khỏi cây. Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxy – OCH3 và ít nhóm hydroxy –OH, có tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít

phân cực như: benzen, cloroform, etyl acetate đôi khi tan một phần trong hexan.Flavonoid mang nhiều nhóm hydroxy có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong dung

môi có tính phân cực như aceton, etanol, butanol, nước…Các flavonoid glycosid, antocyanidin không tan trong dietyl eter, nhưng tan trong

nước nóng, etanol nóng. Riêng antocyanidin, do khá bền với nhiệt độ nên có thểđược chiết tách dưới dạng clorur bởi dung dịch 0,01 N HCL/metanol.Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hayhỗn hợp CHCl3 và ethanol. Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiếtđược phần lớn các flavonoid. Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chấtmethoxy flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững nhất là các acylanthocyanin được acyl hoá với các acid aliphatic do đó người ta thường chiết bằngmethanol có mặt của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì HCl. Cótác giả dùng một lượng nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là trifluoroacetic acid (0,5-3%) đểchiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dể bốc hơi trong quá trình làmđậm đặc. Dịch chiết đem làm đậm đặc dưới chân không ở nhiệt độ thấp (40-70oC).Ðối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin,flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô.

2.1.1. Phương pháp trọng lượng. Nguyên tắc: Chì acetat kiềm cho tủa màu với hầu hết các flavonoid phenol

còn chì acetat trung tính tạo tủa với các dẫn chất có nhóm o.dihydroxyphenol. Dựavào nguyên tắc này ta sử dụng chì acetat để tủa flavonoid sau đó dùng Na 2SO4 đểloại chì khỏi flavonoid.

Qui trình được trình bày trong sơ đồ sau. Cao chiết được hòa tan vào dungdịch 10% etanol / nước chứa trong một erlen. Từ từ rót vào erlen này một dung dịchnước 10% acetat chì, khuấy nhẹ sẽ có tủa flavonoid. Lọc thu lấy tủa. Hòa tan tủa trở

lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành dung dịch treo đồng nhất. Rót





13

thêm vào dung dịch nước bão hòa Na2SO4 nhằm loại bỏ chì PbSO4. Lọc lấy dungdịch nước trong, đuổi nước bằng cô quay chân không thu được cao tho chứaflavonoid toàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid.

Hình 1. Quy trình tủa flavonoid bằng Chì acetat

2.1.2. Phương pháp hấp phụ. Nguyên tắc: Hấp thụ flavonoid bằng than hoạt tính và dùng dung môi hữu cơ

thích hợp để chiết các flavonoid khác nhau.Cho than hoạt tính vào dung dịch cao chiết nhầm hấp thu flavonoid. Lọc lấy

than. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ từ phân cực yếu đến phân cực mạnh,thí dụ etyl eter, etyl acetate, metanol, nước nóng, phenol 7%... để chiết các

flavonoid có tính phân cực khác nhau.

2.1.3. Phương pháp tách phân đoạn.

Cao chiết

Dung dịch nước

Hòa vào etanol 10%

- Dung dịch nước acetat chì 10%, khuấy đều, để yên- Lọc

Dung dịch nước Tủa

- Hòa vào etanol 10%- Thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4 - Để yên. Lọc

Tủa PbSO4 Dung dịch nước

Cô quay chân không

Flavonoid thô

Sắc ký cột

Các flavonoid riêng rẽ





14

Nguyên tắc: Các flavonoid do co mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thểtan trong dung dịch kiềm. Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềmloãng hoặc nước vôi để chiết flavonoid khỏi cây cỏ, sau đó dung dịch chiết dượcacid hóa để trả flavonoid về dạng –OH tự do.

Cách tiến hành: Hòa tan cao chiết vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụclorofom, acetat etyl,… Tiếp theo, thực hiên sự chiết lỏng-lỏng dung dịch này vớidung dịch nước kiềm 5-10% như: dung dịch Na2B4O7.10H2O, NaHCO3, Na2CO3,…Các dung dịch nước kiềm được gộp chung lại và được acid hóa. Sử dụngdung môi hữu cơ phù hợp để chiết tách các flavonoid ra khỏi dung dịch nước. Làmkhan nước bằng CaCl2, Na2SO4,… Đuổi dung môi thu được cao thô chứa flavonoidtoàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid.





15

Hình 2. Quy trình chiết tách flavonoid ra khỏi cây bằng dung dịch kiềm

2.2. ĐỊNH TÍNH [1]. Một số phản ứng định tính (chủ yếu với nhóm euflavonoid)- Phân biệt sơ bộ bằng hơi amoniac:Dưới ánh đèn tử ngoại UV365 và sự hiện diện của hơi amoniac, các flavonid sẽ thayđổi màu sắc. Cao chiết được chấm thành hai chấm riêng biệt lên trên cùng tấm giấysắc ký lớp mỏng, giải ly. Cắt bản mỏng chia ra làm đôi: một bản để tự nhiên cònmột bản để trong bình kín bão hòa bằng hơi amoniac NH3 và tiếp theo phun xịt bản

Cao chiết

Dung dịch hữu cơ

Hòa vào cloroform hoặc etyl acetat

- Thực hiện chiết lõng – lõng vớidung dịch nước kiềm 5-10%

Pha hữu cơ Pha nước kiềm

Acid hóa

Pha nước Pha hữu cơ

- Làm khan với chất làm khan- Đuổi dung môi

Flavonoid thô

Sắc ký cột

Các flavonoid riêng rẽ

Pha nước acid

Thực hiện chiết lõng – lõng với dung môihữu cơ: cloroform, etyl acetat…





16

bởi dung dịch 1% KOH/etanol. Lần lượt quan sát màu của vết trên hai bản: dướiánh sáng thường và ánh sáng đèn tử ngoại 365nm. Sự khác nhau về màu tùy theohợp chất flavonoid được trình bày trong bảng sau.

Không có dung dịch kiềm Phun xịt với dung dịch kiềmFlavonoid Ánh sáng

thường (VIS)UV365 Ánh sáng

thường (VIS)UV365

Flavon Không màuđến vàng nhạt

NâuXanh dương

Vàng Vàng

Flavonol Vàng nhạtđến vàng xậm

Vàng,Vàng – lục

Vàng Vàng

Flavanon Không màu Không màu Không màu Vàng

Flavonol-3-

glycosid

Không màu

đến vàng nhạt

Nâu tối Vàng Vàng,

Vàng – lụcCatechin Không màu Không màu Không màu Vệt tối

Antocyanin Đỏ Nâu tối Xanh dương Vệt tối

Chalcon Vàng sẩm Vàng nâuxậm

Vàng cam –cam đỏ

Cam – đỏTía

Bảng 2. Màu của flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại khi cóvà không có xử lý với kiềm

- Tác dụng của FeCl3: Dựa trên phản ứng của các nhóm phenol (-OH trên vòng

thơm) với Fe3+ tạo phức có màu từ xanh đến nâu.- Tác dụng của NH3: Dựa trên phản ứng tạo màu của các loại flavonid với NH3.Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương.Chalcon và auron có thể cho màu đỏ da cam. Một số nhóm khác như flavan-3-ol,flavanon, isoflavon màu không thay đổi- Tác dụng của NaOH đậm đặc và đun nóng (phân hủy kiềm): flavonoid với dungdịch KOH 30% thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất acid thơm và dẫnchất phenol. Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn chấtacid thơm và phenol khác nhau. Có thể xác định các dẫn chất này bằng phương

pháp sắc ký đối chiếu với chất mẫu, kết quả thu được dùng để góp phần biện luậncấu trúc. Ví dụ khi phân huỷ chất Chrysin thì thu được phloroglucin, acid benzoic. .Tuy nhiên nếu thực hiện định tính với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu vì dễ bị oxy hoá, còn flavanon dễ bị isomer hoá thành chalcon nênnếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ.

- Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc:

flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc





17

biệt . Ðối với chalcon và auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ. Flavanon chomàu cam rồi đỏ.- Tác dụng của antimoin pentachlorid (Phản ứng Martini Bettolo): SbCl5 trong CCl4 chomàu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon. Dihydrochalcon thì mất nốiđôi liên hiệp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc với H2SO4

- Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater): Phản ứng khử bằng bột Mgtrong HCl/etanol trên các dẫn xuất flavonoid. Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung dịch trong

ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím. Nếu cao chiết có chứa isoflavon, isoflavanon, auron

dung dịch không đổi màu.

• Nếu sử dụng bột Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm,còn flavonol và flavanon cho màu hồng nhạt hoặc không màu.- Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm: Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịchchì acetat trung tính hoặc kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoid. Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kièm cho tủa màu với hầu hết cácflavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhómo.dihydroxyphenol.- Phản ứng ghép đôi với muối diazoni: Các dẫn chất flavonoid có nhóm OH ở vị trí7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ.- Tác dụng với dung dịch 1% NaOH/ etanol: Nhỏ dung dịch NaOH vào một dungdịch flavonoid/ hòa tan trong etanol, sẽ có màu từ vàng đến cam đỏ.Nếu là flavon,

isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng.Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến đỏ tím.

2.3. ĐỊNH LƯỢNG [8].2.3.1. Phương pháp trọng lượng. Nguyên tắc: tận chiết flavonoid và loại tạp với các loại dung môi thích hợp.

Đuổi dung môi, sấy, cân.Tiến hành : Cân chính xác M (g) (khoảng 10g) bột dược liệu, chiết bằng n-

hexan trong bộ dụng cụ Soxhlet đến khi dung dịch trong suốt, không màu. Sấy dượcliệu đến 500C đến khô. Tiếp tục chiết bằng cồn ethanol 960 trong dụng cụ Soxhletliên tục trong 8 giờ đến khi dung dịch trong suốt, không màu và không cho màuvàng với dung dịch NaOH 0.1N. Thu được dịch chiết cồn. Cất, thu hồi cồn thu đượcdung dịch cao đặc, xử lý với 50ml nước nóng, lọc, chiết với etyl acetat (5 lần, mỗilần 15ml). Dịch chiết etyl acetat được cất thu hồi dung môi đến cặn. Sấy cặn ở 700Cđến khối lượng không đổi, cân, ghi nhận khối lượng. Kết quả được tính theo côngthức :

F (%) = (p.100)/M.(100-h).100 (%)





18

Trong đó :+ F là hàm lượng flavonoid toàn phần được biểu thị bằng phần trăm (kl/kl).+ p là khối lượng flavonoid toàn phần thu được.+ M là khối lượng mẫu dược liệu ban đầu.

+ h là hàm ẩm của dược liệu.Ưu điểm :

+ Nhanh, giá thành thấp.+ Dụng cụ rẻ tiền, dễ thực hiện.

Nhược điểm :+ Độ chính xác không cao.+ Mất nhiều thời gian.+ Quy trình phức tạp.

2.4.2.Phương pháp UV-VIS. Nguyên tắc : Dựa vào đặc tính tạo phức màu rất mạnh của các flavonoid với

kim loại. Al3+ thường được sử dụng để khảo sát vì nó là kim loại tạo phức màumạnh và không độc hại.

Ưu điểm : Độ chính xác cao, dễ thực hiện. Nhược điểm : Nền mẫu phức tạp nên cần có bước hiệu chỉnh quy trình.Một số công trình nghiên cứu về định lượng tổng flavonoid bằng phương

pháp UV-VIS.Theo nhóm tác giả Hongbin Zhu, ‘‘Analysis of Flavonoids in Portulaca

oleracea L. by UV–Vis Spectrophotometry with Comparative Study on Different

Extraction Technologies. Portulaca oleracea L’’. Các điều kiện tối ưu khảo sát: nồngđộ ethanol là 70% (v / v), tỷ lệ rắn lỏng là 1:50, đun nóng ở nhiệt độ là 50 ° C và thờigian là 9 phút. Định lượng được thực hiện bằng phương pháp quang phổ UV-Vis với hệthống sinh màu với NaNO 2-Al (NO 3) 3 NaOH.

Theo Ana Josane Santas Fernandes và cộng sự; “Tatal flavonoid content inthe raw material and aqueous extractive from Bauhinia monadra Kurz (Caesalpiniaceae)”. Các điều kiện tối ưu đã được khảo sát: nồng độ ethanol: 80%, nồngđộ AlCl3: 9%.

Theo báo cáo của nhóm tác giả Yujie Chen, “Determination of totalflavonoids in three Sedum crude drugs by UV–Vis spectrophotometry” đăng trêntạp chí Pharmacogn Mag. 2010 Oct-Dec; 6(24): 259–263.

Tiến hành trích dược liệu với ether dầu hỏa, bằng siêu phương pháp siêu âmhai lần trong 40 phút. Sau khi bột mẫu được sấy khô hoàn toàn, ethanol 70% đượcthêm vào, siêu âm trong 90 phút (3 × 30 phút) ở 55 ° C, và sau đó được lọc vào bìnhđịnh mức với ethanol 70%.



http://link.springer.com/search?facet-author=%22Hongbin+Zhu%22

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20Y%5Bauth%5D






19

Dung dịch mẫu được cho phản ứng với 5% NaNO 2 để 6 phút. Sau đó chotiếp dung dịch Al 10% (NO 3) 3 trong 6 phút và điều chỉnh pH cho hỗn hợp bằng dungdịch NaOH 4%, để yên trong 15 phút và độ hấp thụ với mẫu trắng.





20

CHƯƠNG 3. SƠ LƯỢC MỘT SỐ CAO TRONGPHÂN TÍCH.

3.1. HẠT BÌM BÌM BIẾCTên khoa học: Ipomoea hederacea Jacp (Pharbitis hederaceaChoisy). SemenPharbitidis.

Mô tả: Bìm bìm là loại cây dây leo nhờ thân quấn, thân mảnh, có lông. Lá 3thùy nhẵn, xanh ở mặt trên, xanh nhạt và có lông ở mặt dưới, dài 14 cm, rộng 12cm, cuống dài 5-9 cm. Hoa màu hồng tím hoặc lam nhạt. Quả nang, hình cầu nhẵn,có 3 ngăn, 2-4 hạt, 3 cạnh lưng khum, 2 bên dẹt, nhẵn nhưng ở tể hơi có lông, màuđen hoặc trắng tùy loại.

Bộ phận dùng: Hạt

Phân bố: Bìm bìm mọc hoang khắp nơi ở nước ta, thường thấy ở các bụi rậm

ven đường, hay được trồng làm cảnh và giàn che nắng. Bìm bìm còn mọc ở Ấn Độ,Indonesia, Thái Lan, Nhật Bản, Philippines, Trung Quốc.

Thành phần hóa học: Trong hạt bìm bìm biếc có chứa khoảng 2% pharbitin(pharbitic acid và vài purolic acid) còn gọi là glucosit. Ngoài ra hạt bìm bìm biếccòn chứa khoảng 11% chất béo và 2 sắc tố cũng là glucosit. Tác dụng dược lý: Trong hạt bìm bìm có chứa chất pharbitin là một chất có tác dụngtẩy xổ mạnh, ức chế giun đũa.

Ngoài ra, hạt bìm bìm cũng làm tăng độ lọc inilin của thận. Bìm bìm biếc có khả năng gây độc, đối với chuột LD

50là 37,5/kg. ở người có thể

gây buồn nôn do thuốc kích thích trực tiếp lên đường tiêu hóa. Liều cao có thể ảnhhưởng đến thận dẫn đến tiểu ra máu cũng như các triệu chứng thần kinh. Công dụng: Tính chất theo Đông y thì bìm bìm biếc vị cay, tính nóng hơi có độc,vào 3 kinh phế, thận và đại tràng. Có tác dụng tả khí phân thấp nhiệt, trục đờm, tiêuẩm lợi nhị tiện là thuốc chữa tiện bĩ và cước khí, chủ trị hạ khí, lợi tiểu, chữa cướcthũng, sát trùng.

Trong thực tế, bìm bìm biếc dùng làm thuốc thông đại và tiểu tiện, thông mật, đôikhi có tác dụng tẩy giun.

3.2. ĐINH LĂNGĐinh lăng có tên khoa học là Polyscias Fruticosa Harms thuộc họ Ngũ gia bì(Araliaceae), trong dân gian còn gọi là cây gỏi cá.

Mô tả: Đinh lăng thuộc loại cây nhỏ, cao 0,8-1,5m. Cây có lá kép, mọc so le, lá 3lần xẻ lông chim, mép khía có răng cưa. Hoa đinh lăng màu lục nhạt hoặc trắng xám, quảdẹt, màu trắng bạc. Quả dẹt, dài 3 - 4mm, dày khoảng 1mm.

Bộ phận dùng: Cây đinh lăng được sử dụng toàn bộ các bộ phận của cây.Phân bố: Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polunésie ở Thái Bình Dương, câyđược trồng ở Indonesia, Malaysia, Campuchia, Lào, mọc ở cả miền nam Trung





21

Quốc. Ở Việt Nam, đinh lăng đã có từ lâu trong nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, trong đình chùa, trạm xá, bệnh viện,… để làm cảnh, làmthuốc và rau gia vị.

Thành phần hóa học: Trong rễ đinh lăng có glycoside, alkaloild, vitamin (B1,B2, B6, C), các phytostrol và 20 loại acid amin, trong đó các acid amin không thể

thay thế (lysin, methionin, tryptophan, cystein). Qua phân tích sơ bộ thành phần hóahọc trong lá thấy có saponin, coumarin, tinh dầu, phytosterol, tannin, acid hữu cơ,đường khử và các hợp chất uronic. Từ rễ và lá của đinh lăng, 11 saponin triterpencó thành phần aglycon là acid oleanolic đã được xác định, trong đó có 8 hợp chấtmới được dặt tên là polysioside A-H. Có 5 hợp chất polyacetylen trong rễ đinh lăngcũng đuọc phân lập, trong đó panaxynol, panaxydol và heptadecaien-diyn-diol làhợp chất có trong nhân sâm và 2 polyacetylen chủ yếu được phân lập từ lá cũng là panaxynol, heptadecaien –diyn-diol.

Tác dụng dược lý: Năm 1961, các khoa dược lý, dược liệu và giải bệnh lýViện y quân sự Việt Nam nghiên cứu tác dụng của cây đinh lăng làm tăng sức dẻodai của cơ thể và một số tác dụng khác.

Công dụng: Trong dân gian, đinh lăng thường dùng để trị ho ra máu, chữatắc tia sữa, làm mát huyết, lợi tiểu, chữa mẫn ngứa. Lá đinh lăng cũng được dùng đểnấu canh với thịt, cá để bồi bổ cho sản phụ, người già hoặc người ốm mới dậy.

Theo y học cổ truyền, rễ đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có côngdụng thông huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giảiđộc thức ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Nói chung, ngoài công dụnglương huyết và giải độc thức ăn, những tính chất khác của đinh lăng gần giống nhưnhân sâm.

3.3 RAU ĐẮNGRau đắng hay Biển súc, Cây càng tôm, Cây xương cá.Tên khoa học : Glinus oppositifolius (L.) DC. Họ rau đắng (Molluginaceae).Cây mọc hoang ở nhiều nơi trong nước ta.Mô tả : Cỏ nằm, phân nhiều nhánh, không lông. Lá đơn, mọc chụm 2-5 lá,

phiến nguyên, hình xoan hẹp, dài 2-2,5 cm, 1 gân chính. Hoa xanh dợt, nhỏ, cócọng dài, không nhánh, 5 tiểu nhị và 3 vòi nhụy. Trái nang.

Bộ phận dùng: Toàn cây (Herba Glini oppositifolii) Nơi sống : Cây phân bố từ Hải Phòng, Nam Định tới Sóc Trăng và Trà

Vinh. Thường gặp trên đụn cát dọc bờ biển hay vùng ngập theo mùa, ao hồ và

ruộng. Thành phần hóa học: Rau đắng đất có saponin, flavonoid. Từ lá đã phân lậpđược các chất: spergulagenin A, spergulin A, spergulin B, spergulacin vàspergulacin A.Tác dụng dược lý: Có tác dụng kích thích tiêu hóa, khai vị, kháng sinh, lợi tiểu,

nhuận gan và hạ nhiệt.Công dụng:+ Rau đắng đất được dùng làm thuốc hạ sốt, chữa bệnh về gan, vàng da.+ Nhân dân ta có dùng cây đem đốt thành tro dùng ngâm lấy nước gội đầu.





22

3.4 DIẾP CÁDiếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp

(Saururaceae).Mô tả : Cây thảo cao 15-50 cm, thân màu lục hoặc tím đỏ. Lá mọc so le, hình

tim, có bẹ, khi vò ra có mùi tanh như mùi cá. Cụm hoa hình bông bao bởi 4 lá bắcmàu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hìnhtrái xoan, nhẵn.

Diếp cá là một loại cây thảo, mọc rất phổ biến ở Việt Nam và một số nướcchâu Á dùng để chửa nhiều bệnh như trĩ, phù thũng, thoát mủ, thông tiểu tiện, viêm,giải độc, thanh nhiệt… Vì trong diếp cá có chứa một số hoạt chất có tính khángkhuẩn và chống oxy hóa.Bộ phận dùng: thân và lá

Phân bố: Cây diếp cá phân bố rộng rãi ở châu á, phân bố từ Ấn Độ quaTrung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và các nước Đông Dương. Ở nước ta, diếp cá mọc

hoang ở chỗ ẩm ướp, thường được trồng làm rau ăn. Thu hái cành lá quanh năm,thường dùng tươi, có thể phơi hay sấy khô để dùng dần.Thành phần hóa học: Diếp cá chứa khoảng 0.049% là tinh dầu của các

aldehyde. Ngoài ra trong diếp cá còn chứa alkaloid và flavonoid.Tác dụng dược lý: Theo Kyoko Hayashi và cộng sự Diếp cá ức chế trực tiếp

virus herpes chủng 1 (HSV-1), virus cúm, virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải ởngười loại 1 (HIV-1) mà không biểu hiện độc tính, nhưng không chống lại poliovirus và coxsackie virus. Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lý bằngthuốc. Ba thành phần chính có tác dụng là: xeton methyl n-nonyl, aldehyde lauryl,và aldehyde capryl.

Công dụng: Diếp cá có tác dụng lợi tiểu, tính chất lợi tiểu do quercitin vàchất vô cơ có trong diếp cá. .Dẫn xuất của dioxyflavonon đều có tính chất của rutin, có tác dụng là tăng sức chịuđựng vi huyết quản làm cho huyết quản khó dứt vỡ. .Alkaloid codalin có tác dụng kích ứng da, gây phồng.

3.5 KIM TIỀN THẢOTên Khoa Học: Herba Jinqiancao, Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr.

Họ Cánh Bướm (Fabaceae).Mô Tả: Cây thảo, sống lâu năm, bò sát đất, dài khoảng 1m. Lá mọc so le,

gồm 3 lá chét hình tròn, có lông &1 vàng. Hoa tự hình chùm. Tràng hoa hình bướm,

màu tía. Quả loại đậu, dài 14-16mmm, chứa 4-5 hạt.Mọc hoang trên vùng đồi trungdu, vùng núi.Bộ Phận Dùng: Toàn cây.Thành Phần Hóa Học: Ancloid, Tannin, Flavones, Phenols.Tác Dụng Dược Lý:+Tác Dụng Lên Tim Mạch tuần hoàn mạch vành tăng, hạ áp lực động mạch,

làm chậm nhịp tim, giảm lượng oxy ở tim đối với Chó.+Tác Dụng Trên Mật: có tác dụng tống sạn mật, làm giảm đau ở ống mật, hết

vàng da.





23

+Tác Dụng Đối Với Hệ Bài Tiết: lợi tiểu đối với chuột và thỏ, có thể do chấtPotasium chứa trong thuốc.

+Tác Dụng Đối Với Sỏi, Sạn: nước sắc Kim tiền thảo liều cao ( trên 80g),thường được dùng trị sạn ở mật hoặc đường tiểu.

+Đối Với Bệnh Nhiễm Khuẩn: nước sắc Kim tiền thảo trị 10 cas ho gà, có 7

cas khỏi, 2 cas có tiến triển. Loại Lysimachia (Quá Lộ Hoàng) đối với tụ cầu vàng,loại Glechoma ( Hoạt Huyết Đơn) đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn thương hàn, lỵ,trực khuẩn mủ xanh đều có tác dụng ức chế.





25

CHƯƠNG 1. VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU.

1.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH.Việc nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp “ Xây dựng quy trình phân tíchtổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng phương pháp UV-VIS “ được tiếnhành tại phòng thí nghiệm Hóa Đại Cương A3 và phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1 –Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trường Đại Học Cần Thơ.

Thời gian thực hiện đề tài: 01/2013 – 05/2013

1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.1.2.1. Dụng cụ- Các loại pipet: 0.1ml, 1ml, 2ml, 10ml

- Bình định mức: 10ml, 25ml, 50ml.- Cốc, đũa thủy tinh, quả bóp. Bình xịt nước cất

- Ống đong 10ml, 25ml.Các dụng cụ được rửa sạch và tráng rửa nhiều lần bằng nước cất 2 lần trước

khi làm thí nghiệm.

1.2.2. Hóa chất.- NaNO2, AlCl3.3H2O được bảo quản trong lọ kín.- Dung môi: DMSO, etanol.- NaOH 10%

- Nước cất 2 lần- Chất chuẩn: Quercetin tinh khiết 97.71%, Rutin tinh khiết 85.5%.





26

Hình 3. Giấy kiểm định chất lượng Quercetin và rutin

1.2.3. Thiết bị nghiên cứu.- Máy đo UV 6800.- Cân phân tích chính xác 10-4g.- Máy tính.- Bể điều nhiệt.

1.2.4. Xử lý kết quả thực nghiệm.Các thông số được xử lý theo chương trình phần mềm MicrosoftTM Excel 2003.





27

1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.Để hoàn thành các yêu cầu của đề tài luận văn, quá trình thực hiện gồm:- Ly trích flavonoid toàn phần bằng etanol từ các cao dược liệu có sẳn trong phòng thí nghiệm Hóa Đại Cương A3.

- Tối ưu hóa qui trình phân tích tồng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis.- Định lượng tổng flavonoid trong một số cao dược liệu có sẳn trong phòngthí nghiệm Hóa Đại Cương A3





28

CHƯƠNG 2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH ĐỊNHLƯỢNG TỔNG FLAVONOID BẰNG PHƯƠNG

PHÁP UV-VIS.

2.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONPOID BẰNG PHƯƠNG PHÁPUV-VIS.

Theo tài liệu [14,15,16] qui trình định lượng tổng flavonoid được đưa ra như

sau:

Hình 4. Quy trình định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS

Từ qui trình trên tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sau:- Bước sóng tối ưu (200-500nm).- Nồng độ dung môi ly trích (40-90%).- Nồng độ AlCl3 tối ưu (4-12%).

- Thời gian phản ứng tối ưu.

2.2. CHUẨN HÓA QUY TRÌNH.2.2.1. Xác định bước sóng tối ưu.Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác một lượng mẫu 5 loại cao có khối lượng m0

(khoảng 30g ) cho vào becher 100ml, thêm tiếp 20ml etanol 80 %, lắc đều, lắt trong bể điều nhiệt ở 50oC khoảng 5 phút. Để nguội, lọc lấy dung dịch, định mức đến25ml bằng etanol 80%. Thu được 5 mẫu dung dịch nồng độ C0.

Cao dược liệu

ethanol

Tủa Dung dịch

AlCl3, môi trường kiềm.

Dung dịch màu

Đo độ hấp thụ

Ghi nhận A





29

Tiến hành:

Mẫu cao: Cho vào bình định mức 50ml: 0.1ml mẫu, 0.1ml chuẩn(100g/ml),

10ml nước cất, 3ml NaNO2, 3ml AlCl3, 2ml NaOH 10% định mức đến 50ml bằng nước cất.

Chất chuẩn: tiến hành phản ứng tương tự với 0.2 ml dung dịch chuẩn.Khảo sát độ hấp thụ trong khoảng 200-500 nm.

Tên Quercertin Rutin Bìmbìm

Rauđắng

Đinhlăng

Diếp cá Kimtiềnthảo

max

(nm)

356 356 378 383 410 385 382

Bảng 3. Bước sóng cực đại của các chất.

Kết quả cho thấy ở pH > 7, phức của các loại cao hấp thụ ở các bước sóng

khác nhau và có sự chênh lệch khá lớn do nền mẫu khác nhau dẫn đến bước sónghấp thu cực đại khác nhau. Vì vậy khi tiến hành định lượng tổng flavonoid củanhững loại dược liệu khác nhau ta cần khảo sát lại bước sóng hấp thu cực đại.

2.2.2. Khảo sát nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ.Tiến hành: Cân một lượng mẫu bằng nhau các loại cao (0.5g) cho vào 5

becher 100ml, thêm lần lượt vào các becher 10ml etanol nồng độ 50%, 60%, 70%,

80% và 90%, để trong bể điều nhiệt ở 50o

C khoảng 5 phút. Để nguội, lọc lấy dungdịch, định mức đến 10ml bằng etanol nồng độ tương ứng. Thực hiện phản ứng như

trên, ghi nhận độ hấp thụ ở max tương ứng khảo sát ở mục 2.2.1





30

Bảng 4. Nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ.

00.02

0.040.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0 20 40 60 80 100

Nồng độ EtOH (%)

Đ ộ

h ấ p t h ụ

( A ) bìm bìm

rau đắng

đinh lăng

diếp cá

kim tiền thảo

Hình 5. Đồ thị biểu diển nồng độ dung môi ảnh hưởng đến độ hấp thụ.

Từ kết quả thu được ở bảng trên và đồ thị cho thấy phức có độ hấp thụ lớnnhất khi hòa tan trong etanol 80% điều đó cho thấy flavonoid chiết tốt trong ethanol

80%. Vì vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo tôi sử dụng dung môi etanol 80% để lytrích mẫu.

2.2.3. Khảo sát nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ.Chuẩn bị mẫu: Cân một lượng mẫu bằng nhau của các loại cao (15g) cho vào

becher 100ml, thêm 20ml etanol 80%, lắc trong bể điều nhiệt khoảng 5 phút ở 500C.Để nguội, lọc, lấy dung dịch định mức đến 25ml bằng etanol 80%. Thu được dungdịch mẫu nồng độ Cm ( giữ mẫu được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo).

40 60 70 80 90

Bìm bìm 0.0918 0.1102 0.1198 0.1237 0.0892

Rau đắng 0.0989 0.1152 0.1285 0.1386 0.0852

Đinh lăng

0.1152 0.1179 0.1244 0.1325 0.0863

Diếp cá0.1022 0.1089 0.1167 0.1261 0.0821

Kim tiền thảo0.1625 0.1687 0.1712 0.1784 0.1325





31

Tiến hành: Cho vào bình định mức 50ml : 0.1ml mẫu nồng độ Cm, 10mlnước cất, 3ml AlCl3 nồng độ từ 4 – 10%, 2ml NaOH 10%, định mức đến vạch bằngnước cất. Đo, ghi nhận độ hấp thụ ở các bước sóng tối ưu tương ứng sau 5 phút.

Bảng 5. Nồng độ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Nồng độ AlCl3

Đ ộ

h ấ p t h ụ

( A ) bìm bìm

rau đắng

đinh lăng

diếp cá

kim tiền thảo

Hình 6. Đồ thị biểu diển nồngdđộ AlCl3 ảnh hưởng đến độ hấp thụ

A

CAlCl3 (%)

Bìm bìm Rau đắng Đinh lăng Kim tiềnthảo

Diếp cá

5 0.2882 0.2218 0.3785 0.4103 0.3011

6 0.2987 0.2304 0.3963 0.4165 0.3123

7 0.3105 0.2396 0.4083 0.4216 0.3189

8 0.3198 0.2412 0.4103 0.4284 0.4050

9 0.3301 0.2507 04518 0.4325 0.4185

10 0.3432 0.2680 0.5106 0.4518 0.432811 0.3264 0.2314 0.4315 0.4389 0.4105





32

Từ kết quả thu được ở bảng và đồ thị trên cho thấy khi nồng độ AlCl3 là10%, phức đạt độ hấp thụ cao nhất. Vì vậy, 10% là nồng độ AlCl3 tối ưu. Ở các thínghiệm tiếp theo chúng tôi thực hiện ở điều kiện này.

2.2.4. Khảo sát thời gian phản ứng ảnh hưởng đến độ hấp thụ.

Tiến hành: Cho vào bình định mức 50ml : 0.1ml mẫu nồng độ Cm, 10ml nước cất,3ml AlCl3 nồng độ từ 10%, 2ml NaOH 10%, định mức đến vạch bằng nước cất. Đođộ hấp thụ ngay sau khi thực hiện phản ứng. Ghi nhận độ hấp thụ ở các điểm thờigian.

0,295

0,3

0,305

0,31

0,315

0,32

0 5 10 15 20 25 30 35

Thời gian (phút)

Đ ộ

h ấ p t h ụ ( A )

Series1

Hình 7. Thời gian phản ứng của cao Kim tiền thảo.

0.3480.3490.35

0.3510.3520.3530.3540.3550.356

0.357

0 10 20 30 40

Thời gian ( phút )

Đ ộ h ấ p t h ụ ( A

)

Series1

Hình 8. Thời gian phản ứng của cao Đinh lăng.





33

Hình 9. Thời gian phản ứng của cao diếp cá.

0.223

0.224

0.225

0.226

0.227

0.228

0.229

0.230.231

0.232

0 5 10 15 20 25 30 35

Thời gian (phút)

Đ ộ h ấ p t h ụ ( A )

Series1

Hình 10. Thời gian phản ứng của cao Rau đắng.

0.212

0.2130.214

0.215

0.216

0.217

0.218

0.219

0.22

0.221

0 5 10 15 20 25 30 35

Thời gian (phút)


Series1

Hình 11. Thời gian phản ứng của cao Bìm bìm

0,295

0,3

0,305

0,31

0,315

0,32

0 5 10 15 20 25 30 35

Thời gian (phút)

Đ

ộ

h ấ p

t h ụ ( A )

Series1





34

Theo kết quả trên, độ hấp thụ của phức của các cao tương đối ổn địnhkhoảng 15 phút sau khi thực hiện phản ứng màu. Do đó, tất cả các mẫu thí nghiệmđược thực hiện trong 15 phút sau phản ứng màu.

2.2.5. Quy trình định lượng tồng flavonoid.Qua các kết quả thí nghiệm khảo sát, đề tài đã chọn được các điều kiện tối ưu để phân tích tổng flavonoid bằng phương pháp UV-VIS nhu sau:

Bước sóng cực đại của các loại cao và chất chuẩn khác nhau và chênhlệch khá nhiều do thành phần và hàm lượng của flavonoid trong các loại caokhác nhau và cấu trúc nền mẫu khác nhau.

Tên Bìm bìm Rau

đắng

Đinh

lăng

Diếp cá Kim tiền

thảo

max (nm)

378 383 410 385 382

Nồng độ ethanol hòa tan gần như nhau: 80%. Nồng độ AlCl3 tối ưu là như nhau: 10%.Thời gian phản ứng tương đối ổn định: 15 phút sau khi phản ứng.





35

Quy trình định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp thêm chuẩn:

+ Chuẩn bị mẫu: Cân M(g) mỗi loại cao (khoảng 0.5g) cho vào cốc, hòa tan bằng10ml ethanol 80% trong bể điều nhiệt (khoảng 500C) lọc lấy dung dịch, địnhmức đến 10ml bằng ethanol 80%. Thu được dung dịch mẫu nồng độ Cm.+ Tiến hành tạo phức: Chuẩn bị trong bình định mức 10ml : Cho vào bình định mức10ml: 0.1ml mẫu nồng độ C0, 0.1ml chất chuẩn nồng độ : C1, C2, C3, C4, C5 (µg/ml),0.3ml NaNO2 5%, 0.3 ml AlCl3, 2ml NaOH 10%. Định mức đến vạch, để 5 phút

+ Đo độ hấp thụ cùng với mẫu trắng ở các bước sóng tối ưu. Ghi nhận độ hấp thụ,vẽ phương trình đường thẳng Y= a.X + b ( Y : độ hấp thụ, X là nồng độ) Kết quả được tính theo công thức: F = ( Cm.V.a)/M.Trong đó: F là hàm lượng tổng flavonoid (mg/g).

Cm là nồng độ flavonoid suy ra từ phương trình.V là thể tích mẫu.A là hệ số pha loãng.M là khối lượng mẫu.

Cao dược liệu

Ethanol 80%

TủaDung dịch

V(ml) chuẩnAlCl3, NaNO2, NaOH.

Dung dịch màu

Đo độ hấp thụ ở max

Ghi nhận AY= a.X + b (b khác 0)Dựng pt





36

CHƯƠNG 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG FLAVONOIDTRONG MỘT SỐ CAO DƯỢC LIỆU BẰNG

PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

3.1. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨN QUERCETIN.Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu tương tự như thí nghiệm trên. ( m0 = 0.5g )Tiến hành: Cho vào bình định mức 10ml: 0.1ml mẫu nồng độ C0, 1ml quercertin

nồng độ lần lượt: 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml, 0.3ml NaNO2 5%, 0.3 ml AlCl3, 2ml NaOH 10%. Đo độ hấp thụ ở bước sóng tối ưu của từng loại cao sau 5 phút.

Nồng độ(µg/ml)

Loại cao

C0 + 10 C0 + 20 C0 + 30 C0 + 40 C0 + 50

Bìm bìm 0.2005 0.2574 0.3072 0.3626 0.4108

Đinh lăng 0.2891 0.3586 0.4221 0.4889 0.5489

Diếp cá 0.2192 0.2714 0.3288 0.3785 0.4389

Kim tiền thảo 0.591 0.6903 0.7944 0.9004 1.0092

Rau Đắng 0.2011 0.2519 0.3089 0.3587 0.4098

Bảng 6. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Quercetin

Hình 12. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu của cao Kim Tiền Thảo-Quercetin

y = 0.1047x + 0.4831R2 = 0.9997

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6

Nống độ (ppm )


Series1

Linear (Series1)





37

Hình 13. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của cao Đinh lăng-Quercetin

y = 0.0547x + 0.1634R2 = 0.9992

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1

Linear (Series1)

Hình 14. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của cao Rau đắng-Quercetin

y = 0.0526x + 0.15R2 = 0.9993

0

0.050.1

0.150.2

0.25

0.3

0.350.4

0.45

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1

Linear (Series1)

Hình 15. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Quercetin

y = 0.065x + 0.2266R2 = 0.9995

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1

Linear (Series1)





38

Nhìn chung, đồ thị biểu diển độ hấp thụ của mẫu có độ tuyến tính cao (R 2 >0.999) giữa độ hấp thụ và nồng độ Cm.

3.2. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN SỬ DỤNG CHẤT CHUẨN RUTIN.Tiến hành: Tiến hành tương tự như mục 3.1, sử dụng chất chuẩn Rutin. Ghi

nhận độ hấp thụ sau 5 phút ở bước sóng tối ưu.

Nồng độ (µg/ml)

Loại cao

C0 + 10 C0 + 20 C0 + 30 C0 + 40 C0 + 50

Bìm bìm 0.1838 0.2382 0.2974 0.3493 0.4083

Rau Đắng 0.1929 0.2515 0.3055 0.3587 0.4134

Diếp cá 0.2038 0.2596 0.3098 0.3689 0.4253

Kim tiền thảo 0.379 0.4527 0.5196 0.6016 0.6692Đinh lăng 0.2727 0.3341 0.3979 0.4589 0.5291

Bảng 7. Độ hấp thụ của mẫu với chất chuẩn Rutin

y = 0.0548x + 0.1399R2 = 0.9997

0

0.05

0.1

0.15

0.20.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 1 2 3 4 5 6

C

A Series1Linear (Series1)

Hình 16. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Rau đắng-Rutin





39

y = 0.056x + 0.1274R2 = 0.9997

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1

Linear (Series1)

Hình 17. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Bìm bìm-Rutin

y = 0,0638x + 0,2073R2 = 0,9994

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1Linear (Series1)

\

Hình 18. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Đinh lăng-Rutin

y = 0.0729x + 0.3056R2 = 0.9992

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6

C

ASeries1

Linear (Series1)

Hình 19. Đồ thị biểu diển độ hấp thụ của Kim tiền thảo-Rutin





40

y = 0.0552x + 0.1478

R2 = 0.9994

0

0.05

0.1

0.150.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 1 2 3 4 5 6

C

ASeries1

Linear (Series1)

Hình 20. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ của Diếp cá-Rutin Nhìn chung, đồ thị biểu diển độ hấp thụ của mẫu có độ tuyến tính cao

(R

2

> 0.999) giữa độ hấp thụ và nồng độ Cm.

3.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.Từ đồ thị cho thấy độ tuyến tính rất cao (R 2>0.999) giữa độ hấp thụ và nồng

độ C. Đề tài tiến hành tính toán hàm lượng tổng flavonoid từ kết quả đo độ hấp thụ

của phức bằng phương pháp thêm chuẩn với chất chuẩn Quercetin và Rutin.

Loại cao Bìm

bìm

Đinh

lăng

Diếp cá Kim tiền

thảo

Rau

Đắng

Tính theoQuercertin

0.5703 0.6972 0.5974 0.9228 0.5627Hàmlượngtổngflavonoid(mg/g) Tính theo

Rutin0.455 0.6498 0.5355 0.8384 0.5106

Bảng 8. Hàm lượng mẫu tính theo Quercetin và Rutin

Nhận xét: Từ bảng kết quả trên ta thấy hàm lượng tổng flavonoid tính theo

hai chất chuẩn cho kết quả khác nhau và hàm lượng tổng flavonoid tính theoQuercetin cho kết quả cao hơn. Do cấu trúc Rutin có phần đường glycoside, chính phần đường này làm ảnh hưởng đến ái lực của phần aglycone với môi trường xungquanh nên làm cho huỳnh quang của Rutin giảm đi rất nhiều so với Quercetin.





41

Tác giả Phan Văn Cư [17 ] trong đề tài nghiên cứu của mình đã định lượngtổng flavonoid trong cây Diếp cá bằng phương pháp cân và hàm lượng tổngflavonoid là: 2.73% (tương đương 0.273mg/g)

So sánh với kết quả của tác giả Phan Văn Cư phương pháp xác định tổngflavanoid bằng UV-Vis đề tài thực hiện có hàm lượng tổng flavonoid đo được rất

cao (gấp 2 lần).Theo luận văn: có thể trong quá trình định lượng tổng flavanoid bằng phương phápcân qua nhiều giai đoạn chiết, lọc tủa dẫn đến mất một lượng khá nhiều cácflavanoid chưa tủa hết và có thể mất lượng trong giai đoạn chiết và giai đoạn loạichì dư.





44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Nguyễn Thị Kim Phụng; giáo trình phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ ; Đạihọc QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH.

[2]. Nguyễn Văn Giáp, Nguyễn Ngọc Thế; Khảo sát các hợp chất họ flavonoidtrong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L;luận văn tốt nghiệp, Đại Học Cần Thơ.[3]. Võ Văn Chi ; Từ điển cây thuốc Việt Nam ; Nxb. Y học, tr. 91 (1997).

[4]. Phạm Hoàng Hộ ; Cây cỏ Việt Nam ; Nxb Trẻ, tr. 979 (2000).[5]. Nguyễn Thị Thúy Hằng ; Khảo sát thành phần hóa học cây đinh lăng dĩa Polyscias scutellaria ; Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. LVCH.[6]. M. Perry ; Medicinal plants of East and Southeast Asia ; The MIT press, 108

(1895).[7]. DNP on CD ROM, Version15.1, Copyright © 1982-2007 Chapman&Hall/CRC.[8]. Chu Thị Ngọc Anh, Khảo sát quy trình xác định Morin, Quercetin và Rutinbằng phương pháp sắc ký bảng mỏng- Fluorodensitometer trên hoa hòe và một sốthực phẩm, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh.[9]. Nguyễn Tuấn Quang, Triệu Duy Điệt, Vũ Bình Dương, Nguyễn Trung Hiếu,Chúc Mai Hiên ; Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây Màng Tím(Cleome chelidonii L.f., Capparaceae) ; học viện quân y.

[10]. Catherine A. Rice-Evans Lester Packer, Flavonoids in Health and Disease.[11] Zarina, Z. and Tan S. Y; Determinnation pf flavonoid in Citrus grandis

(Pomelo) peels and their in hibition activity on lipit peroxidation in fish tissue;Titernational Food Research Journal 20(1):313-317 (2013)[12] Lmaye A. S., Deore G. B., Shinde B. M. and S. l. Laware, Assessment of

Adiantum trapeziforme L. for antioxidant activities, Asian J. Exp.biol.sci.spl.2010:75-80.[13] Ivan M. Savic, Optimization of total flavonoid copound extraction from

Camellia sinesis using the artificial neural natwork and response surface

methodology; Scientific paper.[14]. Hongbin Zhu, Yuzhi Wang, Yuxuan Liu, Yalin Xia, Tian Tang; Analysis of Flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV–Vis Spectrophotometry withC omparative Stud y on Different E xtraction Technologies. P ortulaca oleracea L.[15]. Ana Josane Santas Fernandes và cộng sự; Tatal flavonoid content in the rawmaterial and aqueous extractive from Bauhinia monadra Kurz (Caesalpiniaceae).




http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yuzhi+Wang%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yuxuan+Liu%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yalin+Xia%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Tian+Tang%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Tian+Tang%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yalin+Xia%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yuxuan+Liu%22

http://link.springer.com/search?facet-author=%22Yuzhi+Wang%22




[16]. Yujie Chen, Jing Wang, and Dingrong Wan; Determination of total flavonoidsin three Sedum crude drugs by UV–Vis spectrophotometry; Pharmacogn Mag. 2010Oct-Dec; 6(24): 259–263.[17]. Phan Văn Cư; Phân lập flavonoid từ cao butanol trong cây Diếp cá

(Houttuynia cordata Thunb) ở tỉnh Thừa Thiên Huế; Tạp chí Khoa học, Đại họcHuế, số 63,2010.

[18]. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Kim Oanh ; Phân lập và xác định cấu trúc một sốhợp chất từ cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb) của Việt Nam; Tạp chí Pháttriển KH và CN,tập 11, số 7, 2008



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20J%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wan%20D%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wan%20D%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20J%5Bauth%5D


xây dựng quy trình phân tích tổng flavonoid từ một số cao dược liệu bằng...

Documents