TESIS

EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO Y DEL CONTENIDO DE HEMOCITOS

CIRCULANTES TOTALES EN JUVENILES DE CAMARÓN BLANCO, LITOPENAEUS

VANNAMEI, EXPUESTOS A DIETAS EXPERIMENTALES CON DIFERENTES

NIVELES DE PROTEÍNA Y PROBIÓTICOS.

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS MARINAS Y COSTERAS

ORIENTACIÓN EN ACUACULTURA

PRESENTA:

YENNI MORALES CRISTOBAL

DIRECTORES:

DR. ANGEL I. CAMPA CORDOVA DR. MARCO CADENA ROA

LA PAZ, B.C.S. NOVIEMBRE DE 2012

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

AREA INTERDICIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MARINA

DEDICATORIA

A mis padres (Margarita y Erasto) por ser el pilar fundamental en todo

lo que soy, porque creyeron en mi y por su incondicional apoyo,

porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo ver alcanzada mi

meta, ya que siempre estuvieron impulsándome en los momentos más

difíciles. Va por ustedes, por lo que valen, porque admiro su fortaleza y

por lo que han hecho de mí.

A ustedes mis princesitas hermosas (Dasha aileen y Karolay) que son

mi razón de ser ¡las amo!

A mis hermanos y toda mi familia que de una u otra forma me han

apoyado y animado a concluir este presente.

Mil palabras no bastarían para agradecerles su apoyo, su comprensión

y sus consejos en los momentos difíciles.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Ángel I. Campa Córdova, por su gran apoyo y paciencia, que hicieron

posible la realización de este trabajo, también por sus enseñanzas y consejos que

aportaron a mi formación profesional y personal.

Al Dr. M. Martin terrazas Fierro, por la orientación, aporte de idea al trabajo, sin

duda fue un gran apoyo.

Al CONACYT por otorgarme la beca de maestría.

A la M. C. Irasema Luis por su apoyo y su dedicación en la capacitación y

compartir parte del conocimiento como profesionista, en el desarrollo de los

experimentos y la parte microbiológica que se realizo, muchas gracias y por la

amistad que me brindo, sinceramente mi respeto para usted.

A la Chula por el asesoramiento en el laboratorio de patogénesis.

A Sandra de la Paz Reyes del laboratorio de nutrición experimental, quien tuvo la

disposición de auxiliarme y apoyarme durante el desarrollo de los bioensayos.

A Wilberth Serrano por el apoyo en los bioensayos experimentales como olvidar

esas caminatas de los fines de semana.

A norma angélica y Víctor Manuel del laboratorio de diagnostico microbiológico

por las enseñanzas de las técnicas de tinción e identificación bacteriana.

Al Dr. Jaime Holguín, por brindarme un espacio en el laboratorio de

fitopatología.

A Ernesto Goytortua por enseñarme a usar equipo de la planta de alimento y

asesoramiento en nutrición.

A todos los compañeros del laboratorio de patologia.

A todos mis compañeros y amigos de CIMACO (Claudia, karlita, Ruth, edwin),

por el cariño y apoyo moral que siempre he recibido de ustedes, en especial a ti

Ruth que fuiste mi asesora en la escritura y por aclarar mis dudas de este

trabajo.

Y por aquellas personas que me ofrecieron su ayuda, y por si se me olvido

alguien mil gracias a todos.

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 2. ANTECEDENTES 2.1. Generalidades de la biología de camarones peneidos 2.1.1. Ciclo de vida de los camarones 2.2. La camaronicultura 2.2.1. Importancia económica 2.3. Nutrición general y hábitos alimenticios del camarón 2.3.1. Detección del alimento 2.3.2. Fuentes de proteínas para camarón 2.3.3. Proteínas y aminoácidos 2.3.4. Carbohidratos 2.3.5. Lípidos 2.3.6. Minerales y vitaminas 2.4. Sistema de defensa 2.4.1. Mecanismos de defensa 2.5. Microorganismos benéficos; probióticos 2.5.1. Uso de probióticos en acuacultura 2.5.2. Beneficios de los probióticos 2.5.3. Efectos beneficiosos del uso de los Bacillus como probióticos 2.5.4. Uso de levaduras en acuacultura 3. JUSTIFICACIÓN 4. OBJETIVOS 5. MATERIALES Y METÓDOS 5.1. Bioensayo I 5.1.1. Determinacion del efecto de tres niveles de inclusión de proteína cruda en el alimento sobre el crecimiento y utilización del alimento en juveniles de camarón L. vannamei 5.1.2. Organismos 5.2. Preparacion de los alimentos experimentales 5.2.1. Ingredientes 5.2.2. Formulación de los alimentos 5.2.3. Fabricación de alimentos 5.2.4. Alimentos experimentales 5.2.5. Analisis químico proximal de los ingredientes y alimentos 5.3. Sistema experimental 5.3.1.Diseño experimental 5.4. Bioensayo II

1 4 4 6 6 7 8 10 11 13 15 15 16 17 18 19 20 22 22 24 26 28 29 29 29 29 30 30 30 31 33 34 35 36 37

5.4.1. Determinacion de crecimiento, supervivencia y CTH en juveniles de camarón blanco alimentados con un nivel de proteína en el alimento, con y sin mezcla probiótica 5.4.2. Organismo 5.4.3. Cepas probióticas 5.4.4.Preparacion de las mezclas probióticas 5.5. Alimento experimental 5.5.1. Sistema experimental 5.5.2. Obtencion y conteo total de hemocitos circulantes (CTH) 5.5.3. Evaluacion de parámetros zootécnicos 5.5.4. Análisis estadísticos 6.RESULTADOS 6.1. Bioensayo I 6.1.1. Parámetros físico químicos 6.1.2. Análisis químico proximal de los ingredientes 6.1.3. Composición química proximal de los alimentos experimentales 6.1.4. resultados zootécnicos 6.1.5. Supervivencia 6.1.6. Conteo total de hemocitos (CTH) 6.2. Bioensayo II 6.2.1. Parámetros físico químicos 6.2.2. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimento 6.2.3. Resultados zootécnicos 6.2.4. Conteo total de hemocitos 7. DISCUSIÓN 7.1. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei alimentados con tres niveles de proteína 7.2. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei, alimentados con un nivel de proteína, adicionado con mezclas probióticas 7.3. Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón blanco L. vannamei 8. CONCLUSIONES 9. RECOMENDACIONES 10. BIBLIOGRAFIA

37 37 38 39 39 39 41 42 43 44 44 44 44 46 47 50 51 53 53 53 54 59 60 60 67 71 76 78 79

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Composición de los alimentos utilizados durante el primer

bioensayo de crecimiento en juveniles de camarón blanco L vannamei

Tabla II. Valores promedios de los parámetros físicos químicos del agua de

cultivo durante los 40 días de experimento

Tabla III. Composición proximal de los ingredientes utilizados para la

preparación de las dietas experimentales

Tabla IV. composición química proximal de los tres alimentos usados en el

primer bioensayo de crecimiento para juveniles de L. vannamei

Tabla V. Variables de peso final, consumo aparente de alimento, conversión

alimenticia y supervivencia de juveniles de L. vannamei, alimentados

durante 40 días con tres niveles de proteína

Tabla VI. Valores promedios de los parámetros físicos químicos de la calidad

del agua durante el desarrollo del segundo experimento

Tabla VII. Resultados de las variables medidas durante el bioensayo II de

crecimiento

33

44

45

46

47

53

54

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Vista lateral de la morfología de los camarones peneidos

Figura 2. .Sistema de cultivo utilizado para la evaluación de los alimentos

experimentales en el laboratorio de Nutrición Experimental

Figura 3. peso de L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteina

(38, 41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo

Figura 4. pesos promedios de camarones juveniles de L. vannamei

despues de haber sido tratados con tres alimentos con distintos nivele

de proteina (38, 41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo

Figura 5. Consumo aparente de alimento, en juveniles de camarón

cultivados durante 40 días

Figura 6. .Supervivencia de juveniles de L. vannamei tratados con 38, 41 y

44% de PC durante 40 días de cultivo

Figura 7. Conteo Total de Hemocitos Circulares (CTH) en juveniles de

camarón blanco L. vannamei alimentados durante 40 días con alimentos

conteniendo 38, 41 y 44% PC

Figura 8. Peso de juveniles de camarón blanco L. vannamei, durante 45 días

de cultivo, alimentados con tres diferentes tratamientos: Trat.1) 38% PC;

Trat.2) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras;

1x106 UFC/ml y un control

Figura 9. .Peso promedio de los 3 diferentes tratamientos utilizados en

juveniles de L. vannamei cultivados durante 45 días

Figura 10. Consumo aparente de alimento en juveniles de L. vannamei

cultivados durante 45 días alimentados con 3 distintos tratamientos: Trat.1)

4

36

48

48

50

51

52

56

56

57

38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix

levaduras; 1x106 UFC/ml y un grupo control

Figura 11. Supervivencia de juveniles de camarón L. vannamei alimentados

con tres distintos tratamientos: a) control; b) 38%PC (t1); c) 38%PC+ mix

bacilos; 1x106 UFC/ml (t2); d) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml (t3)

Figura 12. Conteo Total de Hemocitos (CTH), en juveniles de camarón L.

vannamei alimentados con los siguientes tratamientos: a) control; b) 38% PC

(Trat.1), c) 38% PC+ mix bacilos (Trat. 2); d) 38% PC + mix levaduras (Trat.

3), durante 45 días de cultivo experimental

58

59

RESUMEN El cultivo de camarón representa el arte acuícola más tecnificado de las últimas décadas, la producción se ha expandido debido al incremento en la población. El alimento es un factor que influye en la calidad y desarrollo de los camarones, la calidad nutricional del alimento y su manejo en los estanques son sumamente importantes en el cultivo, ya que tienen gran influencia sobre los factores que determinan el resultado final. Se ha demostrado ampliamente que las proteínas son el principal factor del cual depende el crecimiento del camarón. Por otra parte, el cultivo sigue siendo afectado en diferentes partes del mundo por la diseminación de diversas enfermedades infecciosas, provocadas por bacterias y virus las cuales han provocado importantes pérdidas, por tal razón desde tiempos atrás se han venido realizando estudios relacionados con la inmunología del camarón y compuestos que pudieran favorecer el sistema inmune del mismo. En el presente trabajo se evaluó el crecimiento, factor de conversión alimenticia, supervivencia, y el conteo total de hemocitos (CTH) como un parámetro para determinar inmunidad en juveniles de camarón blanco L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteína y probióticos. En la primera parte del estudio, se evalúo el efecto de tres dietas con 38%, 41% y 44% de proteína durante 40 días, alimentando tres veces al día, suministrándo el 10% de la biomasa de cada acuario, realizando monitoreo diarios de los parámetros fisicoquímicos, conteo de organismos, conteo de alimento residual, así como también biometrías cada 15 días, luego de cada biometría se hicieron los ajustes correspondientes de la ración de alimento diario para cada acuario. Al final del primer bioensayo se seleccionó una dieta. Posteriormente, se llevó a cabo un segundo bioensayo, donde se evaluó la dieta seleccionada en el primer bioensayo la cual consistió en el alimento con 38% de proteína, además se evaluó un mix de Bacillus como segundo tratamiento (38% + mix Bac 1x106 cel/g de alimento), un mix de levaduras como tercer tratamiento (38% + mix Leva 1x106 cel/g de alimento) y un control, utilizando alimento comercial marca PIASA (35% de proteína). Para ambos bioensayos se determinó el porcentaje de supervivencia, crecimiento, consumo de alimento, factor de conversión alimenticia y el conteo total de hemocitos como parámetro de inmunidad. Dentro de los resultados obtenidos, el comportamiento de los parámetros físico químicos del agua (oxigeno disuelto, temperatura y salinidad) registrados durante los dos periodos experimentales, no presentaron variaciones significativas en los cultivos, comportándose dentro de los rangos normales recomendados para camarones peneidos. Los resultados obtenidos de crecimiento, en el primer bioensayo, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control favoreciendo el incremento en el peso desde la etapa inicial, no mostrando diferencias significativas entre los tratamientos utilizados (38, 41 y 44% de proteína). Se observó que con niveles de 38% de proteína o superiores, los camarones presentaron mejor comportamiento, además tomando en cuenta el aspecto económico, el tratamiento con 38% de proteína fue el que reunió las mejores condiciones, debido a que resulto un buen alimento para

el crecimiento del camarón, lográndose de esta forma disminuir el nivel de proteína en la dieta comercial. Los valores de conversión alimenticia fueron mayores en los tres niveles de proteína experimentales en comparación con los del grupo control. No se encontraron diferencias entre los tres niveles evaluados considerándose como buenos valores de conversión alimenticia. La supervivencia obtenida en todos los tratamientos se registro entre el 90 y 100 %, no encontrando diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo control. En el segundo bioensayo se agregaron mezclas probióticas en el alimento conteniendo 38% de proteína, obteniendo diferencias significativas en las variables de crecimiento respecto al grupo control (sin probióticos) pero no entre los tratamientos, indicando con estos resultados que un alimento con calidad nutricional se refleja en un rápido crecimiento y mejor salud del camarón. La determinación del factor de conversión alimenticia presentó valores mayores promedios en los tres tratamientos respecto al control. Se obtuvieron supervivencias entre el 80% y el 93% en los tratamientos y un 63.33% en el grupo control sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los grupos tratados y el control. En los resultados del conteo total de hemocitos para el primer experimento, se observaron incrementos en los camarones alimentados con 38, 41 y 44% de proteína, no habiendo diferencias significativas entre los tratamientos pero sí entre los camarones tratados con el alimento de 41% de proteína y el grupo control. El conteo total de hemocitos circulantes en el segundo bioensayo no mostro diferencias entre los tres tratamientos, pero el tratamiento tres (38% + mix Leva 1x106 cel/g de alimento) registro un incremento significativo de hemocitos circulantes en comparación con grupo control. Con relación al CTH, se concluye que los niveles de proteína y la inclusión de probióticos influyen en el contenido de hemocitos circulantes en los camarones, resultando indicadores importantes ya que son las principales células efectoras del sistema inmune. El adicionar mezclas probióticas en el alimento, se demostró que sirven como aditivos en el alimento para camarón blanco, incrementando el número total de hemocitos.

1

I. Introducción

En México una de las actividades que ha adquirido mayor importancia en los

últimos años es la acuacultura, arrojando beneficios sociales y económicos los

cuales a su vez se han traducido en una fuente de alimentación con un elevado

valor nutricional. En forma radical el cultivo de crustáceos, particularmente de

camarón ocupa un lugar importante, debido a la importancia en términos

económicos que este recurso representa para la región del Noroeste del Pacífico

Mexicano. El cultivo de camarón representa el cultivo más tecnificado siendo

además un producto con calidad de exportación (Alvarez y Avilés, 1995). La

calidad nutricional del alimento y su manejo en la estanquería son sumamente

importantes en el cultivo de camarón, ya que tienen gran influencia sobre los

factores que determinan el resultado final. Es necesaria la formulación de dietas

efectivas, nutricionalmente adecuadas y con costos bajos, para lo cual es

imprescindible el estudio de diversos aspectos nutricionales (Galindo et al, 2002).

Las proteínas son los nutrimentos más importantes en el alimento del camarón, ya

que son esenciales para la síntesis de enzimas, hormonas y hemocianina,

constituyen el sustento del sistema inmune, participan en la construcción de

tejidos, su reparación y mantenimiento, siendo además una fuente importante de

energía catabólica para el camarón (Pascual et al, 2003; Guo et al, 2006; Pascual

et al, 2006). Se ha demostrado ampliamente que, las proteínas son el principal

factor del cual depende la velocidad de crecimiento del camarón, pero hasta ahora

poco se ha investigado sobre la formulación de alimentos balanceados sustentada

en la calidad de la proteína (aminoácidos esenciales) en sustitución de la cantidad

(Forster y Dominy, 2006).

La proteína es el componente principal de la hemolinfa y se ha demostrado que

una deficiencia proteica en el alimento repercute de manera directa en la

concentración del nutrimento en ese fluido corporal (Pascual et al, 2006). Lo

2

anterior es importante en virtud de que la hemocianina contenida en la hemolinfa

es también un reservorio de proteína para el camarón y juega un papel en el

control de la precisión osmótica dependiendo de las condiciones de salinidad en el

agua, actuando como molécula adaptativa de acuerdo a los cambios ambientales

(Cuzon et al, 2004).

El desarrollo de la industria camaronera, ha estado caracterizado por el

surgimiento de muchas restricciones en la producción, entre ellas la más

importante es la ocurrencia de enfermedades infecciosas.

La resistencia de los camarones contra organismos invasores es fuertemente

influenciada por su estado inmunológico. Los crustáceos tienen un sistema de

defensa menos desarrollado que en peces u otros vertebrados; más

específicamente, estos carecen de memoria adaptativa; es decir que no son

capaces de producir inmunoglobulinas y dependen aparentemente de sistemas

innatos de defensa. El entendimiento de los mecanismos de defensa de los

camarones en combinación con diferentes estrategias puede contribuir a un mejor

manejo de las enfermedades. De hecho, existen diferentes métodos para conocer

el estado de salud o enfermedad de los animales. Entre ellos, la evaluación de

parámetros inmunológicos y fisiológicos incluyendo concentración de proteína en

la hemolinfa, conteo total de hemocitos, actividad fenoloxidasa, producción de

radicales libres, actividad fagocítica o variables de campo como pueden ser

pruebas de estrés, sobrevivencia, y crecimiento pueden ser utilizados como

indicadores del estado de salud de los camarones (Rodríguez y Le Moullac, 2000).

La función básica de un sistema de defensa es el mantenimiento de la integridad

biológica del individuo, lo cual se logra por una adecuada capacidad para

diferenciar lo propio de lo extraño. Esta característica permite eliminar partículas,

parásitos e incluso células propias alteradas o envejecidas. El fenómeno parece

ser dependiente del reconocimiento de diferencias física, química, fisicoquímicas y

biológicas en las células (Lackie, 1980) y un proceso de defensa es iniciado por

una célula o molécula que reconoce un determinado patrón de no propiedad. El

3

camarón al igual que los otros invertebrados, posee factores celulares y factores

humorales (Vargas-Albores, 1996), los cuales constituyen un sistema de defensa

eficiente. La respuesta celular es un conjunto de mecanismos de defensa donde

se requiere la presencia de las células sanguíneas, hemocitos que son los

responsables de la fagocitosis, la encapsulación y la formación de nódulos.

El uso de probióticos como suplementos de la alimentación animal de granja,

originalmente fueron incorporados en alimentos para aumentar el crecimiento del

animal y mejorar su salud aumentando su resistencia a las enfermedades. Los

resultados obtenidos en muchos países han indicado que algunas de las

bacterias utilizadas en los probióticos son capaces de estimular el sistema

inmune (Fuller, 1992). Las bacterias son adicionadas a los sistemas de producción

acuícola para mejorar o manipular las comunidades microbianas en el agua y

sedimento, para reducir o eliminar a las especies patógenas seleccionadas, y para

mejorar el crecimiento y supervivencia, de las especies acuáticas en cultivo

(Irianto y Austin, 2002). Los probióticos utilizados en estudios acuícolas incluyen

bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, bacteriófagos, levaduras y algas

unicelulares (Irianto y Austin, 2002). Por otro lado, Los probióticos tienen un efecto

benéfico en los procesos de digestión en animales acuáticos y contribuyen a la

nutrición del hospedero, especialmente por ácidos grasos y vitaminas (Venkat et

al, 2004). También existen antecedentes que demuestran que existe una clara

relación de la cantidad de proteína en el alimento sobre la respuesta inmune del

camarón blanco, ya que existe una reducción en los hemocitos (sistema profenol-

oxidasa) y en su actividad (fagocitosis) en dietas con un menor nivel de proteína

(Kureshy y Davis, 2002), pero hasta ahora no hay información sobre el efecto de

dietas formuladas en base a calidad de proteína y su relación con el sistema

inmune del camarón blanco, la cual es uno de los objetivos del presente trabajo de

tesis. Al tomar en cuenta la alimentación del camarón como factor primordial

durante su cultivo, es indispensable encontrar los medios para obtener un

alimento eficiente, de calidad y que estimule un rápido crecimiento lo que

4

disminuye el costo de producción. Se puede lograr un crecimiento importante en la

acuacultura si se obtienen dietas bien balaceadas de buena calidad y que cubran

los requerimientos nutricionales de la especie cultivada. La eficiencia de un

alimento balanceado depende mucho del valor nutricional de sus ingredientes y

principalmente de las fuentes proteicas que poseen tales como la harina de

pescado, harina de soya, levadura, etc. (Espinoza, 1992).

2. Antecedentes

2.1. Generalidades de la biología de camarones peneidos

Los camarones penaeidea forman parte del antiguo grupo de los Natantia,

en el cual fueron ubicados por, Boas (1880), como los peneidea. Dentro de esta

familia

Figura 1. Vista lateral de la morfología de los camarones peneidos.

se encuentra el camarón blanco Litopenaeus vannamei es un invertebrado marino

que se encuentra agrupado dentro de los artrópodos, subfilo crustáceo y

pertenece a la familia penaeus, clase; malacostraca, orden; decápoda. Se

5

caracteriza por tener un tronco compuesto por 14 segmentos más el telson de los

cuales los ocho primeros forman el tórax y los últimos seis el abdomen; todos los

segmentos portan apéndices, los que se encuentran en el abdomen anterior son

llamados pleópodos y son usados para nadar y los posteriores son llamados

periopódos y son usados para caminar en el fondo. El cuerpo tiende a ser

cilíndrico o comprimido lateralmente, tiene un cefalotórax definido y porta un rostro

aserrado con forma de quilla. Posee un exoesqueleto conformado por quitina que

suele ser delgado y flexible. El cordón nervioso se extiende a lo largo del vientre,

su órgano excretor es la glándula antenal que lanza al medio sustancias de

desechos. El sistema circulatorio es abierto, el corazón se encuentra localizado

dorsalmente en el cefalotórax y compuesto por vasos sanguíneos que transportan

la hemolinfa la cual posee cobre y acarrea oxigeno, por lo que desarrolla un color

azuloso, el oxigeno y el dióxido de carbono es transportado desde y hasta las

branquias de donde se realiza el intercambio gaseoso (Ruppert et al, 1996).

Los camarones se alimentan por medio de filtración en el fondo, presentan una

boca en posición ventral y el aparato digestivo se ensancha a lo largo del dorso

para formar una glándula digestiva grande llamada hepatopáncreas que excreta

enzimas digestivas, esta glándula digestiva se compone de los divertículos del

intestino, los espacios entre estos túbulos hepatopancreaticos son los senos o

lagunas tisulares y su principal función es la absorción de nutrientes,

almacenamiento de lípidos y producción de enzimas digestivas (Johnson, 1980).

6

2.1.1. Ciclo de vida de los camarones

El ciclo de vida del camarón inicia en la plataforma continental, cuando los

adultos se reproducen, los huevos fecundados son liberados al océano y quedan a

merced de las corrientes marinas donde eclosionan como larvas nauplio. Todos

los estadios larvarios son de vida planctónica, por lo que son arrastrados por las

corrientes hacia la zona costera. Durante la fase de postlarva, estas migran hacia

las lagunas estuarinas en busca de zonas de refugio y alimentación, los

camarones permanecen en estas áreas salobres con vegetación sumergida y son

utilizadas como áreas de crecimiento durante 7 a 9 meses, antes de migrar

nuevamente al mar a donde llegan como adultos (Alpuche et al, 2005).

2.2. La camaronicultura

La acuacultura de camarón se ha expandido significativamente a lo largo de

América latina y Asia durante la década de los 80´s (Moss, 2002). Actualmente la

producción acuícola del camarón a nivel global se encuentra alrededor de 1,

568,386 mt (Rosenberry, 2005). Casi el 84% del camarón cultivado proviene de

Asia, destacando como productores principales Tailandia, china, Vietnam e india.

En occidente, ecuador es el mayor productor de camarón.

Dentro de la explotación de los recursos marinos, la captura y comercialización

del camarón es una de las actividades económicas más rentables en varios

países. En el pacifico, mexicano habitan tres especies de peneidos que se

explotan comercialmente: Litopenaeus vannamei, L.stylirostris y farfantepanaeus

californiensis, siendo la más importante L. vannamei, que se cultiva principalmente

en Sinaloa, sonora, Nayarit y Baja California Sur, la cual se caracteriza por preferir

salinidad baja.

7

En forma radical el cultivo de crustáceos, particularmente de camarón ocupa un

lugar importante, debido a la importancia en términos económicos que este

recurso representa para la región del Noroeste del Pacífico Mexicano. El cultivo de

camarón representa el cultivo más tecnificado siendo además un producto con

calidad de exportación (Álvarez y Avilés, 1995). La FAO (2003) menciona que en

los últimos años la producción de camarón se ha expandido debido al incremento

en la población y la demanda por los productos del mar que cada vez es mayor.

En el 2001, el camarón fue la segunda especie más importante en acuacultura,

con un valor estimado de 4.8 billones de dólares (FAO, 2003).

2.2.1. Importancia económica

La camaronicultura es una actividad relevante y de gran importancia económica,

se ha vuelto una actividad de riesgo que requiere de fuertes inversiones y eficiente

administración. En general la actividad está dejando de ser una práctica familiar

con escaso componente técnico y girando rápidamente hacia comportamientos

industriales y empresariales. Actualmente la acuicultura es la actividad

agroindustrial de mayor desarrollo a nivel mundial, con un volumen global superior

a los 60 millones de toneladas y un valor de alrededor de 15 mil millones de

dólares, con lo que contribuye en más de 40 % a la producción de organismos

acuáticos. Dentro de la actividad, la camaronicultura es una de las que ha

mostrado un desarrollo más explosivo tanto a nivel mundial como en nuestro país.

Asia es la región con el mayor desarrollo en el cultivo de la mayoría de las

especies, siendo China, el país líder en esta actividad. Sin embargo, en términos

de crecimiento, algunos países de América Latina, incluyendo México, están ahora

en el escenario mundial. La camaronicultura mexicana creció alrededor de 17 %

en sólo dos años y se espera un crecimiento sostenido en los próximos años

(Martinez-Cordova et al, 2008 ). En México, el camarón fue la especie pesquera

8

que mayor actividad económica generó durante el año 2009, se pescaron y

cultivaron un poco más de 162 mil toneladas de camarones, con un valor

comercial total de 8 mil millones de pesos esta suma representó 46.8% de los

ingresos pesqueros totales en el país (Conapesca, 2009).

2.3. Nutrición general y hábitos alimenticios del camarón

El camarón presenta deferentes hábitos alimenticios durante su ciclo de

vida. En condiciones naturales, los camarones peneidos juveniles son

considerados omnívoros o detritívoros. En estudios de contenido estomacal, que

se han hecho en diferentes especies se han encontrado; pequeños crustáceos,

poliquetos, algas y detritos. (Wikins, 1976).

En general, el crecimiento y sobrevivencia del camarón silvestre depende de

factores como la calidad del agua, alimento natural y un hábitat protector. Existen

evidencias que las preferencias alimenticias cambian con la edad y el estado

fisiológico (Marte, 1980). El objetivo del cultivo es proveerle adecuada calidad de

agua, ambiente y nutrición para un rápido crecimiento o densidades mucho

mayores que las encontradas en ambientes naturales.

La nutrición es una rama de la fisiología que estudia el conjunto de procesos

involucrados en la obtención de energía y nutrimentos para realizar las funciones

vitales del organismo tales como mantenimiento, crecimiento y reproducción, por

lo tanto, involucra la ingestión, la digestión, la absorción y el transporte de

nutrientes, así como la remoción de productos de desecho (Akiyama et al, 1991).

Los nutrimentos principalmente proteínas, glúsidos y lípidos son los intermediarios

entre la alimentación y el metabolismo (Guillaume y Ceccaldi, 1999). Los

camarones peneidos están entre los organismos más importantes y extensamente

9

cultivados en el mundo. En un principio, los requerimientos nutricionales de

camarones peneidos fueron definidos en los años 70s (Kanazawa, 1989 y

Deshimaru et al, 1985). Existen diferencias entre los requerimientos nutricionales

de especies de camarones peneidos sin embargo los requerimientos para

Litopenaeus vannamei siguen siendo estudiados.

La nutrición del camarón es un asunto complejo porque sus requerimientos

cambian a lo largo de sus ciclos de vida, por lo que las fórmulas deben ser

específicas para cada ciclo. Más aún, los alimentos naturales suplementan a los

manufacturados y los granjeros deben manejar los estanques como un

ecosistema, y maximizar los beneficios de los alimentos naturales y

manufacturados.

Las fuentes de nutrientes pueden variar, pero ciertos nutrientes son requeridos por

todos los animales en crecimiento, y son conocidos como nutrientes esenciales o

indispensables. Un nutriente esencial es aquel que no puede ser sintetizado a un

nivel requerido para un normal crecimiento y mantenimiento. La proteína es

requerida para el crecimiento, no hay proteínas esenciales, sino aminoácidos

esenciales (las proteínas están compuestos por aminoácidos). A pesar de que los

carbohidratos (ej. harina de trigo) son fuentes de energía, no son carbohidratos

esenciales, porque pueden ser derivados de varios ingredientes, almacenados y

liberados a través de varios procesos metabólicos; además los lípidos de la dieta

son otra fuente de energía. Finalmente, están los ácidos grasos esenciales

(componentes de lípidos), vitaminas y minerales.

Los nutrientes esenciales pueden ser muy bien diferenciados en términos

cuantitativos. Las proteínas, lípidos y carbohidratos son referidos frecuentemente

como macronutrientes. Su presencia en el alimento comprende una porción

substancial del espacio disponible o peso de la dieta. Los micronutrientes (ej.

minerales y vitaminas) son requeridos, relativamente en poca cantidad por el

camarón. El término "micro", sin embargo, no debe ser interpretado como

implicando que ciertos nutrientes son menos importantes. Algunas vitaminas son

10

requeridas en muy pocas concentraciones para la producción comercial de

alimentos (ej. ácido ascórbico, alrededor de 100 mg/kg. de materia seca), sin

embargo, su inclusión es absolutamente requerida para un adecuado

mantenimiento y crecimiento.

2.3.1. Detección del alimento

Las antenas y anténulas intervienen en la quimio-recepción, búsqueda y

reconocimiento del alimento, a través de quimiorreceptores llamados astetascos

que se encuentran en el flagelo lateral de las anténulas. Los movimientos de las

antenas tienen como función aumentar la exposición de los estetascos a los

químicos propiciando la circulación del agua.

El camarón tiene la capacidad de detectar el alimento a distancia, mediante los

receptores antenales, y una vez que sea dirigido a él, por contacto lo degusta,

utilizando los receptores presentes en periópodos y apéndices bucales, dando

como respuesta la aceptación o el rechazo del alimento (Mendoza et al, 1996).

La capacidad de percibir la presencia y detectar el sabor del alimento,

representa una estrategia energética, que permite minimizar el tiempo de

búsqueda y maximizar la proporción neta de energía o de ingredientes ingeridos,

estrategia que puede ser utilizada eficazmente tanto en el diseño de los alimentos

balanceados como en la forma de distribución.

El uso de sustancias atractantes permite que los alimentos sean localizados y

consumidos más rápido por los animales. Estos compuestos son generalmente

extraídos de organismos marinos, también moléculas orgánicas como

aminoácidos libres o bases nitrogenadas. Extractos solubles de diferentes

organismos marinos: calamar, krill, pescado incluyendo aceite de pescado y de

calamar. La manera de aplicar estos atractantes en los alimentos balanceados

11

puede ser mezclado como aditivo con los demás ingredientes de la fórmula, o por

aspersión sobre los pellets terminados (Cruz-Suarez, 1996).

2.3.2. Fuentes de proteínas para camarón

Las proteínas se clasifican de acuerdo a su origen: animal, vegetal y

microbiana. Las proteínas más utilizadas comercialmente en la preparación de

alimentos para camarón se presentan como harinas y principalmente son de

origen animal marino.

Tacón, (1989) resume experiencias en juveniles de peces y camarones

alimentados con raciones en las que una porción significativa de la proteína

dietética es suministrada en forma de aminoácidos “libres” dando como resultado

un crecimiento subóptimo y una eficiencia de conversión alimenticia baja,

comparada con animales alimentados con proteína entera o con proteínas en las

que los aminoácidos son elementos constitutivos de estas. Sin embargo también

menciona que en general, los aminoácidos incorporados a la dieta en forma libre,

son asimilados más rápidamente por los peces, en comparación con los

aminoácidos que integran la proteína.

Una buena fuente de proteínas son los vegetales que son usadas en menor grado

en las dietas para camarón porque son menos atractantes, su composición en

aminoácidos es menos balanceada y muchas contienen productos tóxicos como el

factor anti trípsico de la soya, el algodón etc.; aflatoxinas u otros hongos muy

tóxicos. En la práctica solo las mejores proteínas vegetales son utilizadas; como la

harina de pasta de soya. También están las proteínas de origen microbiológico

como las levaduras desprovistas de factores antinutricionales y las bacterias

fermentadoras de alcoholes. Substituciones de hasta un 30% se han revelado

12

eficaces, mientras que porcentajes mayores requieren suplementación con

aminoácidos libres.

La elaboración de alimentos de alta calidad es una necesidad vital para el

desarrollo de la industria acuícola (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de estos

alimentos está determinada por el tipo, calidad y composición de ingredientes que

se utilicen, la formulación de la dieta y los métodos de procesamiento empleados

en su elaboración, ya que pueden influir en la palatabilidad y disponibilidad de

nutrientes (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de proteína se resume

esencialmente en dos características: coeficiente de utilización digestiva y valor

biológico (equilibrio de aminoácidos esenciales y principalmente del valor relativo

del aminoácido esencial menos abundante con respecto a los requerimientos:

aminoácido limitante).

Las harinas de pescado son un ingrediente comúnmente utilizado en las dietas de

animales domésticos, ya que son una fuente rica en proteína cruda y lípidos, las

harinas de pescado pueden ser elaboradas de diferentes especies de pescados,

incluso existen harinas de pescado que son elaboradas con subproductos de

pescado (desechos del fileteo, vísceras, etc.) estos factores afectan variando el

contenido y digestibilidad de los nutrientes (mayor o menos contenido de huesos

“contenido de cenizas” y aceite) en el producto final (Miles y Chapman, 2006).

Adicionalmente el proceso de elaboración de las harinas afecta la digestibilidad de

la proteína (Opstvedt et al, 2003).

La soya tiene el mejor perfil proteico nutricional de todas las plantas. A partir del

fríjol de soya se pueden obtener varios productos de soya como lo son: La harina

o pasta de soya, la cual se obtiene como un subproducto durante el proceso de

extracción del aceite del fríjol de soya, las hojuelas de soya delipidadas son

sometidas a un proceso de calentamiento y posteriormente convertidas en harina

(el contenido de fibra y proteína de este ingrediente es de alrededor de 7 y 44%

respectivamente, aunque, el nivel de proteína de este ingrediente se puede

13

incrementar hasta un 48% eliminando la cascarilla de soya antes de la extracción

del aceite). La soya integral se obtiene a partir del grano de soya descascarillado

(extrusión, tostado o micronizado) lográndose un producto rico en proteína y

lípidos. Este ingrediente se caracteriza por contener un alto contenido de lípidos y

fibra. Mediante la eliminación de los carbohidratos presentes en la harina de soya

se pueden elaborar otros productos con un nivel mayor de proteína tal como el

concentrado de soya. El aislado de proteína se obtiene por extracción de la

proteína a partir de las hojuelas delipidadas (Peisker, 2001).

Los productos de trigo son utilizados como fuente de energía, su proteína es

altamente digestible en especies acuícolas y adicionalmente son utilizados como

aglutinantes naturales que mejoran la estabilidad de los alimentos en el agua

(Gatlin III et al, 2007; Hertrampf, 2007). Cerca del 90 al 95% del trigo producido en

el mundo es trigo común

2.3.3. Proteínas y aminoácidos.

Las proteínas, carbohidratos y lípidos son los principales nutrimentos y son

los intermediarios entre la alimentación y el metabolismo. La cantidad y calidad de

la proteína en la dieta son los principales factores que influyen sobre el

crecimiento de los camarones (Gutiérrez, 2002). Se ha demostrado que las

proteínas son el principal componente de los ecosistemas bentónicos donde

habitan los camarones penaeidos (Rosa et al, 2000) y el componente más

importante en una dieta para acuacultura, debido al costo y el requisito nutricional

de los organismos (García et al, 1996).

Las proteínas son los componentes más importantes del cuerpo de los animales,

representan aproximadamente el 70 % del peso seco del camarón. La proteína es

14

usualmente el nutriente más costoso y el rango de contenido proteico (referido

como proteína cruda) en los alimentos va desde 18% hasta 45%.

Los elevados requerimientos proteicos en las dietas de los camarones se

atribuyen a sus hábitos alimenticios carnívoros/omnívoros y al uso preferencial de

la proteína dietética sobre los carbohidratos como fuente de energía.

Las proteínas son compuestos orgánicos nitrogenados complejos, constituidos

por aminoácidos (Schneider, 1985). Las proteínas son nutrientes indispensables

para la estructura y funcionamiento de los camarones y son utilizadas

continuamente para el crecimiento basal y reparación de los tejidos. El

requerimiento proteico, varía en función de la edad del organismo (Guillaume,

1999).

Los aminoácidos se dividen en esenciales y no esenciales. Los esenciales son

aquellos que el organismo no puede sintetizar o al menos no en cantidades

suficientes. Se ha sugerido que la composición de aminoácidos de los alimentos

debería ser muy similar al de los animales a alimentar (Mente et al, 2002). Tacón

(2002) menciona que en las dietas se recomienda que incluyan a los diez

aminoácidos considerados como esenciales para los crustáceos: treonina, valina,

metionina, isoleusina, leucina, fenilalanina, lisina, triptófano, histidina y arginina.

Varios autores reportan distintos niveles óptimos de proteína en dietas, pero en

general los valores están alrededor del 35%(Tacon 1989; Kureshy y Allen 2000).

Aunque muchos alimentos comerciales para camarón usados en México rondan el

35% y hay algunos que llegan a contener hasta 40% de proteína cruda (Cruz et al,

2002).

En el caso de los crustáceos y especialmente en los estadios larvarios y de

juveniles, es ampliamente reconocido que los aminoácidos esenciales (AAE)

deben ser aportados por el alimento para mejorar el crecimiento y sobrevivencia

de los organismos en cultivo (Gutiérrez, 2002). En general, entre mas se aproxime

15

el patrón de AAE de la proteína a los requerimientos dietéticos de AAE de la

especie en cuestión, mayor será su valor nutricional y utilización (Tacón, 1989).

2.3.4. Carbohidratos

Los carbohidratos son compuestos químicos que contienen carbono hidrógeno y

oxígeno dispuestos en determinada manera (Schneider, 1985). Los carbohidratos

pueden usarse como fuente de energía como reserva de glucógeno en la síntesis

de quitina, ácidos nucléicos y en la formación de esteroides y de ácidos grasos

(Cruz Suarez et al, 1994). Pueden ser utilizados como una fuente de energía con

mezclas de proteínas y lípidos. Los azúcares complejos y polisacáridos pueden

ser usados mas efectivamente que los azúcares simples (Deshimura et al, 1985).

Los almidones son frecuentemente usados como una fuente excelente de

carbohidratos y para ligar los ingredientes de las formulaciones.

2.3.5. Lípidos

Los lípidos se agrupan en grasas, esteroides y fosfolípidos y son una combinación

especial de carbono, hidrógeno y oxígeno (Schneider, 1985). Con respecto a la

nutrición lipídica, son los principales vehículos de las vitaminas liposolubles y

proveen otros compuestos como esteroles y fosfolípidos. Los requerimientos

cuantitativos de lípidos varían según las especies, en general se recomiendan

valores entre 6 y 7.5% (Akiyama, 1991; Tacón, 1987), recomiendan un mínimo de

10% de lípidos y una relación 5:1 de lípidos de origen marino y vegetal. La

provisión de suficientes lípidos está basada en la satisfacción de los

requerimientos de ácidos grasos altamente insaturados (HUFA). Los fosfolípidos

(FL) son requeridos por el camarón para un adecuado crecimiento y

sobrevivencia. Las lecitinas de soya han sido ampliamente utilizadas para la

suplementación dietaria de poslarvas de camarón debido a su importancia

16

comercial y a los componentes activos principalmente (FL). Basados en recientes

estudios, se recomiendan niveles de 1.25 a 6.5% dependiendo de las especies de

camarón, estadio de desarrollo y la pureza de la lecitina (Cotteau et al, 1997).

2.3.6. Minerales y vitaminas

Con frecuencia, el fósforo y calcio son los minerales más limitantes en la

formulación de alimentos comerciales para la producción de camarones. El fósforo

es único ya que se encuentra únicamente como un sólido y no se solubiliza en

agua. Puede encontrarse en muchas plantas verdes o granos en forma indigerible

conocido como fitato o ácido fítico.

Por esta razón, al analizar su digestibilidad, solo un tercio a un cuarto del fósforo

en alimentos a base de soja es considerado disponible para el camarón. Para

proveer una adecuada dieta en fósforo, se debe incluir en una forma purificada

(ej., fósforo monobásico, dibásico, tribásico). Estas formas purificadas también

tienen digestibilidad variable. El contenido de fósforo total de alimentos para

camarón usualmente es de 1.5-2.5% (como base alimenticia), pero solo alrededor

de 50% de ello está disponible para el crecimiento del camarón. Los paquetes

vitamínicos (con suplementos minerales) son componentes necesarios de los

alimentos comerciales para camarón solo cuando la productividad natural del

estanque no es adecuada (muy altas densidades de siembra). Muchos alimentos

para camarón son frecuentemente suplementados con paquetes de premix de

vitaminas o precursores de vitaminas. Estos son generalmente incluidos de una

forma preventiva contra infecciones de virus y bacterias patógenas.

17

2.4. Sistema de defensa

Los invertebrados a lo largo del tiempo han desarrollado un sistema inmune o de

defensa para protegerse de agentes extraños y mantener su integridad biológica.

El sistema inmune de los invertebrados se caracteriza por la ausencia de

moléculas del tipo de inmunoglobulinas y células linfoides, estos organismos no

poseen un sistema inmunológico específico y son considerados organismos de

poca memoria inmunológica. Tienen mecanismos de defensa innata que está

basado en componentes celulares y humorales que cooperan entre ellos, lo que

esta interrelacionado con la detección y eliminación de patógenos extraños. En la

mayoría de los invertebrados los componentes humorales están representados

por péptidos antimicrobianos, especies reactivas de oxigeno y de nitrógeno,

enzimas que regulan los procesos inmunes y moléculas asociadas al

reconocimiento de agentes extraños. El componente celular está formado por

hemocitos, que son las células sanguíneas. El hemocele de los crustáceos tiene

circulación abierta y las células sanguíneas que se encuentran en este sistema

denominadas hemocitos son análogas a los glóbulos blancos de los vertebrados.

(Vargas, 2002, Maldonado et al, 2003, Zarain-Herzberg y Pacheco- Marges,

2007).

La hemolinfa, es el tejido de transporte y uno de los principales tejidos de reserva

de nutrientes. Ahí se encuentran las moléculas nutricionales que son

transportadas a los distintos tejidos internos por lo que pueden ser utilizadas como

indicadoras del estado nutricional (Pascual, et al. 2003).

18

2.4.1. Mecanismos de defensa

Las reacciones de respuesta celular son llevadas a cabo directamente por los

hemocitos. Esta células sanguíneas se cree pueden ser análogas a los leucocitos

de vertebrados y están clasificados en tres tipos dependiendo de la presencia y

tamaño de gránulos citoplasmáticos: hialinos, semi-granulares y granulares

(Holmblad y Söderhäll, 1999). Aunque la proporción y la función de los hemocitos

puede variar de una especie a otra, en general se considera que los hemocitos

granulares y semi-granulares son capaces de producir melanina por medio del

sistema pro-fenoloxidasa (Johansson y Söderhäll, 1988), en cambio los hemocitos

hialinos y en menor proporción los semi-granulares son responsables de realizar el

proceso de fagocitosis (Giulianini et al, 2007).

La fagocitosis es la más común de las reacciones de defensa celular, proceso

durante el cual células fagocíticas reconocen y se unen a partículas extrañas

como bacterias, esporas, virus o células envejecidas del propio organismo y

posteriormente son internalizadas en una vacuola llamada fagosoma donde son

destruidas (Vázquez et al, 1998; Kim, 2006). La formación de nódulos y la

encapsulación son respuestas multicelulares para eliminar las partículas extrañas,

que por su tamaño, no pueden ser fagocitadas por células individualmente

(Vázquez et al., 1998). Cuando la invasión se produce por una excesiva cantidad

de microorganismos, que no pueden ser fagocitados, los hemocitos proceden a

formar nódulos o bien encapsularlos (Bayne, 1990).

El sistema profenoloxidasa, se encuentra asociado con varios procesos

fisiológicos tales como la esclerosis, la pigmentación de cutícula y la cicatrización

de las heridas. Se encuentra ubicado dentro de vesículas en los hemocitos

granulares y semigranulares. El componente principal del sistema es la enzima

profenoloxidasa que en su forma activa oxida fenoles a quinonas y

19

espontáneamente se forma melanina. En la formación de esta última los

intermediarios previenen el crecimiento de microorganismos inhibiendo las

proteinasas y las quitinasas de patógeno. Existen otros factores de respuesta

como la producción de enzimas líticas, proteasas y péptidos antimicrobianos

(Ceniacua, 1997)

2.5. Microorganismos benéficos; probióticos

Durante los últimos años, algunos organismos unicelulares han llamado la

atención de los investigadores en cuanto a la posibilidad de usarlos en la

alimentación de especies acuícolas cultivadas. Diversos tipos de levaduras,

distintas algas unicelulares y algunas bacterias han sido los protagonistas

principales de una serie de estudios encaminados a comprobar su papel nutritivo

y la posibilidad de incluirlos en las dietas de organismos marinos.

El concepto de ingerir microorganismos vivos con el propósito de manipular la

microflora y mejorar la salud intestinal y el bienestar general de un organismo,

tiene sus primeras raíces a inicios del siglo XX. La palabra probiótico fue acuñada

por Parker, derivada de dos vocablos griego que significa para la vida, de acuerdo

con esta definición son microorganismos o sustancias provenientes de

microorganismos que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal. Esta definición

incluye cultivos, células y metabolitos microbianos. El uso de probioticos y el

efecto de manipular la micro flora intestinal fue inicialmente observado por

Mechnikoff (1907), quien reportó los efectos benéficos de las bacterias

productoras de acido láctico en la prevención y tratamiento de enfermedades

intestinales.

20

Esta práctica actualmente se encuentra sujeta a mucha investigación con la

finalidad de obtener bacterias efectivas contra microorganismos patógenos, así

como para establecer los beneficios generales en el huésped. La mayoría de

productos que se han propuesto para uso en la acuicultura son los probióticos,

entre ellos existen diferentes grupos como las bacterias ácidos lácticas y géneros

como Vibrio, Bacillus y Pseudomonas, principalmente (Austin et al.1995; Garriques

y Arévalo, 1995; Ringo y Gatesoupe, 1998; Verschuerer et al, 2000; Sullivan,

2001).

Se considera probiótico aquel que contiene bacterias vivas que permanecen

activas en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos al ser ingeridos

en cantidades suficientes, tienen efecto muy beneficioso, como contribuir al

equilibrio de la flora intestinal y potenciar el sistema inmunológico (Seh-lelha,

2008), dando como resultado un rápido crecimiento y mejor salud del animal.

La interacción entre la cepa probiotica y la microflora intestinal puede basarse en

la competición con bacterias patógenas por sitios de adhesión a los receptores

epiteliales, por nutrientes y a la producción de sustancias especificas como son

las bacteriocinas (Rodriguez y Le Moullac, 2000; Rengpipat et al, 2000; Simon,

2005; Vazquez et al, 2005).

2.5.1. Uso de probióticos en acuacultura

Gatesoupe, (1991) Presenta a los probióticos como una alternativa para eliminar

los riesgos de proliferación de vibrios oportunistas y mejorar la tasa de

sobrevivencia y de crecimiento de las larvas de peces.

Los probioticos son una alternativa prometedora al uso de antibióticos, reduciendo

las posibilidades de colonización y desarrollo de potenciales bacterias patógenas;

21

bajo el principio de exclusión competitiva y la estimulación del sistema inmune

(Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999).

Los beneficios que han sido observados son: mejora la tasa de producción de

rotíferos y evita la proliferación de vibrios dominantes, lo que permite el desarrollo

de una flora más diversa. Los probióticos usados mejoran el peso de los peces y

las esporas de bacilo mejoran la tasa de sobrevivencia de las larvas de peces, en

caso de infección experimental o accidental con vibrios oportunistas, todos estos

efectos pueden ser debido a sustancias antibióticas provenientes de los

probióticos.

La compañía Diamond V de E.U.A recomienda el uso de la levadura en alimentos

para trucha, bagre, anguila y camarón, en un nivel de 0.5 y 1% en la dieta, ya que

provee de metabolitos y otros factores. Al someter su levadura y el de otras

compañías al proceso de peletizado, ello indican que aun las encapsuladas o

protegidas, mueren a causa del peletizado o presentan una desactivación del 86 al

99.9%, sin embargo los metabolitos no sufren variaciones y son estos, los que

mejoran el crecimiento de los animales.

Moriarty (1999), señala que con el uso de probióticos en acuicultura; la salud de

los animales mejora por la remoción o disminución de la densidad de población de

patógenos, mejorando la calidad del agua a través de una degradación más rápida

de la materia orgánica. Por otra parte en el caso de ciertas cepas (Bacillus sp. V.

alginolyticus) ha permitido tener en los animales un índice inmunitario mayor

respecto al tratamiento control (Gullian, et al. 2003).

22

2.5.2. Beneficios de los probióticos

Estos microorganismos pueden ser añadidos al agua o al alimento, en el manejo

del sistema de cultivo para el control de enfermedades.

El efecto benéfico de los probióticos se atribuye en general a tres mecanismos

diferentes (Wang et al, 2000, Verschuere et al, 2000), que a su vez pueden

deberse a varias causas:

Mejoramiento de la calidad del agua; Ya sea por metabolización de la materia

orgánica o por interacción con algunas algas.

Exclusión competitiva de bacterias nocivas; Competencia por nutrientes, por

sitios de fijación en el intestino o fuentes de energía disponible. Aumento de la

respuesta inmunológica del hospedero.

Aportes benéficos al proceso digestivo del hospedero; Aporte de macro y

micronutrientes para el hospedero o aporte de enzimas digestivas y por ende se

incrementa la tasa de crecimiento. Producción de componentes inhibidores como

antibióticos, bacteriocinas y quelantes que disminuyen el crecimiento del

patógeno.

El uso de mezclas probióticas son más efectivas que las cepas independientes en

el control de patógenos, y en el mejor establecimiento de poblaciones probióticas,

observándose procesos sinérgicos entre cepas que han potenciado los resultados

deseados (Douillet, 2000).

2.5.3. Efectos beneficiosos del uso de los Bacillus como probióticos.

Las bacterias del género Bacillus microbiológicamente son consideradas como

Gram positivas en forma de bastoncillo, agrupadas en cadenas, motiles y

flagelación perítrica, formadoras de endosporas, anaerobias estrictas o

23

facultativas, no son adherentes, y son productoras de sustancias antimicrobianas y

enzimas hidrolasas.

Entre las especies de mayor importancia como probióticos pertenecientes a este

género están Bacillus cereus, B. licheniformis, B. subtilis y B. natto (Jawets, 1996).

Anon (1998), da a conocer que la producción de endosporas es una característica

típica de todas las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium. Estas son

pequeñas estructuras ovoides o esféricas, en las que pueden transformarse estas

bacterias y constituyen formas celulares muy resistentes al calor y al medio

adverso. Otros de los elementos que caracteriza a los Bacillus sp. Es la

producción de enzimas hidrolíticas que ayudan a mejorar la utilización de los

alimentos. Dentro de estas se encuentran las proteasas, amilasas y las

glicosidasas que descomponen las complejas moléculas de los alimentos y las

transforman en nutrientes más simples. Estos compuestos son absorbidos más

rápidamente por el animal o pueden ser empleados por otras bacterias

beneficiosas para el establecimiento de una microflora intestinal balanceada. El

empleo de las bacterias del género Bacillus y sus endosporas también viene dado

por su capacidad de producción de enzimas, estas además de mejorar la digestión

en el hospedero, son capaces de inhibir el crecimiento microbiano de bacterias

dañinas. Las endosporas por su parte, estimulan el sistema inmune contribuyendo

a la resistencia contra el desafío de patógenos ambientales (Lopez-Villagomez y

Cruz-Benavides, 2011).

El empleo de endosporas de bacillus sp. Puede contribuir a una disminución de la

acidez del intestino, favoreciendo el crecimiento de Lactobacillus en el tracto

gastrointestinal, estimulando el sistema inmune, contribuyendo a la resistencia

contra el desafío de patógenos ambientales, inhibiendo y controlando el

crecimiento microbiano de bacterias dañinas y favoreciendo al proceso digestivo.

24

2.5.4. Uso de levaduras en acuacultura

Al tomar en cuenta la alimentación del camarón como factor primordial durante su

cultivo, es indispensable encontrar los medios para obtener un alimento eficiente,

de calidad y que estimule un rápido crecimiento lo que disminuye los costos de

producción. La eficiencia de un alimento balanceado depende mucho del valor

nutricional de sus ingredientes y principalmente de las fuentes proteicas que

poseen tales como , harina de pescado, camarón, pasta de soya, levadura,

etc.(Espinoza, 1992).

Quiñonez (2008), indica que los hongos unicelulares, usualmente de forma

ovalada, con estados vegetativos que se reproducen predominantemente por

gemación o fisión, dando por resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas

pueden ser dimórficas o bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones

ambientales apropiadas. Este grupo de microorganismos está incluido

taxonómicamente en la división Eumycota y dadas sus características de

reproducción sexual, se pueden ubicar en tres subdivisiones: Ascomycota, que

comprende a levaduras que pueden formar esporas contenidas dentro de un asca;

Basidiomycota, en donde los representantes forman esporas externas localizadas

sobre basidios o esterigmas y Deuteromycota en donde se incluyen todas aquellas

levaduras para las que no ha sido posible demostrar que presentan una fase

sexual en su ciclo de vida. Las levaduras registran una amplia distribución en un

variado tipo de hábitats terrestres. Sin embargo, es poco lo que se sabe de las

levaduras de ecosistemas acuáticos, particularmente del marino. También hay

algunas levaduras que son capaces de distribuirse en ambientes salinos no

marinos y son altamente halofílicas o halotolerantes (Ochoa y Vásquez-Juárez,

2004).

En los últimos años el uso de levaduras dentro de la acuacultura ha venido

creciendo, han llamado mucha la atención, en cuanto a la posibilidad de usarlos

25

en la alimentación de especies acuícolas cultivadas. Diversos tipos de levaduras

(Candida lipolytica, torula, S. cerevisiae y Tetraselmis sp.). La elección de estos

microorganismos se debe a diversas ventajas, entre las cuales destaca las

siguientes: el contenido proteico suele ser muy elevado (entre el 40 y 70% de

proteína de la materia seca); su alta velocidad de reproducción, junto con el hecho

de que hacen que se pueda cultivar de forma continua, en pequeños espacios y

con relativa independencia de clima; Fuente de nutrientes: aminoácidos,

vitaminas, oligoelementos; optimización en el proceso de absorción de minerales,

especialmente de zinc, potasio y cobre; propiedades absorbentes, la que los

convierte en fuente de nutrientes y además actúan como amortiguador de pH

(Aguirre-Guzmán, 1994).

26

3. JUSTIFICACIÓN

Es importante considerar que para optimizar el cultivo sustentable es imperativo

cuidar la calidad del agua, ya que su degradación provoca que los animales sean

más propensos al estrés, enfermedades y a presentar una menor tasa de

crecimiento, en gran medida el éxito del cultivo del camarón depende de la calidad

del alimento y de su adecuado manejo. Los alimentos constituyen un factor

decisivo para el éxito de esta actividad y representan generalmente el gasto mayor

en los sistemas de cultivo, del 50 -70% del costo total de producción en cualquier

cultivo de organismos acuáticos, es por ello que la alimentación y nutrición se ha

convertido en una de las áreas de investigación-desarrollo de mayor interés para

la camaronicultura (Tacón, 1995).

La calidad del alimento es importante en el cultivo de especies de interés

comercial, el contenido de proteína influye en el crecimiento y respuesta inmune,

lo cual representa un factor importante en la salud del camarón. Al cubrir el

requerimiento nutricional del camarón en unidades de proteína digerible en

sustitución del contenido de proteína total, se da un paso importante en la

formulación, definiendo con mayor precisión el nivel de calidad del alimento y

permitiendo ofrecer la cantidad de proteína utilizada. Una dieta balanceada, con

un adecuado contenido de nutrientes, es determinante para obtener una buena

tasa de supervivencia y de crecimiento, así como para lograr tasas de conversión

óptimas. En gran medida los resultados de las investigaciones van a depender,

entre otros factores, de la metodología empleada para su determinación, el

empleo de diferentes fuentes de nutrientes, regímenes de alimentación y

condiciones de cultivo, lo que dificulta la comparación de los mismos, no sólo entre

especies, sino también dentro de la misma especie. Además, esta situación se

debe a que como rasgo general, los camarones son animales

carnívoros/omnívoros, que en su dieta natural incluyen una amplia variedad de

27

alimentos, tales como fito y zooplancton, vegetales y animales de mayor tamaño,

así como detritus de diversos orígenes. Se suma a esta característica, la variación

no sólo a nivel de especie, sino también en cada fase del ciclo de vida de estos

organismos, que depende de las condiciones en que cada una de éstas se

desarrolla. Es por ello, que no se puede hablar de una composición óptima de

pienso en general para peneidos. Uno de los aspectos básicos para establecer el

alimento más adecuado que promueva los máximos crecimientos al menor costo,

lo constituye el conocimiento de los requerimientos nutricionales de la especie

objeto de cultivo.

La camaronicultura se enfrenta a un constante reto contra las mortalidades

causadas principalmente por microorganismos de origen viral y bacteriano en los

estanques de cultivo. Se han venido buscando alternativas al uso de antibióticos,

una de ellas es la utilización de microorganismos benéficos utilizados como

aditivos incluidos en el alimento, los cuales tienen la capacidad de modular la

microbiota intestinal, activar el sistema inmune del hospedero, o mejorar su

digestión. Es importante, antes de su aplicación en el campo de cualquier

nutriente y/o aditivo, realizar estudios controlados en el laboratorio a fin de

establecer las dosis y frecuencia de aplicación adecuadas. Con el presente

estudio de investigación se pretende evaluar el efecto de tres niveles de proteína

y microorganismos benéficos sobre el crecimiento y conteo total de hemocitos,

para obtener así organismos mejor nutridos y que ofrezcan mayor resistencia ante

cualquier episodio potencial de infección, activando previamente el sistema

inmune mediante el incremento del número de hemocitos circulantes.

28

4. OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar dietas con distintos niveles de proteína y probióticos sobre el crecimiento

e incremento de hemocitos en juveniles de camarón blanco L. vannamei.

Objetivos particulares

Determinar crecimiento de juveniles de camarón blanco alimentados con

tres niveles de proteína. Seleccionar un nivel de proteína.

Determinar crecimiento en juveniles de camarón blanco alimentados con un

nivel de proteína y con mezclas probióticas.

Determinar conteo total de hemocitos en juveniles previamente

alimentados distintos niveles de proteína y con mezclas probióticas.

29

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizaron dos bioensayos de crecimiento en el laboratorio de Nutrición

Experimental, del centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.

(CIBNOR) para evaluar alimentos con tres niveles de proteína cruda (29, 32 y

35%) como primer bioensayo y un nivel de proteína seleccionado (29%) con y sin

probiótico en el alimento para camarones de Litopenaeus vannamei (segundo

bioensayo).

5.1. Bioensayo I

5.1.1. Determinación del efecto de tres niveles de inclusión de proteína

cruda en el alimento sobre el crecimiento y utilización del alimento en

juveniles de camarón L. vannamei

5.1.2. Organismos

Se utilizaron juveniles de camarón blanco del pacifico L. vannamei obtenidos

de los estanques de cultivo del CIBNOR. Los organismos fueron aclimatados al

manejo y condiciones de cautiverio en el Laboratorio de Nutrición Experimental del

CIBNOR durante 20 días antes de iniciar el experimento, en tanques de fibra de

vidrio con capacidad de 1,500 litros a una temperatura de 29°C y con una

salinidad de 40‰. Los organismos fueron alimentados dos veces al día (10:00am

y 16:00pm) con un alimento comercial PIASAMR para camarón con 35% de

proteína en base húmeda.

30

5.2. Preparación de los alimentos experimentales

5.2.1. Ingredientes

Para la fabricación de los alimentos experimentales se utilizaron los siguientes

ingredientes: pasta de soya, harina de pescado, butirato de hidróxido tolueno

(BHT), carboximetil celulosa (CMC), DL-metionina, Lisina-HCl y L-treonina, fueron

donados por el Laboratorio y Almacén de Alimentos Balanceados de la Posta

Zootécnica de la Universidad Autónoma de Baja California Sur. La harina de trigo

fue adquirida de una casa comercial (Mercado Bravo, La Paz, B.C.S.), el aceite de

pescado, alginato de sodio, lecitina, pre mezcla de vitaminas, pre mezcla de

minerales, fosfato dibásico de sodio, cloruro de colina y vitamina C, fueron

adquiridos en la planta de alimentos balanceados para camarón PIASA S.A. de C.

V. ubicada en el Parque Industrial en La Paz, B.C.S.

Los ingredientes utilizados fueron pulverizados y tamizados usando para ello

un pulverizador (Molinos pulvex, D.F. México) y un tamiz de 250µm,

respectivamente. Se almacenaron en bolsas de plásticos selladas y depositadas

en cubetas herméticas bajo condiciones de refrigeración (4°C) hasta el momento

de la toma de muestras para los análisis químicos respectivos o para la

fabricación de los alimentos experimentales.

5.2.2. Formulación de los alimentos

Los alimentos para camarones fueron formulados con la ayuda del programa

NutrionMR (Guadalajara, Jalisco, México). En la formulación de los alimentos

experimentales se empleó la base de datos generada con los resultados del

análisis químico proximal de los ingredientes (Tabla III).

31

Los tres niveles de proteína usados en el primer bioensayo se planearon

tomando en consideración las demandas de proteína cruda recomendadas

previamente para camarones peneidos (Akiyama y Dominy, 1990). Los niveles de

metionina, lisina y treonina cristalinas fueron calculados de acuerdo al

requerimiento estimado por (Tacón et al. 2002), con el objeto de conseguir

alimentos que cubrieran con los requerimientos para un buen crecimiento y

desarrollo de los camarones.

5.2.3. Fabricación de alimentos

Se elaboraron alimentos para juveniles de camarón blanco con tres niveles de

proteína, consistió en elaborar alimento con 29%, 32%, 35% de proteína cruda

(PC) suplementados con aminoácidos cristalinos (metionina, lisina y treonina),

más un control en el que se utilizó alimento de la casa comercial PIASA S.A. de

C.V.

Los alimentos se elaboraron en la Planta de Alimentos del CIBNOR basándose en

el método reportado por Civera y Guillaume, (1989).

Para la preparación primero se mezclaron el 50% de la harina de trigo, harina de

pescado y pasta de soya, las cuales fueron premezcladas por 15 minutos,

posteriormente se agregaron los ingredientes secos menores en donde se

incluyeron a la pre mezcla de vitaminas, fosfato dibásico de sodio, pre mezcla de

minerales, cloruro de colina, vitamina C y el antioxidante Butil-hidroxi-tolueno

(BHT), los cuales fueron premezclados manualmente con una cuchara metálica en

un recipiente de vidrio antes de ser agregados a la mezcladora. Para la mezcla

se empleó una mezcladora vertical (kitchen AidMR, St. Joseph, MI, EUA), con un

tiempo de 15 minutos en el mezclado.

32

Posteriormente se hizo una emulsión con el aceite de pescado y la lecitina de

soya; misma que fue incorporada a la mezcla de ingredientes secos y mezclado

durante 10 minutos. Una vez homogenizados los ingredientes, se agregó el cloruro

de colina disuelto en agua a 40°C, en un 35% del peso de la mezcla seca total de

cada alimento, y se mezclaron durante 8 minutos adicionales. La masa húmeda

resultante con textura similar a plastilina fue extruida en un molino de carne (Tor-

ReyMR Monterrey, N.L. México) en dos ocasiones para obtener pellets de 2 mm de

diámetro, los cuales fueron cortados manualmente y secados en una estufa con

flujo de aire a una temperatura de 37°C hasta que los pellets alcanzaron una

humedad aproximada del 10%, Por último, los alimentos fueron embolsados,

etiquetados y almacenados bajo refrigeración 4°C hasta su uso.

33

5.2.4. Alimentos experimentales

Se evaluaron tres alimentos experimentales (Tabla I) con distinto nivel de

proteína (29%, 32% y 35%). Se utilizó como control alimento comercial (PIASA).

Tabla I. Composición de los alimentos utilizados durante el primer bioensayo de

crecimiento, en juveniles de camarón blanco L. vannamei.

Ingrediente Nivel de proteína cruda (%)

29.0 32.0 35.0

Harina de pescado 24.0 28 33.3

Harina integral de trigo 33.2 25.2 20

Pasta de soya 26.0 30 30

Aceite de sardina 4.0 4 4

Alginato de sodio 2.0 2.0 2.0

Lecitina de soya 2.0 2.0 2.0

Premezcla de vitaminas1 1.8 1.8 1.8

Fosfato dibásico de sodio 1.2 1.2 1.2

Premezcla de minerales2 0.5 0.5 0.5

Cloruro de colina (62% agente activo) 0.2 0.2 0.2

Vitamina C (35% agente activo)1 0.09 0.09 0.09

Butil-hidroxi-tolueno (BHT) 0.004 0.004 0.004

carboximetil celulosa (CMC) 4.9 4.9 4.9

DL-metionina 0.015 0.008 ------

Lisina-HCl 0.014 ----- ------

L-treonina 0.054 0.045 0.033

Total 100.0 100.0 100.0

1VITCRU0409: Acetato de vitamina A, 15000 IU: D3, 7500 IU; E, 400mg; K3, 20 mg; Tiamina

monohidrató, 150 mg; riboflavina, 100 mg; piridoxina HCl, 50 mg; ácido pantoténico, 100 mg;

34

niacina, 300 mg; biotina, 1 mg; inositol, 500 mg; ácido fólico, 20 mg; cianocobalamina, 0.1 mg. 2MINCRU0409 (g/kg alimento): MgSO4 7H2O, 0.5; ZnSO4 7H2O, 0.09; KCl, 0.5; MnCl2 4H2O,

0.0234; CuCl2 2H2O, 0.005; Kl, 0.5; CoCl2 6H2O, 0.0025.

5.2.5. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimentos

Se analizaron por triplicado los ingredientes y los alimentos experimentales. El

análisis químico proximal fue determinado de acuerdo a la metodología

recomendada por el A.O.A.C (2005). La humedad se determinó por secado en

estufa a 70°C durante 24 h. La cuantificación de cenizas (c) o minerales (método

N° 942.05), se desarrolló por incineración de las muestras en una mufla

(Thermolyne modelo F6000, Dubuque, IA, EUA) a 550 °C durante 6 h.

Para la determinación de proteína cruda se utilizó la metodología (N° 2001.11) se

realizó de manera indirecta cuantificando la concentración de nitrógeno en las

muestras en un digestor (kjeltec modelo 2040, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y

en un destilador automático (Kjeltec modelo 2300, Foss Tecator, Höganäs, Suiza)

con la técnica micro Kjeldahl. La cuantificación de extracto etéreo (EE) (método

N° 2003.05), se hizo usando un sistema de auto extracción (Soxtec Avanti

modelo 2050, Foss Tecator, Höganäs, Suiza), usando como solvente extractor el

éter de petróleo. Para determinar la fibra cruda (método N° 978.10), se usó una

hidrólisis ácido-básica con ácido sulfúrico e hidróxido de sodio en un digestor

(Fibertec modelo M6, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) equipado con una unidad de

extracción caliente (modelo 1020, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y una unidad de

extracción fría (modelo 1021, Foss Tecator, Höganäs, Suiza).

Se calculó el extracto libre de nitrógeno (ELN), a partir de la diferencia entre 100 y

la suma de las determinaciones anteriores. En la medición de energía bruta se usó

un calorímetro adiabático (Parr Instrument Co., Modelo 1261, Moline, IL, EUA). Se

usaron crisoles de acero inoxidable en donde se colocaron pastillas de 1g secadas

35

previamente a 70°C en una estufa por 12 h, se empleó alambre (10 cm) con una

aleación de níquel-cobre el cual estaba en contacto con la muestra, la cual fue

incinerada en una cámara de combustión inyectada con oxígeno. Los residuos

líquidos de la combustión fueron recuperados y titulados con carbonato de sodio

0.725 N; se usó naranja de metilo como indicador, se cuantificó la cantidad de

alambre calcinado en la combustión para los cálculos de la energía liberada.

5.3. Sistema experimental

El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de fibra de vidrio con capacidad de

60 litros (50 x 55 x 38 cm); cada uno con malla mosquitero para evitar la fuga de

organismos, un calentador sumergible de 200 W (EBO-JAGER, Eheim GmbH y

Co., KG Deizisau, Alemania) ajustable para mantener la temperatura del agua

alrededor de 28 °C. Un exhaustor externo para airear el agua por medio de un

soplador de 5 HP y con ello conseguir valores de oxígeno disuelto iguales o

mayores a 5 mg/L.

Se abasteció a los acuarios con agua de mar pasando por un filtro de arena de 70

micras (Cristal-Flo, Modelo T240BP1 Santa Rite Industries Inc., Delavan, WI,

EUA). El agua se bombeó hacia los acuarios, pasando previamente a través de

filtros de arena (70m), de cartuchos (10 y 5m) y luz ultravioleta.

Se realizó el control artificial del fotoperiodo con un reloj automático (timer) con 12

horas de luz constante a partir de las 6:00 am y 12 horas de oscuridad con un

sistema de iluminación de luz de neón de 200 W.

36

Figura 2. Sistema de cultivo utilizado para la evaluación de los alimentos

experimentales en el laboratorio de Nutrición Experimental.

5.3.1. Diseño experimental

Se realizó un bioensayo que tuvo una duración de 40 días con juveniles de

camarón con un peso inicial promedio de 0.24 ± 0.03 g, alojados aleatoriamente

en una densidad de 10 organismos por acuario, con tres replicas (acuarios) por

tratamiento, (120 organismos en total), Los camarones tuvieron un periodo de

aclimatación en los acuarios por dos días antes de iniciar el bioensayo.

Se les suministró el alimento utilizando el 10% de la biomasa total de los

organismos, posteriormente se ajustó en función al consumo diario, de forma que

siempre hubiera un excedente. El alimento fue distribuido en tres raciones al día

(9:00, 13:00 y 17:00 hrs).

37

Diariamente antes del recambio de agua y labores de limpieza, se monitorearon

los siguientes parámetros fisicoquímicos en el agua de cada acuario: temperatura

(termómetro de mercurio), salinidad (refractómetro Sper Scientific 300011) y el

oxígeno disuelto con un oxímetro portátil (YSI, modelo 55-12FT). Se realizó

limpieza diaria de los acuarios por medio de sifoneo, eliminando mudas,

organismos muertos, heces excretadas y restos de alimento, se hizo un recambio

diario del 60% del volumen total del agua. Esto se hizo por la mañana antes de

ofrecer la primera alimentación; diariamente se realizó conteo de alimento residual

y de organismos, para estimar el alimento consumido y supervivencia. Se llevaron

a cabo biometrías a los 15, 30 y 40 días de cultivo, pesando por separado a cada

uno de los organismos de los acuarios utilizando una balanza analítica (con

precisión de d= 0.01 g y máximo 200 g), después de haberlos secado con papel

absorbente. Al finalizar el bioensayo se tomaron muestras de hemolinfa de los

camarones tratados, para determinar el conteo total de hemocitos circulantes.

5.4. Bioensayo II

5.4.1. Determinación de crecimiento, supervivencia y CTH en juveniles

de camarón blanco alimentados con un nivel de proteína en el alimento, con

y sin mezcla probiótica.

5.4.2. Organismos

Se utilizaron juveniles de camarón blanco del pacifico L. vannamei obtenidos de

los estanques de cultivo del CIBNOR. Los camarones fueron aclimatados al

manejo y condiciones de cautiverio en el laboratorio de nutrición Experimental del

CIBNOR, durante 15 días, en tanques de fibra de vidrio con capacidad de 1,500

litros a una temperatura de 29°C y con una salinidad de 40%o. Los organismos

38

fueron alimentados dos veces al día (10:00 y 16:00h) con un alimento comercial

PIASAMR para camarón con 35% de proteína en base húmeda.

5.4.3. Cepas probióticas

Se utilizaron seis cepas experimentales obtenidas de la colección de bacterias y

levaduras del CIBNOR, para realizar las evaluaciones experimentales: tres de las

cepas de bacilos fueron aisladas del hepatopáncreas de animales silvestres sanos

de L. vannamei (cepas YC5-2, YC3-B y C2-2) y las tres restantes fueron

levaduras, dos fueron aisladas del medio marino (Candida insectorum

DHHBCS005 y Debaryomyces hansenii DHHBCS006) y la otra de cítricos

(Debaryomyces hansenii L1).

Previo al bioensayo las cepas mantenidas en crio-conservación (-80°C) fueron

descongeladas y cultivadas individualmente en placas con agar TSA (trypticase

soy Agar) 2.5% NaCl para las bacterias a 37°C por 24 h y en PDA (Patata

Dextrosa Agar) las levaduras a 30°C por 24 h. Las colonias fueron extraídas del

agar y suspendidas en tubos de ensaye conteniendo 10 ml de solución salina 3%

NaCl. La suspensión de las bacterias fue concentrada hasta alcanzar una

absorbancia de 1.0 a una densidad óptica de 540 nm (espectrofotómetro)

equivalente a 1 x 109 UFC/mL y para el caso de las levaduras la suspensión de

las levaduras fue concentrada hasta alcanzar una absorbancia de 1.0 a una

densidad óptica de 600 nm (espectrofotómetro) equivalente a 3 x 107 UFC/mL.

39

5.4.4. Preparación de las Mezclas probióticas

Una vez obtenidas las concentraciones deseadas para cada cepa, en un aspersor

de plástico conteniendo 5 mL de solución salina, se agregó el 33.3 % de cada

suspensión bacteria, para así obtener una concentración final de 1 x 106 UFC/mL,

la cual se le agregó al alimento utilizando cajas petri grandes donde se colocó el

alimento, esto se llevó a cabo en condiciones asépticas, utilizando una campana

de flujo laminar. Este procedimiento también se realizó para el caso de las

levaduras utilizando la misma concentración final.

5.5. Alimento experimental

Con base a los resultados del bioensayo 1 (ver sección 6.1.4.) fue seleccionado el

alimento con 38% de proteína cruda (PC), utilizándolo para el segundo

experimento en el cual se utilizó alimento comercial (PIASA) como control. En la

tabla I sección 5.2.4, se muestra la composición del alimento utilizado.

La metodología para la fabricación del alimento, fue igual a la descrita en la

sección 5.2.3.

5.5.1. Sistema experimental

El segundo bioensayo consistió en evaluar la dieta seleccionada del bioensayo

anterior que fue de 38% PC, para el cual se eligieron 3 tratamientos: 1) alimento

con 38% PC; 2) dieta con 38%PC + mix de bacilos 1x106 UFC/ml; 3) dieta con

40

38% PC+ mix levaduras; 1x106 UFC/ml; 4) dieta control, (alimento comercial,

PIASA, 35% PC).

El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de fibra de vidrio con capacidad de

60 litros (50 x 55 x 38 cm); cada uno con malla mosquitero para evitar la fuga de

organismos, un calentador sumergible de 200 W (EBO-JAGER, Eheim GmbH y

Co., KG Deizisau, Alemania) ajustable para mantener la temperatura promedio del

agua a 28 ± 0.5 °C. Un exhaustor externo para airear el agua por medio de un

soplador con 5 HP de capacidad y con ello conseguir valores de oxígeno disuelto

iguales o mayores a 5 mg/L en los tanques de cultivo.

Los acuarios se abastecieron con agua de mar filtrada a través de un filtro de

arena de 70 micras (Cristal-Flo, Modelo T240BP1 Santa Rite Industries Inc.,

Delavan, WI, EUA). El agua se bombeó hacia los acuarios, pasando previamente

a través de filtros de arena (70m), de cartuchos (10 y 5m) y luz ultravioleta. Se

realizó control artificial del fotoperiodo con un reloj automático (timer) con 12 horas

de luz constante a partir de las 6:00 am y 12 horas de oscuridad con un sistema

de iluminación de luz de neón de 200 W.

El segundo bioensayo tuvo una duración de 45 días se utilizaron juveniles de

camarón con un peso inicial promedio de 0.14 ± 0.02 g, colocados

aleatoriamente a una densidad de 10 organismos por acuario, con tres réplicas

(acuarios) por tratamiento, (120 organismos en total). Los camarones tuvieron un

periodo de aclimatación en los acuarios por dos días antes de iniciar el bioensayo.

Los tratamientos fueron adicionados diariamente, suministrando el alimento al

10% de la biomasa total de los organismos. Posteriormente la cantidad de

alimento suministrada se ajustó en función del consumo diario, de tal forma que

siempre hubiera un pequeño excedente. El alimento fue distribuido en tres

raciones al día (9:00, 13:00 y 17:00 hrs).

41

Diariamente antes del recambio de agua y de las labores de limpieza, se

monitorearon parámetros fisicoquímicos en el agua de cada acuario: temperatura,

salinidad y oxigeno disuelto con un oximetro portátil (YSI, modelo 550A, YSI

Incorporated, Yellowspring, OH, EUA). Se realizó la limpieza de los acuarios por

sifoneo, eliminando mudas, organismos muertos, heces excretadas y restos de

alimento, se realizó diariamente un recambio del 60% del volumen total del agua,

esto se hizo por la mañana antes de ofrecer la primera alimentación; se contaron

diariamente los organismos y el alimento residual, para estimar la supervivencia y

el alimento consumido.

Se realizaron biometrías a los 15, 30 y 45 días de cultivo, pesando por separado a

cada uno de los organismos de cada acuarios utilizando una balanza analítica de

precisión de d= 0.01 g y un máximo de 200 g.

5.5.2. Obtención y conteo total de hemocitos circulantes (CTH)

Al finalizar cada uno de los bioensayos, se tomaron tres organismos al azar por

tratamiento (primer bioensayo) y seis organismos por tratamiento (segundo

bioensayo). La hemolinfa se extrajo de la base del pleopodo del primer segmento

abdominal cerca del poro genital, utilizando una jeringa de 3.0 ml conteniendo un

volumen de 500 µl de solución anticoagulante pre enfriada a 4°C la cual fue

diseñada con base a los valores iónicos y osmóticos de la hemolinfa del

camarón (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA-Na2, 10 mM HEPES, pH 7.3,

850 mOsm kg-1) Vargas-Albores et al. (1996). Posteriormente después de la

extracción de hemolinfa, la muestra fue colocada en tubos Eppendorf estériles de

1.5 ml y se mantuvo en una cama de hielo, para su procesamiento inmediato.

42

El conteo total de hemocitos se realizó de acuerdo con la técnica descrita por

Campa-Córdova et al, (2002). Se tomaron 100 µl de hemolinfa y se colocó en un

tubo de Eppendorf conteniendo 400 µl de solución fijadora (anticoagulante +

formaldehido, al 10%). Los hemocitos fueron contados por observación al

microscopio utilizando una cámara Neubahuer, se depositó en la cámara un

volumen conocido de muestra, y se contó el número de hemocitos totales (sin

diferenciar hemocitos hialinos, semi-granulares y granulares) en cada cuadrante.

El número o conteo total de hemocitos se expresó en millones de hemocitos por

ml.

5.5.3. Evaluación de parámetros zootécnicos

Se evaluaron los parámetros zootécnicos de los dos bioensayos realizados, donde

los organismos fueron pesados individualmente utilizando una balanza modelo

QT-200 con una capacidad máxima de 200 g y una precisión de 0.01 g. Después

de haberles eliminado el exceso de agua con papel absorbente, se determinó:

supervivencia, peso corporal, consumo aparente de alimento y conversión

alimenticia.

Supervivencia (%) = número final de organismos X 100

Número inicial de organismos

Consumo aparente de alimento= alimento suministrado – alimento residual

Estimación visual del alimento residual en los acuarios.

Conversión alimenticia (CA) = alimento aparente consumido (g)

Incremento en peso corregido (g)

43

5.5.4. Análisis estadísticos

Los resultados obtenidos de ambos bioensayos relacionados con las variables de

peso final, conversión alimenticia y supervivencia fueron sometidas a un análisis

de varianza de una vía (ANOVA Statistica versión 6.0). Cuando se encontraron

diferencias entre los tratamientos, se utilizó la prueba de Tukey para determinar

qué tratamientos fueron distintos o similares entre sí.

44

6. RESULTADOS

6.1. Bioensayo I

6.1.1. Parámetros físico-químicos

Los parámetros físico químicos se mantuvieron durante el desarrollo del

experimento dentro de los rangos de tolerancia establecidos para el cultivo del

camarón. La tabla II, indica los valores promedio de los parámetros del agua

determinados durante el experimento.

Tabla II. Valores promedios (± desviación estándar) de los parámetros físicos químicos del agua de cultivo durante los 40 días de experimento.

6.1.2. Análisis químico proximal de los ingredientes

En la tabla III, se muestran los resultados de la composición química proximal de

los ingredientes utilizados en la fabricación de los alimentos, fabricados para los

experimentos. Los resultados más relevante son los valores proteicos de la harina

de pescado y la pasta de soya mostrando una concentración de proteína cruda de

66.9% y 44.43%, respectivamente. Por otro lado la harina de trigo presentó la

menor cantidad de proteína cruda con 13.84%.

Parámetro físico químico Valor promedio

Oxigeno (mg/l) 5.44 ± 0.3

Temperatura(°C) 28 ± 0.2

Salinidad (ppm) 40 ± 0.26

45

El mayor contenido de fibra cruda se obtuvo en la harina de soya con un mayor

porcentaje de 3.93%, seguido de un 1.45% en la harina de trigo y el menor

contenido de fibra se obtuvo en la harina de pescado con un 0.03%. Por otra

parte, el mayor contenido de cenizas se encontró en la harina de pescado con

12.98%, seguida por la harina de soya (7.75%) y la menor cantidad de cenizas se

presentó en la harina de trigo (1.29%). Respecto a la energía bruta, el mayor

contenido se registro en la harina de pescado (5445.25 cal/g), y el menor en la

harina de soya (4569.75 cal/g).

En lo que se refiere a el extracto etéreo se obtuvo mayor contenido en la harina

de pescado con 13.15% y menor cantidad en la harina de soya (1.15%).

Tabla III. Composición proximal (promedio ± desviación estándar) de los

ingredientes utilizados para la preparación de las dietas experimentales.

*Extracto libre de nitrógeno

INGREDIENTE HUMEDAD

(%)

PROTEINA

(%)

EXTRACTO

ETEREO

(%)

FIBRA

CRUDA

(%)

CENIZAS

(%)

*ELN

(%)

ENERGÍA

(cal/g)

Harina de

pescado

3.16 ±

0.09

66.9 ±

0.28

13.15 ±

0.05

0.03 ±

0.05

12.98 ±

0.11 6.94

5445.25 ±

0.00

Harina de

Soya

7.2 ±

0.02

44.43 ±

0.05

1.15 ±

0.02

3.93 ±

0.26

7.75 ±

0.05 42.74

4569.75 ±

39.07

Harina de

Trigo

6.76 ±

0.04

13.84 ±

0.15

1.63 ±

0.02

1.45 ±

0.03

1.29 ±

0.05 81.79

4060.38 ±

54.33

46

6.1.3. Composición química proximal de los alimentos experimentales.

En la tabla IV. se pueden observar los resultados de la composición química

proximal de los tres alimentos empleados en el primer bioensayo en el cual se

evaluó crecimiento para seleccionar el mejor nivel de proteína incluido en el

alimento del camarón.

Los resultados obtenidos de los análisis químicos proximales son el producto de la

combinación de los distintos ingredientes usados durante el proceso de

formulación. Los valores que se observan entre la cantidad de proteína formulada

(29, 32 y 35%) que se aprecia en la primera columna, y la proteína cruda

analizada que se muestra en la segunda columna (38, 41 y 44% PC), son

distintos, no se obtuvieron semejanzas entre la formulada 0 esperada. Por lo tanto

se tomaron en cuenta los niveles de proteína, resultados de los análisis químicos

proximales.

Tabla IV. Composición química proximal de los tres alimentos usados en el primer

bioensayo de crecimiento para juveniles de L. vannamei.

(g/100g de materia seca, ± desviación estándar)

Alimento

% PC

Formulada

Proteína

(%)

Extracto

Etéreo

(%)

Fibra Cruda

(%)

Cenizas

(%)

1

29 38.0 ± 0.11 9.15 ± 0.15 1.02 ± 0.05 7.48 ± 0.02

2

32 41.0 ± 0.25 8.93 ± 0.11 1.20 ± 0.02 0.00 ± 0.00

3

35 44.0 ± 0.18 10.09 ± 0.09 1.21 ± 0.12 8.83 ± 0.01

47

6.1.4. Resultados zootécnicos

Los resultados obtenidos para las variables de peso vivo final, consumo de

alimento, conversión alimenticia y supervivencia en camarones tratados con 3

niveles de proteína incluidos en el alimento y cultivados durante 40 días se

muestran en la Tabla V. El crecimiento de los organismos experimentales se

muestra en la figura 4.

Tabla V. Variables de peso final, consumo aparente de alimento, conversión

alimenticia y supervivencia de juveniles de L. vannamei alimentados durante 40

días con tres niveles de proteína

Consumo aparente de alimento (CAA), factor de conversión alimenticia (FCA). Valores para cada

columna teniendo la misma letra no son significativamente diferentes (p>0.05).

Durante el primer bioensayo se realizaron biometrías cada 15 días para observar

el comportamiento del crecimiento en los camarones. A partir de la primera

biometría (a los 15 días), se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre el

Alimento

% PC Peso Final

(g)

CAA

(g) FCA

Supervivencia

(%)

Control

35.0 2.90 ± 0.39a

4.49 ± 0.13a 1.56 ± 0.05a 77 ± 25.2a

1

38.0 4.53 ± 0.96b

16.6 ± 0.95b 3.67 ± 0.15b 100 ± 0a

2

41.0 4.84 ± 1.25b

17.7 ± 1.67b 3.69 ± 0.38b 100 ± 0a

3

44.0 4.43 ± 1.5b

17.0 ± 0.49b 3.88 ± 0.46b 97 ± 5.7a

48

peso del grupo control y el pesos de los camarones tratados con 38, 41 y 44%

PC. Este comportamiento se mantuvo hasta el final del experimento, no

observando diferencias entre los pesos promedios de los camarones alimentados

con los tres nieles de proteína experimental, pero si con respecto al grupo control

de camarones. Figura 3.

Figura 3. peso de L. vannamei alimentados con distintos niveles de proteina (38,

41 y 44% PC) durante 40 dias de cultivo. *Diferencias significativas (p<0.05).

Los camarones tratados con el alimento control (p<0.05), registraron el menor

peso promedio con 2.90 g, seguido por los tratados con 44, 38, y 41% de PC,

registrando valores al final del primer bioensayo de 4.43, 4.53 y 4.84 g,

respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre los camarones

tratados con los tres niveles de proteína (figura 4).

*

*

*

49

Figura 4. pesos promedios de camarones juveniles de L. vannamei despues de

haber sido tratados con tres alimentos con distintos nivele de proteina (38%, 41%

y 44% PC) durante 40 dias de cultivo. Letras distintas indican diferencias

significativas (p<0.05).

En los resultados obtenidos del consumo aparente de alimento no se encontraron

diferencias significativas entre los grupos tratados con 38, 41 y 44% de PC,

registrando promedios de 16.6, 17.7 y 17.0 g. respectivamente. Sin embargo

dichos valores fueron significativamente mayores (p<0.05) a lo encontrados en el

grupo control (4.49 g).

alimentos; LS Means

Current effect: F(3, 107)=13.794, p=.00000

Effective hypothesis decomposition

Vertical bars denote 0.95 confidence intervals

control alimento 1 alimento 2 alimento 3

alimentos

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0P

eso

s (

g)

a

b

b

b

50

Figura 5. Consumo aparente de alimento, en juveniles de camarón cultivados

durante 40 días. Las Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05).

El factor de conversión alimenticia obtenido en el primer bioensayo resulto similar

entre los alimentos con niveles de 38, 41 y 44% de PC, mostraron valores

significativamente mayores (p<0.05) (3.67, 3.69 y 3.88, respectivamente) a los

encontrados con el grupo control (1.56).

6.1.5. Supervivencia

De acuerdo al análisis estadístico realizado no se encontraron diferencias

significativas (p> 0.05) de supervivencia respecto a los camarones alimentados

con 3 niveles de proteína cruda y los camarones del grupo control. Mediante

observación, los camarones presentaron buen comportamiento, sin embargo, la

a

b

b b

51

mayor supervivencia promedio registrada fue en aquellos camarones alimentados

con 38, 41% de PC (100%) seguido de 44%PC (97%) y con menor supervivencia

el grupo control con el 77% (Figura 6).

Figura 6. Supervivencia de juveniles de L. vannamei tratados con los tres

alimentos experimentales durante 40 días de cultivo.

6.1.6. Conteo total de hemocitos (CTH)

El conteo total de hemocitos obtenido al final del experimento en los camarones

tratados con diferentes niveles de proteína se observa en la figura 7. De acuerdo

con el análisis estadístico, se observó un incremento significativo (p<0.05) en los

organismos alimentados con 41%PC (5 x 106 hemocitos mL-1) respecto al grupo

control (1x106 hemocitos mL-1). No hubo diferencias significativas entre los grupos

52

de camarones tratados con 38, 41 y 44% PC registrando valores de 4 x106, 5 x106

y 3 x106 hemocitos mL-1 respectivamente.

Figura 7. Conteo Total de Hemocitos Circulares (CTH) en juveniles de camarón

blanco L. vannamei alimentados durante 40 días con alimentos conteniendo 38,

41 y 44% PC. Barras con letras distintas representan diferencias significativas

(p<0.05) entre alimentos.

a

ab

bb

bb

bb ab

bb

bb

bb

b

b

b

b

b

b

b

53

6.2. BIOENSAYO II

6.2.1. Parámetros físico químicos

Los parámetros físico químicos analizados durante el desarrollo del experimento

se mantuvieron dentro de los rangos de tolerancia establecidos en cultivo de

camarón. Los valores obtenidos del oxigeno, temperatura y salinidad se muestran

en la tabla VI.

Tabla VI. Valores promedio (± desviación estándar) de los parámetros físicos

químicos de la calidad del agua durante el desarrollo del segundo experimento.

Parámetro físico químico Valor promedio

Oxigeno (mg/l) 5.84 ± 0.73

Temperatura(°C) 28.5 ± 0.2

Salinidad (ppm) 36.11 ± 1.71

6.2.2. Análisis químico proximal de los ingredientes y alimento

En la tabla III y sección 6.1.2. se muestran los resultados de los análisis

proximales de los ingredientes utilizados en el alimento del segundo experimento,

y en la tabla IV, se presentan los resultados del análisis proximal (en base seca

del alimento (38% PC) usado en el experimento de crecimiento para evaluar el

efecto del uso de un nivel de proteína reforzado o no con probióticos. Este nivel de

54

proteína (38% PC), fue utilizado en el primer experimento, fue seleccionado para

ser utilizado en este segundo experimento debido que incremento en peso y CTH

en los camarones tratados respecto a los no tratados (control), a pesar de que

entre los otros dos alimentos de experimentación (41 y 44% PC) no existieron

diferencias significativas (p<0.05).

6.2.3. Resultados Zootécnicos

Los resultados obtenidos en las variables de peso final, consumo de alimento,

conversión alimenticia y supervivencia que se obtuvieron en los camarones

después de 45 días de experimentación se muestran en la tabla VII.

Tabla VII. Resultados de las variables medidas durante el bioensayo II, de

crecimiento.

TRATAMIENTOS

Peso Final

(g)

CAA

(g)

FCA

Supervivencia

(%)

Control 2.71±0.94a 2.21± 0.44a 0.81 ± 0.06a 63.33 ±11.5a

Tratamiento 1 4.42±1.6b 6.98 ± 0.43b 1.56 ± 0.18b 80 ± 17.3a

Tratamiento 2 3.95±1.65b 5.87± 0.16b 1.52 ± 0.26b 83.33 ± 11.55a

Tratamiento 3 4.21±1.46b 6.09 ±0.62b 1.45 ± 0.05b 93.33 ± 5.77a

Consumo aparente de alimento (CAA), factor de conversión alimenticia (FCA). Letras

distintas representan diferencias significativas (p<0.05)

55

Los resultados del peso final obtenido en el segundo bioensayo se muestran en

la figura 9, los juveniles tratados durante 45 días con una dieta de 38% PC y con

dietas adicionando probióticos, mostraron al final del experimento valores más

altos con el tratamiento 1 (38% PC) registrando un peso promedio de 4.42g,

similar a los camarones tratados con la dieta 2 (38%PC+ mix bacilos; 1x106

UFC/ml) y los tratados con la dieta 3 (38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml),

con valores de 3.95 y 4.21g, respectivamente. Estos valores fueron

significativamente mayores (p<0.05) a los del grupo control, ya que este grupo

registró el menor peso promedio con 2.71g. Estas diferencias en peso empezaron

a registrarse a partir de los 15 días de cultivo, cuando se realizo la primera

biometría, presentando el grupo control con un menor peso de 0.38g, y un

respecto al grupo de camarones con el mayor peso promedio 0.53g con la dieta 3.

A los 30 días de cultivo, la biometría arrojó que el mayor peso promedio se

mantuvo con el tratamiento 3 (1.69 g), respecto al menor peso promedio registrado

que fue el grupo control con un peso promedio de1.12 g. Por otra parte a los 45

días del bioensayo el mayor peso lo presento el tratamiento 1 seguido del

tratamiento 2 y 3. Ver figura 8.

56

Figura 8. Peso de juveniles de camarón blanco L. vannamei, durante 45 días de cultivo,

alimentados con tres diferentes tratamientos: Trat.1) 38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix

bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml y un control. (*)

Diferencias significativas (p<0.05).

Figura 9. .Peso promedio de los 3 diferentes tratamientos utilizados en juveniles de L.

vannamei cultivados durante 45 días. Letras distintas muestran diferencias significativas

(p<0.05).

* *

*

*

*

57

Los datos obtenidos para el consumo aparente de alimento muestran que,

no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos 1, 2 y 3, con

promedios de 6.98, 5.87 y 6.09g respectivamente. Los valores anteriores fueron

significativamente mayores (p<0.05) que los registrados en el grupo control (2.21

g).

Figura 10. Consumo aparente de alimento en juveniles de L. vannamei cultivados durante

45 días alimentados con 3 distintos tratamientos: Trat.1) 38% PC; Trat.2) 38%PC+ mix

bacilos; 1x106 UFC/ml); Trat.3) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml y un grupo

control. Las letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05)

El factor de conversión alimenticia fue similar (p>0.05) entre el tratamiento

1, 2 y 3, con valores promedio de 1.56, 1.52 y 1.45, respectivamente. Los

camarones tratados con las dietas experimentales registraron valores

significativamente mayores (p< 0.05) a los encontrados con los camarones

alimentados del grupo control (0.81).

b b

b

a

58

La supervivencia obtenida al final del bioensayo, a los 45 días de cultivo no

registro diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos experimentales.

Sin embargo, la mayor supervivencia promedio se observó en los camarones

alimentados con el tratamiento 3 (93.3%) y la menor supervivencia en los

camarones perteneciente al grupo control (63.3%). Las muertes se presentaron

a partir de los 30 días de cultivo. En la figura 11, se puede observar la

supervivencia desde el inicio del bioensayo hasta el final, a los 45 días.

Figura 11. Supervivencia de juveniles de camarón L. vannamei alimentados con tres

distintos tratamientos: a) control; b) 38%PC (t1); c) 38%PC+ mix bacilos; 1x106 UFC/ml

(t2); d) 38%PC + mix levaduras; 1x106 UFC/ml (t3), durante 45 días de cultivo.

59

6.2.4. Conteo total de hemocitos

El conteo total de hemocitos obtenido en el segundo bioensayo (Figura 12),

después de la alimentación de los camarones con tres diferentes dietas, muestra

un incremento significativo (p<0.05) en la concentración de hemocitos en los

grupos de camarones alimentados con el tratamiento 3 (38%PC + mix levaduras;

1x106 UFC/ml), con un promedio de 14x106 hemocitos mL-1 , comparado con el

grupo control que registro menor valor de hemocitos circulantes con 5x106

hemocitos mL-1. No se registraron diferencias significativas entre las 3 dietas

experimentales utilizadas (p>0.05).

Figura 12. Conteo Total de Hemocitos (CTH), en juveniles de camarón L. vannamei

alimentados con los siguientes tratamientos: a) control; b) 38% PC (Trat.1), c) 38% PC+

mix bacilos (Trat. 2); d) 38% PC + mix levaduras (Trat. 3), durante 45 días de cultivo

experimental. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05).

a

ab ab

b

60

7. Discusión

7.1. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei alimentados

con tres niveles de proteína.

El comportamiento de los parámetros físico químicos del agua (oxigeno disuelto,

temperatura y salinidad) registrados durante el periodo experimental, no presento

alteraciones adversas al cultivo. Comportándose dentro de los rangos normales

recomendados para camarones peneidos, los valores de dichos parámetros se

muestran en la tabla II. Hay que considerar que estos parámetros son

importantísimos, ya que influyen directamente en los requerimientos y

crecimiento de los camarones (Allan y Maguire, 1991)

Como en todos los sistemas de cultivo de animales, el crecimiento y producción de

camarón de cultivo depende completamente de lo suplementario e ingesta de

nutrimentos y alimentos; este último representa el principal y más alto costo de

operación de la mayoría de los cultivos semi-intensivos e intensivos. La necesidad

de elevar los rendimientos en la producción de camarones exige la búsqueda de

formulas alimenticias eficientes que permitan incrementar las tallas de los

animales. Por ello, se han venido formulando objetivos en torno a la identificación

de nuevas fuentes de proteína, buscando la manera de disminuir los niveles de

harina de pescado en los alimentos mediante la sustitución, de forma parcial o

total, por las fuentes de proteínas alternativas (De la Higuera, 1985), para tratar de

disminuir el costo del alimento. En este presente trabajo se realizo la evaluación

de tres niveles de proteína utilizando fuentes de proteína vegetal,

suplementándolos con aminoácidos cristalinos (lisina, metionina y treonina).

Las materias primas utilizadas para formular los alimentos que se usaron en este

estudio fueron la harina de pescado, harina de soya y harina de trigo. De acuerdo

con los resultados de los análisis químicos proximales; la harina de pescado fue la

que presentó el mayor contenido de proteína (66.9%) seguida de la pasta de soya

(44.43%) con menor contenido la harina de trigo (13.84%), estos resultados

61

coinciden con los reportados por Parra (1992); Cruz-Suarez et al, (1996); cruz-

Suarez (2000).

La harina de pescado es considerada como la fuente de proteína de calidad,

regularmente forma parte de las dietas de peneidos, esto se debe a su alta

palatabilidad y regularmente contiene altos niveles de energía y proteína

digestibles, tiene excelentes niveles de aminoácidos esenciales disponibles para

los requerimientos de varias especies tanto de peces y crustáceos (Webster y

Tidwell, 1992; Hardy, 1998). De aquí que dos tercios de la proteína en las dietas

provengan de la harina de pescado (McCoy, 1990). Por etas razones se

considera que no hay límite para la utilización de la harina de pescado en los

alimentos comerciales salvo el precio (Akiyama et al, 1991). Por la alta demanda

que ha tenido sea elevado, por lo tanto es uno de los ingredientes más costosos,

por lo que se buscan fuentes de proteínas alternativas, varios autores han

encontrado buenos resultados utilizando harina de soya en comparación con las

harinas de pescado y harina de camarones, dando respuesta que es superior

como un promotor de crecimiento para camarones peneidos (sick, 1973).

Venkataramiah et al, (1975) postulan que la adición de materia vegetal a la

alimentación ha demostrado un mejoramiento en la eficiencia de conversiones

alimenticias y sobrevivencia de camarones juveniles. Che et al, (1985) sugieren

que el reemplazo de proteína animal con proteína de origen vegetal con

diferentes niveles y calidad de proteína, se justifica en el proceso de crecimiento,

maximizando a un bajo costo el alimento para juveniles de camarones.

La formulación de los alimentos experimentales del presente trabajo, se planearon

tomando en consideración las demandas de proteína cruda recomendadas

previamente para camarones peneidos (Akiyama y Dominy, 1990). Los niveles de

metionina, lisina y treonina cristalinas fueron calculados de acuerdo al

requerimiento estimado por Tacon et al, (2002). Los valores obtenidos de los

análisis químico proximal de los alimentos experimentales (tabla IV) con respecto

62

a la proteína no concuerdan con la cantidad de proteína formulada, consideramos

que se debe probablemente a varias razones; la primera por el hecho de que los

reportes de la composición química se expresan convencionalmente en base seca

(AOAC, 2005), mientras que los niveles de proteína de los alimentos están

expresados en base húmeda, segunda, según Terrazas, 2010 menciona que la

proteína digerible generalmente es menor a la cantidad de proteína cruda

analizada, otra cuestión sería que la formulación no se haya hecho bien. por lo

tanto se tomaron en cuenta los porcentajes de proteína obtenidos de los análisis

proximales.

Al analizar en conjunto los resultados para todas las variables de crecimiento

medidas en este bioensayo, se observó que los diferentes tratamientos tuvieron

efectos positivos, ya que favorecieron el incremento de los pesos desde la etapa

inicial, no mostrando diferencias significativas entre ellos indicando que los

diferentes niveles de proteína (38, 41 y 44%) (Tabla V) se comportaron de la

misma manera. Por lo tanto, se considera que con niveles iguales o superiores a

38% de proteína fueron los que presentaron un mejor comportamiento. Otro

aspecto que se tiene que tomar en cuenta es que si entre ellos analizamos

además el aspecto económico resulta ser que la dieta con nivel de proteína de

38% es la que reúne las mejores condiciones nutricionales, por lo que este nivel

protéico puede sugerirse como buen alimento para el crecimiento, lográndose de

esta forma reducir el nivel de proteína en la dieta comercial, permitiendo la

sustitución efectiva de ingredientes de origen vegetal y aminoácidos cristalinos,

con bajo costo y además para reducir la producción de desperdicios. Estos

resultados concuerdan con Parra, (1992) donde demostró que no existen

diferencias significativas entre el peso ganado y los porcentajes de proteína

utilizados en dietas de 25, 30 y 35% de proteína, indicando que los diferentes

niveles de proteína se comportarón de la misma forma. Por otra parte Galindo et

al, (2002) También reporta que con dietas de 28 y 33% de proteína obtuvieron

crecimientos no significativos entre ambos tratamientos. Cruz-Suárez et al, (2000)

63

evaluaron el efecto de 4 niveles de proteína 20, 25, 30 y 35%, para L. vannamei y

L. stylirostris utilizando fuentes de proteína animal y vegetal, mostrando que la

respuesta al nivel de proteína fue asimétrica para ambas proporciones

animal/vegetal donde los mejores crecimientos fueron provistos por las dietas con

un nivel de inclusión de proteína igual o mayor al 25% de proteína en la dieta.

Diversos autores han estudiado el efecto del nivel de proteína dietaria sobre el

crecimiento y la tasa de conversión, algunos recomiendan niveles de proteína

altos para camarones de 40 a 45%, (Akiyama et al, 1991) Tacon, (1989)

recomienda 40% de proteína, para L. vannamei, colvin y Brand, (1977) proponen

como óptimo 30-35% de proteína en dietas de postlarvas y menos de 30 % para

juveniles. Martinez-Córdova et al, (2002), observó que L. vannamei, se desarrolla

adecuadamente con alimentos con 25% de proteína en estanques productivos.

Pérez-Velázquez et al, (2008) demostraron que la inclusión de proteína cruda en

concentraciones de 25, 30, 35 y 40% en el alimento para camarones (L.

vannamei) y al ajustar el consumo de alimento a fin de obtener concentraciones

iguales de proteína por un periodo de 28 días, no generó diferencias en la

ganancia de peso final o en la tasa de crecimiento entre los grupos de camarones

alimentados con 35 y 40% de proteína, ni entre los grupos que recibieron 25 y

30% de proteína en sus alimentos, obteniendo un peso final de 1.96 y 2.09 g.

respectivamente. Por otra parte Huai et al, (2010), compararon 4 niveles de

proteína cruda (35.5~41.3) o sus equivalentes en proteína digerible (29.8~35.3%),

encontrando que es factible reducir el nivel de ese nutrimento en el alimento en

juveniles de camarón blanco sin afectar su rendimiento productivo, siempre y

cuando sean suplementados los aminoácidos limitantes, tales como la metionina,

la lisina y la treonina.

La evaluación de los alimentos (38, 41 y 44 % de proteína) que se plantearon en

este estudio, permitió conocer la utilización de fuentes de proteína vegetal como

animal suplementados con aminoácidos cristalinos; metionina, lisina y treonina

64

adicionándolos como aminoácidos limitantes, reduciendo así el nivel de proteína a

38% en el alimento para juveniles de camarón L.vannamei, sin afectar su

rendimiento productivo, y así se disminuyó la cantidad de harina de pescado,

obteniendo un alimento de mejor calidad nutricional y con menor cantidad de

proteína.

La formulación a un perfil de aminoácidos digestibles es una herramienta útil para

compensar el nivel de calidad de los ingredientes alimenticios utilizados; su

impacto positivo en el rendimiento zootécnico de los animales se espera sea

mayor con respecto a la formulación a aminoácidos totales o en los casos en

donde se empleen materias primas de menor calidad (Terrazas et al, 2005). En

décadas anteriores, la industria de alimentos balanceados para animales

terrestres empleaban como criterio para la formulación la concentración total de la

proteína en el alimento (Fernandez, 1996) en lugar de formular para mejorar el

perfil de aminoácidos esenciales, meta hacia la que se pudo avanzar con el uso

de aminoácidos cristalinos hasta que se inició la oferta comercial de los mismos

(Terrazas, 2010). Ello ocurrió primero con el uso de metionina para la alimentación

de aves (González y Pesti, 1994) y posteriormente con lisina y treonina para la

producción de cerdos (Cuaron, 1993).

En el caso de la acuacultura, la producción intensiva de peces está más avanzada

en el tema del uso de aminoácidos para la formulación de alimentos, mientras que

en el caso del camarón se ha generado una controversia sobre el uso de

aminoácidos cristalinos en los alimentos, ya que se asume que existe una

importante lixiviación de aminoácidos hacia el agua con la inmersión y la

manipulación del alimento por parte del camarón, antes de su ingestión (Cruz-

Suarez et al, 2005). Se han propuesto estrategias para reducir la lixiviación de los

aminoácidos cristalinos en el agua por medio del uso de sustancias aglutinantes,

dando resultados positivos en la respuesta de crecimiento del camarón (Terrazas,

2010), como en el caso de nuestro estudio, que se utilizó carboxi- metil-celulosa

con el propósito de reducir el problema de lixiviación en los alimentos evaluados,

65

ya que se ha demostrado que es uno de los compuestos que han sido útiles para

mejorar el uso de los aminoácidos cristalinos en alimentos para camarón

(Millamena et al, 1999).

Los aglutinantes o sustancias protectoras de los aminoácidos cristalinos pueden

ser adicionados en dos formas: la primera directamente al aminoácido y la

segunda, incorporando esos compuestos a la mezcla total de ingredientes que

conforman el alimento al momento de su fabricación (Alam et al, 2004,2005). En

este trabajo se optó por la segunda opción, sin embargo, la cantidad de dichos

aminoácidos en la mezcla no pudo ser analizada en el laboratorio, sin embargo, la

respuesta de crecimiento del camarón, obtenida en los bioensayos realizados,

permitió afirmar que sí pudo ser utilizada para su crecimiento. Chi et al, (2009)

evaluaron tres métodos de protección de L-metionina cristalina, sin encontrar

diferencias entre los tratamientos, en donde se protegió al aminoácido y al

tratamiento donde se utilizó el aminoácido en forma directa; esto concuerda con

los resultados benéficos obtenidos sobre el peso final de los camarones en

nuestros bioensayos, con la adición de aminoácidos sin proteger (metionina, lisina

y treonina) adicionados en alimentos bajos en proteína (Huai et al, 2010). Por lo

dicho anteriormente, la disponibilidad biológica de proteína y aminoácidos es un

elemento importante a considerar, porque está relacionado con la cantidad de

nitrógeno retenida por el camarón (Terrazas, 2010), por lo tanto las proteínas son

los componentes de los alimentos complementarios más importantes para el

crecimiento óptimo de los camarones, en cuanto a la cantidad y calidad de la

fuente proteica (chen et al, 1985) y la presencia de aminoácidos esenciales en

estas raciones respondería con una mayor síntesis de proteínas en sus tejidos

(Parra, 1992). Kanasawa, (1985), asume que la diversidad de los niveles óptimos

de proteína para los camarones se debe a varios factores, principalmente a las

diferencias de hábitos alimenticios y de comportamientos (bentónicos o de nado

libre, carnívoro u omnívoro), edad de la especie y fuente proteica usada (fuente

animal o vegetal).

66

En el alimento consumido se pudo observar una notable diferencia entre el grupo

control y los tratamientos, a pesar de que la ración inicial suministrada para todos

los camarones fue del 10% de la biomasa total, de esta manera en cada biometría

realizada se pudo ajustar la ración de manera considerable la cantidad de alimento

suministrado a cada unidad experimental. La cantidad de alimento consumido por

la población tiene alta y bajas durante el periodo experimental, indicando que la

población no consume la misma cantidad de alimento por unidad de biomasa, sino

que hay variaciones que pueden estar determinadas por varios factores, como por

ejemplo los estadios de muda, el tipo de alimento, fotoperiodo, etc. La conversión

alimenticia (Tabla V) fue mayor en los tres niveles de proteína experimentales en

comparación con los del grupo control, no se encontraron diferencias entre los tres

niveles evaluados considerándose los resultados como valores buenos de

conversión alimenticia. En este caso Cruz-Suarez et al, (2000), reporto resultados

similares al evaluar el efecto de 4 niveles en la relación proteína cruda / energía

bruta (P/E = 50, 60, 70 o 80 mg prot./kcal, para niveles de proteína de = 20, 25, 30

o 35%), obteniendo las mejores tasas de conversión alimenticia utilizando niveles

de proteína mayor o igual al 25% de proteína en L. vannamei. Es el caso de este

estudio donde también se obtuvieron resultados de manera similar entre los tres

niveles de proteína evaluadas.

En nuestro estudio, la supervivencia en todos los casos se consideró buena al

presentarse entre el 90 y 100 %, no encontrando diferencias significativas entre

los tratamientos. Probablemente la mortalidad que se presentó en los alimentados

con 44% de proteína, pudo ser por el periodo de muda y los organismos

recurrieron al canibalismo, que es un comportamiento común en los crustáceos.

En este caso Parra, (1992), indica que el porcentaje promedio de sobrevivencia

para varias especies de Penaeus está entre el 80 y 100%; nuestros resultados

están dentro de este rango, a excepción del grupo control donde la sobrevivencia

estuvo por debajo de este rango (73.3%).

67

7.2. Crecimiento de camarones juveniles de L. vannamei, alimentados con

un nivel de proteína, adicionado con mezclas probióticas

En este segundo experimento de crecimiento también fue importante el monitoreo

de los parámetros fisicoquímicos, manteniéndose entre los rangos de tolerancia

establecidos en el cultivo de camarón (Tabla VI).

Durante los últimos años se han venido desarrollando estudios buscando

alternativas para el control de enfermedades infecciosas en los cultivos, una de

ellas han sido los probióticos; que son microorganismos vivos que permanecen

activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos, al ser ingeridos en

cantidades suficientes teniendo efectos benéficos, entre ellos contribuir al

equilibrio de la flora intestinal y potenciar el sistema inmunológico (Seh-lelha,

2008), la utilización de la inmunoestimulación como forma natural de defensa en

los camarones, es una alternativa al uso de antibióticos y quimioterapéuticos, bajo

el principio de exclusión competitiva (Gullian, 2001). Varios estudios han

demostrado que el uso de mezclas probióticas son más efectivas que las cepas

independientes en el control de patógenos, ya que la posibilidad de establecer

poblaciones probióticas a pesar de las variaciones ambientales es mayor, además,

también se han observado procesos sinérgicos entre cepas, que han

incrementado los resultados deseados (Douillet, 2000). En este caso Sotomayor y

Balcazar, (2003) mencionan que las mezclas de cepas probióticas tienen

propiedades como agentes de biocontrol para el uso en laboratorios y granjas de

cultivo, reduciendo la presencia de vibrios patógenos en los sistemas acuícolas.

Varios autores piensan que la alimentación con peletizado comercial puede

alterar paulatinamente la anatomía digestiva, lo que llevaría a un mejor acceso de

bacterias en la colonización del tracto intestinal. En este presente trabajo se

realizó la evaluación de mezclas probióticas de Bacillus (cepas YC5-2, YC3-B y

C2-2) y levaduras (Candida insectorum DHHBCS005, Debaryomyces hansenii

68

DHHBCS006 y Debaryomyces hansenii L1), adicionadas al alimento, considerado

de calidad nutricional del mismo y previamente evaluado en un bioensayo anterior.

De acuerdo con los resultados de las variables de crecimiento medidos en este

estudio, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos con

probióticos incluidos en el alimento con nivel de proteína de 38% (Tratamiento 2 y

Tratamiento 3) y con tratamiento con el nivel de proteína de 38% sin probiótico

(Tratamiento 1), pero sí con respecto al control, que consistió en alimento

comercial (35% de proteína) sin probiótico. Esto nos indica que un buen alimento

de calidad nutricional se refleja en un rápido crecimiento y mejor salud del animal.

De esta manera se comprueba que los probióticos son una alternativa capaz de

mejorar la condición de los organismos en los cultivos, además de tener otros

beneficios de control de calidad del producto final. En el consumo de alimento, no

se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos (Tratamientos 1, 2 y

3. Tabla VII , Figura 10 ), pero si las hubo entre los tratamientos respecto al grupo

control esto indica que el consumo de alimento está relacionado con el incremento

de peso promedio obtenidos, al igual que los resultados del factor de conversión

alimenticia (FCA) encontrándose los mayores valores de FCA en los tres

tratamientos, encontrando diferencias significativas con respecto al control. Se

obtuvieron supervivencias entre el 80% y el 93% en los tratamientos y un 63.33%

en el control, no se encontraron diferencias significativas entre los tratados y el

control. Durante todo el bioensayo se observó buena actividad motriz, buena

aceptación en el consumo de los tratamientos empleados, esto fue reflejado en los

pesos promedios obtenidos.

El género Bacillus si bien no se encuentra dentro de los géneros comunes en

ambientes marinos por tratarse de un microorganismo de origen telúrico, ha sido

aislado del intestino de crustáceos (Rengpipat et al, 2000), peces marinos (Sugita

et al, 1998), y bivalvos (Sugita et al, 1981). Resultados similares a este trabajo con

Penaeus vannamei, Guillan (2001) en un ensayo de evaluación de cepas

69

probióticas como inmunoestimulantes, registró incremento significativo en el peso

promedio de los camarones, respecto al control, así también mejorando la

respuesta inmunitaria de P. vannamei, al usar las cepas: Bacillus p64, Vibrio p62 y

V. alginolyticus (cepa Ili). Por otra parte, Sotomayor y Balcazar (2003) en un

estudio que hicieron evaluando cuatro cepas probióticas Ili (V. alginolyticus), p62 y

p63 (Vibrio sp.) y p64 (Bacillus sp.) ante tres cepas patógenas de forma in vitro,

presentando éstas, mayor capacidad de inhibición sobre el crecimiento de Vibrio

sp. patógeno. De igual forma Rengpipat et al (1998) reportó resultados similares

en postlarvas de 30 días de camarón P. monodon con la utilización de Bacillus

S11 como probiótico en el alimento. Después de alimentar durante 100 días con

células frescas, no encontraron diferencias significativas en crecimiento entre los

tratamientos probióticos, pero sí entre probióticos y el control. El mismo autor

Rengpipat et al (2000), luego de alimentar 90 días con Bacillus 39 S11 en tanques

de P. monodon, encontró que los tratados con probióticos tuvieron mayor

supervivencia que los no tratados, sin embargo, no obtuvieron diferencias

significativas en el crecimiento, atribuyendo estos resultados a diferentes

condiciones de cultivo. Guillan (2001), al evaluar cepas probióticas como

inminoestimulantes reportó una supervivencia del 100% para todos los

tratamientos (Bacillus p64, Vibrio P62 y V. alginolyticus (cepa Ili)). A diferencia de

nuestro trabajo no se encontraron diferencias significativas con respecto a la

supervivencia entre tratamientos ni con el control, se cree que estas altas

mortalidades se deban a la incidencia de la presencia de personal ajeno a los

experimentos, recordemos que los camarones son organismos sensibles a la

presencia y ruidos, estresándose rápidamente, lo que ocasiona la alteración de

los organismos, brincando hacia fuera de los acuarios provocándoles la muerte.

Otro factor pudo ser las etapas de mudas ya que en los crustáceos es algo

característico el que se presente canibalismo entre ellos.

Dentro de las ventajas del uso de probióticos, se considera su influencia en la

actividad digestiva mediante síntesis de vitaminas o cofactores; mejora en la

70

actividad enzimática, pre digestión de proteínas, producción de exoenzimas

eficientes en romper polímeros de celulosa y almidón (Fuller, 1989; Gatesoupe,

1999; Ziemer y Gibson, 1998; Jory, 1998). De acuerdo con Guillan (2001), estas

propiedades podrían ser la causa del incremento en el peso, influyendo en una

mejora sustancial de la digestión o absorción de nutrientes. La vía de

inmunoestimulación es un factor muy importante, sobre todo en organismos

pequeños, donde la eficiencia de la estimulación se debe evaluar con métodos

eficientes. Por otra parte, las levaduras se han utilizado en numerosas

investigaciones como única fuente de proteína en las dietas de diversos peces y

pese a la deficiencia en aminoácidos esenciales y alto contenido en ácidos

nucléicos, se ha comprobado que algunas levaduras pueden ser usadas para

sustituir, al menos parcialmente, a la harina de pescado en las dietas para peces,

siempre que su precio y/o disponibilidad en el mercado lo permita (Aguirre-

Guzmán, 1990). Realmente es escasa la información sobre el uso de mezclas

probióticas de levaduras y bacterias en alimento para camarón, en cambio donde

más se han utilizado cepas con características probióticas son en peces, por

ejemplo Lara-Flores et al, (2002) realizaron un estudio comparativo de un

probiótico comercial contra microorganismos aislados del tracto gastrointestinal de

la tilapia, ellos observaron resultados favorables especialmente con la levadura

Saccharomyces cerevisiae, la cual dio lugar a un mayor crecimiento y mejor

eficiencia alimenticia en comparación con los peces que ingirieron un probiótico

comercial o con los que no recibieron ningún aditivo. Otros ejemplo de estudios

con probióticos son los de Quiñonez, (2008) afirma que al final de su experimento

a los 120 días en tilapia en la etapa de alevín, obtuvo un peso promedio de los

peces alimentados con alimento comercial + DO (DRYOIL® (aceite vitaminado) )

fue de 99,52 ± 2,59g, los peces alimentados con alimento comercial + DO +

mezcla probiótica (5 x 104 ufc/g) pesaron 97,26 ± 3,12 g, los peces alimentados

con alimento comercial + mezcla probiótica (1 x 106 ufc/g) pesaron 96,64 ± 4,52 g,

mientras que los peces alimentados con alimento comercial + DO + mezcla

71

probiótica ( 1 x 107 ufc/g) pesaron 97,36 ± 4,09 g no hubo diferencias significativas

entre los tratamientos. Por otra parte Palacios, et al. (2007) en una investigación

realizada en el sábalo amazónico, demuestra que existen diferencias estadísticas

significativas entre los tratamientos. Estableciendo que el tratamiento donde se

adicionó 2,0 g/kg de probiótico (Bacillus y S. cerevisiae) al concentrado comercial

con 32% de proteína, presentó el mejor resultado con un incremento de 88,52

g/mes, en comparación con el testigo donde no se adicionó probiótico obteniendo

un incremento de apenas 76,57 g/mes. Así también Guevara et al. (2003) en un

estudio realizado en Colombia, en el que adicionaron probióticos a base de

bacterias como Bacillus, Lactobacillus y levaduras del género Saccharomyces al

alimento para tilapia roja en la fase de levante o engorde, demostraron que existió

un efecto positivo, puesto que hubo diferencias significativas para tratamientos con

dosis de 6, 4, y 2 g respectivamente, donde el de mejor desempeño productivo fue

el tratamiento con 6 g de probiótico para las variables: incremento de peso,

longitud estándar final y conversión alimenticia final, en comparación con el control

o testigo que no fue aplicado el probiótico. Esto sustenta que la utilización de

probióticos es viable en los cultivos.

7.3. Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón blanco

L. vannamei

En el presente trabajo se determinaron el conteo total de hemocitos (CTH) a los

camarones, llevándose a cabo dos bioensayos el primero consto alimentar con

tres niveles de proteína (38%, 41 y 44%), esto con el fin de probar si los niveles

de proteína tienen efecto en el incremento de hemocitos de los camarones,

comparando entre los tres tratamientos ante un control (alimento comercial que

comúnmente es utilizado en las granjas camaroneras). En el segundo bioensayo;

después de haber probado los tres niveles de proteína se optó por seleccionar un

72

solo nivel de proteína (38%), al cual se le adicionaron mezclas probióticas de

bacterias y levaduras. Es importante mencionar que estos microorganismos ya

han sido objeto de estudios anteriormente, probándolos individualmente por medio

de inmersión e incluidos en el alimento peletizado, dando buenos resultados como

incremento en peso, estimulación en el sistema inmune en peces, bivalvos,

camarones (adultos y postlarvas), a partir de estos resultados se tomaron en

cuenta dichos aislados para este trabajo, seleccionando la concentración que dió

mejores resultados previos y así evaluarlos mezclados en juveniles de camarón

L. vannamei.

El método utilizado para el conteo de hemocitos fue la cámara de Neubauer, el

cual permitió una clara observación de las células sanguíneas a contar, a través

de esta técnica, se pudo diferenciar las células de cualquier otra estructura extraña

presente en la hemolinfa de los camarones, esto coincide con los reportes de

Vargas-albores et al. (2005), Maldonado et al. (2003), Audelo et al. (2007). El

conteo hemocitario total tiene relación con la resistencia a patógenos (Rodriguez y

Le Moullac, 2000).

En el primer bioensayo, al obtener los resultados del CTH, no se encontraron

diferencias significativas entre los tratados con 38, 41 y 44% de proteína, pero si

se observó mayor incremento de hemocitos en los tratados con 41% de proteína

habiendo diferencias significativas con respecto al grupo control (alimento

comercial marca PIASA, 35% de proteína). Por lo tanto esto se corrobora con lo

dicho por Pascual et al, (2003), que las proteínas son compuestos constituidos

por unidades sencillas, donde los aminoácidos ocupan una posición central por ser

la base para la formación de enzimas, hormonas y hemocianina, todos ellos

componentes de la respuesta inmunitaria. Podríamos decir que los niveles de

proteína sí influyen en el incremento de hemocitos de los camarones, por lo que

son importantes ya que las principales células del sistema inmune son los

hemocitos.

73

El número de hemocitos libres puede variar y en la mayoría de los casos

disminuir dramáticamente durante una infección, así nuevos hemocitos necesitan

ser producidos y liberados por el tejido hematopoyético especializado; tejido que

ha sido identificado en varias especies de crustáceos (Johansson et al, 2000).

Estas células pueden remover y eliminar partículas extrañas del hemocele y

tejidos, alrededor del órgano digestivo, producen productos antimicrobianos de

importancia para la defensa inmunitaria y llevan a cabo proceso como fagocitosis

o actividades de encapsulación, la principal función del sistema inmune, es

“mantener la individualidad biológica” (Vargas-Albores, 2002, Maldonado et al,

2003, Zarain-Herzberg y pacheco-Marges, 2007). La capacidad para limpiar los

tejidos de bacterias invasivas, es de vital importancia para mantener la salud en

los camarones. Le Moullac et al, (1998) reportaron que camarones P. stylirostris

con un bajo CTH sometido a una situación de hipoxia, eran mas sensibles a la

infección con V. alginolyticus virulento. Por eso es importante que los animales

estén alimentados adecuadamente con una buena dieta.

En los resultados del segundo bioensayo, no se encontraron diferencias

significativas entre los tres tratamientos (38% PC (Trat.1), 38% PC+ mix bacterias

a 1x106 UFC/g (Trat. 2) y 38% PC + mix levaduras a1x106 UFC/g (Trat. 3)). Pero si

notándose incrementos de hemocitos en comparación con el grupo control,

resaltando que en el tratamiento tres hubo un mayor incremento de hemocitos en

comparación con el grupo control. Investigaciones sobre el sistema inmune de

camarones, han demostrado que es posible aumentar la resistencia a

enfermedades mediante la ingestión de aditivos alimentarios llamados

inmunoestimulantes (Carrillo-Fuentes, 2000). Estos compuestos, se encuentran

disponibles como tratamientos alternativos, actuando como moléculas de alarma

que activan el sistema inmune. La mayoría son compuestos químicos que se

encuentran como elementos estructurales de bacterias, micelios de hongos y

levaduras, que accidentalmente se ha encontrado que poseen propiedades

inmunoestimulantes (Raa, 1996). Las levaduras son bien conocidas en el área de

74

nutrición animal por producir poliaminas, las cuales incrementan la maduración

intestinal (Peulen et al., 2000). Estos estudios nos demuestran que la utilización de

bacterias o levaduras probióticas, estimulan el sistema inmune de los camarones,

induciendo el incremento de hemocitos circulares, al ser activados también

producen sustancias bactericidas como peróxido de hidrógeno (H2O2) y anión

superóxido (.O-2) que pueden incrementar la resistencia a enfermedades (Song y

Hsieh, 1994), jugando un papel importante en la defensa celular. Un decrecimiento

de hemocitos circulantes en crustáceos, esta correlacionado con una potencial

susceptabilidad a patógenos (Le Moullac y Haffner, 2000). Se ha reportado que

dietas suplementadas con algunas cepas vivas de Saccharomyces cerevisiae y

Debaryomyces hansenii estimulan el sistema inmune de peces y camarones

(Gatesoupe, 2007; Soltanian et al., 2007). En un estudio Pacheco-Marges (2011)

evaluó el efecto de Las cepas DH5, DH6 y LL1 de Debaryomyces hansenii sobre

la respuesta antioxidante de L. vannamei, donde concluye que estas cepas tienen

valor nutricional reflejado en el contenido de proteínas en hemocitos y la

concentración de hemocitos totales, además de inducir incremento en respuestas

antioxidantes. En cuanto a bacterias Guillan, (2001) reportó que el número total de

hemocitos y la concentración total de proteínas plasmáticas en tres tratamientos

(V. alginolyticus Ili, Bacillus P64 y Vibrio P62) no registraron diferencias

significativas entre los tratamientos expuestos, durante 20 días encontrándose

dentro de los valores normales, indicando que la administración de las cepas

bacterianas no deteriora la salud de los camarones. Esto concuerda con lo

obtenido en el presente trabajo, donde tampoco se encontraron diferencias

significativas entre los tratamientos. Las bacterias por naturaleza presentan

mecanismos antagónicos que les permite subsistir en determinados ecosistemas.

La estimulación del sistema inmune por la utilización de cepas probióticas ha sido

reportada por Famularu et al, (1997) y Gatesoupe (1999), como una característica

a considerar en la selección de las bacterias. La inmunoestimulación, es una

alternativa para mantener el sistema de defensa activo, aumentando la resistencia

75

a virus o controlando poblaciones bacterianas patógenas, que puedan afectar la

salud del hospedero. En los camarones, varios componentes microbianos se han

utilizado como estimulantes de las funciones celulares del hospedero, entre ellos

están los β-glucanos (BG), lipopolisacáridos (LPS) y peptidoglucanos (PG), estos

compuestos pueden activar directamente funciones celulares aunado a la

participación de inmuno proteínas del plasma para mejorar la eficiencia de la

respuesta inmune (Vargas-Albores et al, 1998). Los BG están presentes en la

pared celular de levaduras y hongos, los LPS son los principales componentes de

la pared celular de las bacterias Gram (-) siendo considerados por ciertos

investigadores como herramientas potenciales en la prevención de enfermedades

(Newman, 1996). Los PG proceden de la pared celular de bacterias Gram (+). Sin

embargo los Bacillus, han sido vinculados a la producción de poliximina,

bacitracina, tricodin y gramicidin.

Al contrario de los vibrios, la mayoría de los microorganismos perteneciente al

género Bacillus no ha sido asociado a patologías de organismos acuáticos, razón

por la cual se ha promovido su uso (News, 1996).

Por lo dicho anteriormente se considera que los probióticos a pesar de ser

inmunoestimulantes también ayudan en el crecimiento y desarrollo de los

organismos. Realmente se requiere de más estudios para profundizar en el

conocimiento relacionado con estas cepas, para establecer en un futuro

sustentable en el uso de probióticos en la prevención de enfermedades del

camaron L. vannamei.

76

8. CONCLUSIONES

Los diferentes niveles de proteína evaluados generaron efectos positivos,

ya que favorecieron el incremento de los pesos desde la etapa inicial, no

mostrando diferencias significativas entre ellos indicando que los diferentes

niveles de proteína (38, 41 y 44%) se comportaron de la misma manera.

La dieta con nivel de proteína de 38% es la que reúne las mejores

condiciones nutricionales, por lo que este nivel protéico puede sugerirse

como buen alimento para el crecimiento, lográndose de esta forma reducir

el nivel de proteína en la dieta comercial, permitiendo la sustitución efectiva

de ingredientes de origen vegetal y aminoácidos cristalinos, con bajo costo

y además para reducir la producción de desperdicios.

Los niveles de proteína sí influyen en el incremento de hemocitos de los

camarones, por lo que son importantes ya que las principales células del

sistema inmune son los hemocitos.

Los probióticos a pesar de ser inmunoestimulantes también ayudan en el

crecimiento y desarrollo de los organismos.

Estos estudios nos demuestran que la utilización de bacterias o levaduras

probióticas, estimulan el sistema inmune de los camarones, induciendo el

incremento de hemocitos circulares, mejorando la condición de los

organismos en los cultivos, además de tener otros beneficios de control de

77

calidad del producto final. Esto sustenta que la utilización de probióticos es

viable en los cultivos.

La utilización de acuarios en laboratorio para este experimento ofreció

condiciones favorables, ya que se facilita el manejo de los animales y los

resultados son más concretos.

78

9. RECOMENDACIONES

En futuras investigaciones llevar a cabo estudios sobre la estabilidad de los

probióticos al entrar en contacto con el agua, y las perdidas por lixiviación,

ya que estos factores pueden interferir en los resultados.

Se requiere de más estudios para profundizar en el conocimiento

relacionado con estas cepas, para establecer en un futuro sustentable en el

uso de probióticos en la prevención de enfermedades del camarón.

Se sugiere posteriormente, realizar experimentos en campo en condiciones

naturales y probar con otras especies de cultivo para poder comparar y

ratificar los resultados obtenidos.

79

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