zloženie medu
TRANSCRIPT
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
RNDr. Katarína Bíliková, PhD.
Oddelenie molekulárnej apidológie
Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied
Bratislava
Včelí med ako liek
Včelí národ je jako jedna bytosť s kolektívnym vedomím
svoje výsadné postavenie a obdiv si včela zaslúžila svojou dokonalou organizáciou činnosti desiatok tisícov jedincov,
ako i tým, že poskytuje oddávna človeku svoje liečivé produkty
med, peľ, materskú kašičku, propolis ako aj nenahraditeľnou úlohou
v opeľovaní rastlín
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Nemecký egyptológ Ebers kúpil v r. 1873 v Luxore
zvitok papyrusu, napísaný v hieratickom písme (3500 r. pred Kristom).
Bol dlhý 22,23 metrov a obsahoval až 900 receptov
vrátane návodov na farmaceutické použitie medu.
Starovekí grécki filozofi Hippokrates, Democritos
odporúčali užívať med pre získanie telesnej zdatnosti,
upevnenie zdravia, dlhovekosť a plodnosť ...
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Liečivé účinky včelích produktov
Liečivé účinky včelích produktov
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
med v zdravej výžive všetkých vekových skupín obyvateľstva, pri rekonvalescencii po ťažkých chorobách a operáciách, pri chorobách srdca, pečene, obličiek, žalúdka a čriev, pri zápalových ochoreniach dýchacích ciest, pri zmiernení, nervovej vyčerpanosti, únavy, nespavosti, účinkuje ako antibiotikum, ochraňuje pokožku, využíva sa v oftalmológii, …
materská kašička je všeobecne uznávaná a používaná ako zdravie podporujúca substancia. podpora vitality, proti bolesti hlavy a únave, animikrobiálne,
imunostimulačné, dermatologické, stimulatčné, tonizujúce a revitalizačné účinky, dlhovekosť …
včelí jed zmiernenie zápalov kĺbov, špeciálne viazaných s atritídou, ...
propolis mnohoraké liečivé účinky, vrátane antimikrobiálnych, antioxidačných a najnovšie sa zistilo, že účinkuje aj voči HIV, ...
včelí peľ antioxidačné vlastnosti a extrakt z peľu sa používa v liečbe prostaty, ...
včelí vosk použitie v kozmetike a farmaceutickom priemysle, ...
Napriek dôkazom o liečivých účinkoch včelích produktov existuje v odbornej lekárskej komunite skepticizmus
a nedôvera voči ich používaniu
Problém spočíva v tom, že doteraz nie sú presne definované účinné látky
a najmä, že lekári nemajú k dispozícii potrebné údaje o množstve účinnej látky
vo včeľom produkte
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Liečivé účinky včelích produktov
včelia výživa
včela nekonzumuje priamo rastlinné produkty, ale ich modifikuje, konzervuje a uskladňuje
Ide o technologické procesy, v ktorých sa upravuje prirodzený
bielkovinový (peľ) a sacharidový materiál (nektár) tak,
aby sa ich výživová hodnota nezmenila v priebehu 1 roka pri teplote 34 -35C.
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
med larválna výživa včelí peľ
nektár a sladké sekréty rastlín voda kvetový peľ
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Čo je med ?
med je zahustená a enzymaticky upravená zmes látok
zo sladkých štiav rastlín alebo medovice obohatená o
sekréty cefalických žliaz včiel krmičiek.
včela používa pre konzervovanie svojej potravy
vysokú koncentráciu cukru (80%), nízky obsah vody (14% – 18%)
kyslé prostredie (pH 3.7) prítomnosť antibakteriálnych látok včelieho i rastlinného pôvodu
voda 17%
ostatné cukry
9%
glukóza 31%
ostatné látky
4%
fruktóza 38%
sacharóza 1%
Chemické zloženie medu
špecifické zloženie medu závisí od zmesi kvetov navštívených včelami,
liší sa podľa lokality, obdobia, regionálnych a klimatických podmienok
a od jednotlivých včelstiev
enzýmy, proteiny a peptidy
včelieho pôvodu (0,1 - 0,5%),
aminokyseliny, vitamíny, hormóny,
organické látky, fytochemikálie,
minerály, …
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Oddelenie molekulárnej apidológie Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava
rok 1987
Doc. Ing. Jozef Šimúth, DrSc., zakladateľ výskumu bielkovín včelej materskej kašičky u nás a vo svete
zameranie systematický, molekulárno - genetický výskum proteinov a peptidov
vylučovaných včelou do včelích produktov (materská kašička, med, včelí peľ, propolis)
cieľ objasniť ich funkciu vo včelstve
z nutričného, fyziologického a defenzívneho aspektu, ako aj prispieť k objasneniu liečivých účinkov
včelích produktov
rok 2012
Proteiny a peptidy včelej materskej kašičky sú v centre súčasného molekulárneho a fyziologického výskumu
vo svete
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).
kDa 1 2
200.00
116.25
97.40
66.20
45.00
31.30
21.50
14.00
apa 5 (82-87 kDa) apa 3 (60-70 kDa)
apa 1 (55 kDa) apa 2 (49 kDa)
APALBUMINY hlavné proteíny materskej kašičky
Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).
Hlavné bielkoviny materskej kašičky
predstavujú 90% všetkých proteínov MK
patria do jednej proteínovej rodiny
pozostávajúcej z 9 členov
Mw 49-87 kDa
sú pre včelu špecifické
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Fyzikálno-chemické vlastnosti týchto bielkovín
sú podobné známym albumoidným proteínom
(ovoalbumín, sérum albumín)
preto pomenovanie apalbumíny.
Najviac zastúpená bielkovina materskej
kašičky je apalbumin1 predstavujúci 50%
bielkovín obsahu materskej kašičky.
Bíliková. K. et al. (2001) Apidologie 32, 275-283.
Antimikrobiálna aktivita inhibícia rastu Paenibacillus larvae pôvodca moru včelieho plodu
A. Bacillus subtilis B. P. larvae, ATCC 2547 C. P. larvae, ATCC2548 D. P. larvae, ATCC9545
BS9/58 PL47 PL48 PL45
R 5.10-6M R 2,5.10-5M
control H2O2 5.10-4M
Antifungálna aktivita
Botrytis cinerea
Bacterial strains (G+)
Bifidobacterium adolescentis ATCC15703
Bifidobacterium bifidum ATCC15696
Bifidobacterium breve ATCC15700
Bifidobacterium infantis ATCC 15697
Bifidobacterium longum ATCC15707
Clostrídium perfringens ATCC13124
Corynebacterium pyogenes
Eubacterium aerofacience
Lactobacillus acidophilus ATCC311
Lactobacillus acidophilus ATCC4356
Lactobacillus bulgaricus ATCC1841
Lactobacillus helveticus ss. Jugurti
Lactobacillus lactis ATCC8000
Lactobacillus leichmannii ATCC7830
Lenconostoc cremoris ATCC19254
Staphylococcus aureus SC-D
Streptococcus cremoris SCR-812
Streptococcus thermophilus ATCC19258
Fujiwara S. et al. (1990) J.Biol. Chem.265. 11333-11337.
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
ROYALISIN antimikrobiálny a antifungálny faktor larválnej výživy a medu
51 aar, 5523 Da, pI 7,75
molekulárna charakterizácia
Bíliková K. et al (2002), FEBS Letters 528, 125-129.
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
APISIMIN antimikrobiálny, antifungálny a immunoaktívny peptid
včelej materskej kašičky 54 aar, 5540 Da, pI 4,68
pI 1 2
3.50
3.75
4.55
5.20
5.85
7.35
8.15
8.45
9.50
Tricin-SDS-PAGE
1. Mw protein marker
2. royal jelly
3. apisimin
Native PAGE
1. royal jelly
2. apisimin
IEF
1. IEF marker
2. apisimin
Native PAGE-
-Western blot
1. royal jelly
2. apisimin
1 2
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
The PSIPRED Protein Structure Prediction Server http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html Bíliková K. et al (2002). FEBS Letters 528. 117-121
APISIMIN antimikrobiálny, antifungálny a immunoaktívny peptid
včelej materskej kašičky 54 aar, 5540 Da, pI 4,68
Apisimin+
5541.5 Da
K
5412.2 T
5311.0
S
5224.3
štrukturálna charakterizácia MALDI-TOF MS CD spectrum
20 10 1 10 20 30 40 50
MSKIVAVVVLAAFCVAMLVSDVSAKTSISVKGESNVDVVSQINSLVSSIVSGANVSAVLLAQTLVNILQILIDANVFA
CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCEEEEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCC
wavelenght [nm]
190 200 210 220 230 240 250
20
10
0
-10
34 % helix
20 % sheet
11 % turn
Bíliková K. et al (2009) Proteomics. 9. 2131-2138.
250
150
100
75
50
37
25
kDa apa2 apa2a apa2 apa2a
ENSP
AIVR
(apa2)
(apa2a)
9.5
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
4.5
3.5
pI 1 2
IEF of apalbumin2 10% SDS-PAGE Western blot analysis
with polyclonal antibody
against apa2
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Molekulárna charakterizácia
Apalbuminu2a
Antibacterial effect of apalbumin2a on the growth
of P. larvae (ATCC 2547) in MYPGP medium,
with addition of:
apa2 - apalbumin2 (1.8x10-4 M);
apa2a - with addition of apalbumin2a (1.8x10-4 M)
Tcc - with addition of tetracycline hydrochloride
(1x10-5 M) as a positive control.
control - P. larvae withouth of antimicrobial agent
Absorbance measured at 595 nm.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Time of incubation [h]
Ab
sorb
an
ce [m
AU
]
apa2
control
ATCC2457
apa2a
Tcc
Apalbumin2a minoritný homológ apalbumínu2
inhibuje rast Paenibacillus larvae (pôvodca moru včelieho plodu)
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
včela dokáže transformovať výživové bielkoviny na antibiotické
Bíliková K, et al (2009) Proteomics, 9, 2131-2138.
Bielkoviny materskej kašičky pôsobia ako imunostimulátory idukujúce tvorbu cytokinov TNF-alfa, kľúčový cytokín zodpovedný za reguláciu antiviralnych, antibakteriálnych a antiparazitických
defenzívnych mechanizmov organizmu
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
contr
ol
LP
S
RJP
apa
-1-o
ligo
me
ric
ap
a-1
-mo
no
mer
ap
a-2
apis
imin
TNF-
alp
ha
[pg.
ml-1
]
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
1200,0
3 H 6 H 24 H
control LPS RJP
TNF-
alp
ha
[pg.
ml-1
]
Šimúth J., Bíliková K., Kováčvá E., Kuzmová Z., Schroder W. (2004) J. Agric. Food Chem. 12154-12158.
Imunostimulačné vlastnosti bielkovín materskej kašičky
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
parameter metóda
Senzorické farba, chuť, vôňa priame senzorické pozorovania
Fyzikálno-chemické
obsah vody, vodivosť, gravimetria, elektrická konduktivita,
kyslosť, voľné kyselín (glukónová, mravčia, octová, oxalová,...) pH, titračné metódy
Celkový obsah dusíka, stanovenie proteinov,
vitamínov, voľných aminokyselín, ... LC, HPLC,
stanovenie minerálov AAS, AES, OES
Analýza cukrov optická otáčavosť, index lomu
celkový obsah, jednotlivé a pomerné zastúpenie cukrov refraktometria, HPLC, HPLC/MS,
(fruktoza/glukoza, sacharóza, redukujúce cukry, oligosacharidy, ...) stanovenie 13C/12C , IRMS, NMR, ICP-MS detekcia falšovania škrobovými sirupmi, invertom FTIR spectroscopy, HPAEC-PAD, ...
Enyzmatická aktivita
diastazová, invertázová aktivita kolorimetria, polarimetria
Kontaminanty a toxické látky
HMF UV, HPLC, GC, GC/MS,
pesticídy, insekticídy, antibiotiká HPLC/MS, IR, …
toxické látky rastlinného pôvodu (alkaloidy, terpeny, PAH, ...)
ťažké kovy AAS, AES, OES
Botanický pôvod
peľová analýza mikroskopia
aromatické látky rastlinného pôvodu a rastlinné polyfenoly UV, HPLC, GC, GC/MS, HPLC/MS, SPME, ...
Mirobiologické zloženie
baktérie, kvasinky, mikrobiologické metódy
multivariačné štatistické metódy
Používané metódy hodnotenia pravosti včelieho medu
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
kDa
100
70
55
40
35
25
15
10
M RJP apa1 apa1 agát
lip
a ga
štan
re
pka
p
úp
ava
sa
ch.c
uko
r
um
elý
p
úp
avo
vý
agát
ový
nek
tar
ex
trak
t p
eľu
Proteiny materskej kašičky su prítomné v mede a vo včelom peli
Apalbumin1 je hlavným proteínom medu
apa1
55 kDa
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
100
70
55
40
35
25
15
10
Imnochemická detekcia
apalbuminu1
Western blot analysis
using polyclonal anti-apa1
antibody
Electroforetický profil
vzoriek medov, nektáru
a včelieho peľu
12% SDS PAGE
Coomassie Brilliant Blue
staining
Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.
Apalbumin1 hlavný protein materskej kašičky
hlavný proteín medu
nenahraditeľný faktor v procese premeny nektáru na med
dôležitý faktor pri spracovaní kvetového peľu na obnôžkový
hlavný faktor imunostimulačných vlastností medu
syntetizovaný počas celého života včely
pre včelu špecifický
tepelne stabilný
vhodný parameter pre hodnotenie pravosti a kvality medu
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.
výhody:
citlivosť (ng/ml)
presnosť
reprodukovateľnosť
malé množstvo vzorky
jednoduchá príprava vzorky
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Metóda kvantifikácie apalbuminu1 v mede a vo včelích produktoch
s potenciálnym využitím v apiterapii, kozmetike a farmakológii
Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.
Obsah apalbuminu1 v rôznych kvetových medoch a v invertovanom sacharózovom sirupe
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
200,00
vzorky medov zo Slovenska, Česka, Talianska a Španielska
ap
alb
um
in1
[u
g/g
]
pôvod medu
rob
ínia
ag
át
lip
a
ga
šta
n
čere
šn
a
po
ma
ran
č
eu
ka
lyp
tus
rod
od
en
dro
n
rozm
arí
n
pú
pa
va
rep
ka
sln
eč
nic
a
luc
ern
a
bo
dli
ak
leva
nd
ula
tym
ián
po
lyfl
ora
lny
les
ný
sach
aró
zo
vý s
iru
p
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.
Výsledky stanovenia apalbumin1 v mede ELISA metodou
Pôvod medu
Celkový
protein*
[μg.g-1]
apalbumin1 [μg.g-1] apalbumin1
min max priemer*
[%]
celkového
proteinu
[%]
medu
Agát (n=5) 311,42 98,74 126,11 108,64 34,88 0,010
Lipa (n=5) 483,99 96,29 109,82 100,79 20,83 0,010
Gaštan (n=5) 944,20 265,12 310,87 287,42 30,44 0,030
Repka (n=5) 650,88 81,22 137,68 102,47 15,74 0,010
Púpava (n=5) 905,72 129,75 140,86 136,42 15,06 0,010
sacharozový
sirup (n=2) 159,22 7,61 7,72 7,66 4,81 0,001
* priemer (n) vzoriek medu
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.
Čo poodhalili analýzy včelieho genómu? včelí genóm je prekvapivo malý
Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).
včela (Apis mellifera) 10 157 génov
vinná muška (Drosophila melanogaster) 13 600 génov
komár (Anopheles gambiae) 14 000 génov
priadka morušová (Bombyx mori) 18 500 génov
človek (Homo sapiens) 22 500 génov
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Včela má veľmi slabú genetickú výbavu
pre imunitu a odolnosť voči chorobám.
Včelí genóm obsahuje len 6 génov kódujúcich antimikrobiálne peptidy,
kým D.melanogaster ma 3x viac týchto génov.
Obsahuje tiež malý počet génov pre elimináciu škodlivých chemikálii vrátene insekticídov.
Prečo má včela menej génov pre vrodenú imunitu ako iný hmyz ?
Včela má vo svojich produktoch nevyčerpateľný zdroj látok,
ktoré tvoria jej obranný systém voči patogénom, pretože
výživa a zdravie včiel značne závisí
od fyziologicky účinných zložiek rastlín v propolise, peli a v nektári
tie nie sú determinované včelím genómom.
u včely sa vyvinul špecifický defenzívny systém
založený na multifunkcionalite proteinov a peptidov materskej kašičky
ako dôsledok postranslačnej modifikácie materských proteínov. Bíliková K, et al (2009) Proteomics, 9, 2131-2138
Čo poodhalili analýzy včelieho genómu?
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).
Včela je obdarená výnimočným detekčným systémom pre vône včela má v 163 génov,
vinná muška len 62 a komár 79 génov
Včela nemá veľa génov pre chuť Včela má len 10 génov pre chuťové receptory,
kým vinná muška 68 a komár až 76 génov.
Včela sa ich evolúciou zbavila, pretože si vyvinula symbiózu s rastlinami,
ktoré jej poskytujú najchutnejšiu a najvýživnejšiu potravu
vo forme nektáru a peľu.
včela a rastliny predstavujú komplexný symbiotický systém,
ktorý sa evolúciou zdokonalil do úplnej závislosti včely na rastlinách
Čo poodhalili analýzy včelieho genómu?
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Zdravotný stav včelstiev je vážny
Čo spôsobuje hromadný úhyn včelstiev na celom svete? (CCD, Colony Collapse Disorder)
− životné prostredie
− používanie pesticídov, insekticídov, antibiotík
− elektromagnetické žiarenie
− podvíživa
− včelie patogény
− ...
− ?
Bakteriálne Paenibacillus larvae (AFB) Melissococus pluton (EFB) Paenibacillus alvei Streptococcus pluton
Fungálne Ascosphaera apis (Chalkbrood) Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus (Stonebrood) Nosema apis, Nosema ceranae
Virálne Chronic Paralysis Virus [CPV] Black Queen Cell Virus (BQCV) Kashmir bee virus (KBV) Israel acute paralysis virus (IAPV)
Parasitické Varroa mites (Varroa) Tracheal mites (Acarapis)
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Paenibacillus larvae včelí mikrobiálny pathogén, primárny pôvodca moru včelieho plodu
American foulbrood
AFB
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
Nový prístup v prevencii a liečbe včelstiev
nahradenie klasických antibiotík fyziologicky účinnými látkami prítomnými v mede peli a propolise
proteiny a peptidy včelieho pôvodu
fytochemikálie, látky rastlinneho pôvodu
Tylosine
Tetracycline
chlortetracycline tetracycline hydrochlorid oxytetracycline
Použitie antibiotík bolo zakázané vo väčšine krajín EU (2005) pre výskyt reziduí týchto liečiv v mede
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
hlavné bielkoviny materskej kašičky majú okrem výživovej funkcie aj významné fyziologické účinky
Tento predpoklad podporuje aj ich prirodzená funkcia vo včelstve
kde majú úlohu induktora (spúšťača) defenzívnych mechanizmov počas vývoja larvy
a môžu ovplyvniť fenotypický prejav génov.
poznanie molekulárno-chemických a štrukturálnych vlastností
proteinov a peptidov materskej kašičky
prispievajú k objasneniu liečivých účinkov medu, materskej kašičky a včelieho peľu,
ktoré sa používajú ako revitalizačné prostriedky
pre upevnenie ľudského zdravia, duševnej a telesnej výkonnosti a dlhovekosti.
apalbumin1 je vhodným paramerom pre hodnotenie pravosti a kvality medu
imunochemická metóda na kvantifikáciu apalbuminu1 zisťovanie falšovania medu a dôkaz prítomnosti medu a materskej kašičky
v potravinárskych a farmaceutických a kozmetických produktoch
antibiotické proteiny a peptidy materskej kašičky sú perspektívnou náhradou antibiotík pri liečení včelstiev voči patogénom
a predstavujú novú generáciu proteínových antibiotik.
SÚHRN
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia
7.FP EU - BEEDOC
Bees in Europe and the decline of honeybee colonies
Včely v Europe a hormadný úhyn včelstiev.
6.FP EU – BEESHOP
Bees in Europe and Sustainable Honey Production.
Včely v Europe a udržateľná produkcia medu.
6.FP EU – CONCO
Applied Venomics for Production of Inovative Biomedical Drugs.
Využitie aplikovanej venomiky pre prípravu nových bio-liečiv.
Partner Group Project
Functional genomics of physiological active proteins and peptides of honeybee
(Apis mellifera L.)
Funkčná genomika fyziologicky aktívnych proteínov a peptidov včely medonosnej
(Apis mellifera L.).
Institute of Molecular Biology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia
Max-Planck Institute of Molecular Genetics, Berlin, Germany
Riešené projekty Oddelenie molekulárnej apidológie
ÚMB SAV, Bratislava
Poďakovanie
za spoluprácu a poskytnutie vzoriek medu
Slovenský zväz včelárov
Výskumný ústav včelársky, Litovský Hrádok
Výskumný ústav včelársky, Dol u Prahy, Česka republika
Výskumný ústav včelársky, Bologna, Taliansko
Partnerské ústavy v Švédsku, Anglicku, Nemecku, Belgicku, Francúzsku,
Bulharsku a Španielsku
Max-Planckov ústav molekulárnej genetiky, Berlin, Nemecko
JRJ, Tokio, Japonsko
Yunlin University, Taiwan
Slovak Academy of Sciences
Bratislava, Slovakia